KR20200081909A - 핵산 추출장치 및 핵산 추출방법 - Google Patents

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Abstract

핵산 추출장치 및 핵산 추출방법에 대한 발명이 개시된다. 본 발명의 핵산 추출장치는: 자성나노입자와 병원체를 포함한 시료의 이동을 안내하는 관로를 구비하며 자기력에 의해 병원체를 시료에서 분리하여 농축시키는 농축부와, 농축부와 마주하는 위치에 설치되며 농축부에서 농축된 병원체를 전달받아 핵산으로 정제하는 정제부 및 농축부와 정제부를 연결하며 농축부에서 배출되는 병원체와 분리된 시료와 농축된 병원체의 이동경로를 서로 다른 방향으로 안내하는 밸브연결부를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

핵산 추출장치 및 핵산 추출방법{NUCLEIC ACID EXTRACTION DEVICE AND NUCLEIC ACID EXTRACTION METHOD}
본 발명은 핵산 추출장치 및 핵산 추출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자성입자 기반의 대용량 시료 내에 존재하는 낮은 농도의 병원체만을 시료 내 분자진단 저해요소로부터 단시간 내에 분리하여 농축시킨 후 농축된 시료로부터 핵산정제 및 추출이 가능한 일체형 장치를 제공하는 핵산 추출장치 및 핵산 추출방법에 관한 것이다.
일반적으로, 병원에서는 낮은 농도의 병원체 검출을 위해 채취된 환자의 시료를 최소 12시간 이상 배양한다. 그 후 배양된 시료는 원심분리기를 통해 병원체를 분리한 후 진단검사에 이용된다. 그러나 이러한 방법은 시간이 오래 걸리고 분자진단 저해요소의 완벽한 제거가 불가능하므로 분자진단 기반의 검출 민감도에 악영향을 미친다. 또한 채취한 시료(2-5 mL) 대비 실제 분자진단에 사용되는 양은 약 2μL 수준으로 모든 병원체들을 진단검사에 이용하기 어렵기 때문에 병원체의 농축기술이 필수적이다.
또한 병원체를 농축하는 장치와 농축된 병원체에서 핵산을 정제하는 장치 및 핵산을 추출하는 장치가 별도로 설치되므로 설치비용이 증가하는 문제점이 있다. 따라서 이를 개선할 필요성이 요청된다.
본 발명의 배경기술은 대한민국 공개특허공보 제2013-0101606호(2013.09.16 공개, 발명의 명칭: 초고속 핵산 추출 장치, 및 이를 이용하는 핵산 추출 방법)에 게시되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 개선하기 위해 창출된 것으로, 본 발명의 목적은 대용량 시료 내에 존재하는 낮은 농도의 병원체를 신속하게 분리하여 농축하여 핵산을 정제하여 핵산을 신속하게 추출할 수 있는 핵산 추출장치 및 핵산 추출방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 시료에서 병원체를 분리하여 농축하는 장치와, 농축된 병원체에서 핵산을 정제하여 추출하는 장치가 일체형으로 이루어져서 검출속도를 향상시킬 수 있으며, 모든 병원체를 진단검사에 이용하므로 검출민감도를 크게 개선시킬 수 있는 핵산 추출장치 및 핵산 추출방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 핵산 추출장치는: 자성나노입자와 병원체를 포함한 시료의 이동을 안내하는 관로를 구비하며 자기력에 의해 병원체를 시료에서 분리하여 농축시키는 농축부와, 농축부와 마주하는 위치에 설치되며 농축부에서 농축된 병원체를 전달받아 핵산으로 정제하는 정제부 및 농축부와 정제부를 연결하며 농축부에서 배출되는 병원체와 분리된 시료와 농축된 병원체의 이동경로를 서로 다른 방향으로 안내하는 밸브연결부를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 농축부는, 장착홈부를 구비하는 하우징부와, 장착홈부에 삽입되며 자기력을 발생시키는 자력공급부 및 자력공급부와 마주하는 하우징부의 내측에 설치되며 자성나노입자와 병원체를 포함한 시료를 공급받아 밸브연결부로 안내하는 안내관로부를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 자력공급부는 영구자석 또는 전자석인 것을 특징으로 한다.
또한 자력공급부는 하우징부와 정제부에 착탈 가능하게 설치되는 것을 특징으로 한다.
또한 자력공급부는 원기둥 형상으로 이루어지며, 안내관로부는 자력공급부와 같은 곡률을 이루며 곡선 방향으로 설치되는 것을 특징으로 한다.
또한 안내관로부는, 일측은 하우징부의 외측과 연통되며 타측은 하우징부의 내측으로 연장되는 유입관로와, 유입관로에 연결되며 자력공급부의 일측을 감싸는 형상으로 굽어지게 관로가 설치되는 제1곡선관로와, 자력공급부의 타측을 감싸는 형상으로 굽어지게 관로가 설치되며 밸브연결부와 연결되는 제2곡선관로 및 하우징부의 내측에 위치하며 제1곡선관로와 제2곡선관로를 연결하는 연결관로를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 정제부는, 밸브연결부와 연결되는 정제하우징부와, 정제하우징부의 내측에 위치하며 농축된 병원체에서 핵산을 정제하여 추출하는 공간을 형성하는 정제공간부와, 일측은 정제공간부와 연통되며 타측은 정제하우징부의 외측과 연통되고 정제공간부로 정제시약이 공급되는 통로를 형성하는 투입부와, 정제공간부와 정제하우징부의 외측을 연결하며 정제된 핵산을 배출시키는 통로를 형성하는 제1배출부 및 정제공간부와 정제하우징부의 외측을 연결하며 정제된 핵산 이외의 물질을 배출시키는 통로를 형성하는 제2배출부를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 정제공간부는, 상측은 넓고 하측은 좁은 단면적을 구비한 원추 형상의 내측공간을 형성하는 것을 특징으로 한다.
또한 정제부는, 정제하우징부의 하측에 위치하며 자기력을 공급하는 정제자력부를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 정제자력부는 영구자석 또는 전자석인 것을 특징으로 한다.
또한 밸브연결부는, 농축부와 정제부를 연결하는 연결하우징과, 연결하우징의 내측에 위치하며 농축부에서 배출되는 병원체를 정제부를 향한 방향으로 안내하는 제1관로와, 제1관로에서 분기되어 연결하우징의 외측과 연통되는 제2관로와, 제1관로와 제2관로가 연결되는 분기부에서 연장되어 정제공간부로 연장되는 제3관로 및 분기부에 설치되며 제2관로 또는 제3관로로 유체의 이동방향을 제어하는 밸브부를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 밸브부는, 연결하우징에 삽입되어 분기부에 위치하며 슬라이드 이동이 가능하게 설치되는 밸브몸체 및 밸브몸체를 관통하며 유체가 이동되는 유로를 형성하는 밸브관로부를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 밸브관로부는, 밸브몸체를 관통하며 제1관로와 제2관로를 연결하는 제1밸브관로 및 제1밸브관로와 이격된 위치에 설치되며 제1관로와 제3관로를 연결하는 제2밸브관로를 포함하며, 밸브몸체의 슬라이드 이동에 의해 제1밸브관로 또는 제2밸브관로가 제1관로에 연결되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 핵산 추출방법은: 병원체를 포함한 시료에 항체가 고정된 자성나노입자를 혼합하는 준비단계와, 병원체를 포함한 시료를 농축부로 공급하는 공급단계와, 농축부의 자력공급부에서 발생된 자기력에 의해 병원체와 자성나노입자가 시료에서 분리되어 농축되는 농축단계와, 자력공급부에서 발생된 자기력을 차단하고 정제부에 정제자력부를 설치한 후 농축된 병원체를 정제부로 이송시키는 이송단계와, 정제부로 이송된 병원체에서 핵산을 추출하는 추출단계 및 추출된 핵산을 정제하는 정제단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 농축단계는, 병원체와 분리된 시료가 밸브연결부를 통해 외측으로 배출되는 것을 특징으로 한다.
또한 이송단계는, 농축부에서 자기력의 공급을 차단한 후 워싱액을 공급하여 정제부로 농축된 병원체를 이송시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 핵산 추출장치 및 핵산 추출방법은, 대용량 시료 내에 존재하는 낮은 농도의 병원체를 자성을 이용하여 시료에서 신속하게 분리한 후 농축하여 정제부에서 핵산을 정제하여 분리할 수 있으므로 진단검사에 소요되는 비용과 시간을 절약할 수 있다.
또한 본 발명은 시료에서 병원체를 분리하여 농축하는 장치와, 농축된 병원체에서 핵산을 정제하여 추출하는 장치가 일체형으로 이루어져서 검출속도를 향상시킬 수 있으며, 모든 병원체를 진단검사에 이용하므로 검출민감도를 크게 개선시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출장치를 개략적으로 도시한 사시도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출장치의 내부를 개략적으로 도시한 사시도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 하우징부를 도시한 사시도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 하우징부의 내부를 개략적으로 도시한 사시도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 밸브연결부를 도시한 사시도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 자성나노입자가 병원체에 결합된 상태를 도시한 도면이다.
도 7과 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 자성나노입자와 병원체가 자력공급부의 외측에 농축되는 상태를 도시한 사시도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 밸브부를 통과한 시료가 제2관로를 통해 외측으로 배출되는 상태를 도시한 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 밸브부를 통과한 병원체가 제3관로를 향한 방향으로 이동되는 상태를 도시한 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 정제부에 농축된 병원체와 자성실리카입자가 있는 상태를 도시한 사시도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 자성실리카입자에 핵산과 결합되는 양이온가교가 연결된 상태를 도시한 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출장치에서 핵산이 추출되는 상태를 도시한 도면이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출장치에서 유량에 따른 병원체와 항체와 자성나노입자의 포집효율을 도시한 도면이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출장치의 검출민감도를 도시한 도면이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출장치의 성능 테스트를 도시한 도면이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출방법을 도시한 순서도이다.
이하 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출장치 및 핵산 추출방법를 설명한다. 이 과정에서 도면에 도시된 선들의 두께나 구성요소의 크기 등은 설명의 명료성과 편의상 과장되게 도시되어 있을 수 있다.
또한 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 이러한 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출장치를 개략적으로 도시한 사시도이며, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출장치의 내부를 개략적으로 도시한 사시도이며, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 하우징부를 도시한 사시도이며, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 하우징부의 내부를 개략적으로 도시한 사시도이며, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 밸브연결부를 도시한 사시도이며, 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 자성나노입자가 병원체에 결합된 상태를 도시한 도면이며, 도 7과 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 자성나노입자와 병원체가 자력공급부의 외측에 농축되는 상태를 도시한 사시도이며, 도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 밸브부를 통과한 시료가 제2관로를 통해 외측으로 배출되는 상태를 도시한 도면이며, 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 밸브부를 통과한 병원체가 제3관로를 향한 방향으로 이동되는 상태를 도시한 도면이며, 도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 정제부에 농축된 병원체와 자성실리카입자가 있는 상태를 도시한 사시도이며, 도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 자성실리카입자에 핵산과 결합되는 양이온가교가 연결된 상태를 도시한 도면이며, 도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출장치에서 핵산이 추출되는 상태를 도시한 도면이며, 도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출장치에서 유량에 따른 병원체와 항체와 자성나노입자의 포집효율을 도시한 도면이며, 도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출장치의 검출민감도를 도시한 도면이며, 도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출장치의 성능 테스트를 도시한 도면이다.
도 1 내지 도 16에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출장치(1)는, 자성나노입자(10)와 병원체(12)를 포함한 시료(14)의 이동을 안내하는 관로를 구비하며 자기력에 의해 병원체(12)를 혈액과 같은 시료(14)에서 분리하여 농축시키는 농축부(20)와, 농축부(20)와 마주하는 위치에 설치되며 농축부(20)에서 농축된 병원체(12)를 전달받아 핵산(16)으로 정제하는 정제부(30) 및 농축부(20)와 정제부(30)를 연결하며 농축부(20)에서 배출되는 병원체(12)와 분리된 시료(14)와 농축된 병원체(12)의 이동경로를 서로 다른 방향으로 안내하는 밸브연결부(40)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 대용량 시료(2-10 mL)(14) 내에 존재하는 낮은 농도의 병원체(12)를 시료(14)에서 신속하게 분리하여 농축시키며, 병원체(12)에서 핵산(16)을 추출하여 정제하는 장치 및 방법을 제공한다. 따라서 모든 병원체(12)를 진단검사에 이용하므로 검출민감도를 크게 개선하고 신속 진단검사가 가능하도록 할 수 있다.
핵산 추출장치(1)는 농축부(20)와 정제부(30)와 밸브연결부(40)가 일체로 이루어지며, 3D 프린터기 또는 사출 성형에 의해 생산된다. 핵산 추출장치(1)에서는 병원체(12)를 농축한 후, 농축된 병원체(12)를 정제부(30)로의 이송하며, 워싱(Washing) 과정을 포함한 핵산(16) 정제 및 추출과정으로 진행된다.
핵산(16)은 핵 속의 산성 물질이라는 뜻으로 DNA와 RNA를 핵산(16)이라고 한다. 핵산(16)은 수많은 뉴클레오타이드(nucleotide)가 연결되어 구성되며, 이러한 뉴클레오타이드는 핵산(16)을 이루는 기본 단위로 인산, 당, 염기의 세 부분으로 이루어진다.
DNA는 A,G,C,T 네가지의 뉴클레오티드로 구성된 폴리머(polymer) 복합체로, 음전하를 띠고 있는 생체 고분자 물질로 생명체의 유전정보를 담고 있는 유전물이다. 따라서 유전자의 구성, 내용, 성질 등을 분석하기 위해서는 1차적으로 고순도의 DNA가 먼저 분리되어야 한다. 세균인 병원체(12)가 용해되면서 핵산(16)이 나오며, 핵산(16)의 표면은 음전하를 띠고 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출장치(1)의 농축부(20)에서는 세균인 병원체(12)의 농축이 이루어지며, 농축된 병원체(12)는 밸브연결부(40)를 통과하여 정제부(30)로 이송된 후 핵산(16)인 DNA의 정제가 이루어진다.
농축부(20)는 자성나노입자(10)와 병원체(12)를 포함한 시료(14)의 이동을 안내하는 관로를 구비하며, 자기력에 의해 병원체(12)를 시료(14)에서 분리하여 농축시키는 기술사상 안에서 다양한 변형이 가능하다.
병원체(12)를 포함한 시료(14)에 혼합되는 자성나노입자(10)란 강자성을 띠는 입자로서 일반적으로 크기는 약 10nm이다. 이러한 자성나노입자(10)에 항체(18)가 결합되어 있으므로, 자성나노입자(10)를 시료(14)에 혼합하면 항체(18)가 병원체(12)에 연결된다.
농축부(20)는 각각 1개의 주입구와 배출구를 구비하며, 시료(14)의 이동을 안내하는 안내관로부(24)가 나선형상의 채널로 이루어진다. 일 실시예에 따른 농축부(20)는 하우징부(21)와 자력공급부(23)와 안내관로부(24)를 포함한다.
하우징부(21)는 자력공급부(23)가 설치되기 위한 장착홈부(22)를 구비하는 기술사상 안에서 다양한 형상으로 변형이 가능하다. 육면체 형상으로 이루어진 하우징부(21)에는 수평방향으로 장착홈부(22)가 구비되며, 이러한 장착홈부(22)에 자력공급부(23)가 착탈 가능하게 설치된다.
자력공급부(23)는 장착홈부(22)에 삽입되며, 자기력을 발생시키는 기술사상 안에서 다양한 종류의 자기력 공급장치가 사용될 수 있다. 일 실시예에 따른 자력공급부(23)는 영구자석 또는 전자석이며, 하우징부(21)와 정제부(30)에 고정된 상태로 설치되며, 필요에 따라 착탈 가능하게 설치될 수도 있다.
자력공급부(23)로 영구자석을 사용하는 경우, 자기력의 공급과 차단을 위해 자력공급부(23)는 하우징부(21)에 착탈 가능하게 설치된다. 그러나 자력공급부(23)로 전자석을 사용하는 경우, 자력공급부(23)로 공급되는 전원을 제어하여 자력공급부(23)의 자기력을 조절할 수 있으므로 자력공급부(23)는 하우징부(21)에 결합된 상태를 계속 유지할 수 있다.
일 실시예에 따른 자력공급부(23)는 원기둥 형상으로 이루어지며, 자력공급부(23)와 마주하는 위치에 설치되는 안내관로부(24)는 자력공급부(23)와 같은 곡률을 이루며 곡선 방향으로 설치된다.
안내관로부(24)는 자력공급부(23)와 마주하는 하우징부(21)의 내측에 설치되며, 자성나노입자(10)와 병원체(12)를 포함한 시료(14)를 공급받아 밸브연결부(40)로 안내한다. 일 실시예에 따른 안내관로부(24)는, 일측은 하우징부(21)의 외측과 연통되며 타측은 하우징부(21)의 내측으로 연장되는 유입관로(25)와, 유입관로(25)에 연결되며 자력공급부(23)의 일측(도 2기준 우측)을 감싸는 형상으로 굽어지게 관로가 설치되는 제1곡선관로(26)와, 자력공급부(23)의 타측(도 2기준 좌측)을 감싸는 형상으로 굽어지게 관로가 설치되며 밸브연결부(40)와 연결되는 제2곡선관로(27) 및 하우징부(21)의 내측에 위치하며 제1곡선관로(26)와 제2곡선관로(27)를 연결하는 연결관로(28)를 포함한다.
일 실시예에 따른 제1곡선관로(26)와 제2곡선관로(27)는 원호 형상의 곡선을 따라 설치된다. 나선 형태로 이루어진 안내관로부(24)의 중심부에는 원형의 영구자석인 자력공급부(23)가 위치하며, 자력공급부(23)의 자기장이 가장 강한 부분으로 안내관로부(24)가 지나간다.
정제부(30)는 농축부(20)와 마주하는 위치에 설치되며, 농축부(20)에서 농축된 병원체(12)를 전달받아 핵산(16)으로 정제하는 기술사상 안에서 다양한 형상으로 변형될 수 있다. 정제부(30)는 원뿔의 챔버 형상과, 2개의 주입구 및 2개의 배출구를 포함한다.
일 실시예에 따른 정제부(30)는, 밸브연결부(40)와 연결되는 정제하우징부(31)와, 정제하우징부(31)의 내측에 위치하며 농축된 병원체(12)에서 핵산(16)을 정제하여 추출하는 공간을 형성하는 정제공간부(32)와, 일측은 정제공간부(32)와 연통되며 타측은 정제하우징부(31)의 외측과 연통되고 정제공간부(32)로 정제시약이 공급되는 통로를 형성하는 투입부(33)와, 정제공간부(32)와 정제하우징부(31)의 외측을 연결하며 정제된 핵산(16)을 배출시키는 통로를 형성하는 제1배출부(34) 및 정제공간부(32)와 정제하우징부(31)의 외측을 연결하며 정제된 핵산(16) 이외의 물질을 배출시키는 통로를 형성하는 제2배출부(35)를 포함한다.
정제공간부(32)는, 상측은 넓고 하측은 좁은 단면적을 구비한 원추 형상의 내측공간을 정제하우징부(31)의 내측에 형성한다.
또한 정제부(30)는, 정제하우징부(31)의 하측에 위치하며 자기력을 공급하는 정제자력부(36)를 더 포함한다. 정제자력부(36)는 영구자석 또는 전자석인 것을 특징으로 하며, 정제공간부(32)와 마주하는 정제하우징부(31)의 하측에 고정되거나 착탈 가능하게 설치될 수 있다.
밸브연결부(40)는 농축부(20)와 정제부(30)를 연결하며, 농축부(20)에서 배출되는 병원체(12)와 분리된 시료(14) 및 농축된 병원체(12)의 이동경로를 서로 다른 방향으로 안내하는 기술사상 안에서 다양한 변형이 가능하다.
일 실시예에 따른 밸브연결부(40)는, 농축부(20)와 정제부(30)를 연결하는 연결하우징(41)과, 연결하우징(41)의 내측에 위치하며 농축부(20)에서 배출되는 병원체(12)를 정제부(30)를 향한 방향으로 안내하는 제1관로(42)와, 제1관로(42)에서 분기되어 연결하우징(41)의 외측과 연통되는 제2관로(43)와, 제1관로(42)와 제2관로(43)가 연결되는 분기부(46)에서 연장되어 정제공간부(32)로 연장되는 제3관로(44) 및 분기부(46)에 설치되며 제2관로(43) 또는 제3관로(44)로 유체의 이동방향을 제어하는 밸브부(50)를 포함한다.
제1관로(42)의 일측은 안내관로부(24)의 제2곡선관로(27)와 연결되며 제1관로(42)의 타측은 분기부(46)에 연결된다. 제3관로(44)의 일측은 분기부(46)에 연결되며 제3관로(44)의 타측은 정제공간부(32)에 연결된다.
밸브부(50)는 연결하우징(41)의 외측으로 이동되거나, 연결하우징(41)의 내측으로 이동되는 동작에 의해 제1관로(42)와 연결된 유로의 방향이 바뀐다. 농축부(20)의 농축과정 중에는 불순물을 배출하는 제2관로(43)와 제1관로(42)를 연결시키므로 분자진단 저해인자인 불순물을 핵산 추출장치(1)의 외측으로 배출시킨다. 농축된 병원체(12)가 정제부(30)로 이송될 때는, 밸브부(50)가 수평방향으로 이동되어 제1관로(42)와 제3관로(44)를 연결시키므로 농축된 병원체(12)가 정제부(30)로 이동된다.
일 실시예에 따른 밸브부(50)는, 연결하우징(41)에 삽입되어 분기부(46)에 위치하며 슬라이드 이동이 가능하게 설치되는 밸브몸체(51) 및 밸브몸체(51)를 관통하며 유체가 이동되는 유로를 형성하는 밸브관로부(52)를 포함한다.
이러한 밸브관로부(52)는, 밸브몸체(51)를 관통하며 제1관로(42)와 제2관로(43)를 연결하는 제1밸브관로(53) 및 제1밸브관로(53)와 이격된 위치에 설치되며 제1관로(42)와 제3관로(44)를 연결하는 제2밸브관로(54)를 포함한다. 제1밸브관로(53)는 "ㄴ"자 형상의 관로이며, 제2밸브관로(54)는 일자 형상의 관로이다.
제1밸브관로(53)와 제2밸브관로(54)는 밸브몸체(51)의 길이방향을 따라 이격된 상태로 설치되므로, 밸브몸체(51)의 슬라이드 이동에 의해 제1밸브관로(53) 또는 제2밸브관로(54)가 제1관로(42)에 연결되어 유체의 이동방향을 제어할 수 있다. 또한 다른 실시예에 따른 밸브부(50)로 솔레노이드 밸브를 포함하여 다양한 종류의 밸브가 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출장치(1)를 통해 채취된 시료(14) 내에 존재하는 모든 병원체(12)들을 농축한 후 핵산(16)을 정제하는 과정을 통해 모든 병원체(12)를 진단검사에 활용이 가능하므로 검출 민감도를 획기적으로 개선할 수 있다.
도 14에 도시된 바와 같이, 핵산 추출장치(1)로 공급되는 시료(14)의 속도가 5 mL/min, 10 mL/min의 유량에서도 80%이상의 입자 포집 효율을 확인할 수 있으므로, 농축부(20)에서 단시간 내에 대용량 시료(14)를 처리할 수 있음을 알 수 있다.
도 15와 도 16은 대장균 O157:H7균을 1mL 전혈 내 spike하여, 병원체(12)의 농도에 따라 본 장치를 통한 전처리 후, qPCR을 통해 검출민감도를 확인하고, ThermoFisher 그리고 Bioneer에서 판매중인 전처리 kit 제품과의 성능비교를 진행한 결과이다.
도 15는 전혈 1mL 내 대장균 O157:H7 농도에 따른 병원체(12) 농축 및 핵산정제 후 qPCR을 통한 검출민감도를 확인한 결과이다. 그리고 도 16은 전혈 1 mL 내 대장균 O157:H7균을 이용한 상용 제품 성능 테스트를 표로 도시한 결과이다.
도 15와 도 16에 도시된 바와 같이, 기존 상용제품의 경우 핵산(16)증폭검사 후 1000CFU에서도 검출이 불가능한 것을 확인하였으며, 본 발명에 의한 핵산 추출장치(1)에서는 전혈 내 1mL에서 100 CFU까지 검출민감도 개선이 가능함을 알 수 있다.
이하에서는 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출장치(1) 및 핵산(16) 추출방법의 작동상태를 상세히 설명한다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산(16) 추출방법을 도시한 순서도이다.
도 1 내지 도 17에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산(16) 추출방법은, 병원체(12)를 포함한 시료(14)에 항체(18)가 고정된 자성나노입자(10)를 혼합하는 준비단계를 갖는다.(S10)
핵산(16)의 농축 및 분리를 위해서, 자성나노입자(10)의 표면에 항체(18)를 결합시킨 항체(18)-자성나노입자(10)를 합성 후 병원체(12)가 들어있는 시료(14)와 혼합한다. 이 때 시료(14) 내의 병원체(12)들은 자성나노입자(10)의 표면의 항체(18)에 결합된다. 그리고 밸브부(50)의 제1밸브관로(53)가 제1관로(42)와 제2관로(43)에 연결되도록 밸브부(50)를 이동시킨다.
그리고 병원체(12)를 포함한 시료(14)를 농축부(20)로 공급하는 공급단계를 갖는다.(S20) 농축부(20)의 유입관로(25)를 통해 병원체(12)를 포함한 시료(14)가 공급된다. 농축부(20)의 안내관로부(24)에 병원체(12)를 포함한 시료(14)를 공급하며, 이때 튜빙펌프를 이용하여 시료(14)를 공급한다.
그리고 농축부(20)의 자력공급부(23)에서 발생된 자기력에 의해 병원체(12)와 자성나노입자(10)가 시료(14)에서 분리되어 농축되는 농축단계를 갖는다.(S30) 영구자석이 위치한 자력공급부(23)의 외측을 지나가는 시료(14)에서 자성나노입자(10)가 자력공급부(23)와 마주하는 안내관로부(24)의 내측에 농축된다.
병원체(12)를 포함한 시료(14)는 5 mL/min의 조건으로 공급되며, 나선구조 채널인 안내관로부(24)를 따라 이동되는 시료(14)에서 병원체(12)와 결합된 자성나노입자(10)가 제1곡선관로(26) 또는 제2곡선관로(27)에 적층되어 병원체(12)의 농축과정이 진행된다.
이러한 농축단계에서 병원체(12)와 분리된 시료(14)는 밸브연결부(40)를 통해 밸브연결부(40)의 외측으로 배출된다. 이때 밸브연결부(40)의 밸브부(50)에 구비된 제1밸브관로(53)는 제1관로(42)와 제2관로(43)를 연결시키므로, 병원체(12)와 분리된 시료(14)가 정제부(30)를 향한 방향으로 이동됨을 차단하고 분자진단 저해요소들을 핵산 추출장치(1)의 외측으로 배출시킨다.
그리고 자력공급부(23)에서 발생된 자기력을 차단하고 정제부(30)에 정제자력부(36)를 설치한 후 농축된 병원체(12)를 정제부(30)로 이송시키는 이송단계를 갖는다.(S40)
농축부(20)에 고정된 자석인 자력공급부(23)를 제거하거나, 전자석인 자력공급부(23)의 동작을 정지시키므로 자성나노입자(10)와 병원체(12)는 이동이 가능한 상태가 된다. 그리고 1mL의 인산완충식염수(phosphate buffered saline;PBS)를 이용하여 농축된 병원체(12)와 자성나노입자(10)를 정제부(30)를 향한 방향으로 이동시킨다.
이때 밸브연결부(40)의 밸브부(50)에 구비된 제2밸브관로(54)는 제1관로(42)와 제3관로(44)를 연결시키므로 자성나노입자(10)와 병원체(12)는 정제공간부(32)의 내측으로 이동된다. 그리고 정제부(30)의 중앙 하측에는 자기력을 공급하는 정제자력부(36)가 설치되므로 농축된 병원체(12)와 자성나노입자(10)는 정제공간부(32)의 중앙에 모이게 된다.
PBS는 phosphate buffer로 생물학 관련 실험에서 가장 많이 쓰이는 buffer이며 완충용액으로 사용된다. 완충용액은 외부로부터 어느 정도의 산 또는 염기를 가해도 그것들의 영향을 받지 않고, 수소이온농도를 일정하게 유지하려고 하는 용액이다.
또한 이송단계는, 농축부(20)에서 자기력의 공급을 차단한 후 워싱액을 공급하여 정제부(30)로 농축된 병원체(12)를 이송시키는 기술사상 안에서 인산완충식염수 외에 다른 용액을 사용할 수도 있다.
그리고 정제부(30)로 이송된 병원체(12)에서 핵산(16)을 추출하는 추출단계를 갖는다.(S50) 정제부(30)의 투입부(33)를 통해 100μL의 Lysis buffer와 100μL의 Binding buffer를 공급한다.
Lysis buffer는 세포 화합물을 분석하는 분자 생물학 실험에 사용하기 위해 개방형 세포를 파괴할 때 사용되는 완충액이다. 대부분의 용해 완충액은 용해물의 산도 및 삼투압을 조절하기 위해 염을 함유한다. 때로는 세제(예: Triton X-100 또는 SDS)를 첨가하여 막 구조를 해체 할 수도 있으며, 이러한 용해 완충액은 동물과 식물의 조직 세포 모두에서 사용할 수 있다. Lysis buffer는 자성나노입자(10)에 결합된 병원체(12)를 용해하여 핵산(16)을 분리하기 위해 사용된다.
Binding buffer는 이후 정제공간부(32)에 공급될 자성실리카입자(19)와 핵산(16)이 결합할 수 있도록 하는 버퍼기능을 한다.
그리고 주입부를 통해 10μL의 Proteinase K와 5μL의 RNase A를 주입한다. Proteinase K는 핵산(16)의 정제 효율을 높이기 위한 시약으로 단백질 분해효소이다. Proteinase K는 DNA에 붙어있는 histone 단백질을 제거하는 역할을 한다. DNA에는 히스톤 단백질이 붙어 있어서 안정성을 유지한다. 그래서 Proteinase K를 넣어주면 DNA를 뽑을때 Purity가 떨어지는 것이다.
RNase(리보 핵산 분해 효소)는 RNA를 자르는데 사용되는 효소이다. DNA정제에 RNase가 쓰이는 이유는 보통 DNA를 뽑으면 RNA도 같은 원리로 뽑혀져 나오며, 필요한 것은 DNA이므로 필요없는 RNA를 잘라서 없애기 위해서 RNase를 공급하므로 순수한 DNA를 얻을 수 있다.
그리고 상온에서 2분간 온도를 일정하게 유지하며 incubation을 한 후 25μL의 자성실리카입자(19)와 200μL의 아이소프로판올(isopropanol)을 기기에 주입한 후 5분 간 vortex를 진행한다.
이 과정으로 농축된 병원체(12)를 용해시켜 핵산(16)이 추출되며 추출된 핵산(16)은 양이온가교(cation bridge)(17)로 인해 자성실리카입자(19)와 정전기적 결합 형태로 결합한다. 양이온가교(17)는 양이온을 띠며, 자성실리카입자(19)와 핵산(16)은 음이온을 띠므로 양이온가교(17)의 양측에 자성실리카 입자와 핵산(16)이 결합된다.
아이소프로판올은 프로판올의 이성질체인 지방족 포화알코올이다. vortex를 하는 이유는 DNA 정제를 위해 공급된 물질과 효과가 잘 섞기 위해서 시행한다.
아이소프로판올과 에탄올(ethanol)은 동일한 알콜류로서, 염(salt)으로 인해서 중화된 DNA의 침전효율을 증가시키기 위해 사용된다.
그리고 정제부(30) 하측에 부착된 정제자력부(36)를 제거한 후 투입부(33)와 제1배출부(34)와 제2배출부(35)의 관로를 막은 후 5분간 vortex를 진행한다.
그리고 불순물을 배출하기 위한 제1배출부(34)를 오픈하고 약제를 공급하기 위한 투입부(33)도 오프하며, 정제부(30) 하측으로 정제자력부(36)를 이동시킨다.
그리고 추출된 핵산(16)을 정제하는 정제단계를 갖는다.(S60) 투입부(33)를 통해 350μL의 워싱 버퍼를 주입하는 과정을 3번 반복하며 정제공간부(32)에 있는 불순물은 제1배출부(34)를 통해 모두 배출된다. 그리고 정제공간부(32)에 있는 내부유체를 제거하는 동작을 3번 반복한다.
그리고 주입부를 통해 정제공간부(32)로 100μL의 용출 완충액(elution buffer)을 공급하며, 투입부(33)와 제1배출부(34)와 제2배출부(35)는 차단하고 정제부(30) 하측에 있는 정제자력부(36)를 정제하우징부(31)와 떨어진 곳으로 이동시킨다.
그리고 히터로 65℃의 온도로 5분간 정제공간부(32)를 가열한 후, 핵산(16)을 자성실리카입자(19)로부터 분리시킨다. 분리한 액상 시료(14)를 얻게 되면 제2배출부(35)를 통해 정제부(30)의 외측으로 배출시킨다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 대용량 시료(14) 내에 존재하는 낮은 농도의 병원체(12)를 자성을 이용하여 시료(14)에서 신속하게 분리한 후 농축하여 정제부(30)에서 핵산(16)을 정제하여 분리할 수 있으므로 진단검사에 소요되는 비용과 시간을 절약할 수 있다. 또한 시료(14)에서 병원체(12)를 분리하여 농축하는 장치와, 농축된 병원체(12)에서 핵산(16)을 정제하여 추출하는 장치가 일체형으로 이루어져서 검출속도를 향상시킬 수 있으며, 모든 병원체(12)를 진단검사에 이용하므로 검출민감도를 크게 개선시킬 수 있다.
그리고 본 발명은 병원체(12)를 포함한 시료(14)가 안내관로부(24)를 따라 자력공급부(23)의 주변을 이동할 때 자기력의 영향을 계속 받으며 병원체(12)가 농축될 수 있도록 설계되므로, 자성나노입자(10)와 결합된 시료(14)가 5 mL/min 이상의 빠른 유량에서도 90% 이상 병원체(12)를 분리할 수 있다.
또한 농축부(20)와 정제부(30)의 이원화 구조를 통해 병원체(12)가 분리된 시료(14)와 불순물이 정제부(30)로 이동되지 않고 밸브연결부(40)를 통해 외측으로 배출되므로, 핵산정제에 사용되는 자성실리카입자(19) 표면이 임상검체에 오염이 되어 정제 효율이 감소됨을 방지할 수 있다. 그리고 농축된 병원체(12)를 정제부(30)로 이송한 후 병원체(12)에서 바로 핵산(16)을 분리하여 정제하므로 핵산증폭기법의 검출 민감도를 크게 개선할 수 있다.
또한 병원체(12) 농축 및 핵산정제를 단일 장치에서 할 수 있으며, 대용량 시료(14)에서 단시간 내에 병원체(12)를 분리 및 농축하여 분자진단 저해요소를 제거할 수 있으며, 핵산(16)의 정제 과정을 통해 기존 상용 제품에 비해 핵산증폭기법의 검출 민감도를 100배 이상 상승시켜 검사의 정확도를 향상시킬 수 있다.
본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 하여 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 아래의 특허청구범위에 의해서 정하여져야 할 것이다.
1: 핵산 추출장치 10: 자성나노입자
12: 병원체 14: 시료
16: 핵산 17: 양이온가교
18: 항체 19: 자성실리카입자
20: 농축부 21: 하우징부
22: 장착홈부 23: 자력공급부
24: 안내관로부 25: 유입관로
26: 제1곡선관로 27: 제2곡선관로
28: 연결관로 30: 정제부
31: 정제하우징부 32: 정제공간부
33: 투입부 34: 제1배출부
35: 제2배출부 36: 정제자력부
40: 밸브연결부 41: 연결하우징
42: 제1관로 43: 제2관로
44: 제3관로 46: 분기부
50: 밸브부 51: 밸브몸체
52: 밸브관로부 53: 제1밸브관로
54: 제2밸브관로 S10: 준비단계
S20: 공급단계 S30: 농축단계
S40: 이송단계 S50: 추출단계
S60: 정제단계

Claims (16)

  1. 자성나노입자와 병원체를 포함한 시료의 이동을 안내하는 관로를 구비하며, 자기력에 의해 병원체를 시료에서 분리하여 농축시키는 농축부;
    상기 농축부와 마주하는 위치에 설치되며, 상기 농축부에서 농축된 병원체를 전달받아 핵산으로 정제하는 정제부; 및
    상기 농축부와 상기 정제부를 연결하며, 상기 농축부에서 배출되는 병원체와 분리된 시료 및 농축된 병원체의 이동경로를 서로 다른 방향으로 안내하는 밸브연결부;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출장치.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 농축부는,
    장착홈부를 구비하는 하우징부;
    상기 장착홈부에 삽입되며 자기력을 발생시키는 자력공급부; 및
    상기 자력공급부와 마주하는 상기 하우징부의 내측에 설치되며, 상기 자성나노입자와 병원체를 포함한 시료를 공급받아 상기 밸브연결부로 안내하는 안내관로부;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출장치.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 자력공급부는,
    영구자석 또는 전자석인 것을 특징으로 하는 핵산 추출장치.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 자력공급부는,
    상기 하우징부와 상기 정제부에 착탈 가능하게 설치되는 것을 특징으로 하는 핵산 추출장치.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 자력공급부는 원기둥 형상으로 이루어지며, 상기 안내관로부는 상기 자력공급부와 같은 곡률을 이루며 곡선 방향으로 설치되는 것을 특징으로 하는 핵산 추출장치.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 안내관로부는,
    일측은 상기 하우징부의 외측과 연통되며 타측은 상기 하우징부의 내측으로 연장되는 유입관로;
    상기 유입관로에 연결되며, 상기 자력공급부의 일측을 감싸는 형상으로 굽어지게 관로가 설치되는 제1곡선관로;
    상기 자력공급부의 타측을 감싸는 형상으로 굽어지게 관로가 설치되며 상기 밸브연결부와 연결되는 제2곡선관로; 및
    상기 하우징부의 내측에 위치하며 상기 제1곡선관로와 상기 제2곡선관로를 연결하는 연결관로;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출장치.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 정제부는,
    상기 밸브연결부와 연결되는 정제하우징부;
    상기 정제하우징부의 내측에 위치하며, 농축된 병원체에서 핵산을 정제하여 추출하는 공간을 형성하는 정제공간부;
    일측은 상기 정제공간부와 연통되며 타측은 상기 정제하우징부의 외측과 연통되고, 상기 정제공간부로 정제시약이 공급되는 통로를 형성하는 투입부;
    상기 정제공간부와 상기 정제하우징부의 외측을 연결하며, 정제된 핵산을 배출시키는 통로를 형성하는 제1배출부; 및
    상기 정제공간부와 상기 정제하우징부의 외측을 연결하며, 정제된 핵산 이외의 물질을 배출시키는 통로를 형성하는 제2배출부;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출장치.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 정제공간부는,
    상측은 넓고 하측은 좁은 단면적을 구비한 원추 형상의 내측공간을 형성하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출장치.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 정제부는,
    상기 정제하우징부의 하측에 위치하며 자기력을 공급하는 정제자력부;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출장치.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 정제자력부는,
    영구자석 또는 전자석인 것을 특징으로 하는 핵산 추출장치.
  11. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 밸브연결부는,
    상기 농축부와 상기 정제부를 연결하는 연결하우징;
    상기 연결하우징의 내측에 위치하며, 상기 농축부에서 배출되는 병원체를 상기 정제부를 향한 방향으로 안내하는 제1관로;
    상기 제1관로에서 분기되어 상기 연결하우징의 외측과 연통되는 제2관로;
    상기 제1관로와 상기 제2관로가 연결되는 분기부에서 연장되어 상기 정제공간부로 연장되는 제3관로; 및
    상기 분기부에 설치되며, 상기 제2관로 또는 상기 제3관로로 유체의 이동방향을 제어하는 밸브부;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출장치.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 밸브부는,
    상기 연결하우징에 삽입되어 상기 분기부에 위치하며, 슬라이드 이동이 가능하게 설치되는 밸브몸체; 및
    상기 밸브몸체를 관통하며 유체가 이동되는 유로를 형성하는 밸브관로부;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출장치.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 밸브관로부는,
    상기 밸브몸체를 관통하며 상기 제1관로와 상기 제2관로를 연결하는 제1밸브관로; 및
    상기 제1밸브관로와 이격된 위치에 설치되며, 상기 제1관로와 상기 제3관로를 연결하는 제2밸브관로;를 포함하며,
    상기 밸브몸체의 슬라이드 이동에 의해 상기 제1밸브관로 또는 상기 제2밸브관로가 상기 제1관로에 연결되는 것을 특징으로 하는 핵산 추출장치.
  14. 병원체를 포함한 시료에 항체가 고정된 자성나노입자를 혼합하는 준비단계;
    병원체를 포함한 시료를 농축부로 공급하는 공급단계;
    상기 농축부의 자력공급부에서 발생된 자기력에 의해 병원체와 상기 자성나노입자가 시료에서 분리되어 농축되는 농축단계;
    상기 자력공급부에서 발생된 자기력을 차단하고 정제부에 정제자력부를 설치한 후 농축된 병원체를 상기 정제부로 이송시키는 이송단계;
    상기 정제부로 이송된 병원체에서 핵산을 추출하는 추출단계; 및
    추출된 핵산을 정제하는 정제단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 농축단계는,
    상기 병원체와 분리된 시료가 밸브연결부를 통해 외측으로 배출되는 것을 특징으로 하는 핵산 추출방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 이송단계는,
    상기 농축부에서 자기력의 공급을 차단한 후 워싱액을 공급하여 상기 정제부로 농축된 병원체를 이송시키는 것을 특징으로 하는 핵산 추출방법.
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