KR20170041218A

KR20170041218A - 치료제 프리스크리닝용 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20170041218A
Application number: KR1020177004839A
Authority: KR
Inventors: 아비 슈로더; 츠비 야리
Original assignee: 테크니온 리서치 엔드 디벨로프먼트 화운데이션 엘티디.
Priority date: 2014-08-14
Filing date: 2015-08-13
Publication date: 2017-04-14
Also published as: AU2015302873B2; IL250582A0; US10815530B2; US20210040568A1; JP2017529387A; CA2958127A1; US20170233823A1; JP2020172492A; GB201414464D0; AU2015302873A1; WO2016024281A1; IL250582B; CN106714846A; EP3180035A1

Abstract

약물의 세포-특이적 효능 측정용 치료진단적 조성물 및 방법이 제공된다. 추가로, 비제한적으로 종양을 포함하여, 세포 미세환경 내에서 하나 이상의 약물의 치료적 프로파일 연구에 유용한 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

치료제 프리스크리닝용 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR THERAPEUTICS PRESCREENING}

발명의 분야

본 발명은 특히, 치료제의 개인화된 치료적 효능 및 활성의 예측에 유용한 조성물 및 검정에 관한 것이다.

발명의 배경

환자는 약물에 상이하게 반응하고; 치료의 성공은 각 환자에 대하여 올바른 약물의 선택에 크게 의존한다. '개인화된 의약(Personalized Medicines)'은 각 환자의 독특한 질환 제시를 다루는 것 목적으로 한다. 개인화된 의약을 필요로 하는 질환 및 장애는 악성 질환, 염증성 질환 및 신경퇴행성 질환을 포함한다.

암은, 비제한적인 예로서, 병상에서 의약에 대해 낮은 실제의 반응률을 갖는다. 예를 들어, 유방, 식도, 결장 또는 위-암 환자의 60% 미만은 요법에 반응하고; 통계는 폐, 흑색종, 췌장, 간 또는 반복되는 난소암을 갖는 환자에서 30% 미만까지 감소한다. 따라서, 각 환자의 독특한 질환 제시를 다룰, 적절한 치료제에 대한 선택은 치료 결과를 유의미하게 개선할 수 있다.

그의 환자-특이적 항암 활성용 프리스크리닝 약물은 도전적 과제이다. 암 치료가 성공적일 수 있는지를 예측하기 위해 시도한 현존하는 접근법하에서, 생검(biopsy)은 짧은 화학요법적 사이클 이후 환자의 종양으로부터 실시되고, 종양 반응에 대하여 조직학적으로 조사된다. 영상화 기술은 실시간에서 종양 퇴행/진행, 맥관구조 증식 및 대사성 활성에 관한 치료의 효과를 추적할 수 있었다. 그의 항암 활성에 대하여 다중 약물 및 약물 조합을 프리스크리닝하기 위해, 생체외 및 시험관내 검정이 개발되었다. 이들 검정은 환자로부터 생체검사되는 종양 조직에 기반되고 그 다음 시험관내 팽창되거나 생체내 면역-결핍 마우스에 이식된다.

세포 배양 접근법은 이종, 다중-세포성, 종양 미세환경의 부족 때문에 치료적 결과의 예측에서 유효함이 증명되지 않았다. 제2 접근법은 어느 정도 유효함이 증명되었지만; 그러나, 스크린을 위한 마우스의 충분한 수를 생성하기 위해 7-12 개월이 걸린다. 따라서, 약한 및 무-진행성 종양을 갖는 환자만이 상기 검정을 위하여 선택될 수 있다.

유전적 정보 및 환자-특이적 바이오마커는 개인화된 의약의 진전을 도왔다. 그러나, 거의 50%의 환자는 여전히 비-효과적 치료와 불일치되어, 그 다음 '무 반응군'으로 분류된다.

나노기술은, 종양-특이적 바이오-분포, 증가된 세포내 흡수, 및 수용성 및 불용성 약물을 운반하기 위한 능력을 포함하여, 암 치료를 위해 큰 장래성을 갖는다. 나노입자는 또한 원위치에서 항종양 활성의 영상화를 위하여 조영제와 함께 치료적 화물(therapeutic cargo)을 수반하여 운반하기 위한 능력을 갖는다 (즉, 치료진단제) (Zhang, R. et al. 2011, J Nucl Med 52, 958-964).

화학 및 생물 제제의 개인화된 치료적 효능 및 활성 연구를 위한 조성물 및 방법에 대하여 충족되지 않은 욕구가 있다.

발명의 요약

본 발명은 질환으로 고통받는 대상체의 치료제 또는 치료제의 조합에 대한 반응을 예측하고 결정하는데 유용한 조성물 및 방법을 제공한다.

본 발명은, 치료제의 환자 특이적 효능에 대하여, 단일-세포 해상도를 갖는 다중 치료제의 동시의 스크리닝을 가능하게 한 개인화된 접근법을 처음으로 나타낸다. 이로써, 본원에서 개시된 조성물 및 방법은 의사에게 단일 환자를 위해 맞추어진 약물을 선택하기 위한 새로운 손잡이를 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 담체를 포함한 조성물을 제공하고, 상기 적어도 하나의 담체는 하기를 포함한다:

(a) 단일-세포 치료적 유효량의 적어도 하나의 치료제; 및

(b) (a)의 적어도 하나의 치료제를 독특하게 확인한 하나 이상의 바코드.

일부 구현예에서, 조성물은 다수 유형의 담체를 포함하고, 여기에서 각 유형의 담체는 독립적으로 하기를 포함한다:

(a) 단일-세포 치료적 유효량의 적어도 하나의 치료제; 및

일부 구현예에서, 상기 다수의 유형의 담체는 1-5000 유형의 담체이다. 일부 구현예에서, 상기 다수의 유형의 담체는 1-4000 유형의 담체이다. 일부 구현예에서, 상기 다수의 유형의 담체는 1-2000 유형의 담체이다. 일부 구현예에서, 상기 다수의 유형의 담체는 1-500 유형의 담체이다. 다른 구현예에서, 상기 다수의 유형의 담체는 1-200 유형의 담체이다. 다른 구현예에서, 상기 다수의 유형의 담체는 1-10 유형의 담체이다. 다른 구현예에서, 상기 다수의 유형의 담체는 1-5 유형의 담체이다. 다른 구현예에서, 상기 다수의 유형의 담체는 1-4 유형의 담체이다.

또 다른 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 대조 담체를 추가로 포함하고, 상기 대조 담체는 치료제가 없고 상기 대조 담체를 독특하게 확인한 하나 이상의 바코드 (예를 들면, 핵산 분자)를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 치료적 유효량은 실질적으로 단일-세포 치료적 유효량이다. 또 다른 구현예에서, 상기 치료적 유효량은 단일 세포의 상태 조절에 충분하다. 또 다른 구현예에서, 단일 세포의 상태 조절은 하기로부터 선택된다: 세포 증식 조절, 세포 사멸 조절, 세포 약물 내성 조절 및 세포 기능 조절, 활성 또는 생리학 조절. 상기 적어도 하나의 치료제가 세포 막을 가로지를 수 없는 구현예에서, 더 높은 농도의 상기 치료적 유효량이 사용될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 바코드는 상기 대조 담체를 독특하게 확인한 하나 이상의 핵산 분자이다. 또 다른 구현예에서, 상기 핵산 분자는 5-1000 뉴클레오타이드 길이이다. 또 다른 구현예에서, 상기 핵산 분자는 5-500 뉴클레오타이드 길이이다. 또 다른 구현예에서, 상기 핵산 분자는 5-400 뉴클레오타이드 길이이다. 또 다른 구현예에서, 상기 핵산 분자는 5-300 뉴클레오타이드 길이이다. 또 다른 구현예에서, 상기 핵산 분자는 5-250 뉴클레오타이드 길이이다. 또 다른 구현예에서, 상기 핵산 분자는 15-200 뉴클레오타이드 길이이다.

또 다른 구현예에서, 상기 핵산 분자는 상기 세포의 핵산과 실질적으로 동일하지 않거나 상보적이지 않은 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 핵산 분자는 세포의 핵에 진입하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 상기 핵산 분자는 세포의 핵 (예컨대 핵 국재화 신호 (NLS) 또는 핵 수송체)에 진입할 수 있는 성분이 없다.

또 다른 구현예에서, 상기 바코드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 희토류 원소, 형광단, 발색단, 화학발광성(chemilluminescent) 분자, 자기 입자, 염료, 및 방사성 동위원소. 또 다른 구현예에서, 상기 바코드는 희토류 원소이다. 또 다른 구현예에서, 상기 희토류 원소는 란탄족이다.

또 다른 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 최대 250 nm (나노미터)의 직경을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 최소 50 nm의 직경을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 지질-계 입자이다. 또 다른 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 리포솜 및 교질입자로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 치료제, 예컨대 폴리머성 나노입자, 나노겔, (비제한적으로 금 또는 산화철 나노입자를 포함한) 금속 나노입자, 탄소 나노튜브, 층 입자에 의한 층 및 졸-겔 세라믹 입자와 복합된다. 또 다른 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 치료제를 독립적으로 포함한 다수의 담체 및 상기 적어도 하나의 치료제를 독특하게 확인한 핵산 분자를 포함한 조성물이 제공된다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 전신 투여를 위하여 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 종양내 투여를 위하여 제형화된다.

또 다른 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 태그 (예를 들면, 추적자)를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 태그는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 형광단, 발색단, 형광발광성 분자, 자기 입자 또는 염료, 금속, 희토류 및 방사성 동위원소. 일부 구현예에서, 상기 태그는 상기 담체에 의해 성공적으로 표적화된 세포의 스크리닝 및/또는 검출에 유용하다. 일부 구현예에서, 상기 태그는 상기 치료제의 활성 검출에 추가로 유용하다.

또 다른 측면에 있어서, 질환으로 고통받는 대상체의 치료제에 대한 반응을 예측하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 하기 단계:

(a) 상기 대상체에 다수의 유형의 담체를 포함한 조성물의 투여 단계로서, 각 유형의 담체가 독립적으로 단일-세포 치료적 유효량의 적어도 하나의 치료제 및 상기 적어도 하나의 치료제를 독특하게 확인한 하나 이상의 바코드 (핵산 분자)를 포함하는, 단계;

(b) 상기 대상체로부터 세포를 포함한 샘플을 수득하는 단계; 및

(c) 1-5 유형의 담체를 포함한 세포에서, 독특한 바코드에 의해 상기 적어도 하나의 치료제의 효능을 확인하는 단계;를 포함하고

이로써 질환으로 고통받는 대상체의 치료제에 대한 반응을 예측한다.

일부 구현예에서, 상기 대상체는 암으로 고통받는다. 일부 구현예에서, 상기 투여는 정맥내 주입이고 상기 조성물은 상기 대상체의 종양의 단일 세포 당 1-200 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 투여는 종양내 주입이고, 상기 조성물은 상기 대상체의 종양의 단일 세포 당 1-20 담체를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 수득 단계는 상기 조성물의 투여 이후 24-72 시간의 기간 내에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 수득 단계는 상기 조성물의 투여 이후 24-48 시간의 기간 내에서 수행된다.

또 다른 구현예에서, 상기 방법은 상기 핵산 분자의 서열분석의 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 상기 핵산 분자의 증폭의 단계를 추가로 포함한다.

또 다른 구현예에서, 상기 샘플은 단계 (c)에 앞서 단일-세포 서스펜션 속으로 분해된다.

또 다른 구현예에서, 상기 조성물의 상기 적어도 하나의 담체는 적어도 하나의 태그를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 샘플의 상기 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 이용하여 분류된다: FACS, 자기 비드 분류, 효소-결합 면역흡착 검정　(ELISA), 미세유체 기반 분류, 세포-긴장 기반 분류 등등.

본 발명의 추가 구현예 및 적용가능성의 전체 범위는 이하에서 주어진 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형이 이런 상세한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가에 명백해질 것이기 때문에, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내는 동안, 상세한 설명 및 특이적 실시예가 단지 설명으로써 주어진다는 것을 이해하여야 한다.

도 1A-E. 환자의 종양 내부에서 항암 치료제의 효능을 예측하기 위한 비제한적 예의 도식적 실례. (A) 약물, DNA 바코드, 및 형광 염료를 함유한 나노입자의 제작. (B) 상이한 약물을 함유한, 나노입자의 칵테일이 극도로 낮은 용량으로 대상체에 투여된다. (C) 48 시간 후, 코어 생검은 종양으로부터 실시되고, 단일-세포 서스펜션 속으로 해리된다. (D) 서스펜션은, 나노입자 내부에서 형광 염료를 이용하여, 나노입자 흡수에 기반하여 (예를 들면, FACS에 의해) 분류된다. 그 다음 (E) 세포는 생존도 염색을 이용하여 약물 효능 (활성/무활동, I/0)에 따라 분류되고, 활성은 세포 내부에서 DNA 바코드 농도를 측정함으로써 내부 약물 또는 약물 조합과 상관된다. 비치료된 세포 (e')의 운명은 대조로서 유사하게 분석된다.
도 2. 나노입자 합성 및 바코딩을 위하여 고 처리량 접근법(high throughput approach)의 비제한적 예의 도식적 실례가 이용될 수 있다. 미세유체 소자 (왼쪽). 수성상 (최하부 회색 채널) - DNA 및 친수성 치료제가 입자 속으로 부하된다. 수성 맥동류는 미세유체 소자에서 전단 속도를 규제하기 위해 사용된다. 유기상 (최상부 백색 채널) - 다양한 지질 빌딩 블록 및 소수성 약물은 입자의 구조적 인자를 변경하기 위해 대조 펌프를 이용하여 조합된다. 각 입자는 바코드에 상응하는 단 하나의 약물을 함유한다.
도 3A-F. 악성 세포에서 바코딩된 나노입자. DNA 바코드는 1,000 (A), 500 (B), 5 (C) 세포의 클러스터 내부에서, 및 단일 세포 (D) 내부에서 검출되었다. 바코드는 다양한 길이 - 50, 85, 및 120 bp (E)일 수 있거나 또는 추가의 수단을 이용하여 표지될 수 있다. (F) DNA의 복사체이 공초점 현미경 관찰은 4T1 유방 암 세포 내부에서 나노입자를 바코딩하였다. 세포성 막은 적색으로 염색되고 (회색으로 묘사되고), 핵은 청색으로 염색되고 (화살표로 묘사되고), 입자는 백색 점으로서 묘사된다.
도 4. 1차 종양 및 실험적인 전이. 삼중-음성 전이성 유방 암 모델은 4T1 세포의 국부 (허벅지에서 1차 종양, 하부 이미지) 또는 정맥내 (폐 전이, 상부 이미지) 주입에 의해 BALB/c 마우스에서 확립되었다. 1차 종양을 갖는 동물은 정맥내로 바코딩된 나노입자로 주사되었다. 1차 및 전이성 부위에 대한 입자의 바이오-분포는 평가되었고 다양한 약물의 치료적 효능은 스크리닝되었다.
도 5. 종양 조직 내부에서 바코드 분포를 입증한 막대 그래프. 그래프는 자유 바코드로 투여된 동물과 캡슐화된 바코드로 투여된 동물 사이에서 바코드 농도를 도시한다. 대조는 바코드가 없었다.
도 6. 상이한 크기를 갖는 리포솜의 DNA 세포 흡수를 입증한 막대 그래프.
도 7A-B. DOX 치료 이후 살아있는 그리고 죽은 종양 세포 내부에서 바코드 분포를 입증한 막대 그래프. 위약 NPs (A)와, DOX (B)를 함유한 바코딩된 NPs 사이의 종양 세포 내부에서 바코드 분포의 비교.
도 8A-F. 치료진단제 바코딩된 나노입자를 입증한 막대 그래프. 대조 화합물 또는 상이한 약물: 위약 (A), 카페인 (B), 시스플라틴 (C), 독소루비신 (D) 및 젬시타빈 (E)를 함유한 바코딩된 나노입자는 뒷쪽 허벅지에서 1차 종양을 갖는 BALB/c 마우스에 정맥내로 동시에 주사되었다. 48 시간 후, 입자를 종양에서 축적하는 것 및 치료적 활성을 수행하는 것이 가능하면, 생검은 종양으로부터 실시되었다. 생검 조직은 그 다음 단일-세포 서스펜션 속으로 해리되었고, 세포는 (살아있는/죽은) 그의 생존도에 따라 스크리닝되었다. 약물 (젬시타빈, 시스플라틴) 바코드의 상승된 수준은 살아있는 세포와 대비하여 죽은 세포에서 발견되었다. 중성 화합물, 카페인은 모든 살아있는 및 죽은 세포에서 유사한 바코드 수준을 가졌다. y-축은 세포 내부에서 발견된 바코드의 수를 나타낸다. (F) 약물의 효능은 죽은 세포로부터 추출된 바코드의 수를 각 약물에 대하여 살아있는 세포로부터 추출된 바코드의 수로 등분함으로써 계산되었다. 값은 로그 척도로 나타낸다.
도 9A-D. 바코딩 분석에 기반된 치료적 효능. 도 9A-B 및 D는 상이한 치료적 그룹 사이에서 종양 용적 변화를 비교한 막대 그래프이다. 각 그룹은 화학 약물 독소루비신, 시스플라틴, 또는 젬시타빈의 매주 용량을 받았다. 대조 그룹은 염수를 받았다. 각 그룹의 대표적인 종양 치수. 종양은 치료 개시 이후 23 일 추출되었다. 각 그룹의 종양/신체 중량. 모든 종양 및 신체는 희생 일 (9C)에 측정되었다. 데이터는 (n = 6/그룹); * P<0.01; **** P < 0.0001의 평균 +/- SDE로서 계산되었다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 병변에 대한 치료제 또는 치료제의 조합의 치료적 효능 예측 및 결정에 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에서 개시된 조성물 및 방법은 각 환자의 독특한 질환 제시를 설명하기 위해 치료 맞춤을 가능하게 한다.

아래 본원에서 입증된 바와 같이, 담체 (예를 들면, 나노입자)는, 치료 주기 시작에 앞서, 병변 (예를 들면, 암성 병변)의 내부에서 약물 또는 약물 조합의 치료적 효능을 시험하기 위해 치료진단적 게이지로서 작용한다.

일부 구현예에서, 담체는 치료제 및 상응하는 바코드, 및 임의로 태그를 포함한다. 각 담체는, 단 하나의 세포를 치료하기에 충분한, 및 전신 치료적 역치에 상당히 못미치는, 약물의 극도로 낮은 용량을 함유한다.

일부 구현예에서, 적어도 하나의 담체를 포함한 조성물이 제공되고, 상기 적어도 하나의 담체는 하기를 포함한다: 치료적 유효량의 적어도 하나의 치료제; 적어도 하나의 치료제를 독특하게 확인한 핵산 분자; 및 임의로 태그 (즉, 추적자).

일부 구현예에서, 적어도 하나의 치료제 및 핵산 분자는 적어도 하나의 담체 내에서 캡슐화된다. 담체가 태그를 추가로 포함하는 구현예에서, 적어도 하나의 치료제, 핵산 분자, 및 태그는 적어도 하나의 담체 내에서 캡슐화된다.

또 다른 구현예에서, 다수의 담체를 포함한 조성물이 제공되고, 각 담체는 독립적으로 적어도 하나의 치료제 및 상기 적어도 하나의 치료제를 독특하게 확인한 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 치료제 또는 이의 조합을 독립적으로 포함한 1-5 유형의 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 치료제 또는 이의 조합을 독립적으로 포함한 1-10 유형의 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 치료제 또는 이의 조합을 독립적으로 포함한 1-200 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 치료제 또는 이의 조합을 독립적으로 포함한 1-2000 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 치료제 또는 이의 조합을 독립적으로 포함한 2-500 유형의 담체를 포함한다. 이와 같이, 본 발명의 조성물 및 방법은 단일 세포 해상도(cell resolution)에서 다중 치료제 또는 이의 조합의 동시 스크리닝을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 단일 세포 해상도에서 종양-치료제 또는 이의 조합의 동시 스크리닝을 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같이 "담체의 유형"은 하나 이상의 치료제의 동일한 구성을 차후의 유사한 용량으로 포함한 담체를 지칭한다.

치료제

일부 구현예에서, 상기 치료적 유효량은 실질적으로 단일-세포 치료적 유효량이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료적 유효량" 또는 "유효한 양"은, 원하는 치료적 결과를 달성하기 위해, 복용량으로 그리고 필요한 기간 동안, 유효한 양을 지칭한다. 치료제의 치료적 유효량은 장애 또는 증상의 성질 및 특정한 제제에 의존할 것이고 당해 분야의 숙련가에 공지된 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "단일-세포 치료적 유효량"은 단일 세포에서 원하는 치료적 결과를 달성하기에 충분한 유효량을 지칭한다. 특정 구현예에서, 치료제의 상기 단일-세포 치료적 유효량은 상기 치료제의 최소 유효한 용량 (MED)과 비교하여 제제의 상당히 낮은 용량이다. 일부 구현예에서, 상기 단일-세포 치료적 유효량은 상기 치료제의 최소 유효한 용량 (MED)과 비교하여 제제의 최대 0.1%, 0.01%, 0.001% 또는 0.0001%이다. 일부 구현예에서, "단일-세포 치료적 유효량"은 단일 세포에서 원하는 치료적 결과를 달성하기에 충분한 최소 유효량을 지칭한다. 양은 세포 유형, 약물 유형 및/또는 치료의 지속시간에 의존하여 상이할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 원하는 약물이 조성물의 다른 성분과 반응할 수 있는, 단일 세포 당 치료적 유효량의 약물을 제공하기 위해, 과잉량의 약물이 사용된다. 비제한적 예로, 시스플라틴은 바코드 DNA와 반응할 수 있고, 따라서 치료적 유효량의 시스플라틴을 갖는 세포를 제공하기 위해 과잉량이 캡슐화된다.

일부 구현예에서, 제한된 양의 치료제는 사용될 수 있다. 비제한적 예로서, 슈도모나스 독소의 단일 복제물(single copy)은 표적화된 세포를 사멸시키기에 충분하다.

또 다른 구현예에서, 상기 단일-세포 치료적 유효량은 단일 세포의 상태 조절 또는 단일 세포에서 원하는 치료적 결과 달성을 위하여 실질적으로 충분하다. 또 다른 구현예에서, 상기 치료적 유효량은 단일 세포의 상태 조절 또는 단일 세포에서 원하는 치료적 결과 달성을 위하여 충분한 양의 50%, 40%, 30, 20% 또는 10% 이하이다.

치료적 결과는, 예를 들면, 증상의 감소, 장기적인 생존, 개선된 이동, 등등일 수 있다. 치료적 결과는 "치유"일 필요는 없다. 치료적 결과는 또한 예방적일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 단일 세포의 상태 조절은 하기로부터 선택된다: 세포 증식 조절, 세포 사멸 조절, 세포 약물 내성 조절, 세포 기능 조절, 활성 또는 생리학 조절. 일부 구현예에서, 세포 기능 또는 활성 조절은 비제한적으로, 예를 들어, 세포내 또는 트랜스-막 단백질 또는 지질을 포함하여, 하나 이상의 단백질의 RNA 전사, 번역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 단일 세포의 상태 조절은 세포 성분 또는 바이오마커의 존재, 부재, 수준 (예를 들면, 증가 또는 감소), 활성화 또는 저해의 조절을 포함한다. 세포 성분 또는 바이오마커는 비제한적으로 유전자, 유전자 생성물 (예를 들면, RNA, mRNA, miRNA) 및 아미노산 분자 (예를 들면, 단백질)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 활성은 대사성 활성이다.

일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 치료제는 상기 세포의 막을 가로지를 수 없다. 상기 구현예에서, 상기 치료적 유효량은, 예를 들면, 단일 세포 치료를 위한 농도와 비교하여 더 높은 농도일 수 있다. 세포 막을 가로지를 수 없는 치료제의 예는 비제한적으로 RNA 및 친수성 약물을 포함한다.

바코드

한 구현예에서, 상기 바코드는 하나 이상의 핵산 분자이다. 핵산 분자, 예컨대 DNA 가닥은 비제한된 수의 바코딩 옵션을 나타낸다. 본 발명 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이 "바코드", "DNA 바코드"는 모두 서로 교환가능하고 동일한 의미를 갖는다. DNA 바코드로서 작용한 본 발명의 핵산 분자는 데옥시핵산 또는 리보핵산 또는 모두의 폴리머이고, 임의로 합성, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오타이드 염기를 함유한, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는, 예를 들면, 바이오틴, 방사선표지, 또는 형광성 표지로 표지된다.

당해 분야의 숙련가에 의해 인정될 바와 같이, 치료제 담체 속으로 독특한 DNA 바코드의 편입 (캡슐화)은 비제한적으로 마이크로어레이 시스템, PCR, 핵산 하이브리드화 ("블로팅" 포함) 또는 고 처리량 서열분석을 포함한 검정을 이용하여 개별적인 치료제의 확인을 허용한다.

일부 구현예에서, 세포의 음으로 하전된 지질 이중층을 통한 음으로 하전된 DNA 바코드의 침투는 본 발명의 담체 내에서 DNA 바코드의 캡슐화로 가능해진다.

일부 구현예에서, 핵산 분자의 서열은 환경에서 천연 발생인 또는 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 표적화된 상기 세포에서 특히 천연 발생인 물질/물체/입자와 관련된 서열, 패턴, 서명 또는 임의의 다른 핵산 서열을 배제한다. 추가의 구현예에서, 핵산 분자의 서열은 천연 발생 뉴클레오타이드 서열과 관련할 수 있는 10 염기 초과의 뉴클레오타이드 서열, 및 특히 엑손이 없다. 또 다른 구현예에서, 상기 핵산 분자는 (예컨대 세포의 게놈 물질과 핵산 분자의, 특히 상기 세포의 하이브리드화를 예방하기 위해 및/또는 위 양성 증폭 결과를 예방하기 위해) 상기 세포의 게놈 물질과 실질적으로 동일하지 않은 또는 상보적이 아닌 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 핵산 서열은 분자 비콘으로서 추가로 작용할 수 있다. 상기 핵산 서열은 전형적으로 단일 가닥 분자 예컨대 헤어핀 형상일 수 있다. 상기 핵산 분자는 세포에서 상보적 유전자의 검출을 위하여, 예컨대 세포 내부에서 유전적 돌연변이의 검출을 위하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 돌연변이 함유 서열에 상보적인 서열을 갖는다.

일부 구현예에서, 상기 핵산 분자는 사전-정의된 독특한 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "독특한 서열" 또는 "독특하게 확인한(uniquely identifying)"은 차별성을 보존하는 단사 함수(injective function)　(또한 일명, 일대일 함수(one-to-one function)에 기반된 서열을 지칭한다.

독특한 바코드 (예를 들면, 독특한 서열을 갖는 핵산)는 본 발명의 예측 방법의 시행 이후 담체 내에서 상응하는 적어도 하나의 치료제의 확인에 적합하다. 핵산 서열의 존재 및 확인의 검출 방법은 숙련가에 공지되고 (예를 들면, Ilumina Inc.에 의해 상업적으로 이용가능한) 다중 바코드의 존재를 향상시킬 수 있는 서열분석 및 어레이 (예를 들면, 마이크로어레이) 시스템을 포함한다.

일부 구현예에서, 예컨대 증가된 정확도가 바람직한 경우, 핵산 분자는 서열분석 및/또는 증폭 검정 (예를 들면 PCR)에 적합한 길이를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 상기 핵산 분자는 본 발명의 담체 속으로 부하에 적합한 길이를, 바람직하게는 나노크기로 가질 수 있다. 상기 핵산 분자의 길이가 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용된 담체의 유형 및 크기에 의존적임이 인정되어야 한다 (예를 들면, 더 짧은 서열은 나노입자에서 사용에 적합하지만 반면에 더 긴 서열은 극미립자에서 사용될 수 있다).

또 다른 구현예에서, 상기 핵산 분자는 최대 1000, 최대 900, 최대 800, 최대 700, 최대 600, 최대 500, 최대 450, 최대 400, 최대 350, 최대 300, 최대 250, 최대 200, 최대 190, 최대 180, 최대 170, 최대 160, 최대 150, 최대 140, 최대 130 또는 최대 120 염기의 길이를 갖고, 여기에서 각 가능성은 본 발명의 별도 구현예를 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 상기 핵산 분자는 최소 5, 최소 6, 최소 7, 최소 8, 최소 9, 최소 10, 최소 11, 최소 12, 최소 13, 최소 14, 최소 15, 최소 16, 최소 17, 최소 18, 최소 19 또는 최소 20 염기, 최소 21, 최소 22, 최소 23, 최소 24, 최소 25, 최소 26, 최소 27, 최소 28, 최소 29 또는 최소 30 염기, 최소 40, 최소 50, 최소 60, 최소 70, 최소 80, 최소 90, 최소 100 또는 최소 200, 최소 300, 최소 400 또는 최소 500 염기의 길이를 갖고, 여기에서 각 가능성은 본 발명의 별도 구현예를 나타낸다.

핵산 길이의 비 제한적 예는 비제한적으로 5-50 염기, 5-40 염기, 5-30 염기, 5-25 염기, 5-24 염기, 5-23 염기, 5-22 염기, 5-21 염기, 5-20 염기, 5-19 염기, 5-18 염기, 5-17 염기, 5-16 염기 또는 5-15 염기, 15-50 염기, 15-60 염기, 15-70 염기, 15-80 염기, 15-90 염기, 15-100 염기, 15-200 염기, 15-250 염기 또는 15-500 염기를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 각 담체 내에서 상기 핵산 분자는 담체 당 또는 표적화된 세포 당 하나 이상의 가닥의 농도를 갖는다. 핵산 분자의 양을 결정하는 것은 당해 분야의 숙련가의 능력하에서 수월하다. 또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 1-10000 핵산 분자이다. 또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 1-1000 핵산 분자이다. 또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 1-5000 핵산 분자이다. 또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 1-500 핵산 분자이다. 또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 5-500 핵산 분자이다. 당해 분야의 숙련가는 각 입자에서 핵산 분자의 양이 수행된 특이적 검정, 예를 들면, 서열분석 및/또는 증폭 검정에 맞추기 위해 사전-결정될 수 있음을 인식할 것이다.

일부 구현예에 있어서, 각 입자는 독특한 바코드를 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 독특한 바코드로 각 입자 (즉, 담체)의 바-코딩이 단일 세포에 진입한 입자의 양을 나타낼 수 있음을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 질환을 치료하기 위한 치료적 용량의 결정 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에 다수의 유형 담체를 포함한 조성물 투여를 포함하고, 여기에서 각 유형 담체는 하나 이상의 치료제를 포함하고, 여기에서 각 유형의 담체는 상기 하나 이상의 치료제의 용량에서 상이하다.

일부 구현예에 있어서, 각 유형의 입자 (즉, 담체)는 상기 유형의 담체를 확인한 독특한 바코드 (예를 들면, 핵산 서열)를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 각 입자 (즉, 담체)는 상기 유형의 담체를 확인한 독특한 바코드 (예를 들면, 핵산 서열)을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 상기 바코드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 희토류 원소, 형광단, 발색단, 화학발광성 분자, 자기 입자, 염료, 및 방사성 동위원소.

또 다른 구현예에서, 상기 바코드는 희토류 원소이다. 또 다른 구현예에서, 상기 희토류 원소는 란탄족이다. 일부 구현예에서, 상기 란탄족은 하기로부터 선택된다: 란탄 (La), 세륨 (Ce), 　프라세오디뮴 (Pr), 네오디뮴 (Nd), 프로메튬 (Pm), 사마륨 (Sm), 　유로퓸 (Eu), 가돌리늄 (Gd), 테르븀 (Tb), 디스프로슘 (Dy), 홀뮴 (Ho), 에르븀 (Er), 툴륨 (Tm), 이테르븀 (Yb),　루테튬 (Lu), 스칸듐 (Sc) 및 이트륨 (Y). 또 다른 구현예에서, 상기 희토류 원소는 란탄족이다. 일부 구현예에서, 상기 란탄족은 La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb 및 Lu로부터 선택된다.

희토류 원소(예를 들면, 란탄족)는 발광 표지와 복합된 경우 유용할 수 있고, 검출가능한 광학적 반응을 수득하기 위해 선택된 조건 하에서 당해 샘플과 란탄족 착물을 조합함으로써 일반적으로 이용된다. 샘플은 광학적 반응을 유도하기 위해 선택된 파장에서 발광될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 조성물 내에서 상기 담체는 세포내의 바코드로서 상기 핵산 분자를 작동가능하게 이용하기 위해 추가 제제 (예를 들면 화학 또는 생물 제제)를 추가로 포함한다. 상기 제제의 비제한적 예는, 예컨대 DNA 또는 RNA 바코드, 각각의 내인성 또는 외인성 효소에 의한 분해를 예방하기 위해 DNase 또는 RNase를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물을 형성한 용액에서 바코드 농도는 2 내지 100 마이크로몰/리터 (μM) 사이에서 변할 수 있다. 일부 구현예에서, 용액내 바코드 농도는 10 내지 90 마이크로몰/리터 (μM) 사이에서 변할 수 있다. 일부 구현예에서, 용액내 바코드 농도는 20 내지 80 마이크로몰/리터 (μM) 사이에서 변할 수 있다. 일부 구현예에서, 용액내 바코드 농도는 30 내지 70 마이크로몰/리터 (μM) 사이에서 변할 수 있다.

한 구현예에서, 본원에서 기재된 조성물은, 데이터의 통계적 유의도를 보장하기 위해, 분석된 세포의 양에 비해, 작은 수의 나노입자를 포함한다. 전형적으로, 종양에 관해 약물(들)의 치료적 효과를 분석하기 위해, 암 조직의 1 ml³에서 종양 세포의 평균 수는 10⁶ 세포이다. 전체의 조직에서 세포의 총 수는 몇 수천만 세포이다. 즉, 세포 당 조합 가능성의 이론적 수는, 각각의 세포에 진입하기 위한 충분한 바코드인 것을 추정하는, N! (계승) (여기에서 N은 바코드의 수이다)이다. 옵션의 수를 감소시키기 위해, 분석된 조직의 세포 당 바코딩된 나노입자의 수는 바람직하게는 5 미만이다.

한 구현예에서, 1-5 유형의 담체 (즉, 바코딩된 나노입자)는 세포 당 존재한다. 또 다른 구현예에서, 세포 당 1-5 유형의 담체의 존재는 충분한 데이터 및 높은 신호 대 잡음비 (SNR)를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 세포 당 1-5 유형의 담체를 포함한 세포는 분석된다. 또 다른 구현예에서, 세포 당 1-4 유형의 담체를 포함한 세포는 분석된다.

본 발명은, 세포 당 최대 5 바코드 유형의 존재를 달성하기 위해 주사되어야 하는 입자의 양이, 정맥내로 주사된 용량의 6-7%가 종양 부위에 축적하고 종양 부위에 실제로 도달한 나노입자의 5%가 세포에 의해 섭취되고, 그 동안 나머지가 세포외 매트릭스 (ECM)에서 포획되는 것을 고려함으로써, 계산될 수 있다는 발견에 부분적으로 기반된다.

한 구현예에서, 종양 세포 당 1-200 입자는 정맥내 주입을 통해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 종양 세포 당 1-300 입자는 정맥내 주입을 통해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 종양 세포 당 1-400 입자는 정맥내 주입을 통해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 종양 세포 당 1-500 입자는 정맥내 주입을 통해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 종양 세포 당 1-1000 입자는 정맥내 주입을 통해 투여된다.

또 다른 구현예에서, 종양 세포 당 1-20 입자는 종양내로(intratumoraliy) 투여된다. 또 다른 구현예에서, 종양 세포 당 1-10 입자는 종양내로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 종양 세포 당 1-50 입자는 종양내로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 종양 세포 당 1-100 입자는 종양내로 투여된다.

일부 구현예에서, 입자 내부에서 바코드 분자의 양은 최소 1, 또는 대안적으로 최소 5, 또는 대안적으로 최소 10, 또는 대안적으로 최소 20, 또는 대안적으로 최소 30, 또는 대안적으로 최소 40, 또는 대안적으로 최소 50, 또는 대안적으로 최소 60, 또는 대안적으로 최소 70, 또는 대안적으로 최소 80, 또는 대안적으로 최소 90, 또는 대안적으로 최소 100, 또는 대안적으로 최소 500, 또는 대안적으로 최소 1000, 또는 대안적으로 최소 5000, 또는 대안적으로 최소 10000 바코드 분자/입자이다. 일부 구현예에서, 입자 내부에서 바코드 분자의 양은 최대 5, 또는 대안적으로 최대 10, 또는 대안적으로 최대 20, 또는 대안적으로 최대 30, 또는 대안적으로 최대 40, 또는 대안적으로 최대 50, 또는 대안적으로 최대 60, 또는 대안적으로 최대 70, 또는 대안적으로 최대 80, 또는 대안적으로 최대 90, 또는 대안적으로 최대 100, 또는 대안적으로 최대 500, 또는 대안적으로 최대 1000, 또는 대안적으로 최대 5000 바코드 분자/입자이다. 일부 구현예에서, 입자 내부에서 바코드 분자의 양은 5-100 바코드 분자/입자 범위이다. 일부 구현예에서, 입자 내부에서 바코드 분자의 양은 10-90 바코드 분자/입자 범위이다. 일부 구현예에서, 입자 내부에서 바코드 분자의 양은 20-80 바코드 분자/입자 범위이다. 각 가능성은 본 발명의 별도 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 입자 내부에서 바코드 분자의 양은 1-1000 바코드 분자/입자 범위이다. 일부 구현예에서, 입자 내부에서 바코드 분자의 양은 1-10000 바코드 분자/입자 범위이다.

태그

또 다른 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 담체는 적어도 하나의 태그 또는 검출가능한 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 동일한 태그는 모든 담체를 위하여 사용된다. 다른 구현예에서, 독특한 태그는 담체의 하위-세트에 사용된다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 태그는 비제한적으로 형광단, 발색단, 화학발광성 분자, 방사선-마커, 금속, 희토류, 자기 입자 또는 염료를 포함한다.

일부 구현예에서, 태그 또는 검출가능한 모이어티는 비제한적으로 면역학적 검정 예컨대 ELISA, 비드-, 칩- 또는 플레이트-계 멀티플렉스 면역검정, 질량 분광분석법, 전기영동, 면역비탁법(immunonephelometry), 면역혼탁법(immunoturbidimetry), 효소 검정, 예를 들면 측광법에 의해 평가가능한 비색 또는 형광 검정, 및 형광-관련된 세포 분류 (FACS)-계 분석을 포함한 검정에서 또는 다른 임상적으로 확립된 검정에 의해 유용한 태그이다. 모든 이들 방법은 당해 기술의 숙련가에게 잘 알려지고, 문헌에 기재된다.

전형적으로, 태그의 양은 수행된 검정에 의존할 것이고 당해 분야의 숙련가의 능력에 의해 결정될 수 있고 능력하에 수월하다. 일부 구현예에서, 담체는 상기 태그의 1 분자 또는 초과 분자를 포함한다.

담체 (Carriers)

일부 구현예에서, 치료제(들)용 담체, 상기 치료제(들)의 DNA 바-코딩에 유용한 핵산 서열 및 임의로 태그가 제공된다. 본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용된 상기 담체는, 생물학적 분자를 포함한, 표적 특이적 분자, 예컨대 표면 폴리펩타이드, 예를 들면, 비정상적으로 성장한 세포, 암 세포, 면역 세포 및 퇴행성 세포 상에서 폴리펩타이드를 포함한, 폴리펩타이드를 표적할 수 있다.

대안적인 구현예에서, 본 발명은, 비정상적으로 성장한, 이환된, 감염된, 기능이상 및/또는 세포 수용체를 선택적으로 표적하는, (본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용된 화합물 포함에 더하여) 분자, 예를 들면, 펩타이드 또는 항체를 포함한 나노입자 및 리포솜 막의 형태로 담체를 제공한다.

일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 예컨대 운반된 물질 (치료제, 핵산 분자 및 임의로 태그)이 내부 코어 내부에 있는 소포의 형태이다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 지질-계 입자이다. 또 다른 구현예에서, 상기 지질-계 입자는 리포솜이다. 또 다른 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 교질입자이다.

일부 구현예에서, 용액은 지정된 세포에 불활성이고 이에 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예에서, 치료제 이외에, 조성물의 모든 성분은 지정된 세포에 불활성이고 이에 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예에서, 용액은 수용액이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 양이온성 표면활성제(이는 세포에 영향을 미칠 수 있고/있거나 치료제의 활성에 영향을 미칠 수 있고, 치료제의 효과의 정확한 분석을 방해할 수 있기 때문에)가 없다.

일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 예컨대 운반된 물질 (치료제, 핵산 분자 및 임의로 태그)이 또 다른 제제 예컨대 폴리머/단백질/염과 함께 또는 없이 운반된 물질과 복합체/미립자를 형성하는 소포(vesicle)의 형태이다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 성분이 폴리머성 골격에 접합된 또는 반데르발스 또는 소수성 상호작용을 통해 복합된 덴드리머 유사 구조를 형성한다.

일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 폴리머성 나노입자이다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 나노겔이다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 금속 나노입자 (예를 들면, 금 또는 산화철 나노입자)이다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 탄소 나노튜브이다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 층 입자에 의한 층이다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 졸-겔 세라믹 입자이다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 약물을 갖는 단백질 복합체이다.

일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 성분이 폴리머성 골격에 접합된 또는 반데르발스 또는 소수성 상호작용을 통해 복합된 덴드리머 유사 구조를 형성한다.

한 구현예에서, 담체 (예를 들면, 리포솜)는 세포에 세포외 매트릭스를 통해 그의 진입을 용이하게 하기 위해 500 nm 미만 직경이다. 한 구현예에서, 담체 (예를 들면, 리포솜)는 세포에 세포외 매트릭스를 통해 그의 진입을 용이하게 하기 위해 400 nm 미만 직경이다.

한 구현예에서, 담체 (예를 들면, 리포솜)는 300 nm 미만 직경, 250 nm 미만, 200 nm 미만 직경, 150 nm 미만 직경, 100 nm 미만 직경, 50 nm 미만 직경, 20 nm 미만 직경, 10 nm 미만 직경 또는 5 nm 미만 직경이다. 또 다른 구현예에서, 담체 (예를 들면, 리포솜)는 최소 1 nm 직경, 최소 5 nm 직경, 최소 10 nm 직경, 최소 20 nm 직경, 최소 30 nm 직경, 최소 40 nm 직경, 최소 50 nm 직경, 최소 60 nm 직경, 최소 70 nm 직경, 최소 80 nm 직경, 최소 90 nm 직경, 최소 100 nm 직경, 최소 1500 nm 직경, 최소 200 nm 직경, 최소 250 nm 직경 또는 최소 300 nm 직경이다. 각 가능성은 본 발명의 별도 구현예를 나타낸다.

또 다른 구현예에서, 담체는 1-300 nm 직경이다. 또 다른 구현예에서, 담체는 10-250 nm 직경이다. 또 다른 구현예에서, 담체는 5-250 nm 직경이다. 또 다른 구현예에서, 리포솜은 20-150 nm 직경이다. 또 다른 구현예에서, 리포솜은 5-150 nm 직경이다. 또 다른 구현예에서, 리포솜은 20-150 nm 직경이다.

일부 구현예에서, 정맥내 투여용 담체는 5-250 nm 직경이다. 일부 구현예에서, 여기에서 정맥내 투여용 담체는 리포솜이고, 담체는 40-250 nm 직경이다. 일부 구현예에서, 종양내 투여용 담체는 5-300 nm 직경이다. 일부 구현예에서, 여기에서 종양내 투여용 담체는 리포솜이고, 담체는 40-300 nm 직경이다.

일부 구현예에서, 담체의 형태학은 구형 또는 실질적으로 구형, 비-구형 (예를 들면 타원형, 관형, 등), 불규칙형 등일 수 있다.

표적 세포에 치료제 및 핵산의 전달을 용이하게 하기 위한 리포솜 전달 비히클의 사용은 본 발명에 의해 고려된다. 리포솜 (예를 들면, 리포솜 지질 나노입자)은 연구, 산업, 및 의약의 다양한 적용에서, 특히 생체내 진단적 또는 치료적 화합물의 전달 비히클로서 그의 용도에 일반적으로 유용하고 (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998; Drummond et al., Pharmacol. Rev., 51: 691-743, 1999) 하나 이상의 이중층의 막에 의해 외부 배지로부터 격리된 내부 액체 공간을 갖는 현미경적 소포를 보통 특징으로 한다. 리포솜의 이중층 막은 양친매성 분자, 예컨대 공간적으로 분리된 친수성 및 소수성 도메인 (Lasic, 앞에서 언급한 것)을 포함하는 합성 또는 천연 기원의 지질에 의해 전형적으로 형성된다. 리포솜의 이중층 막은 또한 양친매성 폴리머 및 표면활성제 (예를 들면, 폴리머로솜, 니오솜, 등)에 의해 형성될 수 있다.

한 구현예에서, 담체는 표적 세포에 치료제 및 핵산 분자 (DNA 바코드)의 전달을 최적화하기 위해 선택 및/또는 제조될 수 있다. 예를 들어, 만일 표적 세포가 간세포이면 전달 비히클 (예를 들면, 크기, 전하 및/또는 pH)의 특성은 표적 세포에 상기 전달 비히클을 효과적으로 전달하기 위해 최적화될 수 있다. 대안적으로, 만일 표적 세포가 (예를 들면, 신경퇴행성 질환의 요법 서술용) 중추신경계이면, 전달 비히클의 선택 및 제조는 혈액 뇌 장벽 내에서 체류, 및 장벽에 침투 및/또는 상기 표적 세포에 상기 전달 비히클의 직접적 전달의 대안적 수단의 이용을 고려해야 한다.

원하는 독립체의 리포솜 속으로 편입 과정(process of incorporation)은 종종 "부하(loading)"로 지칭된다 (Lasic, et al., FEBS Lett., 312: 255-258, 1992). 리포솜-편입된 치료제, 핵산 및/또는 태그는 리포솜의 내부 공간에서, 리포솜의 이중층 막 내에서 완전히 또는 부분적으로 위치될 수 있다. 리포솜 속으로 제제의 편입은 또한 본원에서 제제가 리포솜의 내부 공간 내에서 전적으로 함유되는 "캡슐화"로 지칭된다. 전형적으로, 담체 (예를 들면 리포솜) 내에서 제제의 캡슐화를 위하여, 화학 연결, 예컨대 제제와 담체 사이에서 공유 결합은 요구되지 않는다. 전달 비히클, 예컨대 리포솜 속으로 제제 편입의 목적은 종종 제제 (예를 들면, 핵산)를 분해하는 효소 또는 화학물질을 함유할 수 있는 환경 및/또는 제제의 급속 배출을 일으키는 시스템 또는 수용체로부터 제제를 보호하는 것이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 선택된 전달 비히클은 그 안에 함유된 치료제 및 핵산 분자 및 임의로 태그의 안정성을 향상시킬 수 있다. 리포솜은 캡슐화된 제제를 표적 세포에 도달하게 할 수 있고/있거나 우선적으로 캡슐화된 제제를 표적 세포에 도달하게 할 수 있거나, 또는 대안적으로 다른 원하지 않는 표적 부위 또는 세포에 제제의 전달을 제한할 수 있다.

일부 구현예에서 담체는 세포에 캡슐화된 치료적 유효량의 적어도 하나의 치료제, 적어도 하나의 치료제를 독특하게 확인한 핵산 분자 및 선택적인 태그의 침투를 용이하게 한다. 일부 구현예에서, 세포에 치료적 유효량의 적어도 하나의 치료제, 적어도 하나의 치료제를 독특하게 확인한 핵산 분자 및 선택적인 태그의 침투는 담체 내에서 캡슐화에 의해 가능해진다.

일부 구현예에서, 리포솜 전달 비히클은 하나 이상의 원하는 제제를 캡슐화하기 위해 제조되어 이로써 조성물은 높은 형질감염 효율 및 향상된 안정성을 입증한다. 리포솜이 표적 세포 속으로 핵산의 도입을 용이하게 할 수 있는 동안, 코폴리머가 용이하게 할 수 있는 것처럼, 다중양이온 (예를 들면, 폴리 L-라이신 및 프로타민)의 부가는 일부 사례에서, 모든 시험관내 및 생체내 수많은 세포주에서 2-28 배만큼, 몇 개 유형의 양이온성 리포솜의 형질감염 효율을 현저하게 향상시킬 수 있다 (참고 N. J. Caplen, et al., Gene Ther. 1995; 2: 603; S. Li, et al., Gene Ther. 1997; 4, 891).　

또 다른 구현예에서, 상기 적어도 하나의 담체는 나노리포솜 또는 지질 나노입자이다. 나노리포솜은 그의 용해도 및 생체이용률, 시험관내 및 생체내 안정성을 개선함으로써, 뿐만 아니라 다른 분자와 그의 원치않는 상호작용을 방지함으로써 생체활성제의 성능을 향상시킬 수 있다. 나노리포솜의 또 다른 이점은 세포-특이적 표적화이고, 이는 건강한 세포 및 조직에 관해 역효과를 최소화하면서 표적 세포에서 최적의 치료적 효능을 위하여 요구된 약물 농도를 달성하기 위해 필요조건이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "지질 나노입자"는 하나 이상의 지질 (예를 들면, 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및 PEG-변형된 지질)을 포함한 전달 비히클을 지칭한다. 바람직하게는, 지질 나노입자는 하나 이상의 표적 세포에 하나 이상의 제제를 전달하기 위해 제형화된다. 적합한 지질의 예는, 예를 들어, 포스파티딜 화합물 (예를 들면, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 세레브로시드, 및 강글리오사이드)를 포함한다. 단독 또는 다른 전달 비히클과 조합과 무관하게, 전달 비히클로서 폴리머의 사용이 또한 고려된다. 적합한 폴리머는, 예를 들어, 폴리아크릴레이트, 폴리알키시아노아크릴레이트, 폴리락타이드, 폴리락타이드-폴리글라이콜라이드 코폴리머, 폴리카프로락톤, 덱스트란, 알부민, 젤라틴, 알기네이트, 콜라겐, 키토산, 사이클로덱스트린, 덴드리머 및 폴리에틸렌이민을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 전달 비히클은 표적 세포에 핵산의 형질감염을 용이하게 하기 위한 그의 능력에 기반하여 선택된다.

본 발명은 표적 세포 속으로 핵산의 전달을 캡슐화하기 위해 그리고/또는 향상시키기 위해 양이온성 지질을 포함한 전달 비히클로서 지질 나노입자의 용도를 고려한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "양이온성 지질"은 선택된 pH, 예컨대 생리적 pH에서 순 양전하를 운반하는 임의의 수의 지질 종을 지칭한다. 고려된 지질 나노입자는 하나 이상의 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및 PEG-변형된 지질을 이용한 다양한 비의 다중-성분 지질 혼합물을 포함시킴으로써 제조될 수 있다. 몇 개의 양이온성 지질은 문헌에서 기재되어 있고, 이들 다수는 상업적으로 이용가능하다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용을 위한 적합한 양이온성 지질은, 본 명세서에 참고로 편입된, 국제 특허 공개 WO 2010/053572에 기재된 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 이온화가능 양이온성 지질을 포함한 지질 나노입자를 이용한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸염화암모늄 즉 "DOTMA"가 사용된다.(미국 특허 번호 4,897,355). DOTMA는 단독으로 제형화될 수 있거나 또는 리포솜 전달 비히클 또는 지질 나노입자 속으로 중성 지질, 디올레오일포스파티딜-에탄올아민 즉 "DOPE" 또는 다른 양이온성 또는 비-양이온성 지질과 조합될 수 있고, 상기 리포솜은 표적 세포 속으로 핵산의 전달을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 다른 적합한 양이온성 지질은, 예를 들어, 5-카복시스페르밀글리신디옥타데실아미드 즉 "DOGS", 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민-카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 즉 "DOSPA" (미국 특허 번호 5,171,678; 미국 특허 번호 5,334,761), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 즉 "DODAP", 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 또는 "DOTAP"를 포함한다. 고려된 양이온성 지질은 또한 하기를 포함한다: 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 즉 "DSDMA", 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 즉 "DODMA", 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 즉 "DLinDMA", 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 즉 "DLenDMA", N-디올레일-N,N-디메틸염화암모늄 즉 "DODAC", N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 즉 "DDAB", N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 즉 "DMRIE", 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(시스,시스-9,12-옥타데카디엔옥시)프로판 즉 "CLinDMA", 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메티 1-1-(시스,시스-9',1-2'-옥타데카디엔옥시)프로판 즉 "CpLinDMA", N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민 즉 "DMOBA", 1,2-N,N'-디올레일카바밀-3-디메틸아미노프로판 즉 "DOcarbDAP", 2,3-디리놀레오일옥시-N,N-디메틸프로필아민 즉 "DLinDAP", 1,2-N,N'-디리놀레일카바밀-3-디메틸아미노프로판 즉 "DLincarbDAP", 1,2-디리놀레오일카바밀-3-디메틸아미노프로판 즉 "DLinCDAP", 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 즉 "DLin-K-DMA", 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란 즉 "DLin-K-XTC2-DMA", 및 2-(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄아민 (DLin-KC2-DMA)) (참고, WO 2010/042877; Semple et al., Nature Biotech. 28:172-176 (2010)), 또는 이들의 혼합물. (Heyes, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, D V., et al., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); PCT 공개 WO2005/121348A1).

콜레스테롤-계 양이온성 지질의 용도는 본 발명에 의해 또한 고려된다. 상기 콜레스테롤-계 양이온성 지질은 단독으로 또는 다른 양이온성 또는 비-양이온성 지질과 조합으로 사용될 수 있다. 적합한 콜레스테롤-계 양이온성 지질은, 예를 들어, DC-Chol (N,N-디메틸-N-에틸카복사미도콜레스테롤), 1,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진 (Gao, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997); 미국 특허 번호 5,744,335), 또는 ICE를 포함한다

또한, 몇 개의 시약은 형질감염 효능을 향상시키기 위해 상업적으로 이용가능하다. 적합한 예는 LIPOFECTIN (DOTMA:DOPE) (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), LIPOFECTAMINE (DOSPA:DOPE) (Invitrogen), LIPOFECTAMINE2000. (Invitrogen), FUGENE, TRANSFECTAM (DOGS), 및 EFFECTENE을 포함한다.

또한, 양이온성 지질 예컨대 디알킬아미노-계, 이미다졸-계, 및 구아니디늄-계 지질이 고려된다. 예를 들어, 특정 구현예는 하나 이상의 이미다졸-계 양이온성 지질을 포함한 조성물에 관한 것이다.

N-옥타노일-스핑고신-1-[석시닐(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-2000] (C8 PEG-2000 세라미드)를 포함한, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-변형된 인지질 및 유도된 지질 예컨대 유도된 세라미드 (PEG-CER)의 용도는, 단독으로 또는 바람직하게는 전달 비히클 (예를 들면, 지질 나노입자)를 포함하는 다른 지질과 함께 조합으로, 본 발명에 의해 또한 고려된다. 상기 성분의 부가는 복잡한 응집을 예방할 수 있고 또한 순환 수명 증가용 및 표적 세포에 지질-핵산 조성물의 전달 증가용 수단을 제공하거나(Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237), 또는 이들은 생체 내 제형 밖으로 빠르게 교환하기 위해 선택될 수 있다 (참고 미국 특허 번호 5,885,613). 특히 유용한 교환가능성 지질은 더 짧은 아실 사슬 (예를 들면, C14 또는 C18)을 갖는 PEG-세라미드이다. 본 발명의 PEG-변형된 인지질 및 유도체 합성된(derivatized) 지질은 리포솜 전달 비히클에 존재하는 총 지질의 몰비 약 0% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 4% 내지 약 10%, 또는 약 2%를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 비-양이온성 지질의 용도를 고려한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "비-양이온성 지질"은 임의의 중성, 쯔비터이온 또는 음이온성 지질을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "음이온성 지질"은 선택된 pH, 예컨대 생리적 pH에서 순 음전하를 운반하는 임의의 수의 지질 종을 지칭한다. 비-양이온성 지질은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트 (DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민 (DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민 (DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민 (SOPE), 콜레스테롤, 또는 이들의 혼합물. 상기 비-양이온성 지질은 단독으로 사용될 수 있지만, 그러나 바람직하게는 다른 부형제, 예를 들어, 양이온성 지질과 조합으로 사용된다. 양이온성 지질과 조합으로 사용될 때, 비-양이온성 지질은 전달 비히클에 존재하는 총 지질의 5% 내지 약 90%, 또는 바람직하게는 약 10% 내지 약 70%의 몰비를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 전달 비히클 (예를 들면, 지질 나노입자)은 다중 지질 및/또는 폴리머 성분을 조합시킴으로써 제조된다. 지질 나노입자를 포함하는 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및/또는 PEG-변형된 지질의 선택뿐만 아니라, 서로에 대한 상기 지질의 상대적 몰비는 선택된 지질(들)의 특징, 의도된 표적 세포의 성질 및 전달된 제제의 특징에 기반된다. 추가의 고려사항들은, 예를 들어, 알킬 사슬의 포화도뿐만 아니라, 크기, 전하, pH, pKa, 융합유도성 및 선택된 지질(들)의 독성을 포함한다.

본 발명의 조성물에서 사용을 위한 리포솜 전달 비히클은 당해 기술에서 현재 공지된 다양한 기술로 제조될 수 있다. 다중-라멜라 소포(multi-lamellar vesicles; MLV)는 종래의 기술, 예를 들어, 적절한 용매에서 지질의 용해에 의해 적합한 컨테이너 또는 용기의 내부 벽상에 선택된 지질의 침착, 및 그 다음 용기의 내부상에 박막을 이탈시키기 위해 용매의 증발 또는 분무 건조에 의해 제조될 수 있다. 수성상은 MLVs의 형성을 초래하는 와동 운동을 갖는 용기에 부가될 수 있다. 단일-라멜라 소포 (ULV)는 그 다음 다중-라멜라 소포의 균질화, 초음파처리 또는 압출에 의해 형성될 수 있다. 또한, 단일라멜라 소포는 세제 제거 기술에 의해 형성될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 모든 시험관내 및 생체내 적용에서 검출가능한 진단적 방사선핵종, 형광성 물질 또는 다른 물질로 부하될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 나노입자 담체는 입자의 고-처리량 합성 및 표지화를 제공하기 위해 적응된 인-라인 미세유체 셋업을 이용하여 지질로 제작된다. 상기 제작 방법은 당해 기술에 공지되어 있다, 예를 들면, Jahn et al., 2007, 랑뮤어 23, 6289-6293. 전형적으로, 치료적 적재물을 제공하기 위한 적절한 크기의 입자가 제작된다.

화학 제제는, 예를 들어 문헌(Schroeder et al., 2007, 랑뮤어 23, 4019-4025)에 의해 보이는 바와 같이, 안정한 HSPC 입자 속으로 부하될 수 있다. 생물학적 치료제 (단백질/RNA)는 '단백질 생산 나노입자' 내부에서 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 나노입자는, 문헌(Schroeder, A. et al. Nano Lett 12, 2685-2689, (2012))에서 보이는 바와 같이, 표적 부위에서 단백질 및 RNA를 합성하기 위해 제어가능하게 유발된다. 이들 나노입자는, 광-불안정한 보호기로 감금된 아미노산, 리보솜, 및 DNA를 포함하여, 전사 및 번역을 책임지는 분자 기계로 충전된 지질 소포로 이루어진다. 입자는 RNA/단백질을 생산할 수 있는 나노-공장으로서 작용한다. 시험관내 및 생체내, 단백질/RNA 합성은 공간적으로 및 일시적으로 제어가능할 수 있고, 밀리초의 시간척도상에서 마이크론-규모 조직 영역을 부각시킴으로써 개시될 수 있다. 이와 같이, 상기 플랫폼은 그의 활성, 예를 들면, 항-암 활성을 위하여 RNA (Png et al. 2012 Nature 481, 190-194) 및 단백질을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 나노입자 (예를 들면, 담체)는 리포솜-형성 지질이 40-100 % 몰의 나노입자를 구성하는 나노입자이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 0-50% % 몰 콜레스테롤을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 1-8 % 몰 PEG-지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 0-10 % 몰의 기능적 지질 (예를 들면, 양이온성 지질 또는 표적화 모이어티를 갖는 지질)을 포함한다.

본원에서 및 당해 기술에서 사용된 바와 같이, 몰 퍼센트 ("% 몰)는 나노입자를 구성한 성분 또는 화합물의 총 몰에 기반한 특정한 성분 또는 화합물의 퍼센트를 지칭한다. 예를 들어, 나노입자가 3 몰의 화합물 A 및 1 몰의 화합물 B를 함유하면, 화합물 A는 혼합물의 75 몰 %를 포함하고 화합물 B는 25 몰 %를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 나노입자 (예를 들면, 담체)는 40-70 % 몰 리포솜-형성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 20-50% % 몰 콜레스테롤을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 4-8 % 몰 PEG-지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 0-3 % 몰의 기능적 지질 (예를 들면, 양이온성 지질 또는 표적화 모이어티를 갖는 지질)을 포함한다. 특이적 구현예에 있어서, 40-70 % 몰 리포솜-형성 지질, 20-50% % 몰 콜레스테롤, 4-8 % 몰 PEG-지질 및 0-3 % 몰의 기능적 지질을 포함한 나노입자는 정맥내 투여에 적합하다.

일부 구현예에서, 본 발명의 나노입자 (예를 들면, 담체)는 50-80 % 몰 리포솜-형성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 0-50% % 몰 콜레스테롤을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 0-3 % 몰 PEG-지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 4-8 % 몰의 기능적 지질 (예를 들면, 양이온성 지질 또는 표적화 모이어티를 갖는 지질)을 포함한다. 특이적 구현예에 있어서, 50-80 % 몰 리포솜-형성 지질, 0-50% % 몰 콜레스테롤, 0-3 % 몰 PEG-지질 및 4-8 % 몰의 기능적 지질을 포함한 나노입자는 종양내 투여에 적합하다.

치료진단적 용도

일부 구현예에 있어서, 질환으로 고통받는 대상체의 치료제에 대한 반응 예측에 사용을 위하여, 치료적 유효량의 적어도 하나의 치료제 및 상기 적어도 하나의 치료제를 독특하게 확인한 핵산 분자를 독립적으로 포함한 다수의 담체를 포함한 조성물이 제공된다.

일부 구현예에 있어서, 질환으로 고통받는 대상체의 치료제에 대한 반응을 예측하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 하기 단계:

(a) 치료적 유효량의 적어도 하나의 치료제 및 상기 적어도 하나의 치료제를 독특하게 확인한 핵산 분자를 독립적으로 포함한 다수의 담체를 포함한 조성물을 대상체에 투여하는 단계; 및

(b) 상기 대상체로부터 수득된 샘플에서, 독특한 핵산 분자에 의해 상기 적어도 하나의 치료제의 효능을 확인하는 단계; 를 포함하고;

또 다른 구현예에서, 상기 방법은 추가로 상기 핵산 분자 서열분석의 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 추가로 상기 핵산 분자 증폭의 단계를 포함한다. 핵산의 증폭 및 서열분석 방법은 당해 분야의 숙련가에 잘 알려진다.

또 다른 구현예에서, 상기 방법은 추가로 세정 및 DNAse 치료 단계, 그 다음 표적 세포를 이용한 제제의 배양(incubation)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 샘플은 치료적 효능의 결정에 앞서 단일-세포 서스펜션 속으로 분해된다. 단일-세포 서스펜션 속으로 세포 샘플의 분해 방법은 당해 기술에 공지되어 있고 예를 들면 gentleMACS™ 분해자를 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 세포 분류 단계를 추가로 포함한 상기 방법. 세포 분류의 방법은 당해 기술에서 잘 알려지고 비제한적으로 FACS, 자기 비드 분류, ELISA, 미세유체 기반 분류, 세포-긴장 기반 분류 등등을 포함한다. 유리한 구현예에 있어서, 각 치료제의 활성은 표적 세포의 분류 및 DNA 바코드에 세포 상태 (예를 들면 살아있는/죽은 세포)의 상관에 의해 분석된다. 추가의 구현예에서, 상기 접근법은 약물의 환자-특이적 및 세포-특이적 활성에 대하여 다중 약물 스크리닝을 가능하게 한다.

구현예에서, 본원에서 개시된 방법은 치료제가 그의 치료적 활성을 실행하기 위해 지속된 양의 시간을 제공하는 단계를 포함한다. 표적화된 세포의 샘플링 이전 지속된 양의 시간은 장애 또는 증상의 성질 및 특정한 제제에 의존할 것이고 당해 분야의 숙련가에 공지된 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 지속된 양의 시간은 조성물의 투여 이후 약 24, 약 30, 약 48 시간, 또는 24 시간 초과를 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 내부에서 바코드의 DNases 분해를 피하기 위해 지속된 양의 시간은 72 시간 미만이다.

일부 구현예에서, 표적화된 세포의 샘플링 이전 지속된 양의 시간은 24 내지 72 시간 범위이다. 일부 구현예에서, 표적화된 세포의 샘플링 이전 지속된 양의 시간은 24 내지 48 시간 범위이다. 다른 구현예에서, 표적화된 세포의 샘플링 이전 지속된 양의 시간은 30-48 시간 범위이다. 다른 구현예에서, 샘플은 조성물의 투여 이후 최소 24 시간에서 수득된다. 다른 구현예에서, 샘플은 조성물의 투여 이후 최소 30 시간에서 수득된다. 다른 구현예에서, 샘플은 조성물의 투여 이후 최소 48 시간에서 수득된다. 다른 구현예에서, 샘플은 조성물의 투여 이후 최대 48 시간에서 수득된다. 다른 구현예에서, 샘플은 조성물의 투여 이후 최대 60 시간에서 수득된다. 다른 구현예에서, 샘플은 조성물의 투여 이후 최대 72 시간에서 수득된다. 다른 구현예에서, 샘플은 조성물의 투여 이후 24-48 시간 사이에서 수득된다. 다른 구현예에서, 샘플은 조성물의 투여 이후 30-48 시간 사이에서 수득된다. 표적화된 세포의 샘플링에 대한 정확한 기간은, 사용된 바코드 및 조사된 치료제의 유형 및 양을 포함하여, 몇 개의 인자에 따라 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 핵산 분자는 투여 (특히 전신 투여) 이후 48 시간 분해에 전형적으로 영향을 받기 쉽고 반면에 희토류 원소는 더 긴 기간 동안 검출될 수 있다. 다른 구현예에서, 치료제는 이들이 표적 세포 상에 작용한 시간에 의하여 달라진다.

일부 구현예에서, 치료제 (예를 들면, 시스플라틴)은 독특한 바코드를 포함한다. 당해 분야의 숙련가는, 상기 구현예에서, 상기 담체가 치료제 (예를 들면, 시스플라틴)를 포함할 수 있고 추가의 바코드를 추가할 필요가 없음을 인식할 것이다.

또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 전신 투여를 위하여 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 상기 전신 투여는 정맥내 주입이다. 또 다른 구현예에서, 상기 투여는 조직 속으로 주입 예컨대 종양내 주입이다.

일부 측면에서, 본 발명의 1-4 유형의 담체를 포함한 적어도 하나의 세포를 포함한 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 1-4 유형의 담체를 포함한 적어도 하나의 세포를 포함한 조성물이 제공되는데, 각 유형의 담체는 단일 세포 치료적 유효량의 적어도 하나의 치료제; 및 적어도 하나의 치료제를 독특하게 확인한 1-10,000 핵산 분자를 포함한 조성물을 독립적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 세포를 포함한 조성물이 제공되는데, 각 세포는 1-4 유형의 담체를 포함하고, 각 유형의 담체는 단일 세포 치료적 유효량의 적어도 하나의 치료제; 및 적어도 하나의 치료제를 독특하게 확인한 1-10,000 핵산 분자를 독립적으로 포함한다.

본 발명의 방법 및 조성물은 막대한 수의 표적 세포를 우선적으로 표적하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 고려된 표적 세포는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 간세포, 상피성 세포, 조혈 세포, 상피성 세포, 내피 세포, 폐 세포, 골 세포, 줄기 세포, 간엽 세포, 신경 세포, 심장 세포, 지방세포, 혈관 평활근 세포, 심근세포, 골격 근육 세포, 베타 세포, 뇌하수체 세포, 활막 표층 세포, 난소 세포, 고환 세포, 섬유아세포, B 세포, T 세포, 망상적혈구, 백혈구, 과립구 및 종양 세포. 본원에서 사용된 바와 같이, "종양 세포"는 1차 암 세포 뿐만 아니라 전이성 세포를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는, 본 발명의 조성물 및 방법이 투여된, 비제한적으로, 인간, 비-인간 영장류, 설치류, 등등을 포함하여, 임의의 동물 (예를 들면, 포유동물)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어들 "대상체" 및 "환자"는 인간 대상체를 참조하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 다른 구현예에서, 용어들 "대상체" 및 "환자"는 비-인간 대상체를 참조하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 악성 질환으로 고통받는 대상체의 치료제에 대한 반응을 결정하거나 예측하는데 유용하다. 일부 구현예에서, 상기 악성 질환은 암, 암 전이 및 전암성 병변이다.

암 치료제의 예는, 예를 들면, 비제한적으로 하기를 포함한다: 아비라테론, 아시트레틴, 알데스류킨, 알렘투주맙, 아미포스틴, 암사크린, 아나그렐라이드, 아나스트로졸, 비소, 아스파라기나제, 아스파라기나제 어위니아, 악시티닙, 아자시티티딘, BCG, 벤다무스틴, 베바시주맙, 벡사로텐, 바이칼루타마이드, 블레오마이신, 보르테조밉, 브렌툭시맙, 브로모크립틴, 부세렐린, 부설판, 카바지탁셀, ,카베르골린, 카페시타빈, 카보플라틴, 카르무스틴, , 세툭시맙, 클로르암부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 크리조티닙, 사이클로포스파마이드, 사이클로스포린, 사이타라빈, 다카바진, 닥티노마이신, 다사티닙, 다우노루비신, 데가렐릭스, 데노수맙, 덱사메타손, 덱스라족산, 도세탁셀, 독소루비신, 독소루비신 페길화된 리포솜, 엔잘루타마이드, 에피루비신, 에리불린, 에를로티닙, 에스트라무스틴, 에토포시드, 에버롤리무스, 엑세메스탄, 필그라스팀, 플루다라빈, 플루오로우라실, 플루타미드, 풀베스트란트, 게피티닙, 젬시타빈, 고세렐린, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파마이드, 이마티닙, 이니파립, 인터페론 알파-2b, 이필리무맙, 이리노테칸, 익사베필론, 람브롤리주맙, 란레오타이드, 라파티닙, 레날리도마이드, 레트로졸, 류코보린, 류프롤라이드, 로무스틴, 메클로레타민, 메드록시프로게스테론, 메게스트롤, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 닐로티닙, 닐루타마이드, 옥트레오타이드, 오파투무맙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 아클리탁셀　나노입자, 알부민-결합된 (nab), 팔미드로네이트, 파니투무맙, 파조파닙 페메트렉세드, 페르투주맙, 포르피머, 프로카바진, 퀴나골리드, 랄티트렉세드, 레오바이러스 혈청형 3 - 데어링 균주, 리툭시맙, 로미뎁신, 룩솔리티닙, 소라페닙, 스트렙토조신, 수니티닙, 타목시펜, 테모졸로마이드, 템시롤리무스, 테니포시드, 테스토스테론, 탈리도마이드, 티오구아닌, 티오테파, 타이로트로핀 알파, 토실리주맙, 토포테칸, 트라스투주맙 (HERCEPTIN®), 트라스투주맙, 엠탄신 (KADCYLA®), 트레오설판, 트레티노인, 베무라페닙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈.

치료제로서 사용된 화학치료제의 예는, 예를 들면, 비제한적으로, 예를 들면, 하기를 포함한다: 알킬화제 (예를 들면, 사이클로포스파마이드, 이포스파마이드, 멜팔란, 클로르암부실, 아지리딘, 에폭사이드, 알킬 설포네이트), 시스플라틴 및 그의 유사체 (예를 들면, 카보플라틴, 옥살리플라틴), 안티메타볼리티트 (예를 들면, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 사이타라빈, 젬시타빈, 플루다라빈), 토포시오머라아제 상호작용제 (예를 들면, 캄프토테신, 이리노테칸, 토포테칸, 에토포시드, 테니포시드, 독소루비신, 다우노루비신), 항미세소관 제제 (예를 들면, 빈카 알카로이드, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 및 비노렐빈; 탁산, 예컨대 파클리탁셀 및 도세탁셀), 인터페론, 인터류킨-2, 히스톤 탈아세틸화효소 저해제, 단클론성 항체, 에스트로겐 조절물질 (예를 들면, 타목시펜, 토레미펜, 랄록시펜), 메게스트롤, 방향화효소 저해제 (예를 들면, 레트로졸, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 옥트레오타이드), 옥트레오타이드, 항-안드로겐 (예를 들면, 플루타미드, 카소덱스), 키나제 및 티로신 저해제 (예를 들면, 이마티닙 (STI571 또는 Gleevac); 게피티닙 (Iressa); 및 에를로티닙 (Tarceva), 등. 예를 들면 문헌(Cancer: Principles and Practice of Oncology, 7th Edition, Devita et al, Lippincott Williams & Wilkins, 2005, Chapters 15, 16, 17, 및 63))을 참조하라.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 염증성 질환 또는 장애로 고통받는 대상체의 치료제에 대한 반응을 결정하거나 예측하는데 유용하다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 퇴행성 질환 또는 장애로 고통받는 대상체의 치료제에 대한 반응을 결정하거나 예측하는데 유용하다. 한 구현예에서, 상기 퇴행성 질환은 골관절염이다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 신경적 질환 또는 장애로 고통받는 대상체의 치료제에 대한 반응을 결정하거나 예측하는데 유용하다.

본원에서 사용된 바와 같이, 수치와 결합된 경우 용어 "약"은 언급 수치의 플러스 및 마이너스 10%를 지칭한다. 예를 들어, 약 1000 나노미터 (nm)의 길이는 1000 nm ± 100 nm의 길이를 지칭한다.

본 발명의 추가의 목적, 이점, 및 신규 특징은, 제한할 의도가 없는, 하기 실시예의 시험시 당해 기술에 통상적으로 숙련된 사람에게 명백해질 것이다. 추가로, 상기 기술된 바와 같이 그리고 아래 특허청구범위 단락에서 청구된 바와 같이 본 발명의 각각의 다양한 구현예 및 측면은 하기 실시예에서 실험적인 뒷받침을 받게 된다.

실시예

일반적으로, 본원에서 사용된 명명법 및 본 발명에서 이용된 실험실 절차는 분자, 생화학적, 미생물학적 및 재조합 DNA 기법을 포함한다. 상기 기술은 문헌에서 철저히 설명된다. 예를 들어, 다음 문헌들을 참조하다("Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as set forth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); 이들 모두는 참고로 편입된다.) 다른 일반적인 참조문헌은 본 문서 전반에 걸쳐 제공된다.

리포솜 합성/제조

리포솜은 당해 기술에 공지된 방법을 이용하여 제조되었다. HSPC, PEG-DSPE 및 콜레스테롤 58% 2% 40%는 순수한 에탄올에서 용해되었고 완전 용해까지 65℃에서 가열되었다.

리포솜 합성: 리포솜은 58% 몰 수소화된 대두 포스파티딜콜린 (HSPC), Mw 762.1; 2 mol% 폴리에틸렌글리콜 디스테아로일-포스포에탄올아민 (m2000PEG DSPE) (- 이의 역할은 입체 효과에 인해 리포솜의 응집/융합을 감소시키는 것이다), Mw 2805.54; 및 40 mol% 콜레스테롤 Mw 386.65의 지질 조성물을 함유한다. 총 지질의 작업 농도는 용액내 50 mM이다. 배지는 탈이온수내 10% PBS/5 % 덱스트로오스이었다. 먼저 지질은 순수한 에탄올에서 용해되었고, 65℃까지 가온되었고 (또한 동일한 온도까지 가온된) 1 mL의 배지에 부가되었다. 직접적인 주입 및 피펫팅 이후, 더 많은 배지가 부가되어 최종 지질 농도를 달성하였다. 수소화된 대두 포스파티딜콜린은 Lipoid (Ludwigshafen, Germany)로부터 제공되었고; m2000PEG-DSPE는 Avanti (Alabaster, Alabama, USA)로부터 구매되었고 콜레스테롤 (카탈로그 번호: C8667-500MG)은 Sigma (Rehovot, Israel)로부터 구매되었다.

DNA 캡슐화: 25 나노몰 및 탈염된 ssDNA 올리고는 50-120 염기쌍의 길이 범위를 갖는 Sigma & IDT (Leuven Belgium)로부터 구매되었다. 2개의 ssDNA의 어닐링 이후, 원액은 100 μM까지 희석되었고 100 마이크로-리터 (μl)의 분액으로 분할되었다. 5ml의 지질 용액에 대하여, 300 μl의 dsDNA는 1ml 배지 용액에 부가된 다음 (3 ml -150 μl의 dsDNA에 대하여) 용해된 지질을 부가하였다. 캡슐화 이후, 압출기는 200 nm 리포솜을 생산하기 위해 사용되었다.

압출 공정: 지질 용액은 400 nm 및 200 nm 막을 통해 3회 압출되었다. 압출기 온도는 65 섭씨 온도 (℃)로 설정되었다.

DLS를 통한 입자 크기 결정 (동적 광 산란) - 압출 이후, 크기 결정은 DLS (ZetaSizer - ZSP)에 의해 실시되었다. PDI 범위는 0.003-0.08 이었다.

시험관내 형질감염: 시험관내 실험은 8/3.5cm 조직 배양판에서 두개의 B-16 (흑색종) 및 4T1 (유방 암) 마우스 암 세포에 대해서 수행되었다. 세포는 RPMI (생물학적 산업)에서 배양되었고, 24 시간 후 10% (v/v)의 리포솜 용액은 세포 배양액에 신선한 배지와 함께 부가되었다. 세포는 24 시간 동안 37℃에서 배양되었고 그 다음 분석되었다.

DNA 추출: 잔여 리포솜을 갖는 배지는 폐기되었고 세포는 PBSX1 (생물학적 산업)으로 3회 세정되었다. 세포는 트립신으로 플레이트로부터 끊어졌고 1.5 ml 에펜도르프 튜브 속으로 이동되었다. 세포는 7 분 동안 1200 rpm에서 원심분리되었고 트립신은 폐기되었다. DNA 추출은 Bligh and Dyer 검정; 167 μl 1:2 클로로포름:메탄올 (v/v), 55.5 μl의 클로로포름, 및 100 μl의 탈이온수의 부가를 이용하여 수행되었다. 5분 동안 1000 rpm에서 원심분리 이후, 상부 수성 상은 수집되었다.

DNA 증폭: dsDNA는 50 μl 반응에서 레디 믹스 ("Ornat")를 이용하여 유전자 증폭기(thermo cycler: "Daniel Biotech")에서 증폭되었다. PCR 이후, 용액은 3% (w/w) 아가로오스 겔 ("Hy-Labs")에 부하되었고 25분 동안 실행되었다.

RT- PCR: DNA 추출 이후, 가닥은 증폭되었고 RT-PCR 유전자 증폭기 ("Bio Rad")에서 TaqMan 프로브를 이용하여 분석되었다.

세포 분류: 10⁶/ml의 농도를 갖는 15 mL의 세포 서스펜션은 유동 활성화된 세포 분류기 (FACS - ARIA)에 취해졌다. 세포의 통문(gating) 이후, 이들은 1,000 세포, 100, 10 세포 및 단일 세포까지 분류되었다. 모든 세포는 폴리프로필렌으로부터 원뿔형 투명 96 웰들내로 분류되었다. 분류 이후, B&D 및 PCR가 수행되었다.

세포 희석: 세포는 1ml 배지에서 현탁되었고 계수되었다. 다음 단계는 최대 10³ 세포 - PBSX1의 900 μl내 100 μl까지 일련의 희석 과정이다. 각 희석액은 10³, 10² 및 10 세포(10 μl 내지 90 μl 탈이온수로)를 얻기 위해 10 만큼 다시 희석된다. 마지막으로, 이론적으로 단일 세포를 얻기 위해, 100 세포 희석액으로부터 1 μl를 취하여 PBSX1의 99 μl에 넣는다.

공초점 / 세포 관측자: DNA 캡슐화 - FAM 접합된 DNA를 함유한 리포솜은 상기 기재된 방법을 이용하여 제조되었다. 리포솜은 10% PBS (막 유형)에 대해 24 시간 동안 투석되었다. 투석 이전 및 이후 샘플 (트리플리케이트)의 형광은 DLS (제조) 여기 및 방출 566-345nm 각각으로 측정되었다. 투석 이후 및 이전에 대한 형광 값은 세분되어 캡슐화 백분율을 제공하였다.

생체내 형질감염: 4T1 (유방 암)의 10⁶세포/ml의 100 μl는 10 주 balb/c 암컷 마우스에 피하 주사되었다. 약 14 주 후(1차 종양이 충분하게 거대하여진 경우), 100 μl의 리포솜 용액은 정맥내 주사되었다. 36 시간 후, 마우스는 희생되었고 그의 기관 (+종양)은 추가 단계를 위하여 얼음에 넣어졌다.

실시예 1

나노입자 제작 및 표지화

나노입자는 입자의 고-처리량 합성 및 표지화를 제공하기 위해 적응된 인-라인 미세유체 셋업 (Jahn, A., et al. 2007, Langmuir 23, 6289-6293)을 이용하여 지질로 제작될 것이다 (도 2). 치료적 부하물(payload)을 제공하기에 적합한 크기의 입자를 제작한다. 화학 제제는 안정한 HSPC 입자에 부하되고 (Schroeder, A. et al. 2007, Langmuir 23, 4019-4025) 생물학적 치료제 (예를 들면, 단백질/RNA)는 ~200 nm '단백질 생산 나노입자' 내부에서 합성된다. 표적 부위에서 단백질 및 RNA를 제어가능하게 유발될 수 있는 합성 나노입자가 최근에 개발된다 (Schroeder, A. et al. 2012, Nano Lett 12, 2685-2689). 이들 나노입자는, 광-불안정 보호기(photo-labile protecting group)로 가두어진 아미노산, 리보솜, 및 DNA를 포함하여, 전사 및 번역을 책임지는 분자 기계로 충전된 지질 소포로 이루어진다. 입자는 RNA/단백질을 생산할 수 있는 나노-공장으로서 작용한다. 시험관내 및 생체내, 단백질/RNA 합성은 공간적으로 그리고 일시적으로 제어가능하고, 밀리초의 시간척도 상에서 마이크론-규모 조직 영역을 부각시킴으로써 개시될 수 있다. 그의 항-암 활성에 대하여 RNA 및 단백질을 스크리닝하기 위해 상기 플랫폼을 사용할 것이다.

1차 및 전이성 치료적 활성은 시험관내 및 생체내 모델링될 수 있다. 동시에 다중 약물을 스크리닝하기 위해 나노입자는 DNA 바코드로 태그된다 (도 3). 도 3에서 보여진 바와 같이, DNA 바코드는 1,000 (도 3A), 500 (도 3B), 5 (도 3C) 세포의 클러스터 내부에서, 그리고 심지어 단일 세포 (도 3D) 내부에서 검출되었다.

실시예 2

1차 및 전이성 모델 검정

초기 생체내 연구는, 와인버그 및 협력자에 의해 보고된, BALB/c 마우스 (도 4)에서 4T1 유방 암 모델을 이용하여 수행되었다. 이들 모델의 임상 정확도를 확인하기 위해, 치료진단적 나노입자의 바이오-분포 및 활성은 또한 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 기형종에서 형성된 인간 유도 종양에서 시험되었다. 이들 종양은 미세환경, 종양내 형태 이종성(intratumoral morphologic heterogeneity), 암 세포 하위집단 및 세포성 표현형을 포함한 정확한 방식으로 임상 시나리오를 반영하기 위해 고려된다 (Burgos-Ojeda, D. et al. 2013, Cancer Res 73, 3555-3565, 2845).

먼저, 리포솜을 이용한 바코드의 전달 효율을 조사하기 위해, 마우스는 바코드 또는 노출된 바코드를 함유한 리포솜으로 투여되었다. 주입 48 시간 이후, 종양은 획득되었고, 균질화되었고 바코드는 추출되었고 증폭되었다. 기저 증폭은 RT-PCR에서 바코드의 비특이적 증폭을 나타낸다. 종양 조직에서 검출된 바코드의 양은 담체 (리포솜)를 이용하여 유의미하게 더 커졌다 (도 5). 두개의 DNA 가닥 (바코드) 및 세포 막이 음전하되었기 때문에, DNA는 매개체 없이 세포에 진입하지 않는다. 따라서, 종양에서 자유 바코드의 존재는 세포보다는 종양의 세포외 기질(extra cellular matrix)에 도달한 DNA 가닥에 의해 설명될 수 있다.

100 나노미터의 직경을 갖는 바코딩된 나노입자 및 마이크론의 직경을 갖는 바코딩된 나노입자는 BALB/C 마우스 함유 유방 암 종양에 정맥내로 주사되었다. 주입 48 시간 후, 종양은 단일 세포 서스펜션에 해리되었고 세포는 FACS를 이용하여 수집되었다. DNA 바코드는 RT-PCR에 의해 추출되었고 증폭되었다. 결과는 나노미터 나노입자의 흡수가 마이크론크기의 나노입자의 흡수보다 유의미하게 더 높았음을 입증한다 (도 6). 이들 결과는 리포솜의 흡수가 크기에 의존적이고, 더 작은 입자일수록 바람직하다는 것을 암시한다.

생체내 기술의 제1 실험은 유방 암에 대한 약물 모델로서 독소루비신 (DOX)의 이용이었다. DOX를 함유한 바코딩된 나노입자 (BNPs)와 약물 없이 바코드만을 함유한 위약 BNPs 사이에서 바코드 분포내 임의의 차이가 있는지를 결정하기 위해, 절차는 2개의 배치로 바코딩된 리포솜 합성 과정을 포함하였다: 1. 리포솜은 바코드만을 함유한다, 2. 리포솜은 바코드 및 DOX를 함유한다. 바코드는 수동적인 방식으로 캡슐화되었고 반면에 DOX는 활성 방식으로 캡슐화되었다. 위약 BNPs는 마우스 (n=3)의 한 그룹에 별도로 주사되었고, DOX BNPs는 또 다른 그룹에 주사되었다. 주입 48 시간 후, 종양은 단일 세포 서스펜션으로 추출되었고 해리되었다. 세포는 생존도 염료 (7AAD)로 염색되었고 FACS에서 살아있는/죽은 세포로 분류되었다. 바코드는 각 그룹으로부터 추출되었다. 추출 이후, DNA 바코드는 RT-PCR에 의해 증폭되었다. 각 그룹 (살아있는/죽은)의 바코드 농도는 바코드의 양으로 형질전환되었고 세포 양에서 정규화되어 세포 당 DNA 바코드 분자를 얻었다. 도 7 (A)는 위약에서 바코딩된 NPs가 살아있는 세포에서 주로 축적하였음을 보여준다. 상기 결과는 죽은 세포에서 거의 흡수가 발생하지 않는다는 가설과 부합한다. DOX 치료의 제2 그룹은 죽은 세포에서 우선적인 분포를 보였다 (도 7 (B)).

난소 암은 거의 유효한 치료적 양상이 없는 것으로 사회에서 대부분 인식되어 있다. 이 질환은 간 또는 복부 공간에 전이 이후 다수회 감지된다.

본 발명에서, 난소 종양은, 앞서 기재된 바와 같이 (Burgos-Ojeda, 앞에서 언급한 것), SCID/베이지 마우스의 hESC 기형종에서 팽창한다. 항-암 약물로 부하된 바코딩된 나노입자는 정맥내로 투여된다. 나노입자의 치료적 과제의 평가는 종양이 축적되고 치료적 과제의 실시할 수 있게 하는 48 시간 후 평가된다. 48 시간 시각표는 4T1 세포를 이용함으로써 입증되었다 (참고, 도 8). 조직의 사후 조직학적 평가(Post-mortem histological evaluation)는 종양 바이오-분포를 연구하기 위해 사용된다. 생검 샘플은 그 다음 단일-세포 서스펜션으로 해리되고 세포는, 항체를 이용하여, (CD45, CD11B, F4/80, CD13, REST를 포함한) 세포 하위집단 및 (살아있는/죽은) 생존도에 따라, 분류된다.

5개의 상이한 약물 또는 대조 화합물을 함유한 바코딩된 나노입자 (도 8은 위약, 카페인, 시스플라틴, 독소루비신 및 젬시타빈을 도시한다)는, 뒷쪽 허벅지에서 1차 종양을 갖는 BALB/c 마우스에 정맥내로 동시에 주사되었다. 48 시간 후, 생검이 종양으로부터 실시되었다. 생검 조직은 그 다음 단일-세포 서스펜션으로 해리되었고, 세포는 (살아있는/죽은) 그의 생존도에 따라 스크리닝되었다. 약물 (젬시타빈, 시스플라틴) 바코드의 상승된 수준은 살아있는 세포와 비교하여 죽은 세포에서 발견되었다. 중성 화합물, 카페인은 모든 살아있는 그리고 죽은 세포에서 유사한 바코드 수준을 가졌다. 도 8 A-E에 의해 지적된 바와 같이, 젬시타빈은 상기 종양 치료를 위하여 시스플라틴 보다 더 효과적이다.

이 결과는 각 바코드에 대하여 독특한 분포를 보인다. 두개의 DOX 및 시스플라틴은 예상대로 분명한 치료적 효과를 보였다. 카페인은 거의 효과를 보이지 않았고 그의 분포는 죽은 세포와 살아있는 세포 사이에서 거의 동등하게 분할되었다 (도 8A-E). 가장 믿기 힘든 결과는 치료적 규모의 2가지 측면에서 나왔다: 위약 및 젬시타빈. 젬시타빈은 그의 분포에 기반된 가장 효율적인 약물로 발견되었다. 거의 모든 젬시타빈 바코드는 죽은 세포에서 축적되었고, 6,000 초과는 살아있는 세포와 비교된다 (도 8 (E)). 치료적 효능의 다른 규모에서, 위약 BNPs는 살아있는 세포에서 거의 유일하게 축적되었다 - 10,000 초과가 죽은 세포와 비교된다(도 8 (A)). 상기 데이터는, 세포가 살아있는 한, 위약 BNPs는 세포에서 축적을 유지할 것임을 암시한다. 이는 분포를 살아있는 세포로 강력하게 편향시킨다.

본 실시예는, 치료 주기의 개시에 앞서, 약물의 세포-특이적 효능을 결정하는 것(도 8F)뿐만 아니라, 종양 미세환경 내에서 상이한 약물의 치료적 프로파일을 연구하기 위한 치료진단적 플랫폼을 예시한다.

3개의 화학요법적 약물 - 독소루비신, 시스플라틴 및 젬시타빈의 바코딩 분석을 입증하기 위해, 치료적 처치가 수행되었다. 실험은 4 그룹을 포함하였고, 각각은 6 마우스를 함유하였다. 각 그룹은, 10 일 후 종양 유도를 개시하는, 24 일 동안 단일 약물로 처리되었다. 각 용량은 1주 1회 정맥내로 주어졌다. 각 그룹은 5 mg/kg의 독소루비신, 6 mg/kg의 시스플라틴, 125 mg/kg의 젬시타빈 또는 대조로서 100 μl의 염수로 처리되었다. 종양 용적은 캘리퍼스로 측정되었고 길이/2*(폭)²으로 계산되었다. 도 9 (A)를 검토함으로써, 약물 효능은 종양 용적 변화 백분율에서의 차이에 기반하여 직접적으로 순위를 매길 수 있다. 이들 결과는 3개의 약물 중에서 가장 효율적인 약물로서 젬시타빈을 평가한 진단적 분석을 강화시킨다. 젬시타빈은 독소루비신에 비해 종양의 성장, 및 대조 치료를 유의미하게 약화시켰다. 임상 독성은 실험의 기간 동안 관측되지 않았다. 치료 개시 24 일 후, 각 마우스의 종양은 추가 분석을 위하여 추출되었다. 도 9 (B)는 각 그룹으로부터 전형적인 종양을 보여준다. 이러한 종양의 가시화는 또한 진단적 결과를 강화시키고 각 치료 사이에서 차이를 입증한다. 상기 결과를 강화시킨 또 다른 징후는 종양/신체 중량 비이다. 종양 중량이 더 작고 신체 중량이 더 클수록, 약물이 더 효과적이다. 도 9(C)에서 젬시타빈에서 최소 종양/신체 중량 비를 초래하는 하나의 추세가 있다. 추세는 두개의 종양 치수 및 종양 용적의 변화에 상관한다. 종양 중량 인자는 종양 성장을 억제하고 파손하기 위한 약물의 유효성을 반영한다. 신체 중량 인자는 신체에 관한 약물의 영향 또는 약물의 부작용이 얼마나 중증인지를 반영한다. 이들 인자의 조합은, 약물이 종양을 치료하기 위해 가장 유효한 약물인지를, 그리고 약물이 신체에 덜 독성을 나타내는지를 결정하는데 용이하게 할 수 있다. 상이한 그룹 사이에서 조직 수준의 차이를 체크하기 위해, 모든 종양은 조직학적으로 연구되었다. 종양으로부터의 조직 슬라이드는 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되었다. 슬라이드의 현미경적 조사는 높은 세포성 고체 종양을 입증한다. 흥미롭게도, 치료법에 임상 반응을 보였던 종양은 덜 세포성이었고 더 낮은 유사분열 카운트를 가졌다. 추가로, 조직 슬라이드는 증식 지수 (도시되지 않음)를 결정하기 위해 토끼 단클론성 항-Ki67 항체 (SP6; Thermo Scientific, Fremont, CA)로 면역조직화학적으로 염색되었다. 슬라이드의 분석은 대조, 독소루비신, 시스플라틴 및 젬시타빈으로 치료된 종양에서, 각각 85%, 90%, 65% 및 40%의 증식 지수를 갖는 더 효과적인 요법을 받은 종양에서 더 낮은 증식 지수를 입증하였다.

실시예 3

과정의 실행가능성

생체내 실험은 2 μM 보다 낮은 바코드 농도의 이용이 (시스템의 LOD 하에서) 검출의 방지를 초래하였음을 보여주었다. 시험관내 연구에 사용된 입자의 농도는, 세포의 단일 층 내부에서 입자의 넘침을 방지하기 위해, 생체내 연구에 사용된 입자의 농도의 백분의 일이었다. 이는 양호한 통계 및 강력한 분석을 허용한다. 캡슐화된 바코드의 분석은 입자 내부에서 바코드 분자의 충분한 범위가 5-100 바코드 분자/입자 범위이어야 함을 보여주었다(이는 DNA 대 지질 몰비에 기반하여 계산되었다). 결과의 통계적인 분석을 위하여, 효율적인 입자 농도는 2-20 μM의 범위를 가짐이 발견되었다. 2 μM 보다 낮은 농도를 이용한 경우, 모든 세포가 적어도 하나의 입자를 함유하지 않을 높은 가능성이 있다. 이러한 농도에서, 시스템내 SNR (신호 대 잡음비)는 너무 낮을 것이다.

입자의 투여 후 세포 획득을 위한 최적의 시점을 결정하기 위해, 조직내 입자 축적용 시간, 세포를 사멸하기 위해 약물이 걸리는 시간, 및 세포에서 분해되기 위해 바코드가 걸리는 시간은 모두 고려되어야 한다. 이들 인자를 고려하여, 입자의 순환 기간은, 생검 수행에 의해 이들의 획득 전에, 48 시간까지 최적화되었다.

바이오-분포에서 생체내 작업은 종양 조직에서 최대 농도를 달성하는데 입자가 24 시간 걸리는 것을 보여주었다. 또한, 시험관내 작업은 몇 개의 약물의 최대 치료적 효능을 달성하기 위한 평균 시간이 24 시간 내지 48 시간으로 다양함을 보여주었다. 입자가 세포에 치명적인 조직 및 약물에 도달하기 위해 걸리는 기간을 고려하여 - 최적의 기간은 30 - 48 시간이어야 한다. 상기 기간의 확대는 세포 내부에 존재하는 DNases에 의해 바코드의 분해 때문에 바코드 분석이 위험할 것이다.

실시예 4

정맥내 및 종양내 투여용 입자 조성물

독특한 지질 요소로 구성된 바람직한 입자를 제조하여 투여 방식, 특이적으로 정맥내 대 종양내 투여에 맞추었다. 정맥내로 투여된 입자 및 종양내로 투여된 입자에 대한 예시적인 조성물은 표 1에서 요약된다.

표 1:

Claims

적어도 하나의 담체를 포함한 조성물로서, 상기 적어도 하나의 담체가 하기를 포함하는, 조성물:
(a) 단일-세포 치료적 유효량의 적어도 하나의 치료제; 및
(b) (a)의 적어도 하나의 치료제를 독특하게 확인한 하나 이상의 바코드.
제 1 항에 있어서, 다수의 유형의 담체를 포함한 조성물로서, 각 유형의 담체가 독립적으로 하기를 포함하는, 조성물:
(a) 단일-세포 치료적 유효량의 적어도 하나의 치료제; 및
(b) (a)의 적어도 하나의 치료제를 독특하게 확인한 하나 이상의 핵산 분자.
제 2 항에 있어서, 상기 다수의 유형의 담체가 15000 유형의 담체인, 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 다수의 유형의 담체가 1-500 유형의 담체인, 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 다수의 유형의 담체가 1-10 유형의 담체인, 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 다수의 유형의 담체가 1-5 유형의 담체인, 조성물.
제 2 항에 있어서, 치료제가 없는 적어도 하나의 대조 담체를 추가로 포함하고 상기 대조 담체를 독특하게 확인한 하나 이상의 바코드를 포함한, 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 치료적 유효량이 단일 세포의 상태 조절에 충분한, 조성물.
제 1 항에 있어서, 단일 세포의 상태의 상기 조절이 하기로부터 선택되는, 조성물: 세포 증식 조절, 세포 사멸 조절, 세포 약물 내성 조절 및 세포 기능, 활성 또는 생리학 조절.
제 1 항, 제 2 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바코드가 하나 이상의 핵산 분자인, 조성물.
제 1 항, 제 2 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바코드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물: 희토류 원소, 형광단, 발색단, 화학발광성 분자, 자기 입자, 염료, 및 방사성 동위원소.
제 11 항에 있어서, 상기 희토류 원소가 란탄족인, 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 5-400 뉴클레오타이드 길이인, 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 5-200 뉴클레오타이드 길이인, 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 상기 세포의 핵산에 실질적으로 동일하지 않거나 또는 상보적이지 않은 서열을 포함하는, 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 담체가 5-250 나노미터의 직경을 갖는, 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 담체가 지질-계(lipid-based) 입자인, 조성물.
제 17 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 담체가 리포솜인, 조성물.
제 17 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 담체가 교질입자인, 조성물.
제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 담체가 태그를 추가로 포함한, 조성물.
제 20 항에 있어서, 상기 태그가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물: 형광단, 발색단, 화학발광성 분자, 자기 입자, 염료, 금속, 희토류, 금속 및 방사성 동위원소.
제 1 항에 있어서, 전신 투여를 위하여 제형화된, 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 질환으로 고통받는 대상체의 치료제에 대한 반응을 예측하기 위하여 사용되는, 조성물.
질환으로 고통받는 대상체의 적어도 하나의 치료제에 대한 반응을 예측하는 방법으로서, 상기 방법이 하기 단계:
(a) 상기 대상체에 다수의 유형의 담체를 포함한 조성물의 투여 단계로서, 각 유형의 담체가 독립적으로 단일-세포 치료적 유효량의 적어도 하나의 치료제 및 상기 적어도 하나의 치료제를 독특하게 확인한 하나 이상의 바코드를 포함하는, 단계;
(b) 상기 대상체로부터 세포를 포함한 샘플을 수득하는 단계; 및
(c) 1-5 유형의 담체를 포함한 세포에서, 독특한 바코드에 의해 상기 적어도 하나의 치료제의 효능을 확인하는 단계; 를 포함하고,
이로써 질환으로 고통받는 대상체의 치료제에 대한 반응을 예측하는, 방법.
제 24 항에 있어서, 상기 대상체가 암으로 고통받는, 방법.
제 25 항에 있어서, 상기 투여는 정맥내 주입이고 상기 조성물이 상기 대상체의 종양의 단일 세포 당 1-200 담체를 포함하는, 방법.
제 25 항에 있어서, 상기 투여가 종양내 주입이고, 상기 조성물이 상기 대상체의 종양의 단일 세포 당 1-20 담체를 포함하는, 방법.
제 24 항에 있어서, 상기 수득 단계가 상기 조성물의 투여 이후 24-72 시간의 기간 내에서 수행되는, 방법.
제 24 항에 있어서, 상기 수득 단계가 상기 조성물의 투여 이후 24-48 시간의 기간 내에서 수행되는, 방법.
제 24 항에 있어서, 상기 핵산 분자의 서열분석 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제 24 항에 있어서, 상기 핵산 분자의 증폭 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제 24 항에 있어서, 상기 샘플이 단계 (c)에 앞서 단일-세포 서스펜션 속으로 분해되는, 방법.
제 24 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 담체가 태그를 추가로 포함하고 상기 샘플의 세포가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 이용하여 분류되는, 방법: FACS, 자기 비드 분류, 미세유체 기반 분류, 세포-긴장 기반 분류(cell-tension based sorting), 및 ELISA.