KR20160106795A - 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양 또는 분화용 배지 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양 또는 분화용 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 본 발명의 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양 또는 분화용 조성물 및 방법은 줄기세포의 분화 및 배양에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양 또는 분화용 배지 조성물{Compositions for Culturing or Differentiating Stem Cells Comprising Biocompatible Solubilized Scaffold Extract Derived from Decellularized Organ Tissue as an Active Ingredient}

본 발명은 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양 또는 분화용 배지 조성물에 관한 것이다.

동소 간(Orthotopic liver) 이식은 말기 간 질환 환자를 살리기 위한 유일한 표준 치료이다. 이러한 절차와 관련하여 기증 간에 대한 수요, 간 기증자의 부족뿐 만 아니라 이식 후 거부 반응과 같은 심각한 문제가 있다. 기증자 기관의 만성적 부족을 보완하기 위한 하나의 잠재적인 방법은 생체 인공(bioartificial) 간 및 보조(secondary livers) 간을 개발하는 것이다. 간은 구조가 매우 복잡하고, 해독, 단백질 합성 및 분해에 필요한 생화학 물질의 생산을 포함하여 신체 내에서 다양한 기능들을 갖는다. 따라서, 구성 요소, 구조 및 기능에 있어서, 간과 동일한 인공 지지체(scaffold)를 제조하는 것은 어렵다. 또한, 양호한 생체 적합성, 적합한 다공성을 가지며 조성, 형태, 구조 상 생체 간과 유사해야 한다. 따라서, 조직 공학, 장기 이식 및 약물 스크리닝을 위한 기능적인 생체 공학적 간의 제조는, 탈세포화 과정을 이용하여 구축될 수 있다. 계면활성제(detergent)를 이용하여 간 조직으로부터 세포 내 구성 요소를 완전히 제거하면, 온전한 간 특이 ECM 및 혈관 네트워크의 구조적 및 기능적 특징들은 잘 보존된다. 조직 공학에 있어 탈세포화된 매트릭스의 응용 잠재력은 방광, 동맥, 식도, 피부 및 기관을 포함한 다수의 조직에 대해 확인된 바 있다. 조직 또는 장기의 탈세포화는 세포 배양 및 이식을 위한 기능 적 스캐폴드를 제조하는 유망한 접근법으로 연구되어 왔다.

재생 의학 및 조직 공학용 인공 간을 개발하기 위해서는, 두 가지 기본적이고 상호보완적인 핵심 요소가 요구된다. 첫 번째는, 모든 세포외 기질(extracellular matrix) 단백질을 보존하고 천연 간 구조를 모방한 생물학적으로 호환가능한 스캐폴드이다. 합성 또는 천연 유래의 다수의 기질들이 간 조직 공학에 이용되어 왔다. 그러나, 대부분의 합성 기질들은 생체 적합성에 문제가 있었다. 탈세 포화 간 스캐폴드는 세포외 기질, 단백질 및 혈관을 유지하고 있어 가장 적합하고 신뢰할 수 있는 소스이다. 두 번째는, 정상적인 간 기능 수행하도록 지지할 수 있는 리시딩(reseeding)을 위한 적합한 세포 공급원이다. 성공적인 조직 재생을 위해서는 조직을 구성하는 세포가 필수적이다. 증식 활성 및 세포 분화 잠재력을 고려할 때, 줄기 세포가 실질적으로 유망한다. 자가재생(self-renewal)은 줄기세포에 멀티- 분화능(multi-potential differentiation ability)을 부여하는 줄기세포 고유의 특성이다. 간 세포로 분화 할 수 있는 성체 줄기 세포(adult stem cells), 태아 간 전구세포(fetal hepatic progenitor) 및 만능 줄기세포(pluripotent stem cells)와 같은 많은 세포 소스가 있다. 그러나, 간세포로의 성체 줄기세포의 분화 가능성은 여전히 논란이 있고, 다능성 줄기세포는 간세포 분화에 대해 유망한 것으로 나타났다. 한편, 간 조직으로부터 플라스틱 인 비트로 상 분리 및 배양된 간세포들은 연약하다. 이러한 세포들은 빠르게 간-특이 기능을 잃고, 인해 적절한 환경 기반의 부족으로 세포 사멸사하는 경향이 있다. 배아 줄기세포(ES, Embryonic stem cells) 및 유도만능줄기세포(iPS, Induced pluripotent stem cells)는 인 비트로 및 인 비보 상에서 간세포로 분화할 수 있는 잠재력을 유지하면서, 인 비트로 상에서 무제한적으로 증식하는 증식능을 가지고 있다. ES는 매우 원시적인 줄기 세포이며, 세 개의 모든 배엽으로 분화할 수 있고, 또한, 외인성 성장인자에 기반하여 최종적인 세포 유형으로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있기 때문에, ES는 여전히 재생 치료를 위한 최선의 모델을 고려된다. 그러나, 대부분의 연구는 2D 세포 배양 시스템에서의 ES로부터 간세포 분화를 보고하고 있고, 3D 인공 스캐폴드에서의 분화는 많이 보고되지 않았으며, 여전히 보다 많은 조사가 필요하다. 적용가능한 세포 소스, 스캐폴드 생체 적합성 및 면역학적 장벽과 같은 아직 많은 어려움을 극복해야 한다.

최근의 연구들은 주로 탈세포화된 전체 간 구조의 응용에 초점을 맞추고 있다. 또한, 코팅 물질 또는 주사 가능한 하이드로 겔과 같은 다른 종류의 생체 물질을 제조하기 위한 탈세포화된 간 조직의 범용성도 연구되고 있다. 세포 특이적인 인 비보 미세 환경에 보다 가깝게 모방할 수 있으므로, 특정 조직으로부터 자연적인 ECM을 얻고 이용하는 것은 이상적인 성장 환경을 제공 할 수 있다. 탈세 포화 기술의 발달로, 완전한 신규한 생체 재료로서의 조직 특이적 세포외 기질(ECM)은 많은 연구자들의 관심을 끌고 있다. 단일 단백질의 다양한 연구 조합에서, 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌 또는 매트리겔은 코팅 물질로서 사용되었지만, 그들은 조직-특이적 결합 또는 다양한 단백질 및 다당류의 비율적인 면에서, 인 비보 ECM을 완벽하게 캡슐화시키지 않는다. ECM 스캐폴드 및 기질(substrate)은 조직 공학을 위한 이상적인 후보이다. ECM은 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌 및 글리코사미노글리칸(GAG)과 같은 섬유질 단백질의 교합하는 그물망을 구성하기 때문이다. 또한, ECM은 성장인자(GF)의 결합 및 세포-표면 수용체와의 상호작용하면서 중요한 형태학적 조직 및 생리학적 기능을 지시하여 시그널 전달을 유도하고, 유전자 전사를 조절한다.

매트리겔과 콜라겐과 같은 다양한 물질들은 서로 다른 세포 유형으로 분화시키기 위한 배양 접시의 코팅에 이용되어 왔다. 그러나, 이러한 물질들은 특정 기관 분화에 유리한 생체-유사 미세 환경에는 완벽하게 맞지 않다. 이에 본 발명자들은 탈세포화된 스캐폴드에서 유래된 특정 2D 기판 코팅을 개발하여, mES 세포의 완전한 내배엽(definitive endoderm)으로의 분화에 적용하였다.

따라서, ECM을 포함하는 탈세포화된 간 조각은 줄기세포의 분화를 위한 생체모방적인(biomimetic) 2D 환경 및 배지 환경을 제공할 수 있으며, 이는 조직 공학에서의 응용 가능성을 나타낸다.

본 발명자들은 줄기세포의 배양 또는 분화를 위한 생체 조직 유래의 신규한 생체적합성 물질을 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 간 세포외 매트릭스로부터 지략적인 플랫폼으로 개발된, mES 세포 배양 및 분화에 생체 적합한 2-차원 기질 코팅 물질인 SSE(solubilized scaffold extract)를 배양용기 코팅 및 배양 배지에 적용하여 mES 세포들의 분화를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 줄기세포 배양 또는 분화용 배지 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포 배양 또는 분화 방법을 제공하는 데 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양 또는 분화용 배지 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "배지(media)"는 인 비트로에서 줄기세포 성장, 분화 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 줄기세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.

또한 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)은 하기와 같은 단계에 의해 제조된다:

(a) 생체 조직을 탈세포화(decellularization)하는 단계;

(b) 상기 탈세포화된 조직으로부터 세포외 기질(ECM, Extracellular Matrix)을 수득하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 ECM을 동결건조 후 분쇄하여 분말을 형성하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계의 분말에 산용액을 첨가하여 산추출한 산가용성 추출물을 수득하는 단계;

(e) 상기 (d) 단계의 산가용성 추출물에 펩신을 첨가하여 분해한 펩신 가용화 추출물을 수득하는 단계;

(f) 상기 (e) 단계의 펩신 가용화 추출물을 중화하여 가용성 추출물(SEx, solubilized extract)을 수득하는 단계;

(e) 상기 (f) 단계의 SEx를 원심분리하여 원심분리된 추출물(CEx, centrifuged extract)을 수득하는 단계; 및

(f) 상기 (e) 단계의 CEx를 여과하여 여과된 추출물(FEx, filtered extract)인 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(SSE, solubilized scaffold extract)을 수득하는 단계.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 생체 조직은 포유류로부터 분리된 조직으로, 탈세포화시켜 세포외 기질(ECM, Extracellular Matrix)을 수득할 수 있는 한 어떠한 포유류의 조직도 포함할 수 있다.

바람직하게는, 돼지, 소, 말, 토끼, 개, 고양이, 양, 염소, 인간, 비인간 영장류, 기니 피크, 또는 설치류으로부터 분리된 조직이고, 보다 바람직하게는 돼지 또는 소이며, 가장 바람직하게는 돼지이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 생체 조직은 간, 심장, 신장, 위, 소장, 대장, 비장, 방광, 폐 또는 피부이고, 보다 바람직하게는 간, 심장 또는 신장이며, 가장 바람직하게는 간이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "스캐폴드(scaffold)"란, 조직공학(Tissue engineering)에 사용되는 용어로서, 생체 세포를 안착시켜 세포와 여러 가지 물질들의 조합을 이용하는 구조물을 말하며, 바이오 스캐폴드란 생체 구조물 즉, 생체 장기를 탈세포화(decellularization)시켜 세포를 제거한 후, 미세구조 및 장기의 윤곽만을 남긴 구조물(주형물)을 의미한다.

따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "가용화 스캐폴드 추출물(SSE, solubilized scaffold extract)"는, 상술한 생체 구조물인 스캐폴드의 가용성 추출물을 의미한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 가용화 스캐폴드 추출물(SSE, solubilized scaffold extract)은 1) 탈세포화로 인하여 세포 구성물이 제거되어 이식시 면역 거부 반응이 최소화되고, 2) 세포 성장과 분화에 관여하는 세포외기질 및 단백질이 보존되고, 3) 간소엽 구조가 보존되어 세포 주입 후 산소 및 영양 공급이 가능하고, 원래 장기 그대로의 형태와 구조가 유지된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 탈세포화는 용해 용액(lysis solution), 저장성 용액(hypotonic solution), 계면활성제, RNase A 및 DNase I으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상을 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 계면활성제는 통상의 계면활성제가 이용될 수 있으며, 이의 농도는 0.1 내지 10%가 바람직하다.

바람직하게는, 상기 계면활성제는 SDS (sodium dodecyl sulfate), Triton-X, DNase 및 CHAPS (3-(3-cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propane sulfonate)로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상이고, 보다 바람직하게는 SDS (sodium dodecyl sulfate) 또는 Triton-X이고, 가장 바람직하게는 SDS (sodium dodecyl sulfate)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (d) 단계의 산용액은 염산, 황산 및 인산으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상이다.

상기 단계에서 스캐폴드에 산용액을 1:1 내지 100의 중량비로 첨가하여 산 가용성 스캐폴드 추출물을 수득할 수 있다.

이어서 상기 산가용성 추출물에 펩신을 1:1 내지 100의 중량비로 첨가하여 분해한 펩신 가용화 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 골수유래 줄기세포, 지방유래줄기세포, 태반유래 줄기세포 및 유도 만능 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 목적에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 가용화 스캐폴드 추출물의 농도는 0.01 ㎎/㎖ 내지 1 ㎎/㎖이며, 보다 바람직하게는 0.01 ㎎/㎖ 내지 0.06 ㎎/㎖이고, 가장 바람직하게는 0.06 ㎎/㎖이다.

즉, 본 발명의 조성물은 줄기세포 배양 또는 분화를 위한 조성물로서, 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)를 유효성분으로 포함하여 배양 또는 분화시키고자 하는 세포의 생존율 및 분화능을 증가시킨다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 줄기세포 배양 또는 분화 방법을 제공한다:

(a) 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Solubilized Scaffold Extract, SSE)로 배양 용기를 코팅하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 SSE로 코팅된 배양 용기 내에서 제 1 항의 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양 또는 분화용 조성물로 줄기세포를 배양 또는 분화시키는 단계.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 (b) 단계에서 추가적으로 분화유도물질을 첨가할 수 있다.

상기 분화유도물질은 당업계에 공지된 어떠한 분화유도물질도 이용될 수 있으며, 분화를 유도하고자 하는 세포의 유형 및 단계에 따라 다양하게 단독 또는 조합하여 첨가될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)은 하기와 같은 단계에 의해 제조된다.

(i) 생체 조직을 탈세포화(decellularization)하는 단계;

(ii) 상기 탈세포화된 조직으로부터 세포외 기질(ECM, Extracellular Matrix)을 수득하는 단계;

(iii) 상기 (ii) 단계의 ECM을 동결건조 후 분쇄하여 분말을 형성하는 단계;

(iv) 상기 (iii) 단계의 분말에 산용액을 첨가하여 산추출한 산가용성 추출물을 수득하는 단계;

(v) 상기 (iv) 단계의 산가용성 추출물에 펩신을 첨가하여 분해한 펩신 가용화 추출물을 수득하는 단계;

(vi) 상기 (v) 단계의 펩신 가용화 추출물을 중화하여 가용성 추출물(SEx, solubilized extract)을 수득하는 단계;

(vii) 상기 (vi) 단계의 SEx를 원심분리하여 원심분리된 추출물(CEx, centrifuged extract)을 수득하는 단계; 및

(viii) 상기 (vii) 단계의 CEx를 여과하여 여과된 추출물(FEx, filtered extract)인 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(SSE, solubilized scaffold extract)을 수득하는 단계.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 코팅 시 가용화 스캐폴드 추출물의 농도는 0.1 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖이며, 보다 바람직하게는 1 ㎎/㎖ 내지 8 ㎎/㎖이고, 가장 바람직하게는 6 ㎎/㎖이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계의 배양 시 가용화 스캐폴드 추출물의 농도는 0.01 ㎎/㎖ 내지 1 ㎎/㎖이며, 보다 바람직하게는 0.01 ㎎/㎖ 내지 0.06 ㎎/㎖이고, 가장 바람직하게는 0.06 ㎎/㎖이다.

즉, 본 발명의 방법은 줄기세포를 배양 또는 분화시키는 방법으로서, 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)를 이용하여 배양 또는 분화시키고자 하는 세포의 접착성, 생존율 및 분화능을 증가시킨다.

또한, 본 발명은 상기 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)을 포함하는, 줄기세포 배양 또는 분화를 위한 배양 용기 코팅용 조성물을 포함한다.

상기 조성물은 가교제 및 천연 고분자를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 가교제는 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 제니핀(Genipin) 및 카보디이미드(carbodiimide)로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상을 포함하고, 보다 바람직하게는 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 또는 제니핀(Genipin)이며, 가장 바람직하게는 글루타르알데히드(glutaraldehyde)이다.

상기 천연 고분자는 콜라겐, 변성 콜라겐, 알기네이트, 변성 알기네이트, 히알루론산, 변성 히알루론산, 젤라틴, 변성 젤라틴, 키토산, 변성 키토산, 피브린 및 변성 피브린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 가교제 및 천연 고분자는 혼합하여 가교결합시켜 처리하거나 각각 단독으로 개별처리할 수 있다. 즉, 1:1 내지 100의 중량비로 혼합 후 가교결합시켜 처리하거나, 또는 상기 가교제 및 천연 고분자는 1:1 내지 100의 중량비로 개별 처리할 수 있으며, 바람직하게는 1:1 중량비로 개별처리하는 것이다.

본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 SSE로 코팅한 배양 용기에, 본 발명의 SSE를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양 또는 분화용 조성물로 줄기세포를 배양 또는 분화시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 본 발명의 조성물에서 상술한 SSE를 이용하는 단계를 포함하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양 또는 분화용 조성물, 및 방법은 줄기세포의 분화 및 배양에 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 5 일 동안 분화시킨 후, 비분화된 mES 세포 및 분화 조건 하에서의 mES 세포에서의 내배엽 마커들의 발현수준을 보여준다.
도 2는 각 조건[내배엽 단독 처리 분화군(En), SSE 코팅 접시에서의 내배엽 분화군(En-SSE) 및 SSE 코팅 접시+SSE 함유 조건-배지 분화군(En-SSE+0.06)]에서의 내배엽 마커들의 RNA 발현수준을 보여준다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험 방법 및 재료

간 획득 및 간 절편의 탈세포화

모든 절차는 강원대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다. 40kg 내지 50kg 무게의 성돈을 직접 도축하고 내장을 제거한 후, 간을 획득하였다. 공지된 프로토콜에 따라 탈세포화를 실시하였다. 간략하게, 획득한 간엽들을 분리하고, 조각 당 0.8 gm의 평균 무게와 1x1x0.5 cm 크기로 여러 개의 얇은 절편으로 손질하였다. 상기 절편들을 500 IU/l 농도의 헤파린(Chungwae Pharma Co., Seoul, Korea) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)을 함유한 1x PBS(phosphate buffered solution)로 진탕기를 이용하여 1 시간 동안 120rpm의 속도로 4℃에서 두 번 세척하였다. 또한, 상기 절편들을 0.1 % SDS(sodium dodecyl sulfate, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 진탕기를 이용하여 72 시간 동안 120rpm의 속도로 4℃에서 탈세포화시켰다. 탈세포화 용액은 매 8 시간 마다 바꿔주었다. 최종적으로, 모든 절편들은 각각 1 % P/S를 함유한 PBS로 2 시간 동안 세 번씩 린스하여 ECM 내 잔류 SDS를 세정하였다.

가용성 ECM(Solubilized ECM)의 제작

공지된 프로토콜을 변경하여 가용성 ECM을 제작한 바 있으며, 대한민국 공개특허 제 호(2014년 월 일 출원예정)에 기재하였다. 설명하자면, 멸균한 간 절편을 48시간 동안 동결건조시키고, 그라인딩 밀을 이용하여 조분말(coarse powder) 상태로 분쇄하였다. 가공된 샘플을 1 ㎖ 염산(HCl, Sigma, St. Louis, MO) 당 10 ㎎ ECM 농도의 0.1M HCl로 분해시킨 후, 펩신을 처리하였다. 펩신(Sigma, St. Louis, MO)을 1 ㎎/㎖의 농도로 사용하였다. ECM 분말은 72 시간 동안 분해시키고 1M NaOH(Sigma, St. Louis, MO)를 첨가하여 pH 8.5로 중화시켰다. 중화 단계는 펩신 활성을 중단시키고, 상기 효소는 pH 6.0 이상에서 비활성화되며, pH 8.0 이상에서는 불안정하다. 이러한 가용화 단계에서, ECM 성분들을 검사하기 위하여 소량을 남기고 이를 가용성 추출물(SEx, solubilized extract)로 지칭하였다. 중화 이후, 상기 추출물을 1500 rpm에서 원심 분리하였으며, ECM 성분들을 검사하기 위하여 상기 결과물의 디브리스(debris) 및 상층액 소량을 획득하고 이를 원심분리된 추출물(CEx, centrifuged extract)로 지칭하였다. 또한, 0.2 ㎛ 주사기 필터(코닝)를 통해 여과하였으며, ECM 성분들을 검사하기 위하여 소량을 남기고 이를 여과된 추출물(FEx, filtered extract)로 지칭하였다. 펩신 분해를 포함해 모든 단계들은 멸균 조건 하 실온에서 실시되었다. 여과 후 얻어진 점성 용액을 가용성 스캐폴드추출물 (SSE, solubilized scaffold extracts)로 지칭하고, 1x PBS로 적당한 농도로 희석하였다.

마우스 배아 줄기 세포의 배양

mES 세포들을 MEF 피더 세포로 처리된 미토마이신 C(Sigma, St. Louis, MO)로 배양하고, 약 4일 후 70% 컨플루언시 일 때 계대하였다. mES 배지는 15% KSR (Knock our serum, Gibco, Carlsbad, CA), 2 mM L-글루타민(Invitrogen, Carlsbad, CA), 1x 비필수 아미노산(Invitrogen, Carlsbad, CA), 0.1 mM 2-머캅토에탄올(Sigma, St. Louis, MO), 1,000 U/ml LIF(leukemia inhibitory factor, Chemicon), 및 0.5% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Carlsbad, CA)이 보충된 DMEM(dulbecco?s modified eagle medium, Welgene, Daegu, Korea)이다. 또한, 상기 mES 세포들은 0.1% 젤라틴으로 미리 코팅한 배양 접시를 이용하여 피더-프리 조건에서 배양 할 수 있다.

가용화 스캐폴드 추출물 코팅 배양 접시에서의 내배엽 분화

mES의 완전 내배엽(definitive endoderm)으로의 분화는 공지된 프로토콜을 따랐다. MEF 기아를 위하여, 80 % 컨플루언시의 mES 세포에 트립신을 처리하고, 30 분 동안 0.1 % 젤라틴 코팅된 15cm 배양 접시에 두었다. 또한, 0 일째에 상기 세포들을 3 x 10⁴ 세포/cm² 밀도로 DMEM, 1% glutamax, 여과된 5% Albumax (1:100, Gibco, Carlsbad, CA) 및 2.5 ?M Y-27632 (1:4000, TOCTIS bioscience)로 구성된 분화 배지에 배양하였다. 1 일 째에, 새로 제조한 배지로 바꿔주었다. 40 시간 후, 2% Hyclone FBS (Fetal bovine serum), 1% glutamax, 및 50 ng/㎖ Activin A (PeproTech)가 보충된 DMEM으로 구성된 분화 배지로 바꿔주었다. 3 일 째 및 4 일 째에, 2% Hyclone FBS (Fetal bovine serum), 1% glutamax, 및 50 ng/㎖ Activin A가 보충된 DMEM으로 구성된 분화 배지로 바꿔주었다. 5 일 째에, 형광현미경으로 내배엽 세포로 분화된 mES의 Sox17 발현을 확인하였고, PCR로 내배엽 특이 마커인 Foxa2, Sox17, GSC, 및 CXCR4의 발현 또한 확인하였다.

다음으로, 상기 mES 세포들의 내배엽 계통으로의 분화를 SSE 위에 적용하였다. 6 ㎎/㎖ 농도의 SSE로 코팅된 배양 접시 및 0.06 ㎎/㎖ 농도의 SSE를 함유한 최적 조건 배지를 이용하여 mES 세포의 내배엽으로의 분화를 조사하였다.

정상 mES 세포들을 3 x 10⁴ 세포/cm² 밀도로 LIF를 포함하는 mES 배지에 배양하여 분화에 대한 음성 대조군으로 이용하였다. 또한, 내배엽 분화 잠재력을 비교하기 위하여 동일한 수의 세포들을 다음과 같은 상이한 그룹으로 배양하였다: 0.1 % 젤라틴 코팅 배양 접시군, 6 ㎎/㎖ SSE 코팅 배양 접시군, SSE 코팅 배양 접시 + 0.06 ㎎/㎖ SSE 함유 배지군. 5 일째에, 모든 세포의 Sox17 발현 수준을 확인하고, 또한 내배엽 특이 마커의 발현 수준을 PCR로 분석하였다.

RNA 추출 및 중합 효소 연쇄 반응

Hybrid-R total RNA kit (GeneAll, Korea)를 이용하여 시료에서 총 RNA를 추출하였다. RNA의 양은 NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE)을 이용하여 측정하고, TProfessional standard 96 gradient machine (Biometra, Goettingen, Germany)을 이용하여 PCR을 실시하였다. 본 발명의 프라이머 서열은 표 1에 나타내였다. PCR 조건은 94℃에서 3 분 동안 전변성, 94℃에서 30 초 동안 변성, 72℃에서 30초, 45초 동안 어닐링, 72℃에서 10 분 동안 최종 신장 단계를 34 회 반복하였다. 이러한 PCR 산물을 EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 1.5% 아가로즈 젤 상에서 분석하였다.

Foxa2 = forkhead box protein A2; Sox17= (sex determining region Y)-box 17; Oct 4= octomer-binding transcription factor 4; GAPDH= glyceraldehydes-3-phosphate dehyderogenase; GSC=Goosecoid homebox ; MIXL1=Mixed Paired-like homebox; CXCR4 = Chemokine receptor 4; Notch 1 = Notch homolog 1; F= forward; R=reverse.

통계 분석

PCR 밴드의 강도를 image J analysis program (NIH)을 이용하여 분석하였다. Two-tailed student's t-test를 이용하여, 평균값 ± 표준 편차로서 표현된 결과 간의 유의성 있는 차이를 평가하였다, * p 값 <0.05, ** p 값 <0.005은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 모든 형광 이미지는 OLYMPUS- ix71 형광 현미경을 이용하여 획득하였다.

실시예 1. 분화된 세포 내 Sox-17-dTomato 및 내배엽 특이-마커들의 발현

내배엽 분화 프로토콜에 따라, mES 세포를 0.1 % 젤라틴으로 코팅된 배양 접시에서 배양하고, 추가적으로 5 일 동안 mES 세포 분화 배지에 노출시켰다(도 1a). 상기 결과들은, Sox-17의 발현을 통해 대부분의 mES 세포들이 완전 내배엽(definitive endoderm)으로 분화된 것을 보여준다(도 1b). 또한, PCR 결과, 분화된 세포들은 내배엽 마커인 Foxa2, Sox17, GSC, CXCR4, MIXL1의 발현 수준이 높게 나타났고, 다능성 마커인 NOTCH1 및 OCT4의 발현 수준은 낮게 나타났다. 반면, LIF를 포함하는 정상 ES 배지에서 배양된 mES 세포들은 다능성 마커인 OCT4의 발현 수준이 높게 나타났고, 분화 마커는 발현이 관찰되지 않았다.

또한, 전기 영동 후 이미지 J 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 밴드 강도를 분석한 결과, 미분화된 mES 세포들에 비해, 분화된 세포 내 Sox17 (18.454 ±0.743%), Foxa2 (24.424 ± 0.313%), GSC (25.646 ± 3.82%), CXCR4 (36.601 ±6.55%), 및 MIXL1 (21.767 ± 4.8%)의 발현 수준은 상당히 높게 나타났다(도 1a).

외배엽 및 다능성 마커들은, mES 세포에 비해, 내배엽으로 분화된 세포에서 발현되지 않았다. 발현 수준을 비교하기 위하여, 모든 그룹의 밴드 강도는 GAPDH를 기준으로 정상화하였다. 이러한 결과들은 mES 세포가 완전 내배엽으로 성공적인으로 분화되었음을 의미한다. 따라서, 본 발명의 내배엽 분화용 프로토콜을 SSE에 적용하여 mES 세포의 분화를 효율적으로 분석할 수 있다.

실시예 2. SSE 코팅 접시에서 향상된 내배엽-특이 마커들의 발현

SSE는 내배엽 계통으로의 mES의 분화를 향상 시킬 수 있는 ECM 성분과 성장 인자를 포함하고 있다. 분화 향상에 있어서의 스캐폴드의 적용을 평가하기 위하여, 6 ㎎/㎖ 농도의 SSE로 코팅된 배양 접시에서 0.06 ㎎/㎖ 농도의 SSE를 함유하는 조건-배지를 이용하여 mES 세포를 완전 내배엽으로 분화시켰다. SSE 코팅 접시에서의 내배엽 분화 후, 상기 세포들은 내배엽 마커인 Foxa2 및 CXCR4의 발현 수준이 SSE 코팅 없이 분화된 대조군(7.92 ± 0.6% 및 6.75 ± 1.1%) 에 비해 각각 9.17 ± 0.67% 및 9.55 ± 0.7%로 상당히 높게 나타났다(도 2a). SSE 코팅 접시에서의 내배엽 분화군 및 SSE 코팅 접시+0.06 ㎎/㎖ 농도의 SSE를 함유하는 조건-배지에서의 내배엽 분화군 모두에서, Foxa2 및 CXCR4의 발현 수준이 대조군의 기본 분화에 비해 높았다. 분화군 모두에서의 Sox17 시그널의 발현 수준을 이미지로 확인하였다(도 2b). 따라서, 탈세포화된 간으로부터 유래된 SSE를 적용하는 것은 mES 세포의 분화를 향상시키는 데 중요한 물질이라는 것을 알 수 있다.

또한, 이러한 결과는 본 발명이 간세포 계통 또는 기관 특이 분화에 대한 완전 내배엽 세포의 효율적인 분화에 적용될 수 있다는 것을 보여준다.

Claims (13)

1. 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양 또는 분화용 배지 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)은 하기와 같은 단계에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물:
   (a) 생체 조직을 탈세포화(decellularization)하는 단계;
   (b) 상기 탈세포화된 조직으로부터 세포외 기질(ECM, Extracellular Matrix)을 수득하는 단계;
   (c) 상기 (b) 단계의 ECM을 동결건조 후 분쇄하여 분말을 형성하는 단계;
   (d) 상기 (c) 단계의 분말에 산용액을 첨가하여 산추출한 산가용성 추출물을 수득하는 단계;
   (e) 상기 (d) 단계의 산가용성 추출물에 펩신을 첨가하여 분해한 펩신 가용화 추출물을 수득하는 단계;
   (f) 상기 (e) 단계의 펩신 가용화 추출물을 중화하여 가용성 추출물(SEx, solubilized extract)을 수득하는 단계;
   (e) 상기 (f) 단계의 SEx를 원심분리하여 원심분리된 추출물(CEx, centrifuged extract)을 수득하는 단계; 및
   (f) 상기 (e) 단계의 CEx를 여과하여 여과된 추출물(FEx, filtered extract)인 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(SSE, solubilized scaffold extract)을 수득하는 단계.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 생체 조직은 포유류로부터 분리된 조직인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 2 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 생체 조직은 간, 심장, 신장, 위, 소장, 대장, 비장, 방광, 폐 또는 피부인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 2 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 탈세포화는 용해 용액(lysis solution), 저장성 용액(hypotonic solution), 계면활성제, RNase A 및 DNase I으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상을 이용하는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 계면활성제는 SDS (sodium dodecyl sulfate), Triton-X, DNase 및 CHAPS (3-(3-cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propane sulfonate)로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 2 항에 있어서, 상기 (d) 단계의 산용액은 염산, 황산 및 인산으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 골수유래 줄기세포, 지방유래줄기세포, 태반유래 줄기세포 및 유도 만능 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 가용화 스캐폴드 추출물의 농도는 0.01 ㎎/㎖ 내지 1 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 다음 단계를 포함하는 줄기세포 배양 또는 분화 방법:
    (a) 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Solubilized Scaffold Extract, SSE)로 배양 용기를 코팅하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 SSE로 코팅된 배양 용기에 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 배지 조성물에 줄기세포를 넣어 배양 또는 분화시키는 단계.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 방법은 (b) 단계에서 추가적으로 분화유도물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 10 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 가용화 스캐폴드 추출물의 농도는 0.1 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 10 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 가용화 스캐폴드 추출물의 농도는 0.01 ㎎/㎖ 내지 1 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 방법.

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