KR20170048730A - 다수의 리간드가 치환된 산화 그래핀 나노입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

다수의 리간드가 치환된 산화 그래핀 나노입자 및 이의 제조방법 Download PDF

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KR20170048730A
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Abstract

본 발명은 산화 그래핀 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로 산화 나노그래핀의 표면에, [화학식 1]로 표시되는 트리블록 공중합체, 양 말단이 R1으로 치환된 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체 및 양 말단이 R2로 치환된 [화학식 3]로 표시되는 트리블록 공중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 공중합체가 포함된 코팅층이 형성됨으로써, 종양 부위에 대한 능동적 표적지향 능력이 향상되어 종양 부위로 산화 그래핀 나노입자의 축적량이 증가되며, 이로 인하여 우수한 광열 치료 효과로 종양을 괴사시킬 수 있다.

Description

다수의 리간드가 치환된 산화 그래핀 나노입자 및 이의 제조방법{Nanographene Oxide Labeled With Several Ligands and Preparation Method Thereof}
본 발명은 종양 부위에 대한 능동적 표적지향 능력이 향상되어 종양 부위로 산화 그래핀 나노입자의 축적량이 증가되며, 이로 인하여 우수한 광열 치료 효과로 종양을 괴사시킬 수 있는 종양 진단 또는 치료용 산화 그래핀 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
정상 조직에서는 화학요법 약물의 비특이적 분포가 전신에 독성을 유발하는 등 바람직하지 않은 부작용을 초래한다. 이러한 부작용은 약물이 종양 부위로 정확히 전달되지 못하여 치료의 효능이 감소되기 때문이다.
지난 10년 동안, 나노입자는 우수한 침투 및 유지(EPR) 효과를 통해 종양 조직에 수동적으로 축적될 수 있었기 때문에 유망한 약물전달 매개체로 보고되었다(N. Bertrand , J. Wu , X. Xu , N. Kamaly and O. C. Farokhzad , Adv . Drug Deliv . Rev., 2014, 66, 2.; H. Maeda , J. Wu , T. Sawa , Y. Matsumura and K. Hori, J. Controlled Release, 2000, 65, 271.)
그러나 수동 표적의 효율은 종양의 종류 또는 상태에 따라 달리지는 종양 조직 신생 혈관의 정도에 따라 제한되었다(D. Peer, J. M. Karp , S. Hong, O. C. Farokhzad , R. Margalit and R. Langer , Nat. Nanotechnol., 2007, 2, 751.).
이러한 한계를 극복하기 위하여, 표적 세포에 특이적으로 결합하는 표적화된 리간드로 표면이 치환된 나노입자가 제조되었다(N. Bertrand , J. Wu , X. Xu , N. Kamaly and O. C. Farokhzad , Adv . Drug Deliv . Rev., 2014, 66, 2.; T. M. Allen, Nat. Rev. Cancer, 2002, 2, 750.; J. Y. Yhee , S. Lee and K. Kim, Nanoscale 2014, 6, 13383.). 상기 나노입자는 종양 세포에 과발현되는 특이 수용체와 상호작용하는 다양한 종양 표적화된 리간드와 결합된다. 그러나 이러한 활성 표적화의 결과는 우수하지 못하여 생체 내(in vivo)에서 평가될 수 없었다.
단일 리간드가 치환된 나노입자의 효율은 수용체 포화로 알려진 현상 때문에 바람직하지 않다(G. Kibria, H. Hatakeyama , N. Ohga , K. Hida and H. Harashima , J. Controlled Release, 2011, 153, 141.).
활성 표적화된 효과를 향상시키기 위하여, 연구자들은 유전 물질의 강한 축적 및 효율적인 전달을 위해 세포 표면에 하나 이상의 수용체로 바이러스를 동시에 표적하는 자연으로부터 영감을 얻었다(Y. Nie , D. Schaffert , W. Rdl , M. Ogris , E. Wagner and M. Gnther , J. Controlled Release, 2011, 152, 127.).
한편, 산화 나노그래핀(nGO)은 종양 조직에 약물을 전달할 수 있을 뿐만 아니라 종양 세포를 선택적으로 표적화하는 리간드가 치환될 수 있다.
종래에는 엽산으로 치환된 산화 나노그래핀의 종양 표적화 특성이 보고되었다(J. H. Lee, A. Sahu , C. Jang and G. Tae, J. Controlled Release, 2015, 209, 219.). 상기 문헌에서는 산화 나노그래핀의 표면을 코팅하는 동안 엽산이 결합된 플루로닉 및 치환되지 않은 플루로닉의 혼합비를 조절함으로써 엽산 리간드의 밀도를 제어하였다.
그러나 상이한 2종 이상의 리간드를 산화 나노그래핀의 표면에 코팅하여 리간드 밀도를 제어할 뿐만 아니라 2종 이상의 리간드에 의해 상승 효과를 보이는 산화 나노그래핀에 대해서는 보고되지 않았다.
1. N. Bertrand, J. Wu, X. Xu, N. Kamaly and O. C. Farokhzad, Adv. Drug Deliv. Rev., 2014, 66, 2. 2. H. Maeda, J. Wu, T. Sawa, Y. Matsumura and K. Hori, J. Controlled Release, 2000, 65, 271. 3. D. Peer, J. M. Karp, S. Hong, O. C. Farokhzad, R. Margalit and R. Langer, Nat. Nanotechnol., 2007, 2, 751. 4. N. Bertrand, J. Wu, X. Xu, N. Kamaly and O. C. Farokhzad, Adv. Drug Deliv. Rev., 2014, 66, 2. 5. T. M. Allen, Nat. Rev. Cancer, 2002, 2, 750. 6. J. Y. Yhee, S. Lee and K. Kim, Nanoscale 2014, 6, 13383. 7. G. Kibria, H. Hatakeyama, N. Ohga, K. Hida and H. Harashima, J. Controlled Release, 2011, 153, 141. 8. Y. Nie, D. Schaffert, W. Rdl, M. Ogris, E. Wagner and M. Gnther, J. Controlled Release, 2011, 152, 127. 9. J. H. Lee, A. Sahu, C. Jang and G. Tae, J. Controlled Release, 2015, 209, 219.
본 발명의 목적은 종양 부위에 대한 능동적 표적지향 능력이 향상되어 종양 부위로 산화 그래핀 나노입자의 축적량이 증가되며, 이로 인하여 우수한 광열 치료 효과로 종양을 괴사시킬 수 있는 2종의 상이한 리간드가 치환된 종양 진단 또는 치료용 산화 그래핀 나노입자를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 산화 그래핀 나노입자를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 산화 그래핀 나노입자를 이용하여 인간을 제외한 포유류의 종양을 진단 또는 치료하는 방법을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 산화 그래핀 나노입자는 산화 나노그래핀의 표면에, 하기 [화학식 1]로 표시되는 트리블록 공중합체, 양 말단이 R1으로 치환된 하기 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체 및 양 말단이 R2로 치환된 하기 [화학식 3]으로 표시되는 트리블록 공중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 공중합체가 포함된 코팅층이 형성될 수 있다;
[화학식 1]
Figure pat00001
[화학식 2]
Figure pat00002
[화학식 3]
Figure pat00003
상기 화학식 1 내지 3에서, n은 8 내지 540의 정수이고, m은 16 내지 70의 정수이며; 상기 화학식 2 및 3에서, R1 및 R2는 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 60의 알킬기, 치환 또는 비치환된 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 60의 아릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 60의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬아미노기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬실릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴실릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 50의 아릴알킬아미노기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 60의 알케닐기, 3 내지 60의 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 60의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 60의 헤테로아릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 60의 할로겐기, 중수소, 수소, 치환 또는 비치환된 cRGD(Cyclic Arginine-Glycine-Aspartic Acid) 펩타이드, 치환 또는 비치환된 엽산(folate), 치환 또는 비치환된 트랜스페린(Transferrin) 단백질, 치환 또는 비치환된 알키린 반족 단백질(Ankyrin repeat protein), 치환 또는 비치환된 단일클론항체(Monoclonal antibody), 치환 또는 비치환된 애피바디(Affibody), 치환 또는 비치환된 LyP-1(Lymphoid tyrosine phosphatase-1) 펩타이드, 치환 또는 비치환된(N-(2-{3-[125I]Iodobenzoyl}aminoethyl)maleimide-F3Cys 아밀로이드 펩타이드, 치환 또는 비치환된 iRGD(Internalizing Arginine-Glycine-Aspartic Acid) 펩타이드, 치환 또는 비치환된 앱타이드(Aptide), 치환 또는 비치환된 A10 앱타머(hairpin structure liked RNA A10 aptamer) 핵산 기반의 리간드, 치환 또는 비치환된 PSMA 앱타머(prostate specific membrane antigen A10 RNA aptamer), 치환 또는 비치환된 키토산(Chitosan), 치환 또는 비치환된 테트라페닐포피린(TPP) 리간드, 치환 또는 비치환된 2-[3-[5-아미노-1-카르복실펜틸]-우레이도]-클루타르산(ACUPA) 리간드, 치환 또는 비치환된 락토스(Lactose), 치환 또는 비치환된 글루코오스(Glucose), 치환 또는 비치환된 봄베신(bombesin), 치환 또는 비치환된 면역글로불린(F(ab) 또는 F(ab)2), 및 단일고리로 연결된 두개 항체의 절편(Single-chain variable fragments, scFv)으로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 상이하게 선택된다.
이때, 상기 R1 및 R2로 각각 cRGD 및 엽산을 사용하는 경우에는 치환된 cRGD 및 엽산, 바람직하게는
Figure pat00004
및
Figure pat00005
일 수 있다.
상기 R1 및 R2에 치환되는 치환기는 수소원자, 중수소 원자, 할로겐 원자, 히드록실기, 시아노기, 니트로기, 아미노기, 아미디노기, 히드라진, 히드라존, 싸이올기(-SH), 카르복실기(-COOH)나 이의 염, 아크릴기(-COC2H3), 술폰산기나 이의 염, 인산이나 이의 염, 탄소수 1 내지 60의 알킬기, 탄소수 2 내지 60의 알케닐기, 탄소수 2 내지 60의 알키닐기, 탄소수 1 내지 60의 알콕시기, 탄소수 3 내지 60의 시클로알킬기, 탄소수 6 내지 60의 아릴기, 탄소수 6 내지 60의 아릴옥시기, 탄소수 6 내지 60의 아릴싸이오기, 탄소수 2 내지 60의 헤테로아릴기, -SiR25R26R27, 및 -NR28R29로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 서로 같거나 상이하게 선택될 수 있다.
상기 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체 및 상기 [화학식 3]로 표시되는 트리블록 공중합체는 하기 [화학식 4] 또는 [화학식 5]의 화합물 중에서 상이하게 선택될 수 있다.
[화학식 4]
Figure pat00006
[화학식 5]
Figure pat00007
상기 [화학식 1]로 표시되는 트리블록 공중합체, 상기 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체 및 상기 [화학식 3]으로 표시되는 트리블록 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 공중합체는 산화 그래핀 나노입자의 총 중량 대비 0-95 : 0-95 : 0-95의 중량비로 혼합될 수 있다.
상기 [화학식 1]로 표시되는 트리블록 공중합체, 상기 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체 및 상기 [화학식 3]으로 표시되는 트리블록 공중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 공중합체와 산화 그래핀 나노입자는 51:49 내지 95:5의 중량비로 혼합될 수 있다.
상기 산화 그래핀 나노입자는 근적외선 레이저를 조사 시 인간을 제외한 포유류의 생체 내 또는 생체 외 종양의 온도는 45 ℃이상, 바람직하게는 45 내지 65 ℃의 높은 온도일 수 있다.
상기 [화학식 1] 내지 [화학식 3]의 트리블록 공중합체에서 n은 196이며, m은 67일 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 산화 그래핀 나노입자를 제조하는 방법은 (A) 산화 나노그래핀, 상기 [화학식 1]로 표시되는 트리블록 공중합체, 양 말단이 R1으로 치환된 상기 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체 및 양 말단이 R2로 치환된 상기 [화학식 3]으로 표시되는 트리블록 공중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 공중합체를 혼합하는 단계; 및
(B) 상기 혼합물을 진탕배양하여 산화 나노그래핀 표면에 상기 트리블록 공중합체 코팅층이 형성되는 단계;를 포함할 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 인간을 제외한 포유류의 생체 내 또는 생체 외 종양을 진단 또는 치료하는 방법은 (a) 상기 산화 그래핀 나노입자를 인간을 제외한 포유류의 생체 내 또는 시료에 주입하는 단계; 및
(b) 상기 투여된 산화 그래핀 나노입자에 근적외선 레이저를 조사하여 종양 세포만을 선택적으로 괴사시키는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 근적외선 레이저를 조사 시 인간을 제외한 포유류의 생체 내 또는 생체 외 종양의 온도는 45 ℃이상, 바람직하게는 45 내지 65 ℃의 높은 온도일 수 있다.
상기 산화 그래핀 나노입자의 표면에 광감작제(photosensitizer)(예를 들어, 메틸렌 블루(Methylene blue), 인도사이아닌 그린(Indocyanine green 등)를 비공유 결합(소수성 상호작용, 수소결합, 이온결합, 반데르발스 인력)과 공유 결합 등으로 부착할 수 있으며, 근적외선 레이저를 조사 시 인간을 제외한 포유류의 종양 조직 부위에 활성산소종이 발생하여 광역학 치료(Photodynamic therapy)가 가능하고, 항암제(예를 들면, Doxorubicin, Docetaxel, Paclitaxel, Annamycin, Platinium based drugs(carboplatin, cisplatin), Oxaliplatin, Camptothecin, Tamoxifen, Epirubicin, Methotrexate, Vinblatin, Topotecan 등), 바이오 신약 등을 비공유 결합(소수성 상호작용, 수소결합, 이온결합, 반데르발스 인력), 공유 결합 등으로 부착할 수 있어, 인간을 제외한 포유류의 종양을 진단 및 치료하는 방법이 될 수 있다.
본 발명의 리간드가 치환된 산화 그래핀 나노입자는 종양 부위에 대한 능동적 표적지향 능력이 향상되어 단일 리간드가 치환된 나노입자에 비하여 종양 조직에만 나노입자가 더욱 축적되고 비종양 조직에는 나노입자가 축적되지 않으며, 이로 인하여 나노입자를 주입한 후 근적외선 레이저로 조사하면 광열 치료 효과로 인해 종양 조직을 모두 괴사시킬 수 있다. 이는 본 발명의 산화 그래핀 나노입자가 빛이 없는 상태에서는 무독성이지만 근적외선 레이저로 조사하면 독성을 발휘하여 상기 광열 치료 효과로 인해 종양 조직을 모두 괴사시키는 것이다.
도 1a는 산화 그래핀(GO) 및 산화 나노그래핀(nGO)의 UV-Vis 스펙트럼이다.
도 1b는 산화 그래핀(GO) 및 산화 나노그래핀(nGO)의 색상을 나타낸 사진이다.
도 2는 산화 그래핀(GO) 및 산화 나노그래핀(nGO)의 FTIR 그래프이다.
도 3a는 cRGD-PF 및 FA-PF의 합성과정을 나타낸 도면이다.
도 3b는 실시예에 따라 제조된 산화 그래핀 나노입자의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 4는 실시예에 따라 제조된 산화 그래핀 나노입자의 개략도이다.
도 5a는 24시간 동안 PF-nGO(실시예 1)를 상이한 농도로 처리한 KB 세포의 생존율을 WST-8 분석법으로 측정한 그래프이다.
도 5b는 24시간 배양 후 KB 세포에서 실시예에 따라 제조된 산화 그래핀 나노입자를 세포 흡수 유동세포 분석법으로 분석한 그래프이다.
도 5c는 유동세포 분석법으로 측정된 상이한 실시예의 산화 그래핀 나노입자에 대한 세포 흡수를 정량적으로 분석한 그래프이다.
도 6은 형광 표지된 실시예에 따라 제조된 산화 그래핀 나노입자의 세포 흡수의 공초점 현미경 영상이다.
도 7a는 KB 종양이 함유된 마우스에서 실시예에 따라 제조된 산화 그래핀 나노입자의 생체 내(In vivo) 표적화 영상이다.
도 7b는 실시예에 따라 제조된 산화 그래핀 나노입자 주입 48시간 후 종양 및 다른 주요 장기의 생체 외(Ex- vivo) 형광 영상이다.
도 7c는 종양 및 다른 주요 장기에서 실시예의 산화 그래핀 나노입자의 형광강도를 나타낸 그래프이다.
도 8a는 실시예에 따라 제조된 산화 그래핀 나노입자를 마우스에 주입하여 레이저로 조사한 후 마우스의 몸 전체 온도를 나타낸 영상이다.
도 8b는 상기 도 8a 마우스의 종양 부위에 대한 온도를 나타낸 그래프이다.
도 8c는 식염수, 실시예에 따라 제조된 나노입자로 처리한 후 KB 종양 함유 마우스의 항종양성 종양 활성을 나타낸 그래프이다.
도 8d는 처리 종료 후 종양의 사진이다.
본 발명은 종양 부위에 대한 능동적 표적지향 능력이 향상되어 종양 부위로 산화 그래핀 나노입자의 축적량이 증가되며, 이로 인하여 우수한 광열 치료 효과로 종양을 괴사시킬 수 있는 종양 진단 또는 치료용 산화 그래핀 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 산화 나노그래핀의 표면을 상이한 리간드로 각각 치환된 2종의 트리블록 공중합체 및 리간드로 치환되지 않은 트리블록 공중합체, 예컨대 양 말단이 R1으로 치환된 트리블록 공중합체, 양 말단이 R2로 치환된 트리블록 공중합체 및 치환되지 않은 트리블록 공중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 공중합체가 포함된 공중합체로 코팅함으로써 종양 조직에 보다 더 효과적인 능동적 표적지향 능력 및 우수한 광열 치료 효과를 보인다. 상기 3종의 공중합체를 함께 사용하는 경우에는 상기 상이한 리간드로 각각 치환된 2종의 트리블록 공중합체와 치환되지 않은 트리블록 공중합체의 중량비를 조절하여 코팅하면 산화 나노그래핀 표면의 리간드의 밀도를 용이하게 조절할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 산화 그래핀 나노입자는 산화 나노그래핀과 상기 산화 나노그래핀을 코팅하는 코팅층으로 이루어진다. 이때, 상기 코팅층은 상기 [화학식 1]로 표시되는 트리블록 공중합체, 양 말단이 R1으로 치환된 상기 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체 및 양 말단이 R2로 치환된 상기 [화학식 3]로 표시되는 트리블록 공중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 공중합체가 포함된다.
상기 원재료로 사용된 산화 나노그래핀(nGO)은 전부 산화된 산화그래핀 또는 대부분 산화되었으나 일부 환원된 나노그래핀일 수 있다.
상기 산화 나노그래핀(nGO)은 그들의 독특한 물리화학적 및 광열 특성으로 종양 조직에 약물을 전달하기 위한 매우 유망한 나노물질로 알려져 있으며, 종양 세포를 선택적으로 표적화할 수 있는 리간드로 치환된다.
상기 [화학식 1]로 표시되는 트리블록 공중합체는 1973년에 어빙 쉬몰카에 의해서 개발된 폴록사머(poloxamer)로 불리는 화합물로서, 이는 중앙의 소수성 폴리옥시프로필렌 블록과 그 양쪽의 친수성 폴리옥시에틸렌 블록으로 구성된 트리블록 공중합체이다. 이러한 폴록사머는 상품명 "플루로닉(Pluronic; BASF사)"으로 널리 알려져 있기도 하다.
또한, 상기 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체 및 상기 [화학식 3]로 표시되는 트리블록 공중합체는 [화학식 1] 화합물의 양 말단이 각각 R1 또는 R2로 치환된 화합물로서, 바람직하게는 상기 [화학식 4] 및 [화학식 5]로 이루어진 군에서 상이하게 선택될 수 있으며; 더욱 바람직하게 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체는 [화학식 4]의 화합물, [화학식 3]로 표시되는 트리블록 공중합체는 [화학식 5]의 화합물일 수 있다.
상기 트리블록 공중합체 혼합물은 상기 [화학식 1]로 표시되는 트리블록 공중합체, 상기 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체(예컨대, [화학식 4]의 화합물) 및 상기 [화학식 3]로 표시되는 트리블록 공중합체(예컨대, [화학식 5]의 화합물)가 0-95 : 0-95 : 0-95의 중량비, 바람직하게는 0-45: 25-50: 25-50의 중량비 중량비로 혼합된다. 상기 중량비에서 세 공중합체가 모두 0인 경우는 제외된다.
또한, 상기 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체와 상기 [화학식 3]으로 표시되는 트리블록 공중합체는 동일한 중량비로 혼합되거나 그 이상일 때 능동적 표적지향 능력을 더욱 향상시켜 종양 부위에 나노입자의 축적량을 월등히 향상시킬 수 있다.
[화학식 1]의 트리블록 공중합체, [화학식 2]의 트리블록 공중합체 및 [화학식 3]의 트리블록 공중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 공중합체와 산화 그래핀 나노입자는 51:49 내지 95:5의 중량비이다. 또한, 상기 중량비를 벗어나는 경우에는 종양 부위에 대한 능동적 표적지향 능력이 향상되지 않을 수도 있다.
일예로, [화학식 1]의 트리블록 공중합체, [화학식 2]의 트리블록 공중합체 및 [화학식 3]의 트리블록 공중합체가 함께 사용되는 경우에는 상기 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체(예컨대, [화학식 4]의 화합물)의 함량이 산화 그래핀 나노입자의 총 함량을 기준으로 10 내지 30 중량%, 바람직하게는 20 내지 25 중량%이다. [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체의 함량은 다른 리간드와의 우수한 상호작용으로 종양 부위에 대한 능동적 표적지향 능력을 향상시키기 위하여 상기 범위를 만족하는 것이 바람직하다.
또한, [화학식 1]의 트리블록 공중합체, [화학식 2]의 트리블록 공중합체 및 [화학식 3]의 트리블록 공중합체가 함께 사용되는 경우에는 [화학식 3]으로 표시되는 트리블록 공중합체(예컨대, [화학식 5]의 화합물)의 함량이 산화 그래핀 나노입자의 총 함량을 기준으로 10 내지 30 중량%, 바람직하게는 20 내지 25 중량%이다. [화학식 3]으로 표시되는 트리블록 공중합체의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 산화 나노그래핀 표면에 코팅되는 플루로닉(Pluronic)이 고르게 분포되지 않아 산화 그래핀 나노입자의 안정성이 떨어질 수 있으며, 능동적 표적지향 능력이 낮아질 수 있다.
특히, [화학식 1]의 트리블록 공중합체, [화학식 2]의 트리블록 공중합체 및 [화학식 3]의 트리블록 공중합체가 함께 사용되는 경우에는 [화학식 2] 및 [화학식 3]의 트리블록 공중합체의 합이 50 중량% 이상이어야 원하는 효과를 달성할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 산화 그래핀 나노입자를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 산화 그래핀 나노입자의 제조방법은 (A) 산화 나노그래핀, 상기 [화학식 1]로 표시되는 트리블록 공중합체, 양 말단이 R1으로 치환된 상기 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체 및 양 말단이 R2로 치환된 상기 [화학식 3]으로 표시되는 트리블록 공중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 공중합체를 혼합하는 단계; 및 (B) 상기 혼합물을 진탕배양하여 산화 나노그래핀 표면에 상기 트리블록 공중합체 코팅층이 형성되는 단계;를 포함한다.
먼저, 산화 나노그래핀 수성 현탁액, 상기 [화학식 1]로 표시되는 트리블록 공중합체, 양 말단이 R1으로 치환된 상기 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체 및 양 말단이 R2로 치환된 상기 [화학식 3]으로 표시되는 트리블록 공중합체를 혼합를 혼합한 후 트리블록 공중합체와 산화 나노그래핀 사이의 소수성 결합에 의해 산화 나노그래핀 표면에 트리블록 공중합체 코팅층을 유도하기 위하여 35 내지 40 ℃에서 10 내지 15시간 동안 진탕배양한다.
또한, 본 발명은 인간을 제외한 포유류의 생체 내 또는 생체 외 종양의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 인간을 제외한 포유류의 생체 내 또는 생체 외 종양의 진단방법 또는 치료방법은 (A) 상기 산화 그래핀 나노입자를 인간을 제외한 포유류의 생체 내 또는 시료에 주입하는 단계; 및 (B) 상기 투여된 산화 그래핀 나노입자에 근적외선 레이저를 조사하여 종양 세포만을 선택적으로 괴사시키는 단계;를 포함한다.
상기 산화 그래핀 나노입자를 주입하고 10시간 후 산화 그래핀 나노입자가 종양 조직에 축적되면 근적외선 레이저를 조사하여 종양 조직만을 선택적으로 괴사시킨다. 구체적으로, 본 발명의 산화 그래핀 나노입자를 주입한 후 근적외선 레이저를 조사하는 경우에는 종양의 온도가 45 ℃이상, 바람직하게는 45 내지 65 ℃로 상승하여 종양을 완전히 괴사시킬 수 있다.
이하에서는 구체적인 실시예를 첨부된 도면과 함께 상세히 설명한다.
제조예 1. 산화 나노그래핀의 제조(nGO)
산화 나노그래핀(nGO)은 카르복실화된 산화 그래핀의 초음파처리에 의해 제조된다.
클로로아세트산(400 mg, Sigma Aldrich) 및 수산화나트륨(400 mg, Sigma Aldrich)을 그래핀 용액(15 ㎖, 2% (w/v) 용액, Angstron사, Dayton, OH, USA)에 첨가하여 80 ℃에서 밤새 교반하여 반응이 종료되면, 혼합물을 초음파 프로브(750 W, 40% 강도)(Vibra cell VCX750, Sonics & Materials Inc., Newtown, CT, USA)로 2시간 동안 초음파 처리한 후 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리시키고 상등액을 폐기하였다. 수득된 침전물은 10 ㎖의 물로 현탁되고 무한 희석 조건이 만족하는 환경에서 2일 동안 탈이온수로 투석(MWCO 3.5kD, Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez, CA, USA)되었다. 상기 투석된 산화 그래핀(GO) 현탁액은 추가로 초음파 처리되고 0.1 ㎛ 필터로 여과되어 산화 나노그래핀(nGO) 스톡 용액을 제조하였다.
도 1a는 산화 그래핀(GO) 및 산화 나노그래핀(nGO)의 UV-Vis 스펙트럼이며, 도 1b는 산화 그래핀(GO) 및 산화 나노그래핀(nGO)의 색상을 나타낸 사진(1 mg/ml)이다. 또한, 도 2는 산화 그래핀(GO) 및 산화 나노그래핀(nGO)의 FTIR 그래프이다.
도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, nGO의 흡광도는 카르복실화 이후 크게 증가하고, 230 nm(GO)에서 240 nm 이상으로 피크가 이동되며; 카르복실화 동안 GO 용액의 색상은 GO의 에폭사이드 그룹의 개환 및 에스테르의 가수분해에 의한 그래핀 시트 내의 전자 결합의 복구 및 방출된 지역 변형 때문에 검은색에서 갈색으로 변화된다. 또한, 전자 결합의 복원 및 감소된 극성 관능기는 플루로닉 블록 공중합체와 상호작용을 위한 유익한 nGO 시트의 향상된 소수성을 기지며; 카르복실화 후 O-H(3423 cm-1), C-O(epoxy, 1223 cm-1), C-O(alkoxy, 1223 cm-1)와 같은 GO에 산소 함유 그룹의 FTIR 피크에서 nGO의 감소를 확인하였다.
실시예 1. PF-nGO의 제조
플루로닉 F127(PEO 98 PPO 67 PEO 98, MW 12,600, BASF사, Seoul, Korea)과 제조예 1에서 제조된 산화 나노그래핀을 혼합하여 37 ℃에서 밤새 진탕배양하여 산화 나노그래핀 표면에 PF을 코팅시킨 후 프리 플루로닉을 제거하기 위하여 무한 희석 조건이 만족하는 환경과 37 ℃의 온도에서 6시간 동안 탈이온수로 투석(MWCO 50kDa)하여 PF-nGO를 제조하였다.
실시예 2. cRGD-nGO의 제조
cRGD 펩타이드 결합된 플루로닉(cRGD-PF, 하기 [화학식 6])을 준비하기 위하여, 디아크릴레이트화된 플루로닉(DA-PF)을 이전에 보고된 바와 동일하게 합성하였다(S. Y. Lee and G. Tae, J. Controlled Release, 2007, 119, 313.; J. Y. Kim, W. I. Choi , Y. H. Kim, G. Tae, S. Y. Lee, K. Kim and I. C. Kwon, J. Controlled Release, 2010, 147, 109.). 여기서 사용된 플루로닉은 플루로닉 F127(PEO 98 PPO 67 PEO 98, MW 12,600, BASF사, Seoul, Korea)이다. 9.3 mg(16 μmol)의 cyclo(RGDfC) 펩타이드(cRGD, MW 578.7, 98% purity, ChinaPeptides사, Shanghai, China)는 1 ㎖의 인산 완충액(100 mM, pH 8.0)에 함유된 50 mg(4 μmol)의 DA-PF와 혼합되어 상온에서 12시간 동안 교반되었다. 미반응 펩타이드는 탈이온수로 24시간 동안 투석(MWCO 3.5kD)되어 제거되었으며, 정제된 cRGD-PF는 동결건조되고 결합효율을 계산하기 위하여 1H-NMR (400MHz, JNM-ECX-400P, JEOL, Tokyo, Japan)로 분석되었다.
상기 cRGD-PF와 제조예 1에서 제조된 산화 나노그래핀을 혼합하여 37 ℃에서 밤새 진탕배양하여 산화 나노그래핀 표면에 cRGD-PF을 코팅시킨 후 프리 플루로닉을 제거하기 위하여 무한 희석 조건이 만족하는 환경과 37 ℃의 온도에서 6시간 동안 탈이온수로 투석(MWCO 50kDa)하여 cRGD-nGO를 제조하였다.
[화학식 6]
Figure pat00008

실시예 3. FA-nGO의 제조
엽산 결합된 플로로닉(FA-PF, 하기 [화학식 7])은 100 mg(7.8 μmol)의 아민이 치환된 플루로닉(이전에 보고된 바와 동일하게 합성, J. H. Lee, A. Sahu , C. Jang and G. Tae, J. Controlled Release, 2015, 209, 219), 69 mg(156 μmol)의 엽산(Sigma Aldrich), 24 mg(156 μmol)의 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, Sigma Aldrich), 22 mg(195 μmol)의 NHS(N-하이드록시석신이미드, Sigma Aldrich)) 및 30 ml의 무수 DMSO를 혼합하여 아르곤 가스가 퍼징된 어두운 분위기하의 상온에서 17시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물은 프리 엽산과 DMSO를 제거하기 위하여 상온에서 36시간 동안 인산 완충액(pH 8.0)으로 투석 (MWCO 3.5kD)되고, 잔여 염을 제거하기 위하여 무한 희석 조건이 만족하는 환경과 37 ℃의 온도에서 36시간 동안 탈이온수로 투석 (MWCO 3.5kD)되었으며, 정제된 FA-PF는 동결건조되고 1H-NMR로 분석되었다. 여기서 사용된 플루로닉은 플루로닉 F127(PEO 98 PPO 67 PEO 98, MW 12,600, BASF사, Seoul, Korea)이다.
상기 FA-PF와 제조예 1에서 제조된 산화 나노그래핀을 혼합하여 37 ℃에서 밤새 진탕배양하여 산화 나노그래핀 표면에 FA-PF을 코팅시킨 후 프리 플루로닉을 제거하기 위하여 37 ℃에서 6시간 동안 탈이온수로 투석(MWCO 50kDa)하여 FA-nGO를 제조하였다.
[화학식 7]
Figure pat00009

실시예 4. cRGD-FA-nGO의 제조
상기 실시예 2와 동일하게 실시하되, cRGD-PF, FA-PF 및 제조예 1에서 제조된 산화 나노그래핀을 함께 혼합하여 cRGD-FA-nGO를 제조하였다.
상기 동결건조된 샘플은 질소퍼징하에서 5 ℃/min의 스캔속도로 30 ℃에서 800 ℃로 가열시켜 해동 후 이용되었다.
도 3a는 cRGD-PF(실시예 2의 cRGD가 치환된 플루로닉) 및 FA-PF(실시예 3의 엽산이 치환된 플루로닉)의 합성과정을 나타낸 도면이며, 도 3b는 실시예에 따라 제조된 산화 그래핀 나노입자의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 3에 도시된 바와 같이, 엽산(FA)이 결합된 플루로닉(FA-PF)에서 엽산은 EDC/NHS 매개된 결합에 의한 γ-COOH 그룹을 통해 아민 치환된 플루로닉의 양단에 결합되며, 복합체의 1H-NMR 분석은 6.8, 7.7, 및 8.7 ppm에서 세 개의 벤질 그룹 피크가 나타나므로 엽산이 결합된 플루로닉(FA-PF)의 성공적인 합성을 확인하였다. 또한, 결합 효율은 PPO 유닛의 메틸 프로톤(1.7 ppm) 및 벤질 프로톤의 비교하여 95% 이상으로 계산되었다.
cRGD 결합된 플루로닉(cRGD-PF)은 디아크릴화된 플루로닉의 비닐 그룹과 펩타이드의 싸이올(-SH) 그룹 사이의 Michael type 첨가반응에 의해 cRGD이 디아크릴화된 플루로닉의 양단에 결합되며, 복합체의 1H-NMR 분석은 7.26-7.42 ppm에 페닐알라닌의 페닐 그룹으로부터 프로톤 피크의 출현으로 cRGD-PF의 성공적인 합성을 확인하였다. 또한, 결합 효율은 PPO 유닛의 메틸 프로톤(1.7 ppm) 및 페닐알라닌의 페닐 프로톤(7.26-7.42 ppm)과 비교하여 계산되었으며, 계산된 값은 95% 이상이다.
도 4는 실시예에 따라 제조된 산화 그래핀 나노입자의 개략도이다.
실시예의 산화 그래핀 나노입자는 도 4에 도시된 바와 같이 제조되며, 하기 [표 1]에 나타낸 바와 같이 nGO와 cRGD-PF, FA-PF, 및 PF의 혼합 중량비에 따라 평균 크기 및 표면전하가 변화된다.
구분 중량비
(cRGD-PF : FA-PF : PF)		 평균 크기(nm) 제타 포텐셜(mV)
nGO 0 : 0 : 0 44±2 -45.3±4.4
실시예 1(PF-nGO) 0 : 0 : 100 52±3 -5.6±1.1
실시예 2(cRGD-nGO) 25 : 0 : 75 52±2 -2.3±1.9
실시예 3(FA-nGO) 0 : 25 : 75 49±2 -6.1±0.6
실시예 4(cRGD-FA-nGO 25 : 25 : 50 56±3 -4.6±0.9
위 표 1에 나타낸 바와 같이, 플루로닉 코팅 후 PF-nGO(실시예 1)의 평균 크기는 44±2 nm에서 52±3 nm로 증가하고, 표면 전하는 비이온 PF에 의해 nGO 표면의 유효도달범위 때문에 -45.3±4.4 mV에서 -5.6±1.1 mV로 향상되었다. 단일 및 2종의 리간드(듀얼 리간드)가 치환된 nGOs(실시예 2, 실시예 3과 실시예 4)의 평균크기 및 표면 전하는 비표적화 PF-nGO(실시예 1)와 서로 유사하다. 따라서, 종양 표적화면에서 리간드 치환된 nGOs의 크기 및 표면 전하는 효과가 없을 것으로 판단된다.
한편, 실시예에 따라 제조된 산화 그래핀 나노입자에 함유된 리간드의 총 함량은 1H-NMR 분석에 의해 계산되었다.
구분 cRGD 또는 FA 함량
(mg/mg of nGO)		 cRGD 또는 FA의 수
(per mg of nGO)
실시예 2(cRGD-nGO) 0.177±0.018 (1.8±0.17)x1017
실시예 3(FA-nGO) 0.137±0.014 (1.8±0.14x1017
실시예 4(cRGD-FA-nGO FA :0.144±0.021 FA :.(1.98±0.19)x1017
cRGD : 0.2±0.008 cRGD : (2.05±0.09)x1017
위 표 2에 나타낸 바와 같이, 동일한 방법으로 제조시 2종의 리간드를 이용한 실시예 4가 더욱 밀도있게 산화 나노그래핀 표면에 코팅되는 것을 확인하였다.
도 5a는 24시간 동안 PF-nGO(실시예 1)를 상이한 농도로 처리한 KB 세포의 생존율을 WST-8 분석법으로 측정한 그래프이며(n=3); 도 5b는 24시간 배양 후 KB 세포에서 실시예에 따라 제조된 나노입자를 세포 흡수 유동세포 분석법으로 분석한 그래프이고; 도 5c는 유동세포 분석법으로 측정된 상이한 실시예의 나노입자에 대한 세포 흡수를 정량적으로 분석한 그래프이다(n=3).(**p < 0.001, N.S.- not significant)
도 5a에 도시된 바와 같이, PF-nGO(실시예 1)의 세포독성은 KB 세포에서 50 μg/ml까지 WST-8 분석에 의해 검출되지 않는 것을 확인하였다.
한편, 실시예 4의 2종 리간드가 치환된 나노입자(cRGD-FA-nGO) 및 실시예 2 및 3의 단일 리간드가 치환된 나노입자(cRGD-nGO 및 FA-nGO)의 세포 흡수는 유동세포 분석법 및 공초점 현미경에 의해 KB 세포와 분석되었다. 상기 각 샘플은 코팅과정 동안 Cy5.5 결합된 플루로닉(Cy5.5-PF)의 소량(0.2 중량%) 첨가에 의해 형광 표지되었다. 24시간 배양 후, KB 세포에서 형광 강도는 유동세포 분석법에 의해 정량적으로 측정된다.
도 5b 및 도 5c에 도시된 바와 같이, cRGD-FA-nGO(실시예 4)으로 처리된 KB 세포는 비표적화 PF-nGO(실시예 1)로 처리된 세포보다 5.1배 강한 형광 강도를 보이는 것을 확인하였으며, cRGD-nGO(실시예 2) 및 FA-nGO(실시예 3)으로 처리된 KB 세포는 비표적화 PF-nGO(실시예 1)로 처리된 세포보다 2.7배 및 2.1배 향상된 형광 강도를 보이는 것을 확인하였다.
따라서, 2종의 리간드가 치환된 나노입자는 단일 리간드가 치환된 나노입자에 비하여 KB 세포에서 상당히 향상된 세포 흡수를 보이는 것을 확인하였다. 구체적으로, cRGD-FA-nGO(실시예 4)로 처리된 세포의 평균 형광 강도는 각각 cRGD-nGO(실시예 2) 및 FA-nGO(실시예 3) 보다 1.9배 및 2.4배 더 강하다. 이러한 결과는 단일 리간드 치환에 비하여 KB 세포 생체 내(in vitro)의 흡수에서 듀얼 리간드 치환된 나노입자(실시예 4)의 상승효과를 보여준다.
도 6은 형광 표지된 실시예에 따라 제조된 나노입자의 세포 흡수의 공초점 현미경 영상이다. KB 세포가 24시간 동안 상이한 나노입자(20 μg/ml) 샘플로 처리되며, 블루 색상은 DAPI 염색된 세포 핵, 레드 색상은 Cy5.5 표지된 nGO이다.
상기 공초점 레이저 주사 현미경(CSLM)은 KB 세포에서 리간드 치환된 실시예의 나노입자의 내재화를 확인하는데 사용된다. 24시간 동안 실시예의 나노입자, 표지된 Cy5.5와 세포를 처리한 후, 이들의 핵을 DAPI로 염색하였다. 내면화된 나노입자로부터 Cy5.5는 레드 형광으로 시각화되고, 세포의 핵은 블루 형광으로 시각화되었다.
도 6에 도시된 바와 같이, 레드 형광은 KB 세포에서 치환된 nGOs의 성공적인 내재화를 드러내는 세포질에서 명확히 관찰되었다. 예상대로, cRGD-FA-nGO(실시예 4) 처리된 세포의 레드 형광 강도는 유동세포 분석법과 상관관계에 따라 다른 그룹(실시예 1 내지 3)보다 더 강한 것을 확인하였다. 한편, PF-nGO(실시예 1)에 비하여 향상된 레드 형광 강도는 세포 처리된 cRGD-nGO(실시예 2) 및 FA-nGO(실시예 3)의 세포질에서 관찰되었다.
도 7a는 KB 종양이 함유된 마우스에서 실시예에 따라 제조된 나노입자의 생체 내(In vivo) 표적화 영상이며, 도 7b는 실시예에 따라 제조된 나노입자 주입 48시간 후 종양 및 다른 주요 장기의 생체 외(Ex-vivo) 형광 영상이고, 도 7c는 종양 및 다른 주요 장기에서 실시예 나노입자의 형광강도를 나타낸 그래프이다(n=3). (**p < 0.001, *p < 0.05)
도 7a에 도시된 바와 같이, 실시예 4에 따라 제조된 2종 리간드가 치환된 나노입자의 종양에서의 상승 효과는 KB 종양 이종이식 모델을 이용한 생체 내(in vivo)에서 특성화되었다.
형광 표지된 실시예의 나노입자는 종양 함유 마우스의 정맥내로 주입되고, 비침습적 근적외선 광학 이미지 기술로 모니터된다. 주입 6시간 및 12시간 후, 형광 신호는 몸 전체에 걸쳐 확산되고, 나노입자의 현지화가 모든 그룹에서 관찰되지 않았다.
하지만, 24시간 후 종양 부위에서 비표적화 PF-nGO(실시예 1) 그룹에 비하여 리간드가 치환된 실시예 4, 실시예 2 및 실시예 3의 나노입자의 형광 신호가 명확히 관찰되었다. 특히, 리간드가 치환된 실시예 2 내지 4 중에서 2종 리간드가 치환된 실시예 4의 나노입자가 주입된 종양 부위가 단일 리간드가 치환된 실시예 2 및 실시예 3에 비하여 형광 신호의 레벨이 높은 것을 확인하였다.
48시간 후, 비표적화 PF-nGO(실시예 1), cRGD-nGO(실시예 2) 및 FA-nGO(실시예 3)로 처리된 마우스의 종양 부위에서 형광 신호가 매우 낮은 것을 확인하였다. 반면, cRGD-FA-nGO(실시예 4)로 처리된 마우스는 종양 부위에서 강한 형광 신호를 보이는 것을 확인하였다.
도 7b에 도시된 바와 같이, 보다 정확하게 다양한 나노입자의 표적화된 종양 효과의 특성을 확인하기 위하여, 나노입자 주입 48시간 후 모든 마우스를 난절(scarifying)하여 절제된 종양 조직 및 다른 주요 장기의 생체 외(ex vivo) 형광 이미지를 촬영하였다.
강한 형광 신호는 다른 세 그룹에 비하여 cRGD-FA-nGO(실시예 4)가 투여된 마우스의 적출된 종양에서 관찰되었다. 적출된 장기에서 얻은 형광 신호의 정량 분석은 다른 주요 장기보다 종양에서 훨씬 높은 신호를 나타내는 것을 확인하였다. 반면, 간은 매우 약한 신호를 보인다. 이는 cRGD-FA-nGO(실시예 4)가 간에 대한 낮은 비특이적 흡수 및 우수한 종양 표적화에 의하여 이상적인 나노물질이 될 수 있음을 의미한다.
단일 리간드로 치환된 cRGD-nGO(실시예 2) 및 FA-nGO(실시예 3)의 종양 표적화 특성은 생체 내(in vitro) 연구에서와 유사하다.
도 7c에 도시된 바와 같이, cRGD-nGO(실시예 2) 및 FA-nGO(실시예예 3)는 비표적화 PF-nGO(실시예 1)보다 약간 높은 종양 축적을 보이지만, 2종 리간드로 치환된 cRGD-FA-nGO(실시예 4)는 다른 그룹 보다 상당히 높은 종양 축적을 보인다. cRGD-FA-nGO(실시예 4)가 투여된 마우스의 종양에서 형광 신호는 cRGD-nGO(실시예 2), FA-nGO(실시예 3), 및 PF-nGO(실시예 1) 보다 각각 1.7배, 2.0배 및 2.3배 강한 것을 확인하였다.
폐의 전반적인 축적이 종양에 비해 매우 적었지만, cRGD-FA-nGO(실시예 4)는 PF-nGO(실시예 1), cRGD-nGO(실시예 2) 및 FA-nGO(실시예 3)에 비하여 나노입자의 폐 축적을 증가시켰다.
도 8a는 실시예에 따라 제조된 나노입자를 마우스에 주입하여 레이저로 조사한 후 마우스의 몸 전체 온도를 나타낸 영상이며; 도 8b는 상기 도 8a 마우스의 종양 부위에 대한 온도를 나타낸 그래프이고; 도 8c는 식염수, 실시예에 따라 제조된 나노입자로 처리한 후 KB 종양 함유 마우스의 항종양성 종양 활성을 나타낸 그래프이며; 도 8d는 처리 종료 후 종양의 사진이다.(*p < 0.05, * * * p < 0.0002, N.S.: not significant)
cRGD-FA-nGO(실시예 4)의 우수한 생체 내(in vivo) 종양 표적화 효과를 종양 이종이식 마우스에서 광열치료 효과로 나타내었다.
도 8a 및 도 8b에 도시된 바와 같이, KB 종양 함유된 마우스는 5개 그룹으로 나뉘며, 식염수, 비표적화 PF-nGO(실시예 1), cRGD-nGO(실시예 2), FA-nGO(실시예 3) 및 듀얼 리간드 치환된 cRGD-FA-nGO(실시예 4)를 정맥 내로 주입하였다.
주입 24시간 후, 종양은 광열 치료를 위해 근적외선 레이저 조사에 노출되었으며, 종양 부위의 온도 증가는 IR 열적 카메라로 측정되었다. IR 열적 카메라로 측정한 결과, 식염수가 주입된 마우스는 레이저 조사하는 동안 종양 부위에서 36 ℃에서 42 ℃로 약간 온도가 상승하였으며, PF-nGO(실시예 1), cRGD-nGO(실시예 2), FA-nGO(실시예 3)가 주입된 마우스는 중양 부위에서 온도가 각각 44 ℃, 50 ℃ 및 47 ℃로 측정되었다.
반면, cRGD-FA-nGO(실시예 4)로 처리된 마우스의 종양 부위 온도는 다른 그룹 보다 매우 높은 57 ℃인 것을 확인하였다. 근적외선 레이저로 처리에 의한 온도 증가는 다른 나노입자 그룹의 생체 내(in vivo) 종양 축적과 잘 일치한다: 종양에서 증가된 나노입자 축적은 높은 광열 효과를 나타낸다.
근적외선 레이저 조사에 의한 온도 증가는 종양 근처 주변조직에서 관찰되지 않았으며, 근적외선 레이저 처리의 효과는 종양 부위에 집중되고 비특이적 조직 손상이 최소화되었다.
또한 도 8c 및 도 8d에 도시된 바와 같이, 종양 부피 및 몸무게 변화를 광열 치료 후 21일 동안 측정하였다.
식염수 그룹 마우스는 비표적화 PF-nGO(실시예 1)로 처리된 마우스에 따라 종양 부피의 급속한 성장을 확인하였다. 이에 비해, 단일 치환된 cRGD-nGO(실시예 2) 및 FA-nGO(실시예 3)로 처리된 마우스는 PF-nGO(실시예 1) 보다 더 높은 나노입자 축적 및 더 나은 광열 치료 효과의 결과로 종양 성장의 억제를 나타내었다. 그러나, 상기 단일 치환된 cRGD-nGO(실시예 2) 및 FA-nGO(실시예 3)는 종양을 완전히 근절하는데 실패하였다.
최상의 결과는 모든 종양이 5일의 근적외선 레이저의 처리로 사라지고 21일의 처리로 재성장되지 않는 듀얼 리간드로 치환된 cRGD-FA-nGO(실시예 4)로 처리된 마우스에서 관찰되었다. cRGD-FA-nGO(실시예 4)에 의한 완전한 종양 제거는 더 높은 종양 축적과 더 나은 광열 치료 효과에 기인할 수 있다.
광열 치료를 실험하는 동안, 마우스는 죽지 않았고 몸무게가 감소되지 않았으며, 이는 나노입자가 독성이 없음을 의미한다.
효율적인 활성 종양 표적화 시스템은 엽산 및 cRGD 펩타이드와, 산화 나노그래핀의 성공적인 치환으로 설계되었다. 산화 나노그래핀에 치환된 각 리간드의 양은 cRGD 및 엽산과 결합된 산화 나노그래핀 및 플루로닉 사이의 비공유 결합에 의해 제어될 수 있다.
듀얼 리간드가 치환된 나노입자(실시예 4)의 종양 표적화 효율성은 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 평가된다. 듀얼 리간드 치환은 단일 리간드 치환된 산화 그래핀 나노입자에 비하여 암세포에서 산화 그래핀 나노입자의 흡수를 향상시킨다.
인테그린 및 엽산 수용체 표적화의 결합은 단일 리간드에 의해 달성된 수준을 넘어서 성공적으로 증폭된 생체 내(in vivo) 종양 표적화를 이루었다. 또한, 산화 그래핀 나노입자의 향상된 종양 현지화는 생체 내(in vivo)에서 더 나은 광열 종양 절제의 결과이다.
엽산 및 cRGD의 듀얼 리간드 결합(실시예 4)이 종양 치료에서 산화 그래핀 나노입자뿐만 아니라 다른 나노시스템의 종양 표적화 효능을 증가시키는데 사용될 수 있음을 시사한다.
-분석 방법
Cy5.5 결합된 플루로닉의 합성(Cy5.5-PF): 아민 치환된 플루로닉에 근적외선 형광 염료인 Cy5.5을 결합시키기 위하여, 1 mg의 Cy5.5-NHS은 5 mg의 아민-PF와 혼합된다. 상기 혼합물은 상온에서 밤새 교반되고, 미결합된 염료의 제거를 위하여 12시간 동안 탈이온수로 투석(MWCO 3.5kD)하였다. 상기 투석된 용액은 동결건조되고, -20 ℃에서 보관된다.
시험관 내(In vitro ) 독성 분석: 플루로닉이 코팅된 실시예 및 비교예에 따라 제조된 나노입자의 독성을 WST-8 분석(WST-8 시약: Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)으로 평가하였다. 상기 KB 세포는 96웰 세포 배양 플레이트(10000 cells/well)에 씨드되고, 37 ℃에서 5% CO2 배양기에서 6시간 동안 배양되었다. 그 후, 배지는 PF-nGO(실시예 1)의 다른 농도를 포함하는 200 μl의 새로운 배지로 대체되었다. 24시간 배양 후, 배지는 제거되고 세포는 PBS로 세척되었다. 다음으로, WST-8 용액이 웰에 첨가되고, 100 μl 용액의 각 웰은 37 ℃에서 1시간 동안 배양 후 새로운 96웰 마이크로 플레이트로 옮겨졌다. 생성된 포르마잔(formazan)의 흡광도는 450 nm에서 마이크로플레이트 리더(SpectraMax M2e, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)에 의해 측정된다.
유동세포 분석법에 의한 시험관 내(In vitro ) 세포 흡수: KB 세포는 10% FBS 및 1% 스트렙토마이신-페니실린이 함유된 통상의 RPMI1640 배지에서 유지되었다. 유동세포 분석법으로 분석 전에, KB 세포는 엽산 프리 RPMI1640 배지(10% FBS, 1% 항생제)에서 2회 계대하였으며, 5x104 cells/well밀도로 24웰 플레이트 배양 플레이트에 접종되었다. 접종된 세포는 24시간 동안 배양되고, 배지는 20 μg/ml의 나노입자에서 치환된 나노입자 샘플(5%의 PF은 형광 프로브로서 Cy5.5-PF로 대체됨)이 함유된 배지로 대체되었다. 24시간 배양 후, 세포는 100 μl의 트립신으로 분리되고, 원심분리(1500 rpm, 4 ℃, 5분)에 의해 수집되며, 10% FBS이 함유된 1 ml의 차가운 PBS로 현탁된다. 세포는 FL4 채널에서 유동세포 분석법(FACS caliber, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 의해 분석되고, 30000 이벤트는 각 샘플에 대해 기록된다.
치환된 nGO 샘플의 특성: nGO(제조예 1), PF-nGO(실시예 1), cRGD-nGO(실시예 2), FA-nGO(실시예 3), 및 cRGD-FA-nGO(실시예 4) 샘플의 유체역학적 반경 및 표면전하는 동적 광산란(DLS) 분광계(ELS-Z2, Otsuka Electronics Co., Osaka, Japan)를 이용하여 측정된다. cRGD-nGO(실시예 2), FA-nGO(실시예 3), 및 cRGD-FA-nGO(실시예 4)의 표면에 다른 플루로닉 코팅의 비율은 1H-NMR로 분석되었다.
공초점 레이저 주사 현미경에 의한 시험관 내(In vitro ) 세포 흡수: KB 세포는 엽산 프리 RPMI 1640 배지로 2회 계대되며, 5x104 cells/well밀도로 24웰 배양 플레이트에 원형의 12 mm 젤라틴이 코팅된 글라스 커버슬립에 접종되었다. 샘플이 함유된 배지는 유동세포 분석법과 유사하게 준비되고, 세포는 37 ℃에서 24시간 동안 샘플과 함께 배양되었다. 상기 세포를 PBS로 세척하고, 4% 파라포름알데히드 용액으로 20분 동안 고정하였다. 상기 커버슬립의 세포는 DAPI로 대조염색되고 커버 글라스에 장착되었다. 그 후, 세포는 공초점 현미경(FV1000, Olympus, Center Valley, PA, USA)으로 촬영하였다.
생체 내(In vivo) 생체분포: 생체 내(in vivo) 종양 이종이식 모델은 피하 무흉선 마우스(male, 6 주령, C3H/HeN, Orient Bio Inc., Seoul, Korea)의 오른쪽 측면으로 KB 세포를 주입하였다. 마우스는 저형광(알팔파 프리) 식이로 유지되고, 광주과학기술연구원(GIST) 위원회의 동물 관리 및 이용의 지침에 따라 처리된다. 종양은 ~150 mm3의 평균 부피로 성장시켰다. 종양이 원하는 크기에 도달한 후, Cy5.5 표지화된 나노입자 샘플(7.5 mg/kg, 200 μl)은 꼬리 정맥을 통해 정맥 내(i.v.)로 주입되었다. 그 후, 형광신호는 주입 후 6h, 12h, 24h, 및 48h에 생체 내(in vivo) 영상 시스템(IVIS 100, Xenogen Corp., Alameda, CA, USA)에 의해 모니터되었다. Cy5.5는 675 nm로 여기되고, 발광 필터는 700 nm로 설정되었다.
형광 노출 시간은 1초이고, 시야(field of view)는 12.5 cm이다. 방사된 신호는 시간 상호 관련된 단일 광자 카운팅 시스템에 의해 수집되고, 마우스는 주입 48시간 후 희생되어 주요 장기를 수득하였다. 절제된 종양, 간, 비장, 신장, 심장 및 폐를 포함하는 주요 장기의 영상을 기록하였다.
근적외선 레이저 매개된 생체 내(in vivo ) 광열 치료: KB 종양 이종이식 마우스가 준비되고 종양이 ~150 mm3의 평균 부피로 성장될 때 치환된 나노입자 샘플(7.5 mg/kg, 200 μl)이 꼬리 정맥을 통해 정맥 내(i.v.)로 주입되었다. 주입 12시간 후, 마우스를 광열치료(PTT)를 위해 레이저로 처리하였다. 각 마우스의 종양은 2 W/cm2 밀도로 10분 동안 연속파 근적외선 레이저 광(808 nm, Dragon Lasers Co., Changchun, China)으로 조사하였다. 마우스의 종양 크기 및 몸무게는 종종 21일 동안 치료기간 동안 측정되었다.

Claims (10)

  1. 산화 나노그래핀의 표면에, 하기 [화학식 1]로 표시되는 트리블록 공중합체, 양 말단이 R1으로 치환된 하기 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체 및 양 말단이 R2로 치환된 하기 [화학식 3]으로 표시되는 트리블록 공중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 공중합체가 포함된 코팅층이 형성된 것을 특징으로 하는 산화 그래핀 나노입자;
    [화학식 1]
    Figure pat00010

    [화학식 2]
    Figure pat00011

    [화학식 3]
    Figure pat00012

    상기 화학식 1 내지 3에서, n은 8 내지 540의 정수이고, m은 16 내지 70의 정수이며;
    상기 화학식 2 및 3에서, R1 및 R2는 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 60의 알킬기, 치환 또는 비치환된 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 60의 아릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 60의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬아미노기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬실릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴실릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 50의 아릴알킬아미노기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 60의 알케닐기, 3 내지 60의 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 60의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 60의 헤테로아릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 60의 할로겐기, 중수소, 수소, 치환 또는 비치환된 cRGD(Cyclic Arginine-Glycine-Aspartic Acid) 펩타이드, 치환 또는 비치환된 엽산(folate), 치환 또는 비치환된 트랜스페린(Transferrin) 단백질, 치환 또는 비치환된 알키린 반족 단백질(Ankyrin repeat protein), 치환 또는 비치환된 단일클론항체(Monoclonal antibody), 치환 또는 비치환된 애피바디(Affibody), 치환 또는 비치환된 LyP-1(Lymphoid tyrosine phosphatase-1) 펩타이드, 치환 또는 비치환된(N-(2-{3-[125I]Iodobenzoyl}aminoethyl)maleimide-F3Cys 아밀로이드 펩타이드, 치환 또는 비치환된 iRGD(Internalizing Arginine-Glycine-Aspartic Acid) 펩타이드, 치환 또는 비치환된 앱타이드(Aptide), 치환 또는 비치환된 A10 앱타머(hairpin structure liked RNA A10 aptamer) 핵산 기반의 리간드, 치환 또는 비치환된 PSMA 앱타머(prostate specific membrane antigen A10 RNA aptamer), 치환 또는 비치환된 키토산(Chitosan), 치환 또는 비치환된 테트라페닐포피린(TPP) 리간드, 치환 또는 비치환된 2-[3-[5-아미노-1-카르복실펜틸]- 우레이도]-클루타르산(ACUPA) 리간드, 치환 또는 비치환된 락토스(Lactose), 치환 또는 비치환된 글루코오스(Glucose), 치환 또는 비치환된 봄베신(bombesin), 치환 또는 비치환된 치환 또는 비치환된 면역글로불린, 및 단일고리로 연결된 두개 항체의 절편(Single-chain variable fragments, scFv)로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 상이하게 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 R1 및 R2에 치환되는 치환기는 수소원자, 중수소 원자, 할로겐 원자, 히드록실기, 시아노기, 니트로기, 아미노기, 아미디노기, 히드라진, 히드라존, 싸이올기(-SH), 카르복실기(-COOH)나 이의 염, 아크릴기(-COC2H3), 술폰산기나 이의 염, 인산이나 이의 염, 탄소수 1 내지 60의 알킬기, 탄소수 2 내지 60의 알케닐기, 탄소수 2 내지 60의 알키닐기, 탄소수 1 내지 60의 알콕시기, 탄소수 3 내지 60의 시클로알킬기, 탄소수 6 내지 60의 아릴기, 탄소수 6 내지 60의 아릴옥시기, 탄소수 6 내지 60의 아릴싸이오기, 탄소수 2 내지 60의 헤테로아릴기, -SiR25R26R27, 및 -NR28R29로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 서로 같거나 상이하게 선택되는 것을 특징으로 하는 산화 그래핀 나노입자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체 및 상기 [화학식 3]으로 표시되는 트리블록 공중합체는 하기 [화학식 4] 또는 [화학식 5]의 화합물 중에서 상이하게 선택되는 것을 특징으로 하는 산화 그래핀 나노입자;
    [화학식 4]
    Figure pat00013

    [화학식 5]
    Figure pat00014
  4. 제1항에 있어서, 상기 [화학식 1]로 표시되는 트리블록 공중합체, 상기 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체 및 상기 [화학식 3]으로 표시되는 트리블록 공중합체는 0-95 : 0-95 : 0-95의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 산화 그래핀 나노입자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 [화학식 1]로 표시되는 트리블록 공중합체, 상기 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체 및 상기 [화학식 3]으로 표시되는 트리블록 공중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 공중합체와 산화 그래핀 나노입자는 51:49 내지 95:5 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 산화 그래핀 나노입자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 산화 그래핀 나노입자는 근적외선 레이저를 조사 시 인간을 제외한 포유류의 종양 조직 부위의 온도가 45 ℃이상으로 상승하는 것을 특징으로 하는 산화 그래핀 나노입자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 [화학식 1] 내지 [화학식 3]의 트리블록 공중합체에서 n은 196이며, m은 67인 것을 특징으로 하는 산화 그래핀 나노입자.
  8. (A) 산화 나노그래핀, 하기 [화학식 1]로 표시되는 트리블록 공중합체, 양 말단이 R1으로 치환된 하기 [화학식 2]로 표시되는 트리블록 공중합체 및 양 말단이 R2로 치환된 하기 [화학식 3]으로 표시되는 트리블록 공중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 공중합체를 혼합하는 단계; 및
    (B) 상기 혼합물을 진탕배양하여 상기 산화 나노그래핀 표면에 트리블록 공중합체 코팅층이 형성되는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 산화 그래핀 나노입자의 제조방법;
    [화학식 1]
    Figure pat00015

    [화학식 2]
    Figure pat00016

    [화학식 3]
    Figure pat00017

    상기 화학식 1 내지 3에서, n은 8 내지 540의 정수이고, m은 16 내지 70의 정수이며;
    상기 화학식 2 및 3에서, R1 및 R2는 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 60의 알킬기, 치환 또는 비치환된 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 60의 아릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 60의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬아미노기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬실릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴실릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 50의 아릴알킬아미노기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 60의 알케닐기, 3 내지 60의 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 60의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 60의 헤테로아릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 60의 할로겐기, 중수소, 수소, 치환 또는 비치환된 cRGD(Cyclic Arginine-Glycine-Aspartic Acid) 펩타이드, 치환 또는 비치환된 엽산(folate), 치환 또는 비치환된 트랜스페린(Transferrin) 단백질, 치환 또는 비치환된 알키린 반족 단백질(Ankyrin repeat protein), 치환 또는 비치환된 애피바디(Affibody), 치환 또는 비치환된 단일클론항체(Monoclonal antibody), 치환 또는 비치환된 LyP-1(Lymphoid tyrosine phosphatase-1) 펩타이드, 치환 또는 비치환된(N-(2-{3-[125I]Iodobenzoyl}aminoethyl)maleimide-F3Cys 아밀로이드 펩타이드, 치환 또는 비치환된 iRGD(Internalizing Arginine-Glycine-Aspartic Acid) 펩타이드, 치환 또는 비치환된 앱타이드(Aptide), 치치환 또는 비치환된 A10 앱타머(hairpin structure liked RNA A10 aptamer) 핵산 기반의 리간드, 치환 또는 비치환된 PSMA 앱타머(prostate specific membrane antigen A10 RNA aptamer), 치환 또는 비치환된 키토산(Chitosan), 치환 또는 비치환된 테트라페닐포피린(TPP) 리간드, 치환 또는 비치환된 2-[3-[5-아미노-1-카르복실펜틸]- 우레이도]-클루타르산(ACUPA) 리간드, 치환 또는 비치환된 락토스(Lactose), 치환 또는 비치환된 글루코오스(Glucose), 치환 또는 비치환된 봄베신(bombesin), 치환 또는 비치환된 면역글로불린, 및 단일고리로 연결된 두개 항체의 절편(Single-chain variable fragments, scFv)으로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 상이하게 선택된다.
  9. (a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 산화 그래핀 나노입자를 인간을 제외한 포유류의 생체 내 또는 시료에 주입하는 단계; 및
    (b) 상기 투여된 산화 그래핀 나노입자에 근적외선 레이저를 조사하여 종양 세포만을 선택적으로 괴사시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 산화 그래핀 나노입자를 이용하여 인간을 제외한 포유류의 종양을 진단 또는 치료하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 근적외선 레이저를 조사 시 인간을 제외한 포유류의 종양 조직 부위의 온도가 45 ℃이상인 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유류의 종양을 진단 또는 치료하는 방법.
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