CN106714846A - 用于治疗剂预筛的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于确定药物的细胞特异性效能的治疗诊断组合物和方法。进一步地，提供了用于研究细胞微环境——包括但不限于肿瘤——内一种或多种药物的治疗曲线的组合物和方法。

Description

用于治疗剂预筛的组合物和方法
技术领域
本发明尤其涉及用于预测治疗剂的个性化治疗效能和活性的组合物和测定。
背景技术
病人对药疗法响应不同；治疗的成功极大地依赖于为每个病人选择正确的药物。‘个性化药物’的目标是解决每个病人独特的疾病表现。需要个性化药物的疾病和障碍包括恶性病、炎性疾病和神经变性疾病。
作为非限制性实例，癌症在临床中对药物具有低的实际响应速率。例如，小于60％的乳腺癌、食道癌、结肠癌或胃癌病人对治疗起反应；在患有肺癌、黑素瘤、胰腺癌、肝癌或再发性卵巢癌的病人中，统计数字降低至小于30％。因此，选择将解决每个病人的独特疾病表现的合适的治疗可以显著提高治疗效果。
为他们的病人-特异性抗癌活性预筛药物是具有挑战性的任务。在尝试预测癌症治疗是否将成功的现有方法下，在短的化疗周期之后从病人的肿瘤取活组织检查，并组织学检查肿瘤响应。显像技术能够实时追踪对肿瘤退化/进行、脉管增殖和代谢活性的治疗效果。为了预筛针对它们的抗癌活性的多种药物以及药物组合，发展了离体和体外测定。这些测定基于肿瘤组织，这些肿瘤组织是来自病人的活组织检查并且然后被体外扩展或植入免疫缺陷小鼠体内。
由于缺乏不均匀的多细胞微环境，还没有证明细胞培养方法在预测治疗结果中有效。已经证明第二方法稍微有效；然而，其花费7-12个月来产生足够数目的小鼠用于筛选。因此，只有患有轻度和非进行性肿瘤的病人可以被选择用于该测定。
遗传信息和病人-特异性生物标记已经帮助推进个性化药物。然而，几乎50％的病人仍然与非有效治疗错配，然后被归类为‘非响应者’。
纳米技术具有治疗癌症的很大希望，包括肿瘤-特异性生物分布、增加的细胞内摄取和携带水溶和水不溶药物的能力。纳米颗粒还具有同时携带治疗物(therapeuticcargo)连同原位显像抗肿瘤活性的造影剂的能力(即，治疗诊断学(theranostics))(Zhang,R.等人2011,J Nucl Med 52,958-964)。
对研究化学和生物试剂的个性化治疗效能和活性的组合物和方法存在未满足的需求。
发明内容
本发明提供用于预测和确定患有疾病的对象对治疗剂或治疗剂的组合的响应。
本发明首次提出了能够针他们的病人特异性效能同时地筛选多种治疗剂的个性化方法，其具有单细胞分辨率。由此，本文中公开的组合物和方法赋予医师为单个病人选择特制的药物的新操作(handle)。
在一个方面，本发明提供包括至少一种载体的组合物，所述至少一种载体包括：
(a)单细胞治疗有效量的至少一种治疗剂；和
(b)独特地识别(a)的至少一种治疗剂的一个或多个条码。
在一些实施方式中，组合物包括多种类型的载体，其中每种类型的载体独立地包括：
(a)单细胞治疗有效量的至少一种治疗剂；和
(b)独特地识别(a)的至少一种治疗剂的一个或多个条码。
在一些实施方式中，所述多种类型的载体是1-5000种类型的载体。在一些实施方式中，所述多种类型的载体是1-4000种类型的载体。在一些实施方式中，所述多种类型的载体是1-2000种类型的载体。在一些实施方式中，所述多种类型的载体是1-500种类型的载体。在其他实施方式中，所述多种类型的载体是1-200种类型的载体。在其他实施方式中，所述多种类型的载体是1-10种类型的载体。在其他实施方式中，所述多种类型的载体是1-5种类型的载体。在其他实施方式中，所述多种类型的载体是1-4种类型的载体。
在另一实施方式中，组合物进一步包括至少一种对照载体，所述对照载体不含治疗剂并且包括独特地识别所述对照载体的一个或多个条码(如，核酸分子)。
在一些实施方式中，所述治疗有效量基本上是单细胞治疗有效量。在另一实施方式中，所述治疗有效量足以调节单细胞的状态。在另一实施方式中，所述调节单细胞的状态选自：调节细胞增殖、调节细胞死亡、调节细胞耐药性和调节细胞功能、活性或生理机能。在所述至少一种治疗剂不能跨越细胞膜的实施方式中，可以使用所述治疗有效量的更高浓度。
在另一实施方式中，所述条码是独特地识别所述对照载体的一个或多个核酸分子。在另一实施方式中，所述核酸分子的长度为5-1000个核苷酸。在另一实施方式中，所述核酸分子的长度为5-500个核苷酸。在另一实施方式中，所述核酸分子的长度为5-400个核苷酸。在另一实施方式中，所述核酸分子的长度为5-300个核苷酸。在另一实施方式中，所述核酸分子的长度为5-250个核苷酸。在另一实施方式中，所述核酸分子的长度为15-200个核苷酸。
在另一实施方式中，所述核酸分子包括基本上不与所述细胞的核酸一致或互补的序列。在另一实施方式中，所述核酸分子不进入细胞核。在另一实施方式中，所述核酸分子不含能够进入细胞核的成分(诸如核定位信号(NLS)或核运载体)。
在另一实施方式中，所述条码选自：稀土元素、荧光团、发色团、化学发光分子、磁性颗粒、染料和放射性同位素。在另一实施方式中，所述条码是稀土元素。在另一实施方式中，所述稀土元素镧系元素。
在另一实施方式中，所述至少一种载体具有至多250nm(纳米)的直径。在另一实施方式中，所述至少一种载体具有至少50nm的直径。在另一实施方式中，所述至少一种载体是脂质基颗粒。在另一实施方式中，所述至少一种载体选自脂质体和胶粒。在另一实施方式中，所述至少一种载体配合有治疗剂，诸如聚合物纳米颗粒、纳米凝胶、金属纳米颗粒(包括但不限于金或铁氧化物纳米颗粒)、碳纳米管、叠层(layer by layer)颗粒和溶胶凝胶陶瓷颗粒。在另一实施方式中，所述至少一种载体包括聚乙二醇(PEG)。
在另一实施方式中，提供了包括多个载体的组合物，该多个载体独立地包括至少一种治疗剂和独特地识别所述至少一种治疗剂的核酸分子。在另一实施方式中，配制所述组合物用于全身施用。在另一实施方式中，配制所述组合物用于瘤内施用。
在另一实施方式中，所述至少一种载体进一步包括标记(如，示踪物)。在另一实施方式中，所述标记选自荧光团、发色团、化学发光分子、磁性颗粒或染料、金属、稀土和放射性同位素。在一些实施方式中，所述标记用于筛选和/或检测成功由所述载体靶向的细胞。在一些实施方式中，所述标记进一步用于检测所述治疗剂的活性。
根据另一方面，提供了用于预测患有疾病的对象对治疗剂的响应的方法，该方法包括以下步骤：
(a)向对象施用包括多种类型的载体的组合物，每种类型的载体独立地包括单细胞治疗有效量的至少一种治疗剂和独特地识别所述至少一种治疗剂的一个或多个条码(核酸分子)；
(b)获得包括来自所述对象的细胞的样品；和
(c)通过独特的条码识别包括1-5种类型的载体的细胞中所述至少一种治疗剂的效果；
由此预测患有疾病的对象对治疗剂的响应。
在一些实施方式中，所述对象患有癌症。在一些实施方式中，所述施用为静脉注射并且所述组合物包括每个所述对象的肿瘤的单细胞1-200个载体。在一些实施方式中，所述施用为瘤内注射，并且所述组合物包括每个所述对象的肿瘤的单细胞1-20个载体。
在一些实施方式中，在施用所述组合物之后24-72小时的时间范围内进行所述获得。在一些实施方式中，在施用所述组合物之后24-48小时的时间范围内进行所述获得。
在另一实施方式中，所述方法进一步包括测序所述核酸分子的步骤。在另一实施方式中，所述方法进一步包括扩增所述核酸分子的步骤。
在另一实施方式中，在步骤(c)之前将所述样品分解为单细胞悬浮液。
在另一实施方式中，所述组合物的所述至少一种载体进一步包括至少一种标记。在另一实施方式中，使用选自下列的方法分选所述样品的所述细胞：FACS、磁珠分选、酶联免疫吸附测定(ELISA)、基于微流体的分选、基于细胞张力的分选等。
通过下文中给出的详细描述，本发明的适用性的进一步实施方式和全部范围将变得显而易见。然而，应当理解，虽然详细描述和具体实例指示本发明的优选实施方式，但是其仅通过说明的方式给出，因为根据详细描述，本发明的精神和范围内的各种变化和修改对本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
图1A-E.用于预测病人肿瘤内部抗癌治疗法的效能的非限制性实例的示意性说明。(A)包含药物、DNA条码和荧光染料的纳米颗粒的构造。(B)以极低剂量向对象施用包含不同药物的纳米颗粒的混合物。(C)48小时之后，从肿瘤取核心活组织检查，并解离为单细胞悬浮液。(D)使用纳米颗粒内部的荧光染料，基于纳米颗粒摄取分选悬浮液(如，通过FACS)。然后，(E)使用生存力染色(viability stain)，根据药物效能分选细胞(活性/失活，I/0)，并且通过测量细胞内部DNA条码使活性与内部药物或药物组合相关联。作为对照，类似地分析未处理的细胞(e`)的结局。
图2.可以采用用于合成并条码化纳米颗粒的高通量(throughput)方法的非限制性实例的示意性说明。微流体装置(左)。水相(底部灰色通道)——将DNA和亲水性治疗物装载入颗粒。水性搏动流动被用于调节微流体装置中的剪切速率。有机相(顶部白色通道)——使用控制泵使各种脂质结构单元和疏水性药物结合以改变颗粒的结构参数。每个颗粒仅包含对应条码的一种药物。
图3A-F.恶性细胞中条码化纳米颗粒。检测1,000个(A)、500个(B)、5个(C)细胞的群(cluster)内和甚至单细胞(D)内的DNA条码。条码可以具有各种长度——50、85和120bp(E)或使用另外的手段标记。(F)4T1乳腺癌细胞内部的DNA条码化纳米颗粒的共焦显微镜检测。细胞膜被染红(描绘的灰色)，细胞核蓝色(由箭头所描绘)，和颗粒被描绘为白色斑点。
图4.原发性肿瘤和实验转移。通过局部(大腿内原发性肿瘤，下图像)或静脉(肺转移，上图像)注射4T1细胞在BALB/c小鼠中建立三阴性转移性乳腺癌模型。向带有原发性肿瘤的动物静脉注射条码化纳米颗粒。评估颗粒至原发性部位和转移性部位的生物分布并筛选各种药物的治疗效能。
图5.说明肿瘤组织内部条码分布的柱状图表。图表描绘了施用游离条码的动物和施用封装条码的动物之间的条码浓度。对照不含条码。
图6.说明具有不同大小的脂质体的DNA细胞摄取的柱状图表。
图7A-B.说明在DOX治疗之后活肿瘤细胞和死肿瘤细胞内部的条码分布的柱状图表。肿瘤细胞内部安慰剂NP(A)和包含DOX的条码化NP(B)之间条码分布的比较。
图8A-F.说明治疗诊断的条码化纳米颗粒的柱状图表。同时将包含对照化合物或不同的药物——安慰剂(A)、咖啡因(B)、顺铂(C)、亚德里亚霉素(D)和吉西他滨(Gemcitabine)(E)——的条码化纳米颗粒静脉注射至带有原发性肿瘤的BALB/c小鼠后大腿中。48小时之后，使颗粒能够在肿瘤中积累并执行治疗活性，从肿瘤取活组织检查。然后将活组织检查组织解离为单细胞悬浮液，并根据它们的生存力(活/死)筛选细胞。与活细胞相比，在死细胞中发现升高水平的药物(吉西他滨、顺铂)条码。中性化合物——咖啡因——在活细胞和死细胞中具有类似的条码水平。y轴指示在细胞内部发现的条码的数目。(F)对于每种药物，通过由死细胞提取的条码数除以由活细胞提取的条码数计算药物的效能。在对数尺度内呈现值。
图9A-D.基于条码分析的治疗效果。图9A-B和D为比较不同治疗组之间肿瘤体积变化的柱状图表。每组得到每周剂量的化疗药物：亚德里亚霉素、顺铂、或吉西他滨。对照组得到盐水。每组的代表肿瘤尺寸。在开始治疗后23天提取肿瘤。每组的肿瘤/身体重量。在处死(9C)当天测量肿瘤和身体二者。数据计算为(n＝6/组)的平均值+/-SDE；*P<0.01；****P<0.0001。
具体实施方式
本发明提供用于预测和确定治疗剂或治疗剂的组合针对损伤的治疗效能的组合物和方法。本文中公开的组合物和方法能够定制治疗以解决每个病人独特的疾病表现。
如本文中下面所说明，在开始治疗周期之前，载体(如，纳米颗粒)充当用于检验损伤内部药物或药物组合的治疗效能(如，癌性损伤)的治疗诊断计量。
在一些实施方式中，载体包括治疗剂和对应的条码，以及任选地标记。每个载体包含极低剂量的药物，其足以仅治疗一个细胞且远在全身治疗阈值以下。
在一些实施方式中，提供了包括至少一种载体的组合物，所述至少一种载体包括：治疗有效量的至少一种治疗剂；独特地识别至少一种治疗剂的核酸分子；以及任选地标记(即，示踪物)。
在一些实施方式中，至少一种治疗剂和核酸分子被封装在至少一种载体内。在其中载体进一步包括标记的实施方式中，至少一种治疗剂、核酸分子和标记被封装在至少一种载体内。
在另一实施方式中，提供了包括多种载体的组合物，每种载体独立地包括至少一种治疗剂和独特地识别所述至少一种治疗剂的核酸分子。在一些实施方式中，组合物包括独立地包括治疗剂或其组合的1-5种类型的载体。在一些实施方式中，组合物包括独立地包括治疗剂或其组合的1-10种类型的载体。在一些实施方式中，组合物包括独立地包括治疗剂或其组合的1-200种载体。在一些实施方式中，组合物包括独立地包括治疗剂或其组合的1-2000种载体。在一些实施方式中，组合物包括独立地包括治疗剂或其组合的2-500种类型的载体。如此，本发明的组合物和方法提供单细胞分辨率下多种治疗剂或其组合的同时筛选。在一些实施方式中，本发明的组合物和方法提供单细胞分辨率下肿瘤-治疗剂或其组合的同时筛选。
如本文中所使用，“类型的载体”指以相继类似计量包括相同组成的一种或多种治疗剂的载体。
治疗剂
在一些实施方式中，所述治疗有效量是基本上单细胞治疗有效量。
如本文中所使用，“治疗有效量”或“有效量”指在剂量下有效并且持续所需时间周期以实现期望的治疗结果的量。治疗剂的治疗有效量将取决于障碍或症状的性质并取决于特定的试剂，且可以通过本领域技术人员已知的标准临床技术确定。
如本文中所使用，“单细胞治疗有效量”指足以在单细胞内实现期望的治疗结果的有效量。在具体实施方式中，与治疗剂的最小有效剂量(MED)相比，所述治疗剂的所述单细胞治疗有效量是试剂的相当低的剂量。在一些实施方式中，与所述治疗剂的最小有效剂量(MED)相比，所述单细胞治疗有效量为至多0.1％、0.01％、0.001％或0.0001％的试剂。在一些实施方式中，“单细胞治疗有效量”指足以在单细胞内实现期望的治疗结果的最小有效量。该量可以不同，取决于细胞类型、药物类型和/或治疗的持续时间。
在另一实施方式中，其中期望的药物可以与组合物的其他成分反应，为了提供每单细胞治疗有效量的药物，使用过量的药物。对于非限制性实例，顺铂可以与条码DNA反应，因此为了提供具有治疗有效量的顺铂的细胞，封装过多的量。
在一些实施方式中，可以使用限制量的治疗剂。作为非限制性实例，单拷贝的假单细胞菌毒素足以杀死靶细胞。
在另一实施方式中，所述单细胞治疗有效量基本上足以调节单细胞的状态或在单细胞内实现期望的治疗结果。在另一实施方式中，所述治疗有效量不大于足以调节单细胞的状态或在单细胞内实现期望的治疗结果的量的50％、40％、30％、20％或10％。
治疗结果可以是，如，减轻症状、延长存活、提高移动性等。治疗结果不需要是“治愈”。治疗结果也可以是预防性的。
在另一实施方式中，所述调节单细胞的状态选自：调节细胞增殖、调节细胞死亡、调节细胞耐药性、调节细胞功能、活性或生理机能。在一些实施方式中，调节细胞功能或活性包括但不限于RNA转录、一种或多种蛋白的翻译，蛋白包括例如细胞内或跨膜蛋白或脂质。在另一实施方式中，所述调节单细胞的状态包括调节细胞成分或生物标记的存在、缺乏、水平(如，增加或降低)、活化或抑制。细胞成分或生物标记包括但不限于基因、基因产物(如，RNA、mRNA、miRNA)和氨基酸分子(如，蛋白)。在一些实施方式中，细胞活性是代谢活性。
在一些实施方式中，所述至少一种治疗剂不能跨越所述细胞的膜。在所述实施方式中，如与治疗单细胞的浓度相比，所述治疗有效量可以处于较高浓度。不能跨越细胞膜的治疗剂的实例包括但不限于RNA和亲水性药物。
条码
在一个实施方式中，所述条码是一种或多种核酸分子。核酸分子——诸如DNA链——呈现未限制数目的条码化选择。如贯穿本发明所使用，“条码”、“DNA条码”彼此均是可互换的并且具有相同的含义。作为DNA条码的本发明的核酸分子是脱氧核酸或核糖核酸或两者的聚合物，并且可以是单链或双链的，任选地包含合成的、非天然或修饰的核苷酸碱基。在一些实施方式中，比如，利用生物素、放射性标记或荧光标记对核酸分子进行标记。
如本领域技术人员所应当理解的，将独特的DNA条码并入治疗剂载体(封装)允许使用测定识别单个治疗剂，识别包括但不限于微阵列系统、PCR，核酸杂交(包括“印迹”)或高通量测序。
在一些实施方式中，通过在本发明的载体内封装DNA条码实现使带负电荷的DNA条码渗透通过细胞的带负电荷的脂质双层。
在一些实施方式中，核酸分子的序列不包括与天然存在于环境中或特定地天然存在于被本发明的方法和组合物靶向的所述细胞中的材料/物质/颗粒相关的序列、模式、特征或任何其他核酸序列。在另外的实施方式中，核酸分子的序列不含超过10个碱基的核苷酸序列，这些碱基可以与天然存在的核苷酸序列，和特别是外显子相关联。在另一实施方式中，所述核酸分子包括与所述细胞的基因组材料基本上不一致或互补的序列(诸如预防核酸分子与细胞的基因组材料——特别是所述细胞的外显子——的杂交，和/或预防假阳性扩增结果)。
在一些实施方式中，所述核酸序列可以进一步作为分子信标。所述核酸序列通常可以是单链分子，诸如发夹形状。所述核酸分子可以用于检测细胞中的互补基因，诸如用于检测细胞内部的基因突变。在一些实施方式中，所述核酸具有与带有突变的序列互补的序列。
在一些实施方式中，所述核酸分子包括预限定的独特序列或由预限定的独特序列组成。如本文中所使用，术语“独特序列”或“独特地识别”指保留区别的基于单射功能的序列(也称为一对一功能)。
在实施本发明的预测方法之后，独特条码(如，具有独特序列的核酸)适合用于识别载体内对应的至少一种治疗剂。用于检测核酸序列的存在和识别的方法对技术人员是已知的并且包括能够增强多个条码存在的测序和阵列(如，微阵列)系统(如，由Ilumina Inc.市售的)。
在一些实施方式中，诸如当期望增加的准确性时，核酸分子具有适合测序和/或扩增试验(如PCR)的长度。在另一实施方式中，所述核酸分子具有适合装载入本发明的载体的长度，优选地在纳米级。应当理解，所述核酸分子的长度取决于在本发明的组合物和方法中使用的载体的类型和大小(如，较短的序列适合用于纳米颗粒，而较长的序列可以用于微粒)。
在另一实施方式中，所述核酸分子具有至多1000、至多900、至多800、至多700、至多600、至多500、至多450、至多400、至多350、至多300、至多250、至多200、至多190、至多180、至多170、至多160、至多150、至多140、至多130或至多120个碱基的长度，其中每种可能性表示本发明的单独的实施方式。在另一实施方式中，所述核酸分子具有至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个碱基、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个碱基、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少200、至少300、至少400或至少500个碱基的长度，其中每种可能性表示本发明的单独的实施方式。
核酸长度的非限制性实例包括但不限于5-50个碱基、5-40个碱基、5-30个碱基、5-25个碱基、5-24个碱基、5-23个碱基、5-22个碱基、5-21个碱基、5-20个碱基、5-19个碱基、5-18个碱基、5-17个碱基、5-16个碱基或5-15个碱基、15-50个碱基、15-60个碱基、15-70个碱基、15-80个碱基、15-90个碱基、15-100个碱基、15-200个碱基、15-250个碱基或15-500个碱基。
在另一实施方式中，每个载体内所述核酸分子具有每载体或每靶细胞一个或多个链的浓度。很好地确定核酸分子的量在本领域技术人的能力范围内。在另一实施方式中，所述一个或多个核酸分子是1-10000个核酸分子。在另一实施方式中，所述一个或多个核酸分子是1-1000个核酸分子。在另一实施方式中，所述一个或多个核酸分子是1-5000个核酸分子。在另一实施方式中，所述一个或多个核酸分子是1-500个核酸分子。在另一实施方式中，所述一个或多个核酸分子是5-500个核酸分子。本领域技术人员将理解可以预先确定每个颗粒中核酸分子的量以便适合执行的具体试验，如测续和/或扩增试验。
根据一些实施方式，每种颗粒包括独特的条码。本领域技术人员将理解，利用独特的条码来条码化每种颗粒(即，载体)可以指示进入单细胞的颗粒的量。在一些实施方式中，本发明提供确定用于治疗疾病的治疗剂量的方法，方法包括向对象施用包括多种类型的载体的组合物，其中每种类型的载体包括一种或多种治疗剂，其中在所述一种或多种治疗剂的剂量中每种类型的载体不同。
根据一些实施方式，每种类型的颗粒(即，载体)包括识别所述载体类型的独特的条码(如，核酸序列)。根据一些实施方式，每种颗粒(即，载体)包括识别所述载体类型的独特的条码(如，核酸序列)。
在另一实施方式中，所述条码选自：稀土元素、荧光团、发色团、化学发光分子、磁性颗粒、染料和放射性同位素。
在另一实施方式中，所述条码是稀土元素。在另一实施方式中，所述稀土元素是镧系元素。在一些实施方式中，所述镧系元素选自：镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)、钪(Sc)和钇(Y)。在另一实施方式中，所述稀土元素是镧系元素。在一些实施方式中，所述镧系元素选自La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu。
当与荧光标记配合时，稀土元素(如，镧系元素)可以是有用的，并且一般通过使镧系元素络合物与感兴趣的样品在选择的条件下结合以得到可检测的光学响应来使用。可以在选择以引起光学响应的波长下照射样品。
在另一实施方式中，组合物内的所述载体进一步包括用于可操作地使用所述核酸分子作为细胞内的条码的另外的试剂(如化学或生物试剂)。所述试剂的非限制性实例包括DNA酶或RNA酶，诸如防止分别被DNA或RNA条码的内源或外源酶降解。
在一些实施方式中，形成本发明的组合物的溶液中的条码浓度可以在2至100微摩/升(μM)之间改变。在一些实施方式中，溶液中的条码浓度可以在10至90微摩/升(μM)之间改变。在一些实施方式中，溶液中的条码浓度可以在20至80微摩/升(μM)之间改变。在一些实施方式中，溶液中的条码浓度可以在30至70微摩/升(μM)之间改变。
在一个实施方式中，相对于分析的细胞的数量，本文中描述的组合物包括少数的纳米颗粒，以便确保数据的统计显著性。通常，当分析药物(一种或多种)对肿瘤的治疗作用时，1毫米3的癌症组织中肿瘤细胞的平均数为106个细胞。整个组织中细胞的总数为数千万个细胞。即，每细胞的组合可能性的理论数为N！(阶乘)，其中N为条码的数目，假设有足够的条码进入每个细胞。为降低选择的数目，分析的组织的每细胞的条码化纳米颗粒的数目优选小于5。
在一个实施方式中，每细胞存在1-5种类型的载体(即，条码化纳米颗粒)/细胞。在另一实施方式中，每细胞存在1-5种类型的载体提供足够的数据和高的信噪比(SNR)。在另一实施方式中，分析每细胞包括1-5种类型的载体的细胞。在另一实施方式中，分析每细胞包括1-4种类型的载体的细胞。
本发明部分基于下面的发现：为了达到每细胞存在至多5个条码类型应被注射的颗粒的量可以如下计算，考虑6-7％的静脉注射的剂量在肿瘤部位积累并且实际到达肿瘤部位的5％的纳米颗粒被细胞吸收，而其余被困在胞外基质(ECM)中。
在一个实施方式中，每肿瘤细胞经由静脉注射施用1-200个颗粒。在另一实施方式中，每肿瘤细胞经由静脉注射施用1-300个颗粒。在另一实施方式中，每肿瘤细胞经由静脉注射施用1-400个颗粒。在另一实施方式中，每肿瘤细胞经由静脉注射施用1-500个颗粒。在另一实施方式中，每肿瘤细胞经由静脉注射施用1-1000个颗粒。
在另一实施方式中，每肿瘤细胞瘤内施用1-20个颗粒。在另一实施方式中，每肿瘤细胞瘤内施用1-10个颗粒。在另一实施方式中，每肿瘤细胞瘤内施用1-50个颗粒。在另一实施方式中，每肿瘤细胞瘤内施用1-100个颗粒。
在一些实施方式中，颗粒内部条码分子的量是至少1、或可选地至少5、或可选地至少10、或可选地至少20、或可选地至少30、或可选地至少40、或可选地至少50、或可选地至少60、或可选地至少70、或可选地至少80、或可选地至少90、或可选地至少100、或可选地至少500、或可选地至少1000、或可选地至少5000、或可选地至少10000个条码分子/颗粒。在一些实施方式中，颗粒内部条码分子的量是是至多5、或可选地至多10、或可选地至多20、或可选地至多30、或可选地至多40、或可选地至多50、或可选地至多60、或可选地至多70、或可选地至多80、或可选地至多90、或可选地至多100、或可选地至多500、或可选地至多1000、或可选地至多5000个条码分子/颗粒。在一些实施方式中，颗粒内部条码分子的量范围在5-100个条码分子/颗粒之间。在一些实施方式中，颗粒内部条码分子的量范围在10-90个条码分子/颗粒之间。在一些实施方式中，颗粒内部条码分子的量范围在20-80个条码分子/颗粒之间。每种可能性表示本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，颗粒内部条码分子的量范围在1-1000个条码分子/颗粒之间。在一些实施方式中，颗粒内部条码分子的量范围在1-10000个条码分子/颗粒之间。
标记
在另一实施方式中，本发明的一种或多种载体进一步包括至少一种标记或可检测的部分。在一些实施方式中，对于所有载体使用同一标记。在其他实施方式中，对于载体的子集使用独特的标记。
可用于本发明的组合物和方法的标记包括但不限于荧光团、发色团、化学发光分子、放射性标记物、金属、稀土元素、磁性颗粒或染料。
在一些实施方式中，标记或可检测的部分是在试验中有用的标记，其包括但不限于免疫测定，诸如ELISA，珠基、芯片基或平板基多重免疫测定、质谱法、电泳、免疫比浊法(immunonephelometry)、免疫浊度测定法(immunoturbidimetry)、酶促测定、比色或荧光测定，如通过光度计可评估的，和基于荧光相关细胞分选(FACS)的分析或通过其他临床建立的测定。所有这些方法对本领域技术人员是已知的，且在文献中描述。
通常，标记的量将取决于待执行的测定，并且可通过本领域技术人员的能力确定，并且很好地在本领域技术人员能力下。在一些实施方式中，载体包括所述标记的一个分子或多个分子。
载体
在一些实施方式中，提供了用于治疗剂(一种或多种)的载体、用于DNA条码化所述治疗剂(一种或多种)的核酸序列和任选地标记。用于实践本发明的方法的所述载体可以靶向具体的分子，包括生物分子，诸如多肽——包括细胞表面多肽，如异常生长细胞、癌细胞、免疫细胞和退化细胞上的多肽。
在可选的实施方式中，本发明提供了纳米颗粒和脂质体膜形式的载体，其包括(除了包括用于实践本发明的方法的化合物以外)分子——如肽或抗体，该分子选择性靶向异常生长、患病、感染、功能异常和/或细胞受体。
在一些实施方式中，所述至少一种载体是小泡的形式，诸如这样的小泡：其携带的材料(治疗剂、核酸分子和任选地标记)在内核内。在一些实施方式中，所述至少一种载体是脂质基颗粒。在另一实施方式中，所述脂质基颗粒是脂质体。在另一实施方式中，所述至少一种载体是胶粒。
在一些实施方式中，溶液对指定的细胞是惰性的并且不影响指定的细胞。在一些实施方式中，除了治疗剂以外，组合物的所有成分是惰性的并且不影响指定的细胞。在一些实施方式中，溶液是水性溶液。在另一实施方式中，本发明的组合物不含阳离子表面活性剂(由于其可以影响细胞和/或影响治疗剂的活性，和阻碍治疗剂的作用的准确分析)。
在一些实施方式中，所述至少一种载体是小泡的形式，诸如这样的小泡：其携带的材料(治疗剂、核酸分子和任选地标记)形成络合物/微粒，其中携带的材料具有或不具有另一试剂，诸如聚合物/蛋白/盐。在一些实施方式中，所述至少一种载体形成树状聚体状结构，其中成分缀合至聚合物主链或经由范德华力或疏水相互作用络合。
在一些实施方式中，所述至少一种载体是聚合物纳米颗粒。在一些实施方式中，所述至少一种载体是纳米凝胶。在一些实施方式中，所述至少一种载体是金属纳米颗粒(如，金或铁氧化物纳米颗粒)。在一些实施方式中，所述至少一种载体是碳纳米管。在一些实施方式中，所述至少一种载体是叠层颗粒。在一些实施方式中，所述至少一种载体是溶胶凝胶陶瓷颗粒。在一些实施方式中，所述至少一种载体是与药物的蛋白络合物。
在一些实施方式中，所述至少一种载体形成树状聚体状结果，其中成分缀合至聚合物主链或经由范德华力或疏水相互作用络合。
在一个实施方式中，载体(如，脂质体)的直径小于500nm，以促进其通过胞外基质进入细胞。在一个实施方式中，载体(如，脂质体)的直径小于400nm，以促进其通过胞外基质进入细胞。
在一个实施方式中，载体(如，脂质体)的直径小于300nm、小于250nm、小于200nm、小于150nm、小于100nm、小于50nm、小于20nm、小于10nm或小于5nm。在另一实施方式中，载体(如，脂质体)的直径为至少1nm、至少5nm、至少10nm、至少20nm、至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少1500nm、至少200nm、至少250nm或至少300nm。每种可能性表示本发明的单独的实施方式。
在另一实施方式中，载体的直径为1-300nm。在另一实施方式中，载体的直径为10-250nm。在另一实施方式中，载体的直径为5-250nm。在另一实施方式中，脂质体的直径为20-150nm。在另一实施方式中，脂质体的直径为5-150nm。在另一实施方式中，脂质体的直径为20-150nm。
在一些实施方式中，用于静脉施用的载体的直径为5-250nm。在一些实施方式中，其中用于静脉施用的载体是脂质体，载体的直径为40-250nm。在一些实施方式中，用于瘤内施用的载体的直径为5-300nm。在一些实施方式中，其中用于瘤内施用的载体是脂质体，载体的直径为40-300nm。
在一些实施方式中，载体的形貌可以为球形或基本上球形、非球形(如，椭圆形、管形等)、不规则形等。
本发明构想了脂质体转移载体促进治疗剂和核酸至靶细胞的递送的用途。脂质体(如，脂质体脂质纳米颗粒)一般用于研究、工业和医疗中多种应用，特别对于它们作为体内诊断或治疗化合物的转移载体的用途(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307-321,1998；Drummond等人,Pharmacol.Rev.,51:691-743,1999)并且一般表征为具有内部水空间的微泡，其通过一个或多个双层的膜与外部介质隔离。脂质体的双层膜通常由两亲性分子形成，诸如合成或天然起源的脂质，其包括空间上分离的亲水性域和疏水性域(Lasic，出处同上)。脂质体的双层膜还可以由两亲性聚合物和表面活性剂形成(如，聚合物囊泡(polymerosome)、囊泡(niosome)等)。
在一个实施方式中，可以选择和/或制备载体以优化治疗剂和核酸分子(DNA条码)至靶细胞的递送。例如，如果靶细胞是肝细胞，可以优化转移载体的性质(如，大小、电荷和/或pH)以向靶细胞有效递送这样的转移载体。可选地，如果靶细胞是中枢神经系统(如，用于神经变性疾病的治疗预测)，转移载体的选择和制备必须考虑血脑屏障的渗透以及在其内的保留和/或向这样的靶细胞直接递送这样的转移载体的可选手段的使用。
将期望的实体并入脂质体的过程常常被称为“装载”(Lasic等人，FEBS Lett.,312:255-258,1992)。脂质体并入的治疗剂、核酸和/或标记可以完全地或部分地位于脂质体的内部空间，在脂质体的双层膜内。将试剂并入脂质体在本文中也称为“封装”，其中试剂被完全包含在脂质体的内部空间内。通常，对于载体(如脂质体)内的试剂的封装，化学键——诸如试剂和载体之间的共价键——是不需要的。将试剂并入转移载体——诸如脂质体——的目的常常是为了保护试剂不受环境损害，环境可能包含降解试剂(如，核酸)的酶或化学试剂和/或引起试剂的快速排泄的系统或受体。因此，在本发明的优选实施方式中，选择的转移载体能够增强治疗剂和核酸分子以及任选地包含在其中的标记的稳定性。脂质体可以使封装的试剂到达靶细胞和/或可以优先使封装的试剂到达靶细胞，或可选地限制试剂至其它不期望的靶部位或细胞的递送。
在一些实施方式中，载体促进封装的治疗有效量的至少一种治疗剂、独特地识别至少一种治疗剂的核酸分子和任选的标记渗透至细胞。在一些实施方式中，通过封装在载体内，能够使治疗有效量的至少一种治疗剂、独特地识别至少一种治疗剂的核酸分子和任选的标记渗透至细胞。
在一些实施方式中，制备脂质体转移载体以封装一种或多种期望的试剂，使得组合物展示高的转染效率和增强的稳定性。虽然脂质体可以促进向靶细胞引入核酸，但是加入聚阳离子(如，聚L-懒氨酸和鱼精蛋白)，作为共聚物可以促进，和在一些例子，显著地增强体内外二者许多细胞系中若干种类型的阳离子脂质体的转染效率达2-28倍(参见N.J.Caplen,等人,Gene Ther.1995；2:603；S.Li,等人,Gene Ther.1997；4,891)。
在另一实施方式中，所述至少一种载体是纳米脂质体或脂质纳米颗粒。纳米脂质体能够通过提高生物活性试剂的溶解度和生物利用率、体内外稳定性，以及避免他们与其他分子的不希望的相互作用来增强他们的性能。纳米脂质体的另一优点是细胞特异性靶向，其是获得靶细胞中最优治疗效果同时最小化对健康细胞和组织的副作用所需的药物浓度的先决条件。
如本文中所使用，短语“脂质纳米颗粒”指包括一种或多种脂质(如，阳离子脂质、非阳离子脂质和PEG-改性脂质)的转移载体。优选地，配制脂质纳米颗粒以向一个或多个靶细胞递送一种或多种试剂。适合的脂质的实例包括，例如，磷脂酰化合物(如，磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂)。还构想的是使用聚合物作为转移载体，无论单独或与其他转移载体结合。适合的聚合物可以包括，例如，聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯，聚丙交酯，聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、藻酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精、树状聚体和聚乙烯亚胺。在一个实施方式中，基于其促进核酸向靶细胞的转染的能力选择转移载体。
本发明构想了使用脂质纳米颗粒作为包括阳离子脂质的转移载体以封装和/或增强递送核酸进入靶细胞。如本文中所使用，短语“阳离子脂质”指在选择的pH——诸如生理pH——下携带净正电荷的任意多种脂质种类。构想的脂质纳米颗粒可以通过包括采用一种或多种阳离子脂质、非阳离子脂质和PEG改性脂质的不同比例的多成分脂质混合物来制备。文献中已经描述了若干阳离子脂质，其中许多是市售的。
用于本发明的组合物和方法的适合的阳离子脂质包括国际专利公开WO2010/053572中描述的那些，其通过引用并入本文。在某些实施方式中，本发明的组合物和方法采用包括可电离的阳离子脂质的脂质纳米颗粒。在一些实施方式中，使用阳离子脂质N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵或“DOTMA”(美国专利号4,897,355)。DOTMA可被单独配制或可与中性脂质——二油酰基磷脂酰乙醇胺或“DOPE”或其他阳离子或非阳离子脂质——结合为脂质体转移载体或脂质纳米颗粒，并且这样的脂质体可被用于增强递送核酸进入靶细胞。其他适合的阳离子脂质包括，例如，5-羧基鲸蜡醇基甘氨酸双十八烷基酰胺(5-carboxyspermylglycinedioctadecylamide)或“DOGS”、2,3-二油基氧基-N-[2(精胺-酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙胺内盐(2,3-dioleyloxy-N-[2(spermine-carboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-pr-opanaminium)或“DOSPA”(美国专利号5,171,678；美国专利号5,334,761)，1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷或“DODAP”、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷或“DOTAP”。考虑的阳离子脂质还包括1,2-双十八酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DSDMA”、1,2-二油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DODMA”、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLinDMA”、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLenDMA”、N-二油基-N,N-二甲基氯化铵或“DODAC”、N,N-双十八烷基-N,N-二甲基溴化铵或“DDAB”、N-(1,2-双肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵或“DMRIE”、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(顺,顺-9,12-十八二烯氧基)丙烷或“CLinDMA”、2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基1-1-(顺,顺-9',1-2'-十八二烯氧基)丙烷或“CpLinDMA”、N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苄基胺或“DMOBA”、1,2-N,N'-二油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DOcarbDAP”、2,3-二亚油酰基氧基-N,N-二甲基丙基胺或“DLinDAP”、1,2-N,N'-二亚油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLincarbDAP”、1,2-二亚油酰基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLinCDAP”、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环或“DLin-K-DMA”、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环或“DLin-K-XTC2-DMA”和2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧戊环-4-基)-N,N-二-甲基乙胺(DLin-KC2-DMA))(参见WO 2010/042877；Semple等人,Nature Biotech.28:172-176(2010))，或其混合物。(Heyes，J.等人,JControlled Release 107:276-287(2005)；Morrissey,D V.等人,Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；PCT公开WO2005/121348A1)。
本发明还构想了使用胆固醇基阳离子脂质。这样的胆固醇基阳离子脂质可以单独或与其他阳离子或非阳离子脂质组合使用。适合的胆固醇基阳离子脂质包括，例如，DC-胆(N,N-二甲基-N-乙基酰胺基胆固醇)、1,4-二(3-N-油基氨基-丙基)哌嗪(Gao,等人Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf等人BioTechniques 23,139(1997)；美国专利号5,744,335)或ICE。
另外，商业购买若干试剂以增强转染效果。适合的实例包括LIPOFECTIN(DOTMA:DOPE)(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)、LIPOFECTAMINE(DOSPA:DOPE)(Invitrogen)、LIPOFECTAMINE2000(Invitrogen)、FUGENE、TRANSFECTAM(DOGS)和EFFECTENE。
还构想的是这样的阳离子脂质，诸如基于二烷基氨基、基于咪唑和基于胍盐的脂质。例如，某些实施方式涉及包括一种或多种基于咪唑的阳离子脂质的组合物。
本发明还构想了单独或优选地与其他脂质一起使用聚乙二醇(PEG)改性磷脂和衍生化脂质，诸如衍生化神经酰胺(PEG-CER)，包括N-辛酰基-鞘氨醇-1-[丁二酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8PEG-2000神经酰胺)，其他脂质包括转移载体(如，脂质纳米颗粒)。添加这样的成分可以阻止络合物聚集并且还可以提供增加循环寿命和增加向靶细胞递送脂质-核酸组合物的手段(Klibanov等人(1990)FEBS Letters,268(1):235-237)，或可以选择他们以在体内快速地交换出制剂(参见美国专利号5,885,613)。特别有用的可交换脂质是具有较短酰基链(如，C14或C18)的PEG-神经酰胺。本发明的PEG改性磷脂和衍生化脂质可以占脂质体转移载体中存在的总脂质的从大约0％至大约20％、大约0.5％至大约20％、大约1％至大约15％、大约4％至大约10％或大约2％的摩尔比。
本发明还构想了使用非阳离子脂质。如本文中所使用，短语“非阳离子脂质”指任何中性、两性离子或阴离子脂质。如本文中所使用，短语“阴离子脂质”指在选择的pH——诸如生理pH——下携带净负电荷的任意多种脂质种类。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、双肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇或其混合物。这样的非阳离子脂质可以单独使用，但优选地与其他赋形剂结合使用，例如，阳离子脂质。当与阳离子脂质结合使用时，非阳离子脂质可以占转移载体中存在的总脂质的5％至大约90％或优选地大约10％至大约70％的摩尔比。
在一些实施方式中，转移载体(如，脂质纳米颗粒)通过结合多种脂质和/或聚合物成分来制备。包括脂质纳米颗粒的阳离子脂质、非阳离子脂质和/或PEG改性脂质的选择，以及这样的脂质彼此间的相对摩尔比是基于选择的脂质(一种或多种)的特性、预期靶细胞的性质和待递送的试剂的特性。另外的考虑包括，例如，烷基链的饱和以及选择的脂质(一种或多种)的大小、电荷、pH、pKa、融合性(fusogenicity)和毒性。
本发明的组合物中使用的脂质体转移载体可以通过目前在本领域内已知的各种技术来制备。多层小泡(MLV)可以通过常规技术来制备，例如，通过在合适的溶剂中溶解脂质然后蒸发溶剂以在器皿的内部上留下薄膜或通过喷雾干燥而在适合的容器或器皿的内壁上沉积选择的脂质。然后可以利用涡流运动将水相添加至器皿，其可以导致MLV的形成。然后可以通过均化、超声或挤出多层小泡来形成单层小泡(ULV)。另外，可以通过洗涤剂去除技术来形成单层小泡。
在某些实施方式中，本发明的组合物可以装载有诊断放射性核素、荧光材料或体外和体内应用二者中可检测的其他材料。
在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒载体由脂质制造，其使用适于容纳颗粒的高通量合成和标记的在线微流体装备。这样的制造方法在本领域内是已知的，如，Jahn等人,2007,Langmuir 23,6289-6293。通常，制造容纳治疗有效负载的合适的大小的颗粒。
化学试剂可以被装载至稳定的HSPC颗粒内，例如由Schroeder等人,2007,Langmuir 23,4019-402所示。可以在‘蛋白生产纳米颗粒’内合成生物治疗剂(蛋白/RNA)。在一些实施方式中，合成纳米颗粒被可控地触发以在靶部位合成蛋白和RNA，如在Schroeder,A等人Nano Lett 12,2685–2689,(2012)中所显示。这些纳米颗粒由脂质小泡组成，脂质小泡填充有负责转录和翻译的分子机器，包括以光不稳定保护基团笼蔽的氨基酸、核糖体和DNA。颗粒作为能够生产RNA/蛋白的纳米工厂。在体外和体内，蛋白/RNA合成可以在空间上和时间上可控，并且可以通过在毫秒的时间级上照射微米级组织区域来引发。如此，该平台可以用于针对它们的活性——如，抗癌活性——来筛选RNA(Png等人,2012Nature 481,190-194)和蛋白。
在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒(如，载体)是这样的纳米颗粒：其中形成脂质体的脂质组成纳米颗粒的40-100％。在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒包括0-50％mol的胆固醇。在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒包括1-8％mol的PEG-脂质。在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒包括0-10％mol的功能脂质(如，阳离子脂质或具有靶向部分的脂质)。
如本文中和本领域内所使用，mol百分比(“％mol”)指基于组成纳米颗粒的成分或化合物的总mol的具体成分或化合物的百分比。例如，如果纳米颗粒包含3mol的化合物A和1mol的化合物B，那么化合物A占混合物的75mol％并且化合物B占25mol％。
在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒(如，载体)包括40-70％mol的形成脂质体的脂质。在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒包括20-50％mol的胆固醇。在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒包括4-8％mol的PEG-脂质。在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒包括0-3％mol的功能脂质(如，阳离子脂质或具有靶向部分的脂质)。根据具体实施方式，包括40-70％mol的形成脂质体的脂质、20-50％mol的胆固醇、4-8％mol的PEG-脂质和0-3％mol的功能脂质的纳米颗粒适合用于静脉施用。
在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒(如，载体)包括50-80％mol的形成脂质体的脂质。在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒包括0-50％mol的胆固醇。在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒包括0-3％mol的PEG-脂质。在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒包括4-8％mol的功能脂质(如，阳离子脂质或具有靶向部分的脂质)。根据具体实施方式，包括50-80％mol的形成脂质体的脂质、0-50％mol的胆固醇、0-3％mol的PEG-脂质和4-8％mol的功能脂质的纳米颗粒适合用于瘤内施用。
治疗诊断用途
根据一些实施方式，提供了用于预测患有疾病的对象对治疗剂的响应的包括多种载体的组合物，多种载体独立地包括治疗有效量的至少一种治疗剂和独特地识别所述至少一种治疗剂的核酸分子。
根据一些实施方式，提供了预测患有疾病的对象对治疗剂的响应的方法，方法包括步骤：
(a)向对象施用包括多种载体的组合物，多种载体独立地包括治疗有效量的至少一种治疗剂和独特地识别所述至少一种治疗剂的核酸分子；和
(b)通过独特的核酸分子识别从所述对象获得的样品中所述至少一种治疗剂的效果；
由此预测患有疾病的对象对治疗剂的响应。
在另一实施方式中，所述方法进一步包括测序所述核酸分子的步骤。在另一实施方式中，所述方法进一步包括扩增所述核酸分子的步骤。用于扩增和测序核酸的方法对本领域技术人员是熟知的。
在另一实施方式中，所述方法进一步包括在利用靶细胞培育试剂之后清洗和DNA酶处理步骤。在另一实施方式中，在确定治疗效果之前所述样品被分解为单细胞悬浮液。将细胞样品分解为单细胞悬浮液的方法在本领域内是已知的并且可以包括例如gentleMACSTM组织处理器(Dissociator)。
在另一实施方式中，所述方法进一步包括细胞分选步骤。细胞分选的方法在本领域内是众所周知的并且包括但不限于FACS、磁珠分选、ELISA、基于微流体的分选、基于细胞张力的分选等。根据优势实施方式，通过分选靶细胞和使细胞状态(如活/死细胞)与DNA条码相关联来分析每种治疗剂的活性。在另外的实施方式中，该方法能够针对它们的病人特异性和细胞特异性活性筛选多种药物。
在实施方式中，本文中公开的方法包括提供持续的时间量的治疗剂以执行其治疗活性。在取样靶细胞之前的持续的时间量将取决于障碍或症状的性质，和取决于特定试剂，并且可以通过本领域技术人员已知的标准临床技术确定。作为非限制性实例，持续的时间量包括在施用组合物后大约24、大约30、大约48小时，或超过24小时。每种可能性表示本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，为了避免细胞内部条码的DNA酶降解，持续的时间量小于72小时。
在一些实施方式中，在取样靶细胞之前的持续的时间量范围为从24至72小时。在一些实施方式中，在取样靶细胞之前的持续的时间量范围为从24至48小时。在其他实施方式中，在取样靶细胞之前的持续的时间量范围为从30-48小时。在其他实施方式中，在施用组合物之后至少24小时获得样品。在其他实施方式中，在施用组合物之后至少30小时获得样品。在其他实施方式中，在施用组合物之后至少48小时获得样品。在其他实施方式中，在施用组合物之后至多48小时获得样品。在其他实施方式中，在施用组合物之后至多60小时获得样品。在其他实施方式中，在施用组合物之后至多72小时获得样品。在其他实施方式中，在施用组合物之后24-48小时之间获得样品。在其他实施方式中，在施用组合物之后30-48小时之间获得样品。可以根据若干因素确定取样靶细胞的准确时间范围，包括使用的条码以及被检查的治疗剂的类型和量。作为非限制性实例，核酸分子通常易于在施用之后48小时降解(特别是全身施用)，而稀土元素可以在较长的时间周期被检测。在其他实施方式中，治疗剂由它们对靶细胞的作用的时间而异。
在一些实施方式中，治疗剂(如，顺铂)包括独特的条码。本领域技术人员将理解，在这样的实施方式中，所述载体可以包括治疗剂(如，顺铂)并且不需要添加另外的条码。
在另一实施方式中，所述组合物被配制用于全身施用。在另一实施方式中，所述全身施用为静脉注射。在另一实施方式中，所述施用为注射入组织，诸如瘤内注射。
在一些方面，提供了包括至少一种细胞的组合物，该至少一种细胞包括本发明的1-4种类型的载体。在一些实施方式中，提供了包括至少一种细胞的组合物，该至少一种细胞包括1-4种类型的载体，每种类型的载体独立地包括单细胞治疗有效量的至少一种治疗剂；和独特地识别至少一种治疗剂的1-10,000个核酸分子。在一些实施方式中，提供了包括多种细胞的组合物，每种细胞包括1-4种类型的载体，并且每种类型的载体独立地包括单细胞治疗有效量的至少一种治疗剂；和独特地识别至少一种治疗剂的1-10,000个核酸分子。
本发明的方法和组合物可被用于优先靶向大量的靶细胞。例如，构想的靶细胞包括但不限于肝细胞、上皮细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、肺细胞、骨细胞、干细胞、间充质细胞、神经细胞、心脏细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、β细胞、垂体细胞、滑膜细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、成纤维细胞、B细胞、T细胞、网织红细胞、白细胞、粒细胞和肿瘤细胞。如本文中所使用，“肿瘤细胞”包括原发性癌细胞以及转移性细胞。
如本文中所使用，术语“对象”指本发明的组合物和方法被施用至其的任何动物(如，哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长类、啮齿类等。在一些实施方式中，关于人类对象，术语“对象”和“病人”在本文中可交换地使用。在其他实施方式中，关于非人类对象，术语“对象”和“病人”在本文中可交换地使用。
在一些实施方式中，本发明的方法用于确定或预测患有恶性疾病的对象对治疗剂的响应。在一些实施方式中，所述恶性疾病是癌症、癌症转移和恶化前的损伤。
癌症治疗剂的实例包括，例如但不限于阿比特龙、阿维A、阿地白介素、阿仑珠单抗、氨磷汀、安吖啶、阿那格雷、阿那罗唑、砷、天冬酰胺酶、天冬酰胺酶欧文菌属、阿西替尼、阿扎胞苷、BCG、苯达莫司汀、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、博来霉素、硼替佐米、本妥昔单抗(Brentuximab)、溴隐亭、布舍瑞林、白消安、卡巴它赛、卡麦角林、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉立滨、氯膦酸盐、克里唑蒂尼、环磷酰胺、环孢霉素、阿糖胞苷、氮烯唑胺、放线菌素D、达沙替尼、道诺霉素、地加瑞克、迪诺苏单抗、地塞米松、右雷佐生、多西他赛、亚德里亚霉素、亚德里亚霉素聚乙二醇化脂质体、恩扎鲁胺、表阿霉素、艾日布林、埃罗替尼、雌莫司汀、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、非格司亭、氟达拉滨、5-氟脲嘧啶、氟他胺、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、戈舍瑞林、羟基脲、依达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、3-硝基-4-碘苯甲酰胺(Iniparib)、干扰素α-2b、易普利姆玛、伊立替康、伊沙匹隆、Lambrolizumab、兰瑞肽、拉帕替尼、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、亮丙瑞林、洛莫司汀、氮芥、甲孕酮、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、美司那、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、尼罗替尼、尼鲁米特、奥曲肽、奥法木单抗、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇纳米颗粒、白蛋白结合(nab)、帕米膦酸钠、帕尼单抗、帕唑帕尼培美曲塞、帕妥珠单抗、卟菲尔钠、甲苄肼、喹高利特、雷替曲塞、呼肠孤病毒血清3型菌株-迪尔林、利妥昔单抗、罗咪酯肽、鲁索利替尼、索拉非尼、链脲菌素、苏尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺、西罗莫司脂化物(Temsirolimus)、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、促甲状腺素α、托珠单抗、拓扑替康、曲妥单抗曲妥单抗、曲妥珠单抗曲奥舒凡、维生素A酸、维罗非尼、长春碱、长春新碱和长春瑞滨。
用作治疗剂的化学治疗剂的实例包括，例如但不限于如，烷基化试剂(如，环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、氮杂环丙烷、环氧化物、烷基硫酸酯)、顺铂和其类似物(如，卡铂、奥沙利铂)、抗代谢物(如，甲氨蝶呤、5-氟脲嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、吉西他滨、氟达拉滨)、拓扑异构酶干扰试剂(如、喜树碱、依立替康、托泊替康、依托泊苷、替尼泊苷、亚德里亚霉素、柔红霉素)、抗微管试剂(如，长春花生物碱、诸如长春新碱、长春碱和长春瑞滨；紫杉烷，诸如紫杉醇和多西他赛)、干扰素、白介素-2、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、单克隆抗体、雌激素调质(如，他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬)、甲地孕酮、芳香化酶抑制剂(如，来曲唑、阿那曲唑、依西美坦、奥曲肽)、奥曲肽、抗雄激素(如，氟他胺、卡索地司(casodex))、激酶和酪氨酸抑制剂(如，伊马替尼(STI571或格列卫(Gleevac))；吉非替尼(易瑞沙)；和厄洛替尼(特罗凯)等。参见如Cancer:Principles and Practice ofOncology,第7版,Devita等人,Lippincott Williams&Wilkins,2005,第15、16、17和63章)。
在一些实施方式中，本发明的方法用于确定或预测患有炎性疾病或障碍的对象对治疗剂的响应。
在一些实施方式中，本发明的方法用于确定或预测患有变性疾病或障碍的对象对治疗剂的响应。在一个实施方式中，所述变性疾病是骨性关节炎。
在一些实施方式中，本发明的方法用于确定或预测患有神经性疾病或障碍的对象对治疗剂的响应。
如本文中所使用，当与值组合时，术语“大约”指参考值的正负10％。例如，大约1000纳米(nm)的长度指1000nm+-100nm的长度。
在查阅了下面的实施例之后，本发明的另外的目的、优势和新特征对本领域普通技术人员将变得显而易见，其不旨在限制性的。另外，如本文此前所叙述和下面权利要求部分中所要求保护的本发明的各种实施方式和方面中的每个在下面的实施例中发现实验支持。
实施例
一般地，本文中使用的命名法和本发明中利用的实验室过程包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。在文献中全面地解释这样的技术。参见，例如，“MolecularCloning:A laboratory Manual”Sambrook等人,(1989)；”Current Protocols inMolecular Biology”Volumes I-III Ausubel,R.M.,编(1994)；Ausubel等人,“CurrentProtocols in Molecular Biology”,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,“A Practical Guide to Molecular Cloning”,John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等人,“Recombinant DNA”,Scientific American Books,New York；Birren等人(编)“Genome Analysis:A Laboratory Manual Series”,Vol.1-4,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York(1998)；美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所阐述的方法学；“Cell Biology:A LaboratoryHandbook”,Volumes I-III Cellis,J.E.编(1994)；Freshney,Wiley-Liss,N.Y.的“Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique”(1994),第三版；“CurrentProtocols in Immunology”Volumes I-III Coligan J.E.编(1994)；Stites等人(编)，“Basic and Clinical Immunology”(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(编),“Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；其全部通过引用并入。贯穿该文件提供其他一般参考。
脂质体合成/制备
使用本领域内已知的方法制备脂质体。将HSPC、PEG-DSPE和胆固醇58％、2％、40％溶解在纯的乙醇中并在65℃下加热直到完全溶解。
合成脂质体：脂质体包含下列的脂质组合物：58％mol的氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、Mw 762.1；2mol％的聚乙二醇二硬脂酰-磷酸乙醇胺(m2000PEG DSPE)——其作用是降低脂质体由于空间效应的聚集/融合，Mw 2805.54；和40mol％的胆固醇Mw 386.65。溶液中总脂质的工作浓度为50mM。培养基为去离子水中10％PBS/5％葡萄糖。首先，将脂质溶解在纯乙醇中，升温至65℃并加入至1ml的培养基(也升温至相同的温度)。在直接注入和移液之后，加入更多培养基以达到最终的脂质浓度。氢化大豆磷脂酰胆碱由Lipoid贡献(Ludwigshafen,Germany)；m2000PEG-DSPE从Avanti(Alabaster,Alabama,USA)购买和胆固醇(分类号：C8667-500MG)来自Sigma(Rehovot，Israel)。
DNA封装：25毫微摩且脱盐的ssDNA寡聚物(oligos)从Sigma&IDT(LeuvenBelgium)购买，其具有50-120个碱基对的长度范围。在两个ssDNA的退火之后，将原液稀释至100μM并分为100微升(μl)的等分试样。对于5ml的脂质溶液，在添加溶解的脂质(对于3ml-150μl的dsDNA)之前，将300μl的dsDNA加入至1ml的培养基溶液。在封装之后，使用挤出机生产200nm的脂质体。
挤出过程：通过400nm和200nm的膜挤出脂质溶液3次。挤出机温度被设置为65摄氏度(℃)。
经由DLS的粒径确定粒径(动态光散射)——在挤出之后，通过DLS(ZetaSizer–ZSP)进行大小确定。PDI范围在0.003-0.08之间。
体外转染：在8/3.5cm组织培养板中在B-16(黑素瘤)和4T1(乳腺癌)小鼠癌细胞二者上进行体外实验。在RPMI(biological industries)中培养细胞，经过24小时，将具有新鲜培养基的10％(v/v)的脂质体溶液加入细胞培养。在37℃下培育细胞24小时，并且然后分析。
DNA提取：具有剩余脂质体的培养基被丢弃并利用PBSX1(BiologicalIndustries)清洗细胞3次。利用胰蛋白酶使细胞与板分离并转移入1.5ml的Eppendorf管。在1200rpm下离心细胞7min，并且丢弃胰蛋白酶。使用Bligh和Dyer试验进行DNA提取；添加167μl的1:2氯仿：甲醇(v/v)、55.5μl的氯仿、和100μl的去离子水。在1000rpm离心5min后，收集上部水相。
DNA扩增：在循环变温器(“Daniel Biotech”)中使用50μl的反应中预混合物(ready mix)(“Ornat”)来扩增dsDNA。经过PCR，将溶液装载至3％(w/w)的琼脂糖凝胶(“Hy-Labs”)并进行25min。
RT-PCR：在DNA提取之后，在RT-PCR循环变温器(“Bio Rad”)使用TaqMan探针扩增和分析链。
细胞分选：取具有106/ml的浓度的15ml的细胞悬浮液至流动活化细胞分选仪(FACS–ARIA)。对细胞设门(gating)后，它们被分选为1,000个细胞、100个细胞、10个细胞和单个细胞。所有细胞被分选入聚丙烯的圆锥透明96井。在分选之后，进行B&D和PCR。
细胞稀释：将细胞悬浮在1ml的培养基中并计数。下一步是在900μl的PBSX1中一系列稀释，至多103细胞–100μl。每个稀释为再稀释10倍，从而得到103、102和10个细胞：10μl至90μl的去离子水。最终，为了在理论上得到单细胞，从100个细胞稀释取1μl放入99μl的PBSX1。
共焦/细胞观测仪：DNA封装——使用上面描述的方法制备包含FAM缀合DNA的脂质体。在10％PBS(膜类型)上透析脂质体持续24小时。分别地利用DLS(制造)激发和发射566-345nm测量透析之前和之后的样品(三份)的荧光。再分透析之后和之前的荧光值以给出封装百分比。
体内转染：100μl的106细胞/ml的4T1(乳腺癌)皮下注射至10周龄的balb/c雌性小鼠。大约14周之后(当原发性肿瘤足够大)，静脉注射100μl的脂质体溶液。36小时之后，处死小鼠并在冰内取其器官(+肿瘤)用于进一步步骤。
实施例1
纳米颗粒制造和标记
纳米颗粒由脂质制造，其使用适于容纳(图2)颗粒的高通量合成和标记的在线微流体装备(Jahn,A.等人2007,Langmuir 23,6289-6293)。制造适于容纳治疗有效负载的合适大小的颗粒。化学试剂被装载至稳定的HSPC颗粒内(Schroeder,A等人2007,Langmuir23,4019-4025)和在～200nm的‘蛋白生产纳米颗粒’内合成生物治疗剂(如，蛋白/RNA)。最近，发展了可以被可控地触发以在靶部位合成蛋白和RNA的合成纳米颗粒(Schroeder,A.等人2012,Nano Lett 12,2685–2689)。这些纳米颗粒由脂质小泡组成，脂质小泡填充有负责转录和翻译的分子机器，包括以光不稳定保护基团笼蔽的氨基酸、核糖体和DNA。颗粒作为能够生产RNA/蛋白的纳米工厂。在体外和体内，蛋白/RNA合成在空间上和时间上可控，并且可以通过在毫秒的时间级上照射微米级组织区域来引发。我们将使用该平台针对它们的抗癌活性筛分RNA和蛋白。
可以体外和体内建模原发性和转移性治疗活性。为了同时筛选多种药物，利用DNA条码标记纳米颗粒(图3)。如图3中所见，检测1,000个(图3A)、500个(图3B)、5个(图3C)细胞的群内和甚至单细胞(图3D)内的DNA条码。
实施例2
分析原发性和转移性模型
在BALB/c小鼠中使用4T1乳腺癌模型进行原始体内研究(图4)，由Weinberg及其合作者报道。为了确认这些模型的临床准确性，在人胚胎干细胞(hESC)畸胎瘤中建立的人衍生的肿瘤中也试验了治疗诊断纳米颗粒的生物分布和活性。这些肿瘤被认为以准确方式反映临床情景，包括微环境、瘤内形态不均一性、癌细胞亚群和细胞表现型(Burgos-Ojeda,D.等人2013,Cancer Res 73,3555-3565,2845)。
首先，为了检查使用脂质体的条码的递送的效率，向小鼠施用包含条码的脂质体或裸露的条码。在注射48小时后，收获、均化肿瘤和提取和扩增条码。基础扩增识别RT-PCR中条码的非特异性扩增。使用载体(脂质体)在肿瘤组织中检测的条码的量显著地较大(图5)。因为DNA链(条码)和细胞膜二者是带负电荷的，所以DNA不进入没有传递质的细胞。因此，肿瘤中游离条码的存在可以由到达肿瘤的细胞外基质而不是细胞的DNA链解释。
将具有100纳米的直径的条码化纳米颗粒和具有微米的直径的条码化纳米颗粒静脉注射至带有乳腺癌肿瘤的BALB/C小鼠。注射48小时之后，肿瘤被解离为单细胞悬浮液并使用FAC收集细胞。通过RT-PCR提取和扩增DNA条码。结果说明纳米的纳米颗粒的摄取显著地高于微米级纳米颗粒的摄取(图6)。这些结果暗示脂质体的摄取是依赖大小的，并偏好较小颗粒。
体内技术的初次尝试通过使用亚德里亚霉素(DOX)作为针对乳腺癌的药物模型。为了确定在包含DOX的条码化纳米颗粒(BNP)和仅包含条码而没有药物的安慰剂BNP之间的条码分布中是否存在任何差异，步骤包括在两批中合成条码化脂质体：1.脂质体仅包含条码，2.脂质体包含条码和DOX。以被动方式封装条码同时以主动方式封装DOX。将安慰剂BNP单独地注入一组小鼠(n＝3)中，和将DOX BNP注入另一组。在注射48小时之后，提取肿瘤并解离为单细胞悬浮液。利用生存力染料(7AAD)染色细胞并在FACS中分选为活/死细胞。从每一组提取条码。提取后，通过RT-PCR扩增DNA条码。将每一组(活/死)的条码浓度转化为条码的量并以细胞的量归一化以得到每细胞的DNA条码分子。图7(A)显示了在安慰剂条码化NP中，主要积累在活细胞中。该结果匹配在死细胞中几乎没有摄取出现的假设。第二组DOX处理显示了死细胞中优先的分布(图7(B))。
卵巢癌是社会上是普遍存在的，其具有很少有效治疗方式。该疾病在转移至肝脏或腹部空间后多次被检测到。
在目前的研究中，如先前所描述(Burgos-Ojeda，出处同上)，卵巢肿瘤在SCID/米色小鼠中的hESC畸胎瘤中扩大。静脉施用装载有抗癌药物的条码化纳米颗粒。经过48小时评价纳米颗粒的治疗任务的评估，其能够在肿瘤中积累并进行治疗任务。通过使用4T1细胞已经证实了48小时的时间线(参见图8)。组织的死后组织学评估被用于研究肿瘤生物分布。然后将活组织检查样品解离为单细胞悬浮液，并使用抗体，根据细胞亚群(包括CD45、CD11B、F4/80、CD13、REST)和生存力(活/死)分选细胞。
将包含五种不同药物或对照化合物(图8描绘了安慰剂、咖啡因、顺铂、亚德里亚霉素和吉西他滨)的条码化纳米颗粒同时静脉注射至在后腿中带有原发性肿瘤的BALB/c小鼠。48小时后，从肿瘤取活组织检查。然后将活组织检查组织解离为单细胞悬浮液，并根据它们的生存力(活/死)筛选细胞。与活细胞相比，在死细胞中发现升高水平的药物(吉西他滨、顺铂)条码。中性化合物、咖啡因在活细胞和死细胞中具有相似的条码水平。如图8A-E所指示，对于治疗该肿瘤，吉西他滨比顺铂更有效。
结果显示了每种条码的独特分布。DOX和顺铂显示了如所预期的清楚的治疗作用。咖啡因显示了几乎没有作用并且其分布在死细胞和活细胞之间几乎相等地分配(图8A-E)。最惊人的结果来自于两侧的治疗程度：安慰剂和吉西他滨。基于吉西他滨的分布，发现其是最有效的药物。与活细胞相比，几乎全部吉西他滨条码积累在死细胞中，超过6,000(图8(E))。在治疗效果的其它程度中，与死细胞相比，安慰剂BNP几乎仅积累在活细胞中，超过10,000，图8(A)。该数据暗示，只要细胞是活的，安慰剂BNP将继续积累在细胞中。这使分布强烈地移动向活细胞移动。
该实施例图解了在开始治疗周期之前，用于确定药物的细胞特异性效能的治疗诊断平台(图8F)，以及研究了肿瘤微环境内不同药物的治疗曲线。
为了验证三种化疗药物——亚德里亚霉素、顺铂和吉西他滨——的条码化分析，进行治疗处理。实验包括4组，每组包含6只小鼠。每组用单种药物处理持续24天，开始10天后肿瘤诱导。一周一次静脉给予每个剂量。每组用5mg/kg的亚德里亚霉素、6mg/kg的顺铂、125mg/kg的吉西他滨或作为对照的100μl的盐水处理。利用卡尺测量肿瘤体积并计算为长度/2*(宽度)2。通过看图9(A)，基于肿瘤体积变化百分比，可以直接对药物效能分级。这些结果增强了分级的(rated)吉西他滨为三种药物中最有效的药物的诊断分析。相对于亚德里亚霉素和对照处理，吉西他滨显著地弱化肿瘤的生长。在实验周期期间没有观察到临床毒性。开始处理24天后，提取每个小鼠的肿瘤用于进行进一步分析。图9(B)显示了来自每组的典型的肿瘤。该肿瘤的视觉化也增强了诊断结果并说明每个处理之间的差异。增强结果的另一个指示是肿瘤/身体重量比。肿瘤重量越小并且身体重量越大，药物越有效。在图9(C)中，吉西他滨中存在导致最小化肿瘤/身体重量比的趋势。趋势与肿瘤尺寸和肿瘤体积的变化相关联。肿瘤重量参数反映了药物抑制和损坏肿瘤生长的效果。身体重量参数反映了药物对身体的影响或药物的副作用多么严重。组合这些参数可有利于确定哪种药物对治疗肿瘤最有效和哪种药物对身体显示较小毒性。为检查不同组之间组织水平中的差异，在组织学上研究所有肿瘤。利用苏木精和伊红染色来自肿瘤的组织切片。切片的显微镜检查高度说明细胞实体肿瘤。有趣地，显示对治疗临床响应的肿瘤是的细胞较少且具有较低的有丝分裂计数。另地，利用兔单克隆抗-Ki67抗体(SP6；Thermo Scientific，Fremont，CA)免疫组织学染色组织切片以确定扩增指数(未显示)。切片的分析说明了在接受更有效治疗的肿瘤中较低的扩增指数，其中扩增指数在对照、亚德里亚霉素、顺铂和吉西他滨治疗的肿瘤中分别为85％、90％、65％和40％。
实施例3
方法的可行性
体内实验显示了使用低于2μM的条码浓度导致阻止检测(在系统的LOD下)。用于体外研究的颗粒的浓度为用于体内研究的颗粒的浓度的百分之一，以阻止在单层的细胞内部颗粒的溢出。这允许好的统计和鲁棒性分析。封装的条码的分析显示了在颗粒内条码分子的充分的范围应当在5-100个条码分子/颗粒(基于DNA与脂质摩尔比计算该范围)的范围内。对于结果的统计分析，发现，有效的颗粒浓度具有2-20μM的范围。当使用低于2μM的浓度时，存在不是所有细胞将包含至少一个颗粒的高可能性。在该浓度之上，系统中的SNR(信噪比)将太低。
为了确定颗粒施用后收获细胞的最优时间点，颗粒在组织中积累的时间、药物杀死细胞花费的时间和在细胞中条码降解花费的时间均应被考虑。考虑这些参数，在通过进行活组织检查收获颗粒之前，颗粒的时间循环周期被优化为48小时。
生物分布中体内工作显示了花费24小时使颗粒在肿瘤组织中达到最大浓度。另外，体外工作显示了达到若干药物的最大治疗效果的平均时间在24小时至48小时之间变化。考虑使颗粒到达组织和使药物在细胞中致死的时间周期——最优的时间周期应当为30-48小时。由于条码被存在于细胞内部的DNA酶降解，延长该时间周期将承受条码分解的风险。
实施例4
静脉和瘤内施用的颗粒组合物
制备由独特脂质组分构成的优选的颗粒以适合于施用模式，具体而言，静脉对瘤内施用。在表1中总结了静脉施用的颗粒和瘤内施用的颗粒的示例性组合物。
表1：

Claims (33)

1.一种包括至少一种载体的组合物，所述至少一种载体包括：
(a)单细胞治疗有效量的至少一种治疗剂；和
(b)独特地识别(a)的所述至少一种治疗剂的一个或多个条码。
2.根据权利要求1所述的组合物，其包括多种类型的载体，其中每种类型的载体独立地包括：
(a)单细胞治疗有效量的至少一种治疗剂；和
(b)独特地识别(a)的所述至少一种治疗剂的一个或多个核酸分子。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述治疗有效量足以用于调节单细胞的状态。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述调节单细胞的状态选自：调节细胞增殖、调节细胞死亡、调节细胞耐药性和调节细胞功能、活性或生理机能。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述多种类型的载体是15000种类型的载体。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述多种类型的载体是1-500种类型的载体。
7.根据权利要求4所述的组合物，其中所述多种类型的载体是1-10种类型的载体。
8.根据权利要求4所述的组合物，其中所述多种类型的载体是1-5种类型的载体。
9.根据权利要求4所述的组合物，其进一步包括不含治疗剂的至少一种对照载体，并且包括独特地识别所述对照载体的一个或多个条码。
10.根据权利要求1、4或7所述的组合物，其中所述条码是一个或多个核酸分子。
11.根据权利要求1、4或7所述的组合物，其中所述条码选自：稀土元素、荧光团、发色团、化学发光分子、磁性颗粒、染料和放射性同位素。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述稀土元素是镧系元素。
13.根据权利要求10所述的组合物，其中所述核酸分子的长度为5-400个核苷酸。
14.根据权利要求10所述的组合物，其中所述核酸分子的长度为5-200个核苷酸。
15.根据权利要求10所述的组合物，其中所述核酸分子包括与所述细胞的核酸基本上不一致或互补的序列。
16.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种载体具有5-250纳米的直径。
17.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种载体为脂质基颗粒。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述至少一种载体为脂质体。
19.根据权利要求17所述的组合物，其中所述至少一种载体为胶粒。
20.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述至少一种载体进一步包括标记。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述标记选自：荧光团、发色团、化学发光分子、磁性颗粒、染料、金属、稀土金属、金属和放射性同位素。
22.根据权利要求1所述的组合物，其被配制用于全身施用。
23.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物用于预测患有疾病的对象对治疗剂的响应。
24.一种用于预测患有疾病的对象对至少一种治疗剂的响应的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)向所述对象施用包括多种类型的载体的组合物，每种类型的载体独立地包括单细胞治疗有效量的至少一种治疗剂和独特地识别所述至少一种治疗剂的一个或多个条码；
(b)获得包括来自所述对象的细胞的样品；和
(c)通过独特的条码识别包括1-5种类型的载体的细胞中所述至少一种治疗剂的效果；
由此预测患有疾病的对象对治疗剂的响应。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述对象患有癌症。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述施用为静脉注射，并且所述组合物包括所述对象的肿瘤的每单细胞1-200个载体。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述施用为瘤内注射，和所述组合物包括所述对象的肿瘤的每单细胞1-20个载体。
28.根据权利要求24所述的方法，其中所述获得在施用所述组合物之后24-72小时的时间范围内执行。
29.根据权利要求24所述的方法，其中所述获得在施用所述组合物之后24-48小时的时间范围内执行。
30.根据权利要求24所述的方法，其进一步包括测序所述核酸分子的步骤。
31.根据权利要求24所述的方法，其进一步包括扩增所述核酸分子的步骤。
32.根据权利要求24所述的方法，其中在步骤(c)之前将所述样品分解为单细胞悬浮液。
33.根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一种载体进一步包括标记，并且其中使用选自以下的方法分选所述样品的细胞：FACS、磁珠分选、基于微流体的分选、基于细胞张力的分选和ELISA。
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