KR20170055348A

KR20170055348A - 자기나노입자 분리장치

Info

Publication number: KR20170055348A
Application number: KR1020150158402A
Authority: KR
Inventors: 김성민; 김명호
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2015-11-11
Filing date: 2015-11-11
Publication date: 2017-05-19

Abstract

본 발명은 자기나노입자 분리장치에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 대장균 신속진단기술 중 자기나노입자(MNP, Magnatic Nano Particle)를 분리하여 음식물 속의 대장균을 검출하는 기술로써, 효소면역측정법을 응용한 방법으로 항원과 항체의 신속하고도 강력한 결합을 기반으로 자기나노입자에 결합시킨 항체와 대장균의 결합을 이용하고자 한 것이다. 이 방법을 사용하면 식품으로부터 미생물 및 박테리아를 분리하고 이를 증폭하여 측정하지 않고, 바로 현장에서 미생물 및 박테리아의 종류와 양을 측정해 낼 수 있다.

Description

자기나노입자 분리장치{Separation device for magnetic nano particle}

기존의 효소면역측정법은 면역 기술 중 가장 잘 정립되어 있으며, 간접 또는 샌드위치 ELISA 등이 병원균 검출에 널리 쓰인다(Frank and Hruska, 2005). ELISA 기술은 대상 항원 세포 전체나 B. cereus, Campylobacter spp., E. coli 그리고 Salmonella spp.의 산물을 검출하기 위해 개발되었다.

도 1의 효소면역측정법의 개요를 살펴보면,

1) 항체고정, 2) 항원-항체결합, 3) 항체에 효소가 결합된 항체(Enzyme-labelled antibody)를 항원-항체 결합된 항체에 반응시키는 단계, 4) 색의 변화를 측정하는 단계로 이루어진다.

여기서, 샌드위치 ELISA 검사에선 1차 항원이 플레이트 웰에 부착된다. 시료에서 추출된 항원을 이 웰에다 첨가하면 항원은 항체에 결합되어 세척한 다음에도 플레이트에 부착 남아있게 된다. 그 다음 peroxidase와 같은 효소로 표지된 2차 항체를 웰에 첨가하고 다시 세척한다. 플레이트에 부착된 분석 대상물의 양은 특별한 기질로 배양한 다음, 배양 중에 변하는 색 변화를 마이크로 플레이트 측정장치로 측정한다. 색 변화는 시료에 포함된 분석대상물의 양에 비례하여 변화한다 (도 1).

그러나 이 방법은 효소라벨이 부착된 항체를 추가적으로 더 사용하여야 하고 측정되는 범위도 색의 변화를 감지할 수 있는 범위로 높아져야하므로, 아주적은 양의 항원을 찾아낼 수 없는 단점이 있다.

도 2에서처럼, (a)는 샘플 속에 대장균(회색)과 이물질(흰색)이 혼합되어 있고, 여기에 항체를 고정한 자기나노입자(MNP)를 혼합하면, 대장균만 자기나노입자와 결합한다.

이제 샘플 내부에는 이물질, 결합하지 않는 자기나노입자 및 자기나노입자와 결합된 대장균만이 남는다. 자기나노입자는 자장에 반응하기 때문에 자석을 이용하여 이물질과 자기나노입자 및 자기나노입자와 결합된 대장균을 분리한다. 기존의 기술에서는 (d)와 같이 마이크로 필터를 이용하여 자기나노입자와 결합된 대장균과 대장균과 결합하지 않는 자기나노입자를 분리한다. (e)에서 자기나노입자와 결합된 대장균을 샘플파이프를 통과시켜 신호를 측정한다.

상기 (d)에서 마이크로 필터를 사용하고, 샘플의 반대쪽에서 진공으로 빨아내는 과정에서 대장균이 손상되거나 서로 영겨붙어 (e)단계로 샘플을 보내는 과정에서 어려움을 있다.

1. Alocilja, E.C., Radke, S.M. 2003. Market analysis of biosensors for food safety. Biosensors and Bioelectronics 18: 841-846. 2. Franek, M., Hruska, K. 2005. Antibody based methods for environmental and food analysis: a review. Vet. Med.-Czech 50: 1-10. 3. Janzten, M.M., Navas, J. Corujo, A., Moreno, R., Lopex, V. 2006. Review: Specified detection of Listeria monocytogenes in foods using commercial methods: from chromogenic media to real-time PCR. Spanish Journal of Agricultural Research, 4(3): 235-247. 4. Kim, G., Moon, J.H., Hahm, B.K., Morgan, M., Bhunia, A., Om, A.S. 2009. Rapid Detection of Salmonella enteritidis in Pork Samples with Impedimetric Biosensor: Effect of Electrode Spacing On Sensitivity. Food Sci. Biotechnol, 18(1): 89-94. 5. Leake L.L. 2007. New worlds of microbiological testing. Foodtechnology 7: 90-94. 6. Noble, R.T., Weisberg, S.B. 2005. A review of technologies for rapid detection of bacteria in recreational waters. Journal of Water and Health 3(4): 381-292. 7. Dostalek, P., Branyik, T., 2005. Prospects for Rapid Bioluminescent Detection Methods in the Food Industry a Review. Czech J. Food Sci., 23(3): 8592. 8. Toldra, F., Reig, M., 2006. Methods for rapid detection of chemical and veterinary drug residues in animal foods. Trends in Food Science & Technology, 17: 482-489.

본 발명은 상기 종래의 문제점을 해소하기 위해 안출된 것으로서,

항체에 자기나노입자를 부착하고 이를 항원과 반응하도록 하였다. 이렇게 반응된 샘플은 핵자기공명장치(NMR)로 샘플의 신호의 크기를 읽어 들여 항원인 대장균의 개수를 측정할 수 있고, 대장균의 측정방법에서 항원이 되는 대장균(E. coli)과 결합하는 항체가 결합된 자기나노입자 중에 결합되지 않고 남은 자기나노입자를 샘플 속에서 분리하는 방법을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하고자, 본 발명은 대장균과 항체을 통하여 결합된 자기나노입자를 검출하는 자기공명장치를 이용하기 위하여 대장균과 결합되지 않는 자기나노입자를 분리하기위한 자기나노입자 분리장치에 있어서,

대장균과 항체를 통하여 결합된 자기나노입자와 대장균과 결합되지 않은 자기나노입자 혼합물을 포스페이드버퍼드살린(PBS) 용액과 혼합한 샘플용액을 상기 분리장치에 공급하는 샘플파이프;

상기 샘플파이프의 타단에 연결되어 진공으로 흡입하여 상기 샘플을 빨아들이는 진공펌프;

상기 샘플파이프는 확관부를 구비하고, 상기 확관부에는 전단과 중단에 각각 자기나노입자를 회전시키기위한 코일을 복수개 구비하며, 상기 확관부 중단에 상기 코일에 의하여 회전력을 얻어, 원심력을 갖게된 상기 자기나노입자를 회전방향으로 분리 배출시키기 위한 분리관;

상기 분리관의 끝단에 자기나노입자를 분리 배출시키기위한 배출관; 및

고압의 포스페이드버퍼드살린(PBS) 공급부를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 자기나노입자 분리장치를 제공한다.

또한, 자기나노입자에 회전력을 주기위하여, 상기 복수의 코일에 전기의 공급을 제어하는 제어부를 포함한 자기나노입자 분리장치를 제공한다.

또한, 상기 제어부는 상기 복수의 코일을 각각별도로 제어하는 자기나노입자 분리장치를 제공한다.

또한, 상기 샘플파이프의 전단부에 상기 샘플을 회선시키기위한 나선형의 주름이 파이프 안쪽에 더 포함하는 자기나노입자 분리장치를 제공한다.

또한, 상기 샘플파이프의 끝단이 상기 자기공명장치의 샘플 투입구와 연결되는 자기나노입자 분리장치를 제공한다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 자기나노입자 분리장치는 기존의 기술과는 달리 마이크로 필터를 사용하지 않기 때문에 샘플 속의 대장균들이 진공에 의하여 서로 달라붙은 다거나 손상되는 일이 없이 샘플을 있는 상태 그대로 분리해 낼 수 있는 효과가 있다.

또한 필터 등을 사용하는 과정에서 샘플이 오염되는 것도 막을 수 있는 장점이 있다.

또한, 마이크로 필터를 사용하는 경우 종래에는 연속적인 측정과정이 이루어질 수 없지만, 본 발명은 샘플을 유체 속에서 이동시키는 과정에서 분리가 이루어지기 때문에 자기공명장치로의 샘플공급이 연속적으로 이루어질 수 있어, 외부로부터 오염이 차단되고 연속측정이 가능한 효과가 있다.

도 1은 ELISA 측정법(효소면역측정법)의 측정방법을 나타낸 개략도
도 2는 기존의 마이크로 필터를 이용한 자기나노입자 분리방법 및 이를 이용한 대장균 검출방법을 나타낸 개략도
도 3은 본 발명의 일실시 예에 따른 자기나노입자 분리기의 구성 및 동작도
도 4는 본 발명의 일실시 예에 따른 자기나노입자 분리기 도 3의 제작 단면도
도 5는 본 발명의 일실시 예에 따른 자기나노입자 분리기의 사시도
도 6은 본 발명의 일실시 예에 따른 자기나노입자 분리기의 정면도 및 측면단면도(a)

이와 같은 특징을 갖는 본 발명은 그에 따른 바람직한 실시 예를 통해 더욱 명확히 설명될 수 있을 것이다.

이하 첨부된 도면을 참조로 본 발명의 여러 실시 예들을 상세히 설명하기 전에, 다음의 상세한 설명에 기재되거나 도면에 도시된 구성요소들의 구성 및 배열들의 상세로 그 응용이 제한되는 것이 아니라는 것을 알 수 있을 것이다. 본 발명은 다른 실시 예들로 구현되고 실시될 수 있고 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 또, 장치 또는 요소 방향(예를 들어 "전(front)", "후(back)", "위(up)", "아래(down)", "상(top)", "하(bottom)", "좌(left)", "우(right)", "횡(lateral)")등과 같은 용어들에 관하여 본원에 사용된 표현 및 술어는 단지 본 발명의 설명을 단순화하기 위해 사용되고, 관련된 장치 또는 요소가 단순히 특정 방향을 가져야 함을 나타내거나 의미하지 않는다는 것을 알 수 있을 것이다. 또한, "제 1(first)", "제 2(second)"와 같은 용어는 설명을 위해 본원 및 첨부 청구항들에 사용되고 상대적인 중요성 또는 취지를 나타내거나 의미하는 것으로 의도되지 않는다.

따라서, 본 명세서에 기재된 실시 예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시 예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

도 3은 본 발명의 일실시 예에 따른 자기나노입자 분리기의 구성 및 동작도이고, 도 4는 본 발명의 일실시 예에 따른 자기나노입자 분리기 도 3의 제작 단면도이고, 도 5는 본 발명의 일실시 예에 따른 자기나노입자 분리기의 사시도이고, 도 6은 본 발명의 일실시 예에 따른 자기나노입자 분리기의 정면도 및 측면단면도(a)이다.

도 3 내지 도 6에 도시한 바와 같이, 본 발명의 자기나노입자 분리장치는 대장균과 항체를 통하여 결합된 자기나노입자와, 상기 대장균과 결합되지 않은 자기나노입자 혼합물을 포스페이드버퍼드살린(PBS) 용액과 혼합하도록 확관부(11)가 구비되고, 상기 확관부(11)에는 전단과 중단에 각각 자기나노입자를 회전시키기 위한 코일(10)을 복수개 구비되며, 상기 확관부(11)에서 혼합된 샘플용액을 공급하는 샘플파이프(8)와; 상기 샘플파이프(8)의 타단에 연결되어 진공으로 흡입하여 상기 샘플을 빨아들이는 진공펌프(13)와; 상기 확관부(11)의 중단에 형성되어 상기 코일(10)에 의하여 회전력을 얻어, 원심력을 갖게 된 상기 자기나노입자를 회전방향으로 분리 배출시키기 위한 분리관(12); 및 상기 분리관(12)의 끝단에 형성되어 자기나노입자를 분리 배출시키기 위한 배출관(9)으로 구성된다.

그리고, 자기나노입자분리기의 작동을 설명하면 하기와 같다.

상기 도 2의 (c) 단계까지의 과정에서 얻어진 샘플(자기나노입자(7)와 결합된 대장균(5)과 대장균(5)과 결합되지 않은 자기나노입자 혼합물)을 PBS버퍼 용액과 혼합하여 반대쪽에서 진공펌프(13)로 빨아들이는 샘플파이프(8)로 공급한다. 상기 샘플파이프(8)의 직경은 2~20㎛, 최적의 크기는 10㎛ 이다. 이는 대장균(5)의 크기가 긴쪽이 2~6㎛ 이므로 이보다 크기가 큰 10㎛일 때 대장균(5)들이 서로 엊히는 경우에도 샘플의 공급이 원활하게 될 수 있기 때문이다.

상기 샘플파이프(8)는 확관부(11)를 가지고, 확관부(11)의 전단과 중단에 각각 자기나노입자(7)를 회전시키기 위한 코일(10)을 구비한다. 상기 확관부(11)는 샘플파이프(8) 직경의 1.5배에서 2배 사이가 적당하다.

상기 확관부(11)의 중단에는 원심력에 의하여 회전반경이 커진 대장균(5)과 결합되지 않는 자기나노입자(7)를 분리 배출하기 위한 자기나노입자 분리관(12)을 구비한다. 상기 분리관(12)은 관 형태와 넓게 퍼진 디스크 형태 모두 가능하다. 분리관(12)은 자기나노입자(7) 크기의 5~10배 크기가 정당하다. 디스크 형태의 경우 디스크 사이의 거리가 자기나노입자(7) 크기의 5~10배 크기가 정당하다. 우리가 사용하는 자기나노입자(7)의 크기는 10 ~ 500㎚ 의 범위를 가진다.

상기 자기나노입자 분리관(12)의 끝단에는 자기나노입자(7)를 배출시키기 위하여 PBS버퍼가 고속으로 지나가는 배출관(9)이 연결된다. 베르누이의 정리에 의하여 고속의 PBS 버퍼가 배출관(9)을 지나가면 생기는 압력 차이에 의하여 자기나노입자가 분리관(12)을 지나 배출관(9)으로 빠져나온다. 배출관(9)의 굵기는 자기나노입자(7)의 크기의 3배 이상이면 가능하다. 그러나, 너무 크면 많은 양의 PBS 버퍼용액을 사용하여야 하므로, 자기나노입자(7)의 3~5배 크기가 적당하다.

도면에 기재하지 않았으나, 자기나노입자(7)의 원심력을 높이기 위하여 샘플파이프(8) 내부에 유체가 회전할 수 있도록 나선형의 주름을 형성하거나, 외부 펌프를 사용하여 중심방향으로 회전하는 PBS 버퍼를 상기 샘플파이프(8)로 공급할 수 있다.

이 본 발명의 사상은 자기나노입자(7)를 포함하는 나노입자 그룹과 검출대상과 생물학적으로 결합력을 가지는 항체(1)와 결합된 나노입자 중에 반응에 참여하지 않은 잉여의 나노입자들을 분리함으로써 다음과정에서 나노입자가 결합된 항원(2)의 양을 정량화할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.

따라서, 항체의 종류와 항체와 결합하는 측정 신호증폭을 위한 물질이 자기나노입자(7)에 한정되는 것은 아니며, 측정방법에 따라 형광을 띠는 입자, 전기장에 반응하는 입자, 방사선에 반응하는 입자를 모두 포함한다. 입자의 크기 역시 나노입자에서부터 수백 마이크로미터의 입자에 이르기까지 다양한 크기의 입자가 사용될 수 있다.

또한, 항원의 종류도 이번 연구에서는 대장균(5)의 일종인 E.coli 를 사용하였지만, 항원의 종류도 항체와 결합 가능한 박테리아, 세포, 단백질, DNA를 모두 포함한다.

항체의 종류 역시, 모노크로날 안티바디를 포함하여, 폴리크로날 안티바디 및 항원을 검출할 수 있는 다양한 형태의 단백질 및 세포를 포함한다.

이 본 발명에서는 자기나노입자(7)에 원심력을 부여하기 위한 방법으로, 코일(10)과 제어부를 사용하여 코일(10)에 전류를 흐르게함으로써, 자장을 형성하여 자기나노입자(7)를 회전시키거나 중심에서 멀어지게하는 방법으로 결합을 하지못한 잉여의 자기나노입자(7)를 분리하는 방법을 사용하였다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 제어부는 전류의 세기뿐 만아니라, 전류의 주기로 제어함으로써 잉여의 자기나노입자(7)는 분리하고자 한다.

또한, 코일(10) 역시 하나의 단일코일을 구성하여 샘플파이프(8)의 벽면으로 자기나노입자(7)를 잡아당기는 방법과, 복수개의 조각된 코일(10)을 샘플파이프(8)의 외부 벽면에 설치(미도시)함으로서, 각각의 코일(10)에 다른 타이밍으로 전류를 공급함으로써 회전형의 자장을 형성하여 자기나노입자(7)를 회전시킬 수 있다.

이러한 자기장의 형성에는 코일(10)뿐 아니라 자석을 사용할 수 있고, 회전하는 자장을 형성하기 위하여 회전하는 자석 등의 물리적인 장치를 이용하는 것도 가능하다. 코일(10)에 적용되는 펄스의 속도는 유체의 속도에 반 비례하며, 1/sec, 당 1초의 전류인가와 전류휴지를 가지는 것으로 설계되었다. 즉, 2/sec의 속도로 유체가 흐르는 경우에 0.5초 주기로 펄스를 가한다. 이러한 펄스의 속도는 유체의 점성에 따라 변화를 10% 범위 내에서 바꿀 수 있도록 하였다. 대용량의 전류를 흘리기 위하여 제어부에는 대전류 용 고속 FET(Field effect transistor)를 사용하였다. 샘플파이프(8)의 출구에는 자장을 감지하는 센서(미도시)를 두어, 샘플이 NMR 장치에 공급되는 것을 감지하고, NMR 측정장치를 구동하는 센서로 사용한다.

상기는 본 발명의 바람직한 실시예를 참고로 설명하였으며, 상기의 실시예에 한정되지 아니하고, 상기의 실시예를 통해 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변경으로 실시할 수 있는 것이다.

8 : 샘플파이프 9 : 배출관
10 : 코일 11 : 확관부
12 : 분리관 13 : 진공펌프

Claims

대장균과 항체가 결합된 자기나노입자를 검출하는 자기공명장치를 이용하여 대장균과 결합되지 않는 자기나노입자를 분리하기 위한 자기나노입자 분리장치에 있어서,
대장균과 항체를 통하여 결합된 자기나노입자와, 상기 대장균과 결합되지 않은 자기나노입자 혼합물을 포스페이드버퍼드살린(PBS) 용액과 혼합하도록 확관부(11)가 구비되고, 상기 확관부(11)에는 전단과 중단에 각각 자기나노입자를 회전시키기 위한 코일(10)을 복수개 구비되며, 상기 확관부(11)에서 혼합된 샘플용액을 공급하는 샘플파이프(8);
상기 샘플파이프(8)의 타단에 연결되어 진공으로 흡입하여 상기 샘플을 빨아들이는 진공펌프(13);
상기 확관부(11)의 중단에 형성되어 상기 코일(10)에 의하여 회전력을 얻어, 원심력을 갖게 된 상기 자기나노입자를 회전방향으로 분리 배출시키기 위한 분리관(12); 및
상기 분리관(12)의 끝단에 형성되어 자기나노입자를 분리 배출시키기 위한 배출관(9);
을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 자기나노입자 분리장치.
제 1항에 있어서,
상기 자기나노입자에 회전력을 주기 위하여 상기 복수의 코일(10)에 전기의 공급을 제어하는 제어부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 자기나노입자 분리장치.
제 2항에 있어서,
상기 제어부는 상기 복수의 코일(10)을 각각 별도로 제어하는 것을 특징으로 하는 자기나노입자 분리장치.
제 1항에 있어서,
상기 샘플파이프(8)의 전단부에는 상기 샘플을 회전시키기 위한 나선형의 주름이 샘플파이프(8) 안쪽에 형성되는 것을 특징으로 하는 자기나노입자 분리장치.
제 1항에 있어서,
상기 샘플파이프(8)의 끝단에는 상기 자기공명장치의 샘플 투입구와 연결되는 것을 특징으로 하는 자기나노입자 분리장치.