KR20160131239A - 헥사노익산 생산에 관여하는 신규 유전자, 상기 유전자로 형질전환된 미생물, 이를 이용한 헥사노익산 제조방법, 및 이를 이용한 헥산올의 제조방법 - Google Patents

헥사노익산 생산에 관여하는 신규 유전자, 상기 유전자로 형질전환된 미생물, 이를 이용한 헥사노익산 제조방법, 및 이를 이용한 헥산올의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 본 발명은 헥사노익산 생산에 관여하는 신규 유전자 및 이를 이용한 헥사노익산 및 헥산올의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로는, 아세틸-CoA를 출발 물질로 하여 헥사노익산을 생산하는 대사경로에 관여하는 효소들을 암호화하는 서열번호 1로 표시되는 유전자, 갈락티톨을 출발 물질로 하여 피루브산을 생산하는 대사경로에 관여하는 효소들을 암호화하는 서열번호 2로 표시되는 유전자, 및 상기 유전자들을 이용한 헥사노익산 및 헥산올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 갈락티톨을 영양원으로 하여 최종적으로 헥사노익산을 생산하는데 관여하는 유전자를 제공함으로써, 이를 이용하여 헥사노익산, 더 나아가 주요 바이오 연료 성분 중 하나인 헥산올을 더욱 향상된 생산 수율로 제공할 수 있다.

Description

헥사노익산 생산에 관여하는 신규 유전자, 상기 유전자로 형질전환된 미생물, 이를 이용한 헥사노익산 제조방법, 및 이를 이용한 헥산올의 제조방법 {Novel genes involved in production of hexanoic acid, microorganism transformed with the genes, method for producing hexanoic acid using the microorganism, and method for producing hexanol using the same}
본 발명은 헥사노익산 생산에 관여하는 신규 유전자 및 이를 이용한 헥사노익산 및 헥산올의 제조방법에 관한 것이다.
지구상에서 사용되는 에너지의 80%는 화석연료로부터 생산되며, 플라스틱 원료, 합성 고무, 용매, 페인트, 접착제와 같은 원료 물질들도 대부분 석유화학공정으로부터 생산되고 있다. 이에, 화석연료의 지속적 공급이 필요하나, 그 매장량의 한계로 인해서, 새로운 대체연료의 개발이 시급한 실정이다. 현재, 대체연료로서, 바이오디젤, 알코올, 바이오매스 등의 다양한 후보물질들이 거론되고 있으나, 예를 들어, 압력, 촉매, 또는 온도 조건 등을 조절하여 자연으로부터 얻어지는 바이오매스를 대체연료로 전환하는 방법도 제안되고 있지만, 생산량 및 효율성 등에서 한계를 드러내고 있다.
바이오매스 중에 포함되어 있는 탄수화물은 알코올, 카르복실산, 에테르, 에스테르 등과 같은 다양한 바이오연료 및 바이오화학원료로 변화될 수 있는 바, 특히 당류 물질들은 미생물, 효소 또는 화학반응에 의해서 알코올 및 C3-C6 카르복실산을 포함하는 중요한 기초 화학물질들로 변환될 수 있다. 재생가능한 식물성 원료 물질들에서 유래한 바이오연료로서 에탄올을 생산하여 이용하는 연구는 많은 부분 진행이 되었지만, C6 물질인 헥산올 등을 생산하는 연구는 아직도 초보적인 단계에 머무르고 있다.
관련하여, 대한민국 공개특허공보 제10-2014-0026207호에서는 시토크롬 p450 단일산화제의 활성이 강화된 헥산올 생산용 미생물 균주로서, 기탁번호 KACC 93152B호의 미생물을 개시하고 있으며, 베타-케토헥사노일-CoA (β-ketohexanoyl-CoA)를 산화시키는 과정을 통해서 헥산올을 생성하는 기능을 담당하는 시토크롬 p450 단일산화제를 코딩하는 염기서열을 재조합기술을 통해서 소정 균주에 도입한 재조합 균주를 개시하고 있다.
또한, 헥산올 제조의 원료가 되는 n-헥사노익산을 생성하는 대표적인 미생물로서, 클로스트리듐 클루이베리 (Clostridium kluyverii) (H. A. Barker and S. M. Taha, J. Bacteriol., 43, 347 (1942))가 알려져 있으며, 이에 대해서는 많은 연구가 진행된 바 있다.
그러나, 현재까지 헥사노익산을 생산하는 미생물의 대사경로에 대해서는 알려진 바가 많지 않으며, 이러한 대사경로 중 어떠한 유전자가 헥사노익산의 생성에 관여하는지에 대한 세부 정보 역시 연구된 바가 없다.
대한민국 공개특허공보 제10-2014-0026207호
H. A. Barker and S. M. Taha, J. Bacteriol., 43, 347 (1942)
따라서, 본 발명에서는 헥사노익산을 생산하는 신규 미생물로서 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스 (Caproiciproducens galactitolivorans)를 확인하고, 그 대사경로를 구축함으로써, 갈락티톨을 영양원으로 하여 최종적으로 헥사노익산을 생산하는데 관여하는 유전자 다발을 확인하고, 이를 통해서 헥사노익산 생산에 관여하는 신규 유전자, 상기 유전자로 형질전환된 미생물, 이를 이용한 헥사노익산 제조방법, 및 이를 이용한 헥산올의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서,
아세틸-CoA를 출발 물질로 하여 헥사노익산을 생산하는 대사경로에 관여하는 효소들을 암호화하는 서열번호 1로 표시되는 유전자를 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 유전자는 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스 (Caproiciproducens galactitolivorans) 균주 (기탁번호 KCCM 10991P)로부터 분리된 유전자일 수 있다.
또한, 본 발명은 갈락티톨을 출발 물질로 하여 피루브산을 생산하는 대사경로에 관여하는 효소들을 암호화하는 서열번호 2로 표시되는 유전자를 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 유전자는 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스 (Caproiciproducens galactitolivorans) 균주 (기탁번호 KCCM 10991P)로부터 분리된 유전자일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1로 표시되는 유전자 및 상기 서열번호 2로 표시되는 유전자를 포함하는 벡터에 의해서 형질전환된 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 갈락티톨을 포함하는 탄소원 배지 중에서 상기 미생물 균주를 배양하여 헥사노익산을 생산하는 단계를 포함하는 헥사노익산의 제조방법을 제공한다.
더 나아가, 본 발명은,
a) 갈락티톨을 포함하는 탄소원 배지 중에서 상기 미생물 균주를 배양하여 헥사노익산을 생산하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 생산물로부터 상기 헥사노익산을 분리하는 단계;
c) 상기 b) 단계로부터 분리된 헥사노익산에 동일한 몰 수의 헥산올을 첨가하여 혼합액을 제조하는 단계;
d) 상기 c) 단계의 혼합액에 대해서 촉매 반응을 수행하여 C12 화합물을 제조하는 단계; 및
e) 상기 d) 단계로부터 제조된 C12 화합물을 수소 기체와 반응시킴으로써 헥산올을 생산하는 단계
를 포함하는 헥산올의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 b) 단계의 분리는 이온교환수지를 사용하여 수행되거나, 또는 물과 섞이지 않는 유기 용매를 사용하여 상기 헥사노익산을 배양액으로부터 추출해 냄으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 d) 단계의 촉매 반응은 제올라이트 (Zeolite), 헤테로폴리산 (heteropoly acids), 실리카-알루미나 (silica-alumina), 나피온 수지 (Nafion-H, 파라톨루엔설폰산 (p-toluenesulfonic acid), SO42-/ZrO2 또는 SO42 -/TiO2-La2O3의 초강산 촉매를 첨가하여 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 d) 단계의 촉매 반응은 에스테라아제를 첨가하여 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 e) 단계의 수소 기체는 상기 a) 단계로부터 생성된 수소 기체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 a) 단계의 탄소원은 바이오매스 또는 유기성 폐자원을 물리적으로 분쇄, 세척 및 가수분해하여 제조한 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, 갈락티톨을 영양원으로 하여 최종적으로 헥사노익산을 생산하는데 관여하는 유전자를 제공함으로써, 이를 이용하여 헥사노익산, 더 나아가 주요 바이오 연료 성분 중 하나인 헥산올을 더욱 향상된 생산 수율로 제공할 수 있다.
도 1은 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스에서 갈락티톨이 대사되는 대사 경로를 도시한 도면이다.
도 2는 갈락티톨로부터 피루브산을 생성하는 대사 과정에 관여하는 오페론을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3은 아세틸-CoA로부터 헥사노익산을 생성하는 대사 과정에 관여하는 유전자 클러스터를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 4는 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스의 전체 유전자 지도를 도시한 도면이다.
도 5는 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스가 보유한 한 개의 플라스미드의 유전자 지도를 도시한 도면이다.
도 6은 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스의 배양 시간에 따른 배양액의 O.D. 수치 변화, 배양액 중 헥사노익산 함량 및 부산물로서 부티르산 함량 변화를 도시한 그래프이다.
이하, 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명에서는, 갈락티톨을 출발 물질로 하여 최종적으로 헥사노익산을 생성하는데 관여하는 신규 유전자 다발을 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스 (Caproiciproducens galactitolivorans) 균주로부터 성공적으로 분리해내었다.
도 1에는 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스에서 갈락티톨이 대사되는 대사 경로를 도시하였다. 도 1을 참조하면, 갈락티톨은 일련의 효소들이 관여하는 대사 과정에 의해서 피루브산으로 전환되며, 생성된 피루브산은 피루브산을 아세틸-CoA로 또는 아세틸-CoA를 피루브산으로 상호 변환시키는데 관여하는 피루브산 생성효소 (pyruvate synthase 또는 pyruvate ferredoxin oxidoreductase)에 의해서 아세틸-CoA로 변환된다.
본 발명에서는, 갈락티톨로부터 피루브산의 생성까지의 일련의 과정에 관여하는 단백질 효소들을 암호화하는 신규 유전자 (서열번호 2)를 제공하며, 상기 유전자를 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스 (Caproiciproducens galactitolivorans) 균주로부터 성공적으로 분리해내었다. 특히, 상기 서열번호 2의 유전자는 특정 프로모터 및 오퍼레이터의 조절을 받는 오페론 구조를 이룬다. 참고로, 도 2에는 갈락티톨로부터 피루브산을 생성하는 대사 과정에 관여하는 오페론을 개략적으로 도시하였다.
이어서, 생성된 아세틸-CoA는 다시 일련의 효소들이 관여하는 대사 과정에 의해서 최종적으로 헥사노익산으로 전환된다.
따라서, 본 발명에서는 또한, 아세틸-CoA로부터 헥사노익산의 생성까지의 일련의 과정에 관여하는 단백질 효소들을 암호화하는 또 다른 신규 유전자 (서열번호 1)를 제공하며, 이러한 유전자 역시 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스 (Caproiciproducens galactitolivorans) 균주로부터 성공적으로 분리해내었다. 특히, 상기 서열번호 1의 유전자는 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스의 전체 유전자 서열에서 소정 위치에 밀집해 있는 유전자 클러스터를 형성한다. 도 3에는 아세틸-CoA로부터 헥사노익산을 생성하는 대사 과정에 관여하는 유전자 클러스터를 개략적으로 도시하였으며, 이러한 유전자 클러스터에 의해서, 전술한 대사 경로에 관여하는 효소들 중, 아세틸 CoA 아세틸 트랜스퍼라아제, CRT (3 히드록시 데히드라타아제), HBD (3 히드록시 데히드로게나아제), ACDH (아실 CoA 데히드로게나아제), ETF AB (전자 수송 플라보단백질; Electron transfer flavoproteins), 및 ACT (아세틸 CoA 트랜스퍼라아제)가 암호화된다.
또한, 본 발명에서는 전술한 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 유전자들을 포함하는 벡터를 이용하여 형질전환된 미생물을 제공하며, 탄소원 배지 중에서 이와 같이 형질전환된 미생물을 배양하여 헥사노익산을 생산하는 단계를 포함하는 헥사노익산의 제조방법을 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 상기 형질전환된 미생물을 이용하여 최종적으로 헥산올을 제조하는 방법을 제공하며, 본 발명에 따른 방법은,
a) 갈락티톨을 포함하는 탄소원 배지 중에서 상기 미생물 균주를 배양하여 헥사노익산을 생산하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 생산물로부터 상기 헥사노익산을 분리하는 단계;
c) 상기 b) 단계로부터 분리된 헥사노익산에 동일한 몰 수의 헥산올을 첨가하여 혼합액을 제조하는 단계;
d) 상기 c) 단계의 혼합액에 대해서 촉매 반응을 수행하여 C12 화합물을 제조하는 단계; 및
e) 상기 d) 단계로부터 제조된 C12 화합물을 수소 기체와 반응시킴으로써 헥산올을 생산하는 단계를 포함한다.
상기 균주 배양에 필요한 탄소원은 바이오매스 또는 유기성 폐자원을 물리적으로 분쇄, 세척 및 가수분해하는 등의 전처리 과정을 거쳐서 제조한 것을 사용할 수 있는데, 유기성 폐기물을 전처리함으로써 유기 성분이 용해되는 효율을 극대화하고, 혐기성 발효에 의한 생물학적 수소 생산 시간을 최소화할 수 있으며, 그 효율 역시 증가시킬 수 있게 된다. 따라서, 바이오매스 또는 유기성 폐자원을 물리적으로 분쇄함으로써 미생물이 기질로 사용하기에 적당한 크기로 만들고, 세척 과정을 통해서 염소 이온 등과 같이 미생물에 독성을 나타내는 성분을 제거하며, 호기성 미생물 등을 사용하여 가수분해 과정을 거침으로써 유기 성분의 용해도를 향상시킬 필요성이 있다.
이어서, 생산된 헥사노익산만을 분리하는 단계를 수행하여야 하는 바, 상기 b) 단계의 분리는 이온교환수지를 사용하여 수행되거나, 또는 물과 섞이지 않는 유기 용매를 사용하여 상기 헥사노익산을 배양액으로부터 추출해 냄으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 이온교환수지를 사용하여 유기산들을 분리해내는 경우, 헥사노익산은 배양액 중에서 음전하를 나타내므로, 음이온 교환수지를 사용하면 배양액 중에서 헥사노익산 만을 선택적으로 흡착시킬 수 있다. 또한, 흡착된 헥사노익산은 알칼리 용액, 산성 용액 및 에탄올 등을 사용하여 음이온 교환수지로부터 탈착시킬 수 있다. 또한, 추출용 유기 용매를 사용하여 헥사노익산을 배양액으로부터 추출해 내는 경우에는, 부틸 부티레이트, 도데칸올, 올레일 알코올 등과 같은 유기 용매를 배양액과 혼합한 다음, 교반해주며 추출할 수 있으며, 배양액으로부터 추출된 헥사노익산을 함유하고 있는 유기용매와 헥사노익산이 추출된 배양액을 유수분리기 등을 사용하여 분리하고, 분리된 헥사노익산 함유 유기용매에 대해서 추가 화학반응을 수행함으로써 헥사노익산을 분리해낼 수 있게 된다.
다음 단계로는, 생산된 헥사노익산에 대해서 에스테르화 반응을 수행함으로써 헥실헥사노에이트를 제조할 수 있게 된다. 예를 들어, 산촉매 및 에스테르화 효소를 사용한 에스테르화 반응에 의해서 헥사노익산으로부터 C12 화합물인 헥실헥사노에이트를 제조하는 반응을 하기 반응식 1 내지 4에 나타내었다.
<반응식 1>
Figure pat00001
상기 반응식 1에 관여하는 화학 촉매 및 효소로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 제올라이트 (Zeolite), 헤테로폴리산 (heteropoly acids), 실리카-알루미나 (silica-alumina), 나피온 수지 (Nafion-H, 파라톨루엔설폰산 (p-toluenesulfonic acid), SO42 -/ZrO2 또는 SO42 -/TiO2-La2O3와 같은 초강산 화학 촉매, 또는 에스테라아제와 같은 효소를 예로 들 수 있다. 특히, 에스테라아제 효소를 사용하는 경우에는, 이를 나노화이버, 카라기나, 젤라틴 또는 비드 등과 같은 담체에 고정시킬 경우, 용이한 효소의 회수가 가능하여 경제적인 재사용이 가능하다.
이어서, 상기와 같이 생성된 C12 에스테르 화합물에 대해서 수소화 반응을 수행하게 되면 헥산올을 제조할 수 있게 된다. 예를 들어, 하기 반응식 2에는 전술한 반응식 1에 의해서 생성된 헥실헥사노에이트의 수소화 반응에 의해서 헥산올이 생성되는 반응을 나타내었다.
<반응식 2>
Figure pat00002
이때, 상기 반응에 소요되는 수소 기체는, 상기 a) 단계의 균주 배양에 의해서, 상기 헥사노익산과 더불어 생산된 수소 기체일 수 있다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1. 균주 선별
종균으로 사용한 슬러지는 중랑 하수처리장으로부터 채취하였다. 슬러지를 100 ℃에서 30 분 동안 열처리하여 포자 형성균을 제외한 미생물을 사멸시킨 후, 선택배지 양의 5 % (v/v)가 되게 배지에 접종하고, 37 ℃ 온도에서 150 rpm의 교반 속도로 2 주일 동안 배양하였다. 배양과정에서 초산 (acetic acid, C2), 프로피오닉산 (propionic acid, C3), 부티르산 (butyric acid, C4), 펜타노익산 (pentanoic acid, C5), 헥사노익산 (hexanoic acid, C6) 등의 유기산과 수소가 생성되었다. 생성된 유기산 중에서 헥사노익산을 최대로 생성하는 미생물을 수차례 계대배양하여 단일 콜로니를 획득하고, 이를 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스 (Caproiciproducens galactitolivorans)으로 명명하였다. 해당 균주를 한국미생물보존센터에 기탁하였다 (기탁번호 KCCM 10991P).
실시예 2. 유전체 분석
유전체 분석은 마크로젠 (대한민국)에 의뢰하여 유전자 정보 파일을 입수한 후, VIM 에디터 (http://www.vim.org)와 벡터엔티아이 프로그램 (https://www.lifetechnologies.com/kr/ko/home/life-science/cloning/vector-nti-software.html) 및 아르테미스 (https://www.sanger.ac.uk/resources/software/artemis) 프로그램을 사용하여 유전자 정보를 확인하였으며, 확인된 모든 유전자 정보에서 E.C. number를 추출하여 KEGG Mapper (http://www.genome.jp/kegg/mapper.html)에 업로드함으로써 경로를 그렸다. 경로가 맵핑된 자료를 이용하여 다시 벡터엔티아이 프로그램에 삽입하여 플라스미드 및 유기산 생산 클러스터를 작성하였다.
도 4에는 상기 과정에 의해서 얻어진 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스의 전체 유전자 지도를 도시하였다. 유전체 분석 결과, 총 2516개의 암호화 서열, 62개의 tRNA 서열 및 12개의 rRNA 서열이 검색되었으며, 도 4에는 도시된 원의 최외곽으로부터 안쪽으로, 정방향 암호화 서열 (최외곽 청색), 역방향 암호화 서열 (최외곽으로부터 두 번째 청색), tRNA (최외곽으로부터 세 번째 적색) 및 rRNA (최외곽으로부터 네 번째 하늘색)가 도시되어 있고, 가장 안쪽 두 개의 동심원은 외부로부터 GC 함량 및 GC skew를 나타낸다. 도 4로부터, GC skew가 급격히 변화되는 지점이 복제 기점임을 유추할 수 있다.
도 5는 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스가 보유한 한 개의 플라스미드 지도를 나타낸다. 이러한 플라스미드에는 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스 균의 세포 분열과 관련된 유전자들인 Fts Z, W, L 가 포함되어 있으며, 포자 형성과 연관된 Spo VD가 함께 포함되어 있다. 또한, HtpG와 같은 스트레스 반응 유전자들도 포함되어 있다. 이러한 플라스미드의 역할은 스트레스를 받았을 때 플라스미드 안에 포함된 유전자들이 작동하여 세포 분열 또는 포자를 형성하게 하는 기능을 한다.
실시예 3. 본 발명에 따른 유전자를 보유한 미생물의 배양액에서 헥사노익산의 생성 확인
카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스으로부터 헥사노익산을 생산하기 위한 최적 배지 조건으로는, 풍부한 복합 질소원이 요구되었으며, 동시에 낮은 산화환원 포텐셜이 요구되었다. 복합 질소원으로는 비프 추출물, 효모 추출물, 트립톤, 펩톤 등이 사용되었으며, 산화환원 포텐셜을 낮게 유지하기 위해서는 환원제인 Na2S 5H2O~9H2O 또는 Cystein HCl를 첨가하였다. 환원제인 Na2S 5H2O~9H2O 또는 씨스테인 HCl의 농도를 0.5 g/L 이상으로 배지에 첨가하면 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스에 독성이 나타나므로 0.5 g/L 이상 첨가하지 않았으며, 각 환원제들이 독성을 나타내지 않는 범위에서 두 가지 환원제를 혼합 사용함으로써 환원력을 증가시켰다. 씨스테인-HCl을 배지에 첨가하였을 때, 일반적으로 약 -100 mV의 산화환원 포텐셜을 얻을 수 있었으며, Na2S 5H2O~9H2O를 첨가하였을 때는 약 -500 mV의 산화환원 포텐셜을 얻을 수 있었다.
카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스을 헥사노익산 생산배지 (조성: 염 용액 1 리터 당, 효모 추출물 15.5 g, 트립톤 10 g, FeSO4·7H2O 0.04 g, 소듐 아세테이트 0.85 g 및 소듐 부티레이트 6.5 g을 포함하고, 갈락티톨은 200 g 포함)에서 초기 pH 7.2에서 40 ℃의 온도로 설정된 진탕 배양기에서 120 rpm으로 배양하였다.
전술한 배양액에 포함된 헥사노익산을 올레일 알코올과 알라민 336 (9:1)의 혼합액인 추출용매를 사용하여 추출하였으며, 도 6에는 배양 시간에 따른 배양액의 O.D. 수치 변화, 배양액 중 헥사노익산 함량 및 부산물로서 부티르산 함량 변화를 도시하였다. 도 6을 참조하면 배양 약 12일 경과 후, 배양액 중 헥사노익산이 90 g/L의 높은 함량으로 포함됨을 알 수 있다.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM10991P
수탁일자 : 20090216
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Novel genes involved in production of hexanoic acid, microorganism transformed with the genes, method for producing hexanoic acid using the microorganism, and method for producing hexanol using the same <130> JKP-0052 <160> 2 <170> KoPatentIn <210> 1 <211> 9770 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Caproiciproducens galactitolivorans <220> <221> gene <222> (1)..(9770) <223> genes for production of hexanoic acid <400> 1 atgtcaagaa aagtcgtatt ggcaggtgcc tgccgaacag caattggtaa aatgggtggt 60 gcgttatcga atgttcccac accgactctt ggtacaattg ttattaaaga agcaatgaaa 120 cgcgcaaaca ttaagcctga gcaggttgat gaagttatca tgggctgcgt ttaccaggct 180 ggacttggac agaacgttgc gcgccagtcg gctgtttttg ctggtattcc ggtaagtgtt 240 cctgctttca ccttaaataa cctttgcggt tccgcattga agagcgttaa cgttgctgcg 300 gctttagttg aagccggtga agcggatatc attattgccg gcggtatgga aaacatgtcc 360 ggcgctccgt atcttcttaa aaaagcccgt ttcggttatc gcatgaataa cggcgagctg 420 cttgactcca 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agatgcaccc ataaatccgt tgatagcaaa attaacatta 9720 tttggtacca aattagcggc ttcccgagcg gttaagattt ttactgccat 9770 <210> 2 <211> 10182 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Caproiciproducens galactitolivorans <220> <221> gene <222> (1)..(10182) <223> genes for production of pyruvate <400> 2 atgaattatc ttagaataga tataggcaaa aacaaccatg tagccagcat gataggcgag 60 gacgggaaac cggtgttccg cgctttttcc ttttcgaacg ccacggaagg cgcggagagc 120 ctgtttgcaa agctggaggc ccacaacgtc cataaggacg agcttgagat tggtctggaa 180 gcgaccggtc attactggct gccggtatat tcataccttc atgacaaggg ctgcaaaatc 240 catgtaatca accccatcca gacgggcgga tggcgcaagg gcgtagagat caggaaacgc 300 aaaaccgacg tcataggctc gatgctgatc gccgagtttg tgcgctacgg cgatttcatt 360 gaggcgcggt tgccggaaga ggctattttt tcgctcaaga acctgacgag attccgtagc 420 tacctggttg attccatcgg agatcttaag cgcaaggtta tctgcgtgct tgatcaggta 480 tttccggaat atcaaagcgt ttttgtcgat gttttcggaa aaacctcaaa ggaaatcctg 540 cttcagtttg gcagccctgc ggaattggag gaggtttccg ccgaaacact cgccgagctg 600 ctggctgatc 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ctccctgcgg aaggcttcct gaaagcaccg tcacgctgca 1500 aaggggcagg tactttttat agcgctccag aaatgcctgc tgttcggccc cggaaacttt 1560 tgcgccaggt tccagaaact ccgtgtgctt tcccgtcgca aggtcaacca cattgatgca 1620 ggaccgtgtt tcgccttcaa tttttacaaa gtcggatgca attccatcct tttcgagcaa 1680 cgattgaatg tattctccgg aaaagccgcc gagaaaaccg gtcgccagca ctttttcgcc 1740 gaaagcggcg gctacgcggg aaacgttcag cccttttcca cccgctgtag gaatggcctg 1800 ccgaacgcgc attacggaat tcagttttac ctcgtcgacc atatacatct tgtcgaccga 1860 ggcgtttaac gtaactgtca gaatcatgtt ttactcctga taatacgggt tcagtcttcg 1920 ttgatcagca tgatcttccc tttgacttcg cctggaattt taaaaagctt gaacgcctgt 1980 gcggcttcgc tcatcgggaa acgcttgtag atcagcttcg ggtcgtattt cagtttgcca 2040 ttgctgaagc attctgccgc tatgatccat tcatcccctg ggaacggcgc gctgtagctc 2100 atccaggaac cggtcagacg gaattccttg cggttcatca gctcgaattt gcgccaaggg 2160 aataaaatgt ctatgctgga tgtgccaata aagcaaacac tcgctttgtt ggaggcaata 2220 tcgaacgcga tgttcatggt ggcgttctgc ccggccgttt caaagacaaa cgggaagccc 2280 ttgccgccgg tcatttccct gatctgttcc ataaaatctt gatcattagt attaatcacc 2340 acatctgccc cgaggttttt cgcaagcgcg agccttgaat cgctgatatc gaaaacgaca 2400 gccctgcgcg caccaaaaat ttttgcccat tgcatggtga acaatccaac cgtaccgccg 2460 cccagaattg cgacgtcttt cccaccgtgg aacccggcgc attttacgcc gtgcagtccg 2520 actgtggcgg gttcaaaaaa cgcgccttcc tcaaaaggaa cggaggcgtc aaatttgacg 2580 acattccttg caggcacctt cacaaagtcc gcgaagctgc cgaacaggct tgaaccgata 2640 aatttatagt gcttgcatag ggaaaaattc cctttttggc aatcgtcaca tttcatgcat 2700 ggaaccagcg gggcggcagt aacatgttcg ccgactttga tattttccac accttttcca 2760 acttctgaaa caataccgga aaattcatgt cccagcacga tggggtaata gtgcgccgca 2820 cacgcgttta cacgcggaat atcggaacca cagattcccg ttgccttcac atggataatc 2880 acttcgcctt ccccggcttt cggggtttca atcttttcat aacgaagatc ttcctgatta 2940 tgtaaaacag ccgctttcat gattgcagta tctcctttgc tttcttaaac ttttccatcg 3000 cagccacaga tcttcatgcg ttccatgacc tgcttcttga cggcctcacg cgcctttgct 3060 ccgtattttt tagggtcaaa cacggcgggg ttctggtgca gatactcttt tacggcatcg 3120 ctgaacgcaa tgcgcagctc cgtcgcaaaa ttcaccttgc agatgccgca actcacgcag 3180 tttcgtatat ctttgtccgt caggccggag gcgccgtgca gcaccatcgg aacggcgagg 3240 actttacgca gttcggcaat cagctctaca ttcagaactg gcttcgtttg gtaaatcccg 3300 tgcgccgtac cgaccccgac ggccagggag gaaacgccgg tttccgcaac aaagcgtacg 3360 gcttgctccg gatcggtata gttgacaccg gagccttcgg tatcgtcttc ctttccgcca 3420 accttaccga gttcgccttc cacagggacc ccacaggggg cgcaggcaga aacgacgtat 3480 tttgtaatcg cgatattttt ctcaagaacc tcttgggaac cgtcgatcat aatggacgtg 3540 taaccagcac gcagtgcctg aacggcaagt tcatagctgt tgccgtgatc aaggtgaatg 3600 gcgacaggga cagaggcatt cttcgcagcc gcgcttacgt ttgcgtaata aaggtcgaca 3660 ccggcgtact ttatcgtacc gggggttgtc tgaatcatga ccggtgcgcg aagctcttca 3720 gcggcggcaa taatcgcctg taccatttcc atattttccg cattgaacgc accgacagca 3780 tagccgcctt tctgtgcgtc aaggagcatt tgtttcgatg ttgttagtgg cataaatcat 3840 ttcctttctt ttaaaagcct gcgaacctct ttcggggaaa cacaccggca aacgcgctcg 3900 gaaaacgact gcgcctcgtc gcggcggctg gcgcggatga gatagcggat ttcgggaatc 3960 cgcgaaggcg acatgctgaa ttcgtccagt ccaaagccca gcagcaaggg aacggcatcc 4020 gcatttcctg cgaattcccc gcacatgcca accggaatgc cgtgacgatg ccccgcctct 4080 atgacgcttc ggatgcttcg gatgacagca gggtgaaagg aatcatacag ctgtgccgtt 4140 ttcttattcc cgcggtctac tgcaagcatg tactgtgtaa ggtcgtttgt gccgatgctg 4200 aaaaaatcgg cataatgagc cagatcgtca gcgcagagca cggcggcggg cgtttccacc 4260 atgattccgg ttttgatgtc tggatcaaag gcaatgccac ggcgggtaag ttccgcttta 4320 cattccgaga gaacggcgtt tgcttcctcc aactcgccaa ccgaaataat catcggatac 4380 ataatgctga tttttccaaa cgcgctggca cgcaggatgg caagaagctg tgttcgaaaa 4440 atatctcttt gctccagtaa gatacggatg gcccgccagc cgagaaaggg gttttcttct 4500 gtttccatct ggaaataagg tagggcttta tccccaccga tgtcgagggt gcggataatc 4560 acttcgcctc cgcacagttc ggcggcgcat ttgtacgcaa cgaactgttc ttcttccgtg 4620 gggagatggt cgctttccat atagagaaat tcgctgcgta gcaggccgat gccctcggcg 4680 ccttcggccg ttgctttctt tatatcctcg agattccccg cgtttgcgta taggcggacc 4740 ctgaagccgt ctgccgtttc cgggggaagg tcgtttgttt gcttcagcat ttcaagacgc 4800 tgccggtact ctttttcccg 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gttcaacggt agttccctgt ttaattgcca tactcagaag 5700 attaataatg ctcgcgcaat ccgctttgcc ggtgtctgta attaggaaca ccttgctttt 5760 gaattttttc aggaatttgc agaactggga ggccggcctg gcgtgcaggc cggttggatt 5820 gctaattgtt actttttgtg aaaccataca ggacttctct ccttaaaccg taaatgctga 5880 gatataacct ctctttttta attctgcgaa tccgcttctt tcttcgcgtt cattttcttg 5940 cggtactgaa catatgtaaa agcgatgcag aaaatataca gggctccgat cgcgatcaga 6000 ccgggaacgt tcgtggtgtg gaaagcttgg gttaagatgt aggttatcgg gcagccgcct 6060 tggtccagag cgacaatttc agagctcttg ttcagcagat tggaatttgc cgctttggca 6120 agggcagtcg tgagcgggat gacctgattg gcgatccaga tggtaataaa catgataatc 6180 gagccggaaa tcaaggtgcg gaacagattt cccttatgga ttccgaccgc aatggcaatg 6240 aagaacccga tggttgcaag gtctccaaac ggaaggattc ggttgcccgg aacgatcata 6300 gcgattagaa tagtgagagg gacaaacagc aaccctgcgg aaacaacctg tgagtcaccc 6360 agcaggatgg ccgggtcaag cccaatgtag aattttgctc cgtgaaagcg ttttgccatc 6420 ttttcttttg caacttcaga aatcggcatt aagccttcca taatgcactt aaccatcttg 6480 ggcatcagaa ccatgacggc 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ccattcggag caggttcaca agattgaaaa aagccttcaa 8220 atggctgtca gaatccacgg cgcttaggca gcagacaaac tcaacggggt caaattcctc 8280 gttgccaaac ggaacagggt gcttcagccg caaaaggctc attcccattt tttgactgcc 8340 gttaccaagc ccagcatgcg gaacggcaaa acccggcgaa aggacaaaat acgaaccgtt 8400 ctctctcata ttctgaaaga tcgcttcaat gtactgcggc aggatatatc cctgctttag 8460 caaaatgtcc gccgattgcc ggattgcttc gtcgctgcaa cagcactcga cgtcaagccg 8520 gatcttatcc ggagagagaa gctggcaaag cattgctgtc ccatgctccg tacgttctcc 8580 aaagtattcg gcggccgctt ttcggacccg caggataatc gcttcggtag cgtcctcctg 8640 tggaatcagt tccgaaagta tgggttgaag ctttttcatc agcccctccg aagtaagtcg 8700 cttctcagga aggtcggttg tccttgcggg atgcttggaa tctaaatatc tgcagatttt 8760 caggtaatcc ccgtcatcca ggaagggact gacctgaata taatcaatgc cgcagttttt 8820 aacgggcacc gtggagatga taaagtcaat accggcatcc ttcaatgtat ctgcattgtg 8880 ggctgccact accgcggcaa tgtcaaaact gaaacgcttc tgcaagcgtt cgaccagcag 8940 ttcggaggtt ccaacacctc ctccgcaggc tacggcaatt ctcgcccttt tccggcttcc 9000 ccgttttctt tctatggctg 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Claims (12)

  1. 아세틸-CoA를 출발 물질로 하여 헥사노익산을 생산하는 대사경로에 관여하는 효소들을 암호화하는 서열번호 1로 표시되는 유전자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스 (Caproiciproducens galactitolivorans) 균주 (기탁번호 KCCM 10991P)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 유전자.
  3. 갈락티톨을 출발 물질로 하여 피루브산을 생산하는 대사경로에 관여하는 효소들을 암호화하는 서열번호 2로 표시되는 유전자.
  4. 제3항에 있어서, 상기 유전자는 카프로이시프로두센스 갈락티토리보란스 (Caproiciproducens galactitolivorans) 균주 (기탁번호 KCCM 10991P)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 유전자.
  5. 서열번호 1로 표시되는 유전자 및 서열번호 2로 표시되는 유전자를 포함하는 벡터에 의해서 형질전환된 미생물.
  6. 갈락티톨을 포함하는 탄소원 배지 중에서 제5항에 따른 미생물 균주를 배양하여 헥사노익산을 생산하는 단계를 포함하는 헥사노익산의 제조방법.
  7. a) 갈락티톨을 포함하는 탄소원 배지 중에서 제5항에 따른 미생물 균주를 배양하여 헥사노익산을 생산하는 단계;
    b) 상기 a) 단계의 생산물로부터 상기 헥사노익산을 분리하는 단계;
    c) 상기 b) 단계로부터 분리된 헥사노익산에 동일한 몰 수의 헥산올을 첨가하여 혼합액을 제조하는 단계;
    d) 상기 c) 단계의 혼합액에 대해서 촉매 반응을 수행하여 C12 화합물을 제조하는 단계; 및
    e) 상기 d) 단계로부터 제조된 C12 화합물을 수소 기체와 반응시킴으로써 헥산올을 생산하는 단계
    를 포함하는 헥산올의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 b) 단계의 분리는 이온교환수지를 사용하여 수행되거나, 또는 물과 섞이지 않는 유기 용매를 사용하여 상기 헥사노익산을 배양액으로부터 추출해 냄으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 헥산올의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 d) 단계의 촉매 반응은 제올라이트 (Zeolite), 헤테로폴리산 (heteropoly acids), 실리카-알루미나 (silica-alumina), 나피온 수지 (Nafion-H, 파라톨루엔설폰산 (p-toluenesulfonic acid), SO42 -/ZrO2 또는 SO42 -/TiO2-La2O3의 초강산 촉매를 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 헥산올의 제조방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 d) 단계의 촉매 반응은 에스테라아제를 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 헥산올의 제조방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 e) 단계의 수소 기체는 상기 a) 단계로부터 생성된 수소 기체인 것을 특징으로 하는 헥산올의 제조방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 a) 단계의 탄소원은 바이오매스 또는 유기성 폐자원을 물리적으로 분쇄, 세척 및 가수분해하여 제조한 것임을 특징으로 하는 헥산올의 제조방법.
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