KR20170051765A - 전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템 및 방법에 관한 것으로, 핵산 추출 시스템에서 자성나노입자, 및/또는 핵산과 자성나노입자의 결합체에 전자기파를 제공하는 방식으로 자성나노입자, 및/또는 핵산과 자성나노입자의 결합체의 이동을 제어하여 핵산 함유 피검체로부터 핵산을 고순도로 빠르고 쉽게 분리할 수 있는 시스템 및 방법을 제공할 수 있다.

Description

전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템 및 방법{System and method for extraction of nucleic acid by using electromagnetic wave}
본 발명은 전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템 및 방법에 관한 것이다.
핵산의 분리는 유전공학에서의 가장 기본적인 기술 중 하나이다. 플라스미드 DNA는 유전자 조작의 기본으로 재조합 DNA제작, 유전자 분석 등의 유전공학에 필수적으로 사용된다. 유전체 DNA는 서던블롯 분석, 유전체 라이브러리 제작, 무작위로 증폭된 다형성 DNA(randomly amplified polymorphic DNA, RADP), 제한효소 절편길이 다형성(restriction fragment length polymorphism, RALP), 제한효소 분석, 유전체 PCR(polymerase chain reaction), 유전자변형 생물(gentically modified organism, GMO) 검출과 염기서열 결정 등에 사용된다. 이와 더불어 순수 분리된 RNA는 노던블롯 분석, RT-PCR(reverse-transcriptase-PCR), cDNA 라이브러리 제작등 유전자 발현 양상 및 메커니즘 연구에 중요하게 사용된다.
DNA 분리방법은 여러가지가 개발되어 있으나 다음과 같은 조건이 충족되어야 효과적으로 이용할 수 있다. 우선 단백질과 같은 불순물을 포함하지 말아야 하며 분리 효율이 높아야 하고, 분리 도중 DNA 또는 RNA의 구조나 성질을 변화시키지 않아야 한다. 예컨대, 분리과정에서 DNA가 분해되거나 단일가닥으로 변성되지 말아야 한다. 마지막으로 분리과정이 너무 복잡하거나 많은 시간이 걸리지 않아야 한다.
한편, 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR; reverse transcription polymerase chain reaction)은 유전자 발현을 분석하는 기술로서, 의학진단 및 범죄수사 등에 폭넓게 활용되고 있다. 성공적인 RT-PCR 수행을 위해서는 무엇보다 바이오시료로부터 높은 순도의 RNA를 정제하는 기술이 매우 중요하다. RNA는 핵산가수분해효소(exonuleases; RNases)에 의해 쉽게 분해되는 특성이 있다. 더욱이 RNase는 사람의 피부나 주변 환경에 흔히 존재하며 쉽게 활성화되는 효소이기 때문에 RNase에 의한 오염 없이 높은 순도의 RNA를 정제하는 것은 매우 까다로운 기술이다.
본 발명의 목적은 핵산 함유 피검체로부터 빠르고 쉽게 고순도로 핵산을 추출하기 위한 시스템 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1양태는 핵산 함유 피검체와 자성나노입자가 혼합되어 핵산과 자성나노입자의 결합체가 형성된 제1 혼합 용액이 투입되며 배수구(111a)를 가진 제1 챔버(111);
상기 자성나노입자와 결합되지 않은 상기 피검체 내의 물질들을 상기 배수구(111a)를 통해 상기 제1 챔버(111)로부터 분리하는 과정에서, 상기 핵산과 자성나노입자의 결합체를 상기 제1 챔버(111)에 유지시키기 위한 전자기파를 상기 제1 챔버(111)에 제공하는 제1 전자기파 발생기(210);
상기 제1 챔버(111)와 연결되며 상기 핵산과 자성나노입자의 결합체의 핵산과 자성나노입자의 분리를 위한 분리 시약이 투입되는 제2 챔버(112);
상기 제2 챔버(112)에서 자성나노입자와 핵산이 분리되어진 제2 혼합 용액이 통과하는 제1 마이크로 채널(131);
상기 제2 혼합 용액이 상기 제1 마이크로 채널(131)을 통과할 때 상기 자성나노입자를 상기 제1 마이크로 채널(131)에 잔류시키기 위한 전자기파를 상기 제1 마이크로 채널(131)에 제공하는 제2 전자기파 발생기(220); 및
상기 제1 마이크로 채널(131)을 통과한 핵산을 수용하는 제3 챔버(113);
를 포함하는, 전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템을 제공한다.
본 발명의 제2양태는 핵산 함유 피검체와 자성나노입자를 혼합하여 핵산과 자성나노입자의 결합체가 형성된 제1 혼합 용액을 배수구(111a)를 가진 제1 챔버(111)에 투입시키는 제1단계;
상기 제1 챔버(111)에 전자기파를 제공하면서 상기 자성나노입자와 결합되지 않은 상기 피검체 내의 물질들을 세척용액을 이용하여 상기 배수구(111a)를 통해 상기 제1 챔버(111)로부터 분리하는 제2단계;
상기 핵산과 자성나노입자의 결합체에 분리 시약을 투입하여 핵산과 자성나노입자를 분리시켜 자성나노입자와 핵산이 분리되어진 제2 혼합 용액을 얻는 제3단계; 및
제1 마이크로 채널(131)에 전자기파를 제공하면서 상기 제2 혼합 용액을 상기 제1 마이크로 채널(131)을 통과시켜 상기 자성나노입자를 상기 제1 마이크로 채널(131)에 잔류시키고 핵산을 통과시켜 제3 챔버(113)에 수용시키는 제4단계;
를 포함하는, 전자기파를 이용한 핵산 추출 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 자세히 설명한다.
기존의 핵산 추출 시스템에서는 자석(마그넷)을 이용하여 자성나노입자를 제어하기 때문에 시스템이 복잡하고 장비가 대형화되고 비싸지는 문제가 있다. 본 발명에서는 핵산 추출 시스템에서 자성나노입자, 및/또는 핵산과 자성나노입자의 결합체에 전자기파를 제공하는 방식으로 자성나노입자, 및/또는 핵산과 자성나노입자의 결합체의 이동을 제어하여 핵산 함유 피검체로부터 핵산을 고순도로 빠르고 쉽게 분리할 수 있는 시스템 및 방법을 제공할 수 있음을 발견하였다. 본 발명은 이에 기초한다.
본 발명에서 사용하는 용어, 핵산 함유 피검체는 핵산을 함유하고 있는 분석 대상물을 의미할 수 있다. 상기 핵산 함유 피검체는 세포 유래일 수 있다. 구체적으로, 상기 핵산 함유 피검체는 동물 세포, 식물 세포, 미생물 세포 등의 모든 세포를 대상으로 할 수 있다. 바람직하기로, 상기 핵산 함유 피검체는 세포를 포함하는 생체유래 피검체가 적합하지만, 이것에 한정되는 것은 아니고, 생체에 유래하지 않는 피검체에도 본 발명의 전자기파를 이용한 핵산 추출 방법을 적용하는 것이 가능하다.
상기 생체유래 피검체로는 동물 및 식물의 생체 구성성분을 적절하게 이용할 수 있다. 인간을 포함하는 동물유래의 피검체로는, 예를 들어, 혈액, 조직액, 림프액, 뇌척수액, 고름, 점액, 콧물, 객담, 소변, 대변, 복수 등의 체액류, 피부, 폐, 간, 점액, 각종 장기, 뼈 등의 조직과 비강, 기관지, 피부, 각종 장기 등을 세정한 후의 세정액을 들 수 있다. 그리고 인간의 경우는 투석 배액도 피검체로 할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 추출방법의 표적으로 하는 핵산은 피검체에 포함되는 세포 고유의 핵산에 한정되지 않고, 세포에 감염된 바이러스의 핵산이나, 세포가 탐식한 미생물 등의 핵산에도 적용할 수 있다. 따라서, 감염증 환자의 탐식세포(백혈구 등)를 포함하는 생체유래 피검체도 본 발명의 헥산 추출방법의 피검체로 적합하다.
이때, 세포벽이나 세포막을 가지는 생물유래 피검체를 사용하기 위해서는 상기 피검체를 세포 용해제로 전처리하는 전처리단계가 수행되어야 한다. 다시 말해, 생물유래 물질을 사용하는 경우, 핵산 함유 피검체로는 세포 용해제와 생물유래 물질의 반응물인 세포 용해 산물을 사용한다.
본 발명에서 사용하는 용어, "핵산(nucleic acid)"은 뉴클레오타이드가 긴 사슬 모양으로 중합된 고분자 유기물의 한 종류이다. 다시 말해, 핵산은 뉴클레오타이드를 단량체로 하여 이들이 사슬 모양으로 중합되어 형성된 고분자 유기물로서 구체적으로 DNA(deoxyribonucleic acid) 및 RNA(ribonucleic acid)를 포함한다. DNA 및 RNA는 사슬 구조 내에 인산을 포함하고 있고 상기 인산이 음전하를 띠게 되고 이로 인해 DNA 및 RNA도 전체적으로 음전하(-)를 띠게 된다.
본 발명에서 사용하는 용어, 자성나노입자는 나노 수준의 크기를 가지며 자성을 나타내는 입자를 의미할 수 있다. 상기 자성나노입자는 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn), 비스무스(Bi) 및 아연(Zn)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 금속 또는 이들의 합금이거나 이들로부터 선택된 금속 산화물 또는 합금 산화물을 함유하는 것일 수 있다. 본 발명에서, 상기 자성나노입자는 표면이 양전하(+)로 개질된 것을 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 자성나노입자는 표면이 실리카로 코팅되고 양전하를 띠는 기능기, 예를 들어 3-아미노프로필기, 아미노메틸기, 2-아미노에틸기, N-메틸-3-아미노프로필기, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필기, N-아미노에틸-3-아미노프로필기 또는 N,N-디(2-아미노에틸)-3-아미노프로필기 등의 아민기로 수식되거나, 또는 상기 자성나노입자는 표면에 키토산 양이온이 침착된 것일 수 있다. 본 발명에서, 상기 자성나노입자는 3 ㎚ 내지 100 ㎚의 직경을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 자성나노입자는 실리카로 코팅되고 3-아미노프로필기로 수식된 산화철(III)(마그네타이트, Fe3O4) 나노입자일 수 있다. 상기 자성나노입자는 시판되는 것을 입수하여 사용할 수 있다.
본 발명에서는 전술한 바와 같이 핵산이 음전하(-)를 띠고 자성나노입자가 양전하(+)를 띠어 이들 간에 용이한 결합이 가능하다.
본 발명에서 사용하는 용어, 전자기파는 전자석에 전류가 흐르는 동안 발생하는 자기장을 의미할 수 있다. 상기 전자기파에 의해 자성나노입자 및/또는 핵산과 자성나노입자가 결합된 결합체가 붙들려 이들의 이동이 제어될 수 있다.
본 발명에서, 상기 전자기파는 전자석에 전류가 흐르는 동안 발생하므로 전류를 조절하여 전자기파의 발생 여부를 원하는대로 용이하게 조절할 수 있다. 또한, 본 발명에서는 전자기파의 발생 여부를 외부에 위치하는 별도의 전자기파 발생 제어기를 통해 조절할 수 있어서 시스템의 조작이 용이하고 핵산 추출을 보다 용이하게 수행할 수 있는 이점이 있다.
구체적인 일 양태로서, 본 발명의 전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템의 구조는 도 1에 도시된 바와 같다.
본 발명에 따른 전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템은 전자기파에 의해 자성나노입자, 및/또는 핵산과 자성나노입자의 결합체의 이동을 제어하여 핵산 함유 피검체로부터 핵산만을 빠르고 쉽게 분리할 수 있도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 전자석을 자성나노입자, 및/또는 핵산과 자성나노입자의 결합체가 이동하는 통로 근처에 배치하고 전압을 인가하는 방식으로 전자기파를 발생시켜 자성나노입자, 및/또는 핵산과 자성나노입자의 결합체의 이동을 제어할 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템은
핵산 함유 피검체와 자성나노입자가 혼합되어 핵산과 자성나노입자의 결합체가 형성된 제1 혼합 용액이 투입되며 배수구(111a)를 가진 제1 챔버(111);
상기 자성나노입자와 결합되지 않은 상기 피검체 내의 물질들을 상기 배수구(111a)를 통해 상기 제1 챔버(111)로부터 분리하는 과정에서, 상기 핵산과 자성나노입자의 결합체를 상기 제1 챔버(111)에 유지시키기 위한 전자기파를 상기 제1 챔버(111)에 제공하는 제1 전자기파 발생기(210);
상기 제1 챔버(111)와 연결되며 상기 핵산과 자성나노입자의 결합체의 핵산과 자성나노입자의 분리를 위한 분리 시약이 투입되는 제2 챔버(112);
상기 제2 챔버(112)에서 자성나노입자와 핵산이 분리되어진 제2 혼합 용액이 통과하는 제1 마이크로 채널(131);
상기 제2 혼합 용액이 상기 제1 마이크로 채널(131)을 통과할 때 상기 자성나노입자를 상기 제1 마이크로 채널(131)에 잔류시키기 위한 전자기파를 상기 제1 마이크로 채널(131)에 제공하는 제2 전자기파 발생기(220); 및
상기 제1 마이크로 채널(131)을 통과한 핵산을 수용하는 제3 챔버(113);
를 포함한다.
상기 제1 챔버(111)는 핵산 함유 피검체와 자성나노입자가 혼합되어 핵산과 자성나노입자의 결합체가 형성된 제1 혼합 용액을 수용하며 바람직하기로 하단에 배수구(111a)를 가지고 있다.
상기 제1 전자기파 발생기(210)는 자성나노입자와 결합되지 않은 상기 피검체 내의 물질들을 상기 배수구(111a)를 통해 상기 제1 챔버(111)로부터 분리하는 과정에서, 상기 핵산과 자성나노입자의 결합체를 상기 제1 챔버(111)에 유지, 즉 부착시키기 위한 전자기파를 상기 제1 챔버(111)에 제공하는 수단이다.
상기 제1 전자기파 발생기(210)는 외부 전자기파 발생 제어기(미도시)를 통해 제어되어 전자기파 발생 여부를 원하는대로 조절할 수 있다.
상기 배수구(111a)는 전자기파가 제공되지 않을 때에는 닫혀 있고 전자기파가 제공될 때에는 열려 자성나노입자와 결합되지 않은 상기 피검체 내의 물질들, 즉 불순물을 상기 배수구(111a)를 통해 상기 제1 챔버(111)로부터 분리시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 배수구(111a)가 닫힌 상태에서 상기 제1 챔버(111)에 세척 용액을 투입한 후, 상기 외부 전자기파 발생 제어기를 통해 상기 제1 전자기파 발생기(210)에 의해 전자기파를 발생시켜 상기 제1 챔버(111)에 전자기파를 제공하면서 상기 제1 챔버(111) 하단의 배수구(111a)를 열면 상기 제1 챔버(111)의 내벽에 핵산과 자성나노입자의 결합체는 부착되고 나머지 잔여물만이 배수구(111a)를 통해 외부로 배출될 수 있다. 이후 불순물 제거를 마치면, 다시 배수구(111a)를 닫고 세척 용액을 가하여 핵산과 자성나노입자의 결합체를 함유한 용액을 얻을 수 있다.
이후 상기 핵산과 자성나노입자의 결합체를 함유한 용액은 상기 제1 챔버(111)와 연결된 제2 챔버(112)로 이동하여 수용될 수 있다.
상기 제2 챔버(112)는 상기 핵산과 자성나노입자의 결합체의 핵산과 자성나노입자의 분리를 위한 분리 시약이 투입되는 수단을 구비할 수 있다.
상기 분리 시약에 의해 자성나노입자와 핵산이 분리되어진 제2 혼합 용액은 상기 제2 챔버(112)로부터 상기 제3 챔버(113)의 방향으로 상기 제1 마이크로 채널(131)을 통해 통과된다.
본 발명에서는 제2 혼합 용액이 제1 마이크로 채널(131)을 통과할 때 상기 제2 전자기파 발생기(220)를 통해 상기 제1 마이크로 채널(131)에 전자기파를 제공하여 제2 혼합 용액 중의 자성나노입자만을 상기 제1 마이크로 채널(131) 내벽에 유지시키고 핵산만을 포함하는 용액을 상기 제3 챔버(113) 내로 수용시킨다.
본 발명에서, 상기 제1 마이크로 채널(131)은 병렬 연결된 복수의 서브 채널로 구성될 수 있으며, 상기 제2 전자기파 발생기(220)는 상기 서브 채널 각각에 전자기파를 제공할 수 있다.
상기 제2 전자기파 발생기(220)는 외부 전자기파 발생 제어기(미도시)를 통해 제어되어 전자기파 발생 여부를 원하는대로 조절할 수 있다.
상기 제1 마이크로 채널(131)의 너비는 핵산이 통과하기에 충분하면 정도이면 되고 이의 길이는 피검체량에 따라 핵산이 자성나노입자와 분리되기에 충분한 정도이면 된다. 구체적으로, 상기 제1 마이크로 채널(131)의 너비는 10 ㎛ 내지 200 ㎛, 예컨대 50 ㎛ 내지 150 ㎛의 범위일 수 있고, 상기 제1 마이크로 채널(131)의 길이는 100 ㎜ 내지 900 ㎜, 예컨대 300 ㎜ 내지 500 ㎜의 범위일 수 있다.
바람직한 다른 일 양태로서, 본 발명의 전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템은
세포 함유 피검체와 세포 용해제가 투입되는 제4 챔버(114);
상기 세포 함유 피검체와 상기 세포 용해제가 혼합된 용액이 지나가는 제2 마이크로 채널(132);
상기 제2 마이크로 채널(132)의 후단에 연결되어 세포 용해제에 의해 용해되어 세포로부터 용출된 핵산 함유 피검체를 임시 수용하는 제5 챔버(115);
상기 제5 챔버(115)로부터 상기 제1 챔버(111)에 연결시키는 제3 마이크로 채널(133); 및
자성나노입자를 수용하며 상기 제3 마이크로 채널(133)의 전단에 연결된 제6 챔버(116);를 더 포함할 수 있다.
상기 제4 챔버(114)는 세포 함유 피검체와 세포 용해제가 투입되는 주입구의 역할을 할 수 있으며, 경우에 따라 별도의 제2 마이크로 채널(132)을 구비하지 않고 상기 제4 챔버(114) 내에서 세포 용해가 충분히 이루어지게 할 수 있다.
상기 제2 마이크로 채널(132)은, 상기 제4 챔버(114)에 투입된, 상기 세포 함유 피검체와 상기 세포 용해제가 혼합된 용액이 지나가는 통로이며 상기 제2 마이크로 채널(132)을 통과하면서 피검체 내 세포가 세포 용해제와 충분히 만나 충분한 세포 용해가 이루어지도록 한다.
상기 제2 마이크로 채널(132)의 너비는 세포가 통과하기에 충분하면 정도이면 되고 이의 길이는 세포 용해가 충분히 이루어질 정도이면 된다. 예컨대, 상기 제2 마이크로 채널(132)의 너비는 10 ㎛ 내지 200 ㎛, 예컨대 50 ㎛ 내지 150 ㎛의 범위일 수 있고, 상기 제2 마이크로 채널(132)의 길이는 100 ㎜ 내지 900 ㎜, 예컨대 300 ㎜ 내지 500 ㎜의 범위일 수 있다.
상기 제5 챔버(115)는 상기 제2 마이크로 채널(132)의 후단에 연결되어 세포 용해제에 의해 용해되어 세포로부터 용출된 핵산 함유 피검체를 임시 수용한다.
상기 제3 마이크로 채널(133)은 상기 제5 챔버(115)를 상기 제1 챔버(111)와 연결시켜 핵산 함유 피검체를 제1 챔버(111)로 이동시키는 통로이다.
상기 제3 마이크로 채널(133)의 전단에 자성나노입자가 수용된 제6 챔버(116)가 연결되어 상기 제3 마이크로 채널(133)에 자성나노입자가 투입되어 상기 제3 마이크로 채널(133)을 통해 이동하는 핵산 함유 피검체가 자성나노입자와 혼합되어 핵산과 자성나노입자의 결합체가 형성될 수 있다.
본 발명에서, 상기 제5 챔버(115)와 상기 제3 마이크로 채널(133) 사이에 배치되는 제7 챔버(117)를 더 포함할 수 있다.
상기 제7 챔버(117)는 자성나노입자가 투입되기 전에 핵산 함유 피검체를 임시 수용시키는 역할을 한다.
본 발명의 전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템은 상기 제1 내지 제7 챔버 및 상기 제1 내지 제3 마이크로 채널이 형성된 베이스 플레이트(100)를 포함할 수 있다.
바람직한 일 양태로서, 상기 베이스 플레이트(100)는,
상기 제4 챔버(114), 상기 제2 마이크로 채널(132), 및 상기 제5 챔버(115)가 형성된 제1 서브 플레이트(101);
상기 제1 챔버(111), 상기 제6 챔버(116), 상기 제7 챔버(117) 및 상기 제3 마이크로 채널(133)이 형성된 제2 서브 플레이트(102); 및
상기 제2 챔버(112), 상기 제3 챔버(113) 및 상기 제1 마이크로 채널(131)이 형성된 제3 서브 플레이트(103);로 구성될 수 있다.
본 발명에서, 상기 제1 및 제2 전자기파 발생기는 상기 베이스 플레이트(100)의 하측에 배치될 수 있다.
상기 제1 내지 제7 챔버는 형태 및 재질 등에 제한없이 각각의 챔버에 수용되는 물질들의 이탈(필요에 따른 불순물 제거 등은 제외)을 방지할 수 있는 구조물로서 피검체를 손상시키거나 변화시키지 않는 재질이면 된다.
본 발명에서, 상기 핵산 함유 피검체와 자성나노입자가 혼합되어 핵산과 자성나노입자의 결합체가 형성된 제1 혼합 용액이 상기 제1 챔버(111)에 일단 투입되면, 상기 제1 챔버(111)에 연결된 펌프(미도시)에 의해 최종 목적지인 제3 챔버(113)까지 상기 제1 마이크로 채널을 통해 유체 흐름을 형성시킬 수 있다. 또한, 세포 함유 피검체와 세포 용해제가 일단 제4 챔버(114)에 투입되면, 상기 제4 챔버(114)에 연결된 펌프(미도시)에 의해 최종 목적지인 제3 챔버(113)까지 상기 제1 내지 제3 마이크로 채널을 통해 유체 흐름을 형성시킬 수 있다.
상기 펌프는 외부의 펌프 제어기를 통해 제어될 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 전자기파를 이용한 핵산 추출 방법은 전술한 바와 같이 하기 단계를 포함한다.
핵산 함유 피검체와 자성나노입자를 혼합하여 핵산과 자성나노입자의 결합체가 형성된 제1 혼합 용액을 배수구(111a)를 가진 제1 챔버(111)에 투입시키는 제1단계;
상기 제1 챔버(111)에 전자기파를 제공하면서 상기 자성나노입자와 결합되지 않은 상기 피검체 내의 물질들을 세척용액을 이용하여 상기 배수구(111a)를 통해 상기 제1 챔버(111)로부터 분리하는 제2단계;
상기 핵산과 자성나노입자의 결합체에 분리 시약을 투입하여 핵산과 자성나노입자를 분리시켜 자성나노입자와 핵산이 분리되어진 제2 혼합 용액을 얻는 제3단계; 및
제1 마이크로 채널(131)에 전자기파를 제공하면서 상기 제2 혼합 용액을 상기 제1 마이크로 채널(131)을 통과시켜 상기 자성나노입자를 상기 제1 마이크로 채널(131)에 잔류시키고 핵산을 통과시켜 제3 챔버(113)에 수용시키는 제4단계.
바람직하기로, 본 발명의 전자기파를 이용한 핵산 추출 방법은
상기 제1단계 이전에
세포 함유 피검체와 세포 용해제를 제4 챔버(114)에 투입하는 제a단계;
상기 세포 함유 피검체와 상기 세포 용해제가 혼합된 용액을 제2 마이크로 채널(132)을 통해 통과시키는 제b단계; 및
세포 용해제에 의해 용해되어 세포로부터 용출된 핵산 함유 피검체를 상기 제2 마이크로 채널(132)의 후단에 연결된 제5 챔버(115)에 수용시키는 제c단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 세포 용해제, 세척용액 및 분리 시약은 통상의 세포 용해제를 입수하여 사용할 수 있다. 예컨대, 세포 용해제로는 우레아 및 티오우레아와 같은 카오트로픽 시약(chaotropic reagent)을 사용하거나 음이온성 계면활성제인 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS)를 사용할 수 있다. 예컨대, 세척용액으로는 1M~8M의 구아니딘 히드로클로라이드, 10~100mM의 트리스 히드로클로라이드, 10mM~500mM 염화나트륨, 및 10%~90%의 알코올(이소프로필알콜, 에칠알콜)로 구성되는 용액을 사용할 수 있다. 예컨대, 분리 시약으로는 pH는 8.0~9.0인 1mM~50mM의 트리스 히드로클로라이드 용액을 사용할 수 있다.
본 발명은 핵산 추출 시스템에서 자성나노입자, 및/또는 핵산과 자성나노입자의 결합체에 전자기파를 제공하는 방식으로 자성나노입자, 및/또는 핵산과 자성나노입자의 결합체의 이동을 제어하여 핵산 함유 피검체로부터 핵산을 고순도로 빠르고 쉽게 분리할 수 있는 시스템 및 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 양태에 따른 전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템의 구성을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는 유체채널칩을 이용한 전자기파에 의한 자성나노입자의 포획실험을 진행하기 위한 실험장치의 구성을 개략적으로 보여주는 도이다.
도 3은 채널을 통과하며 자력의 영향을 받는 자성나노입자 용액의 모습을 보여주는 사진도이다.
도 4는 자력의 영향으로 바닥면에 회수분리된 자성나노입자의 모습을 채널의 측면에서 보여주는 사진도이다.
도 5는 자력의 영향으로 바닥면에 회수분리된 자성나노입자의 모습을 채널의 상부에서 보여주는 사진도이다.
도 7은 카트리지를 이용한 전자기파에 의한 자성나노입자의 포획실험을 진행하기 위한 실험장치의 구성을 개략적으로 보여주는 도이다.
도 8은 채널을 통과하며 자력의 영향을 받는 자성나노입자 용액의 모습을 보여주는 사진도이다.
도 9는 벽면에 자력의 영향으로 회수분리된 자성나노입자의 모습을 보여주는 사진도이다.
도 10은 채널을 통과하기 전의 자성나노입자 용액(좌), 및 채널을 통과한 뒤의 자성나노입자가 회수분리된 용액(우)의 모습을 보여주는 사진도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실험예 1: 유체채널칩을 이용한 전자기파에 의한 자성나노입자의 포획실험
전자기파에 의한 자성나노입자의 포획실험을 진행하기 위하여 도 2와 같이 실험장치를 설정한 뒤 하기와 같이 자성나노입자의 포획실험을 진행하였다.
먼저, 실리카 코팅이 되어있는 자성나노입자 용액(sicastar®-M, micromod, 독일) 1ml를 탈이온수 9ml와 혼합하여 10ml의 자성나노입자 용액을 만들었다. 실린지 펌프의 용액 부피를 10ml, 유체속도를 100ml/h, 실린지 직경을 15mm, 실린지 용량을 10ml로 설정해주었다. 실린지 펌프와 유체채널칩을 연결한 뒤 탈이온수를 실린지에 10ml 주입한 뒤 채널에 흘려 채널 내부를 세척해주었다. 실린지에 상기 자성나노입자 용액 10ml를 채운 다음 유체채널칩과 연결하였다. 90V에서 2000G 가량의 자력이 발생되는 전자석 구동 드라이버의 전압을 90V로 설정하였다. 실린지 펌프를 가동하여 유체채널칩 내부에 자성나노입자 용액을 흘려보내주었다. 이후 유체채널을 통과하는 자성나노입자 용액을 관찰하였다. 마지막으로 주입용액과 채널을 통과한 용액을 비교하였다.
그 결과를 도 3 내지 도 6에 나타내었다.
도 3은 채널을 통과하며 자력의 영향을 받는 자성나노입자 용액의 모습을 보여주는 사진도이다. 도 4는 자력의 영향으로 바닥면에 회수분리된 자성나노입자의 모습을 채널의 측면에서 보여주는 사진도이다. 도 5는 자력의 영향으로 바닥면에 회수분리된 자성나노입자의 모습을 채널의 상부에서 보여주는 사진도이다. 도 3 내지 도 5를 통해, 채널을 통과함에 따라서 자성나노입자가 자력의 영향으로 바닥면에 부착이되어 배수구쪽으로 진행될수록 그 색이 옅어지는 것을 확인할 수 있으며, 실린지펌프에서 주입이 끝난 뒤 채널 내부에 회수된 자성나노입자가 채널의 바닥면에 모여있는 것을 확인할 수 있다.
도 6은 채널을 통과하기 전의 자성나노입자용액(좌) 및 채널을 통과한 뒤의 자성나노입자가 회수분리된 용액(우)의 모습을 보여주는 사진도이다.
도 6을 통해, 실린지 펌프를 통해 주입했던 자성나노입자 용액과 배수구를 통해 배수된 용액을 비교해보면, 배수구를 통해 배수된 용액이 자성나노입자가 회수되어 투명하게 변한 것을 확인할 수 있다.
실험예 2: 카트리지를 이용한 전자기파에 의한 자성나노입자의 포획실험
도 7과 같이 카트리지 외부를 감싸는 형태로 전자석을 배열하기 위하여 전자석을 세개 지그를 이용하여 카트리지 외부에 위치시키고 각각 30V의 전압을 인가하여 하기와 같이 전자기파에 의한 자성나노입자의 포획실험을 진행하였다.
먼저, 실리카코팅이 되어있는 자성나노입자 용액(sicastar®-M, micromod, 독일) 1ml를 탈이온수 3ml와 혼합하여 4ml의 자성나노입자 용액을 만들었다. 실험용 카트리지 내부에 탈이온수를 10ml 주입한 뒤 채널에 흘려 채널 내부를 세척해주었다. 실린지에 상기 자성나노입자 용액 4ml를 채운 다음 실험용 카트리지와 결합하였다. 90V에서 2000G 가량의 자력이 발생되는 전자석 구동 드라이버의 전압을 30V로 설정하였다. 실린지를 작동하여 실험용 카트리지 내부에 자성나노입자 용액을 흘려보내주었다. 상기 카트리지 내부를 통과하는 자성나노입자 용액을 관찰하였다. 마지막으로, 주입용액과 채널을 통과한 용액을 비교하였다.
그 결과를 도 8 내지 도 10에 나타내었다.
도 8은 채널을 통과하며 자력의 영향을 받는 자성나노입자 용액의 모습을 보여주는 사진도이다. 도 9는 벽면에 자력의 영향으로 회수분리된 자성나노입자의 모습을 보여주는 사진도이다. 도 10은 채널을 통과하기 전의 자성나노입자 용액(좌), 및 채널을 통과한 뒤의 자성나노입자가 회수분리된 용액(우)의 모습을 보여주는 사진도이다. 도 8 내지 도 9를 통해, 카트리지 내부를 통과함에 따라서 자성나노입자가 자력의 영향으로 카트리지 내벽에 부착이 되어 배수구쪽으로 진행될수록 그 색이 옅어지는 것을 확인할 수 있으며, 실린지 펌프에서 주입이 끝난뒤 카트리지 내부에 회수된 자성나노입자가 카트리지 내벽에 모여있는 것을 확인할 수 있다. 도 10을 통해, 배수구를 통해 배수된 용액이 자성나노입자가 회수되어 용액이 실린지 펌프를 통해 주입했던 자성나노입자 용액에 비해 더욱 투명하게 변한 것을 확인할 수 있다.
실시예 1: 본 발명의 전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템 제작
도 1에 도시된 바와 같은 전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템을 제작하였다(펌프, 전자기파 발생 제어기, 펌프 제어기, 분리 시약 투입 수단 미도시). 이때 제1 마이크로 채널, 제2 마이크로 채널 및 제3 마이크로 채널의 폭은 각각 100 ㎛, 100 ㎛, 및 100 ㎛로 하고, 길이는 각각 480 ㎜, 480 ㎜ 및 480 ㎜로 하였다. 또한, 전자석을 베이스 플레이트(100)의 하측에 배치하고 30V의 전압을 가하여 전자기파를 발생시켰다. 베이스 플레이트(100)의 재질은 폴리카보네이트를 사용하였다.
실험예 3: 본 발명의 전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템을 이용한 핵산 추출
상기 실시예 1에서 제작한 전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템을 이용하여 하기와 같이 핵산 추출을 수행하였다.
본 실험예에서, 세포 용해제로는 1% SDS 및 10mM Tris(pH 7.4) 함유 용해 버퍼(lysis buffer)를 사용하고, 세척용액으로는 5M의 구아니딘 히드로클로라이드, 50mM의 트리스 히드로클로라이드, 100mM 염화나트륨, 및 70%의 이소프로필알콜로 구성되는 용액을 사용할 수 있다. 예컨대, 분리 시약으로는 pH는 8.0인 10mM의 트리스 히드로클로라이드 용액을 사용하였다. 한편, 실리카코팅이 되어있는 자성나노입자 용액(sicastar®-M, micromod, 독일) 30 ㎕를 탈이온수 1200 ㎕와 혼합하여 자성나노입자 용액을 만들어 사용하였다.
피검체로는 세포(SiHa, 한국세포주은행)를 함유하는 용액 300 ㎕를 사용하였고, 용해 버퍼는 500 ㎕, 세척용액은 1000 ㎕×2, 분리 시약은 100 ㎕를 사용하였다.
핵산 추출 공정은 세포 용해(Lysis), 핵산-자성나노입자 결합(Binding), 불순물 세척(Washing), 및 핵산-자성나노입자 분리에 따른 핵산 용출(Elution)의 단계로 수행하였다.
핵산 추출 시스템 내부 유체 이동은 실린지 펌프를 이용한 압력 부하와 PTFE 밸브를 이용하여 제어가 가능하다.
제4 챔버(114)에 세포를 함유하는 용액 300 ㎕와 세포 용해제를 투입하고 실린지 펌프로 가압하여 유체를 흘려주었다. 이때 제2 마이크로 채널(132)의 하측에 초음파 인가 장치를 두어 30W의 인터벌 출력으로 초음파를 가하여 세포 용해를 촉진시켰다.
이후 제5 챔버(115)에 세포 용해제에 의해 용해되어 세포로부터 용출된 핵산 함유 피검체를 임시 수용시켰다.
그 다음, 상기 핵산 함유 피검체를 제7 챔버(117)로 이동시키고 이를 제3 마이크로 채널(133)을 통해 제1 챔버(111)로 흘려주면서 동시에 제6 챔버(116) 내에 수용되어 있는 자성나노입자 용액을 제3 마이크로 채널(133)을 통해 제1 챔버(111)로 흘려주었다.
그 다음, 제1 챔버(111)에 수용된 핵산과 자성나노입자의 결합체가 형성된 제1 혼합 용액에 세척용액을 가하고 제1 전자기파 발생기(210)를 100W로 5분간 가동하면서 배수구(111a)를 열어 상기 자성나노입자와 결합되지 않은 상기 피검체 내의 물질들을 세척하여 제거하였다. 이러한 세척 과정을 2회 반복하였다.
그 다음 배수구(111a)를 닫고, 탈이온수 100 ㎕를 가한 후 이를 제2 챔버(112)로 이동시켰다. 상기 제2 챔버(112)에 분리 시약을 가하고 제2 챔버(112) 내에 수용된 유체를 제2 전자기파 발생기(220)를 100W로 5분간 가동하면서 제1 마이크로 채널(131)을 통해 제3 챔버(113)로 흘려주었다.
상기 방법으로 제3 챔버(113) 내에 분리된 핵산을 얻을 수 있음을 확인하였다.
100: 베이스 플레이트 101: 제1 서브 플레이트
102: 제2 서브 플레이트 103: 제3 서브 플레이트
111: 제1 챔버 112: 제2 챔버
113: 제3 챔버 114: 제4 챔버
115: 제5 챔버 116: 제6 챔버
117: 제7 챔버 111a: 배수구
131: 제1 마이크로 채널 132: 제2 마이크로 채널
133: 제3 마이크로 채널 210: 제1 전자기파 발생기
220: 제2 전자기파 발생기

Claims (13)

  1. 핵산 함유 피검체와 자성나노입자가 혼합되어 핵산과 자성나노입자의 결합체가 형성된 제1 혼합 용액이 투입되며 배수구(111a)를 가진 제1 챔버(111);
    상기 자성나노입자와 결합되지 않은 상기 피검체 내의 물질들을 상기 배수구(111a)를 통해 상기 제1 챔버(111)로부터 분리하는 과정에서, 상기 핵산과 자성나노입자의 결합체를 상기 제1 챔버(111)에 유지시키기 위한 전자기파를 상기 제1 챔버(111)에 제공하는 제1 전자기파 발생기(210);
    상기 제1 챔버(111)와 연결되며 상기 핵산과 자성나노입자의 결합체의 핵산과 자성나노입자의 분리를 위한 분리 시약이 투입되는 제2 챔버(112);
    상기 제2 챔버(112)에서 자성나노입자와 핵산이 분리되어진 제2 혼합 용액이 통과하는 제1 마이크로 채널(131);
    상기 제2 혼합 용액이 상기 제1 마이크로 채널(131)을 통과할 때 상기 자성나노입자를 상기 제1 마이크로 채널(131)에 잔류시키기 위한 전자기파를 상기 제1 마이크로 채널(131)에 제공하는 제2 전자기파 발생기(220); 및
    상기 제1 마이크로 채널(131)을 통과한 핵산을 수용하는 제3 챔버(113);
    를 포함하는, 전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 마이크로 채널(131)은 병렬 연결된 복수의 서브 채널로 구성되며, 상기 제2 전자기파 발생기(220)는 상기 서브 채널 각각에 전자기파를 제공하는,
    전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템.
  3. 제1항에 있어서,
    세포 함유 피검체와 세포 용해제가 투입되는 제4 챔버(114);
    상기 세포 함유 피검체와 상기 세포 용해제가 혼합된 용액이 지나가는 제2 마이크로 채널(132);
    상기 제2 마이크로 채널(132)의 후단에 연결되어 세포 용해제에 의해 용해되어 세포로부터 용출된 핵산 함유 피검체를 임시 수용하는 제5 챔버(115);
    상기 제5 챔버(115)로부터 상기 제1 챔버(111)에 연결시키는 제3 마이크로 채널(133); 및
    자성나노입자를 수용하며 상기 제3 마이크로 채널(133)의 전단에 연결된 제6 챔버(116);를 더 포함하는,
    전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제5 챔버(115)와 상기 제3 마이크로 채널(133) 사이에 배치되는 제7 챔버(117)를 더 포함하는,
    전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1 내지 제7 챔버 및 상기 제1 내지 제3 마이크로 채널이 형성된 베이스 플레이트(100)를 포함하는,
    전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 베이스 플레이트(100)는,
    상기 제4 챔버(114), 상기 제2 마이크로 채널(132), 및 상기 제5 챔버(115)가 형성된 제1 서브 플레이트(101);
    상기 제1 챔버(111), 상기 제6 챔버(116), 상기 제7 챔버(117) 및 상기 제3 마이크로 채널(133)이 형성된 제2 서브 플레이트(102); 및
    상기 제2 챔버(112), 상기 제3 챔버(113) 및 상기 제1 마이크로 채널(131)이 형성된 제3 서브 플레이트(103);로 구성된,
    전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 전자기파 발생기는 상기 베이스 플레이트(100)의 하측에 배치되는,
    전자기파를 이용한 핵산 추출 시스템.
  8. 핵산 함유 피검체와 자성나노입자를 혼합하여 핵산과 자성나노입자의 결합체가 형성된 제1 혼합 용액을 배수구(111a)를 가진 제1 챔버(111)에 투입시키는 제1단계;
    상기 제1 챔버(111)에 전자기파를 제공하면서 상기 자성나노입자와 결합되지 않은 상기 피검체 내의 물질들을 세척용액을 이용하여 상기 배수구(111a)를 통해 상기 제1 챔버(111)로부터 분리하는 제2단계;
    상기 핵산과 자성나노입자의 결합체에 분리 시약을 투입하여 핵산과 자성나노입자를 분리시켜 자성나노입자와 핵산이 분리되어진 제2 혼합 용액을 얻는 제3단계; 및
    제1 마이크로 채널(131)에 전자기파를 제공하면서 상기 제2 혼합 용액을 상기 제1 마이크로 채널(131)을 통과시켜 상기 자성나노입자를 상기 제1 마이크로 채널(131)에 잔류시키고 핵산을 통과시켜 제3 챔버(113)에 수용시키는 제4단계;
    를 포함하는, 전자기파를 이용한 핵산 추출 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제1단계 이전에
    세포 함유 피검체와 세포 용해제를 제4 챔버(114)에 투입하는 제a단계;
    상기 세포 함유 피검체와 상기 세포 용해제가 혼합된 용액을 제2 마이크로 채널(132)을 통해 통과시키는 제b단계; 및
    세포 용해제에 의해 용해되어 세포로부터 용출된 핵산 함유 피검체를 상기 제2 마이크로 채널(132)의 후단에 연결된 제5 챔버(115)에 수용시키는 제c단계;를 더 포함하는,
    전자기파를 이용한 핵산 추출 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 핵산 함유 피검체는 세포 유래인 것이 특징인 방법.
  11. 제3항에 있어서,
    상기 세포는 동물 세포, 식물 세포 또는 미생물 세포인 것이 특징인 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 자성나노입자는 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn), 비스무스(Bi) 및 아연(Zn)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 금속 또는 이들의 합금이거나 이들로부터 선택된 금속 산화물 또는 합금 산화물을 함유하는 것이 특징인 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 전자기파는 전자석에 전류를 흘려 발생시키는 것이 특징인 방법.
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