KR20170020320A - 결실 돌연변이 - Google Patents

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KR20170020320A
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프리벤 크라벤
엘리자베쓰 젠킨슨
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그린 바이올로직스 리미티드
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Abstract

본 발명은 박테리아 세포로부터 유전 물질을 제거하기 위한, 특히, 박테리아 게놈 내에 결실을 생산하기 위한 또는 내인성 박테리아 플라스미드를 제거하기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 당해 방법은 하나 또는 그 이상의 결실 벡터로의 박테리아 세포의 형질전환에 관한 것이며, 여기서, 결실 벡터는 모집단 내의 박테리아의 게놈 내의 또는 내인성 박테리아 플라스미드 내의 둘 또는 그 이상의 PAM/프로토스페이서를 표적화하는 둘 또는 그 이상의 crRNA의 생산을 지시할 수 있다.

Description

결실 돌연변이{DELETION MUTATIONS}
본 발명은 박테리아 세포로부터 유전 물질을 제거하기 위한, 특히 박테리아 게놈 내에 결실을 생산하기 위한 또는 내인성 박테리아 플라스미드를 제거하기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 당해 방법은 하나 또는 그 이상의 결실 벡터로의 박테리아 세포의 형질전환에 관한 것이며, 결실 벡터는 모집단 내의 박테리아의 게놈 내의, 또는 내인성 박테리아 플라스미드 내의 둘 또는 그 이상의 PAM/프로토스페이서를 표적화하는 둘 또는 그 이상의 crRNA의 생산을 지시할 수 있다. 그에 의해, 박테리아 DNA는 둘 또는 그 이상의 장소에서 절단되고, 생산된 선형화된 단편은 내인성 박테리아 메커니즘에 의한 분해에 민감할 것이다. 이것이 박테리아 게놈 내에서 발생한다면, 큰(major) 단편의 2개의 절단된 말단이 재연결될 수 있는 한편, 작은(minor) 선형 단편(더 짧음)은 분해된다. 박테리아 플라스미드가 표적화된다면, 심지어 큰 단편도 상대적으로 작을 것이며, 이에 따라, 그것은 재연결되기보다는 분해되어, 세포로부터의 플라스미드의 제거를 초래하기 쉽다.
아세톤, 부탄올 및 에탄올의 산업적 생산을 위하여 용매-생산 클로스트리디아(clostridia)가 1910년대 이래로 사용되어 왔다. 1950년대 동안 이들 용매를 합성하기 위한 더욱 효율적인 석유화학 기술의 확립에 의해, 그러한 대규모 박테리아 발효의 중단이 초래되었다. 그러나 현 환경에서, 지속가능하고 재생가능한 공정을 사용한 화학물질의 발생에 대한 압박이 증가되어, 용매의 생산을 위한 클로스트리디아 발효에 관심이 재개되고 있다. 또한, 이것은 몇몇의 게놈의 서열분석(sequencing) 및 RNA 서열분석 및 전사체학의 이용과 함께, 이들 용매발생 클로스트리디아의 생물학적 이해의 진전에 의해 보조된다. 이들 연구 영역은 부탄올을 과다생산하거나, 경쟁하는 부산물의 생산을 없애서, 용매발생 발효의 경제학을 추가로 개선시킬 수 있는 새로운 균주의 조작 가능성을 열었다.
이러한 게놈 정보의 유입을 이용하기 위하여, 상업적으로 적절한 균주의 생산을 야기할 연구 및 이해를 용이하게 하도록 재조합 클로스트리디아 및 기타 박테리아 균주를 생산하기 위한 신속하고 효율적인 방법이 여전히 필요하다.
종래에는 재조합 클로스트리디아 균주를 생산하는 것이 매우 어려웠다. 낮은 재조합 효율과 조합된 낮은 형질전환 효율은 안정적인 재조합 균주가 개선된 용매-관련 표현형을 나타내게 하는 노력을 방해한다. 지난 수년에 걸쳐, II형 인트론, 예를 들어, 타게트론(Targetron)(Sigma) 및 클로스트론(Clostron)(예를 들어, WO 2007/148091호)의 사용을 통한 유전자의 삽입 불활성화 및 '대립형질 결합 교환'(ACE, 예를 들어, WO 2009/101400호)의 사용을 통한 신규 경로 유전자의 통합을 가능하게 하는 기술이 개발되었으나; 그러한 방법에 의한 DNA의 섹션의 결실은 힘이 들고, 이들 방법은 내인성 플라스미드의 완전한 제거에 적용가능하지 않다.
대립형질 교환 방법을 설계하여, 상동성 재조합 방법을 통하여 프레임 내 결실 또는 특정 점 돌연변이를 지니는 클로스트리디아 균주를 생산하였다. 성공적인 재조합 균주의 분리 및 선택의 어려움으로 인하여, 이들은 일반적으로 비효율적이지만, 그들은 고도로 특이적일 수 있다(예를 들어, 문헌[Cartman et al., Appl. Environ. Microbiol. 78(13), 4683-90 (2012)]). 또한, 재조합 균주를 생산하기 위한 전이유전자 돌연변이유발과 같이 RNA 낙-다운 및 간섭 방법이 유용할 수 있다. 그러나 이들은 가치있는 연구 도구이지만, 이들 방법은 매우 특이적이거나 좁은 범위의 유전자를 표적화한다.
일부 경우에, 이들 방법이 필수 유전 물질 대 비-필수 유전 물질을 확인하기 위해 사용될 수 있거나, 완전한 오페론이 제거된 균주를 생산하기 위해 사용될 수 있기 때문에, 영역에 의해 표적화되지만, 비-특이적인 거대 게놈 물질의 섹션의 결실이 바람직하다. 또한, 그것은 일부 환경에서, 내인성 플라스미드를 신속하고 효율적으로 제거할 수 있는데 유용하다. 내인성 플라스미드의 제거에 의해, 플라스미드의 필수성에 관한 질문에 답할 수 있으며, 예를 들어, 메가플라스미드는 세포 생존에 필수적일 수 있지만, 미니-플라스미드는 비필수적일 수 있다. 또한, 내인성 플라스미드를 신속하게 제거하는 능력은 원점 양립불가능성이 효율적인 형질전환 방법을 간섭하는 경우에 유용할 수 있으며, 그에 의해, 연구 및 개발을 위해 필수적인 플라스미드-부재 균주를 제조한다. 이들 고유 플라스미드의 소실은 '천연적으로' 다수의 회차의 계대 및 선택을 통하여, 상당한 노력을 필요로 할 수 있다.
그 다음, 생산된 플라스미드-부재 또는 '결실을 지니는' 균주의 게놈 분석을 이용하여, 기질 흡수 메커니즘 및 용매의 생산과 잠재적으로 관련될 수 있는 미생물 생리학에 관하여 더 많이 이해할 수 있다. 예를 들어, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰은 α-아밀라제 효소, 및 용매 생산에 필수적인 sol 오페론을 인코딩하는 메가플라스미드를 지닌다. 일부 환경에서, 이러한 메가플라스미드는 균주 변성을 통해 소실될 수 있다. 클로스트리듐 아세토부틸리쿰에서, 메가플라스미드의 소실은 대사 유동을 조작하기 위한 출발 균주(M5)를 제공한다. 이것을 사용하여, 플라스미드의 소실로 제거되는 sol 오페론의 선택된 유전자만을 다시 보충함으로써 변경된 아세톤:부탄올:에탄올 용매의 비를 갖는 균주를 생산할 수 있다(예를 들어, 문헌[Nair et al., J. Bacteriol., 176(18), 5843-6, 1994]; 문헌[Sillers et al., Metab. Eng., 10(6), 321-32, 2008]; 문헌[Lee et al., Biotechnol. J., 4(10), 1432-1440, 2009]).
이들 게놈 변경을 이루기 위하여 잠재적으로 사용될 수 있는 방법은 전사 활성화제-유사 엔도뉴클레아제(TALEN, 예를 들어, US 8,420,782 B2호)이지만, 상기 기술은 진핵 게놈을 교정하기 위하여 개발되었으며, 아직 산업적으로 적절한 용매발생 클로스트리디아 균주에 사용하기 위해 구체적으로 조정된 적이 없다. 각 유전자 표적을 위한 TALEN의 조작 요구는 비용이 들고, 시간이 소모되며, 기술이 클로스트리디아에서 정밀하게 작용할 방식의 실제 능력은 그것이 가까운 장래에 광범위하게 허용가능한 도구가 되는 것에 불리한 것으로 여겨진다.
따라서, 요약하여, 고도로 특이적인 돌연변이 및 결실을 생산하기 위한 현재 이용가능한 방법은 모두 복잡한, 다-단계 및 시간-소모 절차이다. 다양한 선택된 유전자, 오페론 및 플라스미드의 중요성의 더욱 신속한 스크리닝 또는 조사를 보장하기 위하여, 유전 물질의 단편을 박테리아 게놈 DNA 내로부터 또는 박테리아에 내인적으로 존재하는 플라스미드로부터 간단히 그리고 신속하게 정밀하지 않아도 되는 방식으로 제거하는 방법이 훨씬 더 유용할 것이다.
따라서, 클로스트리디아 CRISPR/Cas 시스템의 사용에 기초한 신규한 방법이 개발되었다. (CRISPR는 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부(Clustered, Regularly Interspaced, Short, Palindromic Repeats)에 대한 약어이다.) 이들 시스템은 통상 '원핵 적응 면역계'로 기재되며, 박테리아 또는 조류 세포가 그 자신을 침입하는 DNA, 통상 파지 또는 플라스미드 DNA로부터 보호할 수 있는 수단이다.
CRISPR/Cas 시스템이 있는 세포는 짧은 단편을 '침입' DNA로부터 Cas 유전자 클러스터 내로 선택적으로 통합시킬 수 있다. 각 단편은 '스페이서'로 지칭되며, 직접 반복부가 측부 배치된다(flanked). 세포가 동일한 침입 DNA와 다시 마주치면, 세포는 침입 DNA를 적으로 인식할 것이며, Cas 엔도뉴클레아제로 침입 DNA를 절단함으로써 침입 DNA를 파괴할 것이다.
CRISPR/Cas 시스템이 침입 DNA에서 인식하는 서열은 '프로토스페이서'로 지칭되며, 게놈 내의 스페이서 카피에 대하여 동일성을 갖는다. 세포가 스페이서의 게놈 카피를 우연히 공격하지 않는 것을 확실히 하기 위하여, Cas I 또는 Cas II 시스템에서 프로토스페이서는 PAM 서열로 지칭되는 것과 회합된 짧은 서열을 가져야 한다. PAM 서열은 시스템의 유형에 따라 프로토스페이서 서열의 상류 또는 하류일 수 있다. 침입 DNA가 존재하지 않거나, 어떠한 방식으로든 돌연변이되면, 침입 DNA는 세포에 의해 더이상 인식되지 않을 것이며, 침입 DNA는 파괴되지 않을 것이다.
스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 cas9와 회합된 PAM 서열은 널리 알려져 있지만(문헌[Jiang et al., Nature Biotech. (March 2013), vol. 31, no. 3, pp. 233-239]); 그러나 클로스트리디아 시스템과 회합된 PAM은 이전에 확인된 적이 없다.
모든 원핵생물이 CRISPR/Cas 유전자 상동체를 갖는 것은 아니며, 그들 중에서, 그들은 몇몇 별개의 부류에 속한다(문헌[Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol., 9(6), 467-77. 2011]). 스트렙토코커스 피오게네스 및 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터의 II형 cas 9 시스템에 대한 다수의 연구가 공개되어 있다(예를 들어, 문헌[Jiang et al., Nature Biotech. (March 2013), vol. 31, no. 3, pp. 233-239]). 이것은 진핵 세포에서 이용하기 위한 게놈-교정 도구로 개발되었으며, 이는 예를 들어, 효모(문헌[DiCarlo et al., Nucleic Acids Research, 41(7), 4336-4343, 2013]), 제브라피시(문헌[Hwang et al., Nat. Biotechnol., 31(3), 227-9. 2013]) 및 포유류 세포(문헌[Ran et al., Nature Protocols, 8, 2281-2308, 2013])에서 성공적으로 사용되어 왔다.
진핵생물에서, CRISPR/Cas 시스템에 의해 생산되는 dsRNA 파단을 사용하여, 결실 및 기타 INDEL(DNA 내의 삽입 및 결실)을 생산하여, 진핵 세포에서의 비상동성 말단 연결(NHEJ) 경로의 존재 때문에, 사실상 임의의 유전자를 효율적으로 낙아웃시킬 수 있다. 그러나, 대부분의 박테리아에는 이러한 비상동성 말단 연결(NHEJ) 수선 메커니즘이 결여되어 있으며, 게놈 서열의 Cas9 절단은 유전자 결실의 생산보다는 오히려 오직 세포사만을 야기하는 것으로 여겨진다. 이것은 문헌[Barrangou and Marraffini, Molecular Cell, 54(2), 234?244, 2014]에 의한 검토에 요약되어 있다.
신속하고 효율적인 단일-단계 방법에서 박테리아 게놈 내의 결실의 생산을 가능하게 하는 신규한 방법이 이제 개발되었다.
또한, 이러한 신규한 방법을 사용하여 박테리아로부터 표적 내인성 플라스미드(메가플라스미드 포함)를 제거할 수 있다. 결실 벡터를 사용하여 플라스미드 서열 내의 둘 또는 그 이상의 위치를 표적화함으로써, 시스템은 플라스미드를 둘 또는 그 이상의 선형 단편으로 절단할 것이며, 이는 고유 세포 메커니즘에 의한 파괴에 감수성일 것이다. 전형적인 게놈과 비교하여 플라스미드의 상대적으로 작은 크기를 고려해 볼 때, 재연결이 발생하기 전에 후자의 완전한 분해가 발생하기 더 쉬워, 플라스미드의 소실이 초래된다. 이를 사용하여, 내인성 (메가)플라스미드가 숙주 생존에 필수적인 지를 결정할 수 있으며, 숙주 세포로의 플라스미드의 대사적 부담 또는 이익에 대한 이해를 제공할 수 있다. 실제로, 생산된 단편 모두가 그들이 재연결되기 보다는 분해되기에 충분히 작아야 하기 때문에, 내인성 플라스미드를 제거하기 위해 필요한 최소의 수의 절단 위치는 표적 플라스미드의 크기에 좌우되기 쉽다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 박테리아 게놈 내의 결실의 생산 방법을 제공하며, 여기서, 박테리아는 CRISPR/Cas 시스템을 포함하고, 당해 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(a) 박테리아의 모집단을 하나 또는 그 이상의 결실 벡터로 형질전환시키는 단계로서, 결실 벡터(들)가 모집단 내의 박테리아의 게놈에서 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서를 표적화하는 제1 및 제2 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 단계;
(b) 박테리아의 모집단을 제1 및 제2 crRNA가 생산되는 조건하에 배양하는 단계로서, 제1 및 제2 crRNA가 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서를 표적화하고, 제1 및 제2 crRNA가 모집단 내의 하나 또는 그 이상의 박테리아에서 게놈의 이중 절단을 촉진시키고, 박테리아 게놈 DNA의 2개의 절단된 말단이 재연결되는 단계; 및
(c) 상기 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서 사이에서 박테리아 게놈 DNA 내의 결실을 포함하는 유전체를 가지는 하나 또는 그 이상의 박테리아를 분리하는 단계.
단계 (c)에서, 박테리아 게놈 DNA 내의 결실은 바람직하게는 적어도 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서를 임의로 포함하는 그 사이의 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나의 결실 벡터는 모집단 내의 박테리아의 게놈에서 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서를 표적화하는 제1 및 제2 crRNA 둘 모두의 생산을 지시할 수 있다.
바람직하게는, 결실 벡터는 Cas 직접 반복 요소가 측부 배치된 제1 및 제2 Cas 스페이서 요소를 포함한다.
제1 및 제2 CRISPR 스페이서는 결실 벡터 내에 단일의 Cas 어레이로 또는 개별 Cas 어레이로 존재할 수 있다.
이러한 구현예에서, 결실 벡터는 바람직하게는 다음을 포함한다:
(i) Cas 리더 요소,
(ii) 제1 Cas 직접 반복 요소,
(iii) 제1 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 제1 Cas 스페이서 요소,
(iv) 제2 Cas 직접 반복 요소,
(v) 제2 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 제2 Cas 스페이서 요소, 및
(vi) 제3 Cas 직접 반복 요소.
대안적으로, 결실 벡터는 바람직하게는 2개의 어레이를 포함하며, 제1 어레이는
(i) 제1 Cas 리더 요소,
(ii) 제1 Cas 직접 반복 요소,
(iii) 제1 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 제1 Cas 스페이서 요소, 및
(iv) 제2 Cas 직접 반복 요소를 포함하고,
제2 어레이는
(v) 제2 Cas 리더 서열,
(vi) 제3 Cas 직접 반복 요소,
(vii) 제2 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 제2 Cas 스페이서 요소, 및
(viii) 제4 Cas 직접 반복 요소를 포함한다.
다른 구현예에서, 제1 결실 벡터는 모집단 내의 박테리아의 게놈에서 제1 PAM/프로토스페이서를 표적화하는 제1 crRNA의 생산을 지시할 수 있고; 제2 결실 벡터는 모집단 내의 박테리아의 게놈에서 제2 PAM/프로토스페이서를 표적화하는 제2 crRNA의 생산을 지시할 수 있다.
이러한 구현예에서, 제1 결실 벡터는 바람직하게는
(i) 제1 Cas 리더 요소,
(ii) 제1 Cas 직접 반복 요소,
(iii) 제1 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 제1 Cas 스페이서 요소,
(iv) 제2 Cas 직접 반복 요소를 포함하고/거나,
제2 결실 벡터는 바람직하게는
(v) 제2 Cas 리더 요소,
(vi) 제3 Cas 직접 반복 요소,
(vii) 제2 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 제2 Cas 스페이서 요소,
(viii) 제4 Cas 직접 반복 요소를 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 박테리아 게놈 내의 재배열의 생산 방법을 제공하며, 박테리아는 CRISPR/Cas 시스템을 포함하고, 당해 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(a) 박테리아의 모집단을 하나 또는 그 이상의 결실 벡터로 형질전환시키는 단계로서, 결실 벡터(들)가 모집단 내의 박테리아의 게놈에서 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서를 표적화하는 제1 및 제2 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 단계;
(b) 박테리아의 모집단을 제1 및 제2 crRNA가 생산되는 조건하에 배양하는 단계로서, 제1 및 제2 crRNA가 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서를 표적화하고, 제1 및 제2 crRNA가 모집단 내의 하나 또는 그 이상의 박테리아에서 게놈의 이중 절단을 촉진시키는 단계; 및
(c) 게놈이, 비-형질전환된 대조군 박테리아에 비하여 박테리아 게놈 DNA에 재배열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 박테리아를 분리하는 단계.
다른 구현예에서, 본 발명은 박테리아 내의 내인성 플라스미드로부터의 DNA의 제거 또는 결실 방법을 제공하며(이는 플라스미드의 소실을 초래하기 쉬움), 박테리아는 CRISPR/Cas 시스템을 포함하고, 당해 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(a) 박테리아의 모집단을 하나 또는 그 이상의 결실 벡터로 형질전환시키는 단계로서, 결실 벡터(들)가 모집단 내의 박테리아에서 표적 플라스미드 내의 둘 또는 그 이상의 PAM/프로토스페이서를 표적화하는 둘 또는 그 이상의 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 단계;
(b) 박테리아의 모집단을 둘 또는 그 이상의 crRNA가 생산되는 조건하에 배양하는 단계로서, 둘 또는 그 이상의 crRNA가 하나 또는 그 이상의 PAM/프로토스페이서를 표적화하며, 둘 또는 그 이상의 crRNA가 둘 또는 그 이상의 위치에서 표적 플라스미드의 절단을 촉진시켜, 모집단 내의 둘 또는 그 이상의 박테리아에서 선형화된 DNA 단편을 생산하고, 선형화된 단편이 내인성 세포 메커니즘에 의한 분해를 겪는 단계; 및
(c) 표적 플라스미드가 결여된 하나 또는 그 이상의 박테리아를 분리하는 단계.
바람직하게는 선형화된 단편은 (비효율적인) 말단 재연결 과정이 플라스미드를 수선할 수 있기 이전에, 내인성 세포 메커니즘에 의한 분해를 겪는다.
박테리아의 모집단 내의 박테리아는 CRISPR/Cas 시스템을 가져야 한다. 이러한 CRISPR/Cas 시스템은 제1 및 제2 crRNA 또는 둘 또는 그 이상의 crRNA를 사용하여, 염색체 DNA 또는 다른 표적 DNA, 예를 들어, 표적 플라스미드, 바람직하게는 박테리아의 내인성 플라스미드를 절단할 수 있는 것일 것이다.
일부 경우에, 박테리아 모집단 내에 오염이 존재할 수 있음이 허용될 것이다. 본원에 사용되는 용어 "박테리아의 모집단"은 주로 결실 벡터로 형질전환시키고자 하는 박테리아를 말한다.
바람직하게는 CRISPR/Cas 시스템은 I형 CRISPR/Cas 시스템이다.
모집단 내의 박테리아는 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 가질 수 있거나, CRISPR/Cas 시스템은 이종일 수 있다. 예를 들어, 이종 CRISPR/Cas 시스템은 플라스미드-기반일 수 있다.
바람직하게는, CRISPR/Cas 시스템은 내인성 CRISPR/Cas 시스템이고, 다시 말하면, 그것은 야생형 박테리아에 존재한다. 본 발명의 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템은 플라스미드-기반의 시스템이 아니다.
모집단 내의 박테리아는 예를 들어, 그람(Gram)-양성 또는 그람-음성 박테리아일 수 있다. 바람직하게는, 박테리아는 그람-양성이다.
일부 구현예에서, 박테리아는 포자-형성 박테리아이다. 다른 구현예에서, 박테리아는 당분해 박테리아이다.
박테리아는 호기성 또는 혐기성 박테리아일 수 있다. 바람직하게는, 박테리아는 혐기성 박테리아이다. 박테리아는 호열성 박테리아일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 박테리아는 기질을 RCOOH로, 예를 들어, 아세트산염 및/또는 부티르산염으로 전환시킬 수 있다. 이러한 맥락에서, R은 지방족 C1-C5, 바람직하게는 C1-3, 알킬 또는 알케닐기이다. 또한, 박테리아는 RCOOH를 용매로, 바람직하게는 아세톤, 에탄올 및/또는 부탄올 중 하나 또는 그 이상으로 전환시킬 수 있다.
다른 구현예에서, 박테리아는 용매-생산 박테리아이다. 본원에 사용되는 용어 "용매-생산"은 박테리아가 용매, 바람직하게는, 아세톤, 에탄올, 프로판올 및/또는 부탄올과 같은 용매를 생산할 수 있는 박테리아임을 의미한다. 특히 바람직한 특정 구현예에서, 박테리아는 에탄올, 아세톤 및 부탄올을 생산할 수 있다. 바람직하게는, 박테리아는 부탄올-생산 박테리아 또는 부탄올-내성 박테리아이다.
일부 바람직한 구현예에서, 박테리아는 클로스트리듐 속의 것이다. 바람직한 클로스트리듐 종은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum), 클로스트리듐 아르부스티(C. arbusti), 클로스트리듐 아우란티부티리쿰(C. aurantibutyricum), 클로스트리듐 베이예린키이(C. beijerinckii), 클로스트리듐 셀룰로보란스(C. cellulovorans ), 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰(C. cellulolyticum), 클로스트리듐 써모셀룸(C. thermocellum), 클로스트리듐 써모부티리쿰(C. thermobutyricum), 클로스트리듐 파스투리아눔(C. pasteurianum), 클로스트리듐 클루이베리(C. kluyveri), 클로스트리듐 노브이이(C. novyi), 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(C. saccharobutylicum), 클로스트리듐 써모석시노게네스(C. thermosuccinogenes), 클로스트리듐 써모팔마리움(C. thermopalmarium), 클로스트리듐 사카롤라이티쿰(C. saccharolyticum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(C. saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 티로부티리쿰(C. tyrobutyricum), 클로스트리듐 테타노모르품(C. tetanomorphum), 클로스트리듐 마그눔(C. magnum), 클로스트리듐 륭달리(C. ljungdahlii), 클로스트리듐 오토에타노게눔(C. autoethanogenum), 클로스트리듐 부티리쿰(C. butyricum), 클로스트리듐 푸니세움(C. puniceum), 클로스트리듐 디올리스(C. diolis), 클로스트리듐 호모프로피오니쿰(C. homopropionicum) 및 클로스트리듐 로세움(C. roseum)을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 박테리아는 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 균주 N1, 예를 들어, N1-4이다. 본 발명의 다른 구현예에서, 박테리아는 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT)이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-504이다.
다른 바람직한 구현예에서, 박테리아는 클로스트리듐 파스투리아눔(예를 들어, DSM 525), 클로스트리듐 티로부티리쿰(예를 들어, ATCC 52755) 또는 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(예를 들어, NCP 258 및 NCP 262) 또는 클로스트리듐 종 DL-VIII이다.
다른 바람직한 구현예에서, 박테리아는 바실러스 속의 박테리아이다. 다른 바람직한 구현예에서, 박테리아는 악티노마이세탈레스(Actinomycetales) 목의 박테리아이다. 다른 구현예에서, 박테리아는 바람직하게는 스트렙토코커스 또는 에스케리키아 콜라이가 아니다.
박테리아는 바람직하게는 내인성 말단-연결 효소 또는 메커니즘을 갖는 것이다. 다른 구현예에서, 박테리아는 이종 말단-연결 효소 또는 경로를 갖는 것이다.
표적 플라스미드는 내인성 플라스미드(해당 박테리아에서 천연적으로 발생)일 수 있다.
결실될 박테리아 DNA(게놈 또는 플라스미드)의 코어 영역은 박테리아의 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식될 수 있는 2개의 CRISPR PAM/프로토스페이서가 측부 배치된다.
PAM/프로토스페이서는 PAM 서열 및 프로토스페이서의 작용적 조합을 포함하는 박테리아 게놈 또는 표적 플라스미드 내의 서열이다. 각각의 PAM/프로토스페이서 서열은 사용되고 있는 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식될 수 있으며, 적절한 crRNA의 생산시에, 그것은 CRISPR/Cas 시스템에 의해 절단될 것이다.
본원에 사용되는 용어 "작용성 CRISPR/PAM 프로토스페이서"는 박테리아 게놈 또는 표적 플라스미드 내의 CRISPR/PAM 프로토스페이서를 인식하는 crRNA에 의해 인식될 수 있는 CRISPR PAM/프로토스페이서를 의미한다. 일부 경우에, 단일의 돌연변이(예를 들어, PAM 서열 내)가 CRISPR/PAM 프로토스페이서를 비작용성이 되게 하기에 충분할 수 있다.
PAM은 프로토스페이서-인접 모티프에 대한 약어이다. PAM 요소는 박테리아 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식될 수 있다. PAM 요소는 일반적으로 3 내지 6개 뉴클레오티드 길이이며, 각 박테리아 종에 특이적이다.
박테리아 게놈 또는 표적 플라스미드 내의 프로토스페이서에 관한 PAM 요소의 배향이 중요하다. 일부 박테리아 종에서, PAM 요소는 일반적으로 프로토스페이서의 5' 말단에 또는 그 근처에서 관찰되며; 다른 종에서, PAM 요소는 일반적으로 프로토스페이서의 3' 말단에 또는 그 근처에서 관찰된다.
PAM 요소는 박테리아 게놈 또는 표적 플라스미드의 어느 하나의 가닥에 존재할 수 있지만, Cas 스페이서 요소로서 선택된 서열은 (PAM 요소 및 프로토스페이서가 바로 인접하도록) PAM 요소와 동일한 DNA 가닥 상에 존재하여야 한다.
일부 연구에 의해, PAM 요소 내의 거의 임의의 돌연변이가 CRISPR/Cas 시스템에 의한 인식을 없앤다는 것이 밝혀졌다(예를 들어, 문헌[Jiang et al., Nature Biotech (March 2013), vol. 31, no. 3, pp. 233-239]). PAM/프로토스페이서는 각각 작용성 프로토스페이서에 더하여 작용성 PAM 요소를 가져야 한다. 본원에 사용되는 용어 "작용성 PAM 요소" 또는 "박테리아에서 작용성인 CRISPR PAM 요소"는 PAM 요소가 박테리아의 내인성 CRISPR/Cas 시스템에 의해, 또는 박테리아가 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 갖지 않는다면, 박테리아 내로 도입된 벡터-기반의 이종 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식될 수 있음을 의미한다.
1개 초과의 서열이 선택된 박테리아 종에서 PAM 요소로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 K-12로부터의 I-E CRISPR-Cas 시스템은 4개의 작용성 PAM 서열을 갖는 것으로 알려져 있으며(문헌[Gomaa et al. (2014). mBio, 5 (1): e00928-13 DOI: 10.1128/mBio.00928-13]), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT)에서, 적어도 4개의 효율적인 PAM 서열(CCC, CCT, CCA 및 CCG)이 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 확인되었다.
CRISPR/Cas 시스템(그의 내인성 CRISPR/Cas 시스템 또는 이종 플라스미드-유래 시스템)을 갖는 박테리아를 CRISPR 스페이서 및 인접 시험-PAM 요소를 포함하는 플라스미드로 형질전환시킴으로써 특정 박테리아 종에서 작용하는 PAM 요소의 능력을 시험할 수 있다. PAM 요소가 박테리아에서 작용성이면, PAM 요소-함유 플라스미드가 CRISPR/Cas 시스템에 의해 파괴될 것이며, 형질전환 효율은 유의미하게 감소될 것이다. 개념은 본원에 실시예 2에 예시되어 있다.
CRISPR 프로토스페이서는 crRNA에 의해 표적화되는 박테리아 게놈 또는 표적 플라스미드 내의 서열이다(단, 양립가능한 PAM 요소도 또한 적절하게 위치한다).
박테리아 게놈 내의 결실의 생산 방법의 단계 (a)에서, 박테리아의 모집단을 하나 또는 그 이상의 결실 벡터로 형질전환시키고, 결실 벡터(들)는 모집단 내의 박테리아의 게놈에서 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서를 표적화하는 제1 및 제2 crRNA의 생산을 지시할 수 있다.
이러한 단계 (a)의 목적은 2개의 crRNA의 생산을 위해 준비하는 것이다: 제1 crRNA는 박테리아 게놈 내의 제1 PAM/프로토스페이서에 결합할 것이며; 제2 crRNA는 박테리아 게놈 내의 제2 PAM/프로토스페이서에 결합할 것이다.
박테리아 내의 표적 플라스미드의 제거 방법의 단계 (a)에서, 박테리아의 모집단을 하나 또는 그 이상의 결실 벡터로 형질전환시키고, 결실 벡터(들)는 모집단 내의 박테리아에서 표적 플라스미드 내의 둘 또는 그 이상의 PAM/프로토스페이서를 표적화하는 둘 또는 그 이상의 crRNA의 생산을 지시할 수 있다.
이러한 단계 (a)의 목적은 둘 또는 그 이상의 crRNA의 생산을 위해 준비하는 것이며, 이는 표적 플라스미드 내의 하나 또는 그 이상의 PAM/프로토스페이서에 결합할 것이다.
박테리아 내의 표적(바람직하게는 내인성) 플라스미드의 제거 방법에서, 결실 벡터는 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 crRNA의 생산을 지시할 수 있다. 이들은 표적 플라스미드 내의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 PAM/프로토스페이서를 표적화할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "형질전환" 및 "형질전환하는"은 결실 벡터(들)가 박테리아 세포 내로 삽입되는 임의의 단계를 지칭한다. 이런 이유로, 그것은 특히 전기천공법, 컨쥬게이션 또는 트랜스펙션 중 임의의 형태를 포함한다.
결실은 프레임-내이거나, 프레임-내가 아닐 수 있다. PAM/프로토스페이서는 둘 모두/모두 결실 위치 내에 존재할 것이다. 바람직하게는, 결실은 PAM 또는 PAM/프로토스페이서의 적어도 부분을 포함하여, PAM/프로토스페이서가 더 이상 작용성이 되지 않게 한다(즉, 더 이상 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식되지 않음).
결실 벡터는 바람직하게는 환형 벡터이다.
결실 벡터는 바람직하게는 원점 요소, 가장 바람직하게는 그람 양성 원점 요소(예를 들어, "pBP1")를 갖는다.
결실 벡터는 또한, 적절한 선택 마커(예를 들어, 항생제 내성 유전자)를 포함할 수 있다.
결실 벡터는 박테리아 게놈(또는 표적 플라스미드) 내의 CRISPR/PAM 프로토스페이서를 인식하는 crRNA에 의해 인식될 수 있는 CRISPR PAM/프로토스페이서를 포함하지 않는다.
박테리아 게놈 내의 결실의 생산 방법에서, 단계 (b)는 박테리아의 모집단을 제1 및 제2 crRNA가 생산되는 조건하에 배양하는 것을 포함하며, 제1 및 제2 crRNA가 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서를 표적화하고, 제1 및 제2 crRNA가 모집단 내의 하나 또는 그 이상의 박테리아에서 게놈의 절단을 촉진시키고, 박테리아 게놈 DNA의 2개의 절단된 말단이 재연결된다.
이러한 단계에서, CRISPR PAM/프로토스페이서 둘 모두는 박테리아 게놈으로부터 제거되거나(결실에서), CRISPR PAM/프로토스페이서 둘 모두는 PAM/프로토스페이서를 인식하는 crRNA에 의해 인식될 수 없게 된다.
이러한 단계에서, 박테리아의 CRISPR/Cas 시스템(내인성 또는 이종)은 제1 PAM/프로토스페이서에 상응하는 게놈 서열 내의 위치에서, 그리고 제2 PAM/프로토스페이서에 상응하는 게놈 서열 내의 위치에서 박테리아 게놈 DNA를 절단할 것이다. 이런 이유로, 박테리아 게놈은 2회 절단되고, 선형화될 것이며, DNA의 결실된 섹션은 유리될 것이다. 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서 내의 실제 절단 위치 및 이에 따른 결실의 범위는 게놈 내의 2개의 PAM/프로토스페이서 사이의 거리에 좌우될 것이다. 게놈 DNA의 절단된 말단이 재연결 이전에 세포 메커니즘에 의해 트리밍될 가능성이 크다. 일부 경우에, 이러한 트리밍의 범위는 꽤 상당하여, 예를 들어, PAM/프로토스페이서의 쌍에 측부 배치된 수 kb의 서열의 소실을 초래할 수 있다. 최대 트리밍 범위는 인접 필수 유전자에 의해 결정될 수 있는데, 이는 (그러한 유전자 내로의) 추가의 트리밍이 생존가능하지 않을 것이기 때문이며, 말단 재연결을 위한 과정(들)과 경쟁할 것이다.
박테리아 내의 표적 플라스미드의 제거 방법에서, 단계 (b)는 박테리아의 모집단을 둘 또는 그 이상의 crRNA가 생산되는 조건하에 배양하는 것을 포함하고, 둘 또는 그 이상의 crRNA는 둘 또는 그 이상의 PAM/프로토스페이서를 표적화하고, 둘 또는 그 이상의 crRNA는 둘 또는 그 이상의 위치에서 표적 플라스미드의 절단을 촉진시켜, 모집단 내의 하나 또는 그 이상의 박테리아에서 선형화된 DNA 단편을 생산하고, 선형화된 단편이 내인성 세포 메커니즘에 의해 분해를 겪는다. 분해가 DNA 재연결보다 더 신속하게 발생하는 경우에, 플라스미드는 세포로부터 소실될 것이다.
이러한 단계에서, 표적 플라스미드는 CRISPR PAM/프로토스페이서에서 또는 그 근처에서 절단되어, 플라스미드의 둘 또는 그 이상의 선형 단편을 생산한다. 그러한 단편은 숙주 수선 메커니즘이 DNA를 재연결할 수 있기 이전에 숙주 세포 메커니즘에 의해 분해될 수 있다.
박테리아를 배양하기에 적합한 조건은 당업계에 널리 알려져 있을 것이다. 그러한 조건은 예를 들어, 문헌["Clostridia: Biotechnology and Medical Applications", Eds H. Bahl and P. Durre, ISBN 3-527-30175-5, especially section 3.4 "Growth conditions and nutritional requirements"]에 기재되어 있다. 상세사항은 또한, 문헌[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Volume appropriate to the chosen phylum of bacteria], 예를 들어, 문헌[Volume Three for the Firmicutes, ISBN 978-0-387-95041-9]에도 제공되어 있다.
용어 "crRNA"는 CRISPR RNA를 의미한다. crRNA는 CRISPR/Cas 시스템에 의해 절단되어야 하는 표적 스페이서 서열의 측부 배치된 짧은 직접 반복 서열로 이루어진 짧은 단일-가닥 RNA 분자이다.
"Cas 리더 요소"는 일반적으로 직접 반복 클러스터 내의 제1 반복부의 상류에서 관찰되는 DNA 요소이다. 그것은 crRNA의 생산을 촉진시키는데 도움을 주며, 다시 말하면, 그것은 RNA 프로모터로서 작용한다. 현재까지, 수많은 Cas 리더 서열이 확인되었으며, 그의 서열은 용이하게 임의의 특정 Cas 시스템에서 확립될 수 있다. 바람직하게는, Cas 리더 서열은 형질전환되는 박테리아 모집단 내에 존재하는 CRISPR/Cas 시스템에 상응하는 것이다.
Cas 직접 반복 서열은 박테리아의 모집단에 존재하는 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식되는 DNA 요소이다. 이들 직접 반복부는 일반적으로 25 내지 35개 뉴클레오티드 길이, 더욱 일반적으로 약 29 또는 30개 뉴클레오티드 길이이다.
직접 반복부는 동일한 서열의 것일 필요가 없다(일반적으로, 1 내지 2개의 뉴클레오티드의 차이가 Cas 단백질에 의해 용인됨). 직접 반복부는 일반적으로 헤어핀 루프를 형성할 수 있는 팔린드롬 영역을 갖는다.
임의의 하나의 CRISPR/Cas 시스템에 적합한 직접 반복부의 DNA 서열은 상기 시스템의 CRISPR/Cas 직접 반복부-스페이서 클러스터의 임의의 검사로부터 용이하게 관찰될 수 있다.
Cas 스페이서 요소는 관심 박테리아 모집단에 존재하는 CRISPR/Cas 시스템의 선호에 따라, PAM/프로토스페이서 내의 PAM 요소에 대하여 (바람직하게는 인접) 5'에서, 또는 PAM/프로토스페이서 내의 PAM 요소에 대하여 (바람직하게는 인접) 3'에서 관찰되는 20 내지 50개 뉴클레오티드(바람직하게는 30 내지 40개, 더욱 바람직하게는 36 내지 38개 뉴클레오티드)에 대하여 높은 수준의 서열 동일성을 갖는 20 내지 50개 뉴클레오티드(바람직하게는 30 내지 40개, 더욱 바람직하게는 36 내지 38개 뉴클레오티드)의 서열을 포함한다.
바람직하게는, 박테리아 게놈 또는 표적 플라스미드 내의 PAM 요소는 (박테리아 게놈 내의) 프로토스페이서 서열의 시작에 바로 인접한다.
게놈 DNA 또는 표적 플라스미드 내의 프로토스페이서와 결실 벡터(들) 내의 스페이서 요소 서열 간의 서열 동일성 정도는 각각 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 또는 100%이다.
바람직하게는, 비-프로토스페이서 요소와의 상호작용이 낮은 가능성으로 존재하도록 Cas 스페이서 서열이 선택된다.
제1 및 제2 Cas 스페이서 요소는 박테리아 게놈 내의 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서에 결합한다.
유사하게, Cas 스페이서 요소는 표적 플라스미드 내의 상응하는 위치에 결합한다.
최소 결실 범위는 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서 사이의 거리에 의해 정의된다.
바람직하게는 이러한 거리는 10 bp 내지 1000 kb, 더욱 바람직하게는 100 bp 내지 100 kb, 더더욱 바람직하게는 200 내지 500 bp이다.
결실 벡터는 항생제-내성 요소 또는 다른 선택 마커를 포함하여, 이에 따라, 벡터가 예를 들어, 특정 항생제, 예를 들어, 클로람페니콜, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신 등의 존재하에서 선택되게 할 수 있다. 바람직하게는, 결실 벡터는 (1개 초과가 존재하는 경우) 상이한 항생제에서의 그들의 선택을 가능하게 하는 항생제-내성 요소를 포함한다.
아미노산 서열 동일성 백분율 및 뉴클레오티드 서열 동일성은 BLAST 정렬 방법(문헌[Altschul et al. (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]; 및 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)을 사용하여 수득될 수 있다. 바람직하게는, 표준 또는 디폴트 정렬 파라미터가 사용된다.
단백질 데이터베이스에서 유사한 서열을 찾기 위하여 표준 단백질-단백질 BLAST(blastp)가 사용될 수 있다. blastp는 다른 BLAST 프로그램과 같이, 국소 유사성 영역을 찾기 위해 설계된다. 서열 유사성이 전체 서열에 걸쳐 있는 경우, blastp는 또한 전체 정렬을 보고할 것이며, 이는 단백질 확인 목적을 위한 바람직한 결과이다. 바람직하게, 표준 또는 디폴트 정렬 파라미터가 사용된다. 일부 예에서, "저 복잡성 필터"가 중단될 수 있다.
또한, BLAST 단백질 검색은 BLASTX 프로그램, 점수=50, 단어 길이=3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위하여 갭이 있는 정렬을 수득하기 위하여, Gapped BLAST(BLAST 2.0에서)는 문헌[Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 대안적으로, PSI-BLAST(BLAST 2.0에서)를 사용하여, 분자 간의 먼 관계를 검출하는 반복 검색을 수행할 수 있다(상기 문헌[Altschul et al. (1997)] 참조). BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST를 사용하는 경우, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.
뉴클레오티드 서열 비교에 관하여, MEGABLAST, 불연속-megablast 및 blastn을 사용하여, 이러한 목적을 달성할 수 있다. 바람직하게는, 표준 또는 디폴트 정렬 파라미터가 사용된다. MEGABLAST는 구체적으로 매우 유사한 서열 간에 긴 정렬을 효율적으로 찾기 위하여 설계된다. 불연속 MEGABLAST를 사용하여, 본 발명의 핵산과 유사하지만 동일하지 않은 뉴클레오티드 서열을 찾을 수 있다.
BLAST 뉴클레오티드 알고리즘은 질의를 워드로 지칭되는 짧은 부분수열로 나눔으로써 유사한 서열을 찾는다. 프로그램은 먼저 질의 워드에 대한 정확한 일치(워드 히트(hit))를 확인한다. 그 다음, BLAST 프로그램은 다수의 단계로 이들 워드 히트를 연장시켜, 갭이 있는 최종 정렬을 생산한다. 일부 구현예에서, BLAST 뉴클레오티드 검색은 BLASTN 프로그램, 점수=100, 워드 길이=12를 사용하여 수행될 수 있다.
BLAST 검색의 감수성을 지배하는 중요한 파라미터 중 하나는 워드 크기이다. blastn이 MEGABLAST보다 더 민감한 가장 중요한 이유는 그것이 더 짧은 디폴트 워드 크기를 사용한다는 점이다(11). 이 때문에, blastn은 다른 유기체 유래의 관련 뉴클레오티드 서열에 대한 정렬을 찾는데 있어서 MEGABLAST보다 더 낫다. 워드 크기는 blastn에서 조정가능하며, 디폴트 값으로부터 최소 7까지 감소시켜, 검색 민감성을 증가시킬 수 있다.
더욱 민감한 검색은 신규하게 도입된 불연속 megablast 페이지(www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Newsltr/FallWinter02/blastlab.html)를 사용함으로써 달성될 수 있다. 이러한 페이지는 문헌[Ma et al. (Bioinformatics. 2002 Mar; 18(3): 440-5)]에 의해 보고된 것과 유사한 알고리즘을 사용한다. 불연속 megablast는 정렬 연장을 위한 씨드로서 정확한 워드 일치를 필요로 하는 것보다는, 더 긴 주형의 창 내의 불연속 워드를 사용한다. 코딩 방식에서, 제1 및 제2 코돈 위치에서 일치를 찾는데 집중하면서, 제3 위치에서 불일치를 무시함으로써 제3 염기 워블링(wobbling)을 고려한다. 동일한 워드 크기를 사용하는 불연속 MEGABLAST에서의 검색은 동일한 워드 크기를 사용하는 표준 blastn보다 더욱 민감하고 효율적이다. 불연속 megablast에 독특한 파라미터는 워드 크기: 11 또는 12; 주형: 16, 18 또는 21; 주형 유형: 코딩(0), 비-코딩(1) 또는 둘 모두(2)이다.
박테리아 게놈의 2개의 절단된 말단은 박테리아 DNA 수선 메커니즘에 의해 재연결될 것이다. (당업자는 본원의 "2개의 절단된 말단"에 대한 언급이 박테리아 게놈의 2개의 이중-가닥 DNA 말단을 지칭하며, 이것이 기술적으로 4개의 DNA 가닥을 포함하는 것을 용이하게 알 것이다.)
예를 들어, 메가플라스미드 또는 플라스미드의 절단으로부터 생산되는 더 작은 단편은 재연결되지 않는 대신에, 재연결이 발생할 수 있기 이전에, 세포 메커니즘에 의해 분해될 수 있다.
결실은 종종 조악한 결실일 것이며, 다시 말하면, 결실은 종종 Cas 효소에 의해 절단되는 박테리아 게놈의 2개의 말단 간의 정밀한 재연결이 아닐 것이다. 예를 들어, 세포 수선 메커니즘은 절단된 말단을 처리하여, 하나의 또는 잠재적으로 더 많은 추가의 뉴클레오티드의 결실을 초래할 수 있다. 예를 들어, 결실은 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서 위치가 측부 배치된 DNA의 영역의 한 측 또는 양측 상에 1 내지 5 kb, 5 내지 10 kb, 10 내지 30 kb, 30 내지 50 kb 또는 50 내지 100 kb DNA의 결실을 포함할 수 있다.
박테리아 게놈 내의 결실의 생산 방법에서, 단계 (c)는 게놈이 박테리아 게놈 DNA에서 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서를 임의로 포함하여 그 사이에 결실을 포함하는 하나 또는 그 이상의 박테리아를 분리하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 결실은 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서가 측부 배치된 DNA의 영역의 각 측 상의 적어도 1 내지 10 kb의 측부 배치된 DNA에 더하여, 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서를 포함한다.
요망되는 DNA 결실은 갖는 박테리아는 그것이 선형 DNA일 것이며, 이에 따라, 숙주 세포 메커니즘에 의해 분해(예를 들어, 내인성 뉴클레아제에 의해 분해)되기 쉽다는 사실 때문에, 결실된 DNA(2개의 CRISPR/Cas 절단 위치를 임의로 포함하여 그의 사이)를 용이하게 소실할 것이다. 결실된 DNA 섹션은 그것이 분해 전에 재연결될지라도, 세포에서의 안정적인 유지를 위해 필수적인 유전 요소(예를 들어, 적절한 원점)의 전부를 함유하지 않을 것 같다.
분리된 박테리아는 게놈의 2개의 절단된 말단이 재연결되는 것이다.
내인성 플라스미드의 제거 방법에서, 단계 (c)는 이전에 하나 또는 그 이상의 PAM/프로토스페이서를 지녔던 무손상 또는 비절단된 표적 플라스미드가 결여된 하나 또는 그 이상의 박테리아를 분리하는 것을 포함한다.
선택되거나 분리되는 박테리아는 생 박테리아일 것이다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 박테리아 게놈에 결실을 생산하는 단계를 포함하는, 돌연변이된 박테리아의 제조 방법을 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해, 표적 메가플라스미드 또는 다른 플라스미드, 바람직하게는 내인성 플라스미드가 결여된 돌연변이된 박테리아의 제조 방법을 추가로 제공한다.
플라스미드에서, 당해 방법은 완전한 플라스미드의 제거를 야기하지 않고, 대신에, 2개(또는 그 이상)의 표적 위치를 포함하는 DNA의 섹션이 결여된 더 작은 플라스미드의 생산을 초래하는 결실을 생산할 것이다. 이것은 더 큰 플라스미드에서 더 쉽게 관찰되는데, 이는 더 큰 플라스미드가 더 작은 플라스미드보다 필수 요소, 예를 들어, 적합한 원점에 영향을 미치는 결실의 기회가 더 적게 존재하므로, 큰 결실을 용인할 수 있을 가능성이 더 크기 때문이다.
또한, 본 발명은 게놈이 본 발명의 방법에 의해 생산되는 결실을 갖는 박테리아를 제공한다.
게다가, 본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 표적 메가플라스미드 또는 플라스미드, 바람직하게는 내인성 (메가)플라스미드가 소실되게 한 박테리아를 제공한다.
도 1은 다수의 클로스트리디아 종 유래의 직접 반복 서열의 정렬을 보여준다.
도 2는 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT)로의 플라스미드의 형질전환 효율에 대한 PAM 서열의 영향을 보여준다.
도 3은 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT)의 야생형 서열을, 실시예 3에서 생산된 결실 균주 중 하나로부터의 동일한 영역의 게놈 서열 데이터와 비교한다. https://www.sanger.ac.uk/resources/software/artemis/에서 아르테미스(Artemis) 게놈 브라우징 툴을 사용하여 다이어그램을 제작하였다.
실시예
실시예 1: 다수의 클로스트리디아 종 유래의 직접 반복 서열의 정렬
목적: 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 일부 직접 반복 서열을 확인하기 위함.
방법:
직접 반복 및 스페이서 서열은 CRISPRFinder 프로그램(Grissa, I., Vergnaud, G., & Pourcel, C. (2007))을 사용하여 관찰되었다. CRISPRFinder: 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부를 확인하기 위한 웹 도구(Nucleic Acids Res., 35, W52-7).
결과:
다수의 클로스트리디아 종 유래의 직접 반복 서열의 선택은 도 1에 나타나 있다. 일부 경우에, 특정 균주는 1개 초과의 서열을 가지며, 그래서, 가장 빈번하게 사용되는 직접 반복 서열(들)이 여기 포함된다. 약어는 하기와 같다: C_saccharoper = 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT) 또는 N1-504), C_saccharob = 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(NCP258 또는 NCP262, _1 및 _2는 2개의 주요 DR 클러스터를 나타냄), C_tyro = 클로스트리듐 티로부티리쿰(ATCC 52755, _1 및 _2는 2개의 주요 DR 클러스터를 나타냄), C_pasteurianum = 클로스트리듐 파스투리아눔(DSM 525), C_autoethanogenum = 클로스트리듐 오토에타노게눔(DSM10061), C_sp_DLVIII = 클로스트리듐 종(DL-VIII).
실시예 2: 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4( HMT )에서의 PAM 서열의 확인
목적: 추정의 PAM 서열의 유효성을 시험하는 방법을 입증하기 위함.
방법:
클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT)의 주요 직접 반복부 클러스터로부터의 스페이서_53의 서열을 클로스트리디아 셔틀 벡터, pMTL83251로 클로닝하였다. 이러한 스페이서 요소의 5' 말단에 바로 인접하여, 예측된 PAM 서열 CCC, CCG, CCT 및 비-PAM 서열 GAC를 포함하는 다양한 상이한 트리뉴클레오티드 조합을 혼입하였다. 작용성 PAM 서열과 정확하게 조합되는 경우, 스페이서 요소는 프로토스페이서로 작용한다.
플라스미드를 표준 전기천공법 프로토콜을 사용하여 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT)로 형질전환시킨 다음, 5% 글루코스도 함유하는 클로스트리디아 성장 배지(CGM)에서의 하룻밤 회복 단계로 이어졌다. 그 다음, 혼합물을 5% 글루코스 및 40 ㎍/㎖ 에리트로마이신을 함유하는 CGM 아가 플레이트 상으로 스프레딩하고, 32℃에서 무산소 캐비넷에 적어도 48시간 동안 두었다. 그 다음, 콜로니를 계수하여, 빈 벡터의 형질전환에 비한 형질전환 효율의 변화를 결정하였다.
750 ㎖ dH2O에 하기의 양을 용해시킴으로써 CGM 배지를 제조하고: 5.0 g 효모 추출물, 0.75 g K2HPO4, 0.75 g KH2PO4, 0.40 g MgSO4.7H2O, 0.01 g FeSO4.7H2O, 0.01 g MnSO4.4H2O, 1.0 g NaCl, 2.0 g (NH4)2SO4, 2.0 g 아스파라긴(그리고, 고체 배지를 제조한다면, 15 g의 박테리아 아가 번호 1), 오토클레이브시켰다. 배지의 pH(보통 6.6의 영역)를 조정하지 않았다. 20%(w/v) 글루코스 용액(최종 250 ㎖의 부피를 제공하기 위하여 충분한 dH2O 중 용해된 50 g 글루코스)을 제조하고, 따로 오토클레이브시켰다. 일단 냉각되면, 글루코스 및 CGM 용액을 필요에 따라 조합하였다.
결과:
상이한 플라스미드의 형질전환의 상대적 효율은 도 2에 제시되어 있다. 빈 플라스미드 pMTL83251 및 PAM 서열 없이 스페이서_53을 지니는 플라스미드 둘 모두는 콜로니의 론(lawn)을 제공하였다. 5' CCC(PAMC), CCT(PAMT) 또는 CCA(PAMA)에 인접한 스페이서_53을 지니는 플라스미드는 유의미하게 더 적은 콜로니를 제공하였다.
실시예 3: 조악한 결실 방법 예시
목적: 본 발명의 방법이 큰 DNA의 단편을 결실시키기 위해 조정될 수 있는 방법을 보여주기 위함.
방법:
후보 프로토스페이서 요소(이러한 박테리아 시스템에서 작용성인 것으로 알려져 있는 PAM 서열의 인접 3'에 위치)의 선택을 단일의 표적 유전자에서 확인하고, 이들로부터, 대략 1 kb 떨어져 있는(게놈 DNA에서) 2개를 선택하고, 이를 이러한 실시예에 있어서, 프로토스페이서_1 및 프로토스페이서_2로 명명하고, 이는 각각 표적 유전자에 5' 및 3'으로 위치된다. pMTL82154 백본에 기초하여 결실 벡터를 설계하고 작제하였다. 그것은 리더 서열, 제1 직접 반복부, 스페이서_1(잠재적인 프로토스페이서_1에 상응), 제2 직접 반복부, 스페이서_2(잠재적인 프로토스페이서_2에 상응) 및 제3 직접 반복부를 지녔다.
이러한 결실 벡터를 표준 전기천공 방법을 사용하여 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT) 내로 형질전환시켰다. 결실 벡터는 세포 내로 형질전환되는 경우, Cas-매개의 유전자의 절단 및 이후의 유전 물질의 소실을 초래하였다.
이러한 방법을 사용하여 2개의 콜로니를 회수하였으며, 그 중 하나를 이후에 서열분석하였다. 이에 의해, 본 발명의 방법이 모 균주에 비하여 29205개 뉴클레오티드 결실을 생산한 것이 드러났다. 결실된 섹션은 2개의 표적화된 PAM/프로토스페이서 위치 사이의 1 kb 영역 모두를 포함하였다(도 3 참조).
돌연변이 균주의 게놈 서열 내에서, 결실 위치에 걸쳐 있는 서열 데이터 판독은 하기와 같았다:
Figure pct00001
물결 선으로 밑줄 그은 처음 27개 뉴클레오티드는 위치 5709460 내지 5709486에서의 야생형 게놈과 일치한다. 파선으로 밑줄 그은 마지막 74개 뉴클레오티드는 위치 5738692 내지 5738765에서의 야생형 게놈과 일치한다. 총 결실 길이는 5738692-1-5709486 = 29205개 뉴클레오티드이다.
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Claims (22)

  1. 박테리아 게놈 내의 결실의 생산 방법으로서, 상기 박테리아가 CRISPR/Cas 시스템을 포함하고, 상기 방법이 하기의 단계를 포함하는 방법:
    (a) 박테리아의 모집단을 하나 또는 그 이상의 결실 벡터로 형질전환시키는 단계로서, 상기 결실 벡터(들)가 상기 모집단(population) 내의 박테리아의 게놈에서의 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서(PAM/Protospacer)를 표적화하는 제1 및 제2 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 단계;
    (b) 상기 박테리아의 모집단을 제1 및 제2 crRNA가 생산되는 조건하에 배양하는 단계로서, 상기 제1 및 제2 crRNA가 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서를 표적화하고, 상기 제1 및 제2 crRNA가 상기 모집단 내의 하나 또는 그 이상의 박테리아에서 게놈의 이중 절단(dual cleavage)을 촉진시키고, 상기 박테리아 게놈 DNA의 2개의 절단된 말단이 재연결(rejoin)되는 단계; 및
    (c) 상기 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서 사이에서 박테리아 게놈 DNA 내의 결실을 포함하는 유전체를 가지는 하나 또는 그 이상의 박테리아를 분리하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나의 결실 벡터는 모집단 내에서 박테리아의 게놈에서 제1 및 제2 PAM/프로토스페이서를 표적화하는 제1 및 제2 crRNA 둘 모두의 생산을 지시할 수 있는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 결실 벡터가 제1 및 제2 crRNA를 인코딩하는, Cas 직접 반복 요소가 측부 배치된 제1 및 제2 Cas 스페이서 요소(CRISPR Spacer Elements)를 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제1 및 제2 CRISPR 스페이서 요소가 상기 결실 벡터 내에 단일의 Cas 어레이로 또는 상기 결실 벡터 내에 개별 Cas 어레이로 존재하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 결실 벡터가
    (i) Cas 리더 요소,
    (ii) 제1 Cas 직접 반복 요소,
    (iii) 제1 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 제1 Cas 스페이서 요소,
    (iv) 제2 Cas 직접 반복 요소,
    (v) 제2 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 제2 Cas 스페이서 요소, 및
    (vi) 제3 Cas 직접 반복 요소:를 포함하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 결실 벡터가 2개의 어레이를 포함하며, 제1 어레이가
    (i) 제1 Cas 리더 요소,
    (ii) 제1 Cas 직접 반복 요소,
    (iii) 제1 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 제1 Cas 스페이서 요소,
    (iv) 제2 Cas 직접 반복 요소를 포함하고,
    제2 어레이가
    (v) 제2 Cas 리더 요소,
    (vi) 제3 Cas 직접 반복 요소,
    (vii) 제2 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 제2 Cas 스페이서 요소, 및
    (viii) 제4 Cas 직접 반복 요소를 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 제1 결실 벡터가 상기 모집단 내의 박테리아의 게놈에서의 제1 PAM/프로토스페이서를 표적화하는 제1 crRNA의 생산을 지시할 수 있고; 제2 결실 벡터가 상기 모집단 내의 박테리아의 게놈에서의 제2 PAM/프로토스페이서를 표적화하는 제2 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제1 결실 벡터가
    (i) 제1 Cas 리더 요소,
    (ii) 제1 Cas 직접 반복 요소,
    (iii) 제1 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 제1 Cas 스페이서 요소,
    (iv) 제2 Cas 직접 반복 요소를 포함하고, 및/또는,
    상기 제2 결실 벡터가
    (v) 제2 Cas 리더 요소,
    (vi) 제3 Cas 직접 반복 요소,
    (vii) 제2 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 제2 Cas 스페이서 요소,
    (viii) 제4 Cas 직접 반복 요소를 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서, PAM/프로모스페이서 둘 모두가 상기 박테리아 게놈으로부터 제거되거나, PAM/프로토스페이서 둘 모두가 PAM/프로토스페이서를 인식하는 crRNA에 의해 인식될 수 없게 되는 방법.
  10. 박테리아로부터의 표적 내인성 플라스미드의 제거 방법으로서, 상기 박테리아가 CRISPR/Cas 시스템을 포함하고, 상기 방법이 하기의 단계를 포함하는 방법:
    (a) 박테리아의 모집단을 하나 또는 그 이상의 결실 벡터로 형질전환시키는 단계로서, 상기 결실 벡터(들)가 상기 모집단 내의 박테리아에서 표적 플라스미드 내의 하나 또는 그 이상의 PAM/프로토스페이서를 표적화하는 둘 또는 그 이상의 crRNA의 생산을 지시할 수 있는 단계;
    (b) 상기 박테리아의 모집단을 둘 또는 그 이상의 crRNA가 생산되는 조건하에 배양하는 단계로서, 상기 둘 또는 그 이상의 crRNA가 둘 또는 그 이상의 PAM/프로토스페이서를 표적화하며, 상기 모집단 내의 하나 또는 그 이상의 박테리아에서 선형화된 DNA 단편을 생산하기 위해 상기 둘 또는 그 이상의 crRNA가 둘 또는 그 이상의 위치에서 표적 플라스미드의 절단을 촉진시키고, 상기 선형화된 단편이 바람직하게는 내인성 세포 메커니즘에 의해 분해를 겪는 단계; 및
    (c) 상기 표적 플라스미드가 결여된 하나 또는 그 이상의 박테리아를 분리하는 단계.
  11. 제10항에 있어서, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 crRNA가 1, 2, 3, 4 또는 5개의 PAM/프로토스페이서를 표적화하는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 표적 플라스미드가 메가플라스미드 또는 내인성 플라스미드인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아가 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 갖는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아가 I형 CRISPR/Cas 시스템을 갖는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아가 그람(Gram) 양성 박테리아인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아가 비-고도의 재조합발생 박테리아(non-highly recombinogenic bacteria)인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아가 클로스트리디아(Clostridia) 강의 박테리아, 바람직하게는 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae) 목의 박테리아, 더욱 바람직하게는 클로스트리듐(Clostridium) 속의 박테리아이거나, 상기 박테리아가 악티노마이세탈레스(Actinomycetales) 목의 박테리아 또는 바실러스(Bacillus) 속의 박테리아인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 박테리아가 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum), 클로스트리듐 아르부스티(C. arbusti), 클로스트리듐 아우란티부티리쿰(C. aurantibutyricum), 클로스트리듐 베이예린키이(C. beijerinckii), 클로스트리듐 셀룰로보란스(C. cellulovorans ), 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰(C. cellulolyticum), 클로스트리듐 써모셀룸(C. thermocellum), 클로스트리듐 써모부티리쿰(C. thermobutyricum), 클로스트리듐 파스투리아눔(C. pasteurianum), 클로스트리듐 클루이베리(C. kluyveri), 클로스트리듐 노브이이(C. novyi), 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(C. saccharobutylicum), 클로스트리듐 써모석시노게네스(C. thermosuccinogenes), 클로스트리듐 써모팔마리움(C. thermopalmarium), 클로스트리듐 사카롤라이티쿰(C. saccharolyticum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(C. saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 티로부티리쿰(C. tyrobutyricum), 클로스트리듐 테타노모르품(C. tetanomorphum), 클로스트리듐 마그눔(C. magnum), 클로스트리듐 륭달리(C. ljungdahlii), 클로스트리듐 오토에타노게눔(C. autoethanogenum), 클로스트리듐 부티리쿰(C. butyricum), 클로스트리듐 푸니세움(C. puniceum), 클로스트리듐 디올리스(C. diolis), 클로스트리듐 호모프로피오니쿰(C. homopropionicum) 및 클로스트리듐 로세움(C. roseum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  19. 제1항 내지 제9항 및 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항의 방법에 의해 박테리아 게놈 내에 결실을 생산하는 단계를 포함하는 돌연변이된 박테리아의 제조 방법.
  20. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 방법에 의해 박테리아에서 표적 내인성 플라스미드를 제거하는 단계를 포함하는 돌연변이된 박테리아의 제조 방법.
  21. 게놈이 제1항 내지 제9항 및 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산되는 결실을 갖는 박테리아.
  22. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 방법에 의해 표적 내인성 플라스미드가 제거된 박테리아.
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