KR20160147099A - 인터루킨―1베타 억제제의 스크리닝 방법 - Google Patents

인터루킨―1베타 억제제의 스크리닝 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20160147099A
KR20160147099A KR1020150082595A KR20150082595A KR20160147099A KR 20160147099 A KR20160147099 A KR 20160147099A KR 1020150082595 A KR1020150082595 A KR 1020150082595A KR 20150082595 A KR20150082595 A KR 20150082595A KR 20160147099 A KR20160147099 A KR 20160147099A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
asc
candidate compound
group
domain
forms
Prior art date
Application number
KR1020150082595A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101731303B1 (ko
Inventor
이주영
양갑식
이혜은
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭대학교 산학협력단
Priority to KR1020150082595A priority Critical patent/KR101731303B1/ko
Publication of KR20160147099A publication Critical patent/KR20160147099A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101731303B1 publication Critical patent/KR101731303B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/216—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acids having aromatic rings, e.g. benactizyne, clofibrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G01N21/552—Attenuated total reflection
    • G01N21/553—Attenuated total reflection and using surface plasmons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 발명은 인터루킨―1베타 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 어댑터 단백질 ASC 피리딘 도메인(PYD)과 결합하여 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 억제하는 화합물을 스크리닝 할 수 있으며, 상기 스크리닝 된 화합물은 인터루킨―1베타 억제제 특히, 통풍 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인터루킨―1베타 억제제의 스크리닝 방법{Screening method of interleukin-1beta inhibitors}
본 발명은 어댑터 단백질 ASC 피리딘 도메인(PYD)과 결합하여 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 억제하는 화합물을 인터루킨―1베타 억제제 특히, 통풍 치료제로서 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
통풍성 관절염은 관절 및 관절주위의 조직에서 요산 결정의 침착에 의해 야기된다. 이러한 질병 발생은 혈청 요산 수준과 직접 관련되며, 요산의 혈청 수준을 감소시키는 약제는 통풍성 관절염을 갖는 환자를 치료하는 데에 이용된다. 이러한 약제는 크산틴 산화효소 억제제 알로퓨리놀과 같이 요산의 합성을 억제하거나 요산뇨 유인물질과 같이 요산의 배출을 증가시켜 효과를 나타낸다.
최근, 요산 결정에 반응하여 염증성 신호를 야기하는 수용체로서 NLRP3 [NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3]을 확인하였다(Nature 440, 237-241, 2006). NLRP3은 NLR (Nod-like receptor family)의 멤버로서 미생물 침입 및 요산 결정과 같은 내인성 위험 신호를 감지한다. 이러한 신호의 존재 하에서 NLRP3은 어댑터 단백질인 ASC 및 프로-케스페이즈-1과 인플라마좀을 형성한다. 프로-케스페이즈-1은 개열되어 케스페이즈-1으로 분리되어 활성형으로 되며 케스페이즈-1은 프로-IL-1β 전구체를 개열하여 IL-1β를 활성화 시키게 되어 세포외 환경으로 분비한다.
NLRP3 인플라마좀 구성요소가 결핍된 마우스로부터 유래한 대식세포는 요산 결정에 의해 자극된 후 활성 IL-1β을 분비할 수 없다고 알려져 있다. 요산 결정에 의한 관절염은 NLRP3 인플라마좀에 의존하는데, 특히 NLRP3-, ASC- 또는 케스페이즈-1-결핍 마우스에서 호중구 유입은 없어지고 통풍성 관절염 관련 사이토카인의 생성이 감소한다고 알려졌다. IL-1β가 통풍성 관절염에서 중요한 영향을 미치는 사이토카인이며 NLRP3 인플라마좀 활성화가 통풍성 관절염의 병인과 관련되기 때문에, NLRP3 인플라마좀의 억제가 통풍성 관절염의 유효한 치료 전략으로 제안될 수 있다.
한국공개특허 제2006-0130064호
본 발명의 목적은 인터루킨-1베타(IL-1β) 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 통풍 또는 통풍성 관절염 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 어댑터 단백질 ASC와 후보 화합물을 반응시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물에서 ASC PYD 도메인의 Leu45 및 Lys21과 후보 화합물 간의 친유성 결합을 형성하며, ASC PYD 도메인의 Glu13 및 Lys24와 후보 화합물 간의 수소결합을 형성하는 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인터루킨-1베타(IL-1β) 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 어댑터 단백질 ASC과 후보 화합물을 반응시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물에서 ASC PYD 도메인의 Leu45 및 Lys21과 후보 화합물 간의 친유성 결합을 형성하며, ASC PYD 도메인의 Glu13 및 Lys24와 후보 화합물 간의 수소결합을 형성하는 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 통풍 또는 통풍성 관절염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 어댑터 단백질 ASC 피리딘 도메인(PYD)과 결합하여 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 억제하는 화합물을 스크리닝 할 수 있으며, 상기 스크리닝 된 화합물은 인터루킨―1베타 억제제 특히, 통풍 또는 통풍성 관절염 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 CAPE가 ASC와 직접 결합함을 확인할 수 있는 결과로서, 도 1A는 SPR 분석 결과이고, 도 1B는 CAPE의 결합반응, 즉 도 1A의 단위를 Bar 그래프로 나타낸 것이고, 도 1C는 간단한 1:1 상호작용 모델을 이용하여 산출한 CAPE 및 ASC 간의 결합에 대한 동력학적 파라미터를 나타낸 것이고, 도 1D는 CAPE와 ASC 결합에 대한 분자 도킹 모델이며, 도 1E는 면역블롯 결과이다.
도 2는 요산-유도 NLRP3 활성화에 대한 CAPE 유도체의 억제효과를 나타낸 것으로서, 도 2A는 ELISA 분석을 통한 IL-1β의 양을 분석한 것이고, 도 2B 내지 도 2G는 다양한 CAPE 유도체의 SPR 분석 결과이다.
도 3는 ASC PYD 도메인에 대한 앞선 결과에서 유의성 있는 결합력을 나타내었던 CAPE, CAPEN 및 DHC의 결합에 관한 결합모델을 제안한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 통풍 또는 통풍성 관절염 치료제로서 유용한 화합물을 찾기 위해 예의 노력하였으며, 어댑터 단백질 ASC 피리딘 도메인(PYD)과 결합하여 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 억제하는 화합물을 인터루킨―1베타 억제제 특히, 통풍 또는 통풍성 관절염 치료제로서 스크리닝 할 수 있다는 것을 밝혀내어 본 발명을 완성한 것이다.
본 발명은 어댑터 단백질 ASC과 후보 화합물을 반응시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물에서 ASC PYD 도메인의 Leu45 및 Lys21과 후보 화합물 간의 친유성 결합을 형성하며, ASC PYD 도메인의 Glu13 및 Lys24와 후보 화합물 간의 수소결합을 형성하는 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인터루킨-1베타(IL-1β) 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
이때, ASC(apoptosis-associated speck-like protein)는 인플라마좀 어뎁터 단백질로써 N 말단에 PYRIN-PAAD-DAPIN (PYD) 도메인과 C 말단에 caspase-recruitment domain (CARD)으로 구성된 두 개의 단백질 도메인으로 구성되어 있고, 염증성 세포자살 신호전달에 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. 특히 ASC PYD 도메인은 인플라마좀이 형성될 때 NLRP3의 PYD 도메인과 직접적인 결합을 하는 것으로 알려져 인플라마좀에서의 중요한 역할을 하고 있으며 [Structure, 22, 1-13, 2014], 서열번호 1로 표시되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 선별된 후보 화합물은 4,5-디하이드록시기를 갖는 카테콜 고리와 페네틸기 또는 펜틸기를 카르보닐 링커로 연결한 화합물이며, 상기 페네틸기 또는 펜틸기는 ASC PYD 도메인의 Leu45 및 Lys21과의 친유성 결합을 형성하며, 상기 카테콜 고리의 4,5-디하이드록시기는 ASC PYD 도메인의 Glu13과 수소결합을 형성하고, 상기 카르보닐 링커는 Lys24와 또다른 수소결합을 형성할 수 있다.
상기 선별된 후보 화합물은 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제하여 IL-1β의 생성을 감소시킬 수 있다.
상기 선별된 후보 화합물로는 예를들어, 카페인산페닐에틸에스테르 (CAPE), 카페인산펜틸에스테르 (CAPEN) 및 디하이드로카페인산페네틸에스테르 (DHC)로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인터루킨-1베타(IL-1β) 억제제는 통풍 또는 통풍성 관절염 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 어댑터 단백질 ASC과 후보 화합물을 반응시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물에서 ASC PYD 도메인의 Leu45 및 Lys21과 후보 화합물 간의 친유성 결합을 형성하며, ASC PYD 도메인의 Glu13 및 Lys24와 후보 화합물 간의 수소결합을 형성하는 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 통풍 또는 통풍성 관절염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 선별된 후보 화합물은 4,5-디하이드록시기를 갖는 카테콜 고리와 페네틸기 또는 펜틸기를 카르보닐 링커로 연결한 화합물이며, 상기 페네틸기 또는 펜틸기는 ASC PYD 도메인의 Leu45 및 Lys21과의 친유성 결합을 형성하며, 상기 카테콜 고리의 4,5-디하이드록시기는 ASC PYD 도메인의 Glu13과 수소결합을 형성하고, 상기 카르보닐 링커는 Lys24와 또다른 수소결합을 형성할 수 있다.
본 발명에서는 골수 유래 프라이머리 대식세포 (BMDM)를 이용하여 CAPE 또는 이의 유도체들이 요산에 의해 유도된 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 억제하는지 여부를 확인한 결과, 도 1 및 도 2와 같이 CAPE와 이의 유도체인 CAPEN 및 DHC는 ASC를 직접적인 표적으로 하여 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 억제하고, 4,5-디하이드록시기를 갖는 카테콜 고리와 페네틸기 또는 펜틸기를 카르보닐 링커로 연결한 화합물이 효과적으로 요산에 의해 유도된 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 억제하고 IL-1β의 분비를 감소시킴을 확인하였다.
상기 페네틸 또는 펜틸기는 도 3과 같이 ASC PYD 도메인의 Leu45 및 Lys21과의 친유성 상호작용에 참여하며, 카테콜 고리에 존재하는 4,5-디하이드록시기는 ASC PYD 도메인의 Glu13과 수소결합 상호작용을 형성하며, 카르보닐 링커는 ASC PYD 도메인의 Lys24와 또다른 수소결합 상호작용을 형성한다.
따라서, CAPE 또는 이의 유도체와 같이 ASC PYD 도메인의 특정 아미노산 잔기와 결합하는 화합물을 스크리닝 하면 상기 화합물이 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제하고 IL-1β의 생성을 감소시켜 IL-1β 억제제로서 사용될 수 있으며, 상기 IL-1β 억제제는 통풍 또는 통풍성 관절염, 제2형 당뇨병, 알츠하이머병, 죽상동맥경화증, 비알콜성 지방간, 가족성 한냉 자가염증 증후군(FCAS, familial cold autoinflammatory syndrome) 또는 머클-웰스 증후군(MWS, Muckle-Wells syndrome)에서 선택된 크라이오피린 증후군, 석면증, 규폐증, 염증성 장 질환, UV-유도 피부질환, 알러지성 피부염, 연소성 관절염, 류마티스 관절염, 성인형 스틸병, 블레오마이신 유발 폐손상, 알츠하이머성 치매 및 루푸스로 이루어진 군에서 선택된 다양한 질환의 치료 또는 예방용 약제로서 활용될 수 있다[Molecular cell, 54(2), 297-308, 2014; Nat Clin Pract Rheumatol, 4(1),34-42, 2008; Curr Allergy Asthma Rep 10, 229-235, 2010; Mol Neurobiol. 48(3), 875-82, 2013; Scientific World Journal, 11, 1536-47, 2011].
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
1. 세포배양
C57BL/6 마우스로부터 종래 알려진 방법[Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 186, 499-507, 2011]에 따라 골수를 분리한 후 골수-유래 프라이머리 대식세포 (BMDMs)를 준비하였다. 상기 대식세포는 10%(v/v) 태아소혈청 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10,000 units/ml의 페니실린 및 10,000 mg/ml의 스트렙토마이신 (Invitrogen)을 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다.
2. CAPE 및 이의 유도체 준비
카페인산페닐에틸에스테르 (CAPE)는 Sigma-Aldrich로부터 구매하였으며, 이의 유도체들인 카페인산 (CA), 카페인산펜틸에스테르 (CAPEN), 디하이드로카페인산페네틸에스테르 (DHC), 디메톡시신남산페네틸에스테르 (DMC), 디메톡시디하이드로신남산페네틸에스테르 (DMHC) 및 펜프로피온산페네틸에스테르 (PPAPE)는 부산대학교 정연진 교수로부터 제공받았다[The Journal of nutritional biochemistry 21, 809-817, 2010].
3. 인플라마좀 활성화 분석
BMDM을 2x106 세포/ml의 밀도로 6-웰 플레이트 상에 분주하고 100 ng/ml의 LPS [Purified LPS from Escherichia coli, List Biological Laboratory Inc. (Campbell, CA) 구매, 내독성이 없는 물에서 용해시켜 사용함]를 4시간 동안 처리하였다. LPS의 CAPE 또는 이의 유도체들에 대한 영향을 배제하기 위하여, PBS로 LPS를 세정한 후 CAPE 또는 이의 유도체를 첨가하였다. 세포에 CAPE 또는 이의 유도체(10 μM)를 1시간 동안 처리하고 혈청 없는 배지에서 인플라마좀 활성화제인 ATP (5 mM) 또는 MSU (monosodium urate; Invivogen, 500 ㎍/ml) 결정체로 자극시켰다. 상기 세포를 RIPA 완충액(50mM Tris-HCl, pH7.4, 1% NP-40, 0.25% 소듐 데옥시콜레이트, 150mM NaCl, 1mM EGTA, 1mM PMSF, 1mM Na3VO4,10μg/ml 아프로티닌 및 10 μg/ml 루펩틴)으로 용출시킨 용출물을 항-ASC 항체로 면역침강시킨 후 면역블롯 분석을 수행하였다. 이때, 인플라마좀 활성화의 지표로서 상등액에서 프로-IL-1β의 IL-1β로의 개열 여부를 확인하였다. 이때, 상기 상등액은 1 부피의 메탄올과 0.25 부피의 클로로포름을 첨가하여 침전시킨 후 20,000g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층부는 제거하고 1 부피의 메탄올을 첨가하여 얻은 혼합물을 20,000g에서 10분 동안 원심분리하여 단백질 침전물을 얻었고, 실온에서 건조한 후 Laemmli 완충액 (1 M Tris-HCl, pH 6.8, 100% glycerol, 10% SDS, 10% 2-mercaptoethanol and 1% bromophenol blue)로 재현탁시켰다. 이러한 시료는 SDS-PAGE로 옮긴 후 폴리비닐리덴 디플루오로라이드 막에 전기이동 시켰다. 상기 막을 제1항체 및 관련 HRP-접합 제2항체로 탐침시켰다. 각 밴드는 ECL시스템을 이용하여 가시화 하였다.
4. 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)
DuoSet ELISA 키트 (R&D systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 제조자의 지침에 따라 앞서 준비된 BMDM의 배양배지에서 IL-1β의 수준을 측정하였다. 표준곡선 농도는 15.6-1000 pg/ml이었다.
5. 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석
CM5 센서 칩 (cat. # BR-1005-30, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 및 N-하이드록시숙신이미드로 활성화하여 항-ASC 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)가 공유적으로 고정되는 카르복시메틸화된 덱스트란 매트릭스 표면을 형성시켰다. 재조합 인간 ASC 단백질 (Taipei, Taiwan)을 항체-항원 결합을 통해 항-ASC 항체로 캡쳐하였다. 친화도 측정을 위해 결합 및 해리 상태를 Biacore T200 (GE Healthcare)로 관찰하였다. CAPE는 염기성 러닝 완충액 (PBS containing final concentrations of 0.05% Tween-20 and 5% DMSO)으로 용해시키고 25℃에서 5 ml/min의 유속으로 플로우 셀에 다양한 농도로 주입하였다. 대조 실험은 동일 센서 칩에 블랭크 (센서 칩만) 및 활성 (항체만 갖는 센서 칩) 채널로 수행하였다. 얻어진 분석 곡선에 근거하여 완충액의 벌크 효과를 반영한 대조군 신호는 T200 evaluation software ver. 2.0 (GE Healthcare)을 이용하여 제외하였다. 상호작용의 동력학적 파라미터와 친화력 상수는 T200 software (ver. 2.0)로 간단한 1:1 상호작용 모델을 이용하여 산출하였다.
6. 분자 모델링 분석
ASC에 대한 CAPE 또는 이의 유도체들의 결합 모델을 예측하기 위하여, ASC (PDB code 2KN6)의 결정 구조를 이용하였다. 단백질 구조는 Maestro graphical user interface (version 9.3, Schrodinger)에서 Protein Preparation Wizard를 이용하여 축소하였다. CAPE를 Prime (Prime, ver. 3.1, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2012)에서 도킹 틀을 이용하여 ASC의 PYD의 축소된 결정 구조 내로 도킹시켰다. 도킹은 디폴트 세팅을 이용하여 수행하였고, 모든 잔기를 고정시켰다. CAPE의 정제된 도킹 모델을 위한 그래프는 PyMol (http://www.pymol.org)을 이용하여 만들었다.
7. 실험결과
도 1은 CAPE가 ASC와 직접 결합함을 확인할 수 있는 결과로서, 도 1A 및 도 1B와 같이 CAPE는 농도 의존적으로 ASC에 직접 결합하였고, 도 1C에서 상호작용 동력학 및 친화력 상수의 파라미터를 개시하였다. 단백질데이터은행 (PDB)로부터 얻어진 ASC (2KN6)의 결정 구조를 이용한 분자 모델링 분석은 CAPE와 ASC의 PYD 도메인 간의 도킹 모델을 제안한다. 도 1D와 같이 CAPE는 ASC의 Glu13 및 Lys24와 수소결합을 형성하며 친유성 상호작용을 통해 Lys21 및 Leu45와 상호작용하였다. 특히, Glu13은 NLRP3-ASC 상호작용과 ASC-ASC 올리고머화에 모두 중요한 역할을 수행하는 중요한 아미노산이다. 그리고, 도 1E와 같이 CAPE가 LPS 및 ATP로 유도된 BMDM에서 NLRP3과 ASC 간의 결합을 차단하였다. 이러한 결과로부터 CAPE는 ASC를 직접적인 표적으로 하여 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 억제함을 알 수 있었다.
그리고, 도 2는 MSU 결정체-유도 NLRP3 활성화에 대한 CAPE 유도체의 억제효과를 나타낸 것으로서, 도 2A와 같이 카페인산펜틸에스테르 (CAPEN)와 디하이드로카페인산페네틸에스테르 (DHC)는 BMDM에서 MSU 결정체-유도 IL-1β 분비를 감소시킬 수 있는 반면, 카페인산 (CA), 디메톡시신남산페네틸에스테르 (DMC), 디메톡시디하이드로신남산페네틸에스테르 (DMHC), 펜프로피온산페네틸에스테르 (PPAPE)는 이러한 억제 효과를 나타내지 않았다. 그리고 도 2B 내지 도 2G와 같이 표면 플라즈몬 공명 분석에서도 CAPEN와 DHC는 ASC와 결합하지만, CA, DMC 및 PPAPE은 ASC와 결합하지 않았다. 이러한 결과로부터 CAPE 유도체의 억제 효과는 ASC와의 결합 능력에 의존함을 확인할 수 있었으며, 구조적 모티브로부터 CAPE, CAPEN 및 DHC에서 존재하는 페네틸 또는 펜틸기가 CA에 존재하지 않기 때문에 이러한 관능기가 중요한 것으로 확인하였다.
또한, 도 3는 ASC PYD 도메인에 대한 CAPE, CAPEN 및 DHC의 결합에 관한 결합모델을 제안한 것으로서, 도 3A 내지 도 3C는 ASC PYD 도메인에 대한 CAPE, CAPEN 및 DHC의 결합에 관한 결합모델을, 도 3D는 ASC PYD 도메인에 대한 CAPE, CAPEN 및 DHC의 결합에 관한 중첩 결합모델을 나타낸 것이다. 도 3A 내지 도 3C와 같이 페네틸 또는 펜틸기가 ASC PYD 도메인의 Leu45 및 Lys21과의 친유성 상호작용에 참여함을 확인하였다. DMC, DMHC 및 PPAPE에 존재하는 메톡시기로의 대체 또는 디하이드록시기의 부존재는 결합능력 뿐 아니라 억제 활성의 감소를 초래하기 때문에 카테콜 고리에 존재하는 4,5-디하이드록시기도 중요한 작용기이다. 도 3A 내지 도 3C와 같이 제안된 도킹 모델에서는 CAPE, CAPEN 및 DHC의 카테콜 고리가 ASC PYD 도메인의 Glu13과 수소결합 상호작용을 형성하였으며, CAPE, CAPEN 및 DHC의 카르보닐 링커가 ASC PYD 도메인의 Lys24와 또다른 수소결합 상호작용을 형성하였다.
따라서, CAPE 또는 이의 유도체와 같이 ASC PYD 도메인의 특정 아미노산 잔기와 결합하는 화합물을 스크리닝 하면 상기 화합물이 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제하여 통풍성 관절염의 염증성 증상을 효과적으로 약화시킬 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Screening method of interleukin-1beta inhibitors <130> ADP-2015-0142 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Arg Ala Arg Asp Ala Ile Leu Asp Ala Leu Glu Asn Leu Thr 1 5 10 15 Ala Glu Glu Leu Lys Lys Phe Lys Leu Lys Leu Leu Ser Val Pro Leu 20 25 30 Arg Glu Gly Tyr Gly Arg Ile Pro Arg Gly Ala Leu Leu Ser Met Asp 35 40 45 Ala Leu Asp Leu Thr Asp Lys Leu Val Ser Phe Tyr Leu Glu Thr Tyr 50 55 60 Gly Ala Glu Leu Thr Ala Asn Val Leu Arg Asp Met Gly Leu Gln Glu 65 70 75 80 Met Ala Gly Gln Leu Gln Ala Ala Thr His Gln Gly Leu His Phe Ile 85 90 95 Asp Gln His Arg Ala Ala Leu Ile Ala Arg Val Thr Asn Val Glu Trp 100 105 110 Leu Leu Asp Ala Leu Tyr Gly Lys Val Leu Thr Asp Glu Gln Tyr Gln 115 120 125 Ala Val Arg Ala Glu Pro Thr Asn Pro Ser Lys Met Arg Lys Leu Phe 130 135 140 Ser Phe Thr Pro Ala Trp Asn Trp Thr Cys Lys Asp Leu Leu Leu Gln 145 150 155 160 Ala Leu Arg Glu Ser Gln Ser Tyr Leu Val Glu Asp Leu Glu Arg Ser 165 170 175

Claims (7)

  1. 어댑터 단백질 ASC과 후보 화합물을 반응시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물에서 ASC 피린 도메인(PYD)의 Leu45 및 Lys21과 후보 화합물 간의 친유성 결합을 형성하며, ASC PYD 도메인의 Glu13 및 Lys24와 후보 화합물 간의 수소결합을 형성하는 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인터루킨-1베타(IL-1β) 억제제의 스크리닝 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 선별된 후보 화합물은 4,5-디하이드록시기를 갖는 카테콜 고리와 페네틸기 또는 펜틸기를 카르보닐 링커로 연결한 화합물이며, 상기 페네틸기 또는 펜틸기는 ASC PYD 도메인의 Leu45 및 Lys21과의 친유성 결합을 형성하며, 상기 카테콜 고리의 4,5-디하이드록시기는 ASC PYD 도메인의 Glu13과 수소결합을 형성하고, 상기 카르보닐 링커는 Lys24와 또다른 수소결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 인터루킨-1베타(IL-1β) 억제제의 스크리닝 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 선별된 후보 화합물은 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 인터루킨-1베타(IL-1β) 억제제의 스크리닝 방법.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 선별된 후보 화합물은 카페인산페닐에틸에스테르 (CAPE), 카페인산펜틸에스테르 (CAPEN) 및 디하이드로카페인산페네틸에스테르 (DHC)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 인터루킨-1베타(IL-1β) 억제제의 스크리닝 방법.
  5. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 인터루킨-1베타(IL-1β) 억제제는 통풍 또는 통풍성 관절염, 제2형 당뇨병, 알츠하이머병, 죽상동맥경화증, 비알콜성 지방간, 가족성 한냉 자가염증 증후군(FCAS, familial cold autoinflammatory syndrome) 또는 머클-웰스 증후군(MWS, Muckle-Wells syndrome)에서 선택된 크라이오피린 증후군, 석면증, 규폐증, 염증성 장 질환, UV-유도 피부질환, 알러지성 피부염, 연소성 관절염, 류마티스 관절염, 성인형 스틸병, 블레오마이신 유발 폐손상, 알츠하이머성 치매 및 루푸스로 이루어진 군에서 선택된 질환의 치료제인 것을 특징으로 하는 인터루킨-1베타(IL-1β) 억제제의 스크리닝 방법.
  6. 어댑터 단백질 ASC과 후보 화합물을 반응시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물에서 ASC PYD 도메인의 Leu45 및 Lys21과 후보 화합물 간의 친유성 결합을 형성하며, ASC PYD 도메인의 Glu13 및 Lys24와 후보 화합물 간의 수소결합을 형성하는 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 통풍 또는 통풍성 관절염 치료제의 스크리닝 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 선별된 후보 화합물은 4,5-디하이드록시기를 갖는 카테콜 고리와 페네틸기 또는 펜틸기를 카르보닐 링커로 연결한 화합물이며, 상기 페네틸기 또는 펜틸기는 ASC PYD 도메인의 Leu45 및 Lys21과의 친유성 결합을 형성하며, 상기 카테콜 고리의 4,5-디하이드록시기는 ASC PYD 도메인의 Glu13과 수소결합을 형성하고, 상기 카르보닐 링커는 Lys24와 또다른 수소결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 통풍 또는 통풍성 관절염 치료제의 스크리닝 방법.
KR1020150082595A 2015-06-11 2015-06-11 인터루킨―1베타 억제제의 스크리닝 방법 KR101731303B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150082595A KR101731303B1 (ko) 2015-06-11 2015-06-11 인터루킨―1베타 억제제의 스크리닝 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150082595A KR101731303B1 (ko) 2015-06-11 2015-06-11 인터루킨―1베타 억제제의 스크리닝 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160147099A true KR20160147099A (ko) 2016-12-22
KR101731303B1 KR101731303B1 (ko) 2017-05-02

Family

ID=57723907

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150082595A KR101731303B1 (ko) 2015-06-11 2015-06-11 인터루킨―1베타 억제제의 스크리닝 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101731303B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019122270A1 (en) * 2017-12-20 2019-06-27 Michael Heneka Novel means and methods for treating neurodegenerative diseases

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102074215B1 (ko) 2018-07-24 2020-02-06 가톨릭대학교 산학협력단 β-카로틴의 NLRP3 PYD 도메인 결합 사이트 및 이를 이용한 통풍 치료제의 스크리닝 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060130064A (ko) 2003-11-07 2006-12-18 아카디아 파마슈티칼스 인코포레이티드 통증 및 염증 치료에 효과적인 화합물을 동정하기 위한도구로서의 리폭신 수용체, ｆｐｒｌ1의 용도

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9557321B2 (en) * 2010-11-18 2017-01-31 Kyoto University Method for screening drugs for suppressing inflammasome activity

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060130064A (ko) 2003-11-07 2006-12-18 아카디아 파마슈티칼스 인코포레이티드 통증 및 염증 치료에 효과적인 화합물을 동정하기 위한도구로서의 리폭신 수용체, ｆｐｒｌ1의 용도

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019122270A1 (en) * 2017-12-20 2019-06-27 Michael Heneka Novel means and methods for treating neurodegenerative diseases
WO2019120527A1 (en) * 2017-12-20 2019-06-27 Michael Heneka Novel means and methods for treating neurodegenerative diseases
CN111556875A (zh) * 2017-12-20 2020-08-18 M·亨利卡 治疗神经变性疾病的新手段和方法
JP2021509257A (ja) * 2017-12-20 2021-03-25 ヘネカ、ミヒャエルHENEKA, Michael 神経変性疾患を治療するための新規手段および方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR101731303B1 (ko) 2017-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Boivin et al. Granzyme B cleaves decorin, biglycan and soluble betaglycan, releasing active transforming growth factor-β1
Ali Emerging roles for MAS-related G protein-coupled receptor-X2 in host defense peptide, opioid, and neuropeptide-mediated inflammatory reactions
Groß et al. Inflammasome activators induce interleukin-1α secretion via distinct pathways with differential requirement for the protease function of caspase-1
Yokoi et al. Inhibition of FcεRI-dependent mediator release and calcium flux from human mast cells by sialic acid–binding immunoglobulin-like lectin 8 engagement
Meiser et al. The chemokine receptor CXCR3 is degraded following internalization and is replenished at the cell surface by de novo synthesis of receptor
TWI769165B (zh) 治療心血管疾病之組合物及方法
JP2015503905A (ja) Ｐｃｓｋ９の阻害剤としての単一ドメイン抗体
CN103282374A (zh) 用于治疗神经变性病症和阿尔茨海默病并改善正常记忆的方法和组合物
Murakami et al. Role of interleukin-1 and inflammasomes in oral disease
Nogueira et al. Update on therapeutic approaches for rheumatoid arthritis
KR101731303B1 (ko) 인터루킨―1베타 억제제의 스크리닝 방법
EP3119806A1 (en) Il-21 antibodies
Cai et al. Convergent synthesis of novel muramyl dipeptide analogues: inhibition of porphyromonas gingivalis-induced pro-inflammatory effects by high doses of muramyl dipeptide
Wang et al. Prolylcarboxypeptidase independently activates plasma prekallikrein (fletcher factor)
EP1907003A2 (en) Combination therapy with inhibitors of hmgb and caspase for the treatment of inflammatory diseases
Hewit et al. The N-terminal region of the atypical chemokine receptor ACKR2 is a key determinant of ligand binding
CA2733041A1 (en) Effectors of par-2 activation and their use in the modulation of inflammation
Mee et al. Counter-regulation of interleukin-1α (IL-1α) and IL-1 receptor antagonist in murine keratinocytes
CN108076629B (zh) 一种用于治疗、预防或改善主动脉病的gm-csf负调节剂
Huang et al. Redox regulation of pro-IL-1β processing may contribute to the increased severity of serum-induced arthritis in NOX2-deficient mice
KR102074215B1 (ko) β-카로틴의 NLRP3 PYD 도메인 결합 사이트 및 이를 이용한 통풍 치료제의 스크리닝 방법
JP2020062039A (ja) 出血治療のための止血促進タンパク質
Freitas et al. Angiotensin (1-7)-attenuated vasoconstriction is associated with the Interleukin-10 signaling pathway
AU2017283071A1 (en) Antibodies against Mac-1
WO2021055713A1 (en) Integrin receptor alpha v beta 3 and its ligand involved in chronic itch

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant