KR20160143646A - 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산 - Google Patents

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Abstract

스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산, 및 그 히알루론산을 유효 성분으로서 함유하고, 간유동 내피세포를 보호함으로써 저산소/재산소 부하에 의한 간 장해를 경감시켜 간 허혈 재관류에 수반하는 간 이식이나 간 절제 등의 수술에 의한 간부전의 예방 및/또는 치료를 실시할 수 있는 의약.

Description

스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산 {HYALURONIC ACID MODIFIED BY SPHINGOSINE-1-PHOSPHORIC ACID}
본 발명은 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 간 허혈 재관류 장해의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 유효 성분으로서 유용한 스핑고신-1-인산으로 수식된 히알루론산에 관한 것이다.
간 이식이나 간 절제시의 수술 후 간부전의 주요한 원인은 허혈 재관류에 의해 발생하는 저산소/재산소 부하 (Hypoxia-reoxygenation) 인 것이 알려져 있고, 허혈 재관류에 의한 간 장해의 예방에 간유동 내피세포 (LSEC) 의 보호가 중요한 것도 알려져 있다 (Caldwell et al. Hepatology, 10, pp.292-299, 1989). 저산소/재산소 부하에 의해 LSEC 의 아포토시스가 발생하는 것이 보고되어 있는 것으로부터 (Neal R. Banga et al. J. Surg. Res., 178, pp.e35-41, 2012) 가 보고되어 있기 때문에, LSEC 는 간 허혈 재관류 장해의 주요 인자라고 생각된다.
한편, 스핑고 지질 메디에이터인 스핑고신-1-인산 (S1P) 은 세포막의 구성 성분인 스핑고 미엘린 유래의 스핑고신이 스핑고신 키나아제에 의해 인산화됨으로써 생성되고, S1P 수용체를 통해 다채로운 생리 활성을 나타낸다. 예를 들어, S1P 는 항아포토시스 작용을 갖는 것이 알려져 있고 (Cuvillier et al., Nature, 381, pp.800-803, 1996), 알코올성 간 장해에 있어서 LSEC 의 아포토시스를 억제하고 (Dong-Mei Zheng et al. Hepatology, 44, pp.1278-1287, 2006), 허혈 재관류에 의한 신장 장해를 억제하는 것 (Lee et al. Nephrology, 2011) 도 보고되어 있다.
이와 같은 관점에서, S1P 를 사용하여 LSEC 를 보호함으로써 저산소/재산소 부하에 의한 간 장해를 경감시킬 수 있는 것이 기대된다. 그러나, S1P 는 생체막을 구성하는 스핑고 지질의 대사 산물로, 혈소판이나 내피세포에 많이 함유되는 것으로부터, S1P 자체를 LSEC 를 표적으로 하여 간 허혈 재관류 장해의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 없다는 문제가 있다.
이 문제를 해결하기 위해서, S1P 수용체 아고니스트인 FTY720 (핑골리모드 염산염 : 생체 내에서 스핑고신 키나아제에 의해 FTY720 인산화체로 변환된다) 을 사용하여 저산소/재산소 부하에 의한 간 장해를 경감시키는 시도가 이루어지고 있다 (American Journal of Transplantation, 5, pp.40-49, 2005). 그러나, 이 화합물은 장기 투여에 있어서 S1P 의 안타고니스트로서 작용하는 것이 염려되고 있다. 또, 이 화합물은 전체적으로는 스핑고신과 유사한 화학 구조를 갖지만, 탄소 사슬 중에 페닐렌기를 가지고 있는 것으로부터 S1P 의 직접적인 유도체가 아니라, S1P 자체를 LSEC 의 보호에 사용하기 위한 화합물은 아니다.
[화학식 1]
Figure pct00001
또, 히알루론산 (HA) 은 혈관 내 투여 후에 LSEC 에 집적되는 것이 보고되어 있고 (Fraser J et al. Cell Tissue Res., 242, pp.505-510, 1985), 히알루론산 수용체 (HARE/Stabilin-2) 는 LSEC 특이적으로 발현되는 것이 보고되어 있는 것으로부터 (Bin Zhou et al. J. Biol. Chem., 275, pp.37733-37741, 2000), 히알루론산으로 피복된 리포솜에 S1P 를 탑재함으로써 효율적으로 S1P 를 LSEC 에 송달하는 시도도 이루어지고 있다 (과학 연구비 조성 사업, 연구 과제 번호 : 23390319, 「S1P·히알루론산 수식 리포솜을 사용한 난치성 간 장해에 대한 신규 치료약의 개발」, 오코치 노부히로 등, 2011 ∼ 2013 년도). 그러나, 리포솜의 전하나 분자량의 크기 등에서 히알루론산의 리간드로서의 기능이 불충분하여, 원하는 DDS 효과를 달성할 수 없다는 문제가 있었다.
Caldwell et al., Hepatology, 10, pp.292-299, 1989 Neal R.Banga et al., J. Surg. Res., 178, pp.e35-41, 2012 Cuvillier et al., Nature, 381, pp.800-803, 1996 Dong-Mei Zheng et al., Hepatology, 44, 1278-1287, 2006 Lee et al., Nephrology, 16, pp.163-173, 2011 American Journal of Transplantation, 5, pp.40-49, 2005 Fraser J et al. Cell Tissue Res., 242, 505-510, 1985 과학 연구비 조성 사업, 연구 과제 번호 : 23390319, 「S1P·히알루론산 수식 리포솜을 사용한 난치성 간 장해에 대한 신규 치료약의 개발」, 오코치 노부히로 등, 2011 ∼ 2013 년도 (2013년 외과 학회 : 간유동 내피세포를 표적으로 한 Sphingosine-1-phosphate 탑재 간 재생 신규 DDS 제제의 개발)
본 발명은, LSEC 를 보호함으로써 저산소/재산소 부하에 의한 간 장해를 경감시킬 수 있는 물질을 제공하는 것에 있다. 보다 구체적으로는, 정맥 내 투여등의 투여 형태에 의해 LSEC 에 효율적으로 집적되어 항아포토시스 작용을 발휘하여, LSEC 를 보호함으로써 저산소/재산소 부하에 의한 간 장해를 경감시킬 수 있는 물질을 제공하는 것이 본 발명의 과제이다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 실시한 결과, S1P 에 의해 수식된 히알루론산이 매우 효율적으로 LSEC 에 집적되는 것, 및 이 수식 히알루론산이 저산소/재산소 부하에 의한 LSEC 의 아포토시스의 억제에 높은 유효성을 가지고 있는 것을 알아내었다. 또, 이 S1P 에 의해 수식된 히알루론산을 예를 들어 정맥 내 투여 등의 투여 경로에서 인간을 포함하는 포유류 동물에 투여함으로써 저산소/재산소 부하에 의한 간 장해를 유효하게 예방 및/또는 치료할 수 있는 것을 알아내었다. 본 발명은 이들 지견에 기초하여 완성된 것이다.
즉, 본 발명에 의해, 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산이 제공된다. 이 히알루론산은 스핑고신-1-인산을 히알루론산에 공유 결합함으로써 얻을 수 있다.
이 발명의 바람직한 양태에 의하면, 히알루론산과 스핑고신-1-인산을 축합함으로써 얻을 수 있는 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산이 제공된다. 이 히알루론산은, 바람직하게는 히알루론산의 카르복실기와 스핑고신-1-인산의 아미노기를 아미드 결합시킴으로써 얻을 수 있다.
다른 관점에서는, 본 발명에 의해, 간 허혈 재관류에 수반하는 간부전의 예방 및/또는 치료를 위한 의약으로서, 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산을 유효 성분으로서 함유하는 의약 ; 및 간 혈류 차단을 수반하는 간 수술 후의 간부전의 예방 및/또는 치료를 위한 의약으로서, 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산을 유효 성분으로서 함유하는 의약이 제공된다. 간 혈류 차단을 수반하는 간 수술로는, 예를 들어 간 이식이나 간 부분 절제 등을 들 수 있다.
또, 본 발명에 의해, 간 허혈 재관류에 의해 발생하는 저산소/재산소 부하에 의해 발생하는 간부전의 예방 및/또는 치료를 위한 의약으로서, 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산을 유효 성분으로서 함유하는 의약 ; 간 허혈 재관류에 의해 발생하는 저산소/재산소 부하에서 기인하는 간유동 내피세포의 아포토시스를 억제하기 위한 의약으로서, 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산을 유효 성분으로서 함유하는 의약이 제공된다.
또 다른 관점에서는, 본 발명에 의해, 상기 의약의 제조를 위한 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산의 사용 ; 간 허혈 재관류에 수반하는 간부전의 예방 및/또는 치료 방법으로서, 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산의 예방 및/또는 치료 유효량을 인간을 포함하는 포유류 동물에 투여하는 공정을 포함하는 방법 ; 간 혈류 차단을 수반하는 간 수술 후의 간부전의 예방 및/또는 치료 방법으로서, 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산의 예방 및/또는 치료 유효량을 인간을 포함하는 포유류 동물에 투여하는 공정을 포함하는 방법 ; 간 허혈 재관류에 의해 발생하는 저산소/재산소 부하에 의해 발생하는 간부전의 예방 및/또는 치료 방법으로서, 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산의 예방 및/또는 치료 유효량을 인간을 포함하는 포유류 동물에 투여하는 공정을 포함하는 방법 ; 간 허혈 재관류에 의해 발생하는 저산소/재산소 부하에서 기인하는 간유동 내피세포의 아포토시스를 억제하는 방법으로서, 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산의 예방 및/또는 치료 유효량을 인간을 포함하는 포유류 동물에 투여하는 공정을 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명에 의해 제공되는 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산은 매우 효율적으로 간유동 내피세포에 집적되어, 저산소/재산소 부하에 의한 간유동 내피세포의 아포토시스를 억제할 수 있다. 또, 본 발명에 의해 제공되는 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산을 유효 성분으로서 함유하는 의약은 간 허혈 재관류에 수반하는 저산소/재산소 부하에 의해 발생하는 간부전의 예방 및/또는 치료에 높은 유효성을 가지고 있는 것으로부터, 간 혈류 차단을 수반하는 간 수술 후의 간부전의 예방 및/또는 치료를 위한 의약으로서 매우 유용하다.
도 1 은 실시예의 예 1 에서 합성한 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산의 NMR 차트이다.
도 2 는 실시예의 예 2 에 있어서의 4 군의 실험 순서를 나타낸 도면이다.
도 3 은 간 기능 (ALT) 의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 4 는 웨스턴 블롯에 의해 분할된 캐스파아제 3 (Cleaved caspase 3) 의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5 는 간장 병리 평가로서 HE 염색의 결과를 나타낸 도면이다.
도 6 은 간장 병리 평가로서 TUNEL 염색의 결과를 나타낸 도면이다.
도 7 은 TUNEL 염색으로 요청을 나타낸 세포수를 정량화한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8 은 전자 현미경에 의한 간장 미세 구조의 평가 결과를 나타낸 도면이다.
도 9 는 간장에 대한 S1P 집적을 웨스턴 블롯에 의해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명에 의해, 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산 (이하, 「HA-S1P」라고 약기하는 경우가 있다) 이 제공된다. HA-S1P 는 스핑고신-1-인산을 히알루론산에 공유 결합함으로써 얻을 수 있고, 예를 들어, 히알루론산과 스핑고신-1-인산을 축합제의 존재하에서 축합함으로써 얻을 수 있다. 일반적으로는, 히알루론산의 카르복실기와 스핑고신-1-인산의 아미노기 사이에서 축합에 의해 아미드 결합을 생성시키면 된다. 다만, 스핑고신-1-인산의 히알루론산에 대한 공유 결합의 양식은 상기 아미드 결합에 한정되는 것은 아니고, 히알루론산의 카르복실기와 스핑고신-1-인산의 수산기의 에스테르 결합 등이어도 된다.
히알루론산은 N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산의 이당 단위 (이 단위의 분자량은 대략 400) 가 연결된 고분자로, 일반적으로는 5,000 ∼ 8,000,000 정도의 분자량을 가지고 있다. 예를 들어 분자량 600,000 의 히알루론산에 함유되는 이당 단위는 약 1,500 개, 분자량 8,000 의 히알루론산에 함유되는 이당 단위는 약 20 개이다. 히알루론산은 일반적으로는 유리 형태의 히알루론산 또는 히알루론산나트륨으로서 입수 가능하다. 본 명세서에 있어서 사용되는 「히알루론산」이라는 용어는 히알루론산나트륨을 포함한다. 히알루론산 또는 히알루론산나트륨은 식품용이나 화장료용으로서 제공되고 있고, 의약으로서도 사용되고 있다.
예를 들어, 변형성 관절증에 적용되고 있는 히알루론산나트륨으로는 분자량이 600,000 ∼ 1,200,000 정도 (상품명 「알츠」), 500,000 ∼ 730,000 정도 (상품명 「Hyalgan」) 인 것이 사용되고 있고, 안과 수술용으로는 분자량이 600,000 ∼ 1,200,000 정도 (상품명 「오페간」), 분자량이 1,900,000 ∼ 3,900,000 정도 (상품명 「오페간-하이」), 분자량이 1,900,000 ∼ 3,900,000 정도 (상품명 「히알론」), 분자량이 1,530,000 ∼ 2,130,000 정도 (상품명 「오페리드」) 등이 사용되고 있지만, 효소 처리에 의해 분자량이 10,000 ∼ 100,000 정도의 저분자량인 것이나, 분자량이 500 ∼ 5,000 정도의 더욱 초저분자량인 것 등도 제공되고 있다.
본 발명의 HA-S1P 를 조제하기 위한 원료로서 사용되는 히알루론산의 분자량은 특별히 한정되지 않고, 상기에 예시한 것 이외에, 다양한 분자량의 히알루론산을 사용할 수 있다. 예를 들어, 평균 분자량이 500,000 ∼ 700,000 정도인 것이나, 효소 처리에 의해 평균 분자량을 8,000 정도로 한 히알루론산 등을 원료로서 사용할 수 있다. 본 발명의 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산을 조제하기 위한 원료로서 사용되는 히알루론산의 유래는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 계관 유래 또는 발효 유래 등 중 어느 유래의 것이어도 된다.
본 발명의 HA-S1P 의 제조 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 히알루론산과 스핑고신-1-인산을 축합제의 존재하에서 축합시킴으로써 용이하게 제조할 수 있다. 축합제의 종류는 특별히 한정되지 않고, 일반적으로 사용할 수 있는 축합제는 모두 사용할 수 있지만, 예를 들어 카르보디이미드계 축합제, 이미다졸계 축합제, 트리아진계 축합제 등을 사용할 수 있다. 카르보디이미드계 축합제로는, 예를 들어 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 염산염 등을 들 수 있지만, EDC 를 특히 바람직하게 사용할 수 있다. 축합제와 함께 카르복실산의 활성화제로서, 예를 들어 N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 등을 사용할 수도 있다.
축합 반응은, 일반적으로는 히알루론산 (유리 형태) 에 대해 EDC 등의 축합제와 NHS 등의 카르복실산의 활성화제를 첨가한 후에 스핑고신-1-인산을 첨가하여 실온 내지 가온하에서 몇 시간 내지 몇일 정도 반응시키면 된다. 반응은, 히알루론산 1 ㎎ 에 대해 스핑고신-1-인산을 0.5 ∼ 2 ㎍ 정도 사용하여 실시할 수 있다. 축합제는 스핑고신-1-인산에 대해 1 ∼ 20 몰 당량 정도, 바람직하게는 10 몰 당량 정도를 사용할 수 있다. 반응은 예를 들어 물, 메탄올, 에탄올, 디메틸술폭사이드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 테트라하이드로푸란 (THF), 디클로로메탄 등의 용매 중 혹은 이것들의 혼합 용매, 또는 무용매로 실시할 수 있다. 반응 종료 후, 통상적으로는 투석 등의 수단에 의해 EDC, NHS, 및 미반응의 스핑고신-1-인산을 제거함으로써 목적물을 얻을 수 있다. 히알루론산에 스핑고신-1-인산이 결합된 것은 통상적으로는 NMR 에 의해 확인할 수 있다. 일반적으로는 히알루론산 1 분자의 카르복실산의 총 수의 10 ∼ 50 ％ 정도, 바람직하게는 12 ∼ 40 ％ 정도가 스핑고신-1-인산의 아민과 결합한 수식체를 조제하면 된다. 히알루론산 1 분자당 결합된 스핑고신-1-인산의 개수는, 예를 들어 프로톤 NMR 에 의해 히알루론산의 N-아세틸기 (1.8 ppm) 와 스핑고신-1-인산의 지질 부분의 말단 메틸기 및 메틸렌기 (0.9 ppm 및 1.1 ppm) 로부터 적분값을 취하여 계산에 의해 결정할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 HA-S1P 는 효율적으로 간유동 내피세포에 집적되어, 저산소/재산소 부하에 의한 간유동 내피세포의 아포토시스를 억제할 수 있는 것으로부터, HA-S1P 를 유효 성분으로서 함유하는 의약은, 간 허혈 재관류에 수반하는 간부전의 예방 및/또는 치료를 위한 의약으로서 유용하다. 간 허혈 재관류를 발생시키는 처치나 치료의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 간 혈류 차단을 수반하는 간 수술 등을 대표적인 처치로서 들 수 있다. 이와 같은 간 수술로는, 예를 들어 간 이식이나 간 부분 절제 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되는 것은 아니고, 일시적으로 간장에 이르는 혈관을 클립하여 혈류를 차단하고, 몇 분 내지 15 분 정도로 클립을 해제하여 혈류를 재개시키는 수술은 모두 본 발명의 의약의 적용 대상으로 할 수 있다. 어떠한 이론에 구애되는 것은 아니지만, 간 허혈 재관류에 의해 발생하는 저산소/재산소 부하에 의해 발생하는 간부전에서는 저산소/재산소 부하에서 기인하는 간유동 내피세포의 아포토시스가 발생하고 있지만, 본 발명의 의약은 이 아포토시스를 억제하는 작용을 가지고 있다.
본 발명의 의약은, 일반적으로는 정맥 내 투여나 복강 내 투여 등의 비경구 투여에 의해 인간을 포함하는 포유류 동물에 대해 투여할 수 있다. 정맥 내 투여를 실시하는 경우에는 정맥 내 주사나 점적 등의 통상적인 수단을 채용할 수 있다. 혹은 수술 중에 문맥으로부터 본 발명의 의약을 혈관 내 투여하는 것도 가능하다. 저분자량의 히알루론산을 사용하는 경우에는 경구 투여에 의해 액제나 캡슐제 등에 의해 투여할 수 있는 경우도 있다. 투여는 혈류 차단의 몇 분 전 내지 1 시간 전 정도의 사이, 예를 들어 10 분 전 내지 30 분 전 정도의 시기에 실시하는 것이 바람직하지만, 혈류 차단 전이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 간 이식의 경우에는, 도너로부터 간장의 일부를 적출할 때 간장 내에 본 발명의 의약이 충분한 양이 잔류하도록 본 발명의 의약을 투여해 두고, 이식을 받는 환자에 대해서도 이식 직전에 본 발명의 의약을 투여할 수 있지만, 이와 같은 투여 방법은 적절히 선택 가능하며, 특정한 양태에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 의약은, 통상적으로는 수용액의 형태나 동결 건조품의 형태로 주사제 또는 점적제로서 제공되지만, 제제의 조제에 있어서는 주사제나 점적제의 제조에 통상적으로 사용되는 제제용 첨가물을 사용해도 된다. 예를 들어, 수용액의 경우에는 pH 조절제, 안정화제, 또는 완충제 등을 사용할 수 있고, 동결 건조 제제의 경우에는 이것들 이외에 용해 보조제 등을 사용할 수 있지만, 이것들의 특정 제제용 첨가물에 한정되는 것은 아니며, 당업자는 목적에 따라 적절한 제제용 첨가물을 선택할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
예 1 : HA-S1P 의 합성
히알루론산 (2 ㎎/㎖, 분자량 600,000 인 것, 또는 분자량 8,000 인 것) 5 ㎖ 에 EDC (100 ㎎/㎖) 를 95.85 ㎕, NHS (100 ㎎/㎖) 를 57.535 ㎕ 첨가하여 잘 뒤섞었다. 거기에 S1P (25 ㎎/㎖) 67.378 ㎕ 를 첨가하고 55 ℃ 에서 교반하여 24 시간 반응시켰다. 투석 조작을 실시하여 EDC, NHS, 및 미결합의 S1P 의 제거를 실시하였다. S1P 의 도입은 NMR 을 측정하여 1.15 ppm 부근의 피크가 존재하는 것에 의해 확인하였다 (도 1). 이 히알루론산의 카르복실산에 결합된 S1P 의 양은 13.5 ∼ 40 ％ 였다.
예 2
(1) 방법
동물
200 ∼ 250 g 의 웅성 Sprague-Dawley (이하 SD) 래트는 니혼 쿠레아 주식회사 (일본, 도쿄) 로부터 입수하였다. 4 그룹의 SD 래트에 대해 연구하였다.
S1P 의 용매인 메탄올 투여 그룹 (투여 내용은 메탄올 50 ㎕ ＋ 3 ％ BSA 150 ㎕, 합계 200 ㎕), HA 투여 그룹 (투여 내용은 8 kDa 의 HA 를 0.32564 g/ℓ 로 메탄올 : 초순수 ＝ 1 : 3 으로 용해, 합계 200 ㎕), S1P 투여 그룹 (투여 내용은 S1P 투여량으로서 100 ㎍/kg, S1P 50 ㎕ ＋ 3 ％ BSA 150 ㎕, 합계 200 ㎕), HA-S1P 투여 그룹 (투여 내용은 S1P 투여량으로서 100 ㎍/kg, 홋카이도 대학에서 제조한 HA-S1P 제제를 0.358 g/ℓ 로 메탄올 : 초순수 ＝ 1 : 3 으로 용해, 합계 200 ㎕) 에 대해 연구하였다.
동물 실험에서 사용한 모든 순서는, 츠쿠바 대학의 동물 실험에 있어서의 대처 및 용도의 지침에 서술되어 있는 기준에 따랐다.
간 허혈 모델
각각의 약제를 래트에게 미정맥 주사하였다. 주사 10 분 후에 마이크로 클립을 사용하여 간동맥·문맥·담관을 20 분간 일괄 폐색시켰다. 20 분의 전간 허혈 후, 폐색을 해제하였다. 재관류 120 분 후에, 병리 검사를 위해서, 각 그룹 10 ∼ 15 마리의 래트로부터 간 조직을 제거하였다. 또, 약제 주사 직전과 재관류의 30, 60, 120 분 후에 혈액을 채취하였다.
조직의 조정
간 조직을 10 ％ 완충 포르말린 중에서 고정시키고, 계속해서 파라핀 중에 매립하여, 헤마톡실린 및 에오진을 사용하여 염색하였다. 각 그룹의 조직 절편을 평가하였다. 문맥·중심 정맥을 동일 시야로 포함한 중배율 필드 (x200) 에 있어서, 유동 구조를 관찰하였다.
면역 조직 화학 연구
프로메가 주식회사의 DeadEnd (등록상표) Colorimetric TUNEL System (G7360) 을 사용하여, 아포토시스 양성 세포를 면역 조직 화학적으로 검출하였다. 각 그룹의 조직 절편을 평가하였다. 무작위로 선택한 문맥을 중심으로 하는 10 의 강배율 필드 (x400) 에 있어서, TUNEL 양성 세포와 간세포 총 수를 카운트하였다. 이것을 TUNLE 양성 세포수/간세포 총 수의 비로 나타내어 그룹별로 비교하였다.
단백 추출과 웨스턴 블롯 해석
간 조직은 -80 ℃ 에서 보존하고, 150 m㏖/ℓ 의 NaCl 과 50 mM 의 TrisCl, 1 ％ NP-40, 단백질 분해 효소 저해제 중에서 호모게나이즈하였다. 샘플을 원심하여 상청을 해석용으로 채취하였다. 샘플은 12 ％ 도데실황산염과 폴리아크릴아미드겔을 사용하여 전기 영동하여 분리시키고, 니트로셀룰로오스 멤브레인 (Millipore, Bedford, MA, USA) 에 전사시켰다. 1 차 항체로서 항 분할된 캐스파아제 3 항체 (9661) 와 HO-1 항체 (5141) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) 를 사용하였다. 2 차 항체로서 항토끼 IgG HRP linked (7074) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) 를 사용하였다.
생화학 분석
간 실질 장해를 평가하기 위해, 혈청 ALT 값을 자동 분석기 (후지 드라이켐 7000V, 후지 필름, 도쿄, 일본) 를 사용하여 측정하였다.
전자 현미경
허혈 재관류 후의 간유동 내피세포를 전자 현미경으로 평가하였다. 재관류 120 분 후에 간장을 신속히 적출하였다. 간좌엽으로부터 적출한 샘플을 1 ㎣ 로 절제하여 2.5 ％ 글루타르알데히드에 보존하였다. 후고정에 1 ％ 사산화 오스뮴을 사용하였다. 그 후, 농도 단계적으로 알코올을 통과시켜 탈수하여 에폰 포매 (包埋) 하였다. 초박절편은 Ultracut S microtome (Leica Aktiengesellschaft, Vienna, Austria) 를 사용하여 코퍼 그리드로 작성하였다. 절편은 콘트라스트를 강조시키기 위해서 우라닐아세트산염으로 조정하여 시트르산염을 통과시켰다. 표본은 히타치 H-7000 투과형 전자 현미경 (히타치, 도쿄, 일본) 을 사용하여 관찰하였다.
통계 분석
통계 분석은 Kruskal Wallis H-test 와, post hoc test 에 Mann-Whitney U test with Bonferroni correction 을 사용하였다. 통계적으로 유의하다고 하여 p ＜ 0.05 를 받아들였다.
(2) 실험계
200 ∼ 250 g 의 SD 래트를 사용하여 4 개의 실험군 (A) ∼ (D) 를 작성하였다. (A) S1P 의 용매인 메탄올 단독의 비히클 (Vehicle) 군 (메탄올 50 ㎕ ＋ 3 ％ BSA 150 ㎕, 합계 200 ㎕), (B) 히알루론산 단독의 HA 군 (8000 kDa 의 히알루론산을 0.32564 g/ℓ 가 되도록 메탄올 : 초순수 ＝ 1 : 3 으로 용해시킨 것, 합계 200 ㎕), (C) S1P 단독의 S1P 군 (S1P 투여량으로는 100 ㎍/kg, 메탄올에 용해시킨 S1P 50 ㎕ ＋ 3 ％ BSA 150 ㎕, 합계 200 ㎕), (D) HA-S1P 군 (S1P 투여량으로는 100 ㎍/kg, HA-S1P 를 0.358 g/ℓ 가 되도록 메탄올 : 초순수 ＝ 1 : 3 으로 용해시킨 것, 합계 200 ㎕). 래트를 솜노펜틸과 이소플루레인을 사용하여 전신 마취하고, 채혈 후에 각종 약제를 미정맥으로부터 투여하였다. 래트를 개복하여 약제 투여 10 분 후에 마이크로 클립을 사용하여 20 분간의 전간 허혈을 시행하였다. 20 분 후에 클립을 제거하고 재관류시켜, 재관류로부터 30, 60, 및 120 분 후에 채혈을 시행하였다. 120 분 후에는 래트를 희생사시켜 간조직 (좌엽) 을 채취하였다. 실험 순서를 도 2 에 나타낸다.
(3) 간 기능 (ALT) 의 측정
혈청 ALT 는 재관류 30 분 후에 비히클·S1P 군과 비교하여 HA-S1P 군이 유의하게 낮은 값이었다. 재관류 60 분 후에는 비히클·HA·S1P 군과 비교하여 HA-S1P 군이 유의하게 낮은 값이었다. 재관류 120 분 후에 HA 군과 비교하여 HA-S1P 군에서 유의하게 낮은 값이었다. 결과를 도 3 에 나타낸다.
(3) 웨스턴 블롯에 의한 아포토시스와 간 보호 작용의 확인
웨스턴 블롯에 의해 아포토시스 관련 단백인 분할된 캐스파아제 3 의 발현을 문헌에 기재된 방법 (Tamura et al., J Surg Res, 178, pp.443-451, 2012) 에 의해 확인한 결과, HA-S1P 군에서만 억제되고 있었다. 이것으로부터, HA-S1P 투여군이 유의하게 아포토시스를 억제하고 있다고 시사되었다. 또, 간 보호 작용을 갖는 HO-1 의 발현이 HA-S1P 군에서만 증가하고 있었다. 결과를 도 4 에 나타낸다.
(4) 간장 병리 평가
HE 염색에서는, HA-S1P 에서는 유동 구조가 유지되고 있는 데에 반해, 다른 군에서는 유동의 협소화나 사행을 확인하였다 (도 5). TUNEL 염색에서는, HA-S1P 군에서는 양성 세포를 거의 확인하지 않았지만, 다른 군에서는 허혈 재관류 장해를 받기 쉽다고 여겨지는 문맥 근방의 구역 (Zone) 1 을 중심으로 하여 양성 세포를 확인하였다 (도 6). 또 TUNEL 염색의 각 샘플에 있어서 구역 1 을 중심으로 400 배 시야에서 10 시야씩 TUNEL 양성 세포수/총 간 세포수로서 카운트하여 정량화하면 HA-S1P 군에서 유의하게 TUNEL 양성 세포율이 낮은 결과가 되었다 (도 7).
(5) 전자 현미경에 의한 간장 미세 구조 평가
전자 현미경 이미지에서는 HA-S1P 군에 있어서 LSEC 의 배접 구조가 유지되고 있는 데에 반해, 다른 군에서는 LSEC 가 장해되어 유동 내에 박리되어 있는 이미지가 확인되었다 (도 8).
예 3 : 웨스턴 블롯에 의한 간장에 대한 S1P 집적의 확인
하기 방법으로 웨스턴 블롯에 의해 간 조직 내에서의 S1P 의 발현을 확인하였다.
-80 ℃ 에서 보존한 래트의 간 조직을 각종 시약 (150 m㏖/ℓ NaCl, 50 mM Tris-Cl, 1 ％ NP-40, 단백 분해 효소 저해제) 으로 제조한 버퍼를 사용하여 호모게나이즈하였다. 해석하기 위해서 샘플을 원심하여 상청을 채취하였다. 채취한 샘플은 10 ％ SDS-PAGE 겔을 사용하여 분리하고, 니트로셀룰로오스막 (Millipore, Bedford, MA) 에 전사하였다. 1 차 항체로서 항-S1P 항체 (ab140592) (1 : 1000, 토끼 폴리클로날, Abcam, Cambridge, UK) 를 사용하였다. 2 차 항체로서 항-토끼 IgG, HRP-연결된 항체 (#7074S) (1 : 1000, Cell Signalling Technology, Beverley, MA, USA) 를 사용하였다.
결과를 도 9 에 나타낸다. S1P 단독보다 HA-S1P 의 샘플에 있어서 S1P 의 발현이 증가되어 있었다. 이것으로부터, HA-S1P 는 S1P 단독보다 간장에 특이적으로 집적되었던 것이 시사되었다.

Claims (9)

  1. 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산.
  2. 제 1 항에 있어서,
    스핑고신-1-인산을 히알루론산에 공유 결합함으로써 얻을 수 있는 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산.
  3. 제 2 항에 있어서,
    히알루론산과 스핑고신-1-인산을 축합함으로써 얻을 수 있는 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산.
  4. 제 3 항에 있어서,
    히알루론산의 카르복실기와 스핑고신-1-인산의 아미노기를 아미드 결합시킴으로써 얻을 수 있는 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산.
  5. 간 허혈 재관류에 수반하는 간부전의 예방 및/또는 치료를 위한 의약으로서, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산을 유효 성분으로서 함유하는 의약.
  6. 간 혈류 차단을 수반하는 간 수술 후의 간부전의 예방 및/또는 치료를 위한 의약으로서, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산을 유효 성분으로서 함유하는 의약.
  7. 제 6 항에 있어서,
    간 혈류 차단을 수반하는 간 수술이 간 이식이나 간부분 절제인 의약.
  8. 간 허혈 재관류에 의해 발생하는 저산소/재산소 부하에서 기인하는 간부전의 예방 및/또는 치료를 위한 의약으로서, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산을 유효 성분으로서 함유하는 의약.
  9. 간 허혈 재관류에 의해 발생하는 저산소/재산소 부하에서 기인하는 간유동 내피세포의 아포토시스를 억제하기 위한 의약으로서, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 스핑고신-1-인산에 의해 수식된 히알루론산을 유효 성분으로서 함유하는 의약.
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