KR20160137555A - 초음파 전구체 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인지질-안정화 퍼플루오로부탄 미세기포를 포함하는 초음파 조영제 전구체의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상업적 규모의 제조에 적합하며, 상기 미세기포의 더 일관된 바이알-대-바이알 수율 및 크기 분포를 제공한다. 본 발명의 방법을 사용한 키트 및 초음파 조영제의 제조 방법이 또한 제공된다.

Description

초음파 전구체 제조 방법 {ULTRASOUND PRECURSOR PREPARATION METHOD}
본 발명은 인지질-안정화 퍼플루오로부탄 미세기포를 포함하는 초음파 조영제 전구체의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상업적 규모의 제조에 적합하며, 상기 미세기포의 더 일관된 바이알-대-바이알 수율 및 크기 분포를 제공한다. 역시 제공되는 것은 본 발명의 방법을 사용한 키트 및 초음파 조영제의 제조 방법이다.
인지질-안정화된 퍼플루오로탄소 (예컨대 퍼플루오로프로판 또는 퍼플루오로부탄) 미세기포 기재의 초음파 조영제에 대해서는 업계에 잘 알려져 있다 (예컨대 문헌 [Wheatley et al, J.Drug Del.Sci.Technol., 23(1), 57-72 (2013)] 참조).
WO 97/29782호는 하기에서 선택되는 냉동-건조 안정화제 존재하에서의 퍼플루오로탄소 미세기포의 동결건조에 의해, 실온에서 안정한 초음파 조영제 전구체가 제조될 수 있다고 교시하고 있다: 수크로스, 말토스, 트레할로스, 라피노스 또는 스타키오스, 바람직하게는 수크로스.
WO 99/03558호는 더 좁은 크기 분포를 가지는 (즉 단분산) 해당 미세기포를 제공하기 위한, 다분산 혼합물로부터의 초음파 조영제 기체 미세기포의 선택 방법을 개시하고 있다. 기술되어 있는 방법은 부유 및 재-현탁을 포함한다.
WO 99/08715호는 기체-함유 소포의 수성 분산액을 포함하며 그의 멤브레인이 양친매성 멤브레인-형성 물질을 포함하는 약제 조성물의 제조 공정을 개시하고 있는데, 상기 공정은 하기를 포함한다:
(i) 양친매성 멤브레인 형성 물질을 포함하는 혼합물로부터 기체-함유 소포의 액체 분산액을 생성시키는 단계;
(ii) 상기 기체-함유 소포의 액체 분산액을 동결건조시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 동결건조된 생성물을 멸균 수성 액체와 재구성함으로써 기체-함유 소포의 수성 분산액을 생성시키는 단계; 및
(iv) 단계 (i) 또는 단계 (iii)의 수성 분산액 생성물 또는 단계 (ii)의 동결건조된 생성물을 처리함으로써, 기체-함유 소포의 실질적으로 응집물이 없는 멸균 수성 분산액을 생성시키는 단계.
WO 99/08715호는 원치 않는 더 큰 종을 형성하는 미세기포의 응집을 억제하기 위해서는 단계 (i)과 (ii) 사이의 시간이 최소화되어야 한다고 교시하고 있다. 그러나, WO 99/08715호는 기체-함유 소포가 동결건조 전에 크기 조절에 적용되어야 한다는 것, 동결건조 단계 전에 냉동보호제(cryoprotectant)/동결보호제(lyoprotectant)가 사용되어야 한다는 것, 또는 배치 제조 공정에서는 다수의 개별 바이알들에 분배할 것은 교시하지 않고 있다.
EP 1228770 A1호는 동결건조된 전구체의 바이알이 헤드공간(headspace) 기체의 감압하에 밀봉되는, 기체 미세기포를 포함하는 동결건조된 초음파 조영제의 제조 공정을 교시하고 있다. 감압이 전구체 바이알의 재구성-후 형성되는 수성 미세기포 조성물에서 입자 크기를 조절하는 것을 돕는 것으로 언급되고 있다.
WO 2004/069284호는 정해진 크기 분포의 인지질-안정화 기체 미세기포 초음파 조영제를 수득하는 문제를 처리하고 있다. WO 2004/069284호는 동결건조 전에 미세기포 제조 에멀젼에 실질적으로 수-비혼화성인 유기 용매가 사용되어야 한다고 교시하고 있다. WO 2004/069284호는 동결건조된 전구체의 재구성시 수득되는 미세기포가 상대적으로 작은 직경 및 좁은 크기 분포를 가진다고 교시하고 있다.
문헌 [Solis et al [Int.J.Pharmaceut., 396(1-2), 30-38 (2010)]]은 동결건조된 퍼플루오로프로판 미세기포 전구체에 대한 동결보호제를 포함한 부형제들의 효과를 연구하였다. 글루코스가 최고의 동결보호제이며, 트레할로스가 바로 뒤따르는데, 모두 수크로스 또는 만니톨에 비해 뛰어나다고 결론짓고 있다.
문헌 [Feshitan et al [J.Coll.Interf.Sci., 329, 316-324 (2009)]]은 계면활성제-코팅된 미세기포와 달리, 지질-코팅된 미세기포가 원심분리 후 안정하다는 것, 그리고 지질 쉘이 고도로 점성이며 기체에 대하여 상대적으로 비투과성이라는 것을 보고하고 있다. 페쉬탄(Feshitan) 등은 4-5 ㎛ 크기 범위의 퍼플루오로부탄 미세기포가 2-일 이상 동안 안정하기는 하지만, 2-주 후에는 더 작은 크기의 미세기포 (1-2 ㎛)로 붕괴되는 경향이 있다고 보고하고 있다.
미세기포 농도 및 크기 분포의 바이알-대-바이알 변동, 수율, 및 조영제의 기타 중요한 특징들에 대한 조절력을 제공하는 초음파 동결건조 전구체 제조 방법에 대한 필요성은 여전히 존재한다. 그와 같은 방법은 상업적 규모의 제조에 적합해야 하며, 규제 요건 (예컨대 U.S. 약전 및 ICH 지침)을 만족시키는 바이알 함량의 균일성 및 안전성 프로파일을 가지는 전구체 생성물을 산출해야 한다.
[발명의 개요]
초음파처리 및 고전단 에멀젼화와 같은 통상적인 미세기포 초음파 조영제 제조 방법들은 상업적 제조로의 규모-확대 능력과 함께 우수한 수율 및 낮은 제조 비용을 제공한다. 그것은 미세기포 크기 분포를 조절함에 있어서의 어려움이라는 단점을 안고 있다. 더 좁은 크기 분포를 가지는 미세기포의 제조를 가능케 하는 다른 제조 기술들이 개발되어 있기는 하지만, 이러한 대안적인 방법들은 더 낮은-수율의 것이거나, 높은 비용 요건을 포함하거나, 또는 상업적 제조 방법론으로 규모-확대하기에는 너무 느린 것 중 어느 하나이다.
본 발명은 상업적 규모의 제조에 적합하지만 미세기포 농도, 크기 분포, 수율, 및 조영제의 기타 중요한 특징들의 바이알-대-바이알 변동에 대한 적정한 조절력을 제공하기도 하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명자들은 미세기포 조영제 바이알 수천개의 배치 크기의 제조에 있어서, 하기 두 가지 핵심 파라미터가 변동성을 조절하는 데에 중요하다는 것을 발견하였다: (a) 동결건조 전의 미세기포 크기 범위; 및 (b) 해당 바이알로의 분배와 바이알 내용물이 -40 내지 -70℃에서 냉동될 때 사이의 경과 시간 ("유보 시간(holding time)").
본 발명은 양 파라미터의 조절 방법을 제공하는 것으로서, 결과적으로 하기의 장점을 가진다:
(i) 각 바이알에서의 최적의 수율 및 미세기포 농도;
(ii) 바이알 대 바이알 함량의 균일성에 대한 조절력.
본 발명의 조영제 전구체는 또한 다가 양이온에 대하여 덜 민감성인 것으로 밝혀졌다.
이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, 본 발명자들은 액체 기질 (예컨대 수크로스 용액)과 기체-충전된 미세기포 사이의 높은 밀도 증분으로 인하여, 미세기포가 빠르게 액체 부피의 상부로 분리되는 ("크림화(creaming)") 경향이 있는 것으로 믿고 있다. 상기한 (i) 및 (ii)의 잇점을 제공하기 위하여 최소화 및 조절되어야 하는 것이 이와 같은 크림화이다. 마찬가지로, 표면 층에서의 높은 미세기포 농도는 동결건조 동안의 케이크의 건조를 훼손하는 것으로, 및/또는 너무 높은 국소 농도는 최종 수크로스 구조 외부에, 즉 완전히 매립된 기체 포켓이 아닌 표면상의 구멍으로서 그것이 부분적으로 포획되기 때문에 미세기포의 생존률을 격감시키는 것으로 믿고 있다.
제1 측면에서, 본 발명은 수크로스 중에서 수소화 난(egg) 포스파티딜세린에 의해 안정화된 퍼플루오로부탄 미세기포의 동결건조된 조성물을 포함하는 초음파 조영제 전구체의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(i) 수성 용액 중에서 수소화 난 포스파티딜세린에 의해 안정화된 상기 퍼플루오로부탄 미세기포의 수성 현탁액을 제공하는 단계;
(ii) 상기 미세기포의 크기를 2 내지 5 ㎛ 범위의 중앙 크기로 조정하는 단계;
(iii) 5-20 % w/v의 최종 수크로스 농도를 얻도록 단계 (ii)로부터의 크기-조정된 현탁액을 멸균 수성 수크로스 용액으로 희석하는 단계;
(iv) 단계 (iii)으로부터의 조성물의 분취량을 바이알에 분배하여 충전된 바이알을 제공하는 단계;
(v) 단계 (iv)의 분배가 완료된 후 5분 미만의 유보 시간 기간 이내에, 상기 충전된 각 바이알을 -40℃ 내지 -70℃의 온도로 냉각시키는 단계;
(vi) 원하는 수의 냉각된 충전된 바이알이 얻어질 때까지 필요한 만큼 단계 (iv) 및 (v)를 반복하는 단계;
(vii) 단계 (v) 및 (vi)으로부터의 냉각된 충전된 바이알을 냉동-건조시키는 단계;
(viii) 단계 (viii)로부터의 냉동-건조된 바이알의 헤드공간 기체를 퍼플루오로부탄으로 재충전하는 단계;
(ix) 단계 (vii)로부터의 바이알을 마개로 밀봉하는 단계.
"조영제"라는 용어는 생체 내 의료 영상화 분야에서의 그의 통상적인 의미를 가지는데, 포유동물 대상체 단독을 영상화하는 것에 의해 수득될 수 있었던 것에 비해 해당 영역 또는 기관에서의 더 선명한 영상을 제공하는 것을 돕는, 포유동물 투여에 적합한 형태의 작용제를 지칭한다. "대상체"라는 용어는 포유동물 생체 내, 바람직하게는 무손상인 포유동물 신체의 생체 내, 더욱 바람직하게는 살아있는 인간 대상체를 의미한다. "포유동물 투여에 적합한 형태"라는 구는 멸균되어 있으며, 무-발열원이고, 독성 또는 부작용을 생성시키는 화합물이 없으며, 생체적합성 pH (대략 pH 4.0 내지 10.5)에서 제제화되는 조성물을 의미한다. 그와 같은 조성물에는 생체 내에서 색전을 야기할 위험성이 있을 수 있는 미립자가 없으며, 생물학적 유체 (예컨대 혈액)와의 접촉시 침전이 발생하기 않도록 제제화된다. 그와 같은 조성물은 또한 생물학적으로 상용성인 부형제만을 함유하며, 바람직하게는 등장성이다.
다른 생체 내 영상화 작용제에서와 마찬가지로, 조영제는 영상화되는 포유동물 대상체에 대하여 최소한의 약학적 효과를 가지도록 설계된다. 바람직하게는, 조영제는 최소한으로 침습성인 방식으로, 즉 전문 의료 지식하에 수행될 경우 포유동물 대상체에 대한 실질적인 건강상의 위험성 없이, 포유동물 신체에 투여될 수 있다. 그와 같이 최소한으로 침습성인 투여는 바람직하게는 국소 또는 전신 마취의 필요성이 없는 상기 대상체 말초 정맥에의 정맥내 투여이다.
"미세기포"라는 용어는 생체 내 초음파 영상화 분야에서의 그의 통상적인 의미를 가지는데, 통상적으로 0.5 내지 10 ㎛ 사이인 직경의 기체 미세기포를 지칭한다. 7 ㎛를 넘는 크기에서는, 폐 모세관에서의 체류 (색전형성)의 실질적인 위험성이 존재한다. 이와 같은 미세기포는 크기가 적혈구와 유사해서, 포유동물 신체 전체에 걸친 미세혈관 및 모세관에서 그것이 유사한 특징을 나타내는 것을 가능케 한다 (문헌 [Sirsi et al, Bubble Sci.Eng.Technol, 1(1-2), 3-17 (2009)]).
본 발명의 적합한 미세기포는 - 문헌 [Sirsi et al] (상기)에 기술되어 있는 바와 같은 - 인지질 쉘 또는 코팅, 특히 수소화 난 포스파티딜세린 (H-EPS)에 존재하는 인지질에 의해 안정화된다. H-EPS에 존재하는 인지질은 주로 포스파티딜세린 및 포스파티드산이다 (문헌 [Hvattum et al, J.Pharm.Biomed.Anal., 42, 506-512 (2006)]).
퍼플루오로부탄 ("PFB")은 그의 표준인 화학적 의미를 가지는데, 의료 용도의 맥락에서는 퍼플루부탄으로 지칭되기도 한다. 퍼플루오로-n-부탄의 화학식은 CF3CF2CF2CF3 또는 C4F10으로서, -2.2℃의 비점을 가진다. 시중의 퍼플루오로-n-부탄은 미량 (통상적으로 2-4 %)의 퍼플루오로-이소-부탄 이성질체, 즉 CF3CF(CF3)CF3를 함유한다.
"수성 현탁액"이라는 용어는 물 및/또는 수-혼화성 용매를 포함하는 수성 용매 중 미세기포의 현탁액을 지칭한다. 상기 수성 용매는 바람직하게는 생체적합성 운반체이다. "생체적합성 운반체"라는 용어는 조성이 생리학적으로 허용성이도록 된, 즉 독성 또는 과도한 불편성 없이 포유동물 신체에 투여될 수 있도록 된 유체, 특히 액체를 의미한다. 생체적합성 운반체는 적합하게는 멸균 무-발열원 주사용수; 식염수와 같은 수성 용액 (유리하게는 주사용 최종 생성물이 등장성이 되도록 조율될 수 있음); 생체적합성 완충제 (예컨대 포스페이트 완충제)를 포함하는 수성 완충제 용액; 1종 이상 장성-조정 물질 (예컨대 혈장 양이온의 생체적합성 상대이온과의 염), 당 (예컨대 글루코스 또는 수크로스), 당 알콜 (예컨대 소르비톨 또는 만니톨), 글리콜 (예컨대 글리세롤), 또는 기타 비-이온성 폴리올 물질 (예컨대 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 등)의 수성 용액과 같은 주사가능한 운반체 액체이다. 바람직하게는, 생체적합성 운반체는 무-발열원 주사용수, 등장성 식염수 또는 포스페이트 완충제이다. 따라서, 수-비혼화성 유기 용매는 적합하게는 수성 현탁액에서 배제된다.
"전구체"라는 용어는 재구성시 그것이 용이하게 원하는 초음파 조영제를 형성하도록 설계된, 편리한 형태 또는 키트 형태의 조형제를 지칭한다.
"충전된 바이알"이라는 용어는 조성물의 분취량이 거기에 분배된 바이알인 충전된 바이알, 즉 분배된 바이알을 지칭한다. 바이알 부피는 통상적으로 10 mL이게 되는데, 분배되는 부피는 약 2 mL이므로, 바이알이 물리적으로 가득 채워지지는 않으며, 조성물 상에 헤드공간 기체를 남긴다. '헤드공간 기체'라는 용어는 그의 통상적인 의미를 가지며, 동결건조된 조성물 상의 바이알 내 기체를 지칭한다.
"유보 시간"이라는 구는 충전, 즉 단계 (iv)에서의 개별 바이알의 분배 후, -40 내지 -70℃로의 충전된 바이알의 냉각 개시 전의 시간 지연을 지칭한다.
제1 측면 방법의 단계 (i)에서의 미세기포 제조는 하기를 포함한 다양한 업계 공지의 방법들에 의해 수행될 수 있다:
(i) 초음파처리;
(ii) 고전단 에멀젼화;
(iii) 멤브레인 에멀젼화;
(iv) 동축 전기유체역학적 분무 (CEHDA); 및
(v) 미세유체 장치;
(vi) 잉크젯 프린팅.
이러한 방법들에 대해서는 문헌 [Stride et al [Soft Matter, 4, 2350-2359 (2008)]] 및 그의 참고문헌에 기술되어 있다. 미세기포 제조 방법의 추가적인 세부사항은 문헌 [Unnikrishnan et al [Am.J.Roentgenol, 199(2), 292-299 (2012)]]에 의해 제공된다.
잉크-젯 프린팅은 문헌 [Stride et al] (상기)에서 액체-충전된 입자에 더 적합한 것으로 보고되어 있으며, 그에 따라 본 발명의 PFB 미세기포에는 덜 적합하다. 초음파처리는 그것이 광범위한 기포 크기를 제공하는 경향이 있기 때문에 덜 바람직하며, 미세유체 기술은 상업적인 제조에는 적합하지 않은 느린 제조 속도라는 문제점을 안고 있다 (문헌 [Wang et al, Ultraso.Med.Biol., 39(5), 882-892 (2013)]).
본 발명의 바람직한 제조 방법은 바람직하게는 로터 스테이터 믹서(rotor stator mixer)를 사용한 고전단 에멀젼화이며 - 그것이 더 큰 정도의 크기 조절력을 제공하고, 대형 배치 제조에 적합하며, 안정적인 크기 분포를 제공하기 때문이다. 미세기포는 퍼플루오로탄소 (본원에서는 PFB)의 존재하에서 수초 동안 멸균 무-발열원 지질 현탁액을 교반하는 것에 의해 형성된다. 실시예 1은 로터 스테이터 미세기포 제조 방법을 제공한다. 로터-스테이터 믹서에 대해서는 문헌 [Rodgers et al [Chem.Eng.Res.Rev., 90(3), 323-327 (2012)]] 및 [Emulsion Formation and Stability [T.F.Tadros (Ed), Wiley VCH (2013)]]에 기술되어 있는데, 특히 문헌 [Pacek et al Chapter 5 Emulsification in Rotor-Stator Mixers, p. 127-167]을 참조하라.
제1 측면 방법의 단계 (ii)에서의 미세기포 크기 조정은 하기를 포함한 다양한 업계 공지의 방법들에 의해 수행될 수 있다:
(a) 1회 이상 주기의 부유 및 재-현탁; 또는
(b) 분별 원심분리; 또는
(c) 대형 세공을 사용한 교차류 여과; 또는
(d) 전계-유동 분별(field-flow fractionation).
부유 및 재-현탁에 대해서는 문헌 [Kvale et al [Separat.Technol., 6, 219-226 (1996)]]에 기술되어 있는데, 실시예 2에서 제시된다. 크기 범위 1-2 ㎛ 및 4-5 ㎛인 지질-코팅된 퍼플루오로부탄 미세기포의 하위-군집을 분리 및 단리하기 위한 분별 원심분리에 대해서는 문헌 [Feshitan et al [J.Coll.lnterf.Sci., 329, 316-324 (2009)]]에 기술되어 있다.
인지질-안정화된 퍼플루오로부탄 미세기포, 예컨대 작용제 소나조이드(Sonazoid)™는 유연성이며 안정하기도 하다. 따라서, 그것은 크기 분포에 있어서의 상당한 변화 없이도 5 ㎛ 필터를 통과할 수 있다 (문헌 [Sontum, Ultraso.Med.Biol., 34(5), 824-833 (2008)]). 이와 같은 사실, 및 해당 여과가 너무 작은 미세기포를 제거할 수 없다는 사실은 필터를 통한 통과 자체가 본 발명 단계 (ii)에서의 크기 조정에는 적합한 방법이 아니라는 것을 의미한다.
어떤 제조 기술은 정해진 더 좁은 크기 분포의 미세기포를 제공하는 것을 목표로 한다. 그와 같은 경우, 제1 측면 방법의 단계 (i) 및 (ii)는 사실상 공동으로 수행된다. 그러한 제조 기술이 CEHDA 및 미세유체 장치이다. 따라서, 대안적인 실시양태에서, 제1 측면은 순차적인 것과 달리 단계 (i) 및 (ii)를 공동으로 수행하는 선택사항을 포함한다.
"상기 충전된 각 바이알을 -40℃ 내지 -70℃의 온도로 냉각시키는 단계"라는 구는 바이알 및 내용물의 냉각을 지칭한다. 바이알 내용물의 냉동은 약간 정도의 변동을 포함하여 이루어지게 되는데, 일부 바이알이 냉동-건조기 선반에서 과냉되며, 그에 따라 바이알 내용물을 냉동하는 데에 더 오래 걸릴 수 있기 때문이다.
본 발명의 방법은 예를 들면 제조 배치에서 100,000개 이하, 통상적으로는 35,000 내지 40,000개 가량의 바이알 수인 상업적 규모 제조에서 사용하기에 특히 적합하다. 그와 같은 큰 규모의 상업적 제조에서는, 바이알-대-바이알 일관성, 즉 바이알-대-바이알 변동을 최소화하는 것이 중요하다. 따라서, 단계 (iv)에서 분배되는 분취량은 바람직하게는 동일한 부피의 것이며, 더욱 바람직하게는 ± 3 %의 허용오차 내로 조절된다.
본 발명자들은 이와 같은 큰 바이알 수에서는 동결건조 전의 미세기포의 크기 분포 및 유보 시간을 조절하는 것이 중요하다는 것을 발견하였다. 단계 (v)에 따른 수성 수크로스 용액 중에서의 빠른 냉동이 바이알 대 바이알 함량, 특히 미세기포 농도의 균일성을 조절하는 데에 중요하다는 것이 발견되었다. 그와 같은 빠른 냉각은 업계에 알려져 있는 방법들에 의해 수행될 수 있는데, 예컨대 하기다: 액체 질소 배스에의 침지; 유기 용매/드라이 아이스 저온 배스에의 침지; 또는 냉동-건조기 장치 내의 저온인 선반 또는 환경.
그와 같은 상업적 배치 크기 상황에서는, 이후 모든 분배/충전된 바이알이 냉동되기 전에 단계적 방식으로 진행하여 모든 바이알이 충전될 때까지 기다리는 것이 실행가능하지 않다는 것이 발견되었다. 이는 일단 단리되고 나면 지질-코팅된 PFB 미세기포는 2일 이상 동안 안정하다는 통상적인 지식에 위배된다 (문헌 [Feshitan et al, J.Coll.Interf.Sci., 329, 316-324 (2009)]). 이렇게 하여, 본 발명자들은 배치의 균일성을 조절하기 위해서는 하기의 핵심 파라미터들이 모두 조절되어야 한다는 것을 발견하였다:
(i) 동결건조 전의 중앙 미세기포 크기; 및
(ii) 5-분 미만, 바람직하게는 3-분 미만의 기간으로 최소화되어야 하는 - '유보 시간'.
추가적인 세부사항들은 관련 실시예 및 도면 (하기)에서 제공된다.
단계 (vi)에서, "원하는 수"는 특정 조영제 전구체 제조 배치에서의 총 바이알 수를 지칭한다. 따라서, 단계 (vi)는 단계 (v)의 유보 시간 제한을 충족하는 데에 필요한 상황을 담당하고자 하는 것이며, 주어진 바이알 배치 크기로 인하여, 전체 배치 바이알이 충전 및 냉각되어 단계 (vii)에 따라 동결건조될 준비가 될 때까지 많은 분배 및 냉동의 반복 주기가 필요할 수 있다는 것을 의미한다.
"포함하는" 또는 "포함하다"라는 용어는 본 출원 전체에 걸쳐 그의 통상적인 의미를 가지는데, 작용제 또는 조성물이 열거된 필수적인 특징 또는 성분을 가져야 하나, 다른 것이 추가적으로 존재할 수도 있음을 암시한다. '포함하는'이라는 용어는 조성물이 다른 특징 또는 성분의 존재 없이 열거된 성분만을 가진다는 것을 의미하는 "~로 필수적으로 구성되는"을 바람직한 하위세트로서 포함한다.
재충전 단계 (viii)에서는, 업계에 알려져 있는 바와 같이 바이알의 밀봉을 촉진하기 위하여 대략 대기압, 바람직하게는 대기압 직하로 헤드공간 기체가 충전된다.
바람직한 실시양태
제1 측면의 방법은 14-18 μl/mL 범위의 미세구체 농도, 및 2.7-3.5 ㎛ 범위의 미세기포 크기 분포 (중앙 크기)를 제공한다.
제1 측면의 방법에서, 단계 (v)의 유보 시간 기간은 바람직하게는 3분 미만이다. 단계 (v)의 유보 시간 기간은 바람직하게는 각 충전된 바이알에서 그것이 1.0 내지 2.75분 시간 범위 이내에 속하도록 조절된다.
제1 측면의 방법에서, 동결건조된 전구체 조성물은 바람직하게는 멸균된다.
제1 측면의 방법에서, 배치 크기는 바람직하게는 조영제 전구체로 충전될 바이알 500 내지 80,000개, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 50,000개, 가장 바람직하게는 5,000 내지 45,000개 범위이다. 약 35,000 내지 40,000개 바이알의 배치 크기가 이상적이다.
단계 (v)에서 충전된 바이알이 냉각되는 온도는 바람직하게는 약 -60℃이다. 빠른 냉각은 바람직하게는 선반이 -60℃로 사전-냉각되어 있는 냉동-건조기 장치에 적재하는 것에 의해 달성된다.
제1 측면의 방법에서, 단계 (iii)의 수크로스 농도는 바람직하게는 8-12 % w/v, 더욱 바람직하게는 약 10 % w/v, 가장 바람직하게는 92 mg/mL이다. 수크로스는 동결보호제/냉동보호제로서 작용하는데, 미세기포 크기 및 농도가 사전한정되도록 지질-안정화된 PFB 미세기포가 전구체의 동결건조된 수크로스 내에 포획되는 기질을 형성하며, 최종 사용자에 의해 채택되는 재구성 절차에 의해 영향을 받지는 않는 것으로 나타났다. 따라서, 적합한 수성 매체를 사용한 전구체 바이알의 재구성시, 수크로스는 용해되어 인지질-안정화된 PFB 미세기포를 방출한다 (문헌 [Sontum, Ultraso.Med.Biol., 34(5), 824-833 (2008)]). 동결보호제 또는 냉동보호제로서의 당의 사용에 대해서는 업계에 잘 알려져 있는데, 예를 들면 문헌 [Solis et al [Int.J.Pharmaceut., 396, 30-38 (2010)]] 및 그의 참고문헌에 기술되어 있다.
제1 측면의 방법에서, 단계 (ii)의 크기 조정은 바람직하게는 하기에 의해 수행된다:
(a) 1회 이상 주기의 부유 및 재-현탁; 또는
(b) 분별 원심분리; 또는
(c) 이들의 조합.
제1 측면의 방법에서, 단계 (iii) 후에는, 분배 단계 (iv) 및 이후의 동결건조로 진행하기 전에 크기 분포 및 미세기포 농도가 적합하지를 검사하는 것이 바람직하다. 따라서, 그와 같은 단계에서 적합하지 않은 물질을 분배하고 동결건조시키는 시간 및 비용을 피하기 위해서는, 통과/실패 기준이 중요하다.
제1 측면 방법의 단계 (iv)에서는, 다수의 바이알이 바람직하게는 병행으로 - 즉 공동으로 분배된다. 단계 (v)에서는, 다수의 충전된 바이알이 바람직하게는 병행으로 - 즉 공동으로 냉각된다. 통상의 기술자라면, 가용한 분배 장치 (특히 공동 분배에 가용한 분배기 암의 수), 냉동-건조기 장치의 크기 및 바이알 당 분배 시간을 바탕으로 여기에 적합한 수를 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명의 청구범위에 따른 바이알 당 분배 시간 및 최대 유보 시간을 알고 있을 경우, 통상의 기술자라면 배치 내 바이알 하위세트에서 단계 (v)의 냉각이 수행되어야 하기 전에 얼마나 많은 바이알이 충전될 수 있는지를 용이하게 도출할 수 있다. 바람직하게는, 충전된 바이알의 각 군은 원하는 온도 (예컨대 -60℃)로 유지되는 냉동-건조기 장치 (예컨대 냉동-건조기 내의 선반)에 점진적으로 적재된 후, 전체 배치가 냉동-건조기 장치에 적재될 때까지 그 온도에서 유지된다. 바람직한 실시양태에서는, 4개의 충전 바늘이 분배기로부터 사용됨으로써, 4개 바이알이 공동으로 충전된다. 70개 바이알의 하위-군이 이와 같은 방식으로 충전된 다음, -60℃로 사전-냉각된 냉동-건조기에 적재된다.
본 발명의 바람직한 초음파 조영제 및 전구체는 문헌 [Sontum [Ultraso.Med.Biol., 34(5), 824-833 (2008)]]에 기술되어 있는 바와 같은, 이전에는 NC100100으로 알려져 있던 소나조이드™ (GE 헬스케어(Healthcare) AS)이다.
제1 측면의 방법에서 사용하기에 적합한 바이알 및 마개는 제약 등급의 것으로서, 동결건조에 적합한데, 시중에서 광범위하게 구입가능하다. 편평-저 바이알을 사용하는 것이 바람직한데, 그것이 바이알과 냉동-건조기 선반 사이의 열 전달을 증가시키기 때문이다. 마개는 바람직하게는 동결건조에 적합하도록 선택되는데, 바이알로부터의 증기의 유출을 허용하도록 설계됨으로써 - 냉동-건조기가 개방되어 적재해제되기 전에 바이알을 막는 것을 가능하게 한다.
수크로스 역시 시중에서 구입가능한 바 - 제약 등급이 사용되어야 한다. 제약용 GMP 등급의 퍼플루오로부탄은 F2 케미칼스 리미티드(Chemicals Limited)로부터 구입할 수 있다. H-EPS는 일본 효고 아마가사키-시 소재 NOF 코포레이션으로부터 시중에서 구입가능하다.
제2 측면에서, 본 발명은 멸균 수성 매체 중에서 수소화 난 포스파티딜세린에 의해 안정화된 퍼플루오로부탄 미세기포의 현탁액을 포함하는 초음파 조영제 제조용 키트의 제조 방법을 제공하는 바, 하기를 포함한다:
(i) 제1 측면의 방법을 수행하여, 제1 측면에서 정의된 바와 같은 조영제 전구체를 함유하는 바이알을 제공하는 단계; 및
(ii) 단계 (i)로부터의 상기 전구체 바이알을 재구성하여 상기 조영제를 제공하기에 적합한 멸균 수성 용액의 용기를 제공하는 단계.
제1 측면 방법의 바람직한 실시양태들, 및 제2 측면 키트 제조 방법에서의 전구체는 제1 측면 (상기)에서 기술된 바와 같다.
본원에서 "키트"라는 용어는 생체 내 영상화 분야에서의 그의 통상적인 의미를 가지는데, 포유동물 투여에 적합한 형태의 해당 조영제를 제조하기 위한 모든 필요한 구성요소들 (상기한 바와 같음)과 함께 공급되는 조영제 자체 또는 그의 전구체를 지칭한다. 그와 같은 키트는 수주 또는 수개월의 사용가능 저장-수명을 가짐으로써 임상의가 해당 포유동물 대상체를 영상화하기에 적합한 시점 및 시간에 조영제를 제조할 수 있도록 설계된다. 이는 통상적으로 임상의에게 더욱 편리한데, 일단 제조되고 나면, 조영제 자체는 훨씬 더 짧은 사용가능 저장-수명을 가지게 되기 때문이다. 키트를 공급한다는 것은 임상의가 그것이 필요할 때면 언제나 24시간, 7-일의 조영제에 대한 접근권을 가진다는 것을 의미한다. 키트는 적합하게는 환자 안전성 정보 및 시중 공급자에 대한 세부사항과 함께 키트 및 그의 구성요소를 정의함으로써 키트를 사용하는 방법의 세부사항을 제공하는 "포장 유인물"을 포함하게 된다. 이와 같은 키트는 통상적으로 초음파 조영제를 제공하도록 설계된 바람직한 시중 생성물 포맷을 나타낸다.
제2 측면 단계 (ii)의 멸균 수성 용액은 바람직하게는 상기에서 정의된 바와 같은 "생체적합성 운반체"이다. 더욱 바람직하게는, 그것은 멸균 주사용수이다. 가장 바람직하게는, 상기 멸균 수성 용액은 100 μM 미만, 이상적으로는 50 μM 미만의 유리 (즉 킬레이팅되지 않은) 알루미늄, 바륨, 마그네슘, 칼슘 및 아연 이온 총 농도를 가진다.
제2 측면의 키트는 바람직하게는 케모프로텍트(Chemoprotect)® 스파이크 (코단 게엠베하 운트 캄파니(Codan GmbH & Co), 독일 소재)와 같은 벤팅된 필터 (5 ㎛) 스파이크를 추가적으로 포함한다. 키트는 스파이크를 통하여 수성 용액을 이용해 재구성된 후, 이어서 약 1분 동안 수동으로 혼합됨으로써, 우윳빛의 균질한 분산액을 산출한다. 이후, 대상체를 영상화하기 위한 조영제의 투여분이 필터 스파이크를 통하여 주사기로 취출된다. "스파이크"의 역할은 - 그렇지 않을 경우 바이알 내 분산액이 불투명하기 때문에 시각적인 검사로는 검출하기가 어려웠을 - 임의의 외인성 입자 또는 응집물들을 제거하는 것이다.
제3 측면에서, 본 발명은 멸균 수성 매체 중에서 수소화 난 포스파티딜세린에 의해 안정화된 퍼플루오로부탄 미세기포의 현탁액을 포함하는 초음파 조영제의 제조 방법을 제공하는 바, 하기를 포함한다:
(i) 제1 측면의 방법을 수행하여, 제1 측면에서 정의된 바와 같은 조영제 전구체를 함유하는 바이알을 제공하는 단계; 및
(ii) 단계 (i)로부터의 전구체 바이알을 멸균 수성 용액을 이용해 재구성하는 단계.
제1 측면 방법의 바람직한 실시양태들, 및 제2 측면 조영제 제조 방법에서의 전구체는 제1 측면 (상기)에서 기술된 바와 같다. 제3 측면의 방법은 바람직하게는 제2 측면의 키트 제조 방법을 포함한다.
도면의 설명
도 1은 - 3분 미만의 유보 시간에서 바이알에 존재하는 미세기포 평균 농도의 백분율로 나타낸 - 전구체 바이알 내 미세기포 함량에 대한 유보 시간의 효과를 나타낸다. 바이알 당 미세기포의 수율은 약 20-분의 유보 시간에서 최초 값의 약 85 %로 감소되었으며, 60분의 유보 시간에서는 최초 값의 겨우 약 75 %까지 감소되었다.
도 2는 전구체 바이알의 UoC에 대한 유보 시간의 효과를 나타내는 것으로서; 군 평균 중 %로서 개별 바이알 값을 나타낸다. 유보 시간 범위가 더 길수록, 바이알 당 미세기포의 다양성은 더 커진다. 따라서, 상대적 표준 편차 (RSD)으로 나타낼 경우, 미세기포 함량의 범위는 3분 미만 유보 시간에서의 15 %로부터, 20분 미만에서의 22 %를 거쳐, 60분 미만에서의 29 %까지 높게 증가하였다. 수평 파선들은 배치 평균으로부터의 개별 단위의 최대 허용가능한 편차로서의 UoC에 대한 약전 요건인 ± 25 %를 나타낸다. 주지되어 있는 바와 같이, 3분 미만의 유보 시간 범위에서는, 모든 바이알이 이러한 요건 내에 들어 있다. 20분의 유보 시간 범위에서 조차도, 20개 바이알 중 5개가 약전에 설정되어 있는 요건의 외부에 속한다. 60분의 유보 시간 범위에서는, 시험된 39개 바이알 중 11개가 요건 외부에 존재한다.
합쳐서, 도 1 및 2는 수율을 최적화하고 UoC의 규제 요건 (바이알 대 바이알 가변성)에 부합하는 생성물을 제조하는 데에 있어서의 충전과 동결건조 사이에서의 짧은 유보 시간 및 좁은 유보 시간 가변성의 중요성을 입증하고 있다.
도 3은 부유 속도에 대한 미세기포 크기 (㎛로 나타낸 직경)의 효과를 나타낸다. 플롯은 1 g/ml의 밀도 증분 및 1 mPas의 점도에서 스토크스 방정식(Stokes equation)을 바탕으로 계산되었다. 특히, 동결건조 동안의 충전 높이는 통상적으로 1 cm이었으며, 그에 따라 현탁액 중의 모든 5 ㎛ 미세기포는 대략 12분 이내에 액체 기질의 상부로 응집되게 되었다.
도 4는 미세기포의 백분율 손실 대 동결건조 전 미세기포 크기에 대한 데이터를 나타낸다. 결과는 27개 배치 각각에 대한 동결건조 전 및 후의 10개 바이알 분석으로부터의 것이다. 도 3 및 4는 함께 더 큰 미세기포가 훨씬 더 빠르게 크림화되며, 그에 따라 미세기포 수율의 손실로 이어진다는 것을 입증하고 있다. 결론적으로, 전구체 바이알에서의 UoC는 더 작은 것에 비해 동결건조-전의 대형 미세기포의 존재에 더 민감하다. 도 5 역시 2.5 ㎛ 기포에서의 대략 40 %로부터 3.7 ㎛ 기포에서의 80 %로 손실이 증가한다는 것을 보여주고 있다. 도 3 및 4는 함께 제1 측면 방법의 단계 (ii)에서의 동결건조-전 크기 조정이 중요한 이유를 입증하고 있다.
[ 실시예 ]
하기에서 상술되는 비-제한적인 실시예로 본 발명을 예시한다. 실시예 1은 로터 스테이터 혼합을 사용하여 H-EPS에 의해 안정화되는 PFB 미세기포의 제조를 제공한다. 실시예 2는 부유를 사용한 실시예 1 미세기포의 크기 조정 방법을 제공한다. 실시예 3은 PFB 미세기포의 수율 및 UoC에 대한 유보 시간의 효과에 대한 세부사항을 제공한다. 미세기포 농도 대 유보 시간의 결과는 도 1에 나타내었으며, UoC 대 유보 시간 범위의 결과는 도 2에 나타내었다. 합쳐서, 도 1 및 2는 수율을 최적화하고 UoC에 관한 규제 요건 (바이알 대 바이알 가변성)에 부합하는 생성물을 제조하는 데에 있어서의 충전과 동결건조 사이에서의 짧은 유보 시간 및 좁은 유보 시간 가변성의 중요성을 입증하고 있다.
실시예 4는 동결건조 동안의 손실에 대한 미세기포 크기의 효과를 나타낸다. 미세기포 부유 속도 대 미세기포 직경의 결과를 도 3에 나타내었으며, 동결건조 동안의 손실 대 미세기포 직경의 결과를 도 4에 나타내었다. 합쳐서, 도 3 및 4는 부유 속도에 대한 미세기포 크기의 영향, 및 미세기포 크기 증가에 따라 부수하여 증가되는 동결건조 동안의 손실, 및 그에 따라 손실을 최소화하고 UoC에 대한 요건을 충족하기 위한 동결건조 전 크기 조정 단계의 중요성을 입증하고 있다.
약어
FD: 냉동-건조;
GMP: 우수 제조 실시;
H-EPS: 수소화 난 포스파티딜세린;
ICH: 국제 조화 회의(International Conference on Harmonisation);
i.v.: 정맥내;
Min: 분;
PA: 포스파티드산;
PFB: 퍼플루오로부탄;
PS: 포스파티딜세린;
Rpm: 분 당 회전;
UoC: 내용물의 균일성;
WFI: 주사용수.
실시예 1: 로터 스테이터 혼합에 의한 퍼플루오로부탄 미세기포 분산액의 제조
프로필렌 글리콜과 글리세롤의 혼합물 (3:10 w/w) 5.4 % (w/w)를 함유하는 5 내지 100 mL의 물에 H-EPS (500.4 mg)를 첨가하였다. 혼합물을 진탕하면서 80℃로 5분 동안 가열하고, 실온으로 냉각시킨 후, 다시 진탕하고, 사용 전에 밤새 방치하였다.
생성 용액 중 일부 (50 mL)를 원추형 목이 구비된 원형-저 플라스크로 옮겼다. 플라스크에, 25℃로 유지되는 수조에 연결된 온도 조절 유입구 및 유출구가 구비된 유리 자켓을 장착하였다. 로터 스테이터 혼합 축을 용액에 도입하고, 기체 누출을 방지하기 위하여, 기체 함량의 조정 및 압력 조절을 위한 기체 유입구/유출구 연결구조가 장착된 특수 설계 금속 마개로 목 벽체와 혼합 축 사이의 공간을 밀봉하였다. 기체 유출구를 진공 펌프에 연결하고, 1분 동안 용액을 배기하였다. 다음에, 기체 유입구를 통하여 퍼플루오로-n-부탄 기체 분위기를 적용하였다. 개구부가 액체 표면의 약간 위로 오도록 로터 스테이터 혼합 축을 유지하면서, 23,000 rpm에서 10분 동안 용액을 균질화하였다. 백색-색상의 크림질 분산액을 수득하고, 밀봉가능한 용기로 그것을 옮긴 후, 퍼플루오로-n-부탄으로 플러싱하였다. 다음에, 분산액을 분리 깔때기로 옮기고, 12,000 rpm으로 30분 동안 원심분리함으로써, 상부의 크림질 미세기포 층 및 혼탁한 하층액(infranatant)을 산출하였다. 하층액을 제거하고, 물로 대체하였다. 다음에, 이번에는 12,000 rpm에서 15분 동안, 원심분리를 2회 반복하였다. 최종 원심분리 후, 상청액을 10 % (w/w) 수크로스로 대체하였다.
실시예 2: 부유에 의한 퍼플루오로부탄 미세기포의 크기 조정
80 cm의 전체 높이 및 82 cm의 내부 직경을 가지는 원통형 편평-저 유리 분리 챔버에 기계식 교반 블레이드를 장착하였다. 상기 챔버를 실시예 1에 따라 제조된 미세기포 현탁액으로 6 cm 높이까지 충전하였다 (32 리터). 0 내지 15 rpm의 가변 속도로, 완전한 혼합을 수득하기 위하여 교호 방향으로 2분 동안 천천히 현탁액을 교반하였다. 현탁액을 200분 동안 침강시키고, 저부 5 cm 층을 저부의 3개 유출구를 통하여 저류 탱크로 배수 제거하였다. 연결된 레이저 크기-측정 장치가 특정 입자 크기가 출현하였음을 밝힐 때, 유출구를 폐쇄하였다. 주사용수 (WFI)를 6 cm 높이까지 분리 챔버에 충전하고, 교반, 침강 및 배수 주기를 반복하였다.
각 주기 후 유지되는 입자 현탁액의 분취량을 쿨터 계수기 측정에 의해 크기 분포에 대하여 시험하였다. 2 ㎛를 상회하는 입자가 유지된 11주기 후에는, 추가적인 주기를 수행하여 저부 층을 수용 탱크에 수집하는 것 및 상부 층의 폐기에 의해 크기가 4 ㎛를 초과하는 대형 입자를 제거하였다. 이와 같은 단계에서의 해당 주기들에 있어서 침강 시간은 120분이었다. 각 주기 후에는, 수용 탱크의 내용물을 분리 챔버로 되돌려보내고, 6 cm 높이까지 WFI를 첨가하였다.
미만-크기 입자를 제거하기 위한 총 11주기 및 초과크기 입자를 제거하기 위한 이후의 8 주기 후, 쿨터 계수기 측정은 입자의 89 %가 2 내지 4 ㎛ 사이의 크기를 가지고 있음을 나타내었다.
동일한 장치 및 물질을 사용하되, 원하는 크기 한계 미만의 입자를 제거하기 위한 5회의 200분 분리 주기, 다음의 원하는 크기 한계 미만의 입자를 제거하기 위한 8회의 150분 분리 주기, 및 다음의 원하는 크기 한계 초과의 입자를 제거하기 위한 8회의 100분 분리 주기를 사용하여, 수 기준 92 %의 입자가 2.5 내지 4.5 ㎛ 사이이며 72 %가 3.0 내지 4.0 ㎛ 사이인 좁은 분획을 수득하였다.
실시예 3: 수율 및 UoC에 대한 유보 시간의 효과 - 동결건조 및 크기-조정된 PFB 미세기포의 제조
WFI 중 1.5 % (w/w)의 프로필렌 글리콜 및 5.1 % (w/w)의 글리세롤 85 % 용액을 2.5 g의 H-EPSNa에 첨가한 후, 이어서 80℃ 수조에서 5분 동안 가열하는 동안 진탕하는 것에 의해, 500 ml H-EPSNa 분산액의 분할분을 제조하였다. 실온에서 밤새 교반 없이 혼합물을 방치하였다. 최종 농도 5 mg/ml H-EPSNa로 부피를 조정하였다. 인지질 현탁액을 오토클레이빙하고 (F015), 4℃로 저장하였다.
하기의 조건하에서 연속 초음파처리 시스템을 통하여 PFB 기체와 함께 H-EPSNa 현탁액을 펌핑하는 것에 의해, 안정화된 PFB 미세기포를 제조하였다: PFB-유량 45 ml/분, H-EPSNa 분산액의 유량 15 ml/분, 주파수 20.000 Hz, 그리고 온도 33℃. 생성되는 안정화된 PFB 미세기포의 분산액을 하기하는 크기 조정 단계용으로 설계된 탱크에 수집하였다.
WFI (1 kg)를 분산액 (2.2 kg)에 첨가하였다. 분산액을 진탕하면서, 3시간 20분 동안 미세기포를 부유시킨 후, 1830 g의 하층액 (폐기물)을 조심스럽게 저부로부터 제거하고, 1830 g의 WFI로 대체하였다. 분산액을 진탕하고, 또 다시 3시간 20분의 기간 동안 방치한 후, 1830 g의 폐기물을 제거하였다. 총 8×1830 g의 폐기물이 제거될 때까지 이와 같은 절차를 반복하였다. 20 % 수크로스 및 WFI를 첨가하는 것에 의해, 미세기포 크기-최적화 분산액을 미세기포 3.04 % (v/v) 및 수크로스 100 mg/ml의 최종 농도로 조정하였다. 충전 내내 200 rpm으로 분산액을 연속 교반하였으며, 100 rpm의 펌프 속도를 사용하여, 2 g (1.9-2.1 g)을 10 ml 바이알에 충전하였다. 15-20분마다 충전 중량을 기록하였다. 트레이에 바이알을 적재하고 (트레이 당 130-140개 바이알), 냉동-건조기로 수송한 후, 사전-냉각된 선반 상에 위치시켰다 (실제 온도 -58℃).
각 바이알에 대하여, 충전과 냉동-건조기에의 적재 사이의 시간 (유보 시간)을 기록하였다. 냉동 건조기의 사전냉각된 선반 (-58℃) 상에 적재하기 전에, < 3분, 20분 및 60분으로 샘플 군을 나누었다. 각 군 당 10개 바이알을 샘플링하였다. 냉동 건조 완료 후, PFB를 바이알 헤드공간에 첨가한 후, 마개를 막았다.
쿨터 계수에 의해 미세기포 크기 분포 및 부피 농도를 측정하였다.
실시예 4: 동결건조 동안의 손실 (수율)에 대한 미세기포 크기의 효과
동결건조 전에, 로터 스테이터 혼합 및 부유 원리를 통한 크기의 조정 (약간만 다른 장비 및 제조 환경을 사용하는 실시예 1 및 2에서 상술된 바와 같음)을 사용하여, 동결건조 및 크기-조정된 PFB 미세기포의 27개 배치 제조를 수행하였다. 이들 배치 모두에 있어서, 동결건조기에 충전된 바이알을 적재하기 전의 유보 시간은 20분 이하였다.
분석용 샘플
27개 배치 각각에 대하여, 동결건조 전의 10개 바이알 및 동결건조 후의 10개 바이알을 쿨터 계수에 의해 미세기포 함량 및 크기 분포에 대하여 분석하였다. 이에 따라, 동결건조 전의 함량에 대비한 동결건조 동안의 미세기포 농도의 손실을 계산하였다.
부유 속도의 계산
하기의 스토크스 방정식을 바탕으로 미세기포의 수중에서의 부유 속도 대 직경을 계산하였다:
Figure pct00001
식 중, v는 mm/분으로 나타낸 부유 속도이며, ρ는 밀도 증분 (1000 kg/m3으로 고정)이고, g는 중력 상수 (9.8 m/s2)이며, r은 미터로 나타낸 기포 반경이고, η는 점도 (1 mPas로 고정)이다.

Claims (12)

  1. 수크로스 중에서 수소화 난(egg) 포스파티딜세린에 의해 안정화된 퍼플루오로부탄 미세기포의 동결건조된 조성물을 포함하는 초음파 조영제 전구체의 제조 방법이며,
    (i) 수성 용액 중에서 수소화 난 포스파티딜세린에 의해 안정화된 상기 퍼플루오로부탄 미세기포의 수성 현탁액을 제공하는 단계;
    (ii) 상기 미세기포의 크기를 2 내지 5 ㎛ 범위의 중앙 크기로 조정하는 단계;
    (iii) 5-20 % w/v의 최종 수크로스 농도를 얻도록 단계 (ii)로부터의 크기-조정된 현탁액을 멸균 수크로스 수성 용액으로 희석하는 단계;
    (iv) 단계 (iii)으로부터의 조성물의 분취량을 바이알에 분배하여 충전된 바이알을 제공하는 단계;
    (v) 단계 (iv)의 분배가 완료된 후 5분 미만의 유보 시간 기간 이내에, 상기 충전된 각 바이알을 -40℃ 내지 -70℃의 온도로 냉각시키는 단계;
    (vi) 원하는 수의 냉각된 충전된 바이알이 얻어질 때까지 필요한 만큼 단계 (iv) 및 (v)를 반복하는 단계;
    (vii) 단계 (v) 및 (vi)으로부터의 냉각된 충전된 바이알을 냉동-건조시키는 단계;
    (viii) 단계 (vii)로부터의 냉동-건조된 바이알의 헤드공간 기체를 퍼플루오로부탄으로 재충전하는 단계;
    (ix) 단계 (viii)로부터의 바이알을 마개로 밀봉하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 동결건조된 전구체 조성물이 멸균된 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (iii)의 수크로스 농도가 8-12 % w/v인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)의 크기 조정을
    (a) 1회 이상 주기의 부유 및 재-현탁; 또는
    (b) 분별 원심분리; 또는
    (c) 이들의 조합
    에 의해 수행하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii) 후, 분배 단계 (iv)로 진행하기 전에 크기 분포 및 미세기포 농도를 검사하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iv)에서, 다수의 바이알에 병행 분배하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (v)에서, 다수의 충전된 바이알을 병행 냉각시키는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (v)의 유보 시간 기간이 3분 미만인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (v)의 유보 시간 기간이 각 충전된 바이알에 대하여 동일한 것인 방법.
  10. 멸균 수성 매체 중에서 수소화 난 포스파티딜세린에 의해 안정화된 퍼플루오로부탄 미세기포의 현탁액을 포함하는 초음파 조영제 제조용 키트의 제조 방법이며,
    (i) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하여, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조영제 전구체를 함유하는 바이알을 제공하는 단계; 및
    (ii) 단계 (i)로부터의 상기 전구체 바이알을 재구성하여 상기 조영제를 제공하기에 적합한 멸균 수성 용액의 용기를 제공하는 단계
    를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 멸균 수성 용액이 100 μM 미만 총 농도의 유리 알루미늄, 바륨, 마그네슘, 칼슘 및 아연 이온을 함유하는 주사용수인 방법.
  12. 멸균 수성 매체 중에서 수소화 난 포스파티딜세린에 의해 안정화된 퍼플루오로부탄 미세기포의 현탁액을 포함하는 초음파 조영제의 제조 방법이며,
    (i) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하여, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조영제 전구체를 함유하는 바이알을 제공하는 단계; 및
    (ii) 단계 (i)로부터의 전구체 바이알을 멸균 수성 용액을 이용해 재구성하는 단계
    를 포함하는 방법.
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