KR20160117791A

KR20160117791A - 진세노사이드 글리코시다제를 이용한 지페노사이드 lxxv 생산 방법

Info

Publication number: KR20160117791A
Application number: KR1020150045243A
Authority: KR
Inventors: 임완택; 최창호; 김선창
Original assignee: 재단법인 지능형 바이오 시스템 설계 및 합성 연구단
Priority date: 2015-03-31
Filing date: 2015-03-31
Publication date: 2016-10-11
Also published as: KR101781259B1

Abstract

본 발명은 진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase) 단백질을 이용하여 지페노사이드 XVII로부터 지페노사이드 LXXV를 제조하는 방법에 관한 것이다. 희귀 사포닌인 지페노사이드 LXXV를 용이하게 수득함으로써 지페노사이드 LXXV를 산업상 널리 활용할 수 있을 것이다.

Description

진세노사이드 글리코시다제를 이용한 지페노사이드 LXXV 생산 방법{A method for production of gypenoside LXXV using ginsenoside glycosidase}

본 발명은 진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 지페노사이드 XVII에 처리하는 단계를 포함하는, 지페노사이드 LXXV(gypenoside LXXV)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 지페노사이드(gypenoside) XVII의 지페노사이드 LXXV로의 전환용 조성물에 관한 것이다.

사포닌은 식물계에 널리 존재하는 배당체의 당이 아닌 부분이 여러 고리화합물로 이루어진 물질을 의미한다. 인삼 또는 홍삼에 주요 생리활성 성분으로 포함된 트리테르펜 사포닌(triterpene saponin)은 사포닌 성분으로서, 타 식물에서 발견된 사포닌과는 화학 구조가 상이하므로, 이러한 인삼 사포닌을 타 식물계 사포닌과 구별하기 위해서 인삼(Ginseng) 배당체(Glycoside)란 의미로 진세노사이드 (Ginsenoside)라고 부른다.

진세노사이드는 아글리콘(aglycone)의 구조에 따라 프로토파낙사이다이올계(Protopanaxadiol-type, PPD 타입) 진세노사이드, 프로토파낙사트라이올계 (Protopanaxatriol-type, PPT 타입) 진세노사이드 및 올레아놀린산계(Oleanolic acid 타입) 진세노사이드의 세 가지로 분류될 수 있다. 이러한 세 그룹은 다시, 화합물 구조 중 고리의 3번 탄소, 6번 탄소 및 20번 탄소 위치에 글리코시딕 결합 (glycosicid bond)에 의해 부착되는 당 부위(아글리콘)(sugar moieties (aglycones))의 위치 및 수에 따라 분류된다. 올레아놀린산계 진세노사이드의 기본골격은 5환상이고, 여기에는 유일하게 진세노사이드 Ro가 있고, 그 아글리콘은 올레아놀릭산(oleanolic acid)이다. 현재, 40여종 이상의 진세노사이드들이 분리되었다.

지페노사이드(gypenoside;gyp)는 트리테르펜 사포닌 계열 화합물이다. 돌외에서 분리되는 지페노사이드는 100여종에 이르며, 방향성분인 필로두신(phyllodulcin)과 플라보노이드, 카르틴 등을 함유하고 있다. 주요 생리활성으로는 항산화 작용 및 혈관내피세포 보호 작용, 심혈관 기능 개선 작용등이 있으며, 최근의 연구에 따르면, 지페노사이드는 T-세포를 활성화시키고, 신경보호작용(neuroprotective)을 하는 등, 면역 조절과 항산화 작용을 하는 것으로 알려졌다. 특히, 지페노사이드는 그 동안 인삼에만 함유된 것으로 알려진 진세노사이드와 구조와 생리활성 작용이 거의 유사하며 함량 또한 인삼보다 2-3배 많은 것으로 알려졌다.

지페노사이드 LXXV(gypenoside LXVV)는 희귀 진세노사이드(마이너 진세노사이드)로서, 이는 1,000 달톤 내외의 큰 사이즈를 가진 메이저 진세노사이드에 비해 생체 내 흡수율이 높다.

이에, 본 발명자들은 희귀 진세노사이드 GypLXXV를 용이하게 고수율로 다량 수득하기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 마이크로박터 속 유래 진세노사이드 글리코시다제를 이용하여 지페노사이드 XVII로부터 지페노사이드 LXXV를 생산하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 지페노사이드 XVII에 처리하는 단계를 포함하는 지페노사이드 LXXV(gypenoside LXXV)를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 지페노사이드(gypenoside) XVII의 지페노사이드 LXXV로의 전환용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 지페노사이드 XVII에 처리하는 단계를 포함하는 지페노사이드 LXXV(gypenoside LXXV)를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase)"는 이당류 이상의 사슬형 다당류의 글루코시드 분자결합을 가수분해하는 분해하는 효소를 의미하며, 바람직하게는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 단백질을 의미한다. 상기 진세노사이드 글리코시다제는 상기 진세노사이드 글리코시다제를 서열번호 3으로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 지페노사이드 XVII를 지페노사이드 LXXV로 전환하는 진세노사이드 글리코시다제의 활성을 갖는 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 진세노사이드 글리코시다제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

상기 상동성이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 핵산 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다.

상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 코딩하는 핵산은 바람직하게는 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 갖는 핵산을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 진세노사이드 글루코시다제를 코딩하는 핵산은 진세노사이드 글루코시다제의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 핵산인 한 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 서열번호 4로 표시되는 핵산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80%이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 서열로서 실질적으로 진세노사이드 글리코시다제의 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 상기 상동성은 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "벡터"는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 작제물을 말한다. 구체적으로, 상기 벡터를 숙주 세포에 형질전환 또는 형질감염 시킴으로써, 목적하는 단백질인 진세노사이드 글리코시다제를 수득할 수 있다. 본 발명의 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 아그로박테리움 매개 형질전환에 사용할 수 있는 Ti-플라스미드를 포함한다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스, 이중 가닥 식물 바이러스(예, CaMV), 단일가닥 바이러스 또는 게미니 바이러스로부터 유래된 바이러스 벡터가 또한 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.

본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다.

상기의 방법으로 형질전환된 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체는 지페노사이드 GypXVII을 GypLXXV로 전환시킬 수 있는 활성을 가진다.

본 발명에서 형질전환체는 상기 진세노사이드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)같은 바실러스(Bacillus)속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)같은 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)같은 효모; 동물세포 및 곤충 세포가 있다.

본 발명에서 용어, "배양물"은 상기 형질전환체를 공지된 미생물 배양 방법에 따라 배양한 다음 수득한 산물을 의미할 수 있다. 진세노사이드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터가 도입된 형질전환체의 배양물은 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제를 포함하여, GypXVII를 GypLXXV로 전환시킬 수 있는 활성을 가지는 배양물을 의미할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 마이크로박테리움 속 균주(Gsoil167)에서 유래한 진세노사이드 글리코시다제(서열번호 3)를 분리 및 정제하였고, 이를 BglC167b로 명명하였다. 이 효소는 글리코시 하이드로다제 3족(glycoside hydrolase family 3)에 속하는 효소이고, 아미노산 서열은 803개의 잔기를 가지고 있다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 BglC167b를 GypXVII를 포함하는 여러 기질에 처리하여 TLC로 분석한 결과, BglC167b가 GypXVII를 GypLXXV로 전부 전환하는 것을 확인하였다(도 3의 E).

또한, 상기 처리 단계는 상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 형질전환체 또는 배양물을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을, pH 6 내지 9의 조건에서 지페노사이드 XVII에 처리하는 단계인 것일 수 있다.

또한, 상기 처리 단계는 상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 형질전환체 또는 배양물을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을, 25℃ 내지 37℃의 온도 조건에서 지페노사이드 XVII에 처리하는 단계인 것일 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 3으로 표시되는 진세노사이드 글리코시다제(ginsenosside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 지페노사이드(gypenoside) XVII의 지페노사이드 LXXV로의 전환용 조성물을 제공한다. 상기 진세노사이드 글리코시다제, 핵산, 벡터, 형질전환체, 및 배양물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

또한, 상기 조성물은 pH 6 내지 9인 완충용액을 추가로 포함하는 조성물일 수 있다.

상기 완충용액은 완충용액은 알칼리 염(나트륨 또는 칼륨 포스페이트 또는 이들의 수소 또는 이수소 염), 나트륨 시트레이트/시트르산, 나트륨 아세테이트/아세트산을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 다른 제약상 허용 가능한 pH 완충제를 포함할 수 있으며, 이들 완충제의 혼합물도 사용될 수 있다.

완충용액의 pH는 바람직하게는 6 내지 9, 보다 바람직하게는 6 내지 7일 수 있다.

완충용액의 농도는 30mM 내지 70mM일 수 있고, 보다 바람직하게는 40mM 내지 60mM일 수 있다.

또한, 상기 조성물은 25℃ 내지 37℃의 온도 조건에서 지페노사이드(gypenoside) XVII를 지페노사이드 LXXV로 전환하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 진세노사이드 글리코시다제의 효소 특성을 분석한 결과, pH는 pH 6 내지 9의 범위에서, 온도는 25 내지 37℃일 때, 효소의 활성과 안정성이 우수한 것을 확인하였다(도 2).

본 발명은 지페노사이드 XVII(gypenoside XVII)를 이용하여 인삼에서 분리가 어려운 희귀 사포닌인 지페노사이드 LXXV(gypenoside LXXV)를 대량 생산할 수 있는 효과가 있다. 이를 통해 지페노사이드 LXXV를 면역 조절 및 항산화 용도를 가지는 물질로 산업상 이용할 수 있게 한다.

도 1은 Bgl-gyp17을 정제하여 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 도이다. M은 샘플 레인(분자량 기준)을, 레인 1은 유도 전 전체 세포를 나타낸다. 레인 2는 유도 후 전체 세포를, 레인 3은 글루타티온 수지에 의해 정제된 단백질을, 레인 4는 rTEV에 의해 글루타티온 태그(GST tag)가 제거된 BglC167b를 나타낸다.
도 2는 E. coli(Escherichia coli)로부터 정제된 재조합 BglC167b의 안정성 및 활성에 있어서, pH(A) 및 온도(B)의 영향을 나타낸 것이다.
도 3은 BglC167b를 이용한 메이저 타입 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, GypXVII, Rg3, F2, Re 및 Rg1의 생물학적 전환에 대한 TLC 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 Bg1C167b를 이용한 메이저 타입 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, GypXVII, Rg3, F2, Re 및 Rg1의 생물학적 전환에 대한 전환 경로를 나타낸 도이다.
도 5는 GypXVII를 GypLXXV로 모두 전환시킨 HPLC(High performance liquid chromatography) 분석 결과를 나타낸 도이다. A는 반응 전 GypXVII, B는 반응 9시간후의 산물, 및 C는 Prep-HPLC로 정제된 GypLXXV를 나타낸 것이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 진세노사이드 글리코시다제를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작

4회의 스크리닝을 통하여, 포천 인삼 밭으로부터 메이저 진세노사이드(ginsenoside)를 마이너 진세노사이드로 전환하는 박테리아 균주를 동정하였으며 그 중 하나를 Gsoil167로 명명하였다. 상기 균주가 진세노사이드 Rb1을 PPD로, Re를 PPT로 가수분해할 수 있음을 확인하였다.

다른 박테리아에 대한 Gsoil167 균주의 계통발생학적 연관성을 확인하기 위하여 16S rRNA 유전자의 비율을 분석하였으며, Solgent로 시퀀싱하였다(대전, 대한민국). 16S rRNA 유전자 전장 서열을 SeqMan 소프트웨어(DNASTAR)를 사용하여 수집하였고, NCBI 데이터베이스에서 블라스팅 하여 분류학적으로 연관성 있는 16S rRNA 유전자 서열을 GenBank로부터 수득하였다. 유전자 서열에 따른 균주의 계통학적 위치를 Kimura two parameter 모델을 이용하여 계통학적 트리로 판단하였다. 1000 레플리케이션에 기초한 bootstrap 값을 갖는 MEGA 3 프로그램을 사용하여 근린결합법(neighbor-joining)을 사용함으로써 계통학적 트리를 구축하였다. 이는 포토비오틴(photobiotin)-표지된 DNA 프로브 및 마이크로-희석 웰(micro-dilution well)을 사용하여, DNA-DNA 혼성화를 Ezaki 등의 방법에 의해 형광광도(fluorometrically)를 측정함으로써 수행하였다. 각 샘플에서의 최고값과 최저값을 제외하고 나머지 값을 이용하여 유사성을 계산하였다.

16S RNA에 기초한 계통학적 분석 결과, 상기 Gsoil 167은 마이크로박터리움 속에 속하는 것으로 확인되었고, Microbacterium luteolum IFO 15074^T(99.9% 유사성)와 가장 높은 유사성을 나타내어서 Microbacterium sp . Gsoil 167 로 명명하였다.

실시예 2: 포스미드 라이브러리 스크리닝 및 시퀀싱

마이크로박터리움 중 진세노사이드를 전환할 수 있는 진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase)를 스크리닝하기 위하여, 상기 Gsoil 167에서 게놈 DNA를 추출하고 이 중의 진세노사이드 전환효소를 포스미드 라이브러리(Fosmid Library)를 이용하여 스크리닝하였다.

구체적으로, 상기 추출한 게놈 DNA를 이용한 포스미드 라이브러리를 제작하기 위해 CopyControl 포스미드 라이브러리 생성 키트(Fosmid Library Production Kit, Epicentre, U.S.A)를 제조사의 방법에 따라 이용하여 포스미드 라이브러리를 생성하였다. 마이크로박터리움 속 Gsoil167의 게놈 DNA(genomic DNA)를 약 40Kb 단편으로 임의적으로 절단하여 펄스 필드 겔 전기 영동(Pulse Field Gel Electrophoresis, PFGE)으로 소량을 최초로 러닝(running)함으로써, 절단된 DNA 크기를 측정하였다. 이 후, 상기 DNA를 블런트 엔드(blunt end) 및 5'-인산화 말단(5'-phosphorylated end)으로 제조하기 위해 말단-회복(end-repair)시켰다. 저융점(low melting point, LMP) 아가로즈 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 통하여 40Kb 이상인 말단-회복된 DNA 사이즈를 선별하였다. LMP 아가로즈 겔로부터 블런트-엔드 DNA를 정제하였고, pCC1FOS 벡터 내에 접합(ligation)하였다. 이 후, 맥스플랙스 람다 패키지 추출 키트(MaxPlax lambda packaging extract kit, Epicentre, U.S.A.)로 시험관 내(in vitro) 패키징을 수행하였다.

최종적으로, 10 mM 황산 마그네슘(MgSO₄)을 포함하는 LB(Luri-Bertani) 배지(broth)에서 600nm에서의 흡광도(O.D)가 0.6이 될 때까지 대장균(Escherichia coli, E. coli) BL21을 배양하고, 이를 상기 생성물로 형질전환(transformation)하기 위해, 박테리아(E. coli)에 37℃에서 20분간 상기 생성물을 흡수시켰다. 그 후, 클로람페니콜(chloramphenical) 12.5 ug/ml 및 27 ul X-gal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucoside)을 포함하는 LB 플레이트상에 도말하여 37℃에서 배양하였다. 16 내지 20시간 배양 후, 파란색을 나타내는 클론(진세노시드 글리코시다제 생산 추정 클론)을 선별하고, 동일한 플레이트 상에서 한 번 더 활성을 확인하였다.

활성을 확인한 결과 진세노시드 글리코시다제를 생산하는 것으로 추정되는 클론을 클로람페니콜 12.5 ug/ml을 포함하는 0.2 ml의 37℃의 LB 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 이 후, TLC 분석을 통해 진세노사이드-가수 분해능을 분석하였다.

실시예 3: 진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase)의 제조

포스미드의 어셈블 DNA(assembled DNA) 서열을 National Center for Biotechnology Information's ORF FINDER로 분석하였다. 예상되는 ORF에 대해 BLASTP를 사용하여 진세노시드 글리코시다제로 추정되는 ORF를 찾아내고, 하기 표 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 주형 DNA를 PCR을 통해 증폭하였다. 이 효소는 글리코시 하이드로다제 3족(glycoside hydrolase family 3)에 속하는 효소이고 아미노산 서열은 803개의 잔기를 가지고 있었다. (GenBank Accession number: WP_018187396).

프라이머	서열(5'-3')	서열번호
정방향 프라이머	GGT TCC GCG T GGATCC AA CGC CCG CCC GTC CGA TTC CAC C	1
역방향 프라이머	GAT GCG GCC G CTCGAG TC ATG CCT GCT CCC AGT CCA CCG A	2

실시예 4: 재조합 BGL - GYP17 의 분자 클로닝 , 발현 및 정제

상기 실시예에서 증폭된 단편을, pGex 4T-1 발현 벡터 및 재조합 TEV 프로테아제(rTEV)를 포함하는 GST tag(glutatione S-transferase tag) 융합 단백질 발현 벡터에 순차적으로 클론하였다. 그 다음, 재조합 pGex 4T-1을 E. coli BL21(DE3) 세포에 도입하였다.

진세노사이드 글리코시다제를 대량 생산하기 위하여, 상기 형질전환된 균주를 앰피실린(ampicillin)이 첨가된 100 ml의 LB 배지가 들어있는 삼각 플라스크에 접종하여 600nm에서의 흡광도가 0.6이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기에서 200 rpm으로 종균 배양을 실시하였다. IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactoside)를 최종 0.1 mM 농도가 되도록 첨가하여 진세노사이드 글리코시다제의 대량 발현을 유도하였다. 균주가 정체기(stationary phase)에 들었을 때, 균주의 배양액을 6,000xg로 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 100 mM 인산나트륨 버퍼(Sodium phosphate buffer, pH 7.0)를 첨가하여 현탁한 후, 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물을 다시 13,000xg로 4℃에서 15분 동안 원심분리하여, 수용성인 진세노사이드 글리코시다제를 진세노사이드 생산에 사용할 수 있는 상등액으로부터 획득하였다. 글루타티온 수지(Glutathione Resin)를 이용하여 분리 정제하고 프로테아제에 의해 절단하여 얻은 진세노사이드 글리코시다제를 SDS-PAGE로 분석하였다.

그 결과, GST를 제거한 단백질은 약 105 kDa의 분자량을 나타내었다(도 1). 또한, 상기 진세노사이드 글리코시다제 BglC167b를 분석한 결과, 아미노산 개수는 803개이며, 상기 BglC167b의 아미노산 서열을 서열번호 3으로 표시하였다.

실시예 5: pH 변화에 따른 효과 측정

pH가 상기 BglC167b진세노사이드 글리코시다제 효소 활성에 미치는 효과를 측정하였다. 기질은 2.0 mM pNPGlc(p-nitrophenyl-D-glucopyranoside; Sigma)을 사용하였고, 하기와 같은 버퍼(50 mM)를 사용하여 pH를 조절하였다. pH2 내지 10의 범위: KCl-HCl(pH2), 글라이신-HCl(pH3), 아세트산 나트륨(pH4 및 5), 인산 나트륨(pH6 및7), Tris-HCl(pH8 및 9) 및 글라이신-수산화나트륨(pH10).

또한, pH가 효소 안정성에 미치는 효과를 측정하였다. 4℃의 온도에서 24시간 동안 상기 언급된 각 버퍼에서 효소를 배양한 후, 50 mM 칼륨(potassium) 버퍼 내에서 pNPGlc을 분석함으로써 pH 변동에 따른 효소 안정성을 측정하였다. 표준 분석 방법에 의해 잔기 활성을 분석하여 최적 pH에서 수득된 활성 확률로서 그 결과를 도 2의 A에 나타내었다.

그 결과, 진세노사이드 글리코시다제(BglC167b)의 안정성 및 활성이 pH 6 내지 9의 범위에서, 특히 pH 7.0에서 탁월함을 확인하였다(도 2의 A).

실시예 6: 온도 변화에 따른 효과 측정

온도가 상기 BglC167b 진세노사이드 글리코시다제 효소 활성에 미치는 효과를 측정하였다. 4 내지 90℃로 온도를 조절하였으며, pNPGlc(p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside; Sigma) 2.0 mM을 사용하여 5분 동안 최적 pH에서 50 mM 인산 칼륨 버퍼 내 온도 의존적 활성을 분석하였다.

또한, 동일 온도 범위 내에서 30분 동안 인산 칼륨 버퍼 50mM 내 효소 당량을 배양함으로써 온도 안정성 분석을 수행하였다. 구체적으로, 10분간 얼음으로 샘플을 냉각한 후, 표준 분석 방법에 의해 측정된 잔존 활성을 확인함으로써 온도 안정성 분석을 수행한 후, 그 결과를 도 2의 B에 나타내었다.

그 결과, BglC167b의 활성 및 열 안정성은 25 내지 37℃의 범위에서, 보다 바람직하게는 30 내지 37℃의 범위에서 우수한 것을 확인하였다(도 2의 B).

실시예 7: 진세노사이드 글리코시다제 ( BglC167b ) 효소의 진세노사이드 전환 경로 분석

PPD 타입 또는 PPT 타입의 진세노사이드 3번 탄소(C-3), 6번 탄소(C-6) 및 20번 탄소(C-20) 부위에 부착된 글루코스 가수분해에 대한 BglC167b 효소의 특이성 및 선택성을 분석하였다.

이를 위해, 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, GypXVII, Rg3, F2, Re 및 Rg1(도 3A, B, C, D, E, F, G, H 및 I)을 기질로 사용하였고, 효소 0.2U, 50 mM 인산 나트륨 버퍼 0.1%(w/v) (pH 7.0), 및 기질을 포함하는 각 반응 혼합물을 37℃에서 배양하였다. 샘플을 적절한 간격으로 수거하여, 수용액-포화된 부탄올 동량 부피를 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. n-부탄올 분획을 건조하여 증발시키고, 잔기를 CH3OH에 용해시켜 TLC(thin layer chromatography)로 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 특히, 상기 기질 중 GypXVII는 GypLXXV로 전부 전환되는 것을 확인하였다(도 3의 E).

또한, 진세노사이드의 전환 경로는 Rb₁→Rd→Rg₃(S) → PPD; Rd → Rg₃(S) → PPD; GypXVII → GypLXXV → C-K → PPD(S); Re → Rg₂(S); Rb₂→C-Y; Rc→C-Mc; Rg₁→Rh₁(S) 인 것을 확인하였다(도 4).

실시예 8: 진세노사이드 글리코시다제(BglC1167b)를 이용한 진세노사이드 대량 생산

10g 단위 미량의 진세노사이드를 생산하기 위한 효소액을 대량으로 얻기 위하여 형질전환된 E. coli 세포를 얻고자 하기와 같은 과정을 수행하였다.

먼저, 본 배양에 앞서, 500ml 플라스크에 앰피실린이 함유된 LB(Luria-Bertani) 배지에 GST-BglC167b이 함유되어 있는 형질전환된 E. coli BL21(DE3) 세포를 접종하였다. 그 다음날, 10L 발효기에서 6L 부피의 LB에 접종하여 600nm에서의 흡광도가 3이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기에서 500 rpm으로 배양을 실시하였다. 수용성 재조합 단백질인 BglC167b의 발현을 유도하기 위해서 발효기의 온도를 30℃로 낮추고, 글루코스 용액(600 g/l)을 E. coli 세포의 추가 성장을 원활히 하기 위해서 200 내지 500 ml 넣어주었다. 또한, 1M 인산나트륨 버퍼 300 내지 500 ml를 넣어서 안정적인 pH 조건을 꾀하였다. 이에 더하여, 최종 IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactoside) 농도가 0.1 mM이 되도록 첨가하여 진세노사이드 글리코시다제 BglC167b의 대량 발현을 유도하였다. 20 내지 36시간 동안 이를 배양하여 균주가 정체기에 들었을 때 상기 균주의 배양액을 6,000xg로 4℃에서 15분 동안 원심분리하여, E. coli 세포를 200g 얻을 수 있었다(30g/l 전후).

이에 100mM 인산나트륨 버퍼(Sodium phosphate buffer, pH7.0)를 첨가하여 현탁한 다음, 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물을 다시 13,000xg로 4℃에서 15분 동안 원심분리함으로써, 수용성으로 발현된 상기 BglC167b이 포함되어 있는, 진세노사이드 생산에 사용될 수 있는 효소액을 대량으로 획득하였다.

실시예 9: GypLXXV 의 대량 생산 및 정제

상기 실시예 8에서 대량으로 얻어진 효소액 0.5L에 농도 20 mg/ml인 지페노사이드(gypenoside) GypXVII 0.5L를 pH 7.0과 37℃의 조건 하에서 150 rpm으로 교반시키면서 반응시켰다. 반응 9시간 후 모든 GypXVII이 GypLXXV로 전환되는 것을 HPLC로 확인하였다(도 5).

상기 전환된 GypLXXV을 회수하기 위하여 주정을 70%가 되도록 첨가하여 재조합 효소는 불활성화하고, GypLXXV는 용해시켰다. 용해된 진세노사이드는 물로 알콜 농도를 20%로 낮추어 HP20 다공성 수지로 흡착시켰다. 이를 물로 세척한 후, 80% 에탄올을 이용하여 탈착 시킨 다음, 감압식 회전 증발기를 이용하여 순도 높은 GypLXXV를 획득하였다. 그 결과, PPD 혼합물 10g을 반응시켜서 5.7g의 GypLXXV을 수득하였다.

또한, 높은 순도의 GypLXXV를 수득하기 위해, 상기 반응 산물 600mg을 Prep-HPLC(preparative HPLC)를 이용하여 85% 아세토나이트리올(acetonitrile)로 정제하였다. 순수한 산물 240mg을 획득하고 HPLC로 순도를 측정한 결과, 순도 95% 이상의 GypLXXV를 수득하였다.

상기와 같은 결과들은 진세노사이드 글리코시다제(BglC167b)를 분리 및 정제할 수 있으며, BglC167b가 GypXVII을 희귀 사포닌인 GypLXXV으로 효율적으로 전환할 수 있음을 뒷받침 하는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Intelligent Synthetic Biology Center <120> A method for production of gypenoside LXXV using ginsenoside glycosidase <130> KPA150133-KR <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 ggttccgcgt ggatccaacg cccgcccgtc cgattccac 39 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gatgcggccg ctcgagtcat gcctgctccc agtccaccg 39 <210> 3 <211> 803 <212> PRT <213> Microbacterium sp. Gsoil 167 <400> 3 Met Asn Ala Arg Pro Ser Asp Ser Thr Ala His Leu Arg Pro Leu Leu 1 5 10 15 Glu Arg Leu Ser Leu Glu Gln Lys Ala Ala Leu Val Gln Gly Ala Asp 20 25 30 Phe Trp Thr Thr Val Pro Leu Pro Glu Ile Gly Leu Arg Ala Leu Thr 35 40 45 Leu Ser Asp Gly Pro Ala Gly Val Arg Gly Pro Arg Trp Asp Glu Arg 50 55 60 Asp Pro Ser Leu Asn Leu Pro Ser Gly Ser Ala Leu Ala Ala Ser Trp 65 70 75 80 Asp Val Asp Leu Ala His Arg Tyr Gly Ala Ala Ala Ala Ser Glu Ala 85 90 95 Arg Arg Lys Gly Val Asp Val Val Leu Gly Pro Thr Ile Asn Leu His 100 105 110 Arg Ser Pro Leu Gly Gly Arg His Phe Glu Cys Leu Ser Glu Asp Pro 115 120 125 Glu Leu Thr Ala Glu Leu Gly Ala Ala Tyr Val Arg Gly Met Gln Glu 130 135 140 Asn Gly Val Ala Ala Thr Pro Lys His Tyr Val Ala Asn Asp Ser Glu 145 150 155 160 Thr Asp Arg Phe Thr Val Asp Ile Glu Val Asp Glu Arg Ala Leu Arg 165 170 175 Glu Leu Tyr Leu Ala Pro Phe Glu Arg Ala Val Glu Ala Gly Ala Trp 180 185 190 Ser Ile Met Ser Ala Tyr Asn Ala Val Asp Gly Val Thr Met Thr Glu 195 200 205 Asn Asp Leu Leu Glu Thr Pro Leu Asn Ser Glu Trp Gly Phe Asp Gly 210 215 220 Val Val Val Ser Asp Trp Thr Ala Val Arg Ser Leu Asp Ala Val Ala 225 230 235 240 Ala Ala Gln Asp Leu Ala Met Pro Gly Pro Ala Pro Ala Trp Asp Glu 245 250 255 Leu Val Asp Ala Val Arg Asp Gly Arg Val Gln Glu Ser Asp Ile Asp 260 265 270 Arg Lys Val Leu Arg Ile Leu Leu Leu Ala Glu Arg Val Gly Ala Leu 275 280 285 Glu Gly Thr Asp Ala Val Val Pro Ala Pro Leu Asp Gly Pro Ala Phe 290 295 300 Ala Arg Glu Ala Ala Ile Glu Gly Ala Val Leu Leu Gln Asn Asp Gly 305 310 315 320 Val Leu Pro Leu Gly Gly Val Gly Ser Ile Ala Ile Ile Gly His Asn 325 330 335 Ala Arg Glu Ala Arg Thr Gln Gly Gly Gly Ser Ala Thr Val Leu Pro 340 345 350 Glu Glu Val Val Ser Pro Leu Asp Ala Leu Arg Ala Ala Phe Pro Ala 355 360 365 Ala Asp Thr Arg Tyr Ala Ile Gly Ala Val Val Gln Asp Gly Val Ala 370 375 380 Glu Ile Pro Pro Thr Thr Ile Val Asn Pro Val Thr Gly Asp Gln Gly 385 390 395 400 Leu Arg Val Ser Phe Leu Asp Ala Asp Gly Thr Glu Leu Phe Ala Glu 405 410 415 Asp Arg Arg Ala Thr Ala Leu Val Trp Phe Gly Gly Asp Ala Pro Ile 420 425 430 Gly Ala Ser Arg Thr Val Val Leu Ser Thr Arg Tyr Thr Pro Thr Glu 435 440 445 Thr Thr Ser Ile Glu Leu Gly Phe Ala Gly Ala Asn Pro Gly Arg Ile 450 455 460 Phe Val Asp Gly Glu Leu Val Leu Asp Asp Thr Pro Val Ile Glu Gly 465 470 475 480 Thr Asp Leu Gly Ala Ala Phe Leu Asn Pro Pro Ser Val Thr Thr Ala 485 490 495 Val Pro Val Glu Ala Gly Arg Ala Ile Asp Ile Arg Ala Glu Phe Thr 500 505 510 Arg Glu Ser Arg Gly Ala Leu Asp Gly Ala Leu Ser Val Thr Leu Gly 515 520 525 Ile Ala Pro Glu Arg Thr Asp Pro Asp Glu Leu Ile Ala Arg Ala Val 530 535 540 Glu Ala Ala Arg Gly Ala Glu Val Ala Ile Val Val Val Gly Thr Asn 545 550 555 560 Ser Lys Val Glu Ser Glu Gly Tyr Asp Arg Val Asp Leu Asp Leu Pro 565 570 575 Gly Arg Gln Asp Asp Leu Val Arg Ala Val Ala Ala Thr Gly Thr Pro 580 585 590 Thr Ile Val Val Val Asn Ala Gly Ser Pro Val Val Leu Pro Trp Ala 595 600 605 Ala Asp Val Ala Ala Ile Val Gln Gly Tyr Phe Gly Gly Gln Glu Phe 610 615 620 Gly His Ala Ile Ala Asp Val Val Thr Gly Ala Ala Glu Pro Gly Gly 625 630 635 640 Arg Leu Pro Thr Thr Trp Pro Ala Ser Leu Ala Asp Val Pro Val Ser 645 650 655 Ala Val Thr Pro Thr Asp Gly Arg Leu Val Tyr Ala Glu Gly Leu His 660 665 670 Ile Gly Tyr Arg Ala Trp Leu Arg Gln Ser Ala Ala Pro Ala Phe Pro 675 680 685 Phe Gly His Gly Leu Gly Tyr Thr Ser Trp Thr Trp Gly Ala Ala Gln 690 695 700 Arg His Glu Asp Ala Val Glu Val Thr Leu Ala Asn Thr Gly Val Arg 705 710 715 720 Arg Gly Lys Gln Val Val Gln Val Tyr Ala Glu Arg Ala Asp Ser Ala 725 730 735 Val Glu Arg Pro Glu Arg Trp Leu Val Gly Phe Ala Ala Val Arg Ala 740 745 750 Glu Pro Gly Glu Thr Val Thr Ala Val Ile Pro Val Pro Pro Arg Arg 755 760 765 Leu Ala His Trp Ala Gly Asp Trp Val Val Glu Pro Gly Gln Tyr Thr 770 775 780 Leu Arg Ile Gly Pro Ser Val Val Glu Leu Pro Leu Ser Val Asp Trp 785 790 795 800 Glu Gln Ala <210> 4 <211> 2412 <212> DNA <213> Microbacterium sp. Gsoil 167 <400> 4 atgaacgccc gcccgtccga ttccaccgct cacctgcgtc cgctgctgga gcggctctcc 60 ctcgagcaga aggccgcgct cgtgcagggc gccgacttct ggaccacggt gccgctgccc 120 gagatcggat tgcgggcgct cacgctctcc gacggccccg ccggagtgcg cggaccgcga 180 tgggacgagc gcgatccctc gctcaacctc ccgtccggct cggcgctggc agcctcctgg 240 gacgtcgacc tcgcccaccg ctacggggcg gccgcggcat ccgaggcacg gcgcaagggc 300 gtcgacgtgg tgctcggccc cacgatcaac ctgcaccgct cgccgctcgg cggacggcac 360 ttcgagtgtc tcagcgagga cccggagctc accgcggagc tgggggccgc gtacgtgcgc 420 ggcatgcagg agaacggcgt cgccgccacc ccgaagcact acgtcgcgaa cgactcggag 480 acggatcgct tcacggtcga catcgaggtc gacgagcgcg cactgcgcga gctctacctc 540 gcaccgttcg agcgtgccgt cgaagcgggg gcgtggtcga tcatgagcgc ctacaacgcc 600 gtcgacggcg tcacgatgac ggagaacgac ctgctcgaga cgccgctcaa cagcgagtgg 660 ggcttcgacg gcgtcgtcgt cagcgactgg accgccgtgc gctctctcga cgccgtcgcc 720 gcagcgcagg acctcgcgat gcccggcccc gctcccgcct gggacgagct cgtggatgca 780 gtccgtgacg gacgcgtgca ggagagcgac atcgatcgca aggtgctgcg catcctgctc 840 ctcgccgagc gcgtcggtgc gctcgaaggg acggatgccg tcgtcccggc acccctggac 900 ggaccggcct tcgcgcggga ggccgcgatc gagggcgccg tgctgctgca gaacgacggg 960 gtgctcccgc tcggcggcgt cgggagcatc gcgatcatcg gtcacaacgc cagggaggcc 1020 cgcactcagg gcggcggttc ggcgacggta ctgccggaag aggtggtgtc gccgctcgat 1080 gctctccgcg cggcgttccc cgccgcggac acccgctacg cgatcggcgc cgtcgtgcag 1140 gacggcgtcg ccgagatccc gccgacgacg atcgtcaacc cggtgaccgg cgatcagggg 1200 ctgcgggtga gcttcctcga cgcggacggc accgagctgt tcgccgagga ccggcgcgcg 1260 accgcgctgg tgtggttcgg cggcgatgcg ccgatcggcg cgagtcgcac cgtggtgctg 1320 tcgacccggt acacgccgac cgagacgacg agcatcgagc tgggcttcgc gggggcgaat 1380 ccggggcgga tcttcgtcga cggcgagctc gtgctcgacg acaccccggt catcgaggga 1440 accgacctcg gggccgcctt cctcaacccg ccgtccgtga caacggccgt gccggtcgag 1500 gccgggcgtg cgatcgacat ccgcgccgag ttcacccggg agtcgcgggg tgcgctggac 1560 ggcgccctga gcgtgaccct cggcatcgcc ccggagcgca ccgaccccga cgagctgatc 1620 gctcgggccg tcgaggcggc acgcggcgcc gaggtcgcga tcgtcgtcgt cgggacgaac 1680 tcgaaggtcg agtccgaggg atacgaccgc gtggacctcg acctgccggg acgtcaggac 1740 gacctggtgc gcgcggtcgc cgccaccggc acgccgacca tcgtggtcgt gaacgccgga 1800 tccccggtcg tgctgccctg ggccgccgac gtcgcggcca tcgtgcaggg ctacttcggc 1860 gggcaggagt tcggccatgc gatcgccgac gtcgtgacgg gagccgccga gcccggtggc 1920 cgcctgccga ccacgtggcc ggcgtcgctc gccgacgtgc cggtctccgc cgtgaccccg 1980 accgacggcc gtctcgtcta cgccgagggt ctgcacatcg gataccgcgc ctggctgcgg 2040 cagagcgccg ccccggcctt cccgttcggc cacggcctgg gctacacctc atggacctgg 2100 ggcgcggcgc agcgtcacga ggatgccgtc gaggtgaccc tcgcgaacac gggcgtgcgt 2160 cgcgggaagc aggtcgtgca ggtgtacgcc gagcgcgccg actccgccgt cgaacgcccc 2220 gagcgctggc tcgtcggatt cgccgcggtc cgcgccgaac ccggtgagac cgtcaccgcc 2280 gtgatccccg tcccaccccg gcgactcgcg cattgggcgg gcgactgggt cgtcgaaccc 2340 gggcagtaca cgctgcggat cgggccgtcc gtcgtcgagc tgccgctgtc ggtggactgg 2400 gagcaggcat ga 2412

Claims

서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 지페노사이드 XVII에 처리하는 단계를 포함하는, 지페노사이드 LXXV(gypenoside LXXV)를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 처리 단계는 상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 형질전환체 또는 배양물을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을, pH 6 내지 9의 조건에서 지페노사이드 XVII에 처리하는 단계인 것인, 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 처리 단계는 상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 형질전환체 또는 배양물을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을, 25℃ 내지 37℃의 온도 조건에서 지페노사이드 XVII에 처리하는 단계인 것인, 제조 방법.
서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 지페노사이드(gypenoside) XVII의 지페노사이드 LXXV로의 전환용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물은 pH 6 내지 9인 완충용액을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물은 25℃ 내지 37℃의 온도 조건에서 지페노사이드(gypenoside) XVII를 지페노사이드 LXXV로 전환하는 것인, 조성물.