CN115996745A

CN115996745A - Brk肽和使用方法

Info

Publication number: CN115996745A
Application number: CN202180048026.1A
Authority: CN
Inventors: 多米尼克·布里东
Original assignee: Kong Karuo Holdings Co ltd
Current assignee: Kong Karuo Holdings Co ltd
Priority date: 2020-07-06
Filing date: 2021-07-06
Publication date: 2023-04-21
Also published as: KR20230136910A; JP2023533036A; IL299654A; US20230293643A1; WO2022010914A3; BR112023000187A2; EP4175659A2; WO2022010914A2; AU2021303405A1; CA3184955A1

Abstract

本发明涉及：截短的分离的BRK肽和其功能肽，所述肽抑制p27Kip1的磷酸化以及CDK2和CDK4的所产生的激酶活性；并且涉及其药物组合物。本发明进一步涉及一种分离的肽在治疗有需要的受试者的癌症的方法中的用途。

Description

BRK肽和使用方法

相关申请的交叉参考

本申请根据35 U.S.C.119(e)要求于2020年7月6日提交的美国临时申请第63/048,489号的权益。在先申请的公开内容被视为本申请的公开内容的一部分并且通过引用以其整体并入本申请的公开内容中。

序列表的并入

所附序列表中的材料特此通过引用并入到本申请中。名称为CONCARLO2000_1WO_SL的所附序列表文本文件创建于2021年6月18日并且为40kb。所述文件可以在使用WindowsOS的计算机上使用Microsoft Word访问。

发明背景

技术领域

本发明总体上涉及肽，并且更具体地涉及截短肽以及其抑制癌细胞增殖的用途。

背景技术

G1-S期细胞周期过渡受两种细胞周期蛋白-CDK复合物，即细胞周期蛋白D-CDK4/6和细胞周期蛋白E-CDK2支配。细胞周期蛋白D-CDK4(之后被称为CD-K4)使G1把关Rb磷酸化，从而使S期特异性转录因子，如E2F释放。E2F引起细胞周期蛋白E的转录诱导，所述细胞周期蛋白E进而与CDK2成为搭档以进一步使Rb磷酸化并且不可逆地引起到S期的过渡。细胞周期蛋白D1和CDK4在各种人类癌症中过表达，并且在小鼠模型中，任一者的丧失防止某些致癌基因驱动的肿瘤的发展。靶向CDK4活性一直是肿瘤学领域的长期目标，并且因为D-K4位于大多数致癌信号传导通路的下游，因此靶向此激酶可能预防在细胞表面或上游信号转导子受到抑制时频繁发生的抗性。CDK4特异性抑制剂(CDK4i)，如帕博西尼(Palbociclib)(PD0332991，之后被称为PD)、阿贝西尼(Abemaciclib)或瑞博西尼(Ribociclib)的到来已证明CDK4是有前途的靶标。与来曲唑(Letrozole)组合，PD将转移性乳腺癌患者的中位无进展生存期(PFS)从10.2个月延长至20.2个月(PALOMA试验)。然而，用PD治疗的患者的总体存活期(OS)与用单独的来曲唑治疗的患者中看到的总体存活期成十分相似，这表明发生了对此组合疗法的抗性。在组织培养系中，PD或瑞博西尼介导的停滞均未表现出持久性。尽管Rb的丧失表现出有别于细胞系中的原发性PD无反应性，但Ki67、细胞周期蛋白D、CDK4和p16的差异未表现出能够将反应性子组和无反应性子组分层。

细胞周期蛋白D为MAPK通路的转录靶标，但在细胞周期蛋白D与CDK4成为搭档之后，除非第三蛋白质，即p27Kip1(之后为p27)或p21Cip1将复合物保持在一起，否则二聚体不稳定并且快速解离回到单体形式。然而，p27与D-K4以两种不同构象结合：即封闭且未激活构象或可替代地开放且激活形式。此过渡是通过p27在残基Y88(或Y89)以及还有在残基Y74上的酪氨酸(Y)磷酸化介导的，所述残基引起构象变化，从而打开D-K4-p27三元复合物，由此使得其能够使如Rb等底物磷酸化。非磷酸化p27-D-K4复合物是催化上不活跃的，因为缔合的p27阻断CDK4上的ATP结合位点并且防止CDK4结构域本身所需的CDK激活激酶(CAK)磷酸化。p27 Y88通过Y激酶Brk(乳腺瘤相关激酶或PTK6，即蛋白质酪氨酸激酶6)磷酸化并且可以通过其它非受体结合的酪氨酸激酶磷酸化，所述其它非受体结合的酪氨酸激酶包含Src和Abl，并且Brk与p27之间的相互作用是通过Brk的SH3结构域与p27中的富含脯氨酸的结合位点之间的相互作用介导的。体外添加含Brk SH3的肽阻断此相互作用，从而防止p27Y88磷酸化，这进而引起对CDK4的抑制。含有Brk的SH3结构域但缺乏SH1激酶结构域的天然存在的交替剪接形式的Brk(ALT)的过表达还抑制Brk对p27的磷酸化，抑制CDK4，并且引起生长停滞，这表明对p27 Y88磷酸化的抑制可能是用于靶向CDK4依赖性肿瘤的替代方式。

数据表明CDK4i帕博西尼与不含CDK4的单体缔合。尽管激酶抑制剂不与激酶的活性形式缔合看起来似乎不寻常，但与CDK4的缔合也将减少三元复合物的量，从而释放p27以能够与CDK2缔合并抑制CDK2。与CDK4相反，CDK2不需要p27将与其细胞周期蛋白的相互作用稳定化；实际上CDK2对RB的磷酸化在p27无论是磷酸化的还是非磷酸化的时都与复合物缔合时受到抑制。但是即使在不能够使RB磷酸化时，Y-磷酸化的p27-细胞周期蛋白E-CDK2复合物也能够使p27在残基T187上磷酸化，所述残基在体内在p27成为泛素介导的降解的靶标时使其稳定性增加，从而减少p27与CDK2的缔合，并且间接激活细胞周期蛋白E-CDK2复合物。因此，阻断pY88可能具有防止p27降解并且使非磷酸化形式的p27稳定的益处，从而允许其抑制CDK2以及CDK4。对CDK4抑制疗法，如PD的抗性的根源未知，但可以补偿CDK4活性的损失的一个候选者为CDK2，因此在开始时抑制两种激酶的疗法可以提供治疗优点。

乳腺癌是美国妇女的癌症死亡的第二大原因，其中每年死亡约40,000；然而除了分子诊断中的进展之外，广泛的瘤间和瘤内异质性(即，具有不同遗传、表观遗传和/或表型特性的细胞的亚克隆)仍是一项重大挑战，因为除了对化学疗法的应答之外，异质性在患者预后以及对激素和靶向疗法的应答方面带来临床和治疗结果。

对包括癌症的病理性的分子基础的不断增长的知识通过开发针对这些实体的靶向疗法驱动个性化或“精准”医药领域鉴定特异性肿瘤特性并且利用这些特征。然而，特异性靶向癌细胞的个性化医药和其避开细胞周期调节的能力的需要仍未得到满足。

发明内容

本发明基于这样的重要发现，即截短的ALT肽而非全长肽可以特异性抑制癌细胞增殖和存活。这类肽可以掺入到药物组合物中并且可以用于治疗有需要的受试者的癌症。

在一个实施例中，本发明提供了一种分离的肽和功能肽，所分离的肽具有SEQ IDNO:11至13、17、22至23和25中所示的氨基酸序列，所述功能肽与所述氨基酸序列具有至少90％同源性。一方面，所述分离的肽进一步包含N末端修饰、C末端修饰、可检测标签、细胞穿透肽(CPP)、非天然氨基酸、肽缀合物、环肽或其组合。另一方面，相比于未经修饰的肽，所述分离的肽被修饰成具有提高的总体稳定性、延长的血流稳定性、提高的细胞渗透率、提高的细胞活性或其组合。在一些方面，所述可检测标签选自由以下组成的组：荧光标签、显色标签、供体/受体对的成员、稳定同位素以及其任何组合。在一些方面，所述CPP提高了细胞摄取、细胞穿透和/或所述肽的转运。在许多方面，所述肽抑制癌细胞增殖和/或降低癌细胞活力。在一些方面，所述肽抑制肿瘤生长。在其它方面，所述肽增加癌细胞死亡。在各个方面，所述肽增加肿瘤坏死。一方面，所述功能肽与SEQ IDNO:11至13、17、22至23或25具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少86％、至少97％、至少98％或至少99％同源性。另一方面，所述肽具有SEQ ID NO:22或23中所示的氨基酸序列。

在另一实施例中，本发明提供了一种分离的核酸序列，所述分离的核酸序列编码肽或功能肽，所述肽具有SEQ ID NO:11至13、17、22至23和25中所示的氨基酸序列，所述功能肽与所述氨基酸序列具有至少90％同源性。

在一个实施例中，本发明提供了一种药物组合物，其包含分离的肽或功能肽和药学上可接受的载体，所述分离的肽具有SEQ ID NO:11至13、17、22至23和25中所示的氨基酸序列，所述功能肽与所述氨基酸序列具有至少90％同源性。一方面，所述药物组合物进一步包含递送媒剂。在一些方面，所述递送媒剂选自由以下组成的组：纳米颗粒、脂质体、树状大分子、胶束、纳米乳剂、纳米悬浮液、泡囊、纳米囊、磁性纳米颗粒、基于脂蛋白的载体和脂质复合物纳米颗粒。一方面，所述脂质复合物纳米颗粒包含1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、胆固醇、DOPE、TPGS或其组合。一方面，脂质:肽质量比为约12.5:1。另一方面，所述递送媒剂与靶向抗体或抗体-药物缀合物(ADC)偶联。在其它方面，所述递送媒剂与聚乙二醇(PEG)聚合物或与白蛋白缀合。在各个方面，所述药物组合物进一步包含至少一种抗癌剂。一方面，所述功能肽与SEQ ID NO:11至13、17、22至23或25具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少86％、至少97％、至少98％或至少99％同源性。另一方面，所述分离的肽具有SEQ ID NO:22或23中所示的氨基酸序列。

在另一实施例中，本发明提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含分离的肽或功能肽和药学上可接受的载体，所述分离的肽具有SEQ ID NO:11至13、17、22至23和25中所示的氨基酸序列，所述功能肽与所述氨基酸序列具有至少90％同源性。一方面，所述肽抑制p27Kip1的磷酸化。在其它方面，所述肽抑制CDK2和CDK4。在一些方面，所述肽抑制癌细胞增殖和/或降低癌细胞活力。在其它方面，所述肽抑制肿瘤生长。在一些方面，所述肽增加癌细胞死亡。在其它方面，所述肽增加肿瘤坏死。一方面，进一步向所述受试者施用抗癌治疗。一方面，所述抗癌治疗选自化学疗法、放射治疗、免疫疗法、肿瘤切除以及其任何组合。

附图说明

图1为重组且合成的肽的表示。

图2A-2B展示了肽CCL-8-CCL-11相较于Flag-ALT的功效。图2A展示了双重处理48小时后MCF7的活力％。图2B展示了肽或对照处理48小时后的增殖％。值相对于每个经评估浓度的空纳米颗粒对照归一化。*p<0.05。

图3A-3B展示了肽CCL-8-CCL-11相较于Flag-ALT的功效。图3A展示了双重处理48小时后MCF7的活力％。图3B展示了肽或对照处理48小时后的增殖％。值相对于每个经评估浓度的空纳米颗粒对照归一化。*p<0.05。

图4A-4B展示了肽CCL-8-10和CCL-14相较于Flag-ALT的功效。图4A展示了MCF7的活力％。图4B展示了肽或对照治疗48小时后的增殖％。值相对于每个经评估浓度的空纳米颗粒对照归一化。*p<0.05。

图5A-5B展示了肽CCL-8-10和CCL-14相较于Flag-ALT的功效。图5A展示了MCF7的活力％。图5B展示了肽或对照治疗48小时后的增殖％。值相对于每个经评估浓度的空纳米颗粒对照归一化。*p<0.05。

图6A-6B展示了肽CCL-8-10相较于Flag-ALT的功效。图6A展示了双重处理48小时后MCF7的活力％。图6B展示了肽或对照处理48小时后的增殖％。值相对于每个经评估浓度的空纳米颗粒对照归一化。数据表示来自两种生物复制品的平均值。*p<0.05，**p<0.005。

图7A-7B展示了肽CCL-8-10相较于Flag-ALT的功效。图7A展示了双重治疗48小时后MCF7的活力％。图7B展示了肽或对照处理48小时后的增殖％。值相对于每个经评估浓度的空纳米颗粒对照归一化。数据表示来自两种生物复制品的平均值。*p<0.05，**p<0.005。

图8A-8B展示了肽CCL-12-14和CCL-9相较于Flag-ALT的功效。图8A展示了双重治疗48小时后MCF7的活力％。图8B展示了肽或对照处理48小时后的增殖％。值相对于每个经评估浓度的空纳米颗粒对照归一化。*p<0.05，**p<0.005。

图9A-9B展示了肽CCL-12-14和CCL-9相较于Flag-ALT的功效。图9A展示了双重治疗48小时后MCF7的活力％。图9B展示了肽或对照处理48小时后的增殖％。值相对于每个经评估浓度的空纳米颗粒对照归一化。*p<0.05，**p<0.005。

图10A-10B展示了肽CCL-9和CCL-14相较于Flag-ALT的功效。图10A展示了MCF7的活力％。图10B展示了肽或对照治疗48小时后的增殖％。值相对于每个经评估浓度的空纳米颗粒对照归一化。数据表示来自CCL-14的两种生物复制品和CCL-9的三种生物复制品的平均值。*p<0.05，**p<0.005。

图11A-11B展示了肽CCL-9和CCL-14相较于Flag-ALT的功效。图11A展示了双重治疗48小时后MCF7的活力％。图11B展示了肽或对照处理48小时后的增殖％。值相对于每个经评估浓度的空纳米颗粒对照归一化。数据表示来自CCL-14的两种生物复制品和CCL-9的三种生物复制品的平均值。*p<0.05，**p<0.005。

图12A-12D展示了用于在MCF7细胞中在NP肽/FLAG-ALT的两次24小时处理后对flag肽的量进行定量的flag Eliza测定。图12A展示了捕获增加浓度的经NP肽处理的细胞中的FLAG蛋白的总量的Flag Eliza。图12B展示了呈现在每个经处理浓度中捕获的FLAG肽的ng/mL的数值的表。图12C展示了对检测到的flag肽的量进行等量化以将在用FLAG-ALT和CCL-9进行的10ng/ul处理中的增殖％和活力％与20ng/ul CCL-8和CCL-10的增殖％和活力％进行比较。图12D展示了对检测到的flag肽的量进行等量化以将在用FLAG-ALT和CCL-9进行的2.5ng/ul处理中的增殖％和活力％与10ng/ul CCL-8和CCL-10的增殖％和活力％进行比较。*p<0.05，**p<0.005。

图13A-13B展示了肽CCL-8-CCL-10和CCL-14相较于Flag-ALT在MCF10A细胞中的功效。图13A展示了双重处理48小时后MCF10A的活力％。图13B展示了通过评估肽或对照处理48小时后SYTO60染料掺入的水平确定的增殖％。值相对于每个经评估浓度的空纳米颗粒对照归一化。*p<0.05，**p<0.005。

图14A-14B展示了肽CCL-8-CCL-10和CCL-14相较于Flag-ALT在MCF10A细胞中的功效。图14A展示了双重处理48小时后MCF10A的活力％。图14B展示了通过评估肽或对照处理48小时后SYTO60染料掺入的水平确定的增殖％。值相对于每个经评估浓度的空纳米颗粒对照归一化。*p<0.05，**p<0.005。

图15A-15B展示了MCF7和MCF10A细胞中用CCL-9和CCL-14处理后的细胞增殖％与细胞活力％之间的功能比较。图15A展示了双重处理48小时后MCF10A和MCF7细胞的活力％。图15B展示了通过评估肽或对照处理48小时后SYTO60染料掺入的水平确定的增殖％。值相对于每个经评估浓度的空纳米颗粒对照归一化。*p<0.05，**p<0.005。

图16A-16B展示了MCF7和MCF10A细胞中用CCL-9和CCL-14处理后的细胞增殖％与细胞活力％之间的功能比较。图16A展示了双重处理48小时后MCF10A和MCF7细胞的活力％。图16B展示了通过评估肽或对照处理48小时后SYTO60染料掺入的水平确定的增殖％。值相对于每个经评估浓度的空纳米颗粒对照归一化。*p<0.05，**p<0.005。

图17A-17F展示了用于对MCF7和MCF10A细胞中在处理之前和2至24小时处理后flag肽的量进行定量的Flap Eliza测定。图17A展示了对细胞培养基中的在细胞处理之前以下4种不同浓度的药物中的FLAG蛋白的定量：NP-FLAG ALT和CCL-8-10。图17B展示了捕获2次24小时处理之后增加浓度的经NP肽处理的MCF10A细胞中的FLAG蛋白的总量的FlagEliza。图17C展示了捕获2次24小时处理之后0.625ng/ul经NP肽处理的MCF10A细胞中的FLAG蛋白的总量的Flag Eliza。图17D展示了捕获2次24小时处理之后2.5ng/ul经NP肽处理的MCF10A细胞中的FLAG蛋白的总量的Flag Eliza。图17E展示了捕获2次24小时处理之后5ng/ul经NP肽处理的MCF10A细胞中的FLAG蛋白的总量的Flag Eliza。图17F展示了捕获2次24小时处理之后20ng/ul经NP肽处理的MCF10A细胞中的FLAG蛋白的总量的Flag Eliza。*p<0.05，**p<0.005。

图18A-18B展示了CCL-8表征。图18A展示了CCL-8HPLC迹。图18B展示了CCL-8MS。

图19A-19B展示了CCL-9表征。图19A展示了CCL-9HPLC迹。图19B展示了CCL-9MS。

图20A-20B展示了CCL-10表征。图20A展示了CCL-9HPLC迹。图20B展示了CCL-10MS。

图21A-21B展示了CCL-20表征。图21A展示了CCL-20HPLC迹。图21B展示了CCL-20MS。

图22展示了CCL-19MS。

图23展示了CCL-21MS。

图24A-24B。图24A展示了细胞增殖测定结果。图24B展示了包封效率测定结果。

图25A-25B示出了CCL-2与CCL-19和CCL-20之间的功能比较并且展示了用纳米颗粒形式的肽进行剂量应答处理之后测得的ATP活力。图25A为展示了在MCF7细胞中测得的ATP活力的图。N＝4。图25B为展示了在T47D细胞中测得的ATP活力的图。N＝3。

图26示出了CCL-2与CCL-19和CCL-20之间的功能比较并且展示了在BT-549细胞中测得的ATP活力。N＝3。

图27示出了CCL-2与CCL-19和CCL-20之间的功能比较并且展示了在MCF10A细胞中测得的ATP活力。N＝3。

图28A-28E展示了注射有5x10⁶个MCF7细胞并且用媒剂、CCL-2、CCL-19或CCL-20处理的NOS/SCID雄性小鼠的随时间推移变化的肿瘤体积。图28A展示了用媒剂处理的小鼠的肿瘤体积。图28B展示了用CCL-2/NPx(肽:脂质比：1:10)处理的小鼠的肿瘤体积。图28C展示了用CCL-2/NPx(1:12.5)处理的小鼠的肿瘤体积。图28D展示了用CCL-19/NPx(1:12.5)处理的小鼠的肿瘤体积。图28E展示了用CCL-20/NPx(1:12.5)处理的小鼠的肿瘤体积。

图29A-29T展示了注射有5x10⁶个MCF7细胞并且用媒剂、CCL-2、CCL-19或CCL-20处理的NOS/SCID雄性小鼠的体积肿瘤体积随时间推移的变化。图29A展示了肿瘤体积在第2天时的变化。图29B展示了肿瘤体积在第3天时的变化。图29C展示了肿瘤体积在第4天时的变化。图29D展示了肿瘤体积在第5天时的变化。图29E展示了肿瘤体积在第6天时的变化。图29F展示了肿瘤体积在第7天时的变化。图29G展示了肿瘤体积在第8天时的变化。图29H展示了肿瘤体积在第9天时的变化。图29I展示了肿瘤体积在第10天时的变化。图29J展示了肿瘤体积在第11天时的变化。图29K展示了肿瘤体积在第12天时的变化。图29L展示了肿瘤体积在第13天时的变化。图29M展示了肿瘤体积在第14天时的变化。图29N展示了肿瘤体积在第15天时的变化。图29O展示了肿瘤体积在第16天时的变化。图29P展示了肿瘤体积在第17天时的变化。图29Q展示了肿瘤体积在第18天时的变化。图29R展示了肿瘤体积在第19天时的变化。图29S展示了肿瘤体积在第20天时的变化。图29T展示了肿瘤体积在第21天时的变化。*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001,****p≤0.0001。

图30A-30E展示了动物的体重在治疗时间段内的变化。图30A展示了用媒剂处理的小鼠的体重的变化。图30B展示了用CCL-2/NPx(1:10)处理的小鼠的体重的变化。图30C展示了用CCL-2/NPx(1:12.5)处理的小鼠的体重的变化。图30D展示了用CCL-19/NPx(1:12.5)处理的小鼠的体重的变化。图30E展示了用CCL-20/NPx(1:12.5)处理的小鼠的体重的变化。

图31A-31C展示了肽CCL-2、CCL-19、CCL-20在乳腺癌细胞中在体外和体内的功效。图31A展示了在用10ng/ul或20ng/ul肽处理后MCF7细胞的活力％。图31B展示了在用10ng/ul或20ng/ul肽处理后MCF10A细胞的活力％。图31C展示了MCF7乳腺癌肿瘤模型中的肿瘤体积的变化。数据示出为平均值±SEM，**p<0.005。

图32为展示了荧光标记的CCL-19肽在其施用之后4小时的生物分布的条形图。

图33A-33D展示了对肿瘤中的施用CCL-19肽之后并且相比于媒剂的药代动力学参数的分析。图33A展示了随时间推移变化的肿瘤中的坏死％。图33B展示了磷阳性细胞随时间推移变化的％。图33C展示了随时间推移变化的CDK2phos的％。图33D展示了随时间推移变化的Ki67阳性细胞的％。

图34A-34B展示了模型MMTV-Erbb2，即过表达强大Erbb2致癌基因的免疫活性的经基因工程化的模型(GEM)中CCL-20的活性。图34A展示了在IpY.20的情况下相比于媒剂随时间推移变化的肿瘤体积。图34B展示了治疗时间段期间的肿瘤生长速率。

图35A-35B展示了CCL-20乙酸盐表征。图35A展示了CCL-20乙酸盐HPLC迹。图35B展示了CCL-20乙酸盐MS。

图36展示了在用0ng/ul至40ng/ul肽对用IpY调配的2个合成批次的CCL-20处理后MCF7细胞的活力％。所述图还展示了TFA和乙酸盐对MCF7的活力％的影响。

图37展示了在用0ng/ul至40ng/ul肽对用IpY调配的CCL-21、CPP模拟物和CCL-20处理后MCF7细胞的活力％。

图38A-38B展示了对CCL-20在用媒剂、裸CCL-20和包封的CCL-20处理的Balb/C小鼠体内的毒性的分析。图38A为展示血小板计数的图。图38B示出了对血清细胞因子(IL-10、IL-12p70、IL-17、IP-10和G-CSF)的分析。

具体实施方式

本发明基于这样的重要发现，即某些截短的ALT肽特异性抑制癌细胞增殖和存活，并且可以掺入到药物组合物中并用于治疗有需要的受试者的癌症。

在描述本发明组合物和方法之前，应当理解，本发明不限于所描述的具体组合物、方法和实验条件，因为此类组合物、方法和条件可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅用于描述具体实施例的目的，并且不旨在为限制性的，因为本发明的范围仅在所附权利要求中受限制。

如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，对“所述方法”的提及包含本文所描述的类型的一种或多种方法和/或步骤，在阅读本公开等后，所述一种或多种方法和/或步骤对于本领域的技术人员而言将变得显而易见。

本说明书中所提到的所有公开、专利和专利申请均通过相同的程度引用结合在此，如同特定且单独地指示每个单独的公开、专利或专利申请是通过引用并入的。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管与本文所描述的方法和材料类似或同等的任何方法和材料可以用于实践或测试本发明，但应理解的是，修改和变化均涵盖在本发明的精神和范围之内。现在描述优选方法和材料。

在一个实施例中，本发明提供了一种分离的肽和功能肽，所分离的肽具有SEQ IDNO:11至13、17、22至23和25中所示的氨基酸序列，所述功能肽与所述氨基酸序列具有至少90％同源性。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文可互换地使用，并且是指通过共价化学结合连接的至少两个氨基酸的任何链。“编码序列的蛋白质”或“编码特定多肽或肽的序列”为在置于适当调节序列的控制下时在体外或在体内转录(在DNA的情况下)并且翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸序列。编码序列的边界由5'(氨基)末端处的起始密码子和3'(羧基)末端处的翻译终止密码子决定。编码序列可以包含但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列以及甚至合成DNA序列。转录终止序列通常将位于编码序列的3'处。

一方面，本发明的肽与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:22或SEQ IDNO:23或SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:17中提供的肽具有某种同源性。如本文所用，术语“同源性”或同源性％是指在两个或更多个核酸或多肽的上下文中不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守氨基酸取代的同一性或同一性百分比，所述两个更多个核酸或多肽在针对最大对应性进行比较和比对(如果必要，引入空位)时是相同的或具有指定％的核苷酸或氨基酸残基。同一性％可以使用序列比较软件或算法或通过目视检查测量。例如，本发明的分离的功能肽可以具有氨基酸，所述氨基酸与SEQ ID NO:11至13、17、22至23或25具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源性。

在一些方面，功能肽与本文提供的序列，例如，SEQ ID NO:11至13、17、22至23或25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同源性。

如本文所用，“功能肽”为本发明的肽，其为原始肽的经修饰版本，例如，氨基酸变化、突变、缺失等，但保留了原始肽的功能。例如，SEQ ID NO:22的功能肽可以包含额外氨基酸或一个或多个氨基酸的缺失，但功能肽的功能与EQ ID NO:22的功能相同或相似。一方面，本发明提供了SEQ ID NO:11至13、17、22至23或25的功能肽。在一优选实施例中，所述肽具有SEQ ID NO:22或23中所示的氨基酸序列。

一方面，所述分离的肽进一步包含N末端修饰、C末端修饰、可检测标签、细胞穿透肽(CPP)、非天然氨基酸、肽缀合物、环肽或其组合。在一些方面，所述可检测标签选自由以下组成的组：荧光标签、显色标签、供体/受体对的成员、稳定同位素以及其任何组合。

事实上可以对本发明的肽进行任何修饰并将所述修饰包含在本公开中，条件是其不会对肽的性质不利(肽的修饰对其活性的影响可以常规评估，并且可以使用建模工具来预测肽的修饰对其活性的影响)。可替代地，如果由于肽修饰(例如CPP)的位置存在关于活性损失的担忧，则可以掺入小的可切割组分。

可以引入在本发明的分离的肽的N末端极端处的N末端修饰的非限制性实例包含：5-FAM、5-FAM-Ahx、Abz、乙酰化、丙烯醛基、烯丙氧羰基、苯甲酰基、生物素、生物素-Ahx、BOC、Br-Ac-、BSA(N末端的-NH2)、CBZ、丹酰基、丹酰基-Ahx、癸酸、DTPA、脂肪酸、FITC、FITC-Ahx、Fmoc、甲酰化、己酸、HYNIC、KLH(N末端的-NH2)、月桂酸、硫辛酸、马来酰亚胺、MCA、肉豆蔻酰基、辛酸、OVA(N末端的-NH2)、棕榈酰基、PEN、硬脂酸、琥珀酰化和TMR。

可以引入在本发明的分离的肽的C末端极端处的C末端修饰的非限制性实例包含：AFC、AMC、酰胺化、BSA(C末端的-COOH)、苄基、巯基乙胺化、酯基化(OEt)、酯基化(OMe)、酯基化(OtBu)、酯基化(OTBzl)、KLH(C末端的-COOH)、MAPS非对称2个分支、MAPS非对称4个分支、MAPS非对称8个分支、Me、NHEt、NHisopen、NHMe、OSU、OVA(C末端的-COOH)、对硝基苯胺和tBu。

肽缀合物的非限制性实例包含：BSA(C末端的-COOH)、BSA在半胱氨酸上的缀合、KLH(N末端的-NH2)、KLH在半胱氨酸上的缀合、OVA(C末端的-COOH)、OVA(N末端的-NH2)和OVA在半胱氨酸上的缀合。

“环肽”为含有键的循环序列的通过肽的氨基端与羧基端之间的连接、氨基端与侧链之间的连接或两个侧链或更多复杂布置的多肽链。尽管大多数环肽为膜不可渗透的，但一些环肽具有允许细胞通过被动扩散、内吞、内体逃逸或其它机制进入的独特特征。因此，环肽可以作为共轭肽使用以提高本发明的肽(也被称为货物肽)的细胞渗透率。

本发明的肽可以以各种方式标记以允许对其进行检测和/或与其它肽进行区分。所述肽可以例如通过将稳定放射性同位素掺入在氨基酸中来标记。放射性标记的氨基酸的非限制性实例包含：Arg(¹³C₆，¹⁵N₄)、Ile(¹³C₆，¹⁵N)、Leu(¹³C₆，¹⁵N)、Lys(¹³C₆，¹⁵N₂)和Val(¹³C₅，¹⁵N)。肽还可以通过掺入非常规或非天然氨基酸来标记。

肽还可以通过向肽的氨基酸序列添加荧光标签、染料或标记来标记。如本文所用，术语“荧光肽”、“荧光标记”、“荧光团”等是可互换的。荧光标签、染料或标记的非限制性实例包含：IRDye680RD、1-芘甲基胺HCL、5-FAM(N末端)、5-FAM-Ahx(N末端)、Abz/DNP、Abz/Tyr(3-NO2)、DABCYL、DABCYL/Glu(EDANS)-NH2、丹酰基(N末端)、丹酰基-Ahx(N末端)、EDANS/DABCYL、FITC(N末端)、FITC-Ahx(N末端)、Glu(EDANS)-NH2、MCA(N末端)、MCA/DNP、淬灭荧光肽、Tyr(3-NO2)、TMR、AMC、CF、TAMRA、RhB、MCA、NBD、PBA、BODIPY、片段化BODIPY。

肽还可以如下标记：通过掺入化学发光标签，如荧光素或鲁米诺；或通过掺入供体/受体对的成员，例如mClover3/mRuby3、EBFP2/mEGFP、ECFP/EYFP、Cerulean/Venus、MiCy/mKO、CyPet/YPet、EGFP/mCherry、Venus/mCherry、Venus/tdTomato和Venus/mPlum。

对肽的额外修饰可以包含通过在肽上的半胱氨酸残基之间产生二硫键的肽环化、磷酸化、甲基化、PEG化、多抗原肽(MAP)应用和对本领域已知的肽的任何额外修饰。

另一方面，相比于未经修饰的肽，所述分离的肽被修饰成具有提高的总体稳定性、延长的血流稳定性、提高的细胞渗透率、提高的细胞活性或其组合。在一些方面，所述CPP提高了细胞摄取、细胞穿透和/或所述肽的转运。

如本文所用，相比于未进行此类修饰的相同的肽，“提高的”稳定性、细胞渗透率或细胞活性旨在指代在肽被修饰时增加、改善或增强的肽的稳定性、细胞渗透率或细胞活性。如本文所用，肽的血流稳定性是指肽保持处于血流中的时间量，所述时间量可以通过评估例如肽半衰期来测量。相比于在肽未进行修饰时，经修饰的肽的“延长的”稳定性可以在肽被修饰时在血流中在较长时间段内检测到。

本发明的肽可以例如包含短多肽序列，如CPP，所述CPP在活细胞内高效转运生物活性分子并且提高所关注的肽的细胞摄取。肽的细胞摄取可以例如以胞液对肽的细胞外浓度的比率测量。

在其它方面，CPP选自由以下组成的组：穿膜肽、Tat肽、Tat肽变体、pVEC、嵌合转运素、MPG肽、线性和环状聚精氨酸、R₈、R₉、R₆W₃、EB1、VP22、模型两亲性肽(MAP)、Pep-1和Pep-1相关肽、基于融合序列的蛋白质(FBP)、转运素模拟物7(TP-7)、TP-9、TP-10、铜蓝蛋白和铜蓝蛋白衍生物、鱼精蛋白、鱼精蛋白片段/SV40肽、聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸、组氨酸-赖氨酸肽、聚精氨酸、含有肽的复合环状聚阳离子精氨酸和gp41融合序列。

CPP和蛋白质转导结构域(PTD)在本领域以其能够在活细胞内高效转运生物活性分子而众所周知。CPP的长度通常小于30个残基(参见表1)并且通常携带正电荷。CPP或环肽和货物肽可以共价缀合或通过CPP和货物的散料混合进行的非共价相互作用物理复合。每种CPP具有在将CPP与货物蛋白配对时需要考虑的物理化学性质、优选施用模式、特定屏障和优选靶细胞。可以使用对CPP或环肽的另外的修饰，如N^α甲基化来增加肽的渗透。

表1：CPP的序列

在一优选方面，本发明肽抑制癌细胞增殖和/或降低癌细胞活力。在各个方面，所述肽抑制肿瘤生长、增加癌细胞死亡和/或增加肿瘤坏死。

在另一实施例中，本发明提供了一种分离的核酸序列，所述分离的核酸序列编码肽或功能肽，所述肽具有SEQ ID NO:11至13、17、22至23或25中所示的氨基酸序列，所述功能肽与所述氨基酸序列具有至少90％同源性。

在一个实施例中，本发明提供了一种药物组合物，其包含分离的肽或功能肽以及药学上可接受的载体，所述分离的肽具有SEQ ID NO:11至13、17、22至23或25中所示的氨基酸序列，所述功能肽与所述氨基酸序列具有至少90％同源性。

本文还公开了所公开的化合物的药学上可接受的鹽：盐和前药。术语“药学上可接受的盐”包含根据化合物上存在的特定取代基用酸或碱制备的所公开的化合物的盐。在本文所公开的化合物具有足够的碱性或酸性以形成稳定的无毒酸盐或碱盐的情况下，以盐的形式施用化合物可能是适当的。药学上可接受的碱加成盐的实例包含钠盐、钾盐、钙盐、铵盐或镁盐。生理上可接受的酸加成盐的实例包含盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、碳酸、硫酸和有机酸，如乙酸、丙酸、苯甲酸、琥珀酸、富马酸、扁桃酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、丙二酸、抗坏血酸、α-酮戊二酸、α-糖磷酸、马来酸、甲苯磺酰基酸、甲磺酸等。因此，本文公开了盐酸盐、三氟乙酸盐、硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、丙二酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐、α-糖磷酸盐、马来酸盐、甲苯磺酸盐和甲磺酸盐。化合物的药学上可接受的盐可以使用所属领域中已知的标准程序获得，例如通过使具有足够碱性的化合物(如胺)与提供生理学上可接受的阴离子的适合的酸反应。还可以制备羧酸的碱金属(例如，钠、钾或锂)或碱土金属(例如，钙)盐。

如本文所用，“药物组合物”是指包括活性成分和任选地药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的调配物。术语“活性成分”可以可互换地指代“有效成分”并且旨在指代能够在施用时诱导受欢迎的作用的任何药剂。在一个实施例中，活性成分包含生物活性分子。如本文所用，短语“生物活性分子”是指在细胞中具有生物效应的分子。在某些实施例中，活性分子可以为无机分子、有机分子、小有机分子、药物化合物、肽、多肽(如酶或转录因子)、抗体、抗体片段、模拟肽、脂质、核酸(如DNA或RNA分子)、核酶、发夹RNA、不同化学成分的siRNA肽(小干扰RNA)、miRNA、siRNA蛋白缀合物、siRNA肽缀合物和siRNA抗体缀合物、拮抗物、PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)或吗啉基。在某些说明性实施例中，活性剂为多肽或肽或功能肽，所述多肽或肽具有SEQ ID NO:10至15或19中所示的氨基酸序列，所述功能肽与所述氨基酸序列具有至少90％同源性。在一优选实施例中，所述分离的肽具有SEQ ID NO:22或23中所示的氨基酸序列。

“药学上可接受的”意指载体、稀释剂或赋形剂必须与调配物的其它成分相容并且对其接受者或对调配物的活性成分的活性无害。药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂在本领域，例如《雷明顿氏药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》第16版,Osol,A.编辑(1980)中是众所周知的。药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒并且可以包含缓冲剂，如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲铵；氯化苯甲烃铵；氯化苄甲氧胺；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷基酯，如对羟苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，Zn蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。载体的实例包含但不限于脂质体、纳米颗粒、软膏、胶束、微球、微颗粒、乳膏、乳剂和凝胶。赋形剂的实例包含但不限于：抗粘着剂，如硬脂酸镁；粘结剂，如糖类和其衍生物(蔗糖、乳糖、淀粉、纤维素、糖醇等)；蛋白质，如明胶和合成聚合物；润滑剂，如滑石和二氧化硅；以及防腐剂，如抗氧化剂、维生素A、维生素E、维生素C、棕榈酸视黄酯、硒、半胱氨酸、甲硫氨酸、柠檬酸、硫酸钠和对羟基苯甲酸酯。稀释剂的实例包含但不限于水、醇、盐溶液、乙二醇、矿物油和二甲基亚砜(DMSO)。

本发明的药物组合物可以例如以液体形式制备或可以呈干粉形式(例如冻干)。施用药物组合物的特定方法如下描述。

一方面，所述药物组合物进一步包含递送媒剂。

所述递送媒剂是与调配物的其它成分相容，并且对其接受者或对调配物的活性成分的活性无害，用于成功解决递送相关的问题，将所关注的肽携带到治疗作用的期望位点同时减少不良副作用，并允许其高效渗透在靶细胞内的体系。

在一些方面，所述递送媒剂选自由以下组成的组：纳米颗粒、脂质体、树状大分子、胶束、纳米乳剂、纳米悬浮液、泡囊、纳米囊、磁性纳米颗粒、基于脂蛋白的载体和脂质复合物纳米颗粒。

术语“纳米颗粒”用于定义直径介于1纳米与150纳米(nm)之间的物质颗粒。纳米颗粒以各种各样的形状存在，所述形式被赋予了许多非正式名称，如纳米球、纳米棒、纳米链、纳米星、纳米花、纳米礁、纳米须、纳米纤维和纳米盒。纳米颗粒的形状可以通过材料的内在晶体惯态或通过其产生的周围环境的影响确定。纳米颗粒的医学应用涉及作为基础材料的银、金、羟基磷灰石、粘土、二氧化钛、二氧化硅、二氧化锆、碳、金刚石、氧化铝和三氟化镱等基材。也可以产生半固肽纳米颗粒和软纳米颗粒，如脂质体。各种类型的脂质体纳米颗粒目前在临床上用作抗癌药物和疫苗的递送系统。

“纳米囊”是指围绕核心(液体或固体)并且大小的范围为10nm至1000nm的薄膜。纳米囊为由薄聚合物膜包围的油性或水性核心构成的亚微观胶体药物载体体系，所述薄聚合物膜可由天然或合成聚合物构成。

“磁性纳米颗粒”为具有磁芯的纳米颗粒，所述磁芯具有聚合物或金属涂层，所述聚合物或所述金属涂层可以被功能化或以可由含有沉淀在孔内的磁性纳米颗粒的多孔聚合物组成。通过将聚合物或金属涂层功能化，聚合物或金属涂层可以附着例如用于靶向化学疗法或治疗肽的细胞毒性药物。在附着后，颗粒/治疗剂复合物被注射到血流中，通常使用导管以将注射部位定位在靶标附近。磁场(通常来自高场高梯度的稀磁铁)集中在靶位点之上，并且在颗粒进入场时，对颗粒施加的力使颗粒在靶标处被捕获并溢出。

术语“脂质体”或“脂质复合物纳米颗粒”是指无毒非溶血性且非免疫原性的基于脂质的配体涂覆的纳米载体，其可以根据所携带的药物/造影剂的性质将其有效荷载储存在疏水性外壳或亲水性内部中。脂质体是生物相容性的且可生物降解的并且可以被设计成避免受清除机制(网状内皮系统(RES)、肾脏清除、化学或酶失活等)的影响。聚乙二醇(PEG)可以添加到脂质体的表面以增加其在体外相对较低的稳定性；脂质体纳米载体的PEG化延长了构建体的半衰期，同时维持了通常赋予基于脂质的纳米载体的被动靶向机制。

其它基于脂质的纳米载体包含纳米乳剂和基于脂蛋白的载体。如本文所用，术语“纳米乳剂”是指主要由油、表面活性剂和水组成并且具有高动力学稳定性、低粘度的胶体体系。可以用于形成纳米乳剂的油的非限制性实例包含蓖麻油、玉米油、椰子油、月见草油、亚麻油、矿物油、橄榄。乳化剂，如来自植物或动物来源的天然卵磷脂、磷脂、蓖麻油可以为纳米乳剂的组成。表面活性剂或助表面活性剂的非限制性实例包含聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚氧乙烯60、蓖麻油、山梨醇单油酸酯、乙醇、甘油、PEG300、PEG400、聚烯醇和泊罗沙姆(poloxamer)。基于脂蛋白的载体包含为在体内的脂肪的运输中起重要作用的生物脂质载体的脂蛋白。这些载体是由于其大小较小、在循环中的驻留时间长而用作药物递送媒剂的天然纳米颗粒。脂蛋白的实例包含低密度脂蛋白(LDL)，所述LDL在血浆中携带胆固醇。脂蛋白携带高的药物有效载荷并且用作用于运输化疗剂的递送媒剂。

如本文所用，“树状大分子”和“胶束”可以互换使用并且是指基于聚合物的递送媒剂。聚合物胶束可以由由亲水性单体单元和疏水性单体单元两者组成的某些两亲性共聚物制备。树状大分子具有以固定间隔向外扩展以形成小的球状且非常密实的纳米载体的核心。

如本文所用，“纳米悬浮液”由纯的水溶性差的药物组成，不具有以分散形式悬浮的任何基质材料。纳米悬浮液的制备简单并且适用于所有不溶于水的药物。

如本文所用，“泡囊”是指包含能够捕获亲水性化合物和亲脂性化合物的非离子表面活性剂的药物递送媒剂。泡囊是由非离子表面活性剂组成的囊泡，其是可生物降解的，相对无毒，更稳定且价格低廉，是脂质体的替代品。可以通过改变囊泡的组成、大小、层状度、紧堆体积、表面电荷和浓度改变囊泡的性质。

一方面，所述脂质复合物纳米颗粒包含1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、胆固醇、DOPE、TPGS或其组合。

在其它方面，脂质复合物纳米颗粒包含摩尔比为约10:90至90:10的DOTMA和胆固醇。在一些方面，脂质复合物纳米颗粒包含摩尔比为约40:50至50:39的DOTMA和胆固醇。一方面，脂质复合物纳米颗粒包含摩尔比为约50:49:1的DOTMA、胆固醇和TPGS。

一方面，脂质:肽质量比为约8:1、约6:1、约5:1、约10:1、约12.5:1、约15:1、约20:1、约25:1、约30:1或约35:1。在一些方面，脂质:肽质量比为约10:1。在一优选实施例中，脂质:肽质量比为约12.5:1。

本发明的分离的肽可以使用保持肽的性质(即高效用作乳腺癌疗法的CDK4和CDK2双抑制)的各种纳米颗粒调配物包封。

脂质复合物纳米颗粒用于肽的脂质体包封的用途例如可以包含DOTMA、胆固醇、DOPE和TPGS的组合。此类组合的非限制性实例在表2中呈现。

表2：说明性脂质复合物纳米颗粒调配物

首先例如使用乙醇注入方法产生空脂质复合物纳米颗粒，在所述方法中将乙醇中的由DOTMA、胆固醇、DOPE和TPGS组成的脂质混合物快速注入到HEPES缓冲液(pH＝7.4)中，以达到含10％乙醇和90％水溶液的最终混合物以形成空脂质复合物纳米颗粒。然后将空脂质复合物纳米颗粒与肽以所选脂质:肽质量比混合以产生包含所关注的分离的肽的脂质复合物纳米颗粒。

关于本发明有用的阳离子脂质包含但不限于：DDAB，即甲基双十八烷基溴化铵；N-1-(2,3-二油酰基氧基)丙基-N,N,N-三甲基铵甲基硫酸盐；1,2-二酰基氧基-3-三甲基铵丙烷(包含但不限于二油酰基(DOTAP)、二月桂酰基氧基、二肉豆蔻酰基氧基、二棕榈酰基氧基和二硬脂酰基氧基)；N-1-(2,3-二油酰基氧基)丙基-N,N-二甲基胺；1,2-二酰基-3-二甲基铵丙烷(包含但不限于，二油酰基(DODAP)、二月桂酰基、二肉豆蔻酰基、二棕榈酰基和二硬脂酰基)；DOTMA，N-1-2,3-双(油烯基氧基)丙基-N,N,N-三甲基氯化铵(包含但不限于、二油烯基(DOTMA)、二月桂基、二肉豆蔻、二棕榈基和二硬脂基)；DOGS，即双十八基氨基甘氨酰基精胺；DC-胆固醇、3B-N(N',N'二甲氨基乙烷)胺甲酰基胆固醇；DOSPA，即2,3-二油酰基氧基-N-(2-(精胺甲酰胺基)-乙基)-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐；1,2-二酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(包含但不限于二油酰基(DOEPC)、二月桂酰基、二肉豆蔻酰基、二棕榈酰基、二硬脂酰基和棕榈酰基-油酰基)；B-丙氨酰基胆固醇；CTAB，即鲸蜡基三甲基溴化铵；diC14-脒，即N-叔丁基-N'-十四基-3-十四基氨基丙脒；14Dea2；TMAG，即N-(α-三甲基铵基乙酰基)双十二烷基-D-谷氨酸氯；O,O'-双十四酰基-N-(三甲基铵基乙酰基)氯化二乙醇胺：DOSPER，即1,3-二油酰基氧基-2-(6-羧基-精酰基)-丙酰胺；N.N.N',N'-四甲基N,N'-双(2-羟基乙基)-2,3-二油酰基氧基-1,4-丁烷二铵碘化物；1-2-(酰氧基)乙基-2-烷基(烯基)-3-(2-羟乙基)-咪唑啉氯化物衍生物，如DOTIM，即1-2-(9(Z)-十八癸烯酰基氧基)乙基-2-(8(Z)-十七烯基-3-(2-羟乙基)-咪唑啉氯化物；DPTIM，即1-2-(十六癸酰基氧基)乙基-2-十五癸基-3-(2-羟乙基)咪唑啉氯化物；在季胺上含有羟烷基部分的2,3-二烷氧基丙基季铵化合物衍生物，如：DORI，即1,2-二油酰基-3-二甲基-羟乙基溴化铵；DORIE，即1,2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵；DORIE-HP，即1,2-二油酰溴；DORIE-HB，即1,2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基羟丁基溴化铵；DORIE-HPe，即1,2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羟戊基溴化铵；DMRIE，即1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-5羟基乙基溴化铵；DPRIE，即1,2-二棕榈基氧基丙基-3-二甲基-羟基乙基溴化铵；DSRIE，即1,2-二甾基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵。

其它脂质体包含在本发明中。例如，本发明的一个方面提供了包括介于25％与45％(mol/mol)之间的阴离子脂质的脂质体。阴离子脂质的含量影响脂质体的重要特性，如脂质体的脂质水解以及还有对脂质体的免疫应答。随着阴离子脂质的含量增加，脂质水解(以及药物释放)的速率也增加。已经表明，可以通过介于25％与45％之间的阴离子脂质含量达到合理的水解速率。因此，在一个实施例中，阴离子脂质的含量为至少25％。在另一实施例中，阴离子脂质的含量不大于45％。在又另一实施例中，脂质体的阴离子脂质含量选自由以下组成的组：介于25％与45％之间、介于28％与42％之间、介于30％与40％之间、介于32％与38％之间以及介于34％与36％之间。对脂质体的免疫应答可能受阴离子脂质的含量的影响。因此，可以通过将脂质体中的阴离子脂质的含量保持在某种水平以下来降低脂质体在身体中的清除率，并且可以使用脂质体中的阴离子脂质的含量以通过网状内皮系统在水解速率和清除率之间做出平衡。

优选地阴离子脂质为磷脂，并且优选地磷脂选自由以下组成的组：PI(磷脂酰肌醇)、PS(磷脂酰丝氨酸)、DPG(二磷脂酰甘油)、PA(磷脂酸)、PEOH(磷脂酰醇)和PG(磷脂酰甘油)。更优选地，阴离子磷脂为PG。

还特别注意了亲水聚合物的组成。在一优选实施例中，脂质体进一步包括亲水性聚合物，所述亲水性聚合物选自由以下组成的组：PEG[聚(乙二醇)]、PAcM[聚(N-丙烯酰吗啉)]、PVP[聚(乙烯吡咯烷酮)]、PLA[聚(丙交酯)]、PG[聚(乙交酯)]、POZO[聚(2-甲基-2-噁唑啉)]、PVA[聚(乙烯醇)]、HPMC(羟丙基甲基纤维素)、PEO[聚(环氧乙烷)]、壳聚糖[聚(D-葡萄糖胺)]、PAA[聚(胺基酸)]、聚HEMA[聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)]以及其共聚物。最优选地，聚合物是分子量介于100Da与10kDa之间的PEG。特别优选的是2-5kDa(PEG2000至PEG5000)的PEG，并且最优选的是PEG2000。

将聚合物包含在脂质体上是技术人员所熟知的，并且可以用于增加血流中的脂质体的半衰期，可能地通过减少由网状内皮系统进行的清除。优选地，聚合物与磷脂酰乙醇胺的头基缀合。另一种选项是神经酰胺。聚合物缀合的脂质优选地以至少2％的量存在。更优选地，量为至少为5％并且不超过15％。甚至更优选地，聚合物缀合的脂质的量为至少3％并且不超过6％。含有阴离子磷脂和≤2.5％DSPE-PEG2000的脂质体在存在钙的情况下聚集的趋势增加。这通常可以通过形成高粘性凝胶来而被观察到。含有阴离子磷脂且>7.5％的脂质体使脂质体沉积或相分离。

脂质体中带中性电荷的脂质组分：

优选地，本发明的脂质体还包括选自由两性离子磷脂组成的组的不带电磷脂，所述两性离子磷脂包括PC(磷脂酰胆碱)和PE(磷脂酰乙醇胺)。最优选地，两性离子磷脂为PC。与阴离子磷脂相比，两性离子磷脂在脂质体中起着电荷中性脂质组分的作用。通过将两性离子和阴离子磷脂组合在同一脂质体中，可能调整到符合足够高的细胞内水解和血液中的低清除率两者的期望表面电荷密度。脂质体中的两性离子磷脂的量优选地介于40％与75％之间，并且更优选地介于50％与70％之间。

醚磷脂：

磷脂中的一些或所有磷脂可以为醚磷脂。因此，磷脂可以将醚键而非酯键容纳在磷脂的甘油骨干的sn-1位置处。当细胞内磷脂酶使这种特定类型的磷脂水解时，会产生单醚溶血磷脂，并且这些磷脂对例如癌细胞是有毒性的。即醚磷脂可以被视为单醚溶酶磷脂的前药，并且本发明的脂质体可以用于将这种前药递送到癌细胞环境中，在所述癌细胞环境中通过磷脂酶水解激活前药。

对这种纳米颗粒调配物的特性进行了测试，这些特性将在全身递送期间保护蛋白质治疗剂免受酶降解，产生将促进跨细胞膜的被动运输的适当带电外壳，并可能诱导通过肿瘤环境进行的最优摄取。最优纳米颗粒调配物的确定可以包含例如：确定包封效率，以将纳米颗粒包装进行比较；确定细胞的增殖，以确定所包封的肽在癌细胞系中的生长抑制功效；以及确定摄取速率，以确定癌细胞系中的递送动力学。

一方面，递送媒剂与靶向抗体或抗体-药物缀合物(ADC)偶联。

如本文所用，术语“抗体”(Ab)是指与特定抗原具有结合特异性的糖蛋白。可以与本发明的递送媒剂偶联的抗体包含天然或人工、单价或多价抗体，所述抗体包含但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化或嵌合抗体、单链抗体和抗体片段(包含完整抗体的任何部分，优选地完整抗体的抗原结合区或可变区)。抗体片段的实例包含Fab、Fab'和F(ab')2、Fc片段或Fc融合产物、单链Fv(scFv)、二硫链Fv(sdfv)和包含VL或VH结构域的片段；双体，三体等(Zapata等人《蛋白质工程化(Protein Eng.)》8(10):1057-1062[1995])。

抗体可以为对所关注靶标具有特定抗原结合特异性的“靶向抗体”。例如，本发明的递送媒剂可以与对由癌细胞特异性表达的抗原有抗原结合特异性的抗体偶联，以特异性地将本发明的药物组合物递送到表达癌症相关抗原的癌细胞。

可替代地，该抗体可以为抗体-药物缀合物(ADC)，即与靶向抗体偶联的抗癌药物。抗体与靶抗原之间的生化反应在癌细胞中触发然后将抗体和相关的细胞毒素一起吸收或内化的信号。在ADC被内化后，细胞毒素杀死癌细胞。

在其它方面，所述递送媒剂与聚乙二醇(PEG)聚合物或与白蛋白缀合。

在各个方面，所述药物组合物进一步包含至少一种抗癌剂。

术语“抗癌剂”可以指代可以用于治疗癌症的任何药剂、小分子、药物等，如化学疗法、免疫疗法、靶向疗法和检查点抑制剂疗法等。

化学疗法的实例包含用化学治疗剂、细胞毒性剂或抗肿瘤剂进行治疗，所述药剂包含但不限于(i)抗微管剂，所述抗微管剂包括长春花生物碱(vinca alkaloid)(长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春氟宁(vinflunine)、长春地辛(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine))、紫杉烷(taxane)(卡巴他赛(cabazitaxel)、多西他赛(docetaxel)、拉洛他赛(larotaxel)、奥他赛(ortataxel)、紫杉醇(paclitaxel)和替司他赛(tesetaxel))、埃博霉素(epothilones)(伊沙匹隆(ixabepilone))和鬼臼毒素(podophyllotoxin)(依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide))；(ii)抗代谢剂，所述抗代谢剂包括抗叶酸剂(氨基喋呤(aminopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、普拉曲沙(pralatrexate)和雷替曲塞(raltitrexed))和脱氧核苷类似物(阿扎胞苷(azacitidine)、卡培他滨(capecitabine)、卡莫氟(carmofur)、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、地西他滨(decitabine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲(hydroxycarbamide)、巯嘌呤(mercaptopurine)、奈拉滨(nelarabine)、喷司他丁(pentostatin)、替加氟(tegafur)和硫鸟嘌呤(thioguanine))；(iii)拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂包括拓扑异构酶I抑制剂(贝洛替康(belotecan)、喜树碱(camptothecin)、科西特康(cositecan)、吉马替康(gimatecan)、阿依沙替康(exatecan)、伊立替康(irinotecan)、勒托替康(lurtotecan)、希拉替康(silatecan)、拓扑替康(topotecan)和鲁比替康(rubitecan))以及拓扑异构酶II抑制剂(阿柔比星(aclarubicin)、氨柔比星(amrubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔吡星(epirubicin)、依托泊苷、依达比星(idarubicinm)、美巴龙(merbarone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、新生霉素(novobiocin)、吡柔比星(pirarubicin)、替尼泊苷(teniposide)、柔比星(valrubicin)和佐柔比星(zorubicin))；(iv)烷化剂，所述烷化剂包括氮芥(苯达莫司汀(bendamustine)、白消安(busulfan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、磷酸雌莫司汀(estramustinephosphate)、异环磷酰胺(ifosamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)和芥尿嘧啶(uramustine))、亚硝基脲(nitrosoureas)(卡莫司汀(carmustine，BCNU)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine，CCNU)、N-亚硝基-N-甲基脲(MNU)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、司莫司汀(semustine，MeCCNU))和链脲佐菌素(streptozotocin))、铂类(顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、双环铂(dicycloplatin)、奈达铂(nedaplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和赛特铂(satraplatin))、氮丙啶类(aziridines)(卡波醌(carboquone)、噻替派(thiotepa)、丝裂霉素(mytomycin)、亚丝醌(diaziquone，AZQ)、三亚胺醌(triaziquone)和三亚乙基亚胺)、磺酸烷酯(白消安、甘露舒凡(mannosulfan)和曲奥舒凡(treosulfan))、非经典烷基化剂(肼(hydrazines)、丙卡巴肼(procarbazine)、三氮烯(triazenes)、六甲三聚氰胺(hexamethylmelamine)、六甲蜜胺(altretamine)、二溴甘露醇(mitobronitol)和哌泊溴烷(pipobroman))、四嗪(tetrazines)(达卡巴嗪(dacarbazine)、米托唑胺(mitozolomide)和替莫唑胺(temozolomide))；(v)蒽环霉素制剂，所述蒽环霉素制剂包括多柔比星和道诺霉素。这些化合物的衍生物包含表柔吡星和依达比星；吡柔比星、阿柔比星和米托蒽醌、博来霉素(bleomycin)、丝裂霉素C(mitomycin C)、米托蒽醌和放线菌素(actinomycin)；(vi)酶抑制剂，所述酶抑制剂包括FI抑制剂(替吡法尼(Tipifarnib))、CDK抑制剂(阿贝西尼、阿伏西迪(Alvocidib)、帕博西尼、瑞博西尼和塞利西利(Seliciclib))、PrI抑制剂(硼替佐米(Bortezomib)、卡非佐米(Carfilzomib)和伊沙佐米(Ixazomib))、PhI抑制剂(阿那格雷(Anagrelide))、IMPDI抑制剂(噻唑呋林(Tiazofurin))、LI抑制剂(马索罗酚(Masoprocol))、PARP抑制剂(尼拉帕尼(Niraparib)、奥拉帕尼(Olaparib)、卢卡帕尼(Rucaparib))、HDAC抑制剂(贝利司他(Belinostat)、帕比司他(Panobinostat)、罗米地辛(Romidepsin)、伏立诺他(Vorinostat))以及PIKI抑制剂(艾代拉里斯(Idelalisib))；(vii)受体拮抗剂，所述受体拮抗剂包括ERA受体拮抗剂(阿曲生坦(Atrasentan))、视黄醇X受体拮抗剂(蓓萨罗丁(Bexarotene))、性类固醇受体拮抗剂(睾内酯(Testolactone))；(viii)未分组的药剂，所述未分组的药剂包括安吖啶(Amsacrine)、曲贝替定(Trabectedin)、视黄醇(阿利维甲酸(Alitretinoin Tretinoin))、三氧化二砷(arsenictrioxide))、天冬酰胺耗竭剂(天门冬酰胺酶/培门冬酶)、塞来昔布(Celecoxib)、地美可辛(Demecolcine)、伊利司莫(Elesclomol)、依沙芦星(Elsamitrucin)、依托格鲁(Etoglucid)、氯尼达明(Lonidamine)、甲硫恩酮(Lucanthone)、米托胍腙(Mitoguazone)、米托坦(Mitotane)、奥立默森(Oblimersen)、高三尖杉酯碱(Omacetaxine mepesuccinate)和艾瑞布林(Eribulin)。

免疫疗法的实例包含用抗体进行治疗，所述抗体包含但不限于阿仑单抗(alemtuzumab)、AVASTIN^TM(贝伐单抗(bevacizumab))、BEXXAR^TM(托西莫单抗(tositumomab))、CDP 870和CEA-Scan(阿西莫单抗(arcitumomab))、地诺单抗(denosumab)、ERBITUX^TM(西妥昔单抗(cetuximab))、HERCEPTIN^TM(曲妥珠单抗(trastuzumab))、HUMIRA^TM(阿达木单抗(adalimumab))、IMC-IIF 8、LEUKOSCAN^TM(硫索单抗(sulesomab))、MABCAMPATH^TM(阿仑单抗)、MABTHERA^TM(利妥昔单抗(Rituximab))、马妥珠单抗(matuzumab)、MYLOTARG^TM(吉妥珠单抗氧加米星(gemtuzumab oxogamicin))、那他珠单抗(natalizumab)、NEUTROSPEC^TM(锝(99mTc)法诺索单抗))、帕尼单抗(panitumamab)、PANOREX^TM(依决洛单抗(Edrecolomab))、PROSTASCINT^TM(铟-Ill标记的卡罗单抗喷地肽(Indium-Ill labeled Capromab Pendetide))、RAPTIVA^TM(依法利珠(efalizumab))、REMICADE^TM(英利昔单抗(infliximab))、REOPRO^TM(阿昔单抗(abciximab))、利妥昔单抗(rituximab)、SIMULECT^TM(巴利昔单抗(basiliximab))、SYNAGIS^TM(帕利珠单抗(palivizumab))、THERACIM HR3^TM、托珠单抗(tocilizumab)、TYSABRI^TM(那他珠单抗(natalizumab))、VERLUMA^TM(诺非妥莫单抗(nofetumomab))、XOLAIR^TM(奥马珠单抗(omalizumab))、ZENAPAX^TM(达昔单抗(dacliximab))、ZEVALIN^TM(与钇90缀合的替伊莫单抗替坦(ibritumomab tiuxetan，IDEC-Y2B8))、GILOTRIF^TM(阿法替尼(afatinib))、LYNPARZA^TM(奥拉帕尼(olaparib))、PERJETA^TM(帕妥珠单抗(pertuzumab))、OPDIVO^TM(纳武单抗(nivolumab))、BOSULIF^TM(博舒替尼(bosutinib))、CABOMETYX^TM(卡博替尼(cabozantinib))、曲妥珠单抗-dkst((OGIVRI^TM))、SUTENT^TM(苹果酸舒尼替尼(sunitinibmalate))、ADCETRIS^TM(本妥昔单抗瑞他汀(brentuximab vedotin))、ALECENSA^TM(阿来替尼(alectinib))、CALQUENCE^TM(阿卡拉布替尼(acalabrutinib))、YESCARTA^TM(斯洛赛尔(ciloleucel))、VERZENIO^TM(阿贝西尼))、KEYTRUDA^TM(派姆单抗(pembrolizumab))、ALIQOPA^TM(库潘尼西(copanlisib))、NERLYNX^TM(来那替尼(neratinib))、IMFINZI^TM(德瓦鲁单抗(durvalumab))、DARZALEX^TM(达雷木单抗(daratumumab))、TECENTRIQ^TM(阿特朱单抗(atezolizumab))和TARCEVA^TM(埃罗替尼(erlotinib))。

“检查点抑制剂疗法”是使用影响免疫系统功能的免疫检查点的形式的癌症治疗。免疫检查点可以是刺激性的或抑制性的。肿瘤可以使用这些检查点来保护自己免受免疫系统攻击。检查点疗法可以阻断抑制性检查点，从而恢复免疫系统功能。检查点蛋白质包含序性细胞死亡1蛋白(PDCD1，PD-1；也被称为CD279)和其配体，即PD-1配体1(PD-L1，CD274)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、A2AR(腺苷A2A受体)、B7-H3(或CD276)、B7-H4(或VTCN1)、BTLA(B和T淋巴细胞衰减子或CD272)、IDO(吲哚胺2,3-双加氧酶)、KIR(伤细胞免疫球蛋白样受体)、LAG3(淋巴细胞激活基因-3)、TIM-3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)和VISTA(T细胞激活的V结构域Ig抑制因子)。

在一些方面，功能肽与SEQ ID NO:11至13、17、22至23或25具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同源性。

在另一实施例中，本发明提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含分离的肽或功能肽和药学上可接受的载体，所述分离的肽具有SEQ ID NO:11至13、17、22至23或25中所示的氨基酸序列，所述功能肽与所述氨基酸序列具有至少90％同源性。在一优选实施例中，所述分离的肽具有SEQ ID NO:22或23中所示的氨基酸序列。

如本文所用，术语“受试者”是指对其执行本发明方法的任何个体或患者。通常，受试者是人，但是如本领域的技术人员将理解的，受试者可以是动物。因此，其它动物，包含脊椎动物，如啮齿动物(包含小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔子、农场动物(包含牛、马、山羊、绵羊、猪、鸡等)以及灵长类动物(包含猴子、黑猩猩、猩猩和大猩猩)都被包含在受试者的定义中。

术语“治疗”在本文中与术语“治疗方法”可互换使用，并且是指1)治愈、减缓、减轻所诊断的病理病状或病症的症状和/或中止其进展的治疗性治疗或措施，以及2)以及预防/预防性措施两者。需要治疗的那些患者可以包含已经患有特定医学病症的个体以及最终可能获得所述病症的那些个体(即，需要预防性措施的个体)。

“治疗有效量”、“有效剂量”、“治疗有效剂量”、“有效量”等意指本发明的药物组合物的将引发研究人员、兽医、医生或其它临床医生正寻求的组织、系统、动物或人的生物应答或医学应答的量。通常，应答是患者的症状的改善或期望的生物学结果(例如，肿瘤体积减小或受试者的存活率增加)。

术语“……的施用”或“施用”应被理解为意指向需要治疗的受试者提供治疗有效量的本发明的药物组合物。施用途径可以是肠内、局部或肠胃外。因此，施用途径包含但不限于皮内、皮下、静脉内、腹膜内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、经皮、经气管、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内、口服、舌下、经颊、直肠、阴道、鼻、眼施用以及输注、吸入和雾化。如本文所用，短语“肠胃外施用(parenteral administration)”和“肠胃外地施用(administered parenterally)”是指除肠内和局部施用之外的施用模式。

在一些方面，药物组合物的施用为皮内、皮下、静脉内、腹膜内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、经皮、经气管、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、胸骨内、口服、舌下、经颊、直肠、阴道、鼻或眼、或通过输注、吸入或雾化。在其它方面，药物组合物可以在控释系统中递送，如施用静脉内输注、可植入渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其它施用模式。一方面，药物组合物是静脉内施用的。

施用可以通过单独的或与另外的疗法组合的单个剂量或多个剂量，如下文所讨论的。分离的肽的量和给药频率可以由每个特定患者的医师进行优化。在一个实施例中，施用的药物组合物为每日单个剂量。

术语“癌症”是指由在一个部位(原发部位)处开始的异常的且不受控制的细胞增殖表征的一组疾病，其可能侵入并扩散到其它部位(继发部位、转移)，这区分癌症(恶性肿瘤)与良性肿瘤。几乎所有器官都可能受到影响，从而导致可能影响人类的超过100种类型的癌症。癌症可能由多种原因引起，包含遗传易感性、病毒感染、暴露于电离辐射、暴露环境污染物、吸烟和/或饮酒、肥胖、饮食不良、缺乏身体活动或其任何组合。

如本文所用，“瘤”或“肿瘤”，包含其语法变体，是指新的且异常的组织生长，其可能是良性的或癌性的。在相关方面，瘤表明瘤性疾病或病症，包含但不限于各种癌症。例如，这些癌症包含前列腺癌、胰腺癌、胆管癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、肾癌、肺癌、睾丸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌和头颈癌、黑色素瘤、肉瘤、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤等。

示例性癌症包含：急性淋巴性白血病，成人；急性淋巴性白血病，儿童；急性髓样白血病，成人；肾上腺皮质癌；肾上腺皮质癌，儿童；ADS相关淋巴瘤；AIDS相关恶性肿瘤；肛门癌；星形细胞瘤，儿童小脑；星形细胞瘤，儿童大脑；胆管癌，肝外；膀胱癌；膀胱癌，儿童；骨癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；脑干胶质瘤，儿童；脑瘤，成人；脑瘤，脑干胶质瘤，儿童；脑瘤，小脑星形细胞瘤，儿童；脑瘤，大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，儿童；脑瘤，室管膜瘤，儿童；脑瘤，成神经管细胞瘤，儿童；脑瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童；脑瘤，视觉通路与下丘脑胶质瘤，儿童；脑瘤，儿童(其它)；乳腺癌；乳腺癌，妊娠期；乳腺癌，儿童；乳腺癌，男性；支气管腺瘤/类癌，儿童；类癌瘤，儿童；类癌瘤，胃肠；癌，肾上腺皮质；癌，胰岛细胞；未知癌，原发性；中枢神经系统淋巴瘤，原发性；小脑星形细胞瘤，儿童；大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，儿童；宫颈癌；童年癌症；慢性淋巴细胞白血病；慢性髓细胞性白血病；慢性骨髓增殖性病症；腱鞘透明细胞肉瘤；结肠癌；结肠直肠癌，儿童；皮肤T细胞淋巴瘤；子宫内膜癌；室管膜瘤，儿童；上皮癌，卵巢；食管癌；食管癌，儿童；尤文氏肿瘤家族(Ewing's Family ofTumor)；颅外生殖细胞瘤，儿童；生殖腺外生殖细胞瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑色素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌症；胃(胃部)癌；胃(胃部)癌，儿童；胃肠类癌瘤；生殖细胞瘤，颅外，儿童；生殖细胞瘤，性腺外；生殖细胞瘤，卵巢；妊娠滋养细胞肿瘤；胶质瘤，儿童脑干胶质瘤；胶质瘤，儿童视觉通路和下丘脑；毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌，成人(原发性)；肝细胞(肝)癌，儿童(原发性)；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's Lymphoma)，成人；霍奇金氏淋巴瘤，儿童；霍奇金氏淋巴瘤，妊娠期间；下咽癌；下丘脑和视觉通路胶质瘤，儿童；眼内黑色素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波济氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)；肾癌；喉癌；喉癌，儿童；白血病，急性淋巴，成人；白血病，急性淋巴，儿童；白血病，急性髓细胞，成人；白血病，急性髓细胞，儿童；白血病，慢性淋巴细胞；白血病，慢性骨髓性；白血病，毛细胞；唇部和口腔癌；肝癌，成人(原发性)；肝癌，儿童(原发性)；肺癌，非小细胞；肺癌，小细胞；成淋巴细胞白血病，成人，急性；成淋巴细胞白血病，儿童，急性；淋巴细胞白血病，慢性；淋巴瘤，AIDS相关；淋巴瘤，中枢神经系统(原发性)；淋巴瘤，皮肤T细胞；淋巴瘤，霍奇金氏，成人；淋巴瘤，霍奇金氏；儿童；淋巴瘤，霍奇金氏，妊娠期间；淋巴瘤，非霍奇金氏，成人；淋巴瘤，非霍奇金氏，儿童；淋巴瘤，非霍奇金氏，妊娠期间；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；巨球蛋白血症，瓦尔登氏(Waldenstrom's)；男性乳腺癌；恶性间皮瘤，成人；恶性间皮瘤，儿童；恶性胸腺瘤；成神经管细胞瘤，儿童；黑色素瘤；黑色素瘤，眼内；麦克尔细胞癌；间皮瘤，恶性；转移性鳞状颈部癌伴有隐匿性，原发性；多发性内分泌瘤变综合征，儿童；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；蕈样肉芽肿病；脊髓发育不良综合征；骨髓性白血病，慢性；骨髓性白血病，儿童，急性；骨髓瘤，多发性；骨髓增生性病症，慢性；鼻腔和副鼻窦癌；鼻咽癌；鼻咽癌，儿童；成神经细胞瘤；非霍奇金氏淋巴瘤，成人；非霍奇金氏淋巴瘤，儿童；非霍奇金氏淋巴瘤，妊娠期间；非小细胞肺癌；口腔癌，儿童；口腔癌和唇癌；口咽癌；骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌，儿童；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；胰腺癌，儿童；胰腺癌，胰岛细胞；副鼻窦和鼻腔癌；副甲状腺癌；阴茎癌；嗜铬细胞瘤；松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；妊娠期癌症与乳腺癌；妊娠期与霍奇金氏淋巴瘤；妊娠期癌症与非霍奇金氏淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；原发性肝癌，成人；原发性肝癌，儿童；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；肾细胞癌，儿童；肾盂和输尿管，移行细胞癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤，儿童；唾液腺癌；唾液腺癌，儿童；肉瘤，尤文氏肿瘤家族；肉瘤，卡波西氏；肉瘤(骨肉瘤骨恶性纤维组织细胞瘤；肉瘤；肉瘤，横纹肌肉瘤，儿童；肉瘤，软组织，成人；肉瘤，软组织，儿童；塞扎里综合征(SezarySyndrome)；皮肤癌；皮肤癌，儿童；皮肤癌(黑色素瘤)；皮肤癌，麦克尔细胞；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤，成人；软组织肉瘤，儿童；颈鳞癌，伴隐匿性，原发性，转移性；胃部(胃)癌；胃部(胃)癌，儿童；幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童；T细胞淋巴瘤，皮肤；睾丸癌；胸腺瘤，儿童；胸腺瘤，恶性；甲状腺癌；甲状腺癌；儿童；肾盂及输尿管移行细胞癌；滋养叶瘤，妊娠期；原发部位不明，儿童癌症；罕见的儿童癌症；肾盂输尿管、移行细胞癌；尿道癌；子宫肉瘤；阴道癌；视觉通路与下丘脑胶质瘤，儿童；外阴癌；华氏大球蛋白血症(Waldenstrom'sMacro globulinemia)；维尔姆氏瘤(Wilms'Tumor)；以及其转移。

在各个方面，癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、脑癌、甲状腺癌、前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、子宫内膜癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、睾丸癌、头颈癌、皮肤癌、间皮内衬白细胞癌、食道癌、肌肉癌、结缔组织癌、肺癌、肾上腺癌、肾癌、骨癌或睾丸癌以及其转移。

一方面，肽抑制p27的磷酸化。在其它方面，所述肽抑制CDK2和CDK4。在一些方面，所述肽抑制癌细胞增殖和/或降低癌细胞活力。

本发明的肽是截短的ALT肽，其为抑制p27的酪氨酸磷酸化由此干扰CDK4的激酶活性并抑制癌细胞进展到细胞周期中的p27模拟物。

Alt-Brk是含有SH3结构域的交替剪接形式的Brk，其阻断pY88并且充当内源性CDK4抑制剂，因此被鉴定为p27内的可靶向调控区。Brk在60％乳腺癌中过表达，这表明其通过p27酪氨酸磷酸化调节CDK4来促进细胞周期进程。Tyr-88/Tyr-89在p27和可能地Y74的310螺旋中的磷酸化降低了其细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制活性。这使p27-细胞周期蛋白D-CDK4复合物产生构象改变，从而允许p27腾出催化裂以允许ATP进入并进一步使活性位点磷酸化。因此，此位点的磷酸化可以将肿瘤抑制CDK抑制活性转换为致癌活性。

阻断CDK4活性长期以来一直是癌症疗法的目标。然而，由于丝氨酸/苏氨酸激酶活性位点之间的保护，这已被证明是困难的。大多数抑制剂与太多其它必需激酶反应以至于无法提供任何治疗益处。帕博西尼为似乎对CDK4活性极具特异性的CDK4抑制剂。靶向p27酪氨酸(Y)磷酸化作为靶向CDK4活性的间接方式的优势在于p27的底物很少，因此其靶向应是更具特异性的。另外，帕博西尼的使用已示出靶向CDK4是有效方法。p27酪氨酸磷酸化模拟物提供了用于靶向此重要激酶的额外方法，这可能具有额外益处。

肽结构域的小分子模拟物在本领域是已知的。例如，VENCLEXTA^TM是起到Bcl2的BH3结构域的作用的模拟物，其抑制Bcl2作用。以类似方式，本发明提供了p27模拟物。因此，本发明的肽是含有K1的p27肽或含有SH3的Brk肽的具有与天然肽的结果相似的三维结构、能够抑制p27磷酸化的功能模拟物。本发明的肽还提供了优于如图24A和24B中所展示的单独的分离的SH3结构域的优势。抑制p27磷酸化阻止CDK2和CDK4活性，并且因此防止癌细胞进展到细胞周期中。

一方面，进一步向所述受试者施用抗癌治疗。一方面，所述抗癌治疗选自化学疗法、放射治疗、免疫疗法和/或肿瘤切除。

本发明的药物组合物的施用可以与一种或多种另外的治疗剂组合。短语“组合疗法”、“与……组合”等是指同时使用多于一种药物或治疗来增加应答。本发明的组合物例如可以与用于治疗癌症的其它抗癌治疗组合使用。具体地，向受试者施用本发明的肽可以与抗癌治疗组合。

在一些方面，抗癌治疗在施用本发明的药物组合物之前施用、与施用本发明的药物组合物同时施用或在施用本发明的药物组合物之后施用。

在一些方面，抗癌治疗为抗癌剂，所述抗癌剂选自由以下组成的组：帕博西尼(PB)、瑞博西尼、阿贝西尼、奥希替尼(osirmetinib)、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、帕尼单抗(pantitumumab)、凡德他尼(vandetanib)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、维罗非尼(vemurafenib)、对甲苯磺酸索拉非尼(sorafenib tosylate)、PLX-4720、达拉菲尼(dabrafenib)、紫杉醇、顺铂、多西他赛、卡铂、长春新碱、长春花碱、甲氨蝶呤、环磷酰胺、CPT-11、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、吉西他滨、雌莫司汀、卡莫司汀、阿霉素(adriamycin)、依托泊苷、三氧化二砷、伊立替康、赫赛汀(Herceptin)、维罗非尼、埃罗替尼、西妥昔单抗、来曲唑、氟维司群(fulvestrant)和埃博霉素衍生物。

下面呈现了说明了截短的BRK肽的产生以及本发明所设想的对其特异性抑制癌细胞增殖和存活的能力的分析的实例。提供以下实例以进一步展示本发明的实施例，但并不旨在限制本发明的范围。尽管以下实例是可能使用的典型实例，但也可以可替代地使用本领域技术人员已知的其它程序、方法或技术。

实例

实例1

重组产生ALT肽

产生了不同长度的重组肽变体，并将其特性和作用与全长CCL-1肽的特性和作用进行比较。

将编码PxxP肽K1、K2和K3的寡核苷酸退火并且直接与pGEX-KG表达载体连接以产生n末端GST标记的肽。描述了GST、GST-Brk SH3、GST-Brk SH2表达质粒。使用这些质粒转化的大肠杆菌BL21细胞(E.coli BL21 cell)在LB-氨苄西林(ampicillin)中生长，直至OD达到0.6，并且通过添加1mM IPTG诱导蛋白质产生。在2小时之后，通过离心收获细胞。根据GST蛋白纯化手册(通用电气医疗公司(GE Healthcare))对GST-琼脂糖进行细胞裂解和蛋白质纯化。将蛋白质用过量谷胱甘肽洗脱并且对PBS进行透析以供进一步使用。如前所述，由大肠杆菌产生经纯化的C末端组氨酸标记的或N末端Flag标记的p27。使用人p27 cDNA作为用携带点突变的寡核苷酸进行PCR突变发生的模板：PPPP(SEQ ID NO:42)91-95AAAA(SEQ IDNO:43)(ΔK1)；PKKP(SEQ ID NO:44)188-191AAAA(SEQ ID NO:45)(ΔK3)；或PPPP(SEQ IDNO:42)91-95AAAA(SEQ ID NO:45)和PKKP(SEQ ID NO:44)188-191AAAA(SEQ ID NO:45)(ΔK1/K3)。

将PCR片段与T7pGEMEX人His-p27或T7pGEMEX人Flag-p27质粒连接以在大肠杆菌中进行表达。先前描述了突变体Y74F、Y88F和Y88/89F。将Flag标记的p27突变体用Flag抗体(M-2，西格玛F-18C9(Sigma F-18C9))通过Flag免疫沉淀纯化，并且根据制造商的方案用Flag肽(西格玛F-4799)洗脱。将His标记的p27突变体通过FPLC通过his-trap亲和色谱法(his-trap HP，通用电气医疗71-5247-01)进行纯化。将亲和柱根据制造商的方案剥离，然后用5个柱体积的100mM CoCl₂进行洗涤。向粗制材料施涂上样缓冲液，所述上样缓冲液由6M脲、500mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 7.5)和20％甘油组成。将材料用500mM NaCl、50mMTris-HCl(pH 7.5)和10％甘油洗涤。将经纯化的材料用500mM咪唑、20mM Hepes(pH 7.4)和1MKCl洗脱。然后将蛋白质在由25mM Hepes(pH 7.7)、150mM NaCl、5mM MgCl2和0.05％NP40构成的溶液中过夜透析。对所有经纯化的蛋白质通过考马斯(Coomassie)和免疫印迹分析进行分析。将p27、ΔK1、ΔK3、ΔK1/K3、Y74F和Y88/89F盒使用In Fusion基因克隆试剂盒(康迪泰克公司(Clontech))克隆到pTRE3G四环素诱导型逆转录病毒表达构建体(pTRE3Gtetracycline inducible retroviral expression construct)中。使用PCDNA3载体中的人Alt-Brk作为模板通过PCR产生Alt-Brk，之后使用in-fusion克隆试剂盒将其克隆到T7pGEMEXhuman Flag标记的质粒和pTRE3G中。Alt-Brk的氨基酸序列示出如下：

MVSRDQAHLGPKYVGLWDFKSRTDEELSFRAGDVFHVARKEEQWWWATLLDEAGGAVAQGYVPHNYLAERETVESEPAGHAGCAALQDLAACRGPAAPERGGVLPQPARACELPQGPEPVPRPAAGRALPEARA(SEQ ID NO:46)。

实例2

合成产生ALT肽

合成肽可以通过本领域的普通技术人员已知的固相肽化学的标准方法合成。例如，其可以通过固相化学技术按照前面描述的使用自动合成器的程序合成。类似地，可以合成多个片段，然后将多个片段连接在一起以形成更大的片段。这些合成肽片段也可以用特定位置处的氨基酸取代来制成。

对于固相肽合成，许多技术的汇总可以在J.M.Stewart和J.D.Young,《固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)》,W.H.Freeman公司(W.H.Freeman Co.)(圣罗朗西斯科(San Francisco)),1963以及J.Meienhofer,《激素蛋白和肽(Hormonal Proteins andPeptides)》,第2卷,第46页,学术出版社(Academic Press)(纽约(New York)),1973中找到。对于经典溶液合成，参见G.Schroder和K.Lupke,《肽(The Peptides)》第1卷,学术出版社(纽约)。一般来说，这些方法包括将一个或多个氨基酸或适当保护的氨基酸依次添加到正在生长的肽链上。通常，第一氨基酸的氨基或羧基受合适的保护基团保护。将受保护的或衍生化的氨基酸然后附接到惰性固态载体或在溶液中通过以使互补性(氨基或羧基)基团适当地受保护的次序并且在适于形酰胺键的条件下添加接下来的氨基酸来得以利用。然后从此新添加的氨基酸残基中去除保护基团，并且添加接下来的氨基酸(适当受保护的)等。

在所有期望的氨基酸以适当的次序连接后，依次或同时去除任何其余保护基团(和任何固态载体)，以产生最终的多肽。通过对这此一般程序进行简单修改，可以一次向一个生长链添加多于一个氨基酸，例如，通过将(在不使手性中心外消旋化的条件下)受保护的三肽与适当受保护的二肽偶联以在脱保护后形成五肽。

制备本发明的化合物的方法涉及固相肽合成，在所述固相肽合成中氨基酸α-N末端受酸或碱敏感基团保护。这种保护基团应具有对肽键形成的条件稳定同时易于去除，不会破坏正在生长的肽链或其中含有的手性中心中的任何手性中心的外消旋化的特性。合适的保护基团为9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁基氧基羰基(Boc)、苄基氧基羰基(Cbz)、联苯异丙氧基羰基、叔戊基氧基羰基、异羰基氧基羰基、α,α-二甲基-3.5-二甲氧基苄基氧基羰基、o-硝基苯氧硫基、2-氰基-叔丁基氧基羰基等。9-芴基-甲氧基羰基(Fmoc)保护基团对ITP片段的合成是特别优选的。其它优选侧链保护基团用于侧链氨基，如赖氨酸和精氨酸、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(pmc)、硝基、对甲苯磺酰基、4-甲氧基苯-磺酰基、Cbz、Boc和金刚烷基氧基羰基；用于酪氨酸、苄基、o-溴苄氧基羰基、2,6-二氯苄基、异丙基、叔丁基(t-Bu)、环己基、环苯基和乙酰基(Ac)；用于丝氨酸、叔丁基、苄基和四氢吡喃基；用于组氨酸、三苯甲基、苄基、Cbz、对甲苯磺酰基和2,4-二硝基苯基；用于色氨酸、甲酰基；用于天冬氨酸和谷氨酸、苄基和叔丁基；以及用于半胱氨酸、三苯基甲基(三苯甲基)。

在固相肽合成方法中，将α-C末端氨基酸附接到合适的固态载体或述树脂。可用于以上合成的合适的固态载体为对试剂和逐步缩合-脱保护反应的反应条件为惰性以及可溶于所使用的培养基的那些材料。用于α-C末端羧基肽的合成的优选固态载体为4-羟基甲基苯氧基甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)。α-C末端酰胺肽的优选固态载体为可从应用生物系统公司(Applied Biosystems)(加利福尼亚州福斯特城(Foster City,Calif.))获得的4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基乙酰氨基乙基树脂。α-C末端氨基酸在具有或不具有4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲氨基)磷-六氟磷酸(BOP)或双(2-氧代-3-噁唑啉基)氯化膦(BOPCl)的情况下通过N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸(HBTU)与树脂偶联，在介于10℃与50℃之间的温度下在如二氯甲烷或DMF等溶剂中介导约1小时至约24小时的偶联。

在固态载体为4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基树脂时，将Fmoc基团用仲胺，优选地哌啶切割，之后与以上所述的α-C末端酸偶联。用于与脱保护的4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基树脂偶联的优选方法为含O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲六氟-磷酸盐(HBTU，1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT，1当量)的DMF。连续受保护的氨基酸的偶联可以在如本领域众所周知的自动多肽合成仪中进行。在一优选实施例中，正在生长的肽的α-N末端氨基酸受Fmoc保护。从正在生长的肽的α-N末端侧去除Fmoc保护基团是通过用仲胺，优选地哌啶进行处理完成的。将每种脱保护的氨基酸然后以约3倍摩尔过量引入，并且优选地在DMF中进行偶联。偶联剂通常为O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸(HBTU，1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT，1当量)。

在固相合成结束时，将多肽从树脂中去除并脱保护，这可以依次进行或单独操作。可以在单次操作中通过用包括苯甲硫醚、水、乙二硫醇和三氟乙酸的切割试剂对树脂结合的多肽进行处理完成多肽的去除和脱保护。在其中多肽的α-c末端为烷基胺的情况下，将树脂用烷基胺通过氨基水解进行切割。可替代地，肽可以通过酯交换，例如与甲醇交换，然后通过氨基水解或直接转酰胺去除。受保护的肽可以在此时进行纯化，或可以直接进行下一步。侧链保护基团的去除是使用上述切割混合物完成的。将完全脱保护的肽通过一系列色层步骤进行纯化，所述步骤采用以下类型中的任何类型或所有类型：对弱碱树脂(乙酸盐形式)进行的离子交换；对未衍生化的聚苯乙烯-二乙烯基苯(例如，Amberlite XAD)进行的疏水吸附色谱法；硅胶吸附色谱法；对羧甲基纤维素进行的离子交换色谱法；例如对SephadexG-25、LH-20或反流分布进行的分配色谱法；高效液相色谱法(HPLC)，尤其是对辛基或十八烷基甲硅烷基-二氧化硅结合相柱装填进行的反相HPLC。

CCL-8肽的HPLC迹和分子量是使用快原子轰击(FAB)质谱法或任何其它质谱技术(参见图18A-18B)确定的。

CCL-9肽的HPLC迹和分子量是使用快原子轰击(FAB)质谱法或任何其它质谱技术(参见图19A-19B)确定的。

CCL-10肽的HPLC迹和分子量是使用快原子轰击(FAB)质谱法或任何其它质谱技术(参见图20A-20B)确定的。

CCL-20肽的HPLC迹和分子量是使用快原子轰击(FAB)质谱法或任何其它质谱技术(参见图21A-21B)确定的。

CCL-19肽的分子量是使用快原子轰击(FAB)质谱法或任何其它质谱技术(参见图22)确定的。

CCL-21肽的分子量是使用快原子轰击(FAB)质谱法或任何其它质谱技术(参见图23)确定的。

实例3

BRK肽对细胞增殖和细胞活力的影响

在所关注的区和/或氨基酸中产生、截短或突变的各种肽(如图1和表3中所展示的)中，进一步对肽CCL-8-CCL-14在MCF7细胞，即乳腺癌细胞系中的细胞增殖和细胞活力中的单独作用进行了研究。

表3:肽修饰的汇总

为了进行增殖和活力测定，用FLAG-ALT的合成肽处理前2天，将MCF7细胞以500个细胞/孔接种在96孔板上。细胞接种后48小时，将细胞以100ul每种经评估的药物浓度进行处理。将MCF7细胞用与作为内部对照的flag ALT和ALT-5A显性阴性突变体相同的方式进行处理。所有肽在NP1调配物中制备(见表2)。24小时后重复处理。第二天，功能测定进行如下：

使用普洛麦格Cell-Titer Glo(Promega Cell-Titer Glo)目录号G9242规格进行活力测定，并且使用光度计对信号进行测量。

使用SYTO60测定进行增殖测定。简单地说，将细胞在RT中用4％PFA固定15分钟。固定后，将细胞用TC PBS洗涤x2，并且用2uM SYT0-60染料(赛默飞世尔公司(Thermofisher)目录号S11342)溶液在PBS中，RT，在黑暗中温育4小时。染料温育后，将细胞用PBS洗涤，用使用Licor读取器进行成像和定量。

如图2A-2B和3A-3B所示，通过将肽CCL-8-CCL-11的功效与Flag-ALT的功效进行比较，发现CCL-9诱导的对细胞增殖和细胞活力的抑制最强，且呈剂量依赖性方式。

这通过将以下进行比较进一步得到证实：将肽CCL-8-10和CCL-14的功效与Flag-ALT的功效进行比较；将CCL-8-10的功效与Flag-ALT的功效进行比较；将CCL-12-14和CCL-9的功效与Flag-ALT的功效进行比较；以及将CCL-9和CCL-14的功效与Flag-ALT的功效进行比较，如分别在图4A-4B和5A-5B、图6A-6B和7A-7B、图8A-8B和9A-9B以及图10A-10B和11A-11B中所示。

使用Eliza方法对处理后细胞中的肽的量进行评估。简单地说，将MCF7细胞在含有10％FBS、1％P/S、胰岛素和NEEA的DMEM培养基中培养。对于所有实验，使用来自传代3-6的MCF7细胞。MCF10细胞始终为传代1并且在含有成纤维细胞增殖试剂盒(龙沙公司(Lonza)目录号CC-3150)和10ng/ml霍乱毒素(西格玛公司目录号C8052)的MEGM培养基中进行培养。在收获前将细胞在6孔板中培养。将细胞用指定浓度的Flag-ALT或所关注的肽处理2X 24小时。处理后，使细胞胰蛋白酶化，以1500rpm旋转减慢，并且收集细胞团粒。对于细胞裂解，将细胞在活化的RIPA裂解缓冲液中裂解，所述裂解缓冲液含有磷酸酶抑制剂II，即Iii(西格玛公司(Sigma))、蛋白酶抑制剂V(西格玛公司)1uM DTT、50uM NaV和1XPMSF。将细胞团粒重悬于500ul活化的RIPA裂解缓冲液中并且在冰上裂解20分钟。在13,000rpm，4C旋转5分钟后分离上清液。

Flag Eliza是根据百维信公司(Biovisions)(目录号E4700)在Eliza试剂盒中提供的方案进行的。将每个样品一式两份进行处理，每份100ul。根据制造商的说明进行测定，并且使用板读取读取信号。使用提供的Flag蛋白标准品，根据生成的标准曲线推断每次读取的FLAG蛋白浓度。

如图12A-12D所示，在MCF7细胞中，在细胞中检测到相比于CCL-8和CCL-10更大量的CCL-9，这表明所述肽的细胞渗透性更优。进一步地，发现CCL-9对于抑制增殖和活力更有效，即使在较低量的肽的情况下，其抑制率也高于CCL-8和CCL-10的抑制率。

实例4

BRK肽对MCF10A细胞的细胞增殖和细胞活力的影响

在所关注的区和/或氨基酸中产生、截短或突变的各种肽(如图1中所展示的)中，进一步对肽CCL-8-CCL-10和CCL-14在MCF10A细胞，即非致癌乳腺细胞系中的细胞增殖和细胞活力中的单独作用进行了研究。

将细胞培养并制备以供如实例2中所述进行测定。

如图13A-13B和14A-14B所示，将肽CCL-8-CCL-10和CCL-14的功效与Flag-ALT的功效进行比较，发现CCL-9诱导的对细胞增殖和细胞活力的抑制最强，且呈剂量依赖性方式。然而，在MCF7和MCF10A中获得的细胞增殖和细胞活力的比较表明肽极大抑制癌细胞(例如，MCF7)的细胞增殖和细胞活力，但在小得多的程度上影响非致癌细胞(例如，MCF10A)的细胞增殖和细胞活力(参见图4和5，与图13和14进行比较)。

实例5

BRK肽在MCF7细胞和MCF10A细胞中的作用的比较

将CCL-9对细胞增殖和细胞活力的影响与由CCL-14在MCF7细胞和MCF10A细胞中诱导的那些细胞增殖和细胞活力的影响进行比较。将细胞培养并制备以供如实例2中所述进行测定。

如图15A-15B和16A-16B中所展示的，发现CCL-9和CCL-14对抑制致癌MCF7细胞中的细胞增殖和活力比对非致癌MCF10A细胞的抑制更有效。

进一步地，在MCF7细胞和MCF10A细胞中对在细胞中检测到的CCL-8-CCL-10的量进行了比较。将细胞培养并制备以供如实例2中所述进行测定。

如图17A-17F所展示的，发现肽摄取在MCF7细胞中比在MCF10A细胞中有所增加，无论用于处理细胞的肽的量如何都是如此。

在对MCF7细胞和MCF10A细胞的增殖和活力进行评估后，发现在稳定性和反映全长CCL-1应答方面，CCL-9是最佳候选者。在重组环境中产生了稍长的变体(CCL-7)，但不成功；所述肽不稳定并且迅速降解为较小变体。CCL-9包含SH3结构域和紧邻VESEP结构域下游的推定α螺旋结构域。

实例6

BRK肽在体外对乳腺癌细胞的作用

为了确立确定短变体的功能是否与全长IpY.2/1x(CCL-2/NPx)相同，对CCL-19/NPx(IpY.19/1x)和CCL-20/NPx(IpY.20/1x)的功效在体外进行了评估。

将大的140aa CCL-2肽截短至91aa变体，其被称为CCL-19和CCL-20。这两种合成肽的不同之处在于在C端存在一个C到S的取代，这可能会增加CCL-20的稳定性。本研究的目的是研究包装CCL-19和CCL-20、IpY.19和IpY.20的脂质体是否囊括了IpY和全长CCL-2肽在多种乳腺癌系和正常乳腺细胞中的所有特征。

研究对以下进行：

(1)ER/PR阳性乳腺癌系：MCF7和T47D

(2)三阴性乳腺癌系：BT-549

(3)正常乳腺癌细胞系：MCF10A

为了检验CCL-19/NPx(IpY.19/1x)和CCL-20/NPx(IpY.20/1x)在每个细胞系中的功效，进行细胞活力测定(MTT)：

(1)由对细胞中的ATP进行定量以确定肽的生长抑制作用驱动的细胞活力测定(MTT)。

在每个实验中，将结果与IpY.2/1x(CCL-2/NPx)以及CCL-27/NPx(IpY.27/1x)，即用作阴性对照的治疗肽的显性阴性变体的已经确立的功效进行比较。

将细胞在MEM培养基(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，SH30024FS)或RPMI培养基(飞世尔科技公司，SH30027FS)中培养，所述培养基补充有胎牛血清(FBS)(飞世尔科技公司，目录号35016CV)、HyClone非必需氨基酸100x溶液(飞世尔科技公司，目录号SH3023801)、HyClone两性霉素B(Fungizone)溶液(飞世尔科技公司，目录号SV3007801)、Gibco盘尼西林-链霉素(10,000U/ml)(飞世尔科技公司，目录号15140122)、来自牛胰腺的胰岛素溶液(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，目录号I0516)、PEN/STREP/GLUTAMIN(飞世尔科技公司，SV3008201)。为了进行细胞制备，使用了Gibco胰蛋白酶-EDTA(0.25％)，酚红(飞世尔科技公司，目录号25200072)、Gibco PBS，10x(飞世尔公司，目录号70011044)和胰蛋白酶(飞世尔科技公司，25 200 072)。

为了进行ATP活力测定，将细胞以500个细胞/孔铺板在96孔板中，并且允许附着24小时。24小时后，对脂质体中的肽进行剂量应答处理。处理总共进行48小时，每24小时补充一次。根据制造商说明，使用普洛麦格CellTiter Glow活力测定对细胞活力进行评估。

如图25A-25B所示，评估IpY.19/1x和IpY.20/1x在ER/PR乳腺癌细胞系中的功效。相比于IpY.27/1x，即阴性对照，用IpY.2/1x、IpY.19/1x和IpY.20/1x进行处理使细胞活力显著降低。脂质体中的三种治疗肽IpY.2/1x、IpY.19/1x和IpY.20/1x无统计上显著的差异。这表明较短的肽变体CCL-19和CCL-20具有与全长CCL-2相同的功效。

如图26所示，评估IpY.19/1x和IpY.20/1x在三阴乳腺癌细胞系中的功效。尽管IpY.2/1x在三阴系中有某种作用，但其降低ATP驱动的细胞活力的功效比在ER阳性细胞中观察到的功效弱。用IpY.19/1x和IpY.20/1x进行的剂量应答处理使细胞活力适度降低，与IpY.2/1x没有区别。此结果表明较短的肽变体CCL-19和CCL-20在BT-549三阴性系中以与全长CCL-2相同的方式起作用。

如图27所示，评估IpY.19/1x和IpY.20/1x在正常乳房乳腺细胞系中的功效。全长肽CCL-2对正常乳腺细胞系MCF10A的功效低，这潜在地表明所述疗法可能不能像靶向肿瘤细胞那样高效地靶向正常细胞。因此，确立短肽变体CCL-19和CCL-20是否具有相同的治疗特征至关重要。用IpY.19/1x和IpY.20/1x进行处理使细胞活力微弱降低，与MCF10A中的IpY.2/1x没有区别，再现了先前在全长CCL-2的情况下观察到的低功效。

如表4中汇总的，此研究显示，用IpY.19/1x(CCL-19/NPx)和IpY.20/1x(CCL-20/NPx)进行处理使ATP驱动的细胞活力减少，这与IpY.2/1x(CCL-2/NPx)在ER阳性MCF7和T47D系中无区别；用IpY.19/1x(CCL-19/NPx)和IpY.20/1x(CCL-20/NPx)在三阴BT-549细胞系中进行处理未诱导细胞活力的显著降低(这些结果可与在用IpY.2/1x(CCL-2/NPx)对BT-549细胞进行处理之后记录的那些相当)；并且IpY.19/1x(CCL-19/NPx)和IpY.20/1x(CCL-20/NPx)与IpY.2/1x(CCL-2/NPx)在MCF10细胞中类似起所用，其中处理使细胞活力减少最少。

表4：基于ATP活力测定平均值确立的IC₅₀值

<![CDATA[IC<sub>50</sub>(ng/ul)]]>	CCL-2	CCL-19	CCL-20
				MCF7	5.55	5.61	5.48
T47D	7.45	6.20	6.42
				BT-549	>40	>40	>40
MCF10A	>40	>40	>40

MCF7 n＝4；T47F n＝3；BT-549n＝3；MCF10An＝2

已证明，IpY.19和IpY.20两者以与IpY.2在MCF10A正常细胞、三阴BT-549细胞和ER阳性乳腺癌系中相同的方式表现出相同的效率和功能，并且还确立了在所有检验的细胞系中在IpY.19与IpY.20之间在活性上无差异，这表明在IpY.20上将半胱氨酸残基转化为丝氨酸残基并不影响其功能。

将半胱氨酸残基保留在CCL-19上允许通过马来酰亚胺-半胱氨酸偶联反应来荧光标记CCL-19。将CCL-19用IRDye680RD进行标记，并且将使用荧光标记CCL-19作为CCL-20的替代品来研究治疗肽的半衰期，以及进行延长时间过程的研究，以评估CCL-20在体外的给药频率。

实例7

BRK肽在体外对MCF7细胞的肿瘤生长的作用

评估了BRK肽对小鼠体内注射的MCF7细胞的生长的作用。

将雌激素团粒植入到5-6周龄NOD/SCID雌性小鼠体内。一周后，将5x10⁶个MCF7细胞皮下注射在每只动物的右侧，第4乳腺脂肪垫附近。每日监测肿瘤生长，并且用数字卡尺测量肿瘤体积。当肿瘤体积达到200-300mm³时，将小鼠随机分配到处理组。将小鼠分为5个处理组并且使其接受媒剂(PBS/HEPES)、CCL-2/NPx(肽:脂质比为1:10)、CCL-2/NPx(1:12.5)、CCL-19/NPx(1:12.5)或CCL-20/NPx(1:12.5)的每日静脉注射。

如图28A-28E所示，每日测量肿瘤体积。如图29A-29T中示出的，与媒剂相比，用CCL-19/NPx(1:12.5)对小鼠进行处理早在第4天就显著减小了肿瘤体积(参见图29C)，并且肽在减小肿瘤体积方面直至第20天仍然显著有效(参见图29S)。

与媒剂相比，用CCL-20/NPx(1:12.5)对小鼠进行处理在第7天开始显著减小肿瘤体积(参见图29F)，并且在减小肿瘤体积方面直至第19天仍然显著有效(参见图29R)。

如图30A-30E所示，不存在用BRK肽对动物进行处理相关的明显毒性，这可以通过在处理过程中动物的体重无变化中观察到。

实例8

对肽进行生物工程化以靶向乳腺癌细胞

将144aa CCL-1肽生物工程工程化为91aa变体(CCL-20)，以促进产物IpY.20的制造(见表5)。

表5：此研究中使用的IpY版本

肽	大小(aa)	标签	名称	注释
					CCL-1	144	FLAG	IpY.1	与ALT相同
CCL-2	144	无	IpY.2	与ALT相同
					CCL-4A	144	FLAG	IpY.4a	对结合突变无活性
CCl-20	91	无	IpY.20	治疗肽
					CCL-19	91	无	IpY.19	可以加标签的变体
CCL-27	91	无	IpY.27	对结合突变无活性

产生截短的合成肽CCL-20。

通过固相肽合成产生了含有需要增加产物在制造期间的稳定性的对残基的额外修饰的CCL-20肽，并且通过HPLC分析，其纯度为>90％。将LNP部分以12.5:1的脂质:蛋白质质量比混合。产生了额外的变体CCL-19，所述变体含有单个C残基取代，以允许通过马来酰亚胺-半胱氨酸偶联反应对CCL-19进行荧光标记。用IRDye680RD对CCL-19进行标记以产生IpY.19-IRD680作为CCL-20的替代品来研究治疗肽的半衰期和体内递送。在将CCL-19和CCL-20包装在脂质体中以产生IpY.19和IpY.20时，其囊括了亲本IpY.2和全长CCL-2肽在体外的特征中的所有特征(参见图31A和31B)。IpY.20诱导MCF7细胞和T47D细胞的细胞死亡并且对MCF10A细胞无效(图31B)。IpY.19-IRD680在其降低活力并诱导ROS方面与IpY.20无差别。

大小/电荷/稳定性。

使用Zetasizer Nano ZS(马尔文公司(Malvern,Inc))对大小、大小分布和表面电荷(ζ电位)进行了测量。报告了三个独立制备批次的平均值±SD。大小<200nm的正带电粒子促进通过EPR摄取到肿瘤中。这种大小允许在制造过程中期间通过过滤进行灭菌。

表6：

实例9

评估经生物工程化的肽生物分布

使用IpY.20的标记的变体，证明了，在动物体内检测到的10％的荧光在15分钟内定位到肿瘤，并且半衰期为>24小时。

IpY.19，即单半胱氨酸残基在CCL-19上的生物分布使得能够用NIR荧光染料(IRDye680RD)标记CCL-19以产生IpY.19-IRD680，这证明像IpY.20那样在体外表现，并且因此用作IpY.20的替代品。向荷瘤小鼠注射单剂量的IpY.19-IRD680并且将其在不同时间点处死。收获肿瘤和器官(脑部、心脏、肝脏、脾脏、肺部和肾脏)，以进行IVIS成像。在所有时间点，肝脏和肾脏两者均显示出高荧光信号，与LNP清除率一致(图32)。IpY.19-IRD680早至在注射后15分钟到达肿瘤，并且在注射后48小时在肿瘤处积聚。在注射后15分钟、1小时、4小时和24小时，大约10％的总荧光信号被分配到肿瘤部位，到注射后48小时，大约20％的总其余荧光信号被分配到肿瘤部位，并且少于10％存在于脑部、心脏、脾脏和肺部中。有趣的是，IpY.19-IRD680也到达脑部，并且直至注射后48小时累积，这表明IpY.19-IRD680可以穿过血脑屏障(图32)。为了检验IpY.19-IRD680的消除半衰期，在每个时间点采集血浆，并且使用Odyssey Licor机对荧光进行分析。IpY.19-IRD680在血浆中的半衰期为10.5小时。

实例10

评估经生物工程化的肽的药效学

通过分析药效学(PD)接合的标志物，证明了IpY.20在处理24小时内抑制其靶标。

CCL-19的PD标志物。

为了监测靶标接合，开发了几种药效学测定，所述测定可以用于肿瘤FFPE材料。根据以上生物分布实验中，将相同的器官进行福尔马林固定并且进行石蜡包埋以产生FFPE材料，以通过用针对Rbphos、Ki67、CDK2phos(CDK2的活性形式)的抗体进行的免疫组织化学进行分析，这些抗体在增殖的肿瘤细胞中均较高，但在IpY.19-IRD680达到其靶标时减少。Rbphos、Ki67和CDK2phos水平在经IpY.19-IRD680处理的动物中降低(参见图33A-33D)。对用H&E染色的FFPE材料的分析表明，坏死的量在经IpY.19-IRD680处理的动物的肿瘤区中在24小时的时间点时增加(图33A)，与体外观察到的对坏死性凋亡的快速诱导一致。这表明甚至在这么早的时间点，IpY.19-IRD680也阻断细胞增殖并且增加细胞死亡。

在肺中检测到IpY.19-IRD680；然而，通过IVIS成像，无法确定是否肺转移或非肿瘤肺组织吸取了IpY.19-IRD680。

实例11

评估经生物工程化的肽的体内功效

在两种不同的小鼠模型中使用IpY.20对肽在小鼠模型中的治疗功效进行测试。

IpY.20减小了MCF7异种移植模型中的肿瘤体积。对在免疫缺陷型NOD/SCID动物中通过将MCF7 HR+BC细胞注射到第4乳腺中产生的CDX模型每天用亲本IpY.2、IpY.19和IpY.20进行处理。IpY.2在减少肿瘤生长方面极度有效，在处理中，天然MCF7模型和MCF7模型被调理成对帕博西尼具有耐性。这项桥接研究表明，IpY.19和IpY.20表现优于IpY.2，从而在处理的17天内使肿瘤体积显著减小(图31C)。

IpY.20减小了Erbb2小鼠模型的肿瘤体积。MMTV-Erbb2为过表达强大Erbb2致癌基因的免疫活性的经基因工程化的模型(GEM)。雌性Erbb2动物在大约6个月龄时在1个或多个乳腺中自发地患上乳房肿瘤。对动物群体进行监测，并且在1个乳腺的肿瘤≥150mm³时，将其纳入研究，并且用媒剂或IpY.20，3X/周通过I.V.进行处理。IpY.20使肿瘤体积从处理启动后第14天开始显著减小(图34A)，并且使肿瘤生长速率在处理时间段期间显著降低(图34B)。在此模型中显示出IpY.20应答的优点是1)存在完整的免疫系统；以及2)肿瘤在血管化更完整的更类似于人类的转移性病状的正常乳腺内发展的事实。缺点是这些肿瘤为ER-(所有自发性小鼠肿瘤均为ER-)，并且虽然由于缺乏肿瘤进展而观察到肿瘤体积减小，但没有观察到肿瘤消退。然而，这与体外观察结果一致，即HR+肿瘤比TNBC肿瘤更特异性地经历坏死。

IpY.20已显示出在免疫活性小鼠中具有低毒性，可以特异性递送到肿瘤并减少多种乳腺癌小鼠模型的肿瘤，包含肿瘤在生理血管化更多的乳腺内发展的自发性GEM模型。

对几个合成批次的CCL-20进行了测试，并且对2种盐进行了比较。通过用IM NaOH水溶液、水、乙酸、水和甲醇进行洗涤将离子830-S阴离子交换树脂(氯化物形式，Cl-)或等效物转化为乙酸盐形式。将树脂干燥和储存。

用于盐交换的程序。将呈其三氟乙酸盐形式的肽CCL-20溶于甲醇水中，并且添加阴离子交换树脂(乙酸盐形式)并搅拌15分钟。对树脂进行过滤并用甲醇洗涤。将甲醇蒸发，并且将产物冻干并通过HPLC(测定)监测乙酸盐含量。所产生的肽CCL-20乙酸盐通过HPLC进行纯化并且通过质谱法进行分析。其它盐可以使用本领域已知的类似方法产生。

TFA和乙酸盐。在ATP驱动的活力测定中将大规模CCL20-批次#3TFA和乙酸与CCL20-批次#2TFA并行进行了测试。批次3TFA在MCF7细胞中与CCL20-批次2TFA表现相同，展示出相同的功效，并由此验证了批次一致性并证实了活性。充分表征(图35A和35B)的批次#3具有适度但较弱的作用，显示出一些功效，但IC50为13.06ng/ul，几乎是CCL20-批次2TFA和CCL20-批次3-TFA的两倍，然而观察到在乙酸盐的情况下对溶解度的影响非常明显，因此使其成为TFA盐的非常关注的替代品。(图36)。将MCF7 P.3细胞以2x24进行处理，持续总计48小时，并且对其ATP活力进行分析。使批次3-乙酸盐以0.5mg/ml在约15分钟内迅速溶解于溶液中。批次3TFA以0.5mg/ml用了1小时40分钟溶于溶液中。批次2-TFA以0.5mg/ml用了1小时50分钟溶于溶液中。在含有20％HEPES 20mM的完整介质中进行连续稀释。

用CCL20-TFA、CCL19-TFA测试CCL21(CPP衍生物)在ATP细胞活力测定方面的功效。将MCF7铺板在96孔板上，并且用增加浓度的CCL-20-LOT1-NPx和CCL-21进行处理。使用CCL-27-NPx作为阴性对照。将细胞每24小时处理两次，持续48小时的时间段，并且使用普洛麦格cell Titer glo对ATP细胞活力进行分析。发现，与CCL20和CCL19变体相比，其在MCF7细胞中的作用较弱，然而CCL-21的活性到目前为止远优于其亲本对照(无CPP的肽，数据未示出)，由此表明添加到CCL21中的CPP能够穿透肿瘤细胞，而无需使用脂质体调配物。(图37)。

实例12

评估经生物工程化的肽的体内毒性

在重复给药实验中评估了IpY.20在免疫活性模型中的毒性。

为了分析在存在IpY.20的情况下看到的潜在毒性，向免疫活性BalbC动物给药IpY.20，3X/周，0.75mg/kg，持续30天，之后进行安乐死并对血液学、临床化学、临床病理和免疫学进行分析。在经IpY.20处理的动物中，虽然白细胞和红细胞计数与经媒剂处理的小鼠相当，但在血小板中增加(图38A)并且特异性细胞因子产生(图38B)，这表明免疫应答可能已经启动。IpY.20处理组中的小鼠的体重未显著改变，并且基于在整个实验过程中的BCS指南，经处理的小鼠的身体状况评分(BCS)为3。作为对照，向动物给药裸肽，并且在此处理组中未看到任何作用(图38A和38B)。这种作用不是由于LNP本身，因为在用IpY.2进行的毒性实验中使用了相同的LNP调配物，并且未观察到任何作用。因此，与12个剂量的IpY.20经30天时间段相关的毒性是相对温和的。

尽管已经参考以上实例描述了本发明，但应当理解，修改和变化均涵盖在本公开的精神和范围之内。因此，本发明仅由以下权利要求限制。

序列表

<110> 孔卡洛控股有限责任公司(CONCARLO HOLDINGS, LLC)

<120> BRK肽和使用方法

<130> PPI22172489US

<140>

<141>

<150> 63/048,489

<151> 2020-07-06

<160> 50

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-1

<400> 1

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Val Ser Arg Asp Gln Ala

1 5 10 15

His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr

20 25 30

Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly Asp Val Phe His Val Ala Arg

35 40 45

Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly

50 55 60

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65 70 75 80

Thr Val Glu Ser Glu Pro Ala Gly His Ala Gly Cys Ala Ala Leu Gln

85 90 95

Asp Leu Ala Ala Cys Arg Gly Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gly Gly Leu

100 105 110

Pro Gln Pro Ala Arg Ala Cys Glu Leu Pro Gln Gly Pro Glu Pro Val

115 120 125

Pro Arg Pro Ala Ala Gly Arg Ala Leu Pro Glu Ala Arg Ala

130 135 140

<210> 2

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-2

<400> 2

Met Val Ser Arg Asp Gln Ala His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu

1 5 10 15

Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly

20 25 30

Asp Val Phe His Val Ala Arg Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr

35 40 45

Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His

50 55 60

Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu Thr Val Glu Ser Glu Pro Ala Gly His

65 70 75 80

Ala Gly Cys Ala Ala Leu Gln Asp Leu Ala Ala Cys Arg Gly Pro Ala

85 90 95

Ala Pro Glu Arg Gly Gly Val Leu Pro Gln Pro Ala Arg Ala Cys Glu

100 105 110

Leu Pro Gln Gly Pro Glu Pro Val Pro Arg Pro Ala Ala Gly Arg Ala

115 120 125

Leu Pro Glu Ala Arg Ala

130

<210> 3

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-2b

<400> 3

Met Val Ser Arg Asp Gln Ala His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu

1 5 10 15

Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly

20 25 30

Asp Val Phe His Val Ala Arg Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr

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Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His

50 55 60

Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu Thr Val Glu Ser Glu Pro Ala Gly His

65 70 75 80

Ala Gly Cys Ala Ala Leu Gln Asp Leu Ala Ala Cys Arg Gly Pro Ala

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Ala Pro Glu Arg Gly Gly Leu Pro Gln Pro Ala Arg Ala Cys Glu Leu

100 105 110

Pro Gln Gly Pro Glu Pro Val Pro Arg Pro Ala Ala Gly Arg Ala Leu

115 120 125

Pro Glu Ala Arg Ala

130

<210> 4

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-3

<400> 4

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Val Ser Arg Asp Gln Ala

1 5 10 15

His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr

20 25 30

Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly Asp Val Phe His Val Ala Arg

35 40 45

Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly

50 55 60

Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu

65 70 75 80

Thr Val Glu Ser Glu Pro

85

<210> 5

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-4a

<400> 5

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Val Ser Arg Asp Gln Ala

1 5 10 15

His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr

20 25 30

Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly Asp Val Phe His Val Ala Arg

35 40 45

Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr Leu Leu Ala Ala Ala Ala Ala

50 55 60

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65 70 75 80

Thr Val Glu Ser Glu Pro Ala Gly His Ala Gly Cys Ala Ala Leu Gln

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Asp Leu Ala Ala Cys Arg Gly Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gly Gly Leu

100 105 110

Pro Gln Pro Ala Arg Ala Cys Glu Leu Pro Gln Gly Pro Glu Pro Val

115 120 125

Pro Arg Pro Ala Ala Gly Arg Ala Leu Pro Glu Ala Arg Ala

130 135 140

<210> 6

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-4b

<400> 6

Met Val Ser Arg Asp Gln Ala His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu

1 5 10 15

Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly

20 25 30

Asp Val Phe His Val Ala Arg Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr

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Leu Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His

50 55 60

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65 70 75 80

Ala Gly Cys Ala Ala Leu Gln Asp Leu Ala Ala Cys Arg Gly Pro Ala

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Ala Pro Glu Arg Gly Gly Val Leu Pro Gln Pro Ala Arg Ala Cys Glu

100 105 110

Leu Pro Gln Gly Pro Glu Pro Val Pro Arg Pro Ala Ala Gly Arg Ala

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Leu Pro Glu Ala Arg Ala

130

<210> 7

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-5a

<400> 7

Asp Asp Lys Asp Lys Asp Tyr Asp Met Val Ser Arg Asp Gln Ala His

1 5 10 15

Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr Asp

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Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly Asp Val Phe His Val Ala Arg Lys

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Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly Ala

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Arg Pro Ala Ala Gly Arg Ala Leu Pro Glu Ala Arg Ala

130 135 140

<210> 8

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-5b

<400> 8

Asp Asp Lys Asp Lys Asp Tyr Asp Met Val Ser Arg Asp Gln Ala His

1 5 10 15

Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr Asp

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Pro Gln Pro Ala Arg Ala Cys Glu Leu Pro Gln Gly Pro Glu Pro Val

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Pro Arg Pro Ala Ala Gly Arg Ala Leu Pro Glu Ala Arg Ala

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<210> 9

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-6

<400> 9

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1 5 10 15

His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr

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Leu Pro Gln Pro Ala Arg Ala Cys Glu Leu Pro Gln Gly Pro Glu Pro

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Val Pro Arg Pro Ala Ala Gly Arg Ala Leu Pro Glu Ala Arg Ala

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<210> 10

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-7

<400> 10

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Val Ser Arg Asp Gln Ala

1 5 10 15

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Pro Gln Pro Ala Arg Ala

115

<210> 11

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-8

<400> 11

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Val Ser Arg Asp Gln Ala

1 5 10 15

His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Arg Ser Thr

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Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly Asp Val Phe His Val Ala Arg

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<210> 12

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-9

<400> 12

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<210> 13

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-10

<400> 13

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Val Ser Arg Asp Gln Ala

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Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly Asp Val Phe His Val Ala Arg

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Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly

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<210> 14

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-11

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Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr Asp Glu Glu Leu

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Ser Phe Arg Ala Gly Asp Val Phe His Val Ala Arg Lys Glu Glu Gln

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Trp Trp Trp Ala Thr Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly Ala Val Ala Gln

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Gly Tyr Val Pro His Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu Thr Val Glu Ser

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Glu Pro Ala Gly His Ala Gly Ser Ala Ala Leu Gln Asp Leu Ala Ala

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Ser Arg

<210> 15

<211> 93

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-12

<400> 15

Met Val Ser Arg Asp Gln Ala His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu

1 5 10 15

Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly

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Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His

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65 70 75 80

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85 90

<210> 16

<211> 72

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-13

<400> 16

Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr Asp Glu Glu Leu

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Ser Phe Arg Ala Gly Asp Val Phe His Val Ala Arg Lys Glu Glu Gln

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Trp Trp Trp Ala Thr Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly Ala Val Ala Gln

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Gly Tyr Val Pro His Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu Thr Val Glu Ser

50 55 60

Glu Pro Ala Gly His Ala Gly Ser

65 70

<210> 17

<211> 83

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-14

<400> 17

Met Val Ser Arg Asp Gln Ala His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu

1 5 10 15

Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly

20 25 30

Asp Val Phe His Val Ala Arg Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr

35 40 45

Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His

50 55 60

Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu Thr Val Glu Ser Glu Pro Ala Gly His

65 70 75 80

Ala Gly Ser

<210> 18

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-15

<400> 18

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Val Ser Arg Asp Gln Ala

1 5 10 15

His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr

20 25 30

Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly Asp Val Phe His Val Ala Arg

35 40 45

Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly

50 55 60

Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu

65 70 75 80

Thr Val Glu Ser Glu Pro Gly Gln Ala Pro Val Glu Asp His Gly Arg

85 90 95

Pro Leu Cys Gln Gly Arg Leu Ala Leu Cys Gly Ala Arg Leu Ala Cys

100 105 110

Gln Ala Pro Arg Glu Gly Ala Leu Pro Gly Ala Pro Ala Val Arg Pro

115 120 125

Ala Gly Pro Ala Arg Glu Ala Glu Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ala

130 135 140

<210> 19

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-16

<400> 19

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Val Ser Arg Asp Gln Ala

1 5 10 15

His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr

20 25 30

Asp Ala Ala Leu Ser Phe Arg Ala Gly Asp Val Phe His Val Ala Arg

35 40 45

Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly

50 55 60

Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu

65 70 75 80

Thr Val Glu Ser Glu Pro Ala Gly His Ala Gly Cys Ala Ala Leu Gln

85 90 95

Asp Leu Ala Ala Cys Arg Gly Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gly Gly Leu

100 105 110

Pro Gln Pro Ala Arg Ala Cys Glu Leu Pro Gln Gly Pro Glu Pro Val

115 120 125

Pro Arg Pro Ala Ala Gly Arg Ala Leu Pro Glu Ala Arg Ala

130 135 140

<210> 20

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-17

<400> 20

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Val Ser Arg Asp Gln Ala

1 5 10 15

His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr

20 25 30

Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly Asp Val Phe His Val Ala Arg

35 40 45

Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr Leu Leu Asp Glu Ala Ala Ala

50 55 60

Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu

65 70 75 80

Thr Val Glu Ser Glu Pro Ala Gly His Ala Gly Cys Ala Ala Leu Gln

85 90 95

Asp Leu Ala Ala Cys Arg Gly Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gly Gly Leu

100 105 110

Pro Gln Pro Ala Arg Ala Cys Glu Leu Pro Gln Gly Pro Glu Pro Val

115 120 125

Pro Arg Pro Ala Ala Gly Arg Ala Leu Pro Glu Ala Arg Ala

130 135 140

<210> 21

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-18

<400> 21

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Val Ser Arg Asp Gln Ala

1 5 10 15

His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr

20 25 30

Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly Asp Val Phe His Val Ala Arg

35 40 45

Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr Leu Leu Ala Ala Ala Gly Gly

50 55 60

Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu

65 70 75 80

Thr Val Glu Ser Glu Pro Ala Gly His Ala Gly Cys Ala Ala Leu Gln

85 90 95

Asp Leu Ala Ala Cys Arg Gly Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gly Gly Leu

100 105 110

Pro Gln Pro Ala Arg Ala Cys Glu Leu Pro Gln Gly Pro Glu Pro Val

115 120 125

Pro Arg Pro Ala Ala Gly Arg Ala Leu Pro Glu Ala Arg Ala

130 135 140

<210> 22

<211> 91

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-19

<400> 22

Met Val Ser Arg Asp Gln Ala His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu

1 5 10 15

Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly

20 25 30

Asp Val Phe His Val Ala Arg Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr

35 40 45

Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His

50 55 60

Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu Thr Val Glu Ser Glu Pro Ala Gly His

65 70 75 80

Ala Gly Cys Ala Ala Leu Gln Asp Leu Ala Ala

85 90

<210> 23

<211> 91

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-20

<400> 23

Met Val Ser Arg Asp Gln Ala His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu

1 5 10 15

Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly

20 25 30

Asp Val Phe His Val Ala Arg Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr

35 40 45

Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His

50 55 60

Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu Thr Val Glu Ser Glu Pro Ala Gly His

65 70 75 80

Ala Gly Ser Ala Ala Leu Gln Asp Leu Ala Ala

85 90

<210> 24

<211> 91

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-27

<400> 24

Met Val Ser Arg Asp Gln Ala His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu

1 5 10 15

Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly

20 25 30

Asp Val Phe His Val Ala Arg Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr

35 40 45

Leu Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His

50 55 60

Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu Thr Val Glu Ser Glu Pro Ala Gly His

65 70 75 80

Ala Gly Ser Ala Ala Leu Gln Asp Leu Ala Ala

85 90

<210> 25

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-21

<400> 25

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Met Val Ser Arg Asp Gln Ala

1 5 10 15

His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr

20 25 30

Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly Asp Val Phe His Val Ala Arg

35 40 45

Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly

50 55 60

Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu

65 70 75 80

Thr Val Glu Ser Glu Pro Ala Gly His Ala Gly Ser Ala Ala Leu Gln

85 90 95

Asp Leu Ala Ala

100

<210> 26

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-22

<400> 26

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Val Ser Arg Asp Gln Ala

1 5 10 15

His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr

20 25 30

Asp Ala Ala Leu Ser Phe Arg Ala Gly Asp Val Phe His Val Ala Arg

35 40 45

Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly

50 55 60

Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu

65 70 75 80

Thr Val Glu Ser Glu Pro

85

<210> 27

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-23

<400> 27

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Val Ser Arg Asp Gln Ala

1 5 10 15

His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr

20 25 30

Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly Asp Val Phe His Val Ala Arg

35 40 45

Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr Leu Leu Asp Glu Ala Ala Ala

50 55 60

Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu

65 70 75 80

Thr Val Glu Ser Glu Pro

85

<210> 28

<211> 88

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-24

<400> 28

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp

1 5 10 15

Asp Lys Gly Gly Val Thr Thr Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ser

20 25 30

Arg Thr Glu Thr Asp Leu Ser Phe Lys Lys Gly Glu Arg Leu Gln Ile

35 40 45

Val Asn Asn Thr Glu Gly Asp Trp Trp Leu Ala His Ser Leu Ser Asp

50 55 60

Glu Ala Gly Gly Thr Gly Gln Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val

65 70 75 80

Ala Pro Ser Asp Ser Ile Gln Ala

85

<210> 29

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-25

<400> 29

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Val Ser Arg Asp Gln Ala

1 5 10 15

His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr

20 25 30

Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly Asp Val Phe His Val Ala Arg

35 40 45

Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr Leu Leu Ala Ala Ala Gly Gly

50 55 60

Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu

65 70 75 80

Thr Val Glu Ser Glu Pro

85

<210> 30

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<223> CCL-26

<400> 30

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Val Ser Arg Asp Gln Ala

1 5 10 15

His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr

20 25 30

Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly Asp Val Phe His Val Ala Arg

35 40 45

Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr Leu Leu Ala Ala Ala Ala Ala

50 55 60

Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu

65 70 75 80

Thr Val Glu Ser Glu Pro

85

<210> 31

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> 穿膜肽

<400> 31

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

<210> 32

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> Tat肽

<400> 32

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

1 5 10

<210> 33

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> pVEC

<400> 33

Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His

1 5 10 15

Ser Lys

<210> 34

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> 嵌合转运素

<400> 34

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu

1 5 10 15

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

20 25

<210> 35

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> MPG肽

<400> 35

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly

1 5 10 15

Ala Trp Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

20 25

<210> 36

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> Pep-1

<400> 36

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

1 5 10 15

Lys Lys Arg Lys Val

20

<210> 37

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> 合成聚精氨酸R8

<400> 37

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 38

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> 合成聚精氨酸R9

<400> 38

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 39

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> MAP

<400> 39

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys

1 5 10 15

Leu Ala

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> R6W3

<400> 40

Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Arg Arg

1 5

<210> 41

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> P28（铜蓝蛋白50-77）

<400> 41

Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala

1 5 10 15

Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp

20 25

<210> 42

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> 点突变1

<400> 42

Pro Pro Pro Pro

1

<210> 43

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> 点突变2

<400> 43

Ala Ala Ala Ala

1

<210> 44

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> 点突变3

<400> 44

Pro Lys Lys Pro

1

<210> 45

<211> 134

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> Alt-Brk

<400> 45

Met Val Ser Arg Asp Gln Ala His Leu Gly Pro Lys Tyr Val Gly Leu

1 5 10 15

Trp Asp Phe Lys Ser Arg Thr Asp Glu Glu Leu Ser Phe Arg Ala Gly

20 25 30

Asp Val Phe His Val Ala Arg Lys Glu Glu Gln Trp Trp Trp Ala Thr

35 40 45

Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly Ala Val Ala Gln Gly Tyr Val Pro His

50 55 60

Asn Tyr Leu Ala Glu Arg Glu Thr Val Glu Ser Glu Pro Ala Gly His

65 70 75 80

Ala Gly Cys Ala Ala Leu Gln Asp Leu Ala Ala Cys Arg Gly Pro Ala

85 90 95

Ala Pro Glu Arg Gly Gly Val Leu Pro Gln Pro Ala Arg Ala Cys Glu

100 105 110

Leu Pro Gln Gly Pro Glu Pro Val Pro Arg Pro Ala Ala Gly Arg Ala

115 120 125

Leu Pro Glu Ala Arg Ala

130

<210> 46

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> SH3结构域变型

<400> 46

Asp Glu Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala

1 5 10

<210> 47

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> SH3结构域变型

<400> 47

Glu Glu Ala Ala

1

<210> 48

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> SH3结构域变型

<400> 48

Asp Glu Ala Gly Gly Asp Glu Ala Ala Ala

1 5 10

<210> 49

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> SH3结构域变型

<400> 49

Asp Glu Ala Gly Gly Ala Ala Ala Gly Gly

1 5 10

<210> 50

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<223> SH3结构域变型

<400> 50

Asp Glu Ala Gly Gly

1 5

Claims

1.一种分离的肽和功能肽，所述分离的肽具有SEQ ID NO:11至13、17、22至23和25中所示的氨基酸序列，所述功能肽与SEQ ID NO:11至13、17、22至23和25具有至少90％同源性。

2.根据权利要求1所述的分离的肽，其中所述分离的肽进一步包括N末端修饰、C末端修饰、可检测标签、细胞穿透肽(CPP)、非天然氨基酸、肽缀合物、环肽或其组合。

3.根据权利要求1所述的分离的肽，其中相比于未经修饰的肽，所述分离的肽被修饰成具有提高的总体稳定性、延长的血流稳定性、提高的细胞渗透率、提高的细胞活性或其组合。

4.根据权利要求2所述的分离的肽，其中所述可检测标签选自由以下组成的组：荧光标签、显色标签、供体/受体对的成员、稳定同位素以及其任何组合。

5.根据权利要求2所述的分离的肽，其中所述CPP提高了细胞摄取、细胞穿透和/或所述肽的转运。

6.根据权利要求2所述的分离的肽，其中所述CPP选自由以下组成的组：穿膜肽、Tat肽、Tat肽变体、pVEC、嵌合转运素、MPG肽、线性和环状聚精氨酸、R₈、R₉、R₆W₃、EB1、VP22、模型两亲性肽(MAP)、Pep-1和Pep-1相关肽、基于融合序列的蛋白质(FBP)、转运素模拟物7(TP-7)、TP-9、TP-10、铜蓝蛋白和铜蓝蛋白衍生物、鱼精蛋白、鱼精蛋白片段/SV40肽、聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸、组氨酸-赖氨酸肽、聚精氨酸、含有肽的复合环状聚阳离子精氨酸和gp41融合序列。

7.根据权利要求1所述的分离的肽，其中所述肽抑制癌细胞增殖和/或降低癌细胞活力。

8.根据权利要求1所述的分离的肽，其中所述肽抑制肿瘤生长。

9.根据权利要求1所述的分离的肽，其中所述肽增加癌细胞死亡。

10.根据权利要求1所述的分离的肽，其中所述肽增加肿瘤坏死。

11.根据权利要求1所述的分离的肽，其中所述功能肽与SEQ ID NO:11至13、17、22至23和25具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少86％、至少97％、至少98％或至少99％同源性。

12.根据权利要求1所述的分离的肽，其中所述肽具有SEQ ID NO:22或23中所示的氨基酸序列。

13.一种分离的核酸序列，其编码根据权利要求1所述的肽。

14.一种药物组合物，其包括分离的肽或功能肽以及药学上可接受的载体，所述分离的肽具有SEQ ID NO:11至13、17、22至23或25中所示的氨基酸序列，所述功能肽与SEQ ID NO:11至13、17、22至23或25具有至少90％同源性。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，其进一步包括递送媒剂。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述递送媒剂选自由以下组成的组：纳米颗粒、脂质体、树状大分子、胶束、纳米乳剂、纳米悬浮液、泡囊、纳米囊、磁性纳米颗粒、基于脂蛋白的载体和脂质复合物纳米颗粒。

17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述脂质复合物纳米颗粒包括1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、胆固醇、DOPE、TPGS或其组合。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述脂质复合物纳米颗粒包括摩尔比为约10:90至90:10的DOTMA和胆固醇。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述脂质复合物纳米颗粒包括摩尔比为约40:50至50:39的DOTMA和胆固醇。

20.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述脂质复合物纳米颗粒包括摩尔比为约50:49:1的DOTMA、胆固醇和TPGS。

21.根据权利要求18所述的药物组合物，其中脂质:肽质量比为约8:1、约6:1、约5:1、约10:1、约12.5:1、约15:1、约20:1、约25:1、约30:1或约35:1。

22.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述脂质:肽质量比为约12.5:1。

23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述脂质:肽质量比为约10:1。

24.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述递送媒剂与靶向抗体或抗体-药物缀合物(ADC)偶联。

25.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述递送媒剂与聚乙二醇(PEG)聚合物或与白蛋白缀合。

26.根据权利要求14所述的药物组合物，其进一步包括至少一种抗癌剂。

27.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述肽进一步包括N末端修饰、C末端修饰、可检测标签、细胞穿透肽(CPP)、非天然氨基酸、肽缀合物、环肽或其组合。

28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述可检测标签选自由以下组成的组：荧光标签、显色标签、供体/受体对的成员、稳定同位素以及其任何组合。

29.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述CPP选自由以下组成的组：穿膜肽、Tat肽、Tat肽变体、pVEC、嵌合转运素、MPG肽、线性和环状聚精氨酸、R₈、R₉、R₆W₃、EB1、VP22、模型两亲性肽(MAP)、Pep-1和Pep-1相关肽、基于融合序列的蛋白质(FBP)、转运素模拟物7(TP-7)、TP-9、TP-10、铜蓝蛋白和铜蓝蛋白衍生物、鱼精蛋白、鱼精蛋白片段/SV40肽、聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸、组氨酸-赖氨酸肽、聚精氨酸和gp41融合序列。

30.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述功能肽与SEQ ID NO:11至13、17、22至23或25具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少86％、至少97％、至少98％或至少99％同源性。

31.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述分离的肽具有SEQ IDNO:22或23中所示的氨基酸序列。

32.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求14或31所述的药物组合物。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述肽抑制p27的磷酸化。

34.根据权利要求32所述的方法，其中所述肽抑制CDK2和CDK4。

35.根据权利要求32所述的方法，其中所述肽抑制癌细胞增殖和/或降低癌细胞活力。

36.根据权利要求32所述的方法，其中所述肽抑制肿瘤生长。

37.根据权利要求32所述的方法，其中所述肽增加癌细胞死亡。

38.根据权利要求32所述的方法，其中所述肽增加肿瘤坏死。

39.根据权利要求32所述的方法，其中所述肽进一步包括N末端修饰、C末端修饰、可检测标签、细胞穿透肽(CPP)、非天然氨基酸、肽缀合物、环肽或其组合。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述可检测标签选自由以下组成的组：荧光标签、显色标签、供体/受体对的成员、稳定同位素以及其任何组合。

41.根据权利要求39所述的方法，其中所述CPP选自由以下组成的组：穿膜肽、Tat肽、Tat肽变体、pVEC、嵌合转运素、MPG肽、线性和环状聚精氨酸、R₈、R₉、R₆W₃、EB1、VP22、模型两亲性肽(MAP)、Pep-1和Pep-1相关肽、基于融合序列的蛋白质(FBP)、转运素模拟物7(TP-7)、TP-9、TP-10、铜蓝蛋白和铜蓝蛋白衍生物、鱼精蛋白、鱼精蛋白片段/SV40肽、聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸、组氨酸-赖氨酸肽、聚精氨酸、含有肽的复合环状聚阳离子精氨酸和gp41融合序列。

42.根据权利要求32所述的方法，其中所述肽进一步包括递送媒剂。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述递送媒剂选自由以下组成的组：纳米颗粒、脂质体、树状大分子、胶束、纳米乳剂、纳米悬浮液、泡囊、纳米囊、磁性纳米颗粒、基于脂蛋白的载体和脂质复合物纳米颗粒。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述脂质复合物纳米颗粒包括1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、胆固醇、DOPE、TPGS或其组合。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述脂质复合物纳米颗粒包括摩尔比为约10:90至90:10的DOTMA和胆固醇。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述脂质复合物纳米颗粒包括摩尔比为约40:50至50:39的DOTMA和胆固醇。

47.根据权利要求44所述的方法，其中所述脂质复合物纳米颗粒包括摩尔比为约50:49:1的DOTMA、胆固醇和TPGS。

48.根据权利要求43所述的方法，其中脂质:肽质量比为约8:1、约6:1、约5:1、约10:1、约12.5:1、约15:1、约20:1、约25:1、约30:1或约35:1。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述脂质:肽质量比为约12.5:1。

50.根据权利要求48所述的方法，其中所述脂质:肽质量比为约10:1。

51.根据权利要求32所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用抗癌治疗。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述抗癌治疗选自由以下组成的组：化学疗法、放射治疗、免疫疗法、肿瘤切除以及其任何组合。

53.根据权利要求51所述的方法，其中所述抗癌治疗在施用所述药物组合物之前施用、与施用所述药物组合物同时施用或在施用所述药物组合物之后施用。

54.根据权利要求51所述的方法，其中所述抗癌治疗为抗癌剂，所述抗癌剂选自由以下组成的组：帕博西尼(palbociclib)、瑞博西尼(ribociclib)、阿贝西尼(abemaciclib)、奥希替尼(osirmetinib)、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、帕尼单抗(pantitumumab)、凡德他尼(vandetanib)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、维罗非尼(vemurafenib)、对甲苯磺酸索拉非尼(sorafenib tosylate)、PLX-4720、达拉菲尼(dabrafenib)、紫杉醇(paclitaxel)、顺铂(cisplatin)、多西他赛(docetaxol)、卡铂(carboplatin)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、CPT-11、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、雌莫司汀(estramustine)、卡莫司汀(carmustine)、阿霉素(adriamycin)、依托泊苷(etoposide)、三氧化二砷(arsenic trioxide)、伊立替康(irinotecan)、赫赛汀(Herceptin)、维罗非尼、埃罗替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、来曲唑(letrozole)、氟维司群(fulvestrant)和埃博霉素衍生物(epolhilonederivatives)。

55.根据权利要求32所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、脑癌、甲状腺癌、前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、子宫内膜癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、睾丸癌、头颈癌、皮肤癌、间皮内衬白细胞癌、食道癌、肌肉癌、结缔组织癌、肺癌、肾上腺癌、肾癌、骨癌或睾丸癌以及其转移。

56.根据权利要求32所述的方法，其中所述药物组合物的施用为皮内、皮下、静脉内、腹膜内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、经皮、经气管、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、胸骨内、口服、舌下、经颊、直肠、阴道、鼻或眼、或通过输注、吸入或雾化。