KR20160108391A - 수용체 표적화 작제물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 명세서에서 세포 표면 분자를 표적화하는 리간드; 막 관통 도메인; 및 페이로드 결합 도메인을 포함하는 약물 전달 분자; 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물이 개시된다. 또한 암 치료, 암 진행의 저해, 암 전이의 예방 및 치료적 화합물의 전달이 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법, 암 진행을 저해하는 방법, 암 전이를 예방하는 방법 및 뇌에 치료적 화합물을 전달하는 방법이 개시되며, 상기 방법은 치료가 필요한 대상체를 동정하는 단계; 본 명세서에 개시된 바와 같은 약물 전달 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및 상기 대상체에게 유효량의 조성물을 투여하는 단계가 개시된다.

Description

수용체 표적화 작제물 및 이의 용도{RECEPTOR TARGETING CONSTRUCTS AND USES THEREOF}
관련 출원
본 출원은 2014년 1월 17일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/928,903호(발명자: Lali K. MEDINA-KAUWE 등, 발명의 명칭: "c-MET TARGETING CONSTRUCT AND USES THEREOF")로부터의 우선권을 주장하며, 도면을 포함하는 이 기초출원의 전체 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
정부 권리
본 명세서에 개시된 대상은 미국 국립보건원(National Institutes of Health/National Cancer Institute)에 의해 부여된 등록 번호 CA140995 및 CA129822 하에서 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 개시된 대상에 특정 권리를 가진다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 생명공학기술 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 치료제를 표적 세포, 예컨대 암세포에 전달하는 조성물에 관한 것이다.
임상에서 사용되는 현재의 표적화된 치료법에 저항하거나 또는 내성을 획득한 다수의 종양은 c-Met와 같은 단백질의 상승된 표면 수준을 나타낸다. 예를 들어, 폐암은 타쎄바(Tarceva)와 같은 EGF-R 저해제에 대해 내성을 획득한다. 타쎄바와 같은 저해제는 수용체 타이로신 키나제(타이로신 키나제 저해제 또는 TKI로서 알려짐)의 활성을 차단하는 것으로 의도되지만, 대다수의 경우는 TK 저해에 반응하지 않는다. 이들 종양은 상승된 수준의 세포 표면 단백질(예컨대 c-Met)을 특징으로 하며, 따라서 본 명세서에 기재된 치료 접근에 대한 우수한 후보가 되는데, 이 접근은 과발현 단백질을 표적화하고, 종양 세포를 침투할 수 있다.
현재의 시도는 당업계에서 c-Met를 통해 신호전달을 차단하는 것으로 의도되는 c-Met 항체 또는 저해제를 발생시키는 것으로 이루어진다. 그러나, 과거의 이력은 대부분의 경우 항체 또는 소분자를 차단하는 신호전달에 반응하지 않는다는 것을 나타내는데, 종양이 신호전달 저해에도 불구하고 증식을 계속하는 대안의 수단을 채택하기 때문이다.
본 명세서에 기재된 조성물은 독성 분자를 종양 세포 내로 전달하고 그 안에서 종양을 사멸시키기 위한 관문으로서 세포 표면 수용체(예를 들어, c-Met)를 이용함으로써 신호전달을 차단할 필요를 피한다. 리간드 유도 전달은 특이적 세포 표면 수용체(예를 들어, c-Met)에 대해 양성인 종양에 대해 표적화된 결합을 가능하게 하고, 전달 분자 내의 막 관통 도메인은 세포 표면 수용체-매개 세포내 섭취 후에 엔도솜 막을 가로지르는 관통 및 용해를 가능하게 한다. 전달 단백질은 또한, 예를 들어 이온 상호작용을 통해 특정 치료 분자와 비공유적으로 조립되고 특정 치료 분자를 수송하도록 변형된다.
본 명세서에서 세포 표면 분자를 표적화하는 리간드; 막 관통 도메인; 및 페이로드 결합 도메인(payload binding domain)을 포함하는 약물 전달 분자; 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물이 개시된다. 또한 암 치료, 암 진행의 저해, 암 전이의 예방 및 치료적 화합물의 전달이 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법, 암의 진행을 저해하는 방법, 암 전이를 예방하는 방법 및 뇌에 치료 화합물을 전달하는 방법이 개시되며, 상기 방법은 암 치료, 암 진행의 저해, 암 전이의 예방 및 치료적 화합물의 전달이 필요한 대상체를 동정하는 단계; 본 명세서에 개시된 바와 같은 약물 전달 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및 유효량의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 대조군으로서 리포펙타민(도 1A) 및 HerPBK10(도 1B)을 이용하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 흡수 결과를 도시한 도면.
도 2는 PBK10이 GFP를 암호화하는 합성 mRNA를 전달할 수 있다는 것을 도시한 도면. 도 2a는 이 실험에서 사용되는 mRNA의 요약을 제공한다. 도 2b는 리포펙틴에 의해 전달되는 GFP-발현 플라스미드(좌)에 비교한 리포펙틴에 의해 전달된 mRNA로부터의 GFP 발현(우)을 나타낸다. 도 2c는 PBK10-mRNA 복합체의 개략도이다. 도 2d는 PBK10-mRNA 복합체에 대한 세포 결합 데이터를 나타낸다. 도 2e는 세포-결합 복합체의 흡수 결과를 나타낸다. 도 2f는 GFP의 발현 결과의 영상을 나타내는 반면, 도 2g는 그래프 형태로 동일한 데이터를 도시한다.
도 3은 (A) c-MET 수용체 결합에 대한 최소 도메인을 포함하는 In1B321; 및 (B) c-MET의 세포외 도메인에 결합된 In1B321의 개략도를 도시한 도면.
도 4는 재조합 유전자 작제물이 새로운 융합 단백질인 In1B-PBK10을 암호화하기 위해 조립된다는 것을 나타내는 개략도를 도시한 도면. A. pRSET-In1B-PBK10의 구성. B. pRSET-GFP-In1B의 구성. C. 제한효소 분해에 의한 클로닝 삽입물의 확인.
도 5는 재조합 단백질 In1B, In1B-PBK10 및 GFP-In1B가 박테리아에서 생성된다는 것을 나타내는 웨스턴 블롯의 결과를 도시한 도면.
도 6은 c-MET의 표면 수준이 상이한 종양 및 비-종양 세포주에 따라 변한다는 것을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 96-웰 형식으로 수행한 세포 표면 ELISA에 의해 측정한 바와 같은 비투과 세포의 표면에 대한 상대적 수용체 수준을 나타낸다. ELISA 결과는 H1993(폐암 세포주) 및 MDA-MB-231(유방암 세포주)가 c-MET의 가장 높은 세포 표면 수준을 지니는 세포 중에 있다는 것을 나타낸다. RANKL(전립선암 세포주) 및 MDA-MB-435(유방암 세포주)는 중간 수준을 나타내는 반면, LN-GFP(전립선암 세포주) 및 Cos-7(아프리카 그린 원숭이 신장 섬유아세포)은 낮은 수준의 세포 표면 c-MET를 나타낸다.
도 7은 In1B-유래 펩타이드가 c-MET를 인식한다는 것을 나타내는 실험 결과를 도시한 도면. a. In1B321 펩타이드는 c-MET 양성에 우선적인 결합을 나타내지만, 낮은 c-MET인 세포에는 그렇지 않음을 나타낸다. 형광 활성화 세포 정렬 분석(Fluorescence activated cell sorting: FACS)을 사용하여 c-MET 양성 세포에 결합된 In1B의 상대적 수준(면역형광에 의해 인식됨)을 측정하였다. FACS 데이터는 낮은 c-MET 세포(LN GFP)에 비해 높은 c-MET 세포(H1993)에 대해 상대적으로 더 고수준의 In1B 결합을 나타낸다. b. 경쟁적 저해에 의한 c-MET의 확인. 유리 In1B를 c-MET(MET)의 세포외, 리간드 결합 도메인으로부터 유래된 가용성 펩타이드와 함께 사전인큐베이션시켰을 때, H1993에 대한 In1B 결합은 저해될 수 있었다. In1B 및 MET를 1:1 몰 비(MET:In1B)로 인큐베이션시켰는데, 이는 In1B가 MET에 대해 특이적이라면 수용체 결합의 50% 감소를 예측한다. c. In1B-PBK10에 의한 세포 결합은 c-MET 수준에 비례한다. In1B-PBK10은 세포 표면 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 상대적으로 낮은 c-MET 수준을 발현시키는 세포(Cos-7)에 비해, 더 높은 c-MET 세포 표면 발현을 지니는 세포(MDA-MB-231)에 대해 더 높은 수준의 결합을 나타내었다. d. 경쟁 리간드에 의한 c-MET+ 세포에 대한 결합의 저해. In1B-PBK10의 첨가 전에 증가하는 농도의 In1B를 세포에 사전결합시켰을 때, 상승된 농도의 유리 In1B 리간드를 얼음 상에서 1시간 동안 MDA-MB-231 세포에 사전결합시켰다. e. In1B-PBK10은 현탁액 중에서 c-MET+ 세포에 대한 수용체-특이적 결합을 겪는다. 유리 In1B 리간드의 농도를 증가시키면서 현탁액 중의 MDA-MB-435 세포를 인큐베이션시키고, 비결합 In1B를 제거한 후에, 세포를 In1B-PBK10과 함께 인큐베이션시켰다. 유리 In1B 리간드의 농도를 선택하였고, 따라서 In1B-PBK10 대 In1B의 몰 비는 1:1, 1:5 및 1:10이었다. 세포 펠렛과 함께 공동 침전되는 상대적 In1B-PBK10 수준을 측정하기 위해 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 면역블롯 밴드의 농도계 측정(우측 패널)은 In1B의 농도가 증가됨에 따라 In1B-PBK10 결합 수준이 감소된다는 것을 나타내는데, 이는 c-MET에 대한 In1B-PBK10 결합과 일치된다.
도 8은 In1B-PBK10이 c-MET+ 세포 내로 내재화된다는 것을 도시한 도면.
도 9는 In1B-PBK10이 c-MET+ 세포에 독성 분자를 전달할 수 있다는 것을 도시한 도면. a. In1B-PBK10-Ga 입자의 제조. 개략도는 비공유적 조립을 촉진시키기 위해 In1B-PBK10을 Ga-콜롤(Ga-corrole)과 혼합한 후에 한외여과에 의해 입자를 단리시키는 절차를 나타낸다. b. In1B-PBK10-Ga 입자의 DLS. c. In1B-PBK10은 콜롤 페이로드의 사이토졸 유입을 매개한다. d. I-Dox는 c-MET 양성 종양 세포의 생존을 감소시킨다. e. 유리 In1B는 I-Dox 독성을 저해한다.
도 10은 nu/nu 마우스 보유 피하 양쪽 옆구리 MDA-MB-435 종양에서 전신(꼬리 정맥) 전달 후에 In1B-PBK10의 생체 내 분포에 대한 제노겐 스펙트럼(Xenogen Spectum) 영상을 도시한 도면. A. 꼬리 정맥 주사 후 표시한 시점에 전체 마우스의 영상. 청색 화살표는 신장을 나타낸다. 흰색 화살표는 종양을 나타낸다. B. 4시간 시점 후에 희생시킨 동일한 마우스로부터 채취한 종양 및 조직의 영상.
도 11은 HerMn의 조립체를 도시한 도면. A. 기능성 도메인을 강조한 HerPBK10 단백질의 개략도. B. Mn-콜롤(S2Mn)의 화학적 구조. C. 비공유적 조립체의 개략도. D. 용액 중에서 HerMn 입자의 TEM(삽도) 및 동적 광 산란법(dynamic light scattering: DSL) 측정.
도 12는 HerPBK10이 HER3에 결합하고 환자 혈청에 의해 저해되지 않는다는 것을 나타내는 그래프의 그룹을 도시한 도면. A. 고정된 HER3(인간 ErbB3 세포외 도메인; 프로스펙(Prospec))에 대한 HerPBK10 결합의 ELISA -/+ 경쟁적 저해제(HER3 차단)로서 가용성 HER3 펩타이드와 함께 사전 인큐베이션. Un: HerPBK10 없음. B. HER2+ 세포에 대한 HerPBK10 결합의 ELISA -/+ 경쟁적 저해제로서 1x 및 10x 몰 비의 가용성 HER3 펩타이드, 가용성 HER4 펩타이드(ERBB4 펩타이드, 압노바(Abnova)), 베타셀룰린(10㎍/㎖) 또는 퍼투주맙(Pz)과 함께 사전 인큐베이션. C. 5명의 HER2+ 환자 및 연령 매칭한 대조군(HER2-)으로부터의 혈청 내 HER2+(MDA-MB-435) 세포에 대한 HerPBK10 결합의 ELISA. 대조군 샘플을 소 혈청에 결합시키고, 수용체-결합을 재조합 헤레귤린(heregulin) 리간드(+Her)를 이용하는 경쟁적 저해에 의해 입증하였다. N=3. *, 대조군(-Her: 경쟁적 저해제 없음)에 비교하여 p<0.05.
도 13은 HerPBK10이 마우스 HER3에 결합되는 결과를 도시한 도면. A. 인간 및 마우스 HER3의 도메인 I 내지 II의 아미노산 서열 정렬(aa 20-239, 헤레귤린-결합 도메인). 청색 잔기는 아미노산 차이를 나타낸다. B. 인간과 마우스 HER3(1B2E; 셀 시그널링 테크놀로지즈(Cell Signaling Technologies)) 둘 다와 상호작용하는 항-HER3 항체를 이용하는 ELISA에 의해 검출된 상대적 HER3 수준(침투성 없음). C. 4T1 마우스 유방 종양 세포에 대한 HerPBK10의 결합. N=3. *, HerPBK10 단독에 비해 p<0.05.
도 14는 인간 HER2+와 HER2- 종양 세포 상에서 HerMn 독성에 대한 데이터를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 15는 HerMn 세포독성의 메커니즘을 나타내는 사진을 도시한 도면. A. MDA-MB-435 세포에서 HerMn에 의한 미토콘드리아 막 퍼텐셜의 감소를 나타내는 공초점 형광 영상. B. HerMn에 의한 액틴(적색) 및 튜불린(녹색)의 초산화물-매개 붕괴를 나타내는 공초점 형광 영상.
도 16은 S2Ga가 TSPO와 상호작용한다는 데이터를 도시한 도면. A 내지 B. 흡광도 및 형광 스펙트럼을 측정함으로써 TSPO-결합 콜롤의 존재에서 잔류물을 평가하였다. C 내지 D. 인시추로 TSPO와의 HerGa 상호작용 증거. C에서 사용한 녹색 형광 JC-1 염료는 미토콘드리아 내로 축적될 때 적색 형광을 낸다. D는 C에서의 적색 형광의 정량화이다. *, p<0.05.
도 17은 종양 보유 마우스에서 생체 내 분포를 도시한 도면. 꼬리 정맥 주사 후에 알렉사680(Alexa680)-표지된 HerMn, 트라스투주맙(Tz) 및 BSA(12n㏖ ea)의 제노겐 영상화 및 정량화. 그래프는 평균 형광-/+SEM을 나타낸다.
도 18은 HerMn의 치료 효능에 대한 데이터를 도시한 도면. A. 6연속일 동안 HerMn 또는 S2Mn(5n㏖ 콜롤/주사) 1회/일의 매일의 IV(꼬리 정맥을 통해) 주사를 받은 암컷 누드 마우스에서의 HER2+ MDA-MB-435 종양 성장. HerMn과 동일한 농도로 식염수 또는 HerPBK10을 받은 대조군. 치료를 대략 200㎣ 평균 종양 용적에서 시작한다. 종양 용적을 시약의 주사 전에(제1일), 주사 동안(제3일) 및 주사 후에(제8일, 제15일 및 제22일)에 측정하였다. N=8 내지 10 종양/그룹. *p<0.05(일원 ANOVA). B. 2일(실선) 또는 5일(파선) 동안 HerMn, S2Mn, HerPBK10 또는 독소루비신(Dox)에 대한 노출 동안의 인간 CDC 생존도. 3회의 별도 실험으로부터 농도 당 N=3.
도 19는 종양이 없는 마우스에서의 HerPBK10의 조직 분포를 나타낸다.
정의:
편의를 위해, 본 명세서, 실시예 및 첨부하는 청구범위에서 사용되는 특정 용어를 여기에 수집한다. 달리 언급되지 않거나 또는 내용으로부터 내포되지 않는 한, 다음의 용어 및 어구는 이하에 제공된 의미를 포함한다. 달리 명확하게 언급되거나, 또는 내용으로부터 분명하게 되지 않는 한, 이하의 용어 및 어구는 그 용어 또는 어구가 그것이 속하는 분야에서 획득되었다는 것을 의미하는 것을 제외하지 않는다. 정의는 특정 실시형태를 설명하는 것을 보조하기 위해 제공되며, 청구된 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는데, 본 발명의 범주는 청구범위에 의해서만 제한되기 때문이다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
"유리한 결과"는 질환 병태의 중증도를 줄이거나 완화시키는 것, 질환 병태가 악화되는 것을 예방하는 것, 질환 병태를 치유하는 것, 질환 병태가 진행되는 것을 예방하는 것, 질환 병태가 진행될 환자의 기회를 저하시키는 것 및 환자의 수명 또는 기대수명을 연장시키는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 질환 병태는 암이다. 일부 실시형태에서, 질환 병태는 자가면역 질환이다.
"암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에서의 생리적 병태를 지칭하거나 또는 설명한다. 암의 예는 백혈병, 골수종, B-세포 림프종(호지킨 림프종 및/또는 비호지킨 림프종), 뇌암, 유방암, 결장직장암, 폐암, 간세포암, 신장암, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 갑상선암, 신세포암, 암종, 흑색종, 두경부암, 뇌암, 전립선암, 안드로겐-의존성 전립선암 및 안드로겐-독립성 전립선암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "화학치료 약물" 또는 "화학치료제"는 알부민-결합 파클리탁셀(nab-파클리탁셀), 악티노마이신, 알리트레티노인, 올트랜스 레티노산, 아자싸이티딘, 아자티오프린, 베바시주맙, 벡사토텐, 블레오마이신, 보르테조밉, 카보플라틴, 카페시타빈, 세툭시맙, 시스플라틴, 클로람뷰실, 사이클로포스파마이드, 시타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에피루비신, 에포틸론, 에를로티닙, 에토포사이드, 플루오로유라실, 게피티닙, 젬시타빈, 하이드록시유레아, 이다루비신, 이마티닙, 이플리무맙, 이리노테칸, 메클로르에타민, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파니투맙, 페메트렉세드, 리툭시맙, 타플루포사이드, 네티포사이드, 티오구아닌, 토포테칸, 트레티노인, 발루비신, 베무라페닙, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 보리노스타트, 로미뎁신, 5-플루오로유라실(5-FU), 6-머캅토퓨린(6-MP), 클라드리빈, 클로파라빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 펜토스타틴, 미토마이신, 익사베필론, 에스트라무스틴 또는 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 암을 치료하기 위해 사용되는 약물을 지칭한다.
"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"는 진단, 예후 또는 치료법이 요망되는 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 의미한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암을 가진다. 일부 실시형태에서, 대상체는 대상체 생애의 일정 시점에 암을 가진다. 다양한 실시형태에서, 대상체의 암은 관해 중에 있고, 재발성이거나 또는 비재발성이다.
본 명세서에서 사용되는 "포유류"는 인간, 가축 동물, 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물, 반려 동물, 예컨대 개, 고양이, 기닉픽, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소; 영장류, 예컨대 유인원, 원숭이, 오랑우탄 및 침팬지; 갯과 동물, 개 및 늑대; 고양잇과 동물, 예컨대 고양이, 사자 및 호랑이; 말과 동물, 예컨대 말, 당나귀 및 얼룩말; 식품 동물, 예컨대 젖소, 돼지 및 양; 유제류, 예컨대 사슴 및 기린; 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 및 기닉픽 등을 포함하는 포유류강의 임의의 구성원을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 포유류는 인간 대상체이다. 상기 용어는 특정 연령 또는 성별을 의미하지 않는다. 따라서, 남성이든 여성이든, 성인 및 신생아 대상체뿐만 아니라 태아가 본 용어의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "치료", "치료하는", "치료법" 또는 "치료적"은 치료적 치료와 예방적 또는 방지적 측정을 둘 다 지칭하되, 표적화된 예방적 병태를 예방 또는 늦추거나(줄이거나), 병리적 병태를 예방하거나, 유리한 결과를 추구하거나 또는 얻거나 또는 치료가 궁극적으로 성공적이지 않더라도 병태가 발생될 개체의 기회를 저하시키는 것을 목적으로 한다. 치료가 필요한 대상은 이미 병태를 지니고 있는 대상뿐만 아니라 병태가 생기기 쉬운 대상 또는 병태가 예방되어야 할 대상을 포함한다. 특정 절차 또는 투여는 투여 후에 대상체가 더 괜찮다고 느끼지 않더라도 치료적인 것으로 고려된다. 따라서, 대상체의 질환 상태의 임의의 개선 또는 질환 진행의 임의의 늦춤은 치료적인 것으로 고려된다. 암치료의 예는 적극적 감시, 관찰, 수술적 개입, 화학치료법, 면역치료법, 방사선 치료법(예컨대 외부 방사선 조사, 정위 방사선수술(감마 나이프) 및 분할 정위 방사선 치료법(fractionated stereotactic radiotherapy: FSR)), 중점 치료, 전신 치료법, 백신 치료법, 바이러스 치료법, 분자 표적 치료법 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "종양"은 악성이든 또는 양성이든 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "치료제"는, 예를 들어, 질환의 효과를 치료, 저해, 예방, 완화시키고/시키거나, 질환의 중증도를 감소시키고/시키거나, 질환이 진행될 가능성을 감소시키고/시키거나, 질환의 진행을 늦추고/늦추거나 질환을 치유하기 위해 사용되는 제제를 지칭한다. 치료제에 의해 표적화된 질환은 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 생식 세포 종양, 아세포종, 다양한 면역 세포 상에서 발현된 항원 및 다양한 혈액학적 질환, 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환과 관련된 세포 상에서 발현된 항원을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시내용의 관련하여 "약" 값은 개시내용이 열거된 값 ±25%, 또는 대안적으로 열거된 값 ±15%, 또는 대안적으로 열거된 값 ± 10%, 또는 대안적으로 열거된 값 ±5%를 포함한다는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, "약 50개의 아미노산"은 50개±25% 아미노산(즉, 37 내지 63개 아미노산의 범위), 또는 대안적으로 50개±15% 아미노산(즉, 42 내지 58개 아미노산의 범위), 또는 대안적으로 50개±10% 아미노산(즉, 45 내지 55개 아미노산의 범위), 또는 대안적으로 50개±5% 아미노산(즉, 47 내지 53개 아미노산의 범위)를 의미한다.
약물 전달 분자
본 명세서에서 약물 전달 분자가 기재된다. 약물 전달 분자는 세포 표면 분자를 표적화하는 리간드, 막 관통 도메인 및 페이로드 결합 도메인을 포함한다. 약물 전달 분자 내 리간드는 분자를 표적 세포, 예컨대 암세포에 전달한다. 막 관통 도메인은 표적 세포의 사이토졸 침투를 매개한다. 페이로드 결합 도메인은 치료제와 복합체를 형성한다. 치료제와의 복합체에서 약물 전달 분자는 치료제를 표적 세포, 예컨대 암세포에 전달한다. 다양한 실시형태에서, 암세포는 백혈병, 골수종, B-세포 림프종(호지킨 림프종 및/또는 비호지킨 림프종), 뇌암, 유방암, 결장직장암, 폐암, 간세포암, 신장암, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 갑상선암, 신세포암, 암종, 흑색종, 두경부암, 뇌암, 전립선암, 안드로겐-의존성 전립선암 및 안드로겐-독립성 전립선암 중 임의의 하나 이상이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 약물 전달 분자는 직경이 약 5㎚ 내지 약 50㎚인 나노입자를 형성한다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 크기가 약 10 내지 약 30㎚이다. 이어서, 페이로드, 즉, 치료제는 나노입자에 결합된다. 일 실시형태에서, 나노입자는 금속화된 콜롤, 예를 들어 망간(Mn), 철(Fe) 또는 갈륨(Ga) 콜롤을 포함한다. 다른 실시형태에서, 나노입자는 단백질 또는 단백질 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 나노입자에 대한 치료제의 결합은 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 수소결합 및 공유결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 과정을 통한다. 일단 나노입자-치료제 조합물이 세포에 유입되면, 나노입자와 치료제의 결합을 파괴하는 세포 내의 조건에 기인하여, 또는 둘 사이의 공유 결합이 효소에 의해 가수분해되기 때문에, 나노입자와 치료제 사이의 결합은 파괴된다.
일부 실시형태에서, 세포 표면 분자는 감소 또는 제거된 세포자멸사를 야기하는 신호 전달 경로에 연루된 수용체이다. 본 명세서에 기재된 약물 전달 분자 내 리간드에 의해 표적화될 수 있는 세포 표면 분자의 예는 4-1BB, 5T4, 선암종 항원, 알파-태아단백질, BAFF, B-림프종 세포, C242 항원, CA-125, 탄산무수화효소 9(CA-IX), c-MET, CCR4, CD152, CD19, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23(IgE 수용체), CD28, CD30(TNFRSF8), CD33, CD4, CD40, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CEA, CNT0888, CTLA-4, DR5, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, 피브로넥틴 외부 도메인-B, 엽산 수용체 1, GD2, GD3 강글리오사이드, 당단백질 75, GPNMB, HER2/neu, 간세포 성장인자(HGF), 인간 산란 인자 수용체 키나제, IGF-1 수용체, IGF-I, IgG1, L1-CAM, IL-13, IL-6, 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체, 인테그린 α5β1, 인테그린 αvβ3, MORAb-009, MS4A1, MUC1, 뮤신 CanAg, N-글리콜릴뉴라민산, NPC-1C, PDGF-R α, PDL192, 포스파티딜세린, 전립선 암종 세포, RANKL, RON, ROR1, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, 테나신 C, TGF 베타 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 종양 항원 CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, 비멘틴 또는 이들의 조합물 중 임의의 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 암에 특이적인 다른 표적 분자 또는 입자는 당업자에게 명확할 것이고, 본 발명의 대안의 실시형태와 관련하여 사용될 수 있다. 실시형태에서, 리간드는 암세포에 대한 c-MET를 표적화한다. 실시형태에서, 리간드는 HGF이다. 실시형태에서, 리간드는 인터날린 B 또는 이의 단편 또는 이의 변이체이다. 다른 실시형태에서, 리간드는 박테리아 인바신(Inv) 단백질이다.
따라서, 일부 실시형태에서, 리간드는 천연 결합 상대, 또는 세포 표면 분자에 결합될 수 있는 분자이다. 일부 실시형태에서, 리간드는 단백질, 단백질 단편, 폴리펩타이드 또는 올리고펩타이드이다. 다른 실시형태에서, 리간드는 항체 또는 항체 단편이다. 특정 다른 실시형태에서, 리간드는 세포 표면 분자에 결합되는 작은 유기 분자이다. 일부 실시형태에서, 작은 유기 분자는 표적 세포 표면 분자에 대한 천연 결합 상대의 구조를 모방하고 표적 세포 표면 분자에 경쟁적으로 결합하는 한편, 다른 실시형태에서, 작은 유기 분자는 표적 세포 표면 분자에 비경쟁적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 막 관통 도메인은 단백질, 단백질 단편, 폴리펩타이드 또는 올리고펩타이드이다. 특정 실시형태에서, 막 관통 도메인은 약 3 내지 약 35개의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드이다.
실시형태에서, 막 관통 도메인은 아데노바이러스로부터의 펩톤 베이스 단백질 또는 이의 단편이다. 펩톤 베이스 단백질은 감염 초기 단계 동안 정상적으로 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 혈청형 5)의 세포-결합, 유입 및 사이토졸 침투를 매개한다. 펩톤 베이스는 RGD 모티프(Arg-Gly-Asp)를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "PB"는 펩톤 베이스 세그먼트를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 페이로드 결합 도메인은 단백질, 단백질 단편, 폴리펩타이드 또는 올리고펩타이드이다. 특정 실시형태에서, 막 관통 도메인은 약 3 내지 약 35개의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드이다.
일 실시형태에서, 페이로드 결합 도메인은 "K10"으로서도 지칭되는 데카라이신 모티프이다. 데카라이신 모티프는 10개의 라이신 잔기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 페이로드 결합 도메인에 결합하는 페이로드는 핵산이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA), 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA), 리보핵산(RNA), 전령 리보핵산(mRNA), 전달 리보핵산(tRNA), 리보좀 리보핵산(rRNA), 짧은 간섭 리보핵산(siRNA), 단일 가닥 리보핵산(ssRNA) 및 올리고뉴클레오타이드(단일 가닥이든 또는 이중 가닥이든)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 페이로드에 대한 페이로드 결합 도메인의 결합은 정전기적 상호작용, 친전자성 상호작용, 친수성 상호작용(반데르 발스힘), 수소결합 또는 공유 결합으로 이루어진 군으로부터 선택된 과정을 통한다.
다양한 실시형태에서, 약물 전달 분자 내 리간드는 암세포 상의 세포 표면 분자를 표적화한다. 실시형태에서, 세포 표면 분자는 암세포 상의 수용체이다.
실시형태에서, 본 명세서에서 세포 표면 분자를 표적화하는 리간드, 막 관통 도메인 및 페이로드 결합 도메인을 포함하는 약물 전달 분자가 기재되되, 리간드는 인터날린 B(In1B) 또는 이의 단편 또는 이의 변이체이고, 막 관통 도메인은 펩톤 베이스 단백질 또는 이의 단편이며, 페이로드 결합 도메인은 데카라이신 모티프이다. 인터날린 B는 세포 표면 단백질 c-Met를 표적화한다. c-Met의 천연 리간드는 간세포 성장인자(HGF)이다. HGF는 사량체를 형성하고, 이황화 결합 형성을 필요로 한다. 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)로부터 얻은 인터날린 B는 또한 c-MET를 인식하고 결합하지만, 사량체화하지 않거나 이황화 결합 형성을 필요로 하지 않는다. 인터날린 B는 융합 단백질로서 발현될 수 있고, 융합 단백질은 또한 c-Met에 결합한다. In1B는 HGF와 경쟁하지 않는다. 일부 실시형태에서, In1B, 펩톤 베이스 단백질 및 데카라이신 모티프를 포함하는 약물 전달 분자는 세포독성제, 예컨대 콜롤 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 콜롤 화합물은 포르피린-유사 분자이다. 이들 화합물은 다수의 상이한 금속(예컨대 철, 갈륨, 망간 등)과 킬레이트를 만들 수 있고, 운반 단백질에 비공유적으로 결합하며, 세포독성이고, 운반 단백질 없이 세포에 침투하지 않는다.
다른 실시형태에서, 리간드는 세포 표면 분자 CD4, 또는 대안적으로, CD19 또는 CD20을 표적화한다. 추가 실시형태에서, 리간드는 인간 상피 성장 인자 수용체(HER), 예를 들어 HER2 또는 HER3 중 하나를 표적화한다. 다른 실시형태에서, 리간드는 인테그린을 표적화한다.
다양한 실시형태에서, 약물 전달 분자는 치료제를 추가로 포함한다. 치료제는 페이로드 결합 도메인과 함께 복합체를 형성한다. 다양한 실시형태에서, 치료제는 알킬화제, 항대사물질, 항종양 항생제, 유사분열 저해제, 코르티코스테로이드, 세포독성제 또는 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 치료제와 페이로드 결합 도메인 사이의 복합체는 공유 또는 비공유일 수 있다. 일부 실시형태에서, 비공유 복합체는 반데르발스 힘, 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성/친수성 상호작용 중 하나 이상을 통할 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료제와 페이로드 결합 도메인 사이의 상호작용은 링커에 의해 매개될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료제는 독소루비신 또는 콜롤 화합물이다.
또한 본 명세서에서 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법이 기재된다. 상기 방법은 치료가 필요한 대상체를 동정하는 단계 및 약물 전달 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 단계 및 암을 치료하기 위해서 대상체에게 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 약물 전달 분자는 세포 표면 상의 수용체를 표적화하는 리간드, 막 관통 도메인 및 페이로드 결합 도메인을 포함하고 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료제를 추가로 포함한다.
또한 본 명세서에서 암 진행의 저해가 필요한 대상체에서 암 진행을 저해하는 방법이 기재된다. 상기 방법은 암 진행의 저해가 필요한 대상체를 동정하는 단계 및 약물 전달 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 단계 및 암의 진행을 저해하기 위해서 대상체에게 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 약물 전달 분자는 세포 표면 상의 수용체를 표적화하는 리간드, 막 관통 도메인 및 페이로드 결합 도메인을 포함하고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료제를 추가로 포함한다.
또한 본 명세서에서 암 전이의 예방이 필요한 대상체에서 암 전이를 예방하는 방법이 기재된다. 상기 방법은 암 전이의 예방이 필요한 대상체를 동정하는 단계 및 약물 전달 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 단계 및 암 전이를 예방하기 위해 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 약물 전달 분자는 세포 표면 상의 수용체를 표적화하는 리간드, 막 관통 도메인 및 페이로드 결합 도메인을 포함하고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료제를 추가로 포함한다.
또한 본 명세서에서 약물 내성 암(예를 들어, EGFR 타이로신 키나제 저해제에 내성인 암)의 치료, 저해 또는 전이의 예방을 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 치료가 필요한 대상체를 동정하는 단계 및 약물 전달 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 단계 및 약물 내성 암의 치료, 저해 또는 전이의 예방을 위한 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 약물 전달 분자는 세포 표면 상의 수용체를 표적화하는 리간드, 막 관통 도메인 및 페이로드 결합 도메인을 포함하고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료제를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 약물 내성 암은 c-Met, HER2, CD4 및 CD20으로 이루어진 군으러부터 선택되는 수용체를 과발현시킨다.
또한 본 명세서에서 치료 화합물을 뇌에 전달하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 이러한 전달이 필요한 대상체를 동정하는 단계 및 약물 전달 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 단계 및 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 약물 전달 분자는 세포 표면 상의 수용체를 표적화하는 리간드, 막 관통 도메인 및 페이로드 결합 도메인을 포함하고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료제를 추가로 포함한다. 본 명세서에 기재된 조성물은 놀랍게도 혈액-뇌 장벽을 가로지르며, 뇌에서 세포에 페이로드를 전달한다. 따라서, 이들 조성물은 독특하게도 뇌에서의 암, 예를 들어 전이암의 치료에 적합하다.
본 명세서에 기재된 치료 방법의 다양한 양태에서, 조성물 중의 약물 전달 분자는 세포 표면 상의 수용체를 표적화하는 리간드, 막 관통 도메인 및 페이로드 결합 도메인을 포함하되, 리간드는 인터날린 B(In1B) 또는 이의 단편 또는 이의 변이체이고, 막 관통 도메인은 펩톤 베이스 단백질 또는 이의 단편이며, 페이로드 결합 도메인은 데카라이신 모티프이다. 약물 전달 분자는 치료제, 예컨대 독소루비신 또는 콜롤 화합물을 추가로 포함한다.
치료법
본 발명의 다른 양태는 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료제와 복합체화된 약물 전달 분자를 포함하는 유효량의 조성물을 투여함으로써 암(예를 들어, 백혈병, 골수종, B-세포 림프종(호지킨 림프종 및/또는 비호지킨 림프종), 뇌암, 유방암, 결장직장암, 폐암, 간세포암, 신장암, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 갑상선암, 신세포암, 암종, 흑색종, 두경부암, 뇌암, 전립선암, 안드로겐-의존성 전립선암 및 안드로겐-독립성 전립선암)을 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 치료제는 특정 유형의 암을 치료하는데 적용될 수 있는 임의의 화학치료제일 수 있다. 치료제는 유기 분자, 생물학적 분자(예를 들어, 펩타이드 또는 핵산), 또는 이들의 조합물일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 치료제는 알킬화제, 항대사물질, 항종양 항생제, 유사분열 저해제, 코르티코스테로이드, 세포독성제 또는 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 실시형태에서, 치료제는 콜롤 화합물이다. 실시형태에서, 치료제는 siRNA 분자이다.
일부 실시형태에서, 치료제와 복합체화된 유효량의 약물 전달 분자를 포함하는 조성물은 하나 이상의 화학치료제, 예컨대 본 명세서에 제시된 것과 함께 투여된다. 유효량의 조성물 및 화학치료제는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 투여는 전신이다. 일부 실시형태에서, 투여는 국소이다. 대상체에 조성물을 투여하기 위한 다양한 수단은 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 모든 실시형태의 일부 양태에서, 조성물은 눈, 경구, 비경구, 정맥내, 근육내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 폐, 피부, 국소 또는 주사 투여를 포함하는 경로를 통해 투여된다.
암을 치료하기 위해 치료제와 복합체화되는 유효량의 약물 전달 분자를 포함하는 조성물과 함께 사용될 수 있는 추가적인 치료법은 수술, 방사선, 면역치료법, 백신 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가적인 치료법은 암(예를 들어, 흑색종 또는 난소 암종)을 치료하기 위해 치료제와 복합체화되는 유효량의 약물 전달 분자를 포함하는 유효량의 조성물을 포함하는 치료법과 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학치료제는 세포독성 항생제, 항대사물질, 항-유사분열제, 알킬화제, 비소 화합물, DNA 토포아이소머라제 저해제, 탁산, 뉴클레오사이드 유사체, 식물 알칼로이드 및 독소; 및 이의 합성 유도체 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 예시적인 화합물은 알킬화제: 트레오설판 및 트로포스파마이드; 식물 알칼로이드: 빈블라스틴, 파클리탁셀, 도세탁셀; DNA 토포아이소머라제 저해제: 독소루비신, 에피루비신, 에토포사이드, 캄프토테신, 토포테칸, 이리노테칸, 네티포사이드, 크리스나톨 및 미토마이신; 항-엽산: 메토트렉세이트, 마이코페놀산 및 하이드록시유레아; 피리미딘 유사체: 5-플루오로유라실, 독시플루리딘, 및 사이토신 아라비노사이드; 퓨린 유사체: 머캅토퓨린 및 티오구아닌; DNA 항대사물질: 2'-데옥시-5-플루오로유리딘, 아피디콜린 글리시네이트 및 피라졸로이미다졸; 및 항유사분열제: 할리콘드린, 콜히친 및 리족신을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 하나 이상의 화학치료제(예를 들어, FLAG, CHOP)를 포함하는 조성물이 또한 사용될 수 있다. FLAG는 플루다라빈, 사이토신 아라비노사이드(Ara-C) 및 G-CSF를 포함한다. CHOP는 사이클로포스파마이드, 빈크리스틴, 독소루비신 및 프레드니손을 포함한다. 다른 실시형태에서, PARP(예를 들어, PARP-1 및/또는 PARP-2) 저해제가 사용되며, 이러한 저해제는 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, 올라파립, ABT-888, BSI-201, BGP-15(N-진 리서치 래버러토리즈 인코포레이티드(N-Gene Research Laboratories, Inc.)); INO-1001(이노텍 파마슈티칼스 인코포레이티드(Inotek Pharmaceuticals Inc.)); PJ34(Soriano et al., 2001 ; Pacher et al. , 2002b); 3-아미노벤즈아마이드(트레비겐(Trevigen)); 4-아미노-1,8-나프탈이미드; (트레비겐); 6(5H)-페난트리디논(트레비겐); 벤즈아마이드(미국 특허 Re. 36,397호); 및 NU1025(Bowman et al.).
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료법은, 예를 들어, 방사선 치료법을 포함한다. 방사선 치료법에서 사용되는 방사선은 이온화 방사선일 수 있다. 방사선 치료법은 또한 감마선, X-선 또는 양성자 빔일 수 있다. 방사선 치료법의 예는 외부빔 방사선 치료법, 방사성 동위원소(I-125, 팔라듐, 이리듐)의 간질내 착상, 방사성 동위원소, 예컨대 스트론튬-89, 흉부 방사선 치료법, 복강내 P-32 방사선 치료법 및/또는 전체 복부 및 골반 방사선 치료법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 방사선 치료법의 일반적 개요에 대해, 문헌[Hellman, Chapter 16: Principles of Cancer Management: Radiation Therapy, 6th edition, 2001, DeVita et al., eds., J. B. Lippencott Company, Philadelphia] 참조. 방사선 치료법은 외부빔 방사선 또는 원격치료로서 투여될 수 있되, 방사선은 원거리 선원으로부터 유도된다. 방사선 치료는 또한 내부 치료법 또는 근접치료법으로서 투여될 수 있되, 방사선 선원은 암세포 또는 종양 덩어리에 가깝게 신체 내부에 위치된다. 또한 광감작제, 예컨대 헤마토포르피린 및 그의 유도체, 베르토포르핀(BPD-MA), 프탈로사이아닌, 광감작제 Pc4, 데메톡시-하이포크렐린 A; 및 2BA-2-DMHA의 투여를 포함하는 광역동 치료법을 사용이 포함된다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료법은, 예를 들어, 면역치료법을 포함한다. 면역치료법은, 예를 들어, 암 백신 및/또는 민감화된 항원 제시 세포의 사용을 포함할 수 있다. 면역치료법은 암 항원 또는 질환 항원에 관련된 사전형성된 투여(예를 들어, 선택적으로 화학치료제 또는 독소에, 종양 항원에 연관된 단클론성 항체의 투여)에 의해 달성되는, 숙주의 단기간 보호를 위한 수동 면역을 수반할 수 있다. 면역치료법은 또한 암 세포주의 세포독성 림프구-인식 에피토프를 이용하는 것에 중점을 둘 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료법은, 예를 들어, 호르몬 치료법을 포함하고, 호르몬 치료 처리는, 예를 들어, 호르몬 효현제, 호르몬 길항제(예를 들어, 플루타마이드, 비칼루타마이드, 타목시펜, 랄록시펜, 류플롤라이드 아세테이트(LUPRON), LH-RH 길항제), 호르몬 생합성 및 가공의 저해제, 및 스테로이드(예를 들어, 덱사메타손, 레티노이드, 델토이드, 베타메타손, 코티솔, 코티손, 프레드니손, 데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 미네랄로코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 프로게스틴), 비타민 A 유도체(예를 들어, 올트랜스 레티노산(ATRA)); 비타민 D3 유사체; 안티게스타겐(예를 들어, 미페프리스톤, 오나프리스톤) 또는 항안드로겐(예를 들어, 사이프로테론 아세테이트)를 포함할 수 있다.
항암 치료법에 의한 치료의 지속 및/또는 용량은 특정 항암제 또는 이들의 조합물에 따라 다를 수 있다. 특정 암 치료제에 대한 적절한 치료 시간은 당업자에 의해 인식될 것이다. 본 발명은 각각의 암 치료제에 대한 최적의 치료 스케줄의 계속된 평가를 상정하며, 여기서 본 발명의 방법에 의해 결정되는 바와 같은 대상체의 암의 유전자 서명은 최적의 치료 용량 및 스케줄을 결정하는 인자이다.
다양한 실시형태에서, 항암 치료법의 예측된 효능이 결정된 대상체는 포유류(예를 들어, 마우스, 래트, 영장류, 비인간 포유류, 가축, 예컨대 개, 고양이, 젖소, 말)이고, 바람직하게는 인간이다. 본 발명의 방법의 다른 실시형태에서, 대상체는 화학치료법 또는 방사선 치료법을 겪지 않는다. 대안의 실시형태에서, 대상체는 화학치료법 또는 방사선 치료법(예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴 및/또는 탁산에 의함)을 겪었다. 관련된 실시형태에서, 대상체는 종의 대상에 의해 일반적으로 또는 평균적으로 접하는 것 초과의 방사선 또는 화학독성제 수준에 노출된 적이 없다. 특정 실시형태에서, 대상체는 암성 또는 전암성 조직을 제거하기 위해 수술을 받았다. 다른 실시형태에서, 암성 조직은 제거되지 않았고, 예를 들어 암성 조직은 신체의 수술로 치료할 수 없는 영역에, 예컨대 생명에 필수적인 조직에, 또는 수술 절차가 환자에게 상당한 위험을 야기하는 영역에 위치될 수 있거나, 또는 예를 들어, 대상체는 암성 조직의 제거 전에 항암 치료법이 제공된다.
약제학적 조성물
다양한 실시형태에서, 본 발명은 암(예를 들어, 백혈병, 골수종, B-세포 림프종(호지킨 림프종 및/또는 비호지킨 림프종), 뇌암, 유방암, 결장직장암, 폐암, 간세포암, 신장암, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 갑상선암, 신세포암, 암종, 흑색종, 두경부암, 뇌암, 전립선암, 안드로겐-의존성 전립선암 및 안드로겐-독립성 전립선암)을 치료하기 위해 본 명세서에 기재된 치료적 유효량의 약물 전달 분자와 함께 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 다양한 실시형태에서, 약물 전달 분자는 세포 표면 상의 수용체를 표적화하는 리간드, 막 관통 도메인 및 페이로드 결합 도메인을 포함한다. 약물 전달 분자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 약물 전달 분자와 복합체화되는 치료제를 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 약물 전달 분자는 치료제를 표적 암세포에 전달한다.
"약제학적으로 허용가능한 부형제"는 일반적으로 안전한, 비독성의 그리고 바람직한 약제학적 조성물을 제조하는데 유용한 부형제를 의미하며, 수의학적 용도뿐만 아니라 인간 약제학적 용도를 위해 허용가능한 부형제를 포함한다. 이러한 부형제는 고체, 액체, 반고체, 또는 에어로졸 조성물의 경우에 기체일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 임의의 투여 경로를 통한 전달을 위해 제형화될 수 있다. "투여 경로"는 에어로졸, 비강, 경구, 경점막, 경피, 비경구 또는 장을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 투여 경로를 지칭할 수 있다. "비경구"는 안와내, 안내, 주입, 동맥내, 관절내, 심장내, 진피내, 근육내, 복강내, 폐내, 척수내, 흉골내, 척추강내, 자궁내, 정맥내, 지주막하, 피막하, 피하, 경점막 또는 경기관을 포함하는 주사와 일반적으로 관련된 투여경로를 지칭한다. 비경구 경로를 통해, 조성물은 주입용 또는 주사용 또는 동결건조 형태로서 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 비경구 경로를 통해, 조성물은 주입용 또는 주사용 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 장용 경로를 통해, 약제학적 조성물은 정제, 겔 캡슐, 당코팅 정제, 시럽, 현탁액, 용액, 분말, 과립, 에멀전, 마이크로스피어 또는 나노스피어 또는 지질 소수포 또는 제어 방출을 허용하는 중합체 소수포의 형태일 수 있다. 전형적으로, 조성물은 정맥내 또는 복강내 중 하나로 주사에 의해 투여된다. 이들 투여를 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 또한 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 하나의 조직, 기관 또는 신체의 부분으로부터 다른 조직, 기관 또는 신체의 일부까지 관심 대상의 화합물을 운반하거나 또는 수송하는데 수반되는 약제학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 지칭한다. 예를 들어, 담체는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질 또는 이들의 조합물일 수 있다. 담체의 각각의 구성성분은 "약제학적으로 허용가능"하여야 하며, 즉, 제형의 다른 성분과 양립가능하여야 한다. 또한 그것이 접촉될 수 있는 임의의 조직 또는 기관과 접촉 시 사용에 적합하여야 하는데, 이는 그것이 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성 또는 그의 치료적 이점보다 지나치게 더 큰 임의의 다른 합병증의 위험을 수반하지 않아야 한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 또한 경구 투여를 위한 에멀전 또는 시럽으로 캡슐화, 정제 또는 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 고체 또는 액체 담체는 조성물을 향상 또는 안정화시키기 위해, 또는 조성물의 제조를 용이하게 하기 위해 첨가될 수 있다. 액체 담체는 시럽, 땅콩유, 올리브유, 글리세린, 식염수, 알코올 및 물을 포함한다. 고체 담체는 전분, 락토스, 황산칼슘, 2수화물, 백토, 스테아르산마그네슘 또는 스테아르산, 탈크, 펙틴, 아카시아, 한천 또는 젤라틴을 포함한다. 담체는 또한 단독으로 또는 왁스와 함께 지속 방출 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 다이스테아레이트를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 정제 형태에 대해 필요하다면 분쇄, 혼합, 과립화 및 압축; 또는 경질 젤라틴 캡슐 형태에 대해 분쇄, 혼합 및 충전을 수반하는 통상적인 약학 기법에 따라 제조된다. 액체 담체가 사용될 때, 제제는 시럽, 엘릭시르, 에멀전 또는 수성 또는 비수성 현탁액의 형태일 것이다. 이러한 액체 제형은 직접적으로 경구로 투여되거나 또는 연질 젤라틴 캡슐에 충전될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 치료적 유효량으로 전달될 수 있다. 정확한 치료적 유효량은 주어진 대상체에서 치료 효능에 대해 가장 효과적인 결과를 수득하는 조성물의 해당량이다. 이 양은 치료 화합물의 특징(활성, 약동학, 약력학 및 생체활성을 포함), 대상체의 생리적 조건(연령, 성별, 질환 유형 및 병기, 일반적 신체 건강상태, 주어진 투약량에 대한 반응 및 의약의 유형을 포함함), 제형 내 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 담체들의 특성, 및 투여 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다수의 인자에 따라서 다를 것이다. 임상 및 약리학 분야에서 당업자는, 예를 들어 화합물의 투여에 대한 대상체의 반응을 모니터링하고 그에 따라 투약량을 조절함으로써 일상적인 실험을 통해 치료적 유효량을 결정할 것이다. 추가적인 안내를 위해, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro ed. 20th edition, Williams & Wilkins PA, USA) (2000)] 참조.
환자에 대한 투여 전에, 제형은 제제에 첨가될 수 있다. 액체 제형이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 이들 제형은 오일, 중합체, 비타민, 탄수화물, 아미노산, 염, 완충제, 알부민, 계면활성제, 증량제 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
탄수화물 제형은 당 또는 당 알코올, 예컨대 단당류, 이당류 또는 다당류 또는 수용성 글루칸을 포함한다. 당류 또는 글루칸은 프럭토스, 덱스트로스, 락토스, 글루코스, 만노스, 솔보스, 자일로스, 말토스, 수크로스, 덱스트란, 풀루란, 덱스트린, 알파 및 베타 사이클로덱스트린, 가용성 전분, 하이드록시에틸 전분 및 카복시메틸셀룰로스 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. "당 알코올"은 --OH 기를 갖는 C4 내지 C8 탄화수소로서 정의되고, 갈락티톨, 이노시톨, 만니톨, 자일리톨, 솔비톨, 글리세롤 및 아라비톨을 포함한다. 상기 언급된 이들 당 또는 당 알코올은 개개로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 당 또는 당 알코올이 수성 제제에서 가용성이라면 사용되는 양에 대한 고정된 제한은 없다. 일 실시형태에서, 당 또는 당 알코올 농도는 1.0w/v% 내지 7.0w/v, 더 바람직하게는 2.0 내지 6.0w/v%이다.
아미노산 제형은 카르니틴, 알기닌 및 베타인의 좌선성(L) 형태를 포함하지만; 그러나, 다른 아미노산이 첨가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제형으로서 중합체는 평균 분자량이 2,000 내지 3,000인 폴리비닐피롤리돈(PVP), 또는 평균 분자량이 3,000 내지 5,000인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
또한 동결건조 전에 또는 재구성 후에 용액 중에서 pH 변화를 최소화하기 위해 조성물 중에서 완충제를 사용하는 것이 바람직하다. 시트르산염, 인산염, 숙신산염 및 글루탐산염 완충제 또는 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 대부분의 임의의 생리적 완충제가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 농도는 0.01 내지 0.3몰이다. 제형에 첨가될 수 있는 계면활성제는 유럽 특허 제270,799호 및 제268,110호에 나타낸다.
추가적으로, 조성물은, 예를 들어 그들의 순환 반감기를 증가시키기 위해 중합체에 대한 공유 컨쥬게이션에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 그들을 펩타이드에 부착하기 위한 바람직한 중합체 및 방법은 미국 특허 제4,766,106호; 제4,179,337호; 제4,495,285호; 및 제4,609,546호에 나타내며, 이들 모두 그들의 전문이 참고로 포함된다. 바람직한 중합체는 폴리옥시에틸화된 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. PEG는 실온에서 수중에서 가용성이고, 일부 실시형태에서, 평균 분자량이 1000 내지 40,000, 2000 내지 20,000, 또는 3,000 내지 12,000이다. 일부 실시형태에서, PEG는 적어도 하나의 하이드록시기, 예컨대 말단 하이드록시기를 가진다. 하이드록시기는 저해제 상에서 유리 아미노기와 반응하도록 활성화될 수 있다. 그러나, 반응기의 유형 및 양은 본 발명의 공유적으로 컨쥬게이팅된 PEG/항체를 달성하도록 변화될 수 있다.
또한 수용성 폴리옥시에틸화된 폴리올이 본 발명에서 유용하다. 그들은 폴리옥시에틸화된 솔비톨, 폴리옥시에틸화된 글루코스, 폴리옥시에틸화된 글리세롤(POG) 등을 포함한다. POG가 바람직하다. 한 가지 이유는 폴리옥시에틸화된 글리세롤의 글리세롤 백본은 모노-, 다이-, 트라이글리세라이드로 천연 유래의, 예를 들어 동물 및 인간에서의 동일 백본이기 때문이다. 따라서, 이 분지는 신체에서 반드시 외래 제제로 여겨지는 것은 아니다. POG는 분자량이 PEG와 동일한 범위에 있다. POG에 대한 구조는 문헌[Knauf et al., 1988, J. Bio. Chem. 263: 15064-15070]에 나타나며, POG/IL C 2 컨쥬게이트의 논의는 미국 특허 제4,766,106호에서 발견하고, 이들 둘 다 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
액체 약제학적 조성물이 제조된 후에, 이는 분해를 방지하고 멸균성을 보존하기 위해 동결건조될 수 있다. 액체 조성물을 동결건조시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 사용 직전에, 조성물은 추가적인 성분을 포함할 수 있는 멸균 희석제(예를 들어, 링거 용액, 증류수, 또는 멸균 식염수)로 재구성될 수 있다. 재구성 시, 조성물은 당업자에게 공지된 해당 방법을 이용하여 대상체에게 투여된다.
투약량 및 투여 방식은 개체에 의존할 것이다. 일반적으로, 조성물은 항체가 1㎍/㎏ 내지 20㎎/㎏, 20㎍/㎏ 내지 10㎎/㎏, 1㎎/㎏ 내지 7㎎/㎏의 용량으로 주어지도록 투여된다. 일부 실시형태에서, 이는 볼루스 투약 후 순환 수준을 10 내지 20배만큼 그리고 4 내지 6시간 동안 증가시키기 위한 볼루스 용량으로서 주어진다. 연속적 주입은 또한 볼루스 투약 후에 사용될 수 있다. 만약에 그렇다면, 항체는 5㎍/㎏/분 내지 20㎍/㎏/분, 또는 7㎍/㎏/분 내지 15㎍/㎏/분의 용량으로 주입될 수 있다.
키트
본 발명은 또한 암의 치료, 저해 및/또는 전이의 예방이 필요한 대상체에서 암의 치료, 저해 및/또는 전이의 예방을 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료제와 복합체화된 약물 전달 분자를 포함하는 조성물 및 암의 치료, 저해 및/또는 전이의 예방이 필요한 대상체에서 암의 치료, 저해 및/또는 전이의 예방을 위한 조성물의 사용을 위한 설명서를 포함한다.
키트는 본 발명의 조성물 중 적어도 하나를 포함하는 물질 또는 성분의 집합체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 상기 키트는 상기 기재한 바와 같은 치료제와 복합체화된 약물 전달 분자를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명의 키트에 구성된 구성성분의 정확한 특성은 그의 의도된 목적에 의존한다. 일 실시형태에서, 상기 키트는 특히 인간 대상체용으로 구성된다. 추가 실시형태에서, 상기 키트는 대상체, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 농장 동물, 가축 및 실험 동물을 치료하는 수의과적 적용을 위해 구성된다.
사용을 위한 설명서가 키트에 포함될 수 있다. "사용을 위한 설명서"는 전형적으로 목적으로 하는 결과를 달성하기 위해, 예컨대 대상체에서 백혈구 감소증을 치료하거나, 백혈구 감소증의 중증도를 감소시키거나, 백혈구 감소증을 저해 또는 예방하기 위해 키트의 구성성분을 이용하는데 사용될 기법을 설명하는 실재하는 표현을 포함한다. 선택적으로, 키트는 또한 다른 유용한 구성성분, 예컨대 측정 도구, 희석제, 완충제, 약제학적으로 허용가능한 담체, 주사기 또는 당업자에 의해 용이하게 인식될 다른 유용한 용품을 포함한다.
조작성 및 효용을 보존하는 임의의 편리하고 적합한 방법으로 저장되는 키트에서 조립될 물질 또는 구성성분이 실행자에게 제공될 수 있다. 예를 들어, 구성성분은 용해, 탈수 또는 동결건조 형태일 수 있고; 그들은 실온, 냉장 또는 냉동 온도로 제공될 수 있다. 구성성분은 전형적으로 적합한 패키징 물질(들)에 포함된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 어구 "패키징 물질"은 키트의 내용물, 예컨대 본 발명의 조성물 등을 수용하기 위해 사용되는 하나 이상의 물리적 구조를 지칭한다. 패키징 물질은 바람직하게는 멸균, 무 오염물질 환경을 제공하기 위해 잘 공지된 방법에 의해 구성된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 용어 "패키지"는 개개의 키트 구성성분을 수용할 수 있는 적합한 고체 기질 또는 물질, 예컨대 유리, 플라스틱, 종이, 호일 등을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 패키지는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 시알리다제 활성을 갖는 촉매적으로 활성인 항체를 함유하는 적합한 양의 본 발명의 조성물을 수용하기 위해 사용되는 보틀일 수 있다. 패키징 물질은 일반적으로 키트 및/또는 그의 구성성분의 함량 및/또는 목적을 표시하는 외부 라벨을 가진다.
실시예
다음의 실시예는 청구된 본 발명을 더 잘 설명하기 위해 제공되며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 구체적 물질이 언급되는 정도로, 이는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 당업자는 본 발명의 능력의 실행 없이 그리고 본 발명의 범주로부터 벗어나는 일 없이 동등한 수단 또는 반응물을 개발할 수 있다.
실시예 1: 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 및 합성 mRNA의 전달
합성 mRNA의 전달은 유전자 전달에 대한 개선된 대안이다. 유전자 전달 벡터는 유전자 발현을 가능하게 하기 위해 핵을 파괴하여야 하는 반면, mRNA는 단지 단백질 산물의 번역을 위해 세포질 내로의 전달을 필요로 한다. 예컨대 체세포에서 다능성을 유도하기 위한, 예를 들어 소위 야마나카(Yamanaka) 인자를 발현시키기 위한 접근이 사용된다. 전통적 "리포펙션"은 시험관내에서 mRNA의 전달에 유용할 수 있지만, 이것 및 유사한 시스템은 생체내에서 효과적이지 않다.
개시된 표적화 세포 침투 단백질인 HerPBK10은 핵산 및 생체내 약물 전달에 대해 증가된 효능을 가진다. 관련된 단백질인 PBK10을 또한 유전자 및 약물 전달을 위해 개발하였다. HerPBK10은 인간 상피 성장 인자 수용체(HER3)와의 상호작용을 통해 세포의 표적화된 결합 및 침투를 용이하게 하며, PBK10은 인테그린 상호작용을 통해 그렇게 된다.
이하에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 및 합성 mRNA의 전달을 위한 HerPBK10 및 PBK10의 효용을 입증한다.
HerPBK10은 MDA -MB-435 세포에서 표지된 올리고뉴클레오타이드를 수송한다. HerPBK10이 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 전달을 매개할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, Cy3-표지된 올리고뉴클레오타이드(50p㏖)를 실온에서 20분 동안 HerPBK10(5㎍) 또는 비교 대조군으로서 상업적 형질감염 시약인 리포펙타민 2000(미국 캘리포니아주 칼스베드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen))과 함께 0.1M 헤페스(HEPES)/옵티멤 I(Optimem I)(인비트로젠; 미국 캘리포니아주 칼스베드에 소재) 중에서 인큐베이션시켰다. 얻어진 혼합물을 HER을 발현시키는 MDA-MB-435 세포에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 15' 동안 실온에서 4% PFA 중에서 고정시키고, HerPBK10에 대한 면역형광을 위해 가공하였다. 세포를 DAPI로 대비염색하여 핵을 동정하였다. 레이카(Leica) SP2 레이저 주사 공초점 현미경을 이용하여 영상을 획득하였다. 리포펙타민-매개 흡수는 예상한 바와 같이 세포 내 올리고뉴클레오타이드 국소화를 초래하였다(도 1A). 중요하게는, HerPBK10은 HerPBK10-올리고 복합체의 결합 및 흡수 동안 올리고뉴클레오타이드와 함께 공동국소화되었는데(도 1B), 이는 HerPBK10이 올리고뉴클레오타이드의 세포 내로의 수송을 매개한다는 것을 시사한다.
PBK10은 mRNA 전달을 매개한다. 1kb GFP를 암호화하는 합성 mRNA(도 2a)를 사용하여 단백질 발현을 위해 PBK10이 세포 내로의 전달을 매개하는 능력을 시험하였다. 리포펙틴에 의해 전달된 mRNA로부터의 GFP 발현을 리포펙틴에 의해 전달된 GFP-발현 플라스미드와 비교하였다. 리포펙틴에 의해 전달될 때, mRNA는 형광 현미경 검사에 의해 검출가능한 헬라(HeLa) 세포 내 수준으로 GFP를 발현시켰다(도 2b). PBK10과 GFP를 암호화하는 합성 mRNA를 헤페스(HEPES)-완충 식염수(HBS) 중에서 실온에서 대략 20분 동안 PBK10:mRNA의 20:1 중량비로 혼합하고, 이어서, 대략 50 내지 70% 합류로 부착 헬라 세포에 첨가하였다. 따라서, PBK10은 전달을 위해 PBK10이 앞서 발생시킨 유전자 전달 복합체와 유사하게 mRNA와의 복합체를 형성하였다(도 2c).
PBK10이 전달을 매개하는 능력을 PBK10과 mRNA 사이에 만들어진 복합체의 세포 결합을 우선 평가함으로써 시험하였다. PBK10-mRNA 복합체를 수용체 결합을 촉진시키기 위해 얼음 상에서 헬라 세포 상에 인큐베이션시켰지만, 내재화하지 않았고, 그 다음에 세포를 세척하여 유리(비결합) 복합체를 제거하고, ELISA에 의해 가공하여 PBK10에 대해 1차 항체를 이용하여 세포 표면 결합 복합체를 동정하였다. 세포 표면 결합의 ELISA-기반 검출은 복합체가 세포에 결합한다(PBK10+mRNA)는 것을 나타내었다(도 2d). 세포 상에서 PBK10의 인큐베이션(mRNA 없이) 후에 세포를 또한 PBK10 단독에 대해 면역형광을 위해 가공하였다. 세포-결합 복합체(E)의 섭취를 입증하기 위해, 세포를 앞서 기재한 바와 같이 얼음 상에서 복합체와 인큐베이션시키고 나서, 세척하고, 이어서, 37℃에서 가온시켜 내재화를 촉진시켰다. 가온 후 세포를 표시한 시점에 고정시키고, PBK10에 대한 면역형광을 위해 가공하였다(녹색). 세포를 로다민 팔로이딘 및 DAPI를 이용하여 대비 염색하여 액틴(적색) 및 핵(청색)으로 각각 동정하였다. 레이카(Leica) SPE 레이저 주사 공초점 현미경을 이용하여 영상을 획득하였다. 결과는 복합체가 헬라 세포 내로의 시간 의존적 내재화를 겪었다는 것을 나타낸다(도 2e). 헬라 세포의 별도의 세트를 고정시키고, 세포를 PBK10-mRNA 복합체와 함께 인큐베이션시킨 후에 대략 24시간에 GFP에 대해 면역형광을 위해 가공하였다. 결과는 GFP 발현이 낮은 빈도일지라도(소수의 세포) mRNA의 PBK10-매개 전달 후에 검출가능하였다는 것을 나타낸다(도 2d). 충분한 GFP 발현(면역형광에 의해 검출가능)을 가능하게 하는 PBK10:mRNA의 최적의 중량비는 20이었다(도 2e). 이들 결과는 함께 PBK10 또는 HerPBK10에 의해 mRNA를 전달할 수 있었다는 것을 나타내는데, 단백질 둘 다 유사한 형식으로 핵산과 상호작용하기 때문이다.
실시예 2: c-Met에 표적화된 단백질 나노- 작제물
수용체 타이로신 키나제(RTK), c-MET 및 그의 내인성 리간드, 간세포 성장인자(HGF)는 세포 이동, 형태형성 분화 및 3차원 관 구조의 조직화뿐만 아니라 세포 성장 및 정상 조직 발생 동안의 혈관형성에 기여한다. 그러나, c-MET 및 HGF의 조절장애는 종양 진행에 기여할 수 있고, 이러한 환경에서 넓은 범위의 인간암에서의 불량한 예후와 상관관계가 있다.
c-MET의 세포 표면 평가는 현재의 신호 차단 치료법에 대해 획득된 내성을 포함하는 약물 내성과 관련되었고, 따라서 RTK-표적화된 치료법에 대한 중요한 바이오마커가 되었다. RTK를 표적화하는 대다수의 치료법이 종양 생존을 지원하는 하류의 신호전달 경로를 저해하도록 설계된 반면, 이러한 치료에 처음에 반응하는 종양은 신호 저해에 대해 거의 보편적으로 내성을 획득하는 한편, 중요 집단은 이러한 신호-차단 치료법에 대해 이미 본질적으로 내성이 있다.
신호 저해를 필요로 하지 않는 종양-표적화 전략은 c-MET 양성 암세포 상에서 더 효과적인 것으로 증명될 수 있다. 이는 부착된 치료제의 세포 흡수를 촉발시키기 위해 c-MET를 인식하는 리간드에 의해 처리될 수 있고, 따라서 신호전달을 차단할 필요를 우회한다. HGF는 이를 달성하기 위한 잠재력을 가졌지만, 사량체 및 이황화 결합에 대한 그의 필요는 치료제 개발에 대한 기술 문제를 제시한다. c-MET 표적화에 대한 대안의 그리고 잠재적으로 우수한 리간드는 가능하게는 식중독을 야기하는 박테리아로부터 유래될 수 있다.
인간 병원균인 리스테리아 모노사이토게네스는 c-MET에 결합하여 인터날린으로 불리는 그의 표면 단백질을 통해 숙주 세포에 침입한다. 구체적으로, 인터날린 B(In1B)는 c-Met 결합 후에 수용체-매개 세포내 섭취를 촉발한다. In1B 및 HGF는 c-Met의 상이한 영역을 인식하고, In1B는 결합을 위해 사량체화 또는 이황화 결합을 필요로 하지 않는다. 결과적으로, In1B는 그 자체를 본 발명자들이 인간 상피 성장 인자 수용체(HER)와 같은 다른 수용체를 표적화하기 위해 앞서 확립한 종양 표적화를 위한 나노생물학 전략에 제공한다.
PBK10은 펩톤 베이스의 활성을 침투하는 막을 통해 세포 내로 유전자 및 약물 전달을 매개할 수 있는 아데노바이러스 캡시드 펩톤 베이스로부터 유래된 재조합 단백질이다. PBK10은 종양-특이적 리간드에 융합될 때 종양 세포에 표적화될 수 있는 것으로 나타났다. 이 연구에서, In1B의 수용체-결합 부위는 PBK10에 대한 재조합 융합으로서 생성되어 새로운 단백질인 In1B-PBK10을 생성하는데, 이는 c-MET 양성 암세포에 대한 세포독성제의 표적화된 전달을 매개한다.
결과는 In1B-PBK10이 대양한 종양 세포주 상의 c-MET를 인식하는 가용성 융합 단백질로서 생성될 수 있고, 세포 결합 후에 빠른 내재화를 겪는다는 것을 나타낸다. In1B-PBK10은 콜롤과 같은 독성 화합물을 지니는 대략 10 내지 20㎚ 직경 나노클러스터를 형성하고, 세포 유입 후에 세포질 내로의 콜롤 침투를 매개하여 종양 세포사를 야기한다. 따라서, In1-PBK10은 MET-발현 종양에 대한 독성 분자의 표적화된 전달을 매개하기 위한 신규한 작제물이다.
배경
종양 바이오마커로서 c-MET. 상피 간엽 이행 인자 또는 MET는 활성화된 종양 유전자로서 처음 발견된 수용체 타이로신 키나제(RTK)이다. 섬유아세포-유래 세포 운동성 인자 또는 산란 인자(SF)로서도 알려져 있는 MET에 대한 내인성 리간드인 간세포 성장 인자(HGF)는 세포 증식, 운동성, 생존 및 분화 경로를 유도하기 위해 MET를 정상적으로 활성화한다. MET 및 HGF는 각각 상피 및 간충직 유래의 세포에서 주로 발현된다. HGF와 MET 사이의 근거리분비 신호전달은 조직 성장 및 형태형성 분화를 조절하는 상피-간충직 상호작용을 매개한다. 정상 조직에서 HGF-MET 신호전달은 배형성, 기관형성, 혈관형성, 상처 치유 및 조직 재생에 기여하는 반면, 이 경로의 비정상 신호전달은 종양 발생 및 진행, 종양 세포 침입 및 전이와 관련된다.
c-MET는 아미노(N)-말단의 세포외 도메인, 막 확장 세그먼트 및 카복시(C)-말단의 세포내 키나제 도메인으로 이루어진다. 세포외 영역은 PSI 도메인에 인접한 아미노(N)-말단의 세마포린(Sema) 도메인(플렉신, 세마포린 및 인테그린에 존재) 다음에 4개의 면역글로불린(Ig)-유사 도메인으로 이루어지는데, 이들은 함께 HGF에 대한 결합 부위를 포함한다. HGF에 의한 수용체 결합은 MET의 이량체화를 야기하여, ERK1/2, AKT 및 STAT3, 포스포이노시타이드 3-키나제 (PI-3K), Ras-Raf-MAPK, 및 포스포리파제 C를 통해 신호전달을 활성화한다. MET의 리간드 촉발된 세포내 섭취는 분해적 경로와 재순환 세포내 이입 경로 둘 다를 통한 수송을 매개하는 다이나민 및 클라트린-의존적 경로를 통해 일어난다.
c-MET 신호전달의 하향조절은 유전자 증폭이 있는 또는 유전자 증폭이 없는 과발현 및 구성적 키나제 활성화, 키나제-도메인 돌연변이 및 HGF의 과발현에 의한 c-MET의 근거리분비/자가분비 활성화를 포함하는 몇몇 메커니즘을 통해 일어난다. c-MET의 리간드-독립적 활성화는 또한 정상 HGF-MET 신호전달을 파괴하고, 구성적 이량체화를 야기하는 돌연변이뿐만 아니라 저산소성 병태로부터 초래될 수 있다. 후자는 MET의 HIF-1α-유도 전사를 활성화시켜 상승된 단백질 수준을 야기해서 HFG 신호전달을 증폭시키고 침입을 촉진시킨다.
종양에 걸친 다양한 RTK의 이질적 발현은 다수 유형의 암에서 주요 내성 메커니즘이라는 것이 일반적으로 받아들여졌다. 하나의 특이적 RTK를 저해하는 것을 목표로 한 치료법은 종종 다른 RTK의 상향조절 또는 리간드 자극에 기인하여 성공적이지 않으며, 결국, PI3K 및 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK)를 포함하는 세포-생존에 중요한 인자의 신호전달을 지속한다. 이런 내성 메커니즘을 EGFR 저해제에 대한 내성이 비소세포 폐암뿐만 아니라 유방암을 포함하는 다른 종양에서 MET 신호전달의 보상적 상향조절과 관련된다는 것을 나타내는 연구에서 동정하였다. 종합하면, c-MET는 그것이 다양한 유형의 암, 불량한 예후 및 전이와 관련되고, 내성 종양을 동정하고 표적화하기 위한 유용한 바이오마커일 수 있기 때문에 치료적 개입을 위한 타당한 후보이다.
임상에서 HGF/MET 경로에서 현재 표적화된 치료법은 HGF(피클라투주맙) 또는 MET(오나르투주맙)과 관련된 항체 또는 MET 키나제 도메인과 관련된 소분자 저해제(티반티닙 또는 ARQ197) 중 하나로 이루어진다. 이들 접근 모두에 의한 문제는 치료 효능을 위한 신호 저해에 대한 그들의 의존인데, 이는 앞서 언급한 보충적 RTK 혼선이 되기 쉽고, 내성 발생을 용이하게 한다. 이들 두 수용체 사이의 상당한 혼선을 제공하는 다중 RTK, 특히 EGF-R 및 MET의 방식을 차단 또는 파괴하기 위해 병용 요법을 이용하는 것에 증가된 관심이 있다. 이 접근을 시험하는 시험관내 연구는 종양 세포주, 예컨대 폐, 유방, 위 및 결장직장암 상에서 조짐을 보였지만, 이 접근을 시험하는 임상시험은 여전히 진행중이며, 결론이 나지 않은 채로 남아있다.
잠재적 c-MET 표적화제로서의 박테리아 병원균 단백질. 인터날린 B(In1B)는 인간 박테리아 병원균인 리스테리아 모노사이토게네스(Lm)의 표면 상에 나타난 단백질이며, c-MET에 대한 결합을 통해 비-식세포 내로 Lm의 유입을 용이하게 한다. In1B는 N-말단의 나선형 캡 도메인 다음에 면역글로불린-유사 내부 반복체(inter-반복체: IR) 영역에 인접한 상이한 수의 류신-풍부 반복체를 포함하는 Lm 인터날린 단백질의 거대 패밀리의 구성원이다. 다른 인터날린과 달리, In1B 구조는 또한 B-반복체 및 C-말단의 끝에서 3개의 GW 모듈을 포함한다. In1B321, 고친화도로 c-MET에 결합할 수 있는 In1B의 단편은 캡으로서 알려진 단백질 도메인, LRR(단백질-단백질 상호작용 도메인), 및 IR 영역으로 이루어진다. MET에 대한 In1B321의 결합은 그의 2개의 도메인(LRR 및 IR, 각각 MET의 Ig1 및 Sema 도메인에 결합함))을 통해 일어난다.
In1B는 잠재적 종양-표적화 리간드로서 HGF 이상의 몇몇 이점을 가진다. HGF는 20개의 설파이드 결합을 포함하는 이형이량체이고, 프로단백질의 결집된 서브유닛으로의 절단을 필요로 하는데, 이는 특히 외인성 단백질 도메인에 대한 융합으로서 재조합 생성에 대한 문제를 제기할 수 있다. 대조적으로, In1B321은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 재조합 가용성 리간드로서 이미 생성되었고 다른 단백질에 대한 융합을 용인할 수 있다(도 3A). 시험관내 연구는 In1B321 펩타이드가 MET 결합 후에 수용체-매개된 내재화를 촉발시킬 수 있다는 것을 입증하였는데, 이는 나노-전달제로서의 그의 용도에 도움이 된다. 또한 MET의 HGF 결합 부위와 In1B321의 결합 부위 사이의 중복이 없다는 것을 주목하는 것이 중요하며(도 3B); 따라서, MET에 대한 결합에 대해 이들 두 리간드 사이에 경쟁은 없다.
본 연구에서, 이 펩타이드는 그것을 카복실(C)-말단 끝에서 데카라이신 서열(K10)에 의해 변형된 Ad5 펩톤 베이스(PB)에 대한 재조합체 융합으로서 생성함으로써 다시 공학처리한다. 얻어진 다중-도메인 단백질인 In1B-PBK10은 음이온성 화물(cargo), 예컨대 핵산 또는 콜롤(K10 도메인에 의해 매개됨)의 수송을 위한 기능, 표적화된 결합 및 내재화(In1B321 도메인에 의해 매개됨) 및 막 침투 및 세포내 수송(PB 도메인에 의해 매개됨)을 함유한다. 결과는 InB-PBK10 융합 유전자의 구성, 이 재조합 유전자에 의해 암호화된 융합 단백질의 생성, MET 및 유입 세포에 결합하는 능력을 지니는 단백질의 특성 및 시험관내 세포독성 페이로드를 전달하는 능력의 평가를 제공한다.
결과
재조합 유전자는 In1B - PBK10을 암호화하도록 구성될 수 있다. In1B-PBK10 유전자 작제물을 생성하기 위한 전략은 pRSET-A 박테리아 발현 플라스미드 내로 클로닝, 다음에 In1B321 서열의 3' 말단에서 PBK10의 삽입을 위해 In1B321의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭을 수반하는 2단계 클로닝 방법을 수반하였다. 이를 달성하기 위해, PCR에 의해 In1B321 내로 제한 부위를 도입하여 발현 플라스미드인 pRSET-A 내로 "프레임 내" 삽입을 위해 PBK10과 이 서열을 결합시키도록 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 설계하였다.
본 발명자들의 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 다음의 서열을 각각 포함하였다:
Figure pct00001
제한 부위인 SacI를 정방향 프라이머에 도입하여 pRSET-A에 의해 암호화된 N-말단의 폴리-히스티딘 서열과 인접한 In1B321 리딩 프레임을 위치시켰다. BglII 및 KpnI 제한 부위를 역방향 프라이머 내로 도입하였다. SacI 및 KpnI를 사용하여 In1B321을 pRSETA 내로 삽입하였고, In1B321 암호 서열에 대해 바로 3'에 PBK10의 후속적 삽입을 위해 BglII를 사용하였다. Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser(서열번호 3) 아미노산 모티프를 암호화하는 서열을 역방향 프라이머에 포함시켜 In1B321과 PBK10 사이에 짧은 가요성 링커를 혼입시켰다. 고 정확도 중합효소를 사용하여 돌연변이가 In1B321 PCR 산물 내로 도입되지 않았음을 보장하였다.
800bp In1B321 PCR 산물을 SacI 및 KpnI 제한 부위에서 pRSETA 내로 결찰시켜, 플라스미드 작제물인 pRSETA-In1B를 생성하였다. 이어서, PBK10을 제한 부위 BglII 및 HindIII에서 pRSETA-In1B 내로 삽입하였다. 이를 위해서, PBK10을 제한 부위 BamHI 및 HindIII에서 플라스미드 작제물인 pRSETA-PBKIO로부터 절단하고, 이중 분해된 pRSETA-In1B 내로 결찰시켜, pRSETA-In1B-PBK10 작제물을 생성하였다(도 4A). 본 발명자들은 또한 가능한 장래의 시험관내 및 생체내 영상화 실험을 위해 녹색 형광 단백질(GFP)에 대한 카복시 [C]-말단의 융합으로서 In1B321을 암호화하는 작제물인 pRSETA-GFP-In1B를 생성하였다. 이 작제물은 SacI 및 BglII을 이용하여 앞서 기재한 800bp In1B PCR 산물을 분해함으로써 그리고 이를 GFP의 암호 서열과 함께 프레임 내 In1B 삽입물을 위치시키는 pRSETA-GFP 플라스미드 내로 결찰시킴으로써 생성되었다(도 4B). 모든 작제물을 이중 분해하였고, 1% 아가로스 겔을 이용하는 전기영동에 의해 평가하여 예상된 밴드의 존재를 확인하였다(도 4C). 추가적으로, 모두 3개의 작제물을 서열분석하여 그들의 정체를 확인할 뿐만 아니라 리딩 프레임 내로 도입되지 않은 돌연변이를 확인하였다.
재조합 단백질 In1B , 즉, In1B - PBK10 및 GFP - In1B를 박테리아에서 생성할 수 있다. 앞서 기재한 모두 3개의 플라스미드 작제물(pRSET-In1B, pRSET-In1B-PBK10, 및 pRSET-GFP-In1B)을 상기 방법에서 기재한 바와 같이 후속적 단백질 발현 및 정제를 위해 이콜라이(E. coli) 균주인 BLR(DE3) pLysS 내로 형질전환시켰다. 이 균주는 더 전통적인(즉, BL21) 발현 균주와 대조적으로 반복체 서열을 더 용인하며, 따라서 C-말단의 폴리라이신을 함유하는 전장 단백질을 얻는 능력을 가능하게 한다. 한편으로, pRSET-A 플라스미드는 폴리히스티딘 서열에 대한 N-말단의 융합으로서 단백질을 암호화한다. 이 히스티딘(His)-태그는 니켈-킬레이트 수지를 이용하는 친화도 정제를 가능하게 하며, 항 His-태그 항체에 의한 인식을 위한 에피토프를 제공한다.
모두 3개의 작제물은 박테리아에서 가용성 단백질(In1B, In1B-PBK10 및 GFP-In1B)을 생성하였는데, 이는 상기 방법에서 기재한 바와 같이, 니켈-컨쥬게이팅된 수지를 이용하는 금속 킬레이트 친화도 크로마토그래피에 의해 단리시킬 수 있다. 항-His 태그 항체는 대략 37kDa(In1B), 대략 100kDa(In1B-PBK10) 및 대략 63kDa(GFP-In1B)의 예측 분자량에서 겔 전기영동을 변성시킴으로써 이동된 모두 3개의 단백질을 인식하였다(도 5).
c-MET의 표면 수준은 상이한 종양 세포주 간에 상이하다. In1B-PBK10을 특성규명함에 있어서 제1 목적은 이 단백질이 종양 세포 상에서 c-MET를 인식하는지의 여부를 결정하는 것이었다. 상이한 종양 세포주와 관련된 c-MET에 관한 대부분의 문헌은 청 c-MET 단백질 발현 또는 RNA 발현에 기반하며, 따라서 세포 표면 상에 나타난 c-MET의 수준에 관해 정보를 주지 않는다. 따라서, 본 발명자들의 용도를 위해 이용가능한 세포주의 패널 상에서 c-MET의 상대적 세포 표면 수준을 처음 결정하는 것은 중요하였다. 이는 이러한 평가를 위해 이용가능한 대다수의 항체가 c-MET의 사이토카인 도메인에 대해 생성되었고, c-MET 발현 및 활성화의 메커니즘을 평가하는데 사용하였기 때문에 초기 시험감염이 되는 것으로 증명되었다. 이 연구를 위해, 세포 표면 c-MET에 대해 특이적으로 발생된 MET3 항체를 사용하였다. 본 발명자들은 다양한 세포주 상에서 c-MET의 상대적 세포 표면 수준을 측정하기 위해 세포 표면 ELISA를 사용하였다. 간략하게, 이 접근은 본 발명자들이 비침투 세포 상의 표면 상에서 상대적 수용체 수준을 측정할 수 있게 하고, 96웰 형식으로 수행될 수 있어서, 다중 복제물뿐만 아니라 값비싼 시약의 보존을 둘 다 허용한다. 본 발명자들의 ELISA는 H1993(폐암 세포주)와 MDA-MB-231(유방암 세포주)가 가장 높은 표면 수준의 c-MET를 지니는 세포주 중에 있다는 것을 나타낸다. RANKL(전립선암 세포주) 및 MDA-MB-435(유방암 세포주)는 중간 수준을 나타내는 반면, LN-GFP(전립선암 세포주) 및 Cos-7(아프리카 그린 원숭이 신장 섬유아세포)은 저수준의 세포 표면 c-MET를 나타낸다(도 6).
In1B -유래 펩타이드는 c-MET를 인식한다. 표적화 리간드의 수용체-특이성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 형광 활성화 세포 정렬 분석(FACS)을 사용하여 c-MET 양성 세포에 결합된 In1B의 상대적 수준을 측정하였다. 두 종양 세포주를 In1B의 결합에 대해 시험하였다: 고 발현의 c-MET를 지니는 하나의 종양 세포주(H1993) 및 저발현의 c-MET를 지니는 다른 종양 세포주(LN GFP). In1B는 LN GFP에 비해 H1993 세포에 대해 비례적으로 더 고수준의 결합을 나타내었다(도 7a). In1B가 c-MET에 결합되었는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 In1B 결합을 위한 경쟁적 저해제로서 MET의 세포외, 리간드-결합 도메인으로부터 유래된 가용성 펩타이드(MET 펩타이드)를 사용하였다. 저해제 대 리간드의 등몰비는 수용체 결합에서 50% 감소를 예측한다. 일치되게, 등몰(1:1) 농도의 MET:In1B는 H1993 세포에 대한 In1B 결합을 50%만큼 감소시켰는데, 이는 c-MET-민감성 결합을 나타낸다(도 7b).
In1B - PBK10에 의한 세포 결합은 c-MET와 관련되며, 유리 리간드에 의해 경쟁적으로 저해된다. 앞 부문에서, 본 발명자들은 In1B가 c-MET를 통해 c-MET 양성 종양 세포에 결합하는 능력을 가진다는 것을 나타내었다. 다음의 목표는 In1B에 의한 수용체 결합이 융합 단백질의 부분으로서 구현될 때 영향받는지의 여부를 시험하는 것이었다. 이를 평가하기 위해, 본 발명자들은 세포 표면 ELISA를 이용하여 높은 c-MET(MDA-MB-231) 및 낮은 c-MET(Cos-7)를 발현시키는 세포주에 대한 In1B-PBK10의 결합을 평가하였다. In1B-PBK10은 상대적으로 낮은 c-MET 수준을 발현시키는 세포(Cos-7)에 비해 더 높은 c-MET 세포 표면 발현을 지니는 세포(MDA-MB-231)에 대해 더 높은 수준의 결합을 나타내었다(도 7c). In1B-PBK10이 c-MET를 인식한다는 것을 추가로 확인하기 위해, 유리 In1B 리간드를 경쟁적 저해제로서 사용하였다. In1B-PBK10은 증가된 농도의 In1B의 존재에서 MDA-MB-231 세포에 대해 감소된 결합을 나타내었는데, 이는 In1B-PBK10이 c-MET을 통해 이들 세포에 결합한다는 것을 시사한다(도 7d).
In1B - PBK10은 현탁액 중에서 세포 상의 c- MET에 대한 결합을 나타낸다 . c-MET 인식의 추가 확인으로서, 본 발명자들은 In1B-PBK10이 현탁액 중의 세포에 결합할 수 있었는지의 여부를 시험하였다(부착 세포에 대한 결합을 평가한 이전의 분석과 대조적임). 본 발명자들은 경쟁적 저해제로서 증가하는 농도의 유리 In1B 리간드의 존재 하에 In1B-PBK10을 지니는 현탁액 중에서 c-MET 양성 세포주인 MDA-MB-435를 인큐베이션한 풀 다운 분석을 수행하였다. 유리 In1B 리간드의 농도를 선택하였고, 따라서 In1B-PBK10:In1B의 몰 비는 1:1, 1:5 및 1:10이었다. 이어서, 세포 펠렛과 함께 공동침전시킨 In1B-PBK10 수준을 In1B-PBK10에 특이적인 항체(Ad5 항체, 펩톤 베이스를 인식함)를 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 평가하였다. In1B 농도가 증가됨에 따라 In1-PBK10 결합 수준은 감소되었고, 결합은 거의 완전하게 저해되었으며, 따라서 In1B-PBK10은 현탁액 중의 세포 상의 c-MET를 인식하고 결합할 수 있다는 것을 입증하였다(도 7e).
In1B - PBK10은 c-MET+ 세포 내로 내재화된다. 세포 흡수 후에 In1B-PBK10의 생존 및 검출을 시험하기 위해, 본 발명자들은 우선 3종의 상이한 세포 유형인 MDA-MB-231, MDA-MB-435 및 H1993과 함께 In1B-PBK10을 4℃에서 인큐베이션시켜 수용체 결합을 촉진시켰지만, 내재화는 촉진시키지 않았다. 세포내 섭취를 유도하기 위해, 이어서 본 발명자들은 37℃에서 표시한 시간 동안 세포와 함께 인큐베이션시키고, 30분까지의 구체적 시점에 세포를 고정시켰다. 면역형광 염색 및 공초점 현미경 분석은 모두 3개의 세포주에서 In1B-PBK10(녹색으로 나타냄)이 세포막 상에 밀집해 있고 결합의 처음 5분 내에 세포막에서 병소 내에 모였다는 것을 나타낸다. 이어서, In1B-PBK10을 30분까지 핵 주위 영역에 축적하였다. 이들 데이터는 In1B-PBK10이 내재화하고 세포 결합 후 30분 내에 세포 내부에 축적될 수 있다는 것을 나타낸다(도 8). 세포를 30분까지의 구체적 시점에 고정시키고, 레이저 주사 공초점 현미경분석에 의해 영상화하였다. 적색, 액틴; 청색, 핵. 막대, 대략 10마이크론.
In1B - PBK10은 독성 분자를 c-MET+ 세포에 전달한다. In1B-PBK10의 엔도솜 분해(endosomolytic) 능력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 그 자체에 세포막을 본질적으로 침투시킬 수 없는 세포독성제의 세포질 유입을 매개할 수 있었는지의 여부를 평가하였다. 갈륨 (III)을 함유하는 설폰화된 콜롤(S2Ga 또는 Ga-콜롤)은 단백질과 자발적으로 조립할 수 있는 강렬한 형광 화합물이다. 이들 화합물은 그들을 세포 내로 전달하여 독성의 세포질 표적에 접근시키는 막 침투 담체 없이 세포막을 가로지를 수 없다.20-22 메디나-카웨 연구소(Medina-Kauwe lab)는 Ga-콜롤 단독으로 비독성이지만 HerPBK10에 의해 HER2+ 종양 세포 내로 전달될 때 세포사를 촉진시킬 수 있다는 것을 앞서 나타내었다.
이 연구를 위해, In1B-PBK10을 Ga-콜롤과 혼합하여 비공유 조립체를 촉진시켰고, 얻어진 In1B-PBK10-Ga 복합체는 투과 전자 현미경(TEM) 및 동적 광 산란법에 의해 특성규명하였다(도 9a, 및 도 9b). TEM(도 9a의 우측 패널)은 Ga-콜롤(+S2Ga)이 In1B-PBK10 단독(-S2Ga)에 비해 In1B-PBK10에 첨가될 때 형성된 구체 조립체를 나타낸다. 영상화는 단백질 및 콜롤이 10 내지 20㎚ 직경 클러스터를 형성한다는 것을 나타낸다. 입자 크기를 측정하기 위해 사용한 동적 광산란은 In1B-PBK10 단독이 8.4㎚ 평균 직경의 입자를 형성하는 한편, In1BPBK10-Ga은 약 16.4㎚ 직경이라는 것을 나타낸다.
In1B-PBK10-Ga이 세포를 침투하고 c-MET 양성 암세포주에서 콜롤-매개 독성을 유도하는지의 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 다음 중 각각의 1μM, 5μM 및 10μM에 MDA-MB-435 세포를 노출시켰다: In1B-PBK10, S2Ga 및 In1B-PBK10-Ga. 1μM 농도에서, In1B-PBK10-Ga은 세포 생존을 60%만큼 감소시킨 반면, S2Ga 단독 및 In1B-PBK10 단독의 1μM 이상의 농도는 세포 생존에 영향을 미치지 않았다. 이들 데이터는 In1B-PBK10이 엔도솜 분해 능력을 보유한다는 것을 단언하며, 이 작제물이 Ga-콜롤과 같은 세포독성제를 세포 표면 c-MET를 발현시키는 세포 내로 전달시킬 수 있다는 것을 나타낸다(도 9c).
In1B-PBK10의 치료 능력을 추가로 평가하기 위해, 이 단백질이 더 많은 주요스트림 화학치료 분자를 전달하는데 사용될 수 있었는지의 여부를 평가하였다. 독소루비신(Dox)은 넓은 범위의 암유형에 대해 사용된 FDA 승인 세포독성제이다. 이러한 약물이 주로 종양 세포에 대해 표적화될 수 있다면, 부작용을 감소시키는 것에 관해 유리할 것이다. 이 접근에서, 제1 Dox을 이중가닥 올리고 내로 개재시켜 DNA-Dox를 형성하는데, 이는 이어서, (DNA 인산염 백본과의 전하 상호작용을 통해) In1B-PBK10의 폴리라이신에 결합하고, 본 발명자들이 설계한 복합체인 I-Dox를 형성할 수 있다. I-Dox 복합체(Dox 농도에 대해 5μM)를 상기 방법에서 기재한 조건 하에 표시한 세포주 상에서 인큐베이션시켰다. In1B-PBK10을 I-Dox 복합체에서의 그것과 등몰 농도로 인큐베이션시켰다. 처리 후 24시간에 대사(MTT) 분석에 의해 세포 생존을 평가하였다. I-Dox 복합체는 낮은 c-MET 발현을 지니는 세포(LAPC4)에 비교할 때 높은 c-MET 발현을 지니는 세포(H1993)에 대해 상당한 독성을 유도하였다(도 9d). H1993 세포를 우선 유리 In1B 리간드로 처리하여 c-MET를 차단시킨 다음, 상기와 동일한 조건에서 I-Dox에 노출시켰다. In1B-PBK10 단독은 약하게 나타났지만, 세포 수를 상당히 감소시키지 않았는데, 이는 세포사의 주요 메커니즘이 Dox의 전달을 통한다는 것을 시사하였다. 추가적으로, 유리 In1B 리간드는 I-Dox에 의해 세포독성을 저해하였는데, 이는 Dox의 전달을 위한 c-MET 결합 및 유입을 통해 I-Dox-매개 세포독성이 일어난다는 것을 시사한다(도 9e).
실험 절차
세포. 인간 유방암 세포주(MDA-MB-435* 및 MDA-MB-231)를 미국 국립 암 연구소(National Cancer Institute)로부터 얻었다. 인간 폐암(H1993), 및 아프리카 그린 원숭이 신장 섬유아세포(Cos-7) 세포주를 ATCC로부터 얻었다. 인간 난소 암세포(A2780)를 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 얻었다. 전립선암 세포주(LNCaPNeo/RANKL, LNCaPNeo)를 릴런드 청(Leland Chung) 박사(세다스-시나이 의료 센터(Cedars-Sinai Medical Center))가 호의적으로 제공하였다. MDA-MB-435 및 MDA-MB-231을 5% CO2 하에서 DMEM, 10% v/v 소태아 혈청(FBS, 시그마-알드리치), 및 1% v/v 페니실린/스트렙토마이신(시그마-알드리치)에서 유지하였다. H1993 및 A2780 세포를 5% CO2 하에서 RPMI, 10% v/v FBS 및 1% v/v 페니실린/스트렙토마이신에서 유지하였다. Cos-7 세포를 5% CO2 하에서 DMEM/F12 배지, 20% v/v 비가열 불활성화 소태아 혈청(ATCC 30-2020) 및 1% v/v 페니실린/스트렙토마이신(Sigma-Aldrich) 에서 유지하였다. LNCaPNeo / RANKL, LNCaPNeo를 RPMI 배지, 10% v/v FBS 및 1% v/v 페니실린/스트렙토마이신 및 200㎍의 G418 이황산염 용액(시그마 알드리치 G8168) 중에서 유지하였다. 200㎍/㎖의 하이그로마이신(제미니 바이오-프로덕츠(GEMINI Bio-products) 400-123)을 LNCaPNeo / RANKL 세포의 배지에 첨가하여 RANKL-발현 플라스미드를 유지하였다. 세포주 사이의 동등한 합류를 유지하게 위해, 특정 분석에서 그들을 그들의 성장 속도에 따라 플레이팅하였다.
DNA 작제물 . 표적화 작제물인 In1B-PBK10을 2단계 클로닝 방법에 의해 생성하였고(도 8A에서 요약), 이때 In1B 및 PBK10을 암호화하는 서열을 단백질 발현 플라스미드인 pRSET-A(미국 캘리포니아주 칼스베드에 소재한 인비트로젠) 내로 함께 순차적으로 결찰시켰다. 인터날린 B(pMET-30-In1B321)(세비텍(CeBiTec)), 독일 빌레펠드 유니버시티(Bielefeld University))의 aa 36 내지 321을 암호화하는 플라스미드 작제물을 서열, 5'-AGTGAGCTCGAGACTATCACTGTG-3'(서열번호 1) 및 5'-GTTGGTGACTTTCTCCCACCTTCACCACCTTCATCTAGATATCCATGGTAT-3'(서열번호 2)을 각각 포함하는 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다. SacI 제한 부위를 pRSET-A 내로 프레임내 삽입을 위해 정방향 프라이머에서 도입하였다. BglII 및 KpnI 제한 부위를 In1B 암호 서열에 대해 바로 3'에 PBK10의 후속적 프레임내 삽입을 위해 역방향 프라이머 내로 도입하였다. 역방향 프라이머는 또한 In1B와 PBK10 서열 사이에 가요성 링커(GlyGlySerGlyGlySer)(서열번호 3)를 암호화하는 서열을 포함한다. pRSET-A 내로 결찰을 위해 800bp In1B PCR 산물을 SacI 및 KpnI를 이용하여 분해시켰다. 얻어진 작제물인 pRSETA-In1B를 BglII 및 HindIII을 이용하여 분해시켜 In1B에 의해 프레임내 PBK10의 삽입을 제공하였다. BamHI 및 HindIII 제한 효소를 이용하여 PBK10을 플라스미드인 PBK10으로부터 절단하였고, pRSETA-In1B의 BglII-Hindlll 부위 내로 삽입하여 pRSET-In1B-PBK10 작제물을 생성하였다.
녹색 형광 단백질(GFP)에 대한 카복시 [C]-말단의 융합으로서 In1B321을 암호화하는 pRSETA-GFP-In1B 작제물을 SacI 및 BglII를 이용하여 앞서 기재한 800 bp In1B PCR 산물을 분해함으로써, 그리고 이를 In1B321의 프레임내 클로닝을 위해 pRSETA-GFP 플라스미드에 결찰시킴으로써 생성하였다.
박테리아로부터의 단백질 발현 및 정제. BLR(DE3)pLysS(미국 위스콘신주 메디슨에 소재한 노바겐(Novagen)) 박테리아 형질전환체의 밤새 배양물을 0.5㎎/㎖ 암피실린 및 0.034㎎/㎖ 클로람페니콜 및 0.0125㎎/㎖ 테트라사이클린을 함유하는 LB에서 1:50으로 접종하였다. 배양물이 광학 밀도 파장 600㎚(OD 600)에서 0.6의 흡광도 판독에 도달되었을 때, 0.4mM IPTG에 의해 배양을 유도하고 나서 37℃에서 추가 3시간 동안 진탕시키면서 성장시켰다. 배양물을 채취하고 나서 펠렛화하였다. 세포 펠렛을 용해 완충제(50mM 트리스, pH 8.0, 50mM NaCl, 2mM EDTA, pH 8.0)에서 재현탁시키고 나서, 0.1% 트리톤 X-100의 첨가에 의해 용해시키고, 냉동-해동 1주기에 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)를 해동 동안 첨가하였다. 해동 후에, 용해물은 10mM MgCl2를 받았고, 0.01㎎/㎖ DNase 및 용해물을 실온에서 10분 동안 흔들어서 게놈 DN를 분해시킨 후 용해물을 얼음에 되돌리고, 이후에 그들은 300mM NaCl 및 10mM 이미다졸을 받았다. 용해물을 사전 냉각시킨 원심분리관에 옮기고, 균형을 맞추고 나서, 39,000 x g에서 1시간 동안 사전 냉각시킨 로터 내 4℃에서 원심분리시켰다. 상청액을 회수하고 나서, MCAC-10(50mM NaH2P04, 300mM NaCl, 10mM 이미다졸, 및 0.1% 트리톤 X-100, pH 8.0)으로 사전 평형상태로 만든 Ni-NTA 수지(미국 캘리포니아주 발렌시아에 소재한 퀴아젠(Qiagen))에 첨가하고, 1시간 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 결합 단백질을 함유하는 수지를 얼음 상에서 10분 흔드는 동안 1회 20㎖의 MCAC-10 완충제로 그리고 MCAC-20(50mM NaH2P04, 500mM NaCl, 20mM 이미다졸, 및 10% 글리세롤, pH 8.0)으로 3회 세척하고, 다음에 50mM Na-인산염, pH 8.0, 300mM NaCl, 250mM 이미다졸, 및 10% 글리세롤의 2㎖의 용액으로 용리시켰다. 단백질을 저염 완충제로 동시에 완충제 교환하고 나서, 한외여과(아미콘 초원심분리 필터(Amicon Ultra Centrifugal Filters) - 울트라셀(Ultracel) - 50K(미국 매사추세츠주 베드포드에 소재한 밀리포어(Millipore))에 의해 농축시키고, 바이오래드(BioRad) 단백질 정량화 분석(미국 캘리포니아주 허큘러스에 소재한 바이오래드 래버러토리즈(BioRad Laboratories))를 이용하여 그들의 농도를 측정하였다.
단백질 검출. 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 당업계에 공지된 바와 같은 불연속 겔 완충제 시스템에서 수행하였다. 정전압(20V)에서 40분 동안 바이오래드 반건조 전달 세포 세트에서 192mM 글리신, 25mM 트리스 및 20% 메탄올을 이용하여 나이트로셀룰로스 상에서 단백질을 전기적으로 전달하였다. 트리스 완충 식염수(10mM 트리스, pH 7.5, 150mM NaCl)에서 3% 소 혈청 알부민으로 블롯을 차단하였다. 차단 완충제 중에서 1:1500 희석으로 항-RGS-His 태그 항혈청(퀴아젠)을 이용하여 밤새 블롯을 인큐베이션시켰다. 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase: HRP) 컨쥬게이팅된 2차 항체(미국 미조리주 세인트 루이스에 소재한 시그마(Sigma))와 함께 인큐베이션, 다음에 HRP 기질 및 화학발광 검출 시약(써모 피셔(Thermo Fisher))과의 반응 및 막에 대한 노출(하이퍼필름 ECL(Hyperfilm ECL); 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))에 의해 항체-항원 복합체를 검출하였다.
c-MET 세포 표면 발현을 위한 ELISA 기반 분석. 세포주 상에서 c-MET 수준을 결정하기 위해, 세포를 다음의 수를 이용하여 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다: 8x103개 MDA-MB-231, MDA-MB-435, A2780, LNCaPNeo / RANKL, LNCaPNeo 및 9x103개 H1993 및 LAPC4/웰. 48시간 후에 배지를 흡입하고 나서, 세포를 1mM MgCl2 및 1mM CaCl2(PBS+)를 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS)로 간략하게 세척하고, 이어서, 실온(RT)에서 12분 동안 PBS 중의 4% PFA 중에 고정시킨 다음, PBS+(200㎕/웰)로 3회 세척한 후에, 실온에서 차단 용액(3% BSA/PBS, 100㎕/웰) 중에서 1시간 인큐베이션시켰다. 항-c-MET 항체(0.87㎍/㎖로 사용한 마우스 단클론성 항-c-MET; 넛슨 박사(Dr. Knudson))를 3회 중복해서 웰에 첨가하고(100㎕/웰) 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 PBS+로 3회 세척하고 나서, 1:2000 희석으로 HRP-컨쥬게이팅된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 PBS+로 3회 그리고 증류수로 1회 세척하고, 100㎕의 TMB(이바이오사이언스(eBioscience)) 용액을 제조업자의 설명서에 따라 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 기질과 함께 암실에서 30분 동안(또는 청색 전개가 보일 때까지) 인큐베이션시키고 나서, 100㎕의 1N HCl을 첨가함으로써 반응을 중단하였다. 스펙트라 MaxM2 플레이트 판독기(몰레큘러 디바이스 코포레이션(Molecular Devices Corp.))에서 흡광도를 450㎚에서 측정하였다. 이어서, 크리스탈 바이올렛 분석을 수행하여 상대적 세포수를 결정하였다. 간략하게, 세포를 PBS+(200㎕/웰)로 1회 세척하고 나서, 15분 동안 실온에서 0.1% 크리스탈 바이올렛(100㎕/웰)과 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 PBS+(200㎕/웰)로 4회 철저하게 세척하고 나서, 10분 동안 실온에서 95% 에탄올(100㎕/웰)과 함께 인큐베이션시켰다. 흡광도를 490㎚에서 측정하였다.
세포 결합 분석. 상이한 농도의 In1B-PBK10의 세포에 대한 결합을 결정하기 위해, 세포를 다음의 농도에서 96-웰 플레이트에 플레이팅시켰다: 8x103개 LNCaPNeo/RANKL, LNCaPNeo, 및 9x103개 H1993과 LAPC4/웰. 48시간 후에, 배지를 흡입하고 나서, 세포를 100㎕의 완충제 A(무혈청 DMEM, 20mM 헤페스 pH 7.4, 2mM MgCl2, 3% BSA)로 간단하게 세척하였다. 세포를 4℃에서 교반하면서 얼음 상에서 1시간 동안 표시 농도의 In1B-PBK10을 함유하는 50㎕의 완충제 A와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 1회 PBS+(200㎕/웰)로 세척하고 나서, 다음의 변형과 함께 앞서 기재한 바와 같은 세포 표면 ELISA(c-MET에 대해 세포 표면 발현 ELISA)를 실시하였다: In1B-PBK10을 검출하기 위해, 플레이트를 1:1500 희석으로 1차 항체(RGS-His; 퀴아젠)와 함께 밤새 인큐베이션시키고, 2차 항체(염소 항 마우스, 1:2000 희석에서)와 함께 1시간 인큐베이션시켰다.
경쟁적 저해 분석을 위해, In1B-PBK10를 첨가하기 전에 표시된 농도의 In1B를 세포 상에서 인큐베이션 시켰다. 구체적으로, 앞서 기재한 바와 같이 플레이팅한 세포주를 100㎕ 완충제 A로 간단히 세척한 다음, 4℃에서 교반시키면서 얼음 상에서 1시간 동안 1μM, 5μM 또는 10μM의 In1B를 함유하는 50㎕의 완충제 A에서 인큐베이션시켰다. 세포를 완충제 A(100㎕/웰)로 1회 세척하였고, 이어서, 4℃에서 교반시키면서 얼음 상에서 1시간 동안 1μM의 In1B-PBK10을 함유하는 50㎕의 완충제 A와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 PBS+(200㎕/웰)로 1회 세척하고, 플레이트를 In1B-PBK10의 펩톤 베이스 도메인을 인식하는 항체(Ad5 항체; Abeam)와 함께 1:5000 희석으로 인큐베이션시킨 것을 제외하고 앞서 기재한 바와 같은 표면 결합 In1B-PBK10의 면역 검출을 위하여 가공하였다. 플레이트를 2차 항체(염소 항 토끼, 1:2000 희석으로)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. c-MET 세포 표면 발현 ELISA를 위해 앞서 설명한 바와 같이 결합을 검출하였다.
세포 생존 분석. MDA-MB-435 세포를 8x103개 세포/웰로 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 48시간 후에 배지를 흡입하고, 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 락커 상에서 4시간 동안 세포를 상이한 농도의 In1B-PBK10-Ga 및 S2Ga(1, 5 및 10μM)을 함유하는 30 내지 50㎕의 배지와 함께 인큐베이션시켰다. 4시간의 인큐베이션 기간 후에, 추가적인 배지를 웰 당 총 용적이 100㎕가 되도록 첨가하고 나서, 세포를 흔들지 않고 대략 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 프로메가 셀타이터 96(Promega CellTiter 96) 수성 비방사성 세포 증식 분석을 사용하여 세포 생존도를 측정하였다. 배지를 제거하고 나서, 100㎕의 새로운 배지를 웰에 첨가하였다. 제조업자의 설명서에 따라, 2.0㎖의 MTS 용액을 100㎕의 PMS 용액과 혼합하고 나서, 20㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2와 함께 인큐베이션시키고, MTT 시약을 첨가한 후 1 및 2시간에 490㎚에서 판독하였다. 이어서 크리스탈 바이올렛 염색을 수행하여 상대적 세포수를 결정하였다. 간략하게, 세포를 1mM Ca2 + 및 1mM Mg2+를 함유하는 PBS+로 세척하고, 이어서, 0.1% 크리스탈 바이올렛(100㎕/웰)과 함께 실온에서 15분 동안 인큐베이션시킨 다음 PBS+(200㎕/웰)로 4회 세척하였다. 플레이트를 95% 에탄올(100㎕/웰)과 함께 실온에서 인큐베이션시켰고, 흡광도를 590에서 측정하였다.
In1B - PBK10 흡수/ 세포내 수송 분석. In1B-PBK10 흡수 분석을 위해, 세포를 1x105개 세포/웰로 12-웰 접시에서 커버슬립 상에 플레이팅하고 2일 동안 성장시켰다. 처리일에, 접시를 얼음 상에 옮기고 나서, 세포를 다음의 방법에 따르는 표시된 실험을 위해 처리하였다. 흡수 시간 과정을 연구하기 위해, 세포를 찬 PBS로 2회 세척한 다음, 8㎍의 In1B-PBK10를 지니는 0.4㎖의 완충제 A를 각각의 웰에 첨가하였다. 수용체 결합을 촉진시키기 위해(그러나 내재화는 아님) 접시를 4℃에서 흔들면서 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 이어서, 세포를 찬 PBS로 세척하여 비결합 단백질을 제거하였다. 이어서, 웰은 사전가온시킨 완전 배지를 받았고, 접시를 5% CO2에서 37℃로 표시한 시점에 인큐베이션시켰다. 이어서, 개개의 커버슬립을 제거하고 나서, PBS/1% MgCl2로 3회 세척하고, 이어서 15분 동안 실온에서 PBS 중에서 4% 파라폼알데하이드로 고정시켰다. 커버슬립을 PBS로 3회 세척하고, 이어서 5분 동안 PBS 중의 50mM 염화암모늄, 5분 동안 PBS 중의 0.1% 트리톤 X-100과 함께 인큐베이션시킨 다음, 실온에서 30분 동안 PBS 중의 1% BSA로 차단시켰다. 커버슬립 상의 세포를 4℃에서 밤새 1차 항체와 함께 인큐베이션시키고, PBS로 3회 세척한 다음, 암실에서 1시간 동안 실온에서 2차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 지시되는 경우, 액틴 및 핵에 대해 대비염색한 세포를 2차 항체 인큐베이션 동안 1:100 희석으로 텍사스 레드 x-팔로이딘(Texas Red x-Phalloidin)(인비트로젠 T7471)과 함께 인큐베이션시키고 나서, 300 nM 최종 농도로 DAPI에서 5분 인큐베이션시켰다. 팔로이딘, DAPI 및 1차 및 2차 항체를 모두 PBS 중의 1% BSA 중에서 희석시켰다. 2차 항체 및 DAPI 처리 후에, 커버슬립 상의 세포를 PBS로 3회 세척하고 나서, 프롤롱 안티페이드(Prolong Antifade) 장착 배지(미국 오리건주 유진에 소재한 몰레큘러 프로브((Molecular Probes)) 상에 장착시켰다. In1B-PBK10을 검출하기 위해, RGS-His 항체(퀴아젠)를 1:150 희석에서 사용하였고, 1:500 희석으로 형광단-컨쥬게이팅 염소 항-마우스(FITC-컨쥬게이팅)를 형광 검출을 위해 In1B-PBK10에 대해 488㎚, 핵에 대해 405㎚(DAPI) 및 F-액틴에 대해 532㎚(텍사스 레드)에서 사용하였다.
In1B - PBK10 - Dox (I- Dox ) 어셈블리. 바이러스 캡시드-유래 융합 단백질, In1B-PBK10을 웰-확립 절차 후에 독소루비신과 함께 모았다. 간단하게, 상보적 올리고뉴클레오타이드 이중가닥을 등몰 농도의 30개 염기 올리고뉴클레오타이드인 LLAA-5(5'-CGCCTGAGCAACGCGGCGGGCATCCGCAAG-3')(서열번호 4) 및 그의 대응하는 역 보체인 LLAA-3과 함께 혼합함으로써 준비하였다. 혼합물을 5분 동안 비등시키고, 30분 동안 실온으로 냉각시켜 올리고뉴클레오타이드의 어닐링을 촉진시켰다. 이중 가닥 올리고를 1:10 몰 비(DNA:Dox)와 혼합하고 나서, 실온(RT)에서 30분 동안 인큐베이션시킨 다음, HBS 중의 In1B-PBK10:DNA-Dox의 6:1 몰비에서 In1B-PBK10과 함께 인큐베이션하고, 50k MW 컷오프(mwco) 필터막을 이용하는 한외여과로(2시간 내지 밤새 10% 글리세롤과 함께 사전인큐베이션시킴으로써 준비함) 불충분하게 수집된 구성성분으로부터 I-Dox를 단리시켰다. 복합체를 15분 동안 4000 x g에서 또는 용적이 80% 초과까지 감소될 때까지 원심분리시켰다. I-Dox 중의 Dox 농도를 480㎚에서의 측정 흡광도 또는 590㎚에서의 형광(예: 480㎚)을 Dox 흡광도 또는 형광 교정 곡선(미국 몰레큘라 디바이스에 소재한 스펙트라맥스(SpectraMax))에 대해 추론함으로써 결정하였다. Dox 계수 11, 500M-1㎝-1을 이용하여 비어-램퍼트(Beer-Lambert) 식: (최대 흡광도/ Dox 흡광 계수) x 희석 인자 = 농도(M)를 적용함으로써 Dox의 농도를 계산하였다. 실험에서 사용한 I-Dox 용량은 I-Dox 중의 Dox 농도에 기반한다.
In1B - PBK10 -Ga 조립체. 4℃에서 1시간 동안 암실에서 10x 몰 과량의 콜롤을 In1B-PBK10과 함께 부드럽게 교반하면서 인큐베이션시킴으로써 In1B-PBK10을 설폰화된 갈륨 콜롤(S2Ga)과 비공유적으로 조립하였다. 비결합 콜롤을 여과를 위한 제조업자의 절차에 따라 50 K MW 컷오프 스핀 칼름 필터(미국 매사추세츠주 빌러리카에 소재한 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation))를 통해 한외여과에 의해 제거하였고, 여과액이 정제될 때까지 복합체를 PBS로 세척하였다. 잔류물은 여과 과정 내내 밝은 녹색(콜롤 색소를 나타냄)으로 남아있었다. 잔류물을 PBS 중에서 재현탁시키고, 콜롤의 λmax에서의 흡광도에 대해 측정하여 앞서 기재한 바와 같은 콜롤 농도를 얻었다. S2Ga의 λmax는 단백질에 결합될 때, 예를 들어, 424로부터 429㎚로 이동하는 반면, 이는 복합체 중의 콜롤 농도의 추정값을 극적으로 변화시키지 않는다.
FACS 분석. In1B321의 결합을 평가하기 위해, H1993 및 Ln GFP 세포를 48시간 동안 배양시켰다. PBS로 2회 세척한 후에, 세포를 2mM EDTA 중에서 5 내지 10분 동안 37℃에서 인큐베이션시킴으로써 탈착시켰다. 0.01% MgCl2 및 CaCl2(0.01% PBS+)를 함유하는 PBS를 세포에 첨가하고 나서, 2000rpm에서 4분 동안 교반시켰다. 세포를 0.01% PBS+로 3회 이상 세척하고 나서, 재현탁시키고, 계수화하고 에펜도르프관 내로 나누었다. 관을 2분 동안 300 x g으로 교반시키고 나서, 표시된 농도의 In1B를 함유하는 PBS 중의 3% 우유와 함께 재현탁시키고, 냉장실에서 1시간 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 PBS와 함께 4회 세척하고 나서, 실온에서 30분 동안 PBS 중의 3% BSA 중에서 150배 희석시킨 RGS-His 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 4회 세척한 후에 그들을 3% BSA 중에서 2차 항체, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647 염소 항-마우스 IgG(H+L)와 함께 재현탁시키고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 4회 세척하고 나서, 0.1% PFA와 함께 15분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 4회 동안 다시 세척하고, 벡맨 쿨터 시안(Beckman Coulter Cyan) ADP FACS 기계를 이용하여 분석하였다.
In1B321에 의한 세포 결합이 c-MET를 통한다는 것을 입증하기 위해, In1B321 및 MET 펩타이드(메릴랜드주 록빌에 소재한 YCP2247 스피드 바이오시스템즈(SPEED BioSystems))를 얼음 상에서 30분 내지 40분 동안 1xPBS 중의 3% 우유 중에서 인큐베이션시킨 후에 세포에 결합시켰다. 결합 분석을 상기 기재한 바와 같이 수행하였다.
세포 풀 다운 분석. 48시간 동안 성장시킨 MDA-MB-435 세포를 5 내지 10분 동안 교반시키면서 37℃에서 1x PBS 중의 2mM EDTA를 이용하여 들어올렸다. 세포를 5분 동안 300 x g에서 스피닝시킨 후에, 그들을 1회 세척하고 완충제 A + 3% BSA 중에서 재현탁시킨 다음, 4개의 에펜도르프관에 나누었다(2 x 106개 세포/관). 세포를 다시 교반시키고 나서, 500㎕의 완충제 A + 3% BSA 내로 재현탁시켰다. 3개의 관에서, 0.4μM, 2μM 및 4μM의 In1B를 첨가하고, 단백질을 4번째 관에는 첨가하지 않았다; 모든 관을 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 비결합 In1B를 제거하기 위해 모든 세포를 세척 및 스피닝시킨 후에, 500㎕의 완충제 A 중의 0.4μM의 In1B-PBK10를 모두 4개의 관에 첨가한 다음, 수용체 결합을 촉진시키기 위해(그러나 내재화는 아님) 2시간 동안 얼음 상에서 흔들었다. 앞서 기재한 바와 같이 세포를 세척하고, 3회 교반시켰다. 이어서, 펠렛을 50㎕의 SDS-PAGE 샘플 완충제 중에서 현탁시키고, 1:5000 희석으로 In1B-PBK10에 특이적인 항체(Ad5 항체, 펩톤 베이스를 인식함)를 이용하여 SDS-PAGE/웨스턴 블롯팅에 의해 평가하였다.
실시예 3: 양쪽 옆구리 MDA -MB-435 종양을 보유하는 nu / nu 마우스에서의 In1-PBK10 생체 내 분포
배경
앞의 실시예(표제: c-Met에 표적화된 단백질 나노-작제물), 도 6에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-435 세포는 세포 표면 상에서 현저한 수준의 c-MET를 나타낸다. 게다가, 도 7e에서 나타낸 바와 같이, c-MET 표적화된 단백질 작제물인 In1B- PBK10은 c-MET 리간드인 In1B에 의해 경쟁적으로 저하된 상호작용을 통해 이들 세포에 결합하는데, 이는 이 작제물이 c-MET를 통해 이들 세포에 결합할 수 있음을 나타낸다. 도 8은 In1B-BKlO이 수용체 결합 후에 이들 세포에 유입된다는 것을 나타내고, 도 9c는 단백질이 막 불침투성 독성 분자(갈륨-금속화된 콜롤)의 이들 세포내로의 전달을 매개하여 세포사를 야기할 수 있다는 것(따라서, In1-PBK10이 엔도솜 막을 파괴할 수 있다는 것을 입증함)을 나타낸다.
결과
여기서 본 발명자들은 MDA-MB-435 종양을 지니는 마우스에서 In1-PBK10의 생체 내 분포를 평가하여 그것이 생체내 이들 종양에서 축적될 수 있는지의 여부를 평가하였다. 이를 위해서, MDA-MB-435 종양의 암컷 nu/nu 마우스 보유 양쪽 옆구리 이종이식물은 알렉사680(Alexa680)-표지 In1B-PBK10(2n㏖ 단백질)의 단일 정맥 RH리 주사를 받았고, 주사 후 표시한 시점에 640㎚ 여기 및 700㎚ 방출 필터를 이용하여 제노겐(Xenogen) 영상화에 의해 영상화하였다. 전체 동물 영상화는 주사 후 4시간까지 동물로부터의 형광의 상당한 클리어런스를 나타낸다(도 10A). 4시간 시점 후에, 마우스를 희생시키고, 종양 및 조직을 추가 영상화를 위해 제거하였다. 종양은 일부 형광 축적을 나타내지만, 주사한 물질의 상당한 비율을 4시간까지 신장에 대해 제거한 한편, 일부 형광은 간에서 검출가능하였다(도 10B). 심장, 비장, 폐, 뇌 및 골격근을 포함하는 남아있는 조직은 검출가능한 형광을 나타내지 않았다(도 10B). 추가 연구는 신장에 대한 전달이 빠른 제거의 결과인지를 결정할 뿐만 아니라 경쟁적 저해제를 이용하는 생체 내 분포를 결정하여 종양 전달이 c-MET를 통해 일어나는지를 확인하기 위해 이전의 그리고 이후의 시점에 조직 채취를 수반할 것이다.
실시예 4: 뇌 전이성 유방 종양의 나노생물학적 표적화
인간 상피 성장 인자 수용체 서브유닛 3(HER3)의 상승된 세포 표면 수준은 뇌에 퍼진 것을 포함하여 전이성 유방 종양과 관련된다. 현재 주변 유방 종양과 싸우기 위해 다수의 표적화된 치료법을 사용하고 있지만, 뇌 전이에 대한 이들 분자의 전달은 혈액 뇌 장벽(BBB)에 의해 제한된다. 이는 뇌에 대해 전이되는 HER2+ 유방 종양에 의해 예시하며: 이들 종양은, 트라스투주맙과 같은 HER2 항체에 의해 중추 신경계(CNS)의 외부를 표적화할 수 있지만, 이들 동일한 항체에 의해 도달될 수 없는데, HER2 서브유닛이 뇌 내피 상에 존재함에도 불구하고 혈액 혈관벽을 가로질러 항체 통과세포외 배출(transcytosis)을 매개하지 않기 때문이다.
반면에 HER3은 리간드 결합 시 뇌 내피를 가로질러 빠른 통과세포외 배출을 겪는데, 이는 뉴런 성장 및 유지를 위해 뉴레귤린 성장 인자의 전달을 매개하기 위해 정상적으로 일어난다. 본 발명자들은 자기-조립 나노생물학적 입자인 HerMn을 개발하였는데, 이는 종양 세포 내로 독성 분자의 표적화된 유입을 위한 관문으로서 HER3을 사용한다. HerMn은 설폰화된 망간(III) 콜롤(S2Mn 또는 Mn-콜롤)과 비공유적으로 조립된 수용체-표적화된 세포 침투 단백질인 HerPBK10을 포함하는 10 내지 20㎚ 직경의 혈청-안정성 입자이다(도 11). HerPBK10의 표적화 도메인은 리간드, 즉, 헤레귤린 알파로부터 유래되는데, 이는 인간 상피 성장 인자 수용체 서브유닛 3(HER3)과 특이적으로 상호작용하며, 빠른 수용체-매개 세포내 섭취를 유도한다. HER3은 HER2의 바람직한 이량체화 상대이고, HER2-3 이형이량체는 HER2+ 종양 세포 상에서 일반적이기 때문에, 본 발명자들은 앞서 HerPBK10이 마우스에서 HER2+ 종양에 대한 치료적 및 영상화 분자를 표적화하여 화학치료제인 독소루비신에 비해 10x 초과로 더 낮은 용량에서 종양 성장 절제를 매개하는 한편, 심장 및 간 조직을 보존하고, 검출가능한 면역원성은 없다는 것을 나타내었다. HerMn에 의한 종양-표적화된 독성은 미토콘드리아 막 파괴 및 세포골격에 대한 초산화물-매개 손상에 의해 일어난다. HerMn은 또한 콜롤의 상자성 특성에 기인하여 자기 공명 영상화(MRI)에 의한 종양-선택적 검출을 유발할 수 있다.
HerMn은 마우스에서 전신 주사 후에 뇌에 분배되는 것으로 나타나며, 추가로 피하 HER2+ 종양에 대한 바람직한 귀소 및 독성을 나타낸다. 흥미롭게도, Mn 콜롤은 정상 세포에 대한 그의 항산화활성에 기인하여 신경보호 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 뒷받침하면, HerMn은 생체밖 인간 심장 세포 생존을 지원한다. 종합하면, HerMn은 뇌-전이성 유방 종양에 대해 독성을 표적화하는 능력을 가질 수 있지만, 뇌 및 심장과 같은 정상 조직에 대해 유리한 보호 효과를 제공하는 그의 표적화 용량과 능력 둘 다에 기인하여 표적을 벗어난 조직을 보존하는 것을 추측하는 것은 흥미롭다.
배경
뇌 전이는 심각한 임상 문제이다. 뇌에 대한 유방암 전이를 지니는 환자는 평균적으로 1년 미만으로 생존한다. 표적화된 치료법의 증가된 레퍼토리는 주변 종양을 치료하기 위해 생겨났지만, 대부분은 혈액 뇌 장벽(BBB)을 가로지르는 그들의 불능에 기인하여 뇌 전이를 치료하는데 적합하지 않다. 이것의 예는 HER2+ 유방암을 치료하는데 인간 상피 성장 인자 수용체 서브유닛 2(HER2)와 관련된 단클론성 항체인 트라스투주맙(Tz)의 사용이다. HER2+ 암은 공격적 종양, 표준 치료법에 대한 저항, 전이 및 증가된 사망률과 관련된다. 뇌로 전이된 HER2+ 종양은 Tz에 의해 치료될 수 없는데, HER2는 뇌 내피 상에 존재함에도 불구하고 혈액 혈관벽을 가로지르는 통과세포외 배출을 야기하지 않는다. HER2-이며 또한 뇌-전이성인 삼중-음성 유방암(TNBC)은 특이적 세포 표면 바이오마커의 결여에 기인하여 선택사항이 훨씬 더 적다. 라파티닙(Lp), 즉, HER2 및 EGFR의 소분자 타이로신 키나제 저해제(TKI)는 종양 유형 둘 다를 표적화하기 위해 세포막을 용이하게 침투할 수 있지만, 이들 종양은 HER3의 상승에 부분적으로 기인하여 이러한 저해제에 내성이 생길 가능성이 있다.
결과
HerPBK10은 HER3에 특이적이다. HerPBK10은 아데노바이러스 펩톤 베이스 캡시드 단백질로부터 유래된 막-침투성 모이어티에 융합된 HER3 리간드인 헤레귤린-cc(Ig-유사 및 EGF-유사 도메인을 포함하는 아미노산 35 내지 239)의 수용체 결합 영역을 포함한다(도 11A). HerPBK10은 본래 단일 다중도메인 단백질 분자 내에서 페이로드 조립체, 표적화, 내재화 및 엔도솜 침투 기능을 포함하는 비-바이러스 유전자 전달 벡터로서 설계하였다. HER3은 HER2의 바람직한 이량체화 상대이고, HER2-3 이형이량체는 HER2+ 종양 세포 상에서 우세하기 때문에, HerPBK10은 마우스에서 HER2+ 종양에 대한 치료적 분자 및 영상화 분자를 표적화하여 화학치료제인 독소루비신에 비해 10x 초과로 더 낮은 용량에서 종양 성장 절제를 매개하는 한편, 심장 및 간 조직을 보존하고, 검출가능한 면역원성은 없다는 것을 나타내었다.
HER3에 대한 HerPBK10의 특이성은 인간 HER3의 세포외 도메인을 함유하는 고정된 펩타이드에 대한 그의 결합 능력에 의해 뒷받침된다(도 12A). 이는 시험관내 유리 HER3 펩타이드를 이용하는 HerPBK10의 사전 흡착에 의해 저해된다(도 12A). 동일한 펩타이드는 또한 인간(도 12B)과 마우스(도 13B 내지 도 13C) HER3+ 세포 둘 다에 대한 결합을 저해한다. 특히, 마우스 및 인간 HER3의 리간드-결합 도메인은 높은(94%) 서열 동일성을 공유한다(도 13A). HER2-3 이형이량체는 HER2+ 종양 세포 상에서 우세하지만, 이형이량체화-저해 항체인 퍼투주맙(Pz)은 세포의 HER3에 대한 HerPBK10 결합을 방지하지 못하는데(도 12B), 이는 HER2-3 이량체화가 HerPBK10 결합에 필요하지 않다는 것을 나타낸다. 결합은 또한 HER4 펩타이드 또는 베타셀룰린(이는 HER4를 차단함)에 의해 저해되지 않는데(도 12B), 이는 HerPBK10이 HER3-특이적이라는 것을 나타낸다.
HER2+ 환자 및 연령 매칭 대조군으로부터의 혈청은 경쟁적 저해제로서 사용한 과량의 재조합체 리간드(+Her)의 첨가와 대조적으로 배양물 내 HER2+ 세포에 대한 HerPBK10 결합을 방지하지 못한다(그리고 서로 간에 상당한 차이를 나타내지 않는다)(도 12C). 이전의 연구는 면역-적격 마우스에서 HerPBK10의 반복체 투약이 단백질에 대해 검출가능한 중화 항체 형성을 생성하지 않는다는 것을 나타내었다. 게다가, HerPBK10을 인식할 수 있는 전체 아데노바이러스에 대해 생성된 다클론성 항체는 배양에서 세포에 대한 수용체 결합을 방지하지 못한다.
HerPBK10은 Mn- 콜롤과 자기 조립되어 HerMn 나노입자를 형성한다. HerPBK10의 카복시 [C]-말단은 콜롤을 포함하는 음이온성 분자에 대한 친전자성 결합을 매개할 수 있는 데카라이신 꼬리를 포함한다(도 11A). 콜롤은 포르피린과 구조적 유사성을 지니는 거대환식 분자이며 마찬가지로 금속 리간드를 함유할 수 있다(도 11B). 설폰화된 콜롤은 양친매성이며, 생리적 용액 중에서 가용성이고, 친전자성 및 소수성 상호작용을 포함하는 비공유적 상호작용을 통해 단백질에 자발적으로 결합할 수 있다. 음이온성 설포네이토기는 음으로 하전된 세포막에 의한 반발에 기인하여 비특이적 세포 유입을 방지하며, 따라서 운반 단백질을 통해 표적 세포 내로의 콜롤 전달을 지시할 가능성이 있다. 본 발명자들은 HerPBK10을 설폰화된 망간(III) 콜롤(S2Mn 또는 Mn-콜롤)과 조합하여 HerMn으로 표기하는 빠르게 자기 조립하는 10 내지 20㎚ 직경 입자를 형성한다(도 11C 내지 도 11D). 이들 입자는 단일 단백질(25 내지 35개 콜롤/단백질)에 결합된 다중 콜롤 분자를 함유하며, 고속 한외여과를 견뎌 낼 수 있다. 이들 결과는 콜롤이 무시할 수 있는 해리를 지니는 단백질 포켓에서 결합할 수 있고 HerPBK10에 일단 결합되면 혈청 단백질에 대한 전달에 저항한다는 본 발명자들의 이전의 연구 및 본 발명자들의 공동 연구자들의 연구와 일치된다.
HerMn은 HER3 + 종양을 표적화한다 . HerMn은 HER2+/HER3+에 대해 표적화된 독성을 나타내지만 배양물 내 HER2-/HER3- 종양 세포에 대해서는 그렇지 않은 반면, Mn-콜롤은 세포 생존에 대해 효과가 없다. 데이터를 도 14에 나타내며, 여기서 각각의 세포주는 표시된 농도의 HerMn 또는 S2Mn을 받았고, 크리스탈 바이올렛(CV) 염색을 통해 24시간 후에 생존에 대해 평가하였다. 3회의 별도의 실험으로부터 N=3/농축물. HerPBK10의 표적화 리간드는 수용체 결합 후에 빠른 세포내 섭취를 유도하는 것으로 나타났다. 설폰화된 콜롤은 그 자체에 대한 엔도솜 막을 파괴할 수 없고, HerPBK10의 펩톤 베이스 모이어티는 식균 작용의 흡수 및 세포질 내로의 유입 후에 효과적인 막 파괴를 가능하게 한다.
하나의 실험에서, 세포는 24시간 이후에 HBSS 중에서 10μM S2Mn 또는 HerMn, 이어서 TMRM(30nM)를 받았다. 결과를 도 15A에 나타내며, 여기서 대조군은 PBS-처리된다. 공초점 형광 영상(도 15B)는 MDA-MB-435 세포에 대한 인큐베이션의 24시간 후에 HerMn(5μM)에 의한 액틴(적색) 및 튜불린(녹색)의 초산화물-매개 붕괴를 나타낸다. S2Mn(5μM), HerPBK10(HerMn과 등가인 단백질 농도에서) 및 PBS는 대조군으로서 작용하였다. 추가적인 세포는 HerMn 처리 전 1시간 동안 타이론(Tiron)(5mM)을 받았다. 청색, 핵. 기준자=10㎛
일단 세포질에서, HerMn은 미토콘드리아 막 퍼텐셜(도 15A) 및 이들 구조에 대한 초산화물 상승 및 산화적 손상을 통한 세포골격(도 15B)을 붕괴시키는데, 이는 갈륨(III) 콜롤(S2Ga 또는 Ga-콜롤)과 일치된다.
Ga-콜롤은 미토콘드리아 외막 단백질인 TSPO에 직접 결합한다는 것을 발견한다. 결과를 도 16에 나타낸다. 가용성 재조합 TSPO 단백질은 실온에서 대략 20분 동안 등몰 농도(1μM)에서 S2Ga와 함께 인큐베이션한 다음 한외여과로 유리, 비결합 S2Ga을 제거하였다. 흡광도 및 형광 스펙트럼을 측정함으로써 TSPO 단백질-결합 콜롤의 존재에 대해 잔류물을 평가하였다. 지시되는 경우, PK11195를 TSPO에 대한 포르피린-결합 부위에 대한 경쟁적 저해제로서 사용하였다(도 16A 내지 도 16B). 인시추로 TSPO와의 HerGa 상호작용 증거가 있다. 세포를 HerGa으로 처리하기 24시간 전에 MDA-MB-435 세포를 (내인성 TSPO 결합의 경쟁적 저해제로서) 외인성 TSPO를 발현시키는 플라스미드로 형질감염시키고, HerGa-매개 미토콘드리아 파괴에 대해 시험하였고, 이는 미토콘드리아에서의 감소된 적색 형광 염료 축적 및 세포질에서 축적된 녹색 형광에 의해 증명되었다(도 16C 내지 도 16D).
TSPO는 가공을 위해 미토콘드리아 내로 포르피린 및 다른 대사산물을 전위시키며, 미토콘드리아 침투성 전이 기공 복합체의 구성성분과 상호작용하고, 세포의 항상성에 기여한다. Ga-콜롤은 TSPO 상의 포르피린-결합 부위를 특이적으로 인식하는데(도 16A 내지 도 16B), 콜롤 결합이 TSPO에 대한 포르피린 결합을 저해하는 PK11195에 의해 경쟁적으로 저해될 수 있기 때문이다. MDA-MB-435 세포 내 재조합 가용성 TSPO의 과발현은 미토콘드리아 막 퍼텐셜의 콜롤-매개 파괴를 방지하는데(도 16C 내지 도 16D), 이는 콜롤이 인시추로 TSPO와 상호작용한다는 것을 시사한다. Mn-콜롤은 Ga-콜롤과 유사하게 미토콘드리아 막 파괴를 나타내기 때문에, TSPO는 Mn-콜롤의 분자 표적일 가능성이 있다. 이종이식 마우스 종양 모델에서, HerMn은 전신 전달 후에 생체내 종양으로 귀소하며, 심장을 포함하는 대부분의 정상 조직을 우회하고(도 17), 매우 낮은 약학적 용량(0.008㎎/㎏)으로 종양 성장을 제거한다(도 18A). Mn-콜롤은 또한 상자성이며, 따라서 MRI에 유용하다.
마우스에서의 전신 전달 후에 종양 내 축적에 추가로, HerMn은 트라스투주맙 (Tz)과 대조적으로 뇌에 분포될 수 있다는 것을 발견하였다(도 17). 또한 종양이 없는 마우스의 꼬리 정맥에 주사한 HerPBK10은 뇌 국소화를 나타내는 반면, PBK10의 전신 전달(HER3 표적화 리간드가 없음)은 검출가능한 뇌 전달을 나타내지 않는다(도 19). 또한 HerMn은 인간 심장공-유래 세포(cardiosphere-derived cell: CDC)에 대해 비독성일 뿐만 아니라 장기간 노출에 의한 상승 용량에서 독소루비신(심장 독성이 알려짐) 및 HerPBK10 단독(종양 세포 또는 CDCdp 대해 독성 또는 성장 촉진 효과가 없음)과 대조적으로 배양에서 CDC 생존을 증가시킨다는 것을 발견하였다(도 18B). 이는 시험관내 및 생체내 시신경병증 모델에서의 이전의 발견을 뒷받침하는데, 이는 Mn-콜롤이 신경보호적일 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 Mn-콜롤에 대해 독특한 것으로 나타나는데, Ga-콜롤은 이러한 신경보호 효과를 나타내지 않기 때문이다.
종합하면, 이들 결과는 HerMn이 정상 조직에 대해 유리한 효과를 부여하는 한편 종양 조직, 특히 상승된 HER3을 지니는 뇌 전이에 대해 독성을 표적화한다는 것을 나타낸다. HerMn의 표적화 특이성은 이 지적을 덜 적절하게 하는데, 대다수의 전체 입자가 비종양 조직에 분포되는 것으로 나타나기 때문이다(도 17). 그러나, 상대적으로 낮은 콜롤 수준은 신경보호뿐만 아니라 종양 독성을 얻기 때문에(도 18A), 이 잠재적 이중 활성은 가치있는 탐구이다.
적용분야
HerMn은 뇌-전이성 유방 종양에 대해 독성을 전달하는 능력을 갖는 반면, 뇌 및 심장과 같은 정상 조직에 대한 보호를 제공하는 그의 표적화 용량과 능력에 기인하여 표적을 벗어난 조직을 보존하였다.
실시예 5: 예르시니아 엔테로콜리티카 ( Yersinia enterocolitica ) 인바신 -유래 펩타이드를 이용하는 베타-1 인테그린의 표적화
예르시니아 엔테로콜리티카는 장 상피, 특히 장벽의 페이에(Peyer) 패치를 침입하며, 식중독을 야기하는 박테리아 병원균이다. 장 상피의 결합 및 유입은 페이에 패치 위에 놓인 상피 세포 상에서 우세하게 발현되는 베터-1 인테그린과 박테리아 인바신(Inv) 단백질의 상호작용을 통해 일어난다.
인바신을 함유하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 플라스미드(pHIT123-Inv)를 PCR 주형으로서 사용하였고, 베타-1 인테그린 결합 부위(대략 600bp)를 암호화하는 한편 표적화된 전달을 위해 외인성 펩타이드 내로 프레임내 클로닝을 위한 제한 부위를 도입하는 최소 서열을 증폭시키도록 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 설계하였다. 사용한 프라이머는 다음의 서열을 포함하였다: 5'-ACAGAGCTCATAACCGGC ATTAACGTGAAT-3'(서열번호 6); 5'-CTGTGTGCGGAGCCGCAATAGGAATTCATC-3'(서열번호 7); 및 5'-GATGAATTCCTATTGCGGCTCCGCACACAG-3'(서열번호 8). Inv 삽입물에 대해 SacI 및 EcoRI 제한 부위를 증폭 및 첨가하기 위해 이들 프라이머를 사용한다. 추가적인 프라이머는 다음의 서열을 포함하였다: 5'-GTCCAAAACCAAGAAAAGGCGGAGCAGCTGTAC-3'(서열번호9); 5'-ACAATGACGCGTGTACAGCTGCTCCGCCTTTTCTTGGTTTTGGAC-3'(서열번호 10); 5'-CCGCTGTGTGCGGAGCCGCAAGGAGGAACGCGTACACAC-3'(서열번호 11); 5'-GTGTGTACGCGTTCCTCCTTGCGGCTCCGCACACAGCGG-3'(서열번호 12); 및 5'-AC ACACGGATCCTTGCGGCTCCGCACACAGCGG-3'(서열번호 13). 이들 프라이머는 노브(Knob) 또는 전장 섬유 작제물 중 하나에 클로닝을 위해 MluI 또는 BamHI 제한 부위를 도입한다.
외인성 펩타이드는 아데노바이러스(Ad) 캡시드 섬유 및 노브 단백질을 암호화한다. 섬유질은 감염을 개시하기 위해 1차 세포 결합을 매개하고 N-말단의 긴 섬유성 샤프트 도메인 다음에 C-말단의 구형 노브 도메인을 포함하는 Ad 캡시드로부터 연장되는 각각의 안테나-유사 돌출부를 기술한다. 노브 도메인은 세포 표면 수용체와 특이적으로 상호작용하고 샤프트 없이 가용성 단백질로서 생성되는 것이다. Inv는 PBK10에 융합될 때 효과적인 리간드이다.
노브 서브도메인을 Inv로 대체하는 두 전략을 이용하여 Inv 서열을 노브 내로 삽입해서, 재조합 노브 작제물, 즉, ABCJ-Inv 및 AGJ-Inv을 생성하였다. 재조합 단백질을 N-말단의 GFP-태그된 단백질(GFP-ABCJ-Inv 및 GFP-AGJ-Inv)과 비태그 단백질 둘 다로서 이들 작제물을 발현시키는 pRSET 벡터로부터 박테리아에서 생성한다. 제3 전략에서, Inv를 노브의 DG 루프 내로 삽입하고 나서, 시험관내 번역에서 사용하여 S35-표지 단백질을 생성하였다. 천연 겔 전기영동은 야생형 노브와 유사하게 올리고머(이량체 및 삼량체)의 형성을 유지하였음을 나타내었다(따라서, Inv가 융합 단백질의 3차 구조를 혼란시키지 않았음을 시사한다). 모든 시나리오에서, 전장 가용성 단백질이 생성된다.
Inv를 전장 섬유 단백질의 노브로 대체한 작제물을 또한 생성하였다. 바큘로바이러스 벡터를 사용하여 박테리아 내 단백질을 발현시켰다. 전장 섬유 단백질의 샤프트와 노브 도메인 사이에 Inv를 발현시키기 위해 제2 섬유 작제물을 생성하였고, 인자X 절단 부위를 Inv와 노브 사이에 도입하였다.
실시예 6: CD4에 대한 리간드
인간 면역결핍 바이러스(HIV) gp120 외피 단백질의 CD4 결합 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열인 TITLPCRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTR(서열번호 5)은 CD4에 대한 결합에 충분하다. 이 서열을 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 얻었다. 서열번호 5를 암호화하는 핵산 서열(대략 132nt)을 p블루스크립트(pBluescript)(PSK) 플라스미드 내로 클로닝시켰다. 브롬화 에피듐 염색 전기영동 겔은 BamHI-EcoRI 분해에 의해 벡터(대략 3kb)로부터의 삽입물(대략 132nt)의 절제를 나타내었다. 이어서, 얻어진 산물을 CD4를 발현시키는 세포(즉, "헬퍼" T-세포)에 이러한 전달 단백질을 표적화하기 위한 외인성 펩타이드, 예컨대 PBK10를 이용하여 프레임내 삽입한다.
SEQUENCE LISTING <110> CEDARS-SINAI MEDICAL CENTER <120> RECEPTOR TARGETING CONSTRUCTS AND USES THEREOF <130> WO/2015/109264 <140> PCT/US2015/011870 <141> 2015-01-16 <150> US 61/928,903 <151> 2014-01-17 <160> 13 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agtgagctcg agactatcac tgtg 24 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gttggtgact ttctcccacc ttcaccacct tcatctagat atccatggta t 51 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized sequence <400> 3 Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cgcctgagca acgcggcggg catccgcaag 30 <210> 5 <211> 44 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 5 Thr Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln Phe Ile Asn Met Trp Gln 1 5 10 15 Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile Arg 20 25 30 Cys Ser Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg 35 40 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Yersinia enterocolitica <400> 6 acagagctca taaccggcat taacgtgaat 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Yersinia enterocolitica <400> 7 ctgtgtgcgg agccgcaata ggaattcatc 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Yersinia enterocolitica <400> 8 gatgaattcc tattgcggct ccgcacacag 30 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Yersinia enterocolitica <400> 9 gtccaaaacc aagaaaaggc ggagcagctg tac 33 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Yersinia enterocolitica <400> 10 acaatgacgc gtgtacagct gctccgcctt ttcttggttt tggac 45 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Yersinia enterocolitica <400> 11 ccgctgtgtg cggagccgca aggaggaacg cgtacacac 39 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Yersinia enterocolitica <400> 12 gtgtgtacgc gttcctcctt gcggctccgc acacagcgg 39 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Yersinia enterocolitica <400> 13 acacacggat ccttgcggct ccgcacacag cgg 33

Claims (28)

  1. 약물 전달 분자로서,
    세포 표면 분자를 표적화하는 리간드;
    막 관통 도메인; 및
    페이로드 결합 도메인(payload binding domain)을 포함하는, 약물 전달 분자.
  2. 제1항에 있어서, 치료제를 더 포함하는, 약물 전달 분자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 치료제는 상기 페이로드 결합 도메인과의 복합체를 형성하는, 약물 전달 분자.
  4. 제3항에 있어서, 상기 복합체는 공유 또는 비공유인, 약물 전달 분자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약물 전달 분자는 직경이 약 5㎚ 내지 약 50㎚인 나노입자인, 약물 전달 분자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포 표면 분자는 단백질, 단백질에 부착된 탄수화물 모이어티 또는 이들의 조합물인, 약물 전달 분자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 세포 표면 분자는 수용체이고, 상기 리간드는 암세포 상에서 상기 수용체를 표적화하는, 약물 전달 분자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 암세포는 폐암, 신장암, 간암, 위암, 유방암, 결장직장암, 위암, 난소암, 비소세포폐암종 또는 뇌암 세포 중 임의의 하나 이상인, 약물 전달 분자.
  9. 제7항에 있어서, 상기 수용체는 c-Met, HER2, HER3, CD4 및 CD20으로 이루어진 군으로부터 선택된, 약물 전달 분자.
  10. 제7항에 있어서, 상기 리간드는 단백질, 단백질 단편, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 항체, 항체 단편 및 작은 유기 분자로 이루어진 군으로부터 선택된, 약물 전달 분자.
  11. 제7항에 있어서, 상기 리간드는 간세포 성장인자(HGF), 인터날린 B, 박테리아 인바신(Inv) 단백질 및 서열번호 5에 제시된 서열을 갖는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된, 약물 전달 분자.
  12. 제1항에 있어서, 상기 막 관통 도메인은 아데노바이러스로부터 얻은 펩톤 베이스 단백질 또는 이의 단편인, 약물 전달 분자.
  13. 제1항에 있어서, 상기 페이로드 결합 도메인은 데카라이신 모티프인, 약물 전달 분자.
  14. 제2항에 있어서, 상기 치료제는 알킬화제, 항대사물질, 항종양 항생제, 유사분열 저해제, 코르티코스테로이드, 세포독성제 또는 이들의 조합물 중 임의의 하나 이상인, 약물 전달 분자.
  15. 제2항에 있어서, 상기 치료제는 단백질, 단백질 단편, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 핵산, 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), mRNA, tRNA, rRNA, ssRNA, siRNA 및 작은 유기 분자로 이루어진 군으로부터 선택된, 약물 전달 분자.
  16. 제2항에 있어서, 상기 치료제는 콜롤 화합물(corrole compound), 트레오설판, 트로포스파마이드, 빈블라스틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에토포사이드, 캄프토테신, 토포테칸, 이리노테칸, 네티포사이드, 크리스나톨, 미토마이신, 메토트렉세이트, 마이코페놀산, 하이드록시유레아, 5-플루오로유라실, 독시플루리딘, 사이토신 아라비노사이드, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 2'-데옥시-5-플루오로유리딘, 아피디콜린 글리시네이트, 피라졸로이미다졸, 할리콘드린, 콜히친 및 리족신, 또는 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된, 약물 전달 분자.
  17. 약제학적 조성물로서.
    약물 전달 분자; 및
    약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하되,
    상기 약물 전달 분자는,
    세포 표면 상에서 수용체를 표적화하는 리간드;
    막 관통 도메인; 및
    페이로드 결합 도메인을 포함하는, 약제학적 조성물.
  18. 암의 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    상기 치료가 필요한 대상체를 동정하는 단계;
    제1항의 약물 전달 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및
    상기 대상체에서 암을 치료하기 위해 상기 대상체에게 유효량의 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 암은 백혈병, 골수종, B-세포 림프종(호지킨 림프종 및/또는 비호지킨 림프종), 뇌암, 유방암, 결장직장암, 폐암, 간세포암, 신장암, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 갑상선암, 신세포암, 암종, 흑색종, 두경부암, 뇌암, 전립선암, 안드로겐-의존성 전립선암 및 안드로겐-독립성 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 리간드는 인터날린 B 또는 이의 단편이고, 상기 막 관통 도메인은 펩톤 베이스 단백질 또는 이의 단편이며, 상기 페이로드 결합 도메인은 데카라이신 모티프인, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 조성물은 세포독성제를 더 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  22. 제18항에 있어서, 상기 세포독성제는 콜롤 화합물, 트레오설판, 트로포스파마이드, 빈블라스틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에토포사이드, 캄프토테신, 토포테칸, 이리노테칸, 네티포사이드, 크리스나톨, 미토마이신, 메토트렉세이트, 마이코페놀산, 하이드록시유레아, 5-플루오로유라실, 독시플루리딘, 사이토신 아라비노사이드, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 2'-데옥시-5-플루오로유리딘, 아피디콜린 글리시네이트, 피라졸로이미다졸, 할리콘드린, 콜히친, 및 리족신, 또는 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  23. 제18항에 있어서, 추가적인 치료법을 투여하는 단계를 더 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  24. 제18항에 있어서, 상기 조성물 및 상기 추가적인 치료법은 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  25. 제18항에 있어서, 상기 추가적인 치료법은 수술, 방사선, 면역치료법, 백신 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상인, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  26. 암 진행의 저해가 필요한 대상체에서 암의 진행을 저해하는 방법으로서,
    치료가 필요한 대상체를 동정하는 단계;
    제1항의 약물 전달 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및
    상기 대상체의 상기 진행을 저해하기 위해 상기 대상체에게 유효량의 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암의 진행을 저해하는 방법.
  27. 암 전이의 예방이 필요한 대상체에서 암의 전이를 예방하는 방법으로서,
    치료가 필요한 대상체를 동정하는 단계;
    제1항의 약물 전달 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및
    상기 대상체에서 암 전이를 예방하기 위해 상기 대상체에게 유효량의 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 전이를 예방하는 방법.
  28. 뇌에 치료적 화합물의 전달이 필요한 대상체에서 뇌에 치료적 화합물을 전달하는 방법으로서,
    치료가 필요한 대상체를 동정하는 단계;
    제1항의 약물 전달 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및
    상기 대상체에게 유효량의 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 뇌에 치료적 화합물을 전달하는 방법.
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