KR20170015715A

KR20170015715A - 암의 치료 또는 진단을 위한 lrig2의 용도

Info

Publication number: KR20170015715A
Application number: KR1020150108251A
Authority: KR
Inventors: 서대식; 배지현; 박시은
Original assignee: 재단법인 아산사회복지재단; 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2015-07-30
Filing date: 2015-07-30
Publication date: 2017-02-09
Also published as: KR101762250B1

Abstract

본 발명은 암의 치료 또는 진단을 위한 LRIG2의 용도에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 LRIG2(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 2) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 유효성분으로 포함하는 자궁내막암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 자궁내막암 진단용 바이오 마커, 자궁내막암 진단용 조성물, 자궁내막암 진단용 키트, 및 자궁내막암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

암의 치료 또는 진단을 위한 LRIG2의 용도{Use of LRIG2 for Diagnosis or Treatment of Cancer}

본 발명은 암의 치료 또는 진단을 위한 LRIG2의 용도에 관한 것이다.

자궁내막암(Endometrial carcinoma)은 가장 일반적인 부인과 암질환으로, 젊은 자궁내막암 환자의 치료 시, 임신가능성을 보존하기 위하여 선택적으로 프로게스테론(progesterone) 호르몬 치료를 한다. 그러나, 이러한 자궁내막암에 있어 프로게스테론의 효과에 대한 분자적 기반은 알려져 있지 않다.

한편, 막관통 류신-풍부 부위 단백질(transmembrane leucine-rich repeat protein)의 Lrig 패밀리 중 하나인 Lrig2(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 2)는 일부 발암성 수용체 티로신 키나제들을 음성적으로 조절하는 것으로 알려져 있으며, 마우스의 자궁에서 과발현되는 것으로 밝혀진 바 있다. 또한, Lrig 패밀리 중 하나인 Lrig1은 종양 억제자(tumor suppressor)로 제시되며, 이의 발현은 다른 종양 유형에서 감소되는 것으로 나타났다.

암의 분자생물학적 기초를 이해하고 효과적인 치료법을 개발하기 위한 방법은 암세포와 정상 세포간의 유전자 발현의 차이를 찾는 것이다. 정상 세포와 악성 세포 간에 정상-상태 mRNA 수준이 다를 것이라는 가정을 기초로 한 방법들은 차등적으로 발현되는 유전자를 찾는데 이용되고 있다.

그 중 RNA 간섭(RNA interference:RNAi)은 매우 특이적이고, 효율적으로 유전자 발현을 억제할 수 있는 메카니즘으로, 이는 목적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 가닥과 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 가닥으로 구성되는 이중가닥 RNA(dsRNA)를 세포 등에 도입하여 목적유전자 mRNA의 분해를 유도함으로서 목적유전자의 발현을 억제한다.

또한, 나노입자(nanoparticle)는 약물 전달, 유전자 전달, 세포 내 영상, 광선치료와 같은 생체의학 분야에서 촉망되는 도구로서 사용되어 왔으며, 특히 금 나노소재는 합성과 작용의 용이성, 화학적 안정성, 생체 적합성, 및 조정 가능한 광학적 및 전기적 특성으로 인해 많은 관심을 받고 있다.

이에, 본 발명자들은 이러한 분자생물학적 도구들을 이용하여 암에서의 Lrig2 유전자의 역할을 확인하였다.

본 발명자들은 자궁내막암을 치료하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 자궁내막암 세포주에 자궁내막암 호르몬 치료제로 이용되고 있는 프로게스테론을 처리한 경우 Lrig2의 발현 증가를 확인하였고, 이를 바탕으로 이러한 Lrig2의 과발현이 자궁내막암 세포주의 생존능을 감소시키는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 자궁내막암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 자궁내막암 진단용 바이오 마커를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 자궁내막암 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 자궁내막암 진단용 바이오 마커를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 자궁내막암 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 자궁내막암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 LRIG2(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 2, NCBI GenBank Gene ID: 9860) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 유효성분으로 포함하는 자궁내막암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 가장 큰 특징은 본 발명의 약학적 조성물이 LRIG2 유전자 또는 이의 단백질을 유효성분으로 이용하여 자궁내막암세포의 세포자멸사(apoptosis)를 활성화하여, 자궁내막암세포의 성장만을 특이적으로 억제함으로써, 자궁내막암을 예방 또는 치료하는 것이다.

이때, LRIG2 단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, NCBI GenBank Gene ID 9860인 LRIG2(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 2) 유전자가 코딩하는 단백질인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 LRIG2 유전자를 포함하는 발현벡터 또는 상기 발현벡터가 형질도입된 포유동물 세포를 유효성분으로 포함하는 자궁내막암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 LRIG2를 발현하는 유전자 치료용 발현벡터를 제공할 수 있다. 이때, 상기 발현벡터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터인 것이 바람직하고, 상기 바이러스성 벡터는 아데노 바이러스 벡터, 렌티바이러스를 포함하는 레트로바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스 벡터 또는 헤르페스-심플렉스 바이러스 벡터인 것이 바람직하다.

본 발명은 상기 발현벡터가 형질도입된 세포주를 제공할 수 있다. 이때 상기 세포주는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 정상 세포주 또는 암세포주인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 약학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 국소 주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 LRIG2(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 2, NCBI GenBank Gene ID: 9860) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질로써, 자궁내막암 환자에서 특이적으로 발현이 억제되는 것을 특징으로 하는 자궁내막암 진단용 바이오 마커를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 자궁내막암 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '진단용 바이오 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)'는 자궁내막암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 자궁내막암을 가진 세포에서 억제 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

본 발명의 목적상, 자궁내막암 진단 마커는 LRIG2(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 2) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질로, 자궁내막암 세포에서 발현이 억제되는 유전자이다. 진단에 있어서 유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정 시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도 (reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 자궁내막암 진단 마커는, 자궁내막암의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 항상 억제되는 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 LRIG2(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 2, NCBI GenBank Gene ID: 9860) 유전자 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁내막암 진단용 조성물을 제공한다.

상기 유전자 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준은 자궁내막암 의심 환자의 생물학적 시료로부터 측정한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '생물학적 시료'는 자궁내막암 발병에 의해 자궁내막암 마커인 LRIG2 유전자 또는 단백질 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 유전자 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함한다.

즉, 상기 생물학적 시료 중의 유전자 발현 수준은 mRNA의 양을 확인함으로써 확인할 수 있다.

본 발명에서 'mRNA 발현수준 측정'은 자궁내막암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 자궁내막암 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RTPCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드 또는 뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명에서 '단백질 발현수준 측정'은 자궁내막암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 자궁내막암 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.

이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony)면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 LRIG2 유전자에 특이적인 프라이머 서열을 포함하는 자궁내막암 진단 마커 조성물을 제공할 수 있다(서열번호 1의 정방향 프라이머: AAATGCAGCGGAATGGAATTAGC, 서열번호 2의 역방향 프라이머: CCCCTTGTTTACTCGTGTAAGGT).

본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.

프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

또한, 본 발명은 LRIG2 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 자궁내막암 진단 마커 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 상기 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 자궁내막암 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 자궁내막암 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명에 따른 상기 자궁내막암 진단용 조성물을 포함하는 자궁내막암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트이다.

또한, 상기 자궁내막암 진단 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

예컨대, 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 자궁내막암 진단용 조성물 또는 상기 자궁내막암 진단 키트를 이용한 자궁내막암 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공할 수 있다.

예컨대, 본 발명은 LRIG2 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 자궁내막암 의심 환자의 생물학적 시료로부터 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 상기 mRNA 수준을 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는 자궁내막암 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

생물학적 시료에서 mRNA을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 mRNA 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 자궁내막암 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교 할 수 있고, 자궁내막암 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여 자궁내막암 의심 환자의 실제 자궁내막암 발병 여부를 진단할 수 있다.

mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 자궁내막암 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.

상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 자궁내막암 진단마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 자궁내막암 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다. 한편, DNA 칩은 상기 자궁내막암 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 자궁내막암의 발병 여부를 판독할 수 있다.

또한, 본 발명은 LRIG2 단백질에 특이적인 항체를 자궁내막암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계, 및 상기 단백질 형성량의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 자궁내막암 진단 방법을 제공한다.

생물학적 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 단백질 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 자궁내막암 의심환자에게서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 자궁내막암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여, 자궁내막암 의심 환자의 실제 자궁내막암 발병 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어 '항원-항체 복합체'란 자궁내막암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8, [Os(bpy) 3]²⁺, [RU(bpy) 3]²⁺, [MO(CN) 8]^4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 자궁내막암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 자궁내막암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 자궁내막암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다.

시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 자궁내막암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 자궁내막암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다. 또한, 바람직하게는, 상기 자궁내막암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다.

또한, 바람직하게는, 상기 자궁내막암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 자궁내막암 발병 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 자궁내막암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) LRIG2(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 2, NCBI GenBank Gene ID: 9860) 유전자가 도입된 세포를 배양하는 단계;

(b) 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 증가 또는 억제 후보 물질을 상기 세포에 처리하는 단계; 및

(c) 상기 처리된 세포와 대조군의 상기 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계.

본 발명은 전술한 유전자의 단백질이 상향 발현되는 세포를 배양하고, 발현억제 또는 발현증가 후보 물질을 세포에 처리한 뒤, 후보 물질을 처리하지 않은 대조구 세포에서의 자궁내막암 진단 마커(단백질, mRNA)의 발현 정도와 비교하여 자궁내막암 관련 단백질 발현을 저해하거나 증가시키는 자궁내막암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 스크리닝에는 자궁내막암 진단 마커의 mRNA 발현정도를 프라이머 또는 프로브를 이용하는 방법이 이용될 수 있으며, 그 중에서도 RT-PCR이 바람직하다. 대조구와 비교하여 진단 마커의 발현을 감소시키거나 증가시키는 자궁내막암 치료제를 선별하여 자궁내막암 치료에 사용할 수 있다.

본 발명의 방법은 상술한 바이오 마커를 이용하여 치료제의 효과를 판정하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 동물 발암 모델 제작 방법을 제공할 수 있다:

(a) 암세포를 동물에게 주입하는 단계;

(b) AuNP-αRNA I-AS LRIG2 콘쥬게이트(conjugate)를 제작하는 단계;

(c) 상기 (a) 단계의 동물에게 상기 (b) 단계의 콘쥬게이트를 주입시키는 단계.

본 발명에서는 암세포의 성장을 보다 촉진 및 증가시키기 위해 AuNP-αRNA I-AS LRIG2 콘쥬게이트(conjugate)로 특정 유전자를 타겟팅하여 발현 수준을 조절함으로서 동물 발암 모델을 효과적으로 제작하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 특정 유전자는 LRIG2 유전자로서, 상기 유전자의 발현 억제는 암세포의 성장을 증가시킨다.

상기 유전자의 발현 억제는 LRIG2 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항체, 앱타머, 천연추출물 및 화학물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 의해 억제된다.

보다 바람직하게는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA) 또는 miRNA(microRNA)이며, 가장 바람직하게는 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "siRNA"는, 이중가닥의 RNA가 다이서에 의해 절단되어 생성되는 21-25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제하는 것을 말한다. 본 발명의 목적상 LRIG2 mRNA에 특이적으로 결합하여 상기 유전자의 발현을 억제하는 것을 의미한다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 siRNA는 5'-CUGAUACCGUCAGCCAACA-3'(서열번호 3) 및 5'-UGUUGGUGACGGUAUCAG-3'(서열번호 4)이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 상기 miRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 염기서열로서, 이에 제한되지는 않으나 안티센스 RNA, 안티센스 DNA 및 안타고니스트(antagonist) mRNA를 포함한다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 LRIG2에 대한 안티센스 DNA 서열(AS LRIG2)로서 본 발명의 콘쥬게이트를 제작하는 데 이용된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계의 AuNP-αRNA I-AS LRIG2 콘쥬게이트는 서열번호 5로 기재된다.

상기 AuNP-αRNA I-AS LRIG2 콘쥬게이트는 LRIG2에 대한 안티센스 서열(AS LRIG2)과 금 나노입자(gold nanoparticle, AuNP)를 결합시킨 복합체이다.

본 발명에서 상기 "나노입자(nanoparticle)"란, 나노 단위의 직경을 가지는 다양한 물질의 입자를 의미하며, 상기 나노입자는 나노크기를 갖는 입자라면 특별히 제한되지는 않는다.

본 발명에서 상기 "금 나노입자"란, 나노 단위의 직경을 가지는 금의 금속입자를 의미하며, 이러한 작은 입자 크기는 본 발명의 나노입자가 목적의 세포로 침투하는 것을 용이하게 하여 세포 내에 복합체의 침투를 가능하게 한다.

본 발명에서 콘쥬게이트를 언급하면서 사용되는 용어 "αRNA I"는 상기 AuNP(금입자)와 AS LRIG2를 연결해주는 역할을 하는 특정 서열을 가리키며, 상기 서열은 서열번호 5에 기재된 서열에 포함된다.

즉, 본 발명의 AuNP-αRNA I-AS LRIG2 콘쥬게이트(서열번호 5: CGCTAGCAGAGCCGAGATTGTTGGCTGACGGTATCAG)는 다음과 같이 구성된 복합체이다: (i) 금입자(AuNP) + (ii) 상기 금입자와 AS LRIG2를 연결해주는 역할을 하는 특정 서열의 αRNA I + (iii) 타겟 유전자인 LRIG2에 대한 안티센스 서열(AS LRIG2).

본 발명에 의하면, LRIG2 유전자 또는 이의 단백질을 유효성분으로 이용하여 자궁내막암세포의 세포자멸사(apoptosis)를 활성화하여, 자궁내막암세포의 성장만을 특이적으로 억제함으로써, 자궁내막암을 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 세포사의 LRIG2-유도 효과를 보여준다. 도 1a는 Hec-1A와 이시카와 세포를 LRIG2-GFP 코딩하는 플라스미드(50 또는 100 ng) 또는 siRNA로 형질 전환시켰다. 상기 세포를 형질전환 24 시간 후 분석하였다. 도 1b는 아넥신 V-양성 세포자멸성 세포의 유세포 계측법 분석의 결과를 보여준다. 도 1c는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되는 카스파제 3, 8 및 9의 활성화를 보여준다. 도 1d는 Hec-1A에서 미토콘드리아로부터 시토크롬 c의 세포질 방출에 대한 LRIG2의 효과를 보여준다. 세포질 분획과 미토콘드리아 분획 내 시토크롬 c 수준은 웨스턴 블롯 분석으로 분석하였다. 결과들은 각 그룹에 대해 3 번 실시한 독립적인 실험의 평균 ±SEM이고, 상대적인 배수 변화(relative fold change)로 표시된다. 별표는 대조군에 비해 유의한 값을 나타낸다(* p <0.05).
도 2는 BCL-2 패밀리에 의해 조절되는 LRIG2-유도 세포사를 보여준다. 도 2a는 Hec-1A 세포에서의 BCL-2 패밀리의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 도 2b는 야생형 및 bak-/-, bax-/- 및 bax-/-/bak-/-에 대한 녹아웃(knockout) MEF 세포를 증가된 양의 LRIG2-GFP로 형질전환시키고, 형질전환 24 시간 후 세포 생존율을 측정하였다. 도 2c는 Hec-1A 세포를 LRIG2-GFP 및 MCL-1로 동시-형질전환시키고, 형질전환 24 시간 후 세포 생존율을 측정하였다.
도 3은 Hec-1A에서 세포주기를 정지시키는 LRIG2를 보여준다. 도 3a는 LRIG2-GFP 또는 LRIG2-특이 siRNA로 형질전환시킨 후의 세포 주기를 유세포 계측법으로 분석한 결과를 보여준다. 도 3b는 LRIG2 단백질에 의한 p21 단백질 발현 조절을 확인하기 위하여 항-p21 항체를 이용하여 실시한 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여준다.
도 4는 세포사 및 AKT 신호 전달 시그널링에 의한 세포 주기를 조절하는 LRIG2의 효과를 보여준다. 도 4a는 Hec-1A 세포를 LRIG2-GFP로 형질전환시키고, 상기 세포에 24 시간 동안 DMSO, LY294002, U0126, AG490 또는 SP600125를 처리한 후, 이들의 생존율을 측정한 결과를 보여준다. 도 4b는 Hec-1A 세포를 LRIG2-GFP로 형질전환시키고, 상기 세포에 LY294002를 처리한 후, 이들의 세포 주기를 측정한 결과를 보여준다. 도 4c는 Hec-1A 세포를 LRIG2-GFP로 형질전환시키고, 상기 세포에 LY294002를 처리한 후, 이들의 단백질 발현을 측정한 결과를 보여준다.
도 5는 자궁 내막 암 조직에서 감소된 LRIG2의 발현을 보여준다. 도 5a는 정상 자궁 내막(n=10) 및 자궁 내막 암 조직(n=10)의 FFPE 조직에서 추출한 동량의 단백질을 준비한 후, 항- LRIG2 항체를 이용하여 실시한 면역침강 분석 결과를 보여준다. 도 5b는 정상적인 자궁 내막 및 자궁 내막 암 간의 LRIG2 단백질 발현 수준을 상대적으로 비교한 결과를 보여준다.
도 6은 LRIG2가 녹다운 시 인 비보 상에서 종양의 크기가 증가되는 것을 보여준다. 도 6a는 스크램블(Scrambled) siRNA와 LRIG2로 콘쥬게이션된 기능화 AuNPs의 합성을 개략적으로 보여준다. 도 6b는 마우스에 이종 이식시킨 암에 AuNP-RNAI- Scrambled siRNA 및 AuNP-RNAI- LRIG2를 주입한 후 각각의 종양의 크기(mm³)((길이 x 넓이2 x π/6)를 4 주 동안에 걸쳐 측정한 결과를 보여준다. 도 6c는 희생(이식 30일 후)시 종양 무게를 측정한 결과를 보여준다. 데이터는 평균 ±SEM으로 표시되고, 별표는 해당 대조군(n=6, 각각)에 비해 통계학적으로 유의한 값을 나타낸다(* P <0.05). 도 6d는 종양 내 LRIG2의 단백질 수준을 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과를 보여준다. 대표적인 종양의 실제 크기가 표시된다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험 방법 및 재료

세포 배양 및 시약

자궁 내막 선암 세포주, Hec-1A(ATCC, Manassas, VA) 및 이시카와 세포 (Dae-Shik Suh)를 McCoy'5A 변형 배지 및 DMEM/F12(Dulbecco? modified Eagle? medium/F12)에서 배양하였다. bax -/-, bak -/-, bax -/-, bak -/- (bax knock-out, bak knock-out, bax/bak knock-out 세포)의 마우스 배아 섬유 아세포(Mouse embryo fibroblasts, MEFs) 및 야생형 세포를 CB 톰슨(University of Pennsylvania, PA, USA) 박사로부터 제공받아서 DMEM(Dulbecco? modified Eagle? medium) 배지에서 배양하였다. 배지는 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하였다. 세포 배양에 사용되는 시약은 Caisson Laboratories에서 구입하였다. 항-LRIG2 항체는 Abcam에서 구입하였다. 항-카스파제(caspase) 3, 항- 카스파제 8, 항- 카스파제 9, 항-AKT 및 항-P-AKT 항체들은 Cell Signaling으로부터 구입하였다. 항-BCL-2, 항-BCL-XL, 항-BCL-W, 항-A1, 항-MCL-1, 항-BAK, 항-BAX, 항-BIM, 항-BID, 항-BAD, 항-NOXA, 항-PUMA, 항-P21 및 항-β-액틴(actin) 항체들은 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다. 화합물로는 LY294002(PI3K inhibitor), U0126(ERK inhibitor), AG490(JAK inhibitor) 및 SP600125(JNK inhibitor)을 이용하였다.

플라스미드 컨스트럭트

LRIG2-GFP를 코딩하는 플라스미드를 Hakan Hedman(Umea University, Sweden)팀으로부터 제공받았다.

RNA 간섭(RNA interference)

5'-CUGAUACCGUCAGCCAACA-3'(서열번호 3) 및 5'-UGUUGGUGACGGUAUCAG-3'(서열번호 4)의 특정 올리고뉴클레오티드(Bioneer)를 이용하여 내인성(Endogenous) LRIG2를 사이런싱하였고, 5'-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3' 및 5'-ACGAAAUUGGUGGCGUAGG-3'를 대조군으로 이용하였다. 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드는 어닐링 버퍼(Bioneer)의 존재하에 어닐링된다.

세포 생존율

MicroPorator MP-100(Digital Bio Technology)를 사용하여, Hec-1A 세포, 이시카와 세포 및 MEFs 세포(1 x 10⁴)에 LRIG2-GFP 플라스미드 50 내지 100 ng, 및 siRNA 100 nM과 200 nM을 형질감염시켰다. Hec1-A 세포 및 이시카와 세포의 형질감염 24 시간 후, 제조업체의 지시에 따라 CellTiter-Glo 분석 키트 (Promega)를 사용하여, 세포 생존율을 측정하였다.

아넥신 V-양성 세포에 대한 유세포 계측법 분석(Flow cytometry analysis)

이전에 보고된 바와 같이(Kim JH, oncogene), 아넥신 V-양성 세포사멸성 세포(apoptotic cells)가 검출되었다.

시토크롬 ( Cytochrome ) c 방출

MicroPorator MP-100을 사용하여, Hec-1A 세포(1 x 10⁷)를 LRIG2-GFP 또는 공벡터 플라스미드로 형질감염시켰다. 본 발명자들에 의해 이미 개시된 디지토닌-기반 방법(Kim JH, oncogene)을 사용하여, 세포질과 중막(heavy membrane) 분획물을 분리하여, 적절한 항체로 웨스턴 블롯을 분석하였다.

웨스턴 블롯 분석

MicroPorator MP-100을 사용하여, Hec-1A (2 x 10⁶) 세포에 pEGFP-N1과 LRIG2-GFP 플라스미드 3㎍을 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간 후, NP-40(시그마) 용해 완충액을 이용하여 세포 용해물을 제조하여, 동량의 전체 단백질에 각각의 항체로 면역블롯팅을 위한 SDS-PAGE를 실시하였다. ChemiDoc^TM XRS+ System Imager (Bio-Rad Laboratories)을 이용하여 막을 검출하였다. OptiQuant 소프트웨어 (Bio-Rad Laboratories)로 결정된 바와 같이, 면역침전물(immunoprecipitates)의 단백질 농도에 기초하여 상대적인 발현(%)을 산출하였다.

세포주기 분석

이미 개시된 바(KIM JH, journal of reproduction and development)와 같이, 세포주기 분석을 검출하였다.

인간 자궁 내막 조직

자궁내막암 환자 10 명으로부터 수득한 자궁내막암 및 대조군인 자궁 근종 환자 10 명으로부터 수득한 자궁 내막 조직의 포르말린-고정 파라핀 포매(Formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) 블록 섹션(10 ㎛ 두께)을 제작하여 조사하였다. 상기 섹션은 병리학자에 의해 검토되었고, 서울 아산 병원의 바이오-자원 센터로부터 얻었다.

인간 자궁 내막 조직의 단백질 추출 및 면역침강

FFPE된 정상 자궁내막 및 자궁내막암 조직 섹션으로부터 총 단백질을 추출하였다. 제조사의 지시에 따라 Qproteome FFPE 조직 키트(Qiagen)를 이용하여 FFPE 조직 단백질 추출물을 추출하였다. 총 단백질을 면역침강 분석하였다.

콘쥬게이트 제조

- 나노 입자의 제조

시트레이트-안정화 금 나노입자(Citrate-stabilized gold nanoparticles)(13 nm) 및 올리고뉴클레오티드-기능화 입자(oligonucleotide-functionalized particles)를 이미 개시된 방법(Jae-Hong Kim, Chem. Commun., 46, 4151-4153, 2010; Rosi et al.,2006; Ryou et al., 2010)으로 제조하였다.

- AuNP -αRNA I-AS LRIG2 콘쥬게이트의 제조

당업계에 공지된 방법에 따라 LRIG에 대한 siRNA 서열과 금 나노 입자를 결합시킨 복합체인 AuNP-αRNA I-AS LRIG2 콘쥬게이트를 다음과 같이 제조하였다.

본 발명에서 사용된 AuNP-RNAI-AS LRIG2 운반체는 영국 BBI Life Science로부터 구입한 Gold colloid-15nm(#EM.GC15)에 특정 RNAI 서열이 접합되어 있으며, 상기 RNAI 서열에 상보적인 결합서열을 포함하는 LRIG2 antisense 서열을 결합시킨다. 실시예로 10nM RNAI이 접합되어진 금나노입자에 0.8mM 농도의 LRIG2 antisense DNA을 0.3 M NaCl buffer, 섭씨 55도의 온도에서 10분간 배양 후 이후 13,000 Xg에서 원심분리 후 상층액을 제거하였다. 이렇게 생성된 AuNP-RNAI-LRIG2 antisense 복합체를 운반체로서 종양(tumor volume ~ 0.1 cm3)에 직접 주사하였다.

동물 연구

Hec-1A 세포 (2 x 10⁶)를 18-20 g 무게의 BALB/c nu/nu 면역결핍 6 주령 마우스(Charles River Laboratories International, Inc., Japan)의 피하에 주입하였다. 종양 세포 이식 12 일 후, PBS에 현탁한 대조군 또는 AuNP-αRNA I-AS LRIG2 콘쥬게이트(서열번호 5)를 매 2 일 마다 이식한 종양 부위에 주입하였다. 매일 마우스의 무게 및 종양의 크기를 측정하였다. 콘쥬게이트의 첫번째 주입으로부터 18일 째에 종양-이식 마우스를 희생시킨 후, 종양을 절제하여 측량하였다.

통계 분석

Student-Newman-Keuls 테스트(SAS)를 이용하여, 값들의 다중 비교 분석을 실시하고, 대조군과의 비교에 Student? 테스트를 이용하였다. 상기 데이터들을 평균 ±SEM로 표시하고, p <0.05를 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

실시예 1: LRIG2 에 의해 유도된 BAX - 및 BAK -의존성 미토콘드리아 세포 사멸 확인

본 발명자들은 자궁내막암 세포주에 자궁내막암 호르몬 치료제로 이용되고 있는 프로게스테론을 처리한 경우 Lrig2의 발현 증가를 확인하였다.

이에, 자궁내막암 세포주에서의 LRIG2의 기능을 조사하기 위해, 본 발명자들은 암세포의 생존율 분석을 실시하였다. 결과들은 도 1에 나타내었다.

LRIG2의 이소성(Ectopic)-발현은 암세포 생존율을 감소시켰고(도 1a), 아넥신 V-양성 세포들은 증가시켰다(도 1b).

또한, LRIG2-매개 세포사(cell death)가 카스파제-의존성 세포자멸성(apoptotic) 반응인지의 여부를 확인하기 위하여, LRIG2 과발현에 따른 카스파제 3, 8 및 9의 활성화를 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 그 결과, LRIG2-유도 세포사는 카스파제 3 및 9 활성화와 관련성이 있었다(도 1c).

또한, 본 발명자들은 LRIG2-유도 카스파제 활성화가 가능한 중간매개체로서 미토콘드리아 막 보전성(membrane integrity)을 추가적으로 조사하였다. LRIG2의 과발현 후, 시토크롬 c가 세포질로 방출되었다(도 1d).

한편, BCL-2 패밀리의 전(pro)- 및 항-세포자멸성 구성요소가 LRIG2에 의하여 초래되는 세포사를 결정하는 것에 관여하는 지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 BCL-2 패밀리의 단백질 수준을 평가하였다(도 2a). 그 결과, LRIG2를 과발현시킨 경우, anti-apoptotic 유전자로 알려진 MCL-1의 발현이 감소하고 pro-apoptotic 유전자로 알려진 BAX, BAK의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 또한, LRIG2를 knock-down 시킨 경우, 반대의 경향을 나타내는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 각각 bax-/-, bak-/-, 및 bax/bak-/- MEF 세포에서의 세포사 반응을 평가하였다. LRIG2-유도 세포사는 bax-, bak- 및 bax/bak-결핍 세포에서 완벽하게 블록킹되었다(도 2b).

또한, MCL-1은 LRIG2와 공동-발현되는 경우, LRIG2 단독과 비교하여 세포 생존율은 감소된 세포사를 보여준다(도 2c).

이러한 결과들은 BAX, BAK 및 MCL-1이 LRIG2 유도 세포사의 중요한 매개체임을 의미한다.

실시예 2: LRIG2 단백질의 비정상적 세포 주기(Defective cell cycle) 확인

본 발명자들은 Hec-1A 세포에서 LRIG2를 과발현시킨 후, 유세포 계측법으로 세포 주기의 다른 단계에서의 세포 집단을 분석하였다.

도 3a에서 보여주는 바와 같이, LRIG2 과발현은 G0/G1 단계에서 세포 집단을 증가시킨 반면, LRIG2 넉다운(knock down)은 G0/G1 단계에서 세포 집단을 감소시켰다.

또한, 본 발명자들은 LRIG2에 의한 세포 주기 진행을 억제하는 중요한 CDK(cyclin-dependent kinase) 억제제인 p21의 단백질 수준을 조사하였다. 도 3b에서 보여주는 바와 같이, LRIG2 과발현은 p21의 발현을 증가시킨 반면, LRIG2 녹다운(knock down)은 p21의 발현을 감소시켰다.

실시예 3: LRIG2 에 의한 세포사 및 AKT 신호전달 시그널링을 통한 세포 주기 조절 확인

도 4b에서 보여주는 바와 같이, LRIG2 과발현은 G0/G1기의 cell cycle을arrest시키는 반면, LRIG2 과발현 후 AKT inhibitor(LY294002)를 처리한 후에는 그러한 변화가 관찰되지 못하는 것을 확인하였다.

실시예 4: 자궁내막암 환자에서 하향조절된 LRIG2 의 발현 확인

본 발명의 분자 및 세포 실험 결과는 LRIG2가 자궁내막암 세포의 세포자멸에 있어 중요하다는 것을 제시한다. 본 발명자들은 자궁내막암 환자에서의 LRIG2의 발현을 조사하였다. 면역침강분석은 자궁 내막 조직의 LRIG2 단백질의 명확한 발현을 보여준다. LRIG2의 발현 수준은 자궁 내막 암 조직에서 낮거나 검출되지 않았다(도 5a 및 5b).

실시예 5: 자궁 내막 종양 성장 억제에 연관 있는 종양 억제자로서의 LRIG2

이러한 결과를 기반으로, AuNP-DNA 콘쥬게이트를 이용하여 마우스의 이종이식 종양 내로 siLRIG2가 잘 전달되었는지 여부를 확인하였다. 도 6a는 이러한 과정을 보여준다.

인 비트로 세포 배양 결과와 동일하게, AuNP-αRNA I-AS LRIG2 콘쥬게이트를 주입시킨 이종이식 종양의 크기는 대조군 콘쥬게이트를 주입시킨 종양의 크기보다 유의하게 컸다(도 6b). 또한, AuNP-αRNA I-AS LRIG2 콘쥬게이트를 주입시킨 종양의 무게는 대조군 보다 46.9%가 유의하게 증가하였다(도 6c). 본 발명자들은 AuNP-αRNA I-AS LRIG2를 주입시킨 이종 이식 종양의 LRIG2 발현을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. LRIG2의 발현 비율은 AuNP-αRNA I-AS 대조군에서보다 AuNP-αRNA I-AS LRIG2에서 감소되었다(도 6d).

<110> THE ASAN FOUNDATION CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Use of LRIG2 for Diagnosis or Treatment of Cancer <130> ASAN1-119 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRIG2 forward primer <400> 1 aaatgcagcg gaatggaatt agc 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRIG2 reverse primer <400> 2 ccccttgttt actcgtgtaa ggt 23 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRIG2 siRNA <400> 3 cugauaccgu cagccaaca 19 <210> 4 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRIG2 siRNA <400> 4 uguuggugac gguaucag 18 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AuNP aRNA I AS LRIG2 conjugate <400> 5 cgctagcaga gccgagattg ttggctgacg gtatcag 37

Claims

LRIG2(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 2, NCBI GenBank Gene ID: 9860) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 유효성분으로 포함하는 자궁내막암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 유전자를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터가 형질도입된 세포를 포함하는 것을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 암세포의 세포자멸사(apoptosis)를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
LRIG2(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 2, NCBI GenBank Gene ID: 9860) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질로써, 자궁내막암 환자에서 특이적으로 발현이 억제되는 것을 특징으로 하는 자궁내막암 진단용 바이오 마커.
LRIG2(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 2, NCBI GenBank Gene ID: 9860) 유전자 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁내막암 진단용 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 유전자 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드 또는 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항의 조성물을 포함하는 자궁내막암 진단용 키트.
제 8 항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 자궁내막암 진단용 키트.
다음 단계를 포함하는 자궁내막암 치료제의 스크리닝 방법:
(a) LRIG2(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 2, NCBI GenBank Gene ID: 9860) 유전자가 도입된 세포를 배양하는 단계;
(b) 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 증가 또는 억제 후보 물질을 상기 세포에 처리하는 단계; 및
(c) 상기 처리된 세포와 대조군의 상기 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계.