KR20170009605A - Composition for detecting mutations of NRAS gene and kit comprising the same - Google Patents
Composition for detecting mutations of NRAS gene and kit comprising the same Download PDFInfo
- Publication number
- KR20170009605A KR20170009605A KR1020150101919A KR20150101919A KR20170009605A KR 20170009605 A KR20170009605 A KR 20170009605A KR 1020150101919 A KR1020150101919 A KR 1020150101919A KR 20150101919 A KR20150101919 A KR 20150101919A KR 20170009605 A KR20170009605 A KR 20170009605A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- seq
- primer
- reverse primer
- kit
- probe
- Prior art date
Links
- 101150073096 NRAS gene Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title description 75
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 172
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 76
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 claims description 68
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 claims description 68
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 51
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 42
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 42
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 42
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 20
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229940121647 egfr inhibitor Drugs 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 claims description 9
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 9
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 9
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 claims description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 4
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 claims description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 3
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 claims description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 claims description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 30
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 21
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 11
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 abstract description 6
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 abstract description 6
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 18
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 14
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 13
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 13
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 13
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 9
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 9
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 8
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 6
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 6
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 5
- 101000584612 Homo sapiens GTPase KRas Proteins 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 4
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 4
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 4
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 4
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 3
- 239000002136 L01XE07 - Lapatinib Substances 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 3
- 229960004891 lapatinib Drugs 0.000 description 3
- BCFGMOOMADDAQU-UHFFFAOYSA-N lapatinib Chemical compound O1C(CNCCS(=O)(=O)C)=CC=C1C1=CC=C(N=CN=C2NC=3C=C(Cl)C(OCC=4C=C(F)C=CC=4)=CC=3)C2=C1 BCFGMOOMADDAQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 3
- 235000019809 paraffin wax Nutrition 0.000 description 3
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 3
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 description 3
- 102200124923 rs121913254 Human genes 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 101710113436 GTPase KRas Proteins 0.000 description 2
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 101150040459 RAS gene Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N carbonyl sulfide Chemical compound O=C=S JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 102200006520 rs121913240 Human genes 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 206010052358 Colorectal cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 206010069755 K-ras gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N deoxyadenylic acid Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N deoxyguanylic acid Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002542 deteriorative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002431 foraging effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011885 in vitro diagnostic (IVD) kits Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 1
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000955 prescription drug Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012421 spiking Methods 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Abstract
Description
본 발명은 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물, 상기 조성물을 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머/프로브 세트를 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트에 관한 것이다.More particularly, the present invention relates to a primer and probe set composition for NRAS gene mutation detection, a NRAS gene mutation detection kit comprising the NRAS gene mutation detection kit, And a kit for detecting an NRAS gene mutation comprising a part of a primer / probe set.
암이란 다양한 원인에 의해 세포의 분열과 사멸 간의 균형이 파괴됨으로써 계속적인 분열과 증식에 의해 발생한 비정상적인 세포의 집단을 의미하며, 종양 또는 신생물이라고도 한다. 일반적으로 장기, 백혈구, 뼈, 림프절 등을 포함한 100 가지 이상의 신체의 여러 부분에 발병하며, 주변조직으로 침윤하는 현상 및 다른 기관으로 이동하는 전이를 통해 심각한 증상으로 발전한다.Cancer refers to a group of abnormal cells caused by continuous division and proliferation by destroying the balance between cell division and death by various causes, and is also called a tumor or neoplasm. It generally develops in more than 100 parts of the body, including organs, white blood cells, bones, lymph nodes, etc., and develops into serious symptoms through the phenomenon of invasion into surrounding tissues and metastasis to other organs.
암의 치료제는 지속적으로 개발되고 있어, 현재 임상에서 사용되는 각종 암에 대한 치료제는 수십 가지에 이르고 있다. 하지만 현재까지도 임상의들은 두 가지의 어려움을 겪고 있는데, 첫째는 치료제가 치료 효과를 나타내기까지는 몇주 정도의 시간이 소요되고 개개 환자들에게 효과가 있는 치료제를 미리 알 수가 없다는 것이다. 즉, 항암제의 치료 효과는 며칠 내에 판정할 수 있는 것이 아니라 수주에 걸쳐서 서서히 나타나기 때문에 처방된 약물이 효과가 없다고 판단하기까지는 오랜 시간이 걸린다는 것이다. 그 후 치료 효과가 부적절하다면 다른 종류의 치료제로 변경을 고려하는데, 결국 치료 개시 시기에 임상의가 환자에게 적절한 치료제를 선택하지 못하였다면, 그만큼 효과적인 치료에 이르는데, 시간이 그만큼 지체하게 되며, 병의 진행, 재발 및 예후에 치명적인 영향을 미치게 된다. Cancer therapy is being developed continuously, and dozens of therapies for various cancers currently used in clinical trials are available. However, until now, clinicians are suffering from two difficulties. First, it takes several weeks for the therapeutic effect to take effect. In other words, the therapeutic effects of anticancer drugs can not be judged within a few days, but they gradually appear over several weeks, so it takes a long time to judge the prescription drug to be ineffective. If the treatment is not effective enough, the patient will be considered for other types of treatment. If the clinician can not select the appropriate treatment for the patient at the time of initiation of treatment, the time will be delayed And the prognosis of the disease.
두 번째 어려움은 치료제에 치료 반응을 보이지 않는 환자가 다수 존재하는 점이다. 예를 들어, 유방암 치료제인 라파티닙(lapatinib)은 HER2 단백질의 수치가 높고 (HER2 양성) EGRF 단백질의 수치가 낮은 경우에 치료효과가 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 그러나 전이성의 HER2 음성 유방암은 라파티닙에 반응을 하지 않아 라파티닙이 효과가 없는 것으로 드러났다. 이러한 연구결과를 참고하면, 일단 유방암 환자들은 치료를 받기 전에 정확한 검사를 통하여 HER2 음성인지 혹은 양성인지를 확실히 밝혀야 적절한 치료를 선택할 수 있음을 알 수 있다.The second difficulty is that there are a number of patients who do not respond to the treatment. For example, lapatinib, a breast cancer treatment, has been shown to have therapeutic effects when high levels of HER2 protein (HER2 positive) and low levels of EGRF protein are present. However, metastatic HER2 negative breast cancer did not respond to lapatinib, indicating that lapatinib was ineffective. These results suggest that patients with breast cancer need to know precisely whether they are HER2 negative or positive before treatment, so that appropriate treatment can be selected.
따라서, 치료제에 대한 치료반응과 그 부작용을 미리 예측할 수 있다면, 환자에게 맞는 약물을 미리 선별하여 약물을 잘못 선택함으로 인하여 생기는 치료 탈락(dropout)률을 낮추고 약물의 순응도를 높일 수 있을 것이다. 또한 약물의 효과가 나타나기까지 걸리는 시간과 환자가 겪을 지도 모르는 부작용의 위험을 피해 갈 수 있을 것이다. Therefore, if the therapeutic response to the therapeutic agent and its side effects can be predicted in advance, it will be possible to lower the dropout rate of the drug and improve the compliance of the drug due to the wrong selection of the drug. It will also avoid the time it takes for the drug to take effect and the risk of side effects that the patient may experience.
한편, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 암 성장에 중요한 역할을 하는 티로신 키나아제이다. 예를 들어, 전이성 결장암(CRC)을 갖는 환자의 종양 중 85%를 초과하는 종양에서 EGFR의 과발현이 관찰된다(Lee JJ and Chu E,Clin Colorectal Cancer 2007; 6 Suppl 2:S42-6). 이러한 EGFR을 표적으로 하는 항암 약물이 개발되어 왔다. 세툭시맵(cetuximab) 및 파니툼맵(panitumumab)은 전이성 CRC를 위한 2차 용도 및 옥살리플라틴 및 이리노테칸-기반의 치료요법과 조합된 1차 용도에 있어서 유망한 치료 효과를 나타내는 두 가지 EGFR 억제제이다Lee JJ and Chu E, Clin Colorectal Cancer. 2007; 6 Suppl 2:S42-6; Zhang W, et al., Ann Med. 2006;38: 545-51). 그러나 모든 환자들이 세툭시맵 및 파니툼맵에 반응하는 것은 아니다.On the other hand, epidermal growth factor receptor (EGFR) is a tyrosine kinase that plays an important role in cancer growth. For example, overexpression of EGFR is observed in more than 85% of tumors in patients with metastatic colorectal cancer (CRC) (Lee JJ and Chu E, Clin Color Cancer 2007; 6 Suppl 2: S42-6). Antitumor drugs targeting such EGFR have been developed. Cetuximab and panitumumab are two EGFR inhibitors that exhibit promising therapeutic effects in secondary use for metastatic CRC and primary use in combination with oxaliplatin and irinotecan-based therapies Lee JJ and Chu E, Clin Colorectal Cancer. 2007; 6 Suppl 2: S42-6; Zhang W, et al., Ann Med. 2006; 38: 545-51). However, not all patients respond to Cetuximap and Panitum map.
Ras 유전자의 변이는 암의 유전적 변이에 있어서 가장 흔하게 발견되는 돌연변이 중 하나이다. 이 중 N-ras(NRAS) 돌연변이는 GTP를 GDP로 가수분해하는 NRAS의 기능에 영향을 주어 NRAS가 계속적으로 활성화 상태가 되도록 한다. NRAS 유전자의 엑손 2 및 3에서의 돌연변이는 잘 알려져 있으며, 최근 엑손 4에서의 돌연변이가 발견되었고, 이는 대장암 환자에서 약물의 반응성에 영향을 미친다는 것이 보고되고 있다(BMJ Open. 2014 May 23;4(5):e004652.). Mutations in the Ras gene are one of the most commonly found mutations in the genetic mutation of cancer. Among these, the N-ras (NRAS) mutation affects the function of NRAS to hydrolyze GTP to GDP so that NRAS is continuously activated. Mutations in the NRAS gene in
NRAS의 유전자 돌연변이는 20%의 악성흑색종, 12%의 백혈병, 8% 갑상선암 및 2~3%의 대장암 환자에서 발견이 되는 것으로 보고되고 있다. 악성 흑색종, 갑상선암 및 대장암에서 NRAS의 돌연변이는 주로 codon 61에서 발견이 되나, 혈액암에서는 다양한 코돈에서의 돌연변이가 병변에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. NRAS 유전자의 돌연변이는 방사선 요법 및 EGFR 저해제 치료 요법에 대한 저항성과 연관이 있는 것으로 보고되고 있다. NRAS 변이가 존재하면 EGFR 저해제인 세툭시맵 또는 파니툼맵에 대한 약효가 나타나지 않을 것이라는 점이 예측될 수 있기 때문에, 변이된 NRAS 를 지니는 환자들은 이들 EGFR 저해제를 이용한 치료 요법에 대한 효과를 나타내지 못할 수 있다.NRAS gene mutations have been reported to be found in 20% of malignant melanoma, 12% of leukemia, 8% of thyroid cancer, and 2% to 3% of colorectal cancer patients. Mutations in NRAS in malignant melanoma, thyroid cancer, and colorectal cancer are mainly found in codon 61, but mutations in various codons have been reported to affect lesions in hematologic malignancies. Mutations in the NRAS gene have been reported to be associated with resistance to radiotherapy and EGFR inhibitor therapy. Patients with mutated NRAS may not be able to demonstrate the efficacy of these EGFR inhibitors in treatment because the NRAS mutation may be expected to result in no effect on the EGFR inhibitors Cetuximap or panitumum .
이와 같이, NRAS 돌연변이의 존재는 세툭시맵 또는 파니툼맵과 같은 EGFR 키나아제 저해제에 반응하는 약물 감수성의 강력한 예측인자로 작용하므로, 최적의 치료적 접근을 위해 NRAS 돌연변이의 효과적이고 신속한 검출 방법이 요구된다.Thus, the presence of the NRAS mutation acts as a strong predictor of drug sensitivity in response to EGFR kinase inhibitors such as cetuximap or panitumum, and therefore an effective and rapid detection method of the NRAS mutation is required for an optimal therapeutic approach .
이에, 본 발명자들은 NRAS 돌연변이를 간편하고 신속하게 검출하여 NRAS 돌연변이와 관련된 암 환자의 약물치료 전략을 선택할 수 있는 프라이머/프로브 세트를 발굴하고, 이에 적합한 키트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have completed the present invention by developing a kit suitable for detecting NRAS mutation in a simple and rapid manner to select a primer / probe set capable of selecting a drug treatment strategy for cancer patients related to NRAS mutation.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 21 내지 26 로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, Therefore, an object of the present invention is to provide a polynucleotide set of a forward primer of SEQ ID No. 1, a reverse primer of SEQ ID No. 2, a forward primer of SEQ ID No. 3, a reverse primer of SEQ ID No. 4, and a probe selected from the group consisting of SEQ ID No. 21 to 26 ,
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 27 내지 32로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, A reverse primer of SEQ ID NO: 2, a reverse primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, and a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 27 to 32,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 정방향 프라이머, 및 서열번호 34 내지 36으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, A forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 5, a reverse primer of SEQ ID NO: 6, a forward primer of SEQ ID NO: 7, a forward primer of SEQ ID NO: A polynucleotide set of a probe selected from the group,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머 및 서열번호 37 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,A reverse primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a reverse primer of SEQ ID NO: 9, a reverse primer of SEQ ID NO: 10 and a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOs:
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 정방향 프라이머, 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 42 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,A forward primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a forward primer of SEQ ID NO: 11, a reverse primer of SEQ ID NO: 12, a forward primer of SEQ ID NO: 13, a forward primer of SEQ ID NO: A polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 42 to 45,
서열번호 16의 정방향 프라이머, 서열번호 17의 역방향 프라이머, 서열번호 18의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 19의 정방향 프라이머, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 46 내지 48로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트A forward primer of SEQ ID NO: 16, a reverse primer of SEQ ID NO: 17, a forward primer of SEQ ID NO: 18, a reverse primer of SEQ ID NO: 6, a forward primer of SEQ ID NO: 19, a forward primer of SEQ ID NO: 20, Lt; RTI ID = 0.0 > polynucleotide < / RTI &
를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공하는 것이다.As an active ingredient, a primer and a probe set composition for detecting NRAS gene mutation.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머/프로브 세트를 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for detecting NRAS gene mutation comprising a composition of the present invention and a kit for detecting NRAS gene mutation comprising a part of the primer / probe set of the composition of the present invention.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 21 내지 26 로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, The reverse primer of SEQ ID NO: 3, the reverse primer of SEQ ID NO: 4, and the reverse primer of SEQ ID NOs: 21 to 26. The reverse primer of SEQ ID NO: A set of polynucleotides of probes,
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 27 내지 32로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, A reverse primer of SEQ ID NO: 2, a reverse primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, and a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 27 to 32,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 정방향 프라이머, 및 서열번호 34 내지 36으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, A forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 5, a reverse primer of SEQ ID NO: 6, a forward primer of SEQ ID NO: 7, a forward primer of SEQ ID NO: A polynucleotide set of a probe selected from the group,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머 및 서열번호 37 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,A reverse primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a reverse primer of SEQ ID NO: 9, a reverse primer of SEQ ID NO: 10 and a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOs:
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 정방향 프라이머, 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 42 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,A forward primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a forward primer of SEQ ID NO: 11, a reverse primer of SEQ ID NO: 12, a forward primer of SEQ ID NO: 13, a forward primer of SEQ ID NO: A polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 42 to 45,
서열번호 16의 정방향 프라이머, 서열번호 17의 역방향 프라이머, 서열번호 18의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 19의 정방향 프라이머, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 46 내지 48로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트A forward primer of SEQ ID NO: 16, a reverse primer of SEQ ID NO: 17, a forward primer of SEQ ID NO: 18, a reverse primer of SEQ ID NO: 6, a forward primer of SEQ ID NO: 19, a forward primer of SEQ ID NO: 20, Lt; RTI ID = 0.0 > polynucleotide < / RTI &
를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공한다.As an active ingredient, a primer and a probe set composition for NRAS gene mutation detection.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머/프로브 세트를 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.In order to accomplish still another object of the present invention, there is provided a kit for detecting mutation of NRAS gene comprising a composition of the present invention and a primer / probe set of a part of the composition of the present invention.
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY (2th ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walkered., 1988); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. The following references provide one of the skills with a general definition of the terms used in the specification of the present invention: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2nd ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walkered., 1988); And Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.
이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 21 내지 26 로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, The present invention relates to a primer and a probe set composition for NRAS gene mutation detection, comprising a forward primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a forward primer of SEQ ID NO: 3, an inverted primer of SEQ ID NO: A polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of 21 to 26,
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 27 내지 32로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, A reverse primer of SEQ ID NO: 2, a reverse primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, and a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 27 to 32,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 정방향 프라이머, 및 서열번호 34 내지 36으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, A forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 5, a reverse primer of SEQ ID NO: 6, a forward primer of SEQ ID NO: 7, a forward primer of SEQ ID NO: A polynucleotide set of a probe selected from the group,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머 및 서열번호 37 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,A reverse primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a reverse primer of SEQ ID NO: 9, a reverse primer of SEQ ID NO: 10 and a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOs:
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 정방향 프라이머, 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 42 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,A forward primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a forward primer of SEQ ID NO: 11, a reverse primer of SEQ ID NO: 12, a forward primer of SEQ ID NO: 13, a forward primer of SEQ ID NO: A polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 42 to 45,
서열번호 16의 정방향 프라이머, 서열번호 17의 역방향 프라이머, 서열번호 18의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 19의 정방향 프라이머, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 46 내지 48로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함한다.A forward primer of SEQ ID NO: 16, a reverse primer of SEQ ID NO: 17, a forward primer of SEQ ID NO: 18, a reverse primer of SEQ ID NO: 6, a forward primer of SEQ ID NO: 19, a forward primer of SEQ ID NO: 20, As the active ingredient. The polynucleotide set of the probe selected in Fig.
본 발명의 조성물은 바람직하게는 EGFR 저해제에 대한 치료 반응성 (responsiveness) 예측을 위한 것일 수 있다. NRAS는 EGFR 하류 이펙터이고, 항-EGFR 단클론항체의 치료효과 대한 1차 저항의 마커이다. NRAS 돌연변이를 갖는 환자들은 EGFR 저해제인 세툭시맵(cetuximab) 또는 파니툼맵(panitumumab) 치료로부터 항암효과를 나타내지 못할 가능성이 존재한다. The composition of the present invention may preferably be for predicting the responsiveness of an EGFR inhibitor to treatment. NRAS is an EGFR downstream effector and is a primary resistance marker for the therapeutic effect of anti-EGFR monoclonal antibodies. Patients with NRAS mutations may not be able to demonstrate anti-cancer effects from the EGFR inhibitors cetuximab or panitumumab.
따라서, 상기 EGFR 저해제는 바람직하게는 세툭시맵(cetuximab) 또는 파니툼맵(panitumumab) 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다 .Thus, the EGFR inhibitor may be, but is not limited to, cetuximab or panitumumab.
본 발명에서 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.In the present invention, the term " primer " means an oligonucleotide in which the synthesis of a primer extension product complementary to a nucleic acid chain (template) is induced, that is, the presence of a polymerizing agent such as a nucleotide and a DNA polymerase, It can act as a starting point for synthesis under pH conditions. Preferably, the primer is a deoxyribonucleotide and is a single strand. The primers used in the present invention may include naturally occurring dNMPs (i.e., dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides. In addition, the primers may also include ribonucleotides.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.The primer should be long enough to be able to prime the synthesis of the extension product in the presence of the polymerizing agent. The suitable length of the primer is determined by a number of factors, such as the temperature, the application, and the source of the primer, but is typically 15-30 nucleotides. Short primer molecules generally require lower temperatures to form a sufficiently stable hybrid complex with the template. The term " annealing " or " priming " means that the oligodeoxynucleotide or nucleic acid is apposited to the template nucleic acid, which polymerizes the nucleotide to form a complementary nucleic acid molecule to the template nucleic acid or a portion thereof .
본 발명에서 “프로브”는 정량적 PCR에 이용되는 taqman probe의 일종으로 디자인된 것이다. 바람직하게는 프로브에는 형광 물질 (HEX, VIC, FAM dye)를 부착하였으며, 모든 프로브의 3'쪽에는 ??쳐 (quencher)로 BHQ1이 이용될 수 있다. TaqMan probe는 일반적으로 5‘ 말단을 형광 물질로, 3’ 말단을 quencher 물질로 tagging한 oligonucleotide이며, TaqMan probe는 annealing step에서 template DNA에 특이적으로 hybridization하지만, probe의 3‘ 말단에 quencher가 있기 때문에 빛을 주어도 형광을 발하지 못하지만, 다음 과정인 extension step에서 Taq DNA polymerase가 가지고 있는 5’→3‘ exonuclease 활성에 의해, 주형에 hybridization한 TaqMan probe가 분해되면 형광물질이 probe로부터 분리되어 quencher에 의한 억제가 해제되고 형광을 발하게 되는 원리에 의해서 PCR 반응에 따른 형광이 정량적으로 발하게 된다. In the present invention, " probe " is designed as a kind of taqman probe used for quantitative PCR. Preferably, a fluorescent material (HEX, VIC, FAM dye) is attached to the probe, and BHQ1 can be used as a quencher on the 3 'side of all the probes. The TaqMan probe is an oligonucleotide tagged with the 5 'end as a fluorescent substance and the 3' end as a quencher. The TaqMan probe specifically hybridizes to the template DNA in the annealing step, but there is a quencher at the 3 'end of the probe However, if the TaqMan probe hybridizes to the template due to the 5 '→ 3' exonuclease activity of the Taq DNA polymerase in the next step of extension, the fluorescent material is separated from the probe and is inhibited by the quencher And fluorescence is emitted quantitatively by the principle of the fluorescence emitted by the PCR reaction.
본 발명에서의 게놈 DNA 유전자 변이에 특이적인 프라이머 및 프로브는 NRAS 유전자의 돌연변이를 검출하기 위한 것일 수 있다. 바람직하게는 게놈 DNA 유전자 변이에 특이적인 프라이머 및 프로브는 PCR 반응 용액 및 표준 PCR 반응 용액에 대해서 동일한 서열로 사용되며, 각각 독립적으로 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 21 내지 26 로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, Primers and probes specific for the genomic DNA gene mutation in the present invention may be ones for detecting mutations of the NRAS gene. Preferably, the primers and probes specific for the genomic DNA gene mutation are used in the same sequence for the PCR reaction solution and the standard PCR reaction solution, and each independently comprise a forward primer of SEQ ID NO: 1, an inverted primer of SEQ ID NO: 2, A reverse primer of SEQ ID NO: 4 and a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 21 to 26,
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 27 내지 32로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, A reverse primer of SEQ ID NO: 2, a reverse primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, and a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 27 to 32,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 정방향 프라이머, 및 서열번호 34 내지 36으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, A forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 5, a reverse primer of SEQ ID NO: 6, a forward primer of SEQ ID NO: 7, a forward primer of SEQ ID NO: A polynucleotide set of a probe selected from the group,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머 및 서열번호 37 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,A reverse primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a reverse primer of SEQ ID NO: 9, a reverse primer of SEQ ID NO: 10 and a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOs:
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 정방향 프라이머, 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 42 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,A forward primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a forward primer of SEQ ID NO: 11, a reverse primer of SEQ ID NO: 12, a forward primer of SEQ ID NO: 13, a forward primer of SEQ ID NO: A polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 42 to 45,
서열번호 16의 정방향 프라이머, 서열번호 17의 역방향 프라이머, 서열번호 18의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 19의 정방향 프라이머, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 46 내지 48로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.A forward primer of SEQ ID NO: 16, a reverse primer of SEQ ID NO: 17, a forward primer of SEQ ID NO: 18, a reverse primer of SEQ ID NO: 6, a forward primer of SEQ ID NO: 19, a forward primer of SEQ ID NO: 20, And a set of polynucleotides of the probe selected in SEQ ID NO.
PCR 반응 여부의 측정은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으나, 리포터 형광 염료 및/또는 ??쳐 (quencher) 형광 염료로 표지된 프로브를 사용한 광학적 정량 분석 시스템에 의해서 측정될 수 있으며, 바람직하게는 각 미분화된 작은 방울 각각의 PCR 반응에 대한 형광값을 측정하는 것에 의해서 수행될 수 있다. The measurement of the PCR reaction can be performed according to a method known in the art, but can be measured by an optical quantitative analysis system using a probe labeled with a reporter fluorescent dye and / or a quencher fluorescent dye, Preferably by measuring the fluorescence value for each PCR reaction of each undifferentiated droplet.
구체적으로 프로브에 FAM, HEX, VIC 형광염료 (형광물질) 또는 EvaGreen 형광염료가 결합된 형태를 사용하였으므로 이들에 대한 형광을 측정하는 것에 의해서 수행될 수 있다. 이와 같은 과정은 상용의 검출장치 (예를 들어, biorad사의 Droplet Reader)에 의해서 수행될 수 있으며, 해당 장치내에서 각각의 샘플의 droplet 형광 신호를 각각 감지 및 positive와 negative droplet의 수를 세어 자동으로 분석까지 완료될 수 있다.Specifically, since the probe is combined with FAM, HEX, VIC fluorescent dye (fluorescent substance) or EvaGreen fluorescent dye, it can be performed by measuring fluorescence thereon. This process can be performed by a commercially available detector (for example, Droplet Reader from biorad), which detects the droplet fluorescence signal of each sample in the apparatus, counts the number of positive and negative droplets, and automatically Analysis can be completed.
이 때 검출을 위해서 PCR 반응 용액에 첨가되는 프로브 및 표준 PCR 반응 용액에 첨가되는 프로브는 각각 상이한 형광물질과 결합되어 있을 수 있다.In this case, probes to be added to the PCR reaction solution and probes to be added to the standard PCR reaction solution for detection may be respectively associated with different fluorescent materials.
한편, 본 발명은 본 발명의 프라이머/프로브 세트를 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.Meanwhile, the present invention provides a kit for NRAS gene mutation detection comprising the primer / probe set of the present invention.
본 발명이 상기 키트는, background (noise)를 줄이기 위해 돌연변이 위치에 상응하는 야생형 서열을 이용하여 돌연변이 검출용 프로브가 야생형 서열에 non-specific 하게 binding 하지 못하도록 디자인 한 oligomer (blocker)를 추가적으로 포함할 수 있다.The kit of the present invention may further include an oligomer (blocker) designed to prevent non-specific binding of a mutation detection probe to a wild-type sequence using a wild-type sequence corresponding to a mutation position to reduce background noise have.
본 발명의 키트는 바람직하게는 본 발명의 프라이머/프로브 세트를 이용한 PCR 반응에 의한 NRAS 유전자의 돌연변이의 검출에 이용될 수 있다. 본 발명의 키트는 PCR 이나 이의 검출에 사용되는 당업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 각 성분들을 혼합하는데 사용될 튜브, 웰 플레이트, 사용방법을 기재한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다.The kit of the present invention can preferably be used for the detection of mutations of the NRAS gene by PCR reaction using the primer / probe set of the present invention. The kit of the present invention may further comprise tools and / or reagents known in the art used for PCR or detection thereof. The kit of the present invention may further comprise a tube, a well plate, an instructional material describing a method of use and the like to be used for mixing the components as necessary.
아울러, 본 발명의 키트는 RUO (research use only) 또는 IVD (investigation use only) 키트일 수 있다. IVD 키트에는 IVD-CDx 키트도 포함된다.In addition, the kit of the present invention may be a research use only (RUO) or an investigation use only (IVD) kit. IVD kits also include IVD-CDx kits.
한편, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 21 내지 26 로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다. On the other hand, the present invention is characterized in that a polynucleotide set of the forward primer of SEQ ID NO: 1, the reverse primer of SEQ ID NO: 2, the forward primer of SEQ ID NO: 3, the reverse primer of SEQ ID NO: 4 and the probe selected from the group of SEQ ID NOs: The present invention provides a kit for detecting an NRAS gene mutation.
본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 27 내지 32로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다. The present invention relates to a polynucleotide set comprising a forward primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a forward primer of SEQ ID NO: 3, an inverted primer of SEQ ID NO: 4 and a polynucleotide set of probes selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 27 to 32 The present invention provides a kit for detecting an NRAS gene mutation.
또한, 본 발명은 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 정방향 프라이머, 및 서열번호 34 내지 36으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다. The reverse primer of SEQ ID NO: 6, the reverse primer of SEQ ID NO: 6, the forward primer of SEQ ID NO: 7, the forward primer of SEQ ID NO: 8, and the reverse primer of SEQ ID NO: And a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of 34 to 36 as an active ingredient.
또한 본 발명은 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머 및 서열번호 37 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다. The present invention also relates to a polynucleotide set of the forward primer of SEQ ID NO: 3, the reverse primer of SEQ ID NO: 4, the forward primer of SEQ ID NO: 9, the reverse primer of SEQ ID NO: 10 and the probes selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 37 to 41, The present invention provides a kit for detecting an NRAS gene mutation.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 정방향 프라이머, 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 42 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.The reverse primer of SEQ ID NO: 12, the forward primer of SEQ ID NO: 13, the forward primer of SEQ ID NO: 14, the reverse primer of SEQ ID NO: 12, the reverse primer of SEQ ID NO: And a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 42 to 45 as an active ingredient.
본 발명은 또한 서열번호 16의 정방향 프라이머, 서열번호 17의 역방향 프라이머, 서열번호 18의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 19의 정방향 프라이머, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 46 내지 48로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다. The reverse primer of SEQ ID NO: 18, the reverse primer of SEQ ID NO: 6, the forward primer of SEQ ID NO: 19, the forward primer of SEQ ID NO: 20 and the primer of SEQ ID NO: 48 as a polynucleotide set of an NRAS gene mutation.
본 발명의 키트는 qPCR (quantitative PCR) 또는 digital PCR 방법에 사용되는 것이다. The kit of the present invention is used in qPCR (quantitative PCR) or digital PCR method.
본 발명의 키트에 적용가능한 주형은 NRAS의 돌연변이 검출이 필요하며, PCR 반응이 가능한 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 본 발명의 키트는 FFPE (formalin fixed parafin embedded) 조직에서 분리된 DNA 또는 상기 조직 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA, 또는 혈액에서 분리된 cfDNA(cell-free DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. The template applicable to the kit of the present invention can be used without restriction as long as mutation detection of NRAS is required and PCR reaction is possible. Preferably, the kit of the present invention comprises DNA isolated from FFPE (formalin fixed paraffin embedded) A cDNA synthesized from a tissue-derived RNA by a reverse transcription reaction, or a cfDNA (cell-free DNA) isolated from blood as a template.
인간 혈장에서 순환하는 cfDNA는 염증성 장애, 산화 스트레스 및 악성 종양 등의 다양한 생리학적 및 병리학적 병태들에서 연구되고 있다. cfDNA의 혈류 방출과 관련된 정확한 기전은 불확실하지만, 아마도 세포자살, 세포괴사 및 세포로부터의 능동적인 방출이 종합적으로 작용하는 것으로 보인다. 혈관을 통해 순환하는 cfDNA는 잠재적으로 유용한 바이오마커이다. DNA 수준과 단편화 패턴은 진단 및 예후 예측 목적으로 흥미로운 가능성을 제시한다. 특히 환자의 혈액에서 간단히 검출할 수 있다는 점에서 삶의 질을 크게 훼손하지 않고 간편하고 신속하게 바이오마커를 검출할 수 있다는 유용성이 있다. CfDNA circulating in human plasma has been studied in a variety of physiological and pathological conditions such as inflammatory disorders, oxidative stress and malignant tumors. The precise mechanism involved in the release of cfDNA into the bloodstream is unclear, but seems likely to be a synergistic effect of apoptosis, cellular necrosis and active release from cells. CfDNA circulating through blood vessels is a potentially useful biomarker. DNA levels and fragmentation patterns present interesting potential for diagnostic and prognostic prediction purposes. In particular, the biomarker can be detected easily and rapidly without deteriorating the quality of life because the biomarker can be easily detected from the patient's blood.
생검 후 환자에게서 얻은 조직은 통상적으로 포르말린(포름알데히드) 등에 의해서 고정화한다. 고정화한 생물학적 샘플은 일반적으로 탈수시키고, 파라핀 등의 고체 지지체에 포매하며, 이렇게 제조된 시료를 FFPE 시료라고 한다. FFPE 시료 상의 핵산, 특히 DNA는 고정된 세포에 존재하고, 단편화 되어 있거나 포르말린에 의해 교차 결합되어 있으므로 파라핀을 제거하고 고정된 세포를 용해하여 DNA를 비롯한 핵산을 세포 내에서 용출시킬 필요가 있다.The tissue obtained from the patient after biopsy is usually fixed with formalin (formaldehyde) or the like. The immobilized biological sample is generally dehydrated and embedded in a solid support such as paraffin, and the sample thus prepared is called an FFPE sample. Nucleic acids in the FFPE sample, especially DNA, are present in immobilized cells and are either fragmented or cross-linked by formalin, so it is necessary to remove the paraffin and dissolve the fixed cells to elute the DNA and other nucleic acids in the cells.
본 발명에 있어서 용어 “파라핀”은 형태학적, 면역조직화학적 및 효소조직화학적인 해석을 포함하는 모든 해석에 있어서 사용되는 생체시료의 포매 매체를 포괄적으로 말하는 것이다. 즉, 본 발명에 있어서의 파라핀은 석유계 파라핀 왁스 단체(單體)여도 되고, 당해 석유계 파라핀 왁스를 기제(基劑)로 하여, 포매 매체의 품질향상 등의 목적으로 첨가될 수 있는 모든 다른 성분을 포함한 것이어도 된다. 여기서, 석유계 파라핀 왁스는 석유에 유래하는 상온에서 고형인 탄화수소류의 혼합물을 말한다.In the present invention, the term " paraffin " comprehensively refers to a foraging medium of a biological sample used in all analyzes including morphological, immunohistochemical and enzymatic histochemical analysis. That is, the paraffin in the present invention may be a petroleum-based paraffin wax alone, and may be any one selected from the group consisting of all kinds of petroleum-based paraffin waxes, May be included. Herein, the petroleum paraffin wax refers to a mixture of hydrocarbons which are solid at room temperature derived from petroleum.
일반적으로 FFPE 처리된 암 환자의 검체 시료를 회전식 미세톱 (rotary microtome)으로 5~10μm 의 두께로 절단한 다음 상용의 FFPE 용 핵산 분리 키트 또는 이를 활용하는 장치를 통해 DNA를 포함하는 핵산을 분리할 수 있다. FFPE에서 핵산을 분리하는 키트/장치는 예를 들어 지멘스 사의 Tissue Preparation System 및 이와 관련된 시약 (VERSANT tissue preparation reagents)을 들 수 있다.In general, a specimen of a cancer patient treated with FFPE is cut into a thickness of 5 to 10 μm using a rotary microtome, and then a nucleic acid containing DNA is isolated through a commercially available nucleic acid separation kit for FFPE or a device utilizing the same . Kits / devices for separating nucleic acids from FFPE include, for example, the Tissue Preparation System from Siemens and VERSANT tissue preparation reagents.
아울러, 본 발명의 키트는 혈액에서 분리된 CTC (circulating tumor cell)에서 분리된 DNA 또는 상기 CTC 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA를 주형으로 할 수 있다. CTC는 악성 종양 환자의 말초혈액에서 발견되는 종양세포이다. CTC가 암전이 과정에서 중요한 역할을 하기 때문에 CTC는 암의 연구, 진단 등에 있어서 매우 중요하게 여겨지고 있으나, 말초혈액 내 순환종양세포 존재 수가 매우 드물어, 수백만 개 이상의 정상 혈구세포에 섞여 있는 수십 개 이하의 종양세포를 검출할 수 있는 정도의 민감도가 요구되는 검출 시스템이 필요하다. In addition, the kit of the present invention can be used as a template for DNA isolated from blood circulating CTC (circulating tumor cell) or cDNA synthesized by reverse transcription from the CTC-derived RNA. CTC is a tumor cell found in the peripheral blood of a malignant tumor patient. Because CTC plays an important role in the process of metastasis, CTC is considered to be crucial in the study and diagnosis of cancer, but the number of circulating tumor cells in the peripheral blood is very rare, and there are fewer than a dozen There is a need for a detection system that requires a degree of sensitivity to detect tumor cells.
본 발명에서 치료 반응성은 암의 성장률이 치료제와 접촉하지 않은 그의 성장과 비교해서 치료제와 접촉한 결과로서 억제된다면 치료제에 대해서 "반응성"이라고 정의할 수 있다. 암의 성장은 다양한 방식으로 측정될 수 있고, 예를 들어, 종양의 크기 또는 그 종양 유형에 적합한 종양 마커의 발현이 측정될 수 있다. 아울러, 상기 “반응성”에는 유의미한 생존곡선상의 생존시기의 증가를 나타낼 수도 있다. The therapeutic response in the present invention can be defined as "responsive" to a therapeutic agent if the growth rate of the cancer is inhibited as a result of contact with the therapeutic agent as compared to its growth in the absence of contact with the therapeutic agent. The growth of cancer can be measured in various ways, for example, the expression of a tumor marker suitable for the size of the tumor or its tumor type can be measured. In addition, the above " reactivity " may indicate an increase in survival time on a significant survival curve.
암은 성장률이 치료제와 접촉하지 않은 그의 성장과 비교해서 치료제와 접촉한 결과로서 매우 낮은 정도로 억제되거나 억제되지 않는다면 치료제에 대해서 "비반응성"이다. 위에서 언급된 바와 같이, 암의 성장은 다양한 방식으로 측정될 수 있고, 예를 들어, 종양의 크기 또는 그 종양 유형에 적합한 종양 마커의 발현이 측정될 수 있다. 비반응성의 척도는 환자의 삶의 질, 전이도 등을 비롯하여 종양의 성장 크기를 넘는 추가의 기준을 이용해서 평가될 수 있다.Cancer is "non-responsive" to the therapeutic agent unless the growth rate is suppressed or suppressed to a very low extent as a result of contact with the therapeutic agent as compared to its growth not in contact with the therapeutic agent. As noted above, cancer growth can be measured in a variety of ways, for example, the expression of tumor markers suitable for the size of the tumor or its tumor type can be measured. Non-responsive measures can be assessed using additional criteria beyond the growth size of the tumor, including the patient's quality of life, metastasis, and the like.
암 치료제에 대한 치료 반응성으로 EGFR (epidermal growth factor receptor)의 저해제에 대한 치료 반응성일 수 있으며, 이에 따라 본 발명의 암은 악성흑색종, 백혈병, 갑상선암, 직장대장암 및 폐암 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The cancer of the present invention may be malignant melanoma, leukemia, thyroid cancer, colorectal cancer, and lung cancer. However, the cancer of the present invention is not limited thereto. It is not.
Ras 유전자의 변이는 암의 유전적 변이에 있어서 가장 흔하게 발견되는 돌연변이 중 하나이다. 이 중 NRAS 돌연변이는 GTP를 GDP로 가수분해하는 NRAS의 기능에 영향을 주어 NRAS가 계속적으로 활성화 상태가 되도록 한다. NRAS 유전자의 엑손 2 및 3에서의 돌연변이는 잘 알려져 있으며, 최근 엑손 4에서의 돌연변이가 발견되었고, 이는 대장암 환자에서 약물의 반응성에 영향을 미친다는 것이 보고되고 있다(BMJ Open. 2014 May 23;4(5):e004652.). Mutations in the Ras gene are one of the most commonly found mutations in the genetic mutation of cancer. Among them, the NRAS mutation affects the function of NRAS hydrolyzing GTP to GDP, so that NRAS is continuously activated. Mutations in the NRAS gene in
NRAS의 유전자 돌연변이는 20%의 악성흑색종, 12%의 백혈병, 8% 갑상선암 및 2~3%의 대장암 환자에서 발견이 되는 것으로 보고되고 있다. 악성 흑색종, 갑상선암 및 대장암에서 NRAS의 돌연변이는 주로 codon 61에서 발견이 되나, 혈액암에서는 다양한 코돈에서의 돌연변이가 병변에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. NRAS 유전자의 돌연변이는 방사선 요법 및 EGFR 저해제 치료 요법에 대한 저항성과 연관이 있는 것으로 보고되고 있다. NRAS 변이가 존재하면 세툭시맵 또는 파니툼맵에 대한 약효가 나타나지 않을 것이라는 점이 예측될 수 있기 때문에, 변이된 NRAS 를 지니는 환자들은 이들 EGFR 억제제를 이용한 치료 요법에 대한 효과를 나타내지 못할 수 있다.NRAS gene mutations have been reported to be found in 20% of malignant melanoma, 12% of leukemia, 8% of thyroid cancer, and 2% to 3% of colorectal cancer patients. Mutations in NRAS in malignant melanoma, thyroid cancer, and colorectal cancer are mainly found in codon 61, but mutations in various codons have been reported to affect lesions in hematologic malignancies. Mutations in the NRAS gene have been reported to be associated with resistance to radiotherapy and EGFR inhibitor therapy. Patients with mutated NRAS may not be able to demonstrate the efficacy of these EGFR inhibitors in treatment regimens, since it is predictable that the NRAS mutation will not have an effect on cetuximab or panitum mapp.
악성흑색종, 백혈병, 갑상선암, 직장대장암, 폐암 등의 암을 치료하기 위하여 다양한 EGFR 표적 약물이 개발되었으며, 이의 대표적인 예로는 세툭시맵(cetuximab) 또는 파니툼맵(panitumumab)를 들 수 있다. A variety of EGFR target drugs have been developed to treat cancers such as malignant melanoma, leukemia, thyroid cancer, colorectal cancer, and lung cancer. Representative examples thereof include cetuximab or panitumumab.
본 발명의 시료에서 분리되는 핵산은 바람직하게는 게놈 DNA이며, 더 바람직하게는 돌연변이를 보유하고 있을 것으로 추정되는 게놈 DNA이다. The nucleic acid isolated from the sample of the present invention is preferably a genomic DNA, more preferably a genomic DNA presumed to have a mutation.
본 발명의 조성물 또는 키트는 바람직하게는 자동화 또는 반자동화된 방법의 NRAS 돌연변이 검출에 이용될 수 있다. 상기에서 자동화는 샘플 (시료)의 투입; 추출, 분리, 반응이 완료된 기재 (예를 들어, 튜브, 플레이트)의 재배치 또는 이동; 시약, 버퍼의 스톡 (stock)에의 투입, 보충; 장비의 유지관리를 제외한 전부 또는 대부분 과정이 인간 이외의 수단 (예를 들어, 로봇)을 통해서 이루어지는 것을 의미한다.The compositions or kits of the invention can preferably be used for NRAS mutation detection in automated or semi-automated methods. In the above, automation can be achieved by injecting a sample (sample); Relocation or movement of a substrate (e.g., tube, plate) that has been extracted, separated, or reacted; Reagent, buffer stock, replenishment; Means that all or most of the process, except equipment maintenance, takes place through means other than human (for example, a robot).
본 발명의 조성물 또는 키트는 NRAS 유전자의 돌연변이의 검출에 있어서 우수한 민감도로 돌연변이 검출하였으며, NRAS와 높은 homologous를 보이는 K-ras와 교차반응 없이 각 키트에 상응하는 돌연변이 사이트만을 검출하는 우수한 특이도를 나타내었다. The composition or kit of the present invention was mutated in the detection of mutation of NRAS gene with excellent sensitivity and showed excellent specificity for detecting only the mutant site corresponding to each kit without cross reaction with K-ras showing high homologous with NRAS .
참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990); Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997); Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987); De Andres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995); Held et al., Genome Research 6:986-994 (1996); T.E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)). For reference, the above-mentioned nucleotide and protein work can be referred to the following references (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); Sambrook et al Inc., San Diego, Calif. (1990), < RTI ID = 0.0 > Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press De Andres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995); Held et al., ≪ Diagnostic 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol., 158: 419 -29 (2001)).
본 발명의 프라이머/프로브 세트는 암 환자의 치료제에 대한 반응성 예측, 진단뿐만 아니라 암의 전이 또는 재발에 대한 예측이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.The primer / probe set of the present invention can predict the reactivity of a cancer patient to a therapeutic agent, and can predict not only the diagnosis but also the metastasis or recurrence of the cancer. Therefore, the primer / probe set can be used for the purpose of judging the necessity of administration of the anti- Can be usefully used.
도 1은 표준물질로 사용될 mini-clone의 모식도롤 나타낸 도면이다.
도 2는 NC1-F6 정방향 프라이머 및 NC1-R61 역방향 프라이머 쌍의 검출 민감도 및 직선성을 평가한 결과이다(A: 검출 민감도, B: 검출 직선성)
도 3은 NC23-F4 정방향 프라이머 및 NC23-R4 역방향 프라이머 쌍의 검출 민감도 및 직선성을 평가한 결과이다(A: 검출 민감도, B: 검출 직선성)
도 4는 NC39-F8 정방향 프라이머 및 NC39-R10 역방향 프라이머 쌍의 검출 민감도 및 직선성을 평가한 결과이다(A: 검출 민감도, B: 검출 직선성)
도 5는 NC39-F10 정방향 프라이머 및 NC39-R9 역방향 프라이머 쌍의 검출 민감도 및 직선성을 평가한 결과이다(A: 검출 민감도, B: 검출 직선성)
도 6은 NRAS 돌연변이 검출용 키트에 포함된 프라이머 구성, 프로브의 구성 및 검출 가능한 돌연변이의 종류를 나타낸 것이다.
도 7은 NRAS 돌연변이 검출용 프로브들이 NRAS 돌연변이를 특이성 있게 검출하는지를 교차반응 여부로 평가한 결과를 나타낸 도면이다(A: NP8, B: NP9-1, C: NP10, D: NP11-1, E: NP12, F: NP13).
도 8은 NRAS allele specific-NC14 프라이머가 KRAS와 교차반응을 하는지 여부를 평가한 결과이다(A: NC14, B: NRAS exon 3, 4 miniclone, C: KRAS cxon 2, 3, 4 miniclone).
도 9는 NRAS와 높은 homologou를 갖는 KRAS 돌연변이 miniclone을 이용하여 본 발명의 프라이머 및 프로브가 교차반응을 나타내는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 도면이다(A: NP4-CP:21, B: NP6-CP:22, C: NP18-CP: 22, D: NP10-CP:22).
도 10은 NRAS 돌연변이 검출용 프로브와 NRAS 돌연변이 miniclone들 간의 교차반응 여부에 대한 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 NRAS 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브가 ddPCR 적용시 NRAS와 높은 homologuou를 가지는 KRAN 돌연변이 miniclone과 교차반응을 하는지 여부에 대한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 allele specific-NC15 프라이머 및 allele specific-NC16 프라이머들의 직진성을 평가한 결과이다.
도 13은 본 발명의 NRAS 돌연변이 검출용 키트 내 MMX1, MMX3 및 MMX6에 포함된 프로브 mixture에 대한 해당 돌연변이 site에 대한 특이도를 평가한 결과이다.
도 14는 같은 형광을 갖는 allele specific-프라이머 상호간에 간섭받지 않고 각 프라이머에 해당하는 돌연변이 site를 검출할 수 있는지 여부를 평가한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 블로커 올리고뉴클레오티드를 사용하였을 때의 돌연변이 검출 효과를 평가한 결과이다.
도 16는 NRAS 돌연변이 검출용 키트의 MMX1 또는 MMX2의 프라이머 및 프로브가 해당 돌연변이 site를 검출할 수 있는지 여부를 평가한 결과이다.
도 17는 NRAS 돌연변이 검출용 키트의 MMX3 또는 MMX4의 프라이머 및 프로브가 해당 돌연변이 site를 검출할 수 있는지 여부를 평가한 결과이다.
도 18은 NRAS 돌연변이 검출용 키트의 MMX5 또는 MMX6의 프라이머 및 프로브가 해당 돌연변이 site를 검출할 수 있는지 여부를 평가한 결과이다.
도 19는 FFPE reference 표준샘플에서 NRAS 돌연변이 검출용 키트가 NRAS 돌연변이를 검출할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, horizon사의 FFPE 조직 (HD412와 HD351)에서 추출한 DNA(Q61L, Q61K)와 human genomic DNA(#G3041,Promega, LOT#0000092266)내 돌연변이 site를 본 발명의 키트로 검출한 결과이다.
도 20은 돌연변이 빈도수(frequency)를 제공하는 FFPE reference 표준샘플에서 본 발명의 NRAS 돌연변이 검출키트가 검출해 낸 돌연변이 copy 수를 측정한 결과이다. Fig. 1 is a schematic diagram of a mini-clone used as a reference material.
Figure 2 shows the results of detection sensitivity and linearity of NC1-F6 forward primer and NC1-R61 reverse primer pairs (A: detection sensitivity, B: detection linearity)
Figure 3 shows the results of detection sensitivity and linearity of the NC23-F4 forward primer and NC23-R4 reverse primer pairs (A: detection sensitivity, B: detection linearity)
Figure 4 shows the results of the detection sensitivity and linearity of NC39-F8 forward primer and NC39-R10 reverse primer pairs (A: detection sensitivity, B: detection linearity)
Figure 5 shows the results of the detection sensitivity and linearity of NC39-F10 forward primer and NC39-R9 reverse primer pairs (A: detection sensitivity, B: detection linearity)
FIG. 6 shows the primer configuration, probe configuration, and detectable mutations included in the NRAS mutation detection kit.
FIG. 7 is a graph showing the results of cross reactivity of NRAS mutation detection probes with NRAS mutation. (A: NP8, B: NP9-1, C: NP10, D: NP11-1, E: NP12, F: NP13).
Figure 8 shows the results of NRAS allele specific-NC14 primers cross-reacting with KRAS (A: NC14, B:
FIG. 9 is a graph showing the results of confirming whether a primer and a probe of the present invention exhibit a cross-reaction using a KRAS mutant miniclone having NRAS and a high homologue (A: NP4-CP: 21, B: NP6- 22, C: NP18-CP: 22, D: NP10-CP: 22).
FIG. 10 is a graph showing the results of experiments on the cross reaction between NRAS mutation detection probes and NRAS mutant miniclones.
Figure 11 shows the results of whether the NRAS mutation detection primer and probe cross-react with NRAS and KRAN mutant miniclone with high homologue in ddPCR application.
12 shows the results of evaluating the linearity of allele specific-NC15 primers and allele specific-NC16 primers.
FIG. 13 shows the results of evaluating the specificity of the mutant site of the probe mixture contained in MMX1, MMX3 and MMX6 in the NRAS mutation detection kit of the present invention.
FIG. 14 is a graph showing the results of an experiment evaluating whether or not a mutant site corresponding to each primer can be detected without interfering with allele specific primers having the same fluorescence.
Fig. 15 shows the results of evaluating the mutation detection effect when the blocker oligonucleotide was used.
16 is a result of evaluating whether primers and probes of MMX1 or MMX2 of the NRAS mutation detection kit can detect the corresponding mutant site.
Fig. 17 is a result of evaluating whether primers and probes of MMX3 or MMX4 of the NRAS mutation detection kit can detect the corresponding mutant site.
Fig. 18 is a result of evaluating whether primers and probes of MMX5 or MMX6 of the NRAS mutation detection kit can detect the corresponding mutant site.
19 is a graph showing the relationship between the NRAS mutation detection kit and the DNA extracted from horizon's FFPE tissue (HD412 and HD351) (Q61L, Q61K) and human genomic DNA (# G3041, Promega, LOT # 0000092266) was detected with the kit of the present invention.
Figure 20 shows the results of measuring the number of mutant copies detected by the NRAS mutation detection kit of the present invention in a FFPE reference standard sample providing a mutation frequency.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
<실시예 1>≪ Example 1 >
표준물질로 사용될 clone의 제작Fabrication of a clone to be used as a reference material
디자인된 프라이머와 프로브를 검증하기 위해, 그리고 ddPCR 수행에 필요한 표준물질을 만들기 위해 본 연구단계에서 mini-clone을 제작하였다. Mini-clone의 제작과정은 먼저 EGFR의 각각 exon에서 돌연변이가 일어난 구간, 즉 probe 위치를 가운데로 하여 약 300bp을 합성하였다. 합성된 die 300bp DNA fragment는 vector pUC57 vector의 universal link sequence 사이에 삽입하고(도 1 참조), 제작된 clone은 대장균 DH5α 세포에 형질전환 (transformation) 시켰다.To validate designed primers and probes, and to make the reference material required for ddPCR performance, mini-clones were constructed in this study. The production of the mini-clone was first about 300 bp in the region of mutation in each exon of EGFR. The synthesized die 300bp DNA fragment was inserted between the universal link sequence of the vector pUC57 vector (see FIG. 1), and the clone was transformed into E. coli DH5α cells.
<실시예 2>≪ Example 2 >
프라이머/프로브 디자인 및 선발Primer / probe design and selection
대장직장암 관련 유전자인 NRAS의 바이오 마커를 개발하기 위해 cosmic번호 (http://cancer.sanger.ac.uk)를 기반으로 하여 돌연변이 위치를 확인하였다. 유전자의 exon별 프라이머를 primer3 plus 프로그램과 PyroMa가 Assay Design 2.0을 사용하여 NRAS aexon 2,3,4의 forward는 모두 intron부분과 overlapping될 수 있도록 디자인 하였으나 reverse primer는 forward primer와 맞는 조건을 찾기위해 intron 부분이 포함되지 않은 것도 포함되었다. 이 때, 프라이머의 Tm값은 58~60℃로 하였으며 GC%는 40~60%로 디자인하였다. 프라이머 다이머 및 헤어핀 루프를 확인한 후 Blast search를 통해 해당 서열들의 homology를 확인 하였다. In order to develop a biomarker for NRAS, a gene related to colorectal cancer, a mutation site was identified based on a cosmic number (http://cancer.sanger.ac.uk). The forward primer of the gene was designed to overlap with the intron part of the
프로브는 조건을 충족하는 것들을 선별하여 taqman probe로 디자인하였다. 5‘ wild type 프로로브에는 HEX/FAM reporter fluorescence를 부착하였으며, 5’ mutant probe에는 FAM dye를 부착하여 이후에 증폭 여부를 검출가능하도록 하였다. 모든 프로브의 3' 쪽에는 quencher로 BHQ1를 사용하였다. NRAS exon 2, 3, 4번에 각각 10, 5, 5개의 프로브들이 final로 결정되어 프로브들을 디자인하여 합성하였다. 본 발명자들에 의해 디자인된 프로브는 allele specific을 갖고 있으며 대부분의 프로브들이 cosmic 번호를 가지고 있었다.The probes were designed with the taqman probe to select those that met the criteria. HEX / FAM reporter fluorescence was attached to the 5 'wild type prolove, and FAM dye was attached to the 5' mutant probe to detect the amplification. BHQ1 was used as a quencher on the 3 'side of all probes. 10, 5, and 5 probes were finalized in
NRAS의 exon 별 10쌍이상의 프라이머(Forward, Reverse set)를 선별하여 SYBR green을 이용해 serial dilution한 9개의 wild type miniclone 을 template로 하여 saturation point 와 R2 값이 0.999에 가까운 프라이머 1쌍을 선정하여 이후 실험에 사용하였다. 프라이머 농도는 10 pmoles/ul로 결정하여 사용하였다. NRAS exon primers (forward and reverse set) were selected, and nine pairs of wild type miniclone serially diluted with SYBR green were used as a template. One pair of primers with a saturation point and R 2 value close to 0.999 were selected. Was used for the experiment. The primer concentration was determined to be 10 pmoles / ul.
이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다. The results are shown in Fig.
도2 는 NRAS RUO kit 구성을 위한 선택된 primer 들로서 선택요건을 프라이머의 민감도를 테스트하였다. 민감도를 알아보기 위한 항목들은 프라이머가 작동가능한 DNA의 시료농도를 희석하여 측정범위 산출하였으며 또한 그 측정범위의 최소 량도 산출하였다. 또한 이 프라이머의 성능을 알아보는 지표로는 지선성을 산출하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 프라이머 선별을 하기 위해 109 에서 101 까지의 miniclone DNA 카피수를 이용하여 직선성 값을 구한 결과, 모든 프라이머의 Cp값 20~24 로 안정한 값을 취하며 직선성의 R2이 0.99이상을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 프라이머의 민감도는 miniclone의 101 카피에서도 보이고 있어 매우 우수한 것으로 확인되었다. Figure 2 shows the selection of primers for the construction of NRAS RUO kit and tested the sensitivity of primers to selection requirements. Sensitivity was calculated by diluting the sample concentration of the primer - operable DNA and calculating the minimum amount of the measurement range. Also, the branching property was calculated as an index to check the performance of the primer. As shown in FIG. 2, the linearity value was obtained by using the number of copies of miniclone DNA from 10 9 to 10 1 for primer selection. As a result, Cp value of all the primers was stable to 20 to 24, 2 was more than 0.99. The sensitivity of the primers was also confirmed in 101 copies of the miniclone.
한편, background(noise)를 줄이기 위해 돌연변이 위치에 상응하는 야생형 시퀀스를 이용하여 돌연변이 검출용 프로브가 야생형 시퀀스에 non-specific하게 결합하지 못하도록 blocker oligomer를 제작하였다. In order to reduce the background noise, a blocker oligomer was constructed so that the probe for mutation detection could not be non-specifically bound to the wild type sequence by using a wild type sequence corresponding to the mutation position.
디자인된 프라이머(표 1), 프로브(표 2) 및 블로커(표 3)의 정보는 다음과 같다.The information of the designed primer (Table 1), the probe (Table 2) and the blocker (Table 3) are as follows.
상기 제작된 프라이머와 프로브를 조합하여 NRAS의 총 43개의 돌연변이를 검출할 수 있는 NRAS 돌연변이 검출용 RUO 키트를 구성하였으며, 상기 키트에 포함된 조성물의 구성은 도 6에 나타내었다. A NRU mutation detection RUO kit capable of detecting 43 mutations of NRAS in total was constructed by combining the prepared primers and probes, and the composition of the composition contained in the kit is shown in FIG.
<실시예 3>≪ Example 3 >
프로브, 프라이머의 특이성 테스트Specificity test of probe and primer
프로브가 서로 다른 돌연변이 clone과도 교차반응이 일어나는지를 알아보기 위해 NRAS 돌연변이 위치에 특이적으로 결합하는 프로브를 디자인하였다. 상기 디자인된 프로브 선별 과정에서 Ct값이 20~25를 해당하는 copy수인 105 copy의 miniclone template를 이용하여 각각의 프로브가 같은 엑손 또는 다른 엑손의 돌연변이간 cross-reactivity가 있는지 여부를 qPCR로 확인하였다.To investigate whether the probe cross-reacts with different mutant clones, we designed a probe that specifically binds to the NRAS mutation site. Using the miniclone template of 10 5 copies with a copy number of 20 to 25 in the designed probe selection process, qPCR was used to determine whether each probe had cross-reactivity between mutations of the same exon or other exon .
qPCR 조건은 선행된 실험 조건을 따라 annealing/extension 온도를 67℃로 올려 30cycle로 증폭으로 실험을 수행하였고, 따라서 이후 실험에 사용하는 모든 프로브의 농도를 2pmoles/ul, annealing/extension 온도는 67℃, 30cycle로 고정으로 PCR 조건을 확립하였다. The qPCR conditions were amplified to 30 cycles by raising the annealing / extension temperature to 67 ° C according to the preceding experimental conditions. Therefore, the concentration of all probes used in the following experiments was 2 pmoles / l, annealing / extension temperature was 67 ° C, The PCR conditions were established with 30 cycles.
본 발명의 상기 프로브들이 NRAS 돌연변이를 특이성 있게 검출하는지를 교차반응 여부를 통해 평가하였으며, 이에 대한 결과를 도 7에 나타내었다. Whether or not the probes of the present invention specifically detect NRAS mutation was evaluated through cross-reactivity, and the results are shown in FIG.
도 7에 나타낸 바와 같이, 각각의 프로브는 각각의 미니클론에서 특이도를 보였으며, Exon2 안에 위치한 각 mutation 프로브를 같은 exon2와 다른 exon 3,4 모두와 교차 반응을 수행한 결과 각 프로브 간에 상응하는 miniclone 및 같은 codon에만 특이도를 보이고 다른 exon간에는 교차반응이 없어 매우 우수한 검출 특이도를 나타내는 것을 확인하였다. As shown in Fig. 7, each probe showed specificity in each mini-clone, and each mutation probe located in Exon2 was cross-reacted with the same exon2 and all
한편, 상기 NRAS 돌연변이 검출용 RUO 키트에 포함되어 있는 allele specific(AS) 프라이머간에 다중 PCR(multiplex PCR)을 수행하여 교차반응을 나타내는지 여부를 확인하였으며, 이에 대한 결과를 도 8에 나타내었다.. On the other hand, multiplex PCR was performed between the allele specific (AS) primers contained in the NRAS mutation detection RUO kit to confirm whether or not the cross reactivity was exhibited. The results are shown in FIG.
도 8에 나타낸 바와 같이, AS-NC14 primer는 같은 codon의 돌연변이들과 반응을 보였으나 같은 exon 내 다른 codon 돌연변이들 및 다른 NRAS exon 그리고 K-ras exon 2,3,4의 miniclone과 교차반응을 하지 않았음.As shown in FIG. 8, the AS-NC14 primer reacted with mutations of the same codon but did not cross-react with other codon mutants in the same exon and other NRAS exons and miniclone of K-
또한 NRAS와 높은 homologou를 같는 KRAS 돌연변이에 대해서도 본 발명의 프라이머 및 프로브가 교차반응을 나타내는지 여부를 확인하고지 실험을 수행하였으며, 이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다. Also, it was confirmed whether or not the primers and probes of the present invention exhibit cross-reactivity for KRAS mutation having high homology with NRAS, and the results are shown in FIG.
도 9에 나타낸 바와 같이, NRAS 프로브 NP4, NP6, NP18, NP10은 그에 상응하는 miniclone과 NRAS의 다른 exon 3, 4 그리고 KRAS exon 2, 3, 4 wild type miniclone을 이용하여 본 발명의 프라이머 및 프로브가 교차반응을 나타내는지 여부를 확인하고자 실험을 수행하였으며, 교차반응을 실험한 결과 각 프로브에 해당하는 miniclone을 이용한 Cp값은 21~22을 보였으며, 관계없는 miniclone과는 Cp값이 35이상으로 교차반응을 보이지 않는 것을 확인할 수 있었다. 9, the NRAS probes NP4, NP6, NP18, and NP10 correspond to the corresponding miniclone, NRAS
<실시예 4><Example 4>
ddPCR 적용시 프로브들의 특이성 테스트Testing the specificity of the probes when applying ddPCR
표준물질로서 제작된 miniclone을 이용하여 ddPCR(droplet digital PCR)을 이용한 기초실험을 수행하였다. Miniclone의 정량은 qubit으로 하였으며, DNA 정량은 Invitrogen사의 qubit으로 3번 정량하여 실험값으로 사용하였다. Circular form과 super coiled form 포함을 가지는 plasmid를 linearized 시켜줌으로써 ddPCR의 효율을 극대화할 수 있다. Incubator에서 30분 반응 후 5ul는 따로 취해서 Gel runing하여 확인하고 나머지 volume은 정량 후 103 copies/ul(1/10 step으로)되게 dilution하여 -20도 냉동고에 보관하였다. A basic experiment using ddPCR (droplet digital PCR) was performed using a miniclone prepared as a reference material. Quantitation of miniclone was performed with qubit, and DNA quantitation was quantified 3 times with Invitrogen qubit. The efficiency of ddPCR can be maximized by linearizing plasmids containing circular and supercoiled forms. After incubation for 30 minutes in Incubator, 5ul was taken separately and gel run was confirmed. The remaining volume was diluted to 10 3 copies / ul (1/10 step) after quantification and stored in freezer at -20 ° C.
Template로서 각 프로브에 맞는 digested NRAS miniclone들을 103 copy가 되게 넣어줌으로써 각 프로브(2pmole/ul)가 그에 상응하는 NRAS miniclone과 ddPCR이 잘 되는지 알아보기 위한 실험을 진행하였다. As a template, the experiment was conducted to determine whether the corresponding NRAS miniclone and ddPCR of each probe (2 pmole / ul) were well tolerated by inserting the digested NRAS miniclones corresponding to each probe into 10 3 copies.
또한, NRAS 프로브와 NRAS 돌연변이 miniclone들 간의 교차반응 여부에 대한 실험을 진행하였다. 즉, NRAS exon 2, 3, 그리고 4에 해당하는 모든 돌연변이 검출용 프로브들은 각 exon에 제작된 NRAS wild-type/ mutant miniclone들과 교차반응을 나타내는지 여부를 확인하고자 하였다. 실험의 조건은 총 reaction volume을 20ul하며 PCR 조건은 annealing과 extension 온도를 62℃로 하였다. ddPCR 반응에 사용된 샘플은 제작된 miniclone과 human genomic DNA(#G3041,Promega, LOT#0000092266)의 103 카피 (약 3.3ng)을 spiking 하여 50% 돌연변이 frequency로 만들어 사용하였다. We also investigated the cross-reactivity between NRAS probe and NRAS mutant miniclone. In other words, all mutation detection probes corresponding to
이에 대한 결과를 도 10에 나타내었다. The results are shown in Fig.
도 10에 나타낸 바와 같이, 103 카피의 같은 miniclone과 gDNA를 사용하여 실험을 수행한 결과 NRAS mutant를 검출하는 프로브에 상응하는 mutation 사이트에만 반응하는 특이도를 보여줌을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 10, when 10 3 copies of the same miniclone and gDNA were subjected to the experiment, it was confirmed that the NRAS mutant showed specificity reacting only to the mutation site corresponding to the probe detecting the mutant.
한편, 본 발명의 프라이머 및 프로브가 ddPCR 적용시 NRAS와 높은 homologuou를 가지는 NRAS 돌연변이 miniclone과 교차반응을 하는지 여부에 대한 실험을 진행하였고, 이에 대한 결과를 도 11에 나타내었다. Meanwhile, the present inventors carried out an experiment to determine whether the primers and probes of the present invention cross-react with NRAS mutant miniclone having NRAS and high homologue when ddPCR was applied, and the results are shown in FIG.
도 11에 나타낸 바와 같이, 각각의 프로브들은 103 카피의 각각의 프로브들은 103 카피의 NRAS AS-primer에 상응하는 NRAS miniclone을 사용하여 실험을 수행한 결과 NRAS AS-primer는 KRAS 및 NRAS의 다른 exon과 교차반응이 없었으며 각 프라이머에 상응하는 같은 codon mutation 사이트에만 반응하는 특이도를 보여주는 것을 확인하였다. As shown in FIG. 11, each probe of 10 3 copies was subjected to an experiment using NRAS miniclone corresponding to 10 3 copies of the NRAS AS-primer. As a result, the NRAS AS-primer was different from KRAS and NRAS exon and showed specificity to react only to the same codon mutation site corresponding to each primer.
<실시예 6>≪ Example 6 >
Allele specific 프라이머의 직선성 평가Evaluation of linearity of allele specific primers
103 카피로 고정된 DNA농도에서 돌연변이 빈도 %를 50%, 5%, 0.5%, 0.05%로 희석하여 allele specific 프라이머의 직선성을 평가하였다. 그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, R2 값이 1로 나타나, 이 primer 방식의 돌연변이 검출법도 유용하다는 것을 알 수 있었다. The linearity of the allele specific primers was evaluated by diluting the mutation frequency percentages to 50%, 5%, 0.5%, and 0.05% at 10 3 copies fixed DNA concentrations. As a result, as shown in Fig. 12, the R2 value was 1, and it was found that the mutant detection method using this primer method was also useful.
<실시예 7>≪ Example 7 >
동일 형광으로 구성된 프로브 또는 프라이머의 검출능 평가Evaluation of detection ability of probes or primers composed of the same fluorescence
하나의 mixture 안에 FAM 프로브 혹은 HEX 프로브을 섞어서 상호간에 간섭받지 않고 각 프로브 또는 프라이머에 해당하는 돌연변이 site를 검출할 수 있는지 여부를 평가하기 위한 실험을 진행하였다. Experiments were conducted to evaluate whether a mutant site corresponding to each probe or primer could be detected without interfering with each other by mixing FAM probe or HEX probe in one mixture.
이에 대한 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다. The results are shown in Fig. 13 and Fig.
도 13에 나타낸 바와 같이, 한 반응에 들어갈 같은 codon 돌연변이를 검출할 수 있는 프로브들의 mixture에 대한 특이도를 본 결과 gDNA에는 반응하지 않고 사용된 프로들에 해당하는 돌연변이 clone들을 검출할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. As shown in Fig. 13, the specificity of a mixture of probes capable of detecting the same codon mutation entering a reaction was confirmed, and it was confirmed that mutant clones corresponding to the used pros can be detected without reacting to gDNA I could.
또한 도 14에 나타낸 바와 같이, 같은 codon을 검출할 수 있는 allele specific-primer들을 한 반응에 섞어 실험한 결과 gDNA에사는 cut-off로 해당하는 돌연변이 miniclone들과 구분할 수 있었으며 해당하는 돌연변이 사이트를 검출할 수 있었다. Also, as shown in FIG. 14, allele specific primers capable of detecting the same codon were mixed in one reaction. As a result, gDNA Escherichia coli was able to be distinguished from mutant miniclone corresponding to cut-off, and the corresponding mutant site was detected I could.
또한, FAM/HEX 프로브들을 섞어서 다중 PCR을 수행할 때 서로 간섭받지 않고 각 프로브에 해당하는 돌연변이 site를 검출할 수 있는지 여부를 평가하기 위한 실험을 진행하였다. In addition, experiments were conducted to evaluate whether mutant sites corresponding to each probe can be detected without interfering with each other when multiplex PCR is performed by mixing FAM / HEX probes.
이에 대한 결과를 도 15 내지 도 17에 나타내었다. The results are shown in Figs. 15 to 17.
도 15 내지 도 17에 나타낸 바와 같이, 한 reaction (MMX)에 두 개의 exon에 해당하는 돌연변이 site을 혼합한 후, 두 exon을 구분하기 위해 각각의 TaqMan probe인 다른 형광색을 띄는 FAM과 HEX를 사용하였고 PCR 반응을 위한 프라이머도 두 exon 에 해당하는 프로브들을 혼합하여 반응하게 하였다. 프로브와 프라이머가 서로 혼합 되었지만 서로 간섭반응을 보이지 않고 해당하는 돌연변이 site만을 검출하는 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 15 to FIG. 17, two mutant sites corresponding to two exons were mixed in one reaction (MMX), and then different fluorescent color FAM and HEX were used to distinguish the two exons from each other Primers for PCR reaction were also prepared by mixing probes corresponding to two exons. It was confirmed that the probe and the primer were mixed with each other, but only the corresponding mutant site was detected without interference with each other.
또한 6개의 reaction을 통하여 41개의 NRAS 돌연변이를 검출할 수 있으며 codon으로 그 돌연변이를 구별할 수 있었다. 특히, MMX2에 Exon 2 WT probe, NP23-2를 이용하여 환자샘플에 대한 quality를 확인할 수 있도록 키트가 제작되었다. 또한, 본 키트는 MMX1에 대장직장암에 NRAS 돌연변이 (codon12와 codon61)의 frequency 가 높게 나타나는 프로브를 한 mixture에 반응하도록 디자인되었다. In addition, 41 NRAS mutations were detectable through six reactions and codons were used to distinguish the mutations. In particular, a kit was developed to confirm the quality of patient samples using MMX2 with
한편, 본 발명자들은 PCR 수행시 background (noise)를 줄이기 위해 돌연변이 위치에 상응하는 wild-type 서열을 이용하여 돌연변이 검출용 프로브가 야생형 서열에 non-specific 하게 binding 하지 못하도록 디자인 한 oligomer (블로커)를 추가적 디자인 하여 multiplex PCR 반응에 첨가하였다. 그 결과 도 18에 나타낸 바와 같이, 프로브들의 mix는 base line이 올라가는 것을 초래하여 non-specific 과 positive signal이 분리가 되지 않았으나 WT 블로커를 첨가한 결과 non-specific 과 분리가 용이하게 되는 것을 확인할 수 있었다. Meanwhile, the present inventors have proposed an oligomer (blocker) designed to prevent non-specific binding of a mutation detection probe to a wild-type sequence by using a wild-type sequence corresponding to a mutation site in order to reduce background noise Were designed and added to the multiplex PCR reaction. As a result, as shown in FIG. 18, the mixing of the probes resulted in the rise of the base line, so that the non-specific and positive signals were not separated, but it was confirmed that the addition of the WT blocker facilitates non-specific and separation .
<실시예 6>≪ Example 6 >
FFPE reference 표준샘플에 대한 돌연변이 검출능 평가Evaluation of mutation detection ability for FFPE reference standard samples
본 발명의 키트 조성물이 FFPE reference 표준샘플에서 돌연변이를 우수하게 검출할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, Horizon사의 FFPE 조직 (HD412와 HD351)에서 추출한 DNA(Q61L, Q61K)와 human genomic DNA(#G3041,Promega, LOT#0000092266)을 이용하여 본 연구의 RUO kit로 분석 하였다. (Q61L, Q61K) and human genomic DNA (# G3041, Q61K) extracted from Horizon's FFPE tissue (HD412 and HD351) in order to evaluate whether the kit composition of the present invention can detect the mutation excellently in the FFPE reference standard sample. Promega, LOT # 0000092266) using the RUO kit of this study.
이에 대한 결과를 도 19 및 도 20에 나타내었다. The results are shown in Figs. 19 and 20.
도 19에 나타낸 바와 같이, 각 돌연변이에 상응하는 NRAS 프로브로 검체 내의 돌연변이가 검출이 되었다. 또한 도 20에 나타낸 바와 같이 돌연변이 frequency를 제공하는 샘플로 검출 된 카피 수를 분석한 결과 reference와 정확한 카피수를 나타내어 본 발명의 키트가 우수한 돌연변이 검출능을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다. As shown in Fig. 19, a mutation in the sample was detected with NRAS probe corresponding to each mutation. Also, as shown in FIG. 20, the number of copies detected as a sample providing a mutation frequency was analyzed and it was confirmed that the kit of the present invention exhibits excellent mutation detection ability by showing a reference and an accurate copy number.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 프라이머/프로브 세트는 암 환자 예후의 치료제에 대한 반응성 예측, 진단뿐만 아니라 암의 전이 또는 재발에 대한 예측이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적으로 유용하게 사용할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다. As described above, the primer / probe set of the present invention is capable of predicting the reactivity of a cancer patient to a therapeutic agent, not only diagnosis but also cancer metastasis or recurrence, It is very useful for industrial purposes because it can be used for the purpose of suggesting clues.
<110> Gencurix Inc Seoul National University R&DB Foundation <120> Composition for detecting mutations of N-ras gene and kit comprising the same <130> np15-0094 <160> 52 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(NC1-F6) <400> 1 ggttcttgct ggtgtgaaat gact 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(NC1-R6) <400> 2 tctggattag ctggattgtc agtg 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(NC23-F4) <400> 3 cccccaggat tcttacagaa a 21 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(NC23-R4) <400> 4 cctgtcctca tgtattggtc tctc 24 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(AS-F14) <400> 5 ggtggtggtt ggagcaaa 18 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(AS2-R5) <400> 6 cctctatggt gggatcatat tca 23 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(AS-F15) <400> 7 tggtggtggt tggagcacc 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(AS-F16) <400> 8 tggtggtggt tggagcata 19 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(NC39-F10) <400> 9 gccaagagtt acgggattcc at 22 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(NC39-R9) <400> 10 ttgcacaaat gctgaaagct gta 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(AS-F30-1) <400> 11 gacatactgg atacagctgg ta 22 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(AS3-R4) <400> 12 ttattgatgg caaatacaca gag 23 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(AS-F32-3) <400> 13 catactggat acagctggaa g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(AS-F33-3) <400> 14 catactggat acagctggat t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(AS-F37-3) <400> 15 atactggata cagctggact g 21 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(NC39-F8) <400> 16 ttagggagca gattaagcga gta 23 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(NC39-R10) <400> 17 ttcgtgggct tgttttgtat c 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(AS-F19) <400> 18 gtggtggttg gagcaggtaa 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(AS-F20) <400> 19 tggtggttgg agcaggtta 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(AS-F21) <400> 20 ggtggttgga gcaggtgtc 19 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP24-1) <400> 21 ctggatacag ctggaaaaga agagtaca 28 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP25-1) <400> 22 tggatacagc tggacgagaa gagtac 26 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP2-2) <400> 23 tggttggagc aagtggtgtt g 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP3-1) <400> 24 tggtggttgg agcatgtggt g 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP5-2) <400> 25 tggttggagc agatggtgtt g 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP6-1) <400> 26 tggttggagc agttggtgtt g 21 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP8) <400> 27 ttggagcagg tagtgttggg aa 22 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP9-1) <400> 28 tggagcaggt tgtgttggga 20 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP10) <400> 29 tggttggagc aggtcgtgtt g 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP11-1) <400> 30 tggttggagc aggtgatgtt g 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP12) <400> 31 tggttggagc aggtgttgtt g 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP13) <400> 32 tggttggagc aggtgctgtt g 21 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP23-2) <400> 33 tggttataga tggtgaaacc tgtttg 26 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(AP2W) <400> 34 tgggaaaagc gcactgacaa 20 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP38-1) <400> 35 tggacatact ggatacagat ggacaag 27 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP43-2) <400> 36 tggacatact ggatacaact ggacaag 27 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP27-1) <400> 37 tggatacagc tggacatgaa gagtaca 27 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP28-1) <400> 38 tggatacagc tggacacgaa gagtac 26 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP31-1) <400> 39 tggatacagc tggagaagaa gagtaca 27 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP35-1) <400> 40 tggatacagc tggaccagaa gagtac 26 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP40-1) <400> 41 ttgaaacctc aaccaagacc agaca 25 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(AP3W) <400> 42 caatacatga ggacaggcga agg 23 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP4) <400> 43 tggtggttgg agcacgtgg 19 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP7) <400> 44 tggttggagc agctggtgtt 20 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP18) <400> 45 tggttggagc aggcggtgt 19 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(AP2W) <400> 46 tgggaaaagc gcactgacaa 20 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP41) <400> 47 tgggaaacaa ctgtgatttg cca 23 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(NP42-1) <400> 48 tgggaaacaa ttgtgatttg cc 22 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Blocker(N-ex3-b1) <400> 49 ctggatacag ctggacaaga agagt 25 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Blocker(N-ex2-b1) <400> 50 tggagcaggt ggtgttgg 18 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Blocker(N-ex4-b2) <400> 51 tgaaacctca gccaagacca ga 22 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Blocker(N-ex4-b1) <400> 52 gtgggaaaca agtgtgattt gc 22 <110> Gencurix Inc Seoul National University R & DB Foundation <120> Composition for detecting mutations of N-ras gene and kit comprising the same <130> np15-0094 <160> 52 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (NC1-F6) <400> 1 ggttcttgct ggtgtgaaat gact 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (NC1-R6) <400> 2 tctggattag ctggattgtc agtg 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (NC23-F4) <400> 3 cccccaggat tcttacagaa a 21 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (NC23-R4) <400> 4 cctgtcctca tgtattggtc tctc 24 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (AS-F14) <400> 5 ggtggtggtt ggagcaaa 18 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Primer (AS2-R5) <400> 6 cctctatggt gggatcatat tca 23 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (AS-F15) <400> 7 tggtggtggt tggagcacc 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (AS-F16) <400> 8 tggtggtggt tggagcata 19 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (NC39-F10) <400> 9 gccaagagtt acgggattcc at 22 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (NC39-R9) <400> 10 ttgcacaaat gctgaaagct gta 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (AS-F30-1) <400> 11 gacatactgg atacagctgg ta 22 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (AS3-R4) <400> 12 ttattgatgg caaatacaca gag 23 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (AS-F32-3) <400> 13 catactggat acagctggaa g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (AS-F33-3) <400> 14 catactggat acagctggat t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (AS-F37-3) <400> 15 atactggata cagctggact g 21 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (NC39-F8) <400> 16 ttagggagca gattaagcga gta 23 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (NC39-R10) <400> 17 ttcgtgggct tgttttgtat c 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (AS-F19) <400> 18 gtggtggttg gagcaggtaa 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (AS-F20) <400> 19 tggtggttgg agcaggtta 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (AS-F21) <400> 20 ggtggttgga gcaggtgtc 19 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP24-1) <400> 21 ctggatacag ctggaaaaga agagtaca 28 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP25-1) <400> 22 tggatacagc tggacgagaa gagtac 26 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP2-2) <400> 23 tggttggagc aagtggtgtt g 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP3-1) <400> 24 tggtggttgg agcatgtggt g 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP5-2) <400> 25 tggttggagc agatggtgtt g 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP6-1) <400> 26 tggttggagc agttggtgtt g 21 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP8) <400> 27 ttggagcagg tagtgttggg aa 22 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP9-1) <400> 28 tggagcaggt tgtgttggga 20 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP10) <400> 29 tggttggagc aggtcgtgtt g 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP11-1) <400> 30 tggttggagc aggtgatgtt g 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP12) <400> 31 tggttggagc aggtgttgtt g 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP13) <400> 32 tggttggagc aggtgctgtt g 21 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP23-2) <400> 33 tggttataga tggtgaaacc tgtttg 26 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (AP2W) <400> 34 tgggaaaagc gcactgacaa 20 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP38-1) <400> 35 tggacatact ggatacagat ggacaag 27 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP43-2) <400> 36 tggacatact ggatacaact ggacaag 27 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP27-1) <400> 37 tggatacagc tggacatgaa gagtaca 27 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP28-1) <400> 38 tggatacagc tggacacgaa gagtac 26 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP31-1) <400> 39 tggatacagc tggagaagaa gagtaca 27 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP35-1) <400> 40 tggatacagc tggaccagaa gagtac 26 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP40-1) <400> 41 ttgaaacctc aaccaagacc agaca 25 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (AP3W) <400> 42 caatacatga ggacaggcga agg 23 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP4) <400> 43 tggtggttgg agcacgtgg 19 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP7) <400> 44 tggttggagc agctggtgtt 20 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP18) <400> 45 tggttggagc aggcggtgt 19 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (AP2W) <400> 46 tgggaaaagc gcactgacaa 20 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP41) <400> 47 tgggaaacaa ctgtgatttg cca 23 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe (NP42-1) <400> 48 tgggaaacaa ttgtgatttg cc 22 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > Blocker (N-ex3-b1) <400> 49 ctggatacag ctggacaaga agagt 25 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > Blocker (N-ex2-b1) <400> 50 tggagcaggt ggtgttgg 18 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > Blocker (N-ex4-b2) <400> 51 tgaaacctca gccaagacca ga 22 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > Blocker (N-ex4-b1) <400> 52 gtgggaaaca agtgtgattt gc 22
Claims (22)
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 27 내지 32로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 정방향 프라이머, 및 서열번호 34 내지 36으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머 및 서열번호 37 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 정방향 프라이머, 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 42 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 16의 정방향 프라이머, 서열번호 17의 역방향 프라이머, 서열번호 18의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 19의 정방향 프라이머, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 46 내지 48로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
A reverse primer of SEQ ID NO: 2, a reverse primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, and a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 21 to 26,
A reverse primer of SEQ ID NO: 2, a reverse primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, and a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 27 to 32,
A forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 5, a reverse primer of SEQ ID NO: 6, a forward primer of SEQ ID NO: 7, a forward primer of SEQ ID NO: A polynucleotide set of a probe selected from the group,
A reverse primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a reverse primer of SEQ ID NO: 9, a reverse primer of SEQ ID NO: 10 and a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOs:
A forward primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a forward primer of SEQ ID NO: 11, a reverse primer of SEQ ID NO: 12, a forward primer of SEQ ID NO: 13, a forward primer of SEQ ID NO: A polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 42 to 45,
A forward primer of SEQ ID NO: 16, a reverse primer of SEQ ID NO: 17, a forward primer of SEQ ID NO: 18, a reverse primer of SEQ ID NO: 6, a forward primer of SEQ ID NO: 19, a forward primer of SEQ ID NO: 20, Wherein the polynucleotide set of the probe is selected from the group consisting of:
The primer and probe set composition according to claim 1, wherein the NRAS gene mutation detection is for predicting the responsiveness to an EGFR inhibitor.
3. The primer and probe set composition of claim 2, wherein the EGFR inhibitor is cetuximab or panitumumab.
2. The primer and probe set composition according to claim 1, wherein the probe is bound to a fluorescent material.
5. The primer and probe set composition according to claim 4, wherein the fluorescent material is at least one selected from the group consisting of VIC, HEX, FAM, and EverGreen dyes.
A kit for detecting NRAS gene mutation comprising the primer and probe set composition of claim 1 as an active ingredient.
7. The kit of claim 6, wherein the kit is a research use only (RUO) or an investigation use only (IVD) kit.
A reverse primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a forward primer of SEQ ID NO: 3, an inverse primer of SEQ ID NO: 4 and a polynucleotide set of the probes selected from the group consisting of SEQ ID NOS: Kits for the detection of gene mutations.
9. The kit of claim 8, wherein the kit further comprises a blocking oligomer of SEQ ID NO: 49, 50 or SEQ ID NO: 49 and 50.
A reverse primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, and a NRAS Kits for the detection of gene mutations.
11. The kit of claim 10, wherein the kit further comprises a blocking oligomer of SEQ ID NO: 50.
A forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 5, a reverse primer of SEQ ID NO: 6, a forward primer of SEQ ID NO: 7, a forward primer of SEQ ID NO: And a polynucleotide set of the probe selected as the active ingredient.
A reverse primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 9, a reverse primer of SEQ ID NO: 10 and a polynucleotide set of the probes selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 37 to 41 as an active ingredient. Kits for the detection of gene mutations.
14. The kit of claim 13, wherein the kit further comprises a blocking oligomer of SEQ ID NOs: 49, 51 or SEQ ID NOs: 49 and 51.
A forward primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a forward primer of SEQ ID NO: 11, a reverse primer of SEQ ID NO: 12, a forward primer of SEQ ID NO: 13, a forward primer of SEQ ID NO: Wherein the polynucleotide set of the probe selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 42 to 45 is used as an active ingredient.
16. The kit of claim 15, wherein the kit further comprises a blocking oligomer of SEQ ID NO: 50.
A forward primer of SEQ ID NO: 16, a reverse primer of SEQ ID NO: 17, a forward primer of SEQ ID NO: 18, a reverse primer of SEQ ID NO: 6, a forward primer of SEQ ID NO: 19, a forward primer of SEQ ID NO: 20, Wherein the polynucleotide set of the probe is selected from the group consisting of:
18. The kit of claim 17, wherein the kit further comprises a blocking oligomer of SEQ ID NO: 52.
19. The kit according to any one of claims 6 to 18, wherein the kit is used for qPCR (quantitative PCR) or digital PCR method.
19. The kit according to any one of claims 6 to 18, wherein the kit comprises cfDNA (cell-free DNA) separated from blood as a template.
19. The kit according to any one of claims 6 to 18, wherein the kit comprises DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded (FFPE) or complementary DNA synthesized by reverse transcription from the tissue-derived RNA as a template .
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150101919A KR102600347B1 (en) | 2015-07-17 | 2015-07-17 | Composition for detecting mutations of NRAS gene and kit comprising the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150101919A KR102600347B1 (en) | 2015-07-17 | 2015-07-17 | Composition for detecting mutations of NRAS gene and kit comprising the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20170009605A true KR20170009605A (en) | 2017-01-25 |
| KR102600347B1 KR102600347B1 (en) | 2023-11-09 |
Family
ID=57991252
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020150101919A KR102600347B1 (en) | 2015-07-17 | 2015-07-17 | Composition for detecting mutations of NRAS gene and kit comprising the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102600347B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019066621A1 (en) * | 2017-09-29 | 2019-04-04 | 주식회사 젠큐릭스 | Composition for detecting ras/braf mutations, and kit comprising same |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012131092A2 (en) * | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Signature Diagnostics Ag | Method and kits for the prediction of response/nonresponse to the treatment with an anti-egfr antibody in patients with colorectal cancer of all uicc stages |
| CN102994619A (en) * | 2011-09-13 | 2013-03-27 | 广州益善生物技术有限公司 | NRAS gene mutation detection specificity primer and liquid chip thereof |
| WO2015023433A1 (en) * | 2013-08-14 | 2015-02-19 | Primeradx, Inc. | Compositions and methods for multiplex analysis of nras and braf nucleic acids |
-
2015
- 2015-07-17 KR KR1020150101919A patent/KR102600347B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012131092A2 (en) * | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Signature Diagnostics Ag | Method and kits for the prediction of response/nonresponse to the treatment with an anti-egfr antibody in patients with colorectal cancer of all uicc stages |
| CN102994619A (en) * | 2011-09-13 | 2013-03-27 | 广州益善生物技术有限公司 | NRAS gene mutation detection specificity primer and liquid chip thereof |
| WO2015023433A1 (en) * | 2013-08-14 | 2015-02-19 | Primeradx, Inc. | Compositions and methods for multiplex analysis of nras and braf nucleic acids |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0121891 (2015.05.08) 1부.* * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019066621A1 (en) * | 2017-09-29 | 2019-04-04 | 주식회사 젠큐릭스 | Composition for detecting ras/braf mutations, and kit comprising same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102600347B1 (en) | 2023-11-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9228239B2 (en) | High resolution melting analysis as a prescreening tool | |
| US11180812B2 (en) | Use of DNA in circulating exosomes as a diagnostic marker for metastatic disease | |
| US20130102006A1 (en) | Detection method for novel ros1 fusions | |
| Miyamae et al. | Mutation detection of epidermal growth factor receptor and KRAS genes using the smart amplification process version 2 from formalin-fixed, paraffin-embedded lung cancer tissue | |
| JP5769952B2 (en) | Highly sensitive detection method for EML4-ALK fusion gene | |
| CA2726531A1 (en) | Compositions and methods for classifying lung cancer and prognosing lung cancer survival | |
| CN109735623B (en) | Colorectal cancer biomarker | |
| KR102600344B1 (en) | Composition for detecting mutations of KRAS gene and kit comprising the same | |
| WO2017033905A1 (en) | Method for detecting ocln-arhgap26 gene | |
| US20180187267A1 (en) | Method for conducting early detection of colon cancer and/or of colon cancer precursor cells and for monitoring colon cancer recurrence | |
| US11261482B2 (en) | Composition for detecting epidermal cell growth factor receptor gene mutation, and kit comprising same | |
| KR102600347B1 (en) | Composition for detecting mutations of NRAS gene and kit comprising the same | |
| KR20170009603A (en) | Composition for detecting mutations of epidermal growth factor receptor gene and kit comprising the same using cfDNA in plasma | |
| KR20190038464A (en) | The composition for detecting mutations of RAS/BRAF and the kit consisting of the compounds | |
| KR101586846B1 (en) | A improved method for providing information for diagnosis of breast cancer and kit for diagnosis of breast cancer therefor | |
| KR102353064B1 (en) | Composition for detecting copy number variation of HER2 and kit comprising the same | |
| EP3775289A1 (en) | Methylation-based biomarkers in breast cancer screening, diagnosis, or prognosis | |
| RU2688189C1 (en) | Oligonucleotide sequence oligonucleotide sequence for the nras gene q61r mutation in the tumor formations of the thyroid gland | |
| WO2009048901A1 (en) | Quantitative/semi-quantitative measurement of epor on cancer cells | |
| KR101528331B1 (en) | Method of providing information for early diagnosis of breast cancer with reverse transcription quantitative PCR and diagnostic kit using tissue and blood | |
| KR20210120737A (en) | The composition for detecting mutations of PIK3CA and the kit consisting of the compounds | |
| KR101587939B1 (en) | Automated system for diagnosing responsiveness of treatment for lung cancer drug | |
| WO2015129655A1 (en) | Method for detecting dnajb1-prkaca gene | |
| KR101778789B1 (en) | Method for diagnosing responsiveness of second line treatment for cancer patients using circulating tumor cells | |
| KR101586847B1 (en) | Method of providing information for early diagnosis of breast cancer with reverse transcription quantitative PCR and diagnostic kit using tissue and blood |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |