KR20160104009A

KR20160104009A - 변형된 FcRn-결합 성질을 갖는 Fc-영역 변이체

Info

Publication number: KR20160104009A
Application number: KR1020167019016A
Authority: KR
Inventors: 틸만 슐로트하우어
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2014-01-15
Filing date: 2015-01-12
Publication date: 2016-09-02
Also published as: US20190016792A1; JP2021113214A; BR112016016411A2; CA2931979A1; WO2015107025A1; RU2016133345A3; MX2016008540A; HK1223951A1; RU2016133345A; US20170037121A1; EP3094649A1; JP2017505768A; AR099079A1; CN105873948A; CN113248613A; JP6873701B2; RU2730592C2; CN105873948B

Abstract

본 발명은 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는, 면역글로불린 힌지 영역의 적어도 일부, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 각각 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드로서, 이때 i) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A를 포함하거나, ii) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L251D, L314D 및 L432D를 포함하거나, iii) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L251S, L314S 및 L432S를 포함하는, 폴리펩티드에 관한 것이다.

Description

변형된 FcRn-결합 성질을 갖는 Fc-영역 변이체{FC-REGION VARIANTS WITH MODIFIED FCRN-BINDING PROPERTIES}

본 발명은 정제 성질을 손상시키지 않으면서 Fc-수용체 결합에 대하여 변형된 IgG Fc-영역에 관한 것이다.

비용 효율적 생산 과정에 대한 요구는 하나 이상의 친화성 크로마토그래피 단계를 포함하는 다운스트림 정제의 최적화의 필요성을 이끌어내었다. 프로세싱될 보다 더 큰 부피 및 제자리 세정(CIP) 프로토콜에 대한 보다 더 엄격한 요구는 해결될 필요가 있는 특징들의 일부이다(Hober, S., J. Chrom. B. 848 (2007) 40-47).

선택적 Fc-영역 친화성 리간드에 의한 단일클론 항체의 정제는 치료 단일클론 항체의 대규모 생산을 위한 가장 기대되는 방법이다. 사실상, 이 절차는 온전한 상태로 남아 그의 성질을 보유할 수 있는 항체의 항원 특이적 부분, 즉 Fab 도메인과의 어떠한 상호작용의 확립을 요구하지 않는다(문헌(Salvalaglio, M., et al., J. Chrom. A 1216 (2009) 8678-8686) 참조).

친화성 정제 단계는 그의 선택성으로 인해 정제 사슬에서 초기에 사용됨으로써, 연속적 유닛 작업들의 수가 감소될 수 있다(상기 문헌(Hober); 문헌(MacLennan, J., Biotechnol. 13 (1995) 1180); 및 문헌(Harakas, N.K., Bioprocess Technol. 18 (1994) 259) 참조).

IgG에 선택적으로 결합하도록 가장 많이 채택된 리간드는 Fc-영역의 CH2-도메인과 CH3-도메인 사이의 힌지(hinge) 영역에 위치하는 "컨센서스 결합 부위"(CBS)(DeLano, W.L., et al., Science 287 (2000) 1279)로서 공지된 영역에서 대다수의 IgG들의 Fc-영역과의 고도로 선택적인 상호작용을 확립할 수 있는 스타필로코커스 단백질 A 및 단백질 G이다.

스타필로코커스 단백질 A(SPA)는 그람 양성 세균 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 표면 상에 노출된 세포벽 관련 단백질 도메인이다. SPA는 다양한 종들로부터의 IgG, 예를 들면, 인간, 토끼 및 기니 피그 IgG에 대한 높은 친화성을 갖되, 소 및 마우스 IgG와의 단지 약한 상호작용을 갖는다(하기 표 참조)(상기 문헌(Hober); 문헌(Duhamel, R.C., et al., J. Immunol. Methods 31 (1979) 211); 문헌(Bjork, L. and Kronvall, G., Immunol. J. 133 (1984) 969); 문헌(Richman, D.D., et al., J. Immunol. 128 (1982) 2300); 및 문헌(Amersham Pharmacia Biotech, Handbook, Antibody Purification (2000)) 참조).

IgG의 CH2-도메인과 CH3-도메인 사이의 중쇄 힌지 영역은 단백질 A 이외의 여러 단백질들, 예컨대, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합할 수 있다(상기 문헌(DeLano and Salvalaglio) 참조).

SPA CBS는 항체의 표면 상의 소수성 포켓(pocket)을 포괄한다. IgG CBS를 구성하는 잔기들은 Ile 253, Ser 254, Met 252, Met 423, Tyr 326, His 435, Asn 434, His 433, Arg 255 및 Glu 380(카바트(Kabat) EU 지수 넘버링 시스템에 따른 IgG 중쇄 잔기들의 넘버링)이다. 하전된 아미노산들(Arg 255, Glu 380)은 Ile 253 및 Ser 254에 의해 형성된 소수성 놉(knob) 주변에 배치되어 있다. 이것은 극성 및 친수성 상호작용의 확립을 초래한(할 수 있)다(상기 문헌(Salvalaglio) 참조).

일반적으로, 단백질 A-IgG 상호작용은 2개의 주요 결합 부위들을 사용함으로써 기술될 수 있다: 제1 부위는 중쇄 CH2-도메인에 위치하고 (단백질 A의) Phe 132, Leu 136, Ile 150과 Ile 253 및 Ser 254에 의해 구성된 IgG 소수성 놉 사이의 소수성 상호작용, 및 Lys 154(단백질 A)와 Thr 256(IgG) 사이의 한 정전기 상호작용을 특징으로 한다. 제2 부위는 중쇄 CH3-도메인에 위치하고 Gln 129 및 Tyr 133(단백질 A)과 His 433, Asn 434 및 His 435(IgG) 사이의 정전기 상호작용을 특징으로 한다(상기 문헌(alvalaglio) 참조).

문헌(Lindhofer, H., et al., J. Immunol. 155 (1995) 219-225)은 래트/마우스 쿠아드로마스(quadromas)에서 우세한 종-제한된 중쇄/경쇄 페어링을 보고한다.

문헌(Jedenberg, L., et al., J. Immunol. Meth. 201 (1997) 25-34)은 2개의 Fc 변이체들(각각의 다른 동종형(isotype)으로부터의 동종형성 다이펩티드 치환을 각각 함유하는 Fc13 및 Fc31)의 SPA 결합 분석이, Fc1 및 Fc31이 SPA와 상호작용하는 반면, Fc3 및 Fc13이 검출가능한 SPA 결합을 결여한다는 것을 보여주었다고 보고하였다. Fc-영역 변이체 Fc31의 만들어진 SPA 결합은 도입된 다이펩티드 치환 R435H 및 F436Y로부터 비롯된 것으로 결론지어진다.

오늘날, 치료 단일클론 항체에 대한 초점은 2개 이상의 표적들(항원들)에 특이적으로 결합하는 이중특이적 또는 심지어 다중특이적 항체의 발생 및 사용이다.

한 발현 세포주에서 4개의 항체 쇄들(2개의 상이한 중쇄들 및 2개의 상이한 경쇄들)로부터 다중특이적 이종이량체성 IgG 항체를 생성하는 데 있어서 기본 도전과제는 소위 쇄 관련 문제이다(문헌(Klein, C., et al., mAbs 4 (2012) 653-663) 참조). 다중특이적 항체의 좌측 및 우측 아암(arm)으로서 상이한 쇄들의 요구된 사용은 한 세포에서의 발현 시 항체 혼합물을 유발한다: 2개의 중쇄들은 (이론적으로) 4개의 상이한 조합들(이들 중 2개는 동일함)로 회합할 수 있고, 이들 각각은 경쇄와 확률론적(stochastic) 방식으로 회합하여 2⁴개(= 총 16개)의 이론적으로 가능한 쇄 조합들을 야기할 수 있다. 16개의 이론적으로 가능한 조합들 중 10개의 조합들이 발견될 수 있고, 이들 중 1개만이 원하는 기능성 이중특이적 항체에 상응한다(De Lau, W.B., et al., J. Immunol. 146 (1991) 906-914). 복합 혼합물로부터 이 원하는 이중특이적 항체를 단리하는 데 있어서의 어려움 및 이론상 최대 12.5%의 본질적인 낮은 수율은 한 발현 세포주에서의 이중특이적 항체의 생산을 극도로 어렵게 만든다.

쇄 관련 문제를 극복하고 2개의 상이한 중쇄들의 정확한 회합을 강제하기 위해, 1990년대 후반 제넨테크(Genentech)의 카터와 그의 동료들(Carter et al.)은 "놉스-인투-홀스(knobs-into-holes)"(KiH)로서 지칭된 방법을 발명하였다(문헌(Carter, P., J. Immunol. Meth. 248 (2001) 7-15); 문헌(Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681); 문헌(Zhu, Z., et al., Prot. Sci. 6 (1997) 781-788); 문헌(Ridgway, J.B., et al., Prot. Eng. 9 (1996) 617-621); 문헌(Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270(1997) 26-35); 및 미국 특허 제7,183,076호 참조). 기본적으로, 상기 개념은 대다수의 상호작용들이 일어나는, 항체의 2개 중쇄들의 2개 CH3-도메인들 사이의 계면의 변형에 의존한다. 벌키(bulky) 잔기가 한 항체 중쇄의 CH3-도메인 내로 도입되고 열쇠("놉")와 유사하게 작용한다. 다른 중쇄에서, 자물쇠와 유사하게 이 벌키 잔기를 수용할 수 있는 "홀"이 형성된다. 생성된 이종이량체성 Fc-영역은 인공 다이설파이드 가교의 도입/형성에 의해 더 안정화될 수 있다. 특히, 모든 KiH 돌연변이들이 CH3-도메인 내에 묻히고 면역 시스템에 "보일 수" 없다. 추가로, KiH 돌연변이를 갖는 항체의 성질, 예컨대, (열)안정성, FcγR 결합 및 효과기 기능(예를 들면, ADCC, FcRn 결합) 및 약동학적(PK) 거동은 영향을 받지 않는다.

97% 초과의 이종이량체화 수율을 갖는 정확한 중쇄 회합은 6개의 돌연변이들을 도입함으로써 달성될 수 있다: "놉" 중쇄에서의 S354C, T366W, 및 "홀" 중쇄에서의 Y349C, T366S, L368A, Y407V(상기 문헌(Carter) 참조; 카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 잔기의 넘버링). 홀-홀 동종이량체가 발생될 수 있는 반면, 놉-놉 동종이량체는 전형적으로 관찰되지 않는다. 홀-홀 이량체는 선택적 정제 절차 또는 하기 요약된 절차에 의해 고갈될 수 있다.

무작위 중쇄 회합의 문제가 다루어지고 있지만, 정확한 경쇄 회합도 보장되어야 한다. KiH CH3-도메인 방법과 유사하게, 궁극적으로 전체 이중특이적 IgG를 이끌어낼 비대칭 경쇄-중쇄 상호작용을 조사하기 위한 노력이 시도되었다.

로슈(Roche)는 최근에 KiH 기술로 조합할 때 이중특이적 이종이량체성 IgG 항체에서 정확한 경쇄 페어링을 강제하기 위한 가능한 방법으로서 크로스맙(CrossMab) 방법을 개발하였다(상기 문헌(Klein); 문헌(Schaefer. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 11187-11192); 및 문헌(Cain, C., SciBX 4 (2011) 1-4) 참조). 이것은 이중특이적 또는 심지어 다중특이적 항체를 일반적인 방식으로 생성할 수 있게 한다. 이 포맷에서, 의도된 이중특이적 항체의 한 아암은 본래의 상태로 남아있다. 제2 아암에서, 전체 Fab 영역, 또는 VH-VL 도메인 또는 CH1-CL 도메인은 중쇄와 경쇄 사이의 도메인 교차(crossover)에 의해 교환된다. 결과로서, 새로 형성된 "교차된" 경쇄는 이중특이적 항체의 다른 아암의 (정상, 즉 교차되지 않은) 중쇄 Fab 영역과 더 이상 회합되지 않는다. 따라서, 정확한 "경쇄" 회합은 도메인 정렬에서 이 최소한의 변화에 의해 강제될 수 있다(상기 문헌(Schaefer) 참조).

주와 그의 동료들(Zhu et al.)은 다이아바디(diabody) 변이체의 2개 VL/VH 계면들에서 다이설파이드 가교뿐만 아니라 여러 입체적으로 상보적인 돌연변이들을 도입하였다. 돌연변이 VL Y87A/F98M 및 VH V37F/L45W가 항-p185HER2 VL/VH 계면 내로 도입될 때, 모 다이아바디에 비해 전체 수율 및 친화성을 유지하면서 90% 초과의 수율로 이종이량체성 다이아바디가 회수되었다(상기 문헌(Zhu) 참조).

추가이(Chugai)의 연구자들은 정확한 경쇄 회합을 촉진하기 위해 돌연변이를 VH-VL 계면(주로 VH에서 Q39 및 VL에서 Q38이 하전된 잔기로 전환됨) 내로 도입함으로써 이중특이적 다이아바디를 유사하게 디자인하였다(국제 특허출원 공개 제WO 2006/106905호; 및 문헌(Igawa, T., et al., Prot. Eng. Des. Sel. 23 (2010) 667-677)).

국제 특허출원 공개 제WO 2011/097603호에는 공통된 경쇄 마우스가 보고되어 있다.

국제 특허출원 공개 제WO 2010/151792호에는 단리의 용이성을 제공하는 이중특이적 항체 포맷으로서, CH3-도메인에서 상이하게 변형된, 즉 이종이량체성을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 항체 포맷이 제공되어 있는데, 이때 상기 상이한 변형은 CH3 변형에 대한 비-면역원성 또는 실질적으로 비-면역원성 변형이고, 상기 변형들 중 하나 이상은 친화성 시약, 예컨대, 단백질 A에 대한 이중특이적 항체에 대한 상이한 친화성을 야기하고, 이중특이적 항체는 단백질 A에 대한 그의 친화성에 근거하여 파괴된 세포, 배지, 또는 항체들의 혼합물로부터 단리될 수 있다.

신생아 Fc-수용체(FcRn)는 생체내 IgG 클래스의 항체들의 대사적 운명을 위해 중요하다. FcRn은 라이소좀 분해 경로로부터 IgG를 구제하여 제거를 감소시키고 반감기를 증가시키는 기능을 한다. 이것은 2개의 폴리펩티드들, 즉 50 kDa 클래스 I 주조직적합성 복합체-유사 단백질(α-FcRn) 및 15 kDa β2-마이크로글로불린(β2m)으로 구성된 이종이량체성 단백질이다. FcRn은 클래스 IgG의 항체의 Fc-영역의 CH2-CH3 부분에 높은 친화성으로 결합한다. 클래스 IgG의 항체와 FcRn 사이의 상호작용은 pH 의존적이고 1:2 화학양론적으로 일어난다(즉, 1개의 IgG 항체 분자가 그의 2개의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티들을 통해 2개의 FcRn 분자들과 상호작용할 수 있다)(예를 들면, 문헌(Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083) 참조).

따라서, IgG 시험관내 FcRn 결합 성질/특성은 혈액 순환계에서의 그의 생체내 약동학적 성질을 표시한다.

중쇄 CH2-도메인 및 CH3-도메인의 상이한 아미노산 잔기들이 FcRn과 IgG 클래스의 항체의 Fc-영역 사이의 상호작용에 참여한다.

FcRn 결합에 영향을 미치는 상이한 돌연변이들 및 이와 더불어 혈액 순환계에서의 반감기는 공지되어 있다. 마우스 Fc-영역-마우스 FcRn 상호작용에 매우 중요한 Fc-영역 잔기들은 부위-지정된 돌연변이유발에 의해 확인되었다(예를 들면, 문헌(Dall'Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180) 참조). 잔기 I253, H310, H433, N434 및 H435(카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링)는 상호작용에 관여한다(Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533-2536; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542-548). 잔기 I253, H310 및 H435는 인간 Fc-영역과 뮤린 FcRn의 상호작용에 매우 중요한 것으로 발견되었다(Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2885).

FcRn에 결합하는 Fc-영역(및 마찬가지로 IgG)을 증가시키는 방법은 Fc-영역에서 다양한 아미노산 잔기들을 돌연변이시킴으로써 수행되어 왔다: Thr 250, Met 252, Ser 254, Thr 256, Thr 307, Glu 380, Met 428, His 433 및 Asn 434(문헌(Kuo, T.T., et al., J. Clin. Immunol. 30 (2010) 777-789); 및 문헌(Ropeenian, D.C., et al., Nat. Rev. Immunol. 7 (2007) 715-725) 참조).

단백질-단백질 상호작용 연구로 FcRn 결합을 개선하기 위한 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E의 조합은 문헌(Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524)의 저자들(Dall'Acqua et al.)에 의해 기재되어 있다. 인간 Fc-영역-인간 FcRn 복합체의 연구는 잔기 I253, S254, H435 및 Y436이 상호작용에 매우 중요하다는 것을 보여주었다(Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). 문헌(Yeung, Y.A., et al., J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671)에는 잔기 248 내지 259 및 301 내지 317 및 376 내지 382 및 424 내지 437의 다양한 변이체들이 보고되었고 조사되었다.

국제 특허출원 공개 제WO 2014/006217호에는 삼중 돌연변이를 갖는 이량체성 단백질이 보고되어 있다. pH 의존적 결합의 기작에 대한 FcRn/이종이량체성 Fc 복합체의 2.8 옹스트롬(Angstrom)에서의 결정 구조는 문헌(Martin, W., et al., Mol. Cell. 7 (2001) 867-877)에 의해 보고되었다. 미국 특허 제6,277,375호에서, 증가된 반감기를 갖는 면역글로불린 유사 도메인이 국제 특허출원 공개 제WO 2013/004842호에 보고되어 있다. 쉴즈와 그의 동료들(Shields, R. L., et al.)은 Fc 감마 RI, Fc 감마 RII, Fc 감마 RIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위의 고해상 맵핑, 및 Fc 감마 R과의 개선된 결합을 갖는 IgG1 변이체의 디자인을 보고하였다(Biochem. Mol. Biol. 276 (2001) 6591-6604). 마우스 IgG1의 트랜스사이토시스(transcytosis) 및 이화(catabolism)에 관여하는 아미노산 잔기들의 묘사는 문헌(Medesan, C., et al., J. Immunol. 158 (1997) 2211-2217)에 의해 보고되었다. 미국 특허출원 공개 제2010/0272720호에는 변형된 FcRn 결합 부위를 갖는 항체 융합 단백질이 보고되어 있다. 이종이량체성 단백질의 생산은 국제 특허출원 공개 제WO 2013/060867호에 보고되어 있다. 차오와 그의 동료들(Qiao, S.-W., et al.)은 항원의 항체-매개 제시가 FcRn에 의존한다는 것을 보고하였다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 (2008) 9337-9342).

스타필로코커스 단백질 A에 특이적으로 결합하고 인간 FcRn에 결합하지 않는 변이체 Fc-영역이 본원에 보고되어 있다. 이 변이체 Fc-영역은 CH2-도메인 및 CH3-도메인에서 특정 아미노산 돌연변이들을 함유한다. 이종이량체성 Fc-영역의 홀 쇄 또는 놉 쇄에서 사용될 때 이 돌연변이들은 이종이량체성 Fc-영역의 정제, 즉 동종이량체성 Fc-영역으로부터의 이종이량체성 Fc-영역의 분리를 가능하게 한다는 것을 발견하였다.

본원에 보고된 한 양태는

하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는, 면역글로불린 힌지 영역의 적어도 일부, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는, 면역글로불린 힌지 영역의 적어도 일부, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 (이량체성) 폴리펩티드로서,

이때, (카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링에 따를 때) i) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A를 각각 포함하거나, ii) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L251D, L314D 및 L432D를 각각 포함하거나, iii) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L251S, L314S 및 L432S를 각각 포함하고, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드가 면역글로불린 힌지 영역의 적어도 일부에서 하나 이상의 다이설파이드 가교에 의해 연결되어 있는, (이량체성) 폴리펩티드이다.

한 실시양태에서, (이량체성) 폴리펩티드는 인간 FcRn에 특이적으로 결합하지 않고 스타필로코커스 단백질 A에 특이적으로 결합한다.

한 실시양태에서, (이량체성) 폴리펩티드는 동종이량체성 폴리펩티드이다.

한 실시양태에서, (이량체성) 폴리펩티드는 이종이량체성 폴리펩티드이다.

한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V("홀")를 추가로 포함하고, 제2 폴리펩티드는 돌연변이 S354C 및 T366W("놉")를 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 돌연변이 S354C, T366S, L368A 및 Y407V("홀")를 추가로 포함하고, 제2 폴리펩티드는 돌연변이 Y349C 및 T366W("놉")를 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인은 인간 IgG1 서브클래스의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인이다. 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 돌연변이 L234A 및 L235A를 각각 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 돌연변이 P329G를 각각 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 각각 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인은 인간 IgG4 서브클래스의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인이다. 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 돌연변이 S228P 및 L235E를 각각 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 돌연변이 P329G를 각각 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 각각 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인은 인간 IgG2 서브클래스의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인이다. 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 돌연변이 H268Q, V309L, A330S 및 P331S를 각각 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인은 인간 IgG2 서브클래스의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인이다. 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 돌연변이 V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S 및 P331S를 각각 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인은 인간 IgG4 서브클래스의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인이다. 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 돌연변이 S228P, L234A 및 L235A를 각각 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 돌연변이 P329G를 각각 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 돌연변이 S228P, L234A, L235A 및 P329G를 각각 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 돌연변이 Y436A를 포함한다.

한 실시양태에서, (이량체성) 폴리펩티드는 Fc-영역 융합 폴리펩티드이다.

한 실시양태에서, (이량체성) 폴리펩티드는 (전장) 항체이다.

한 실시양태에서, (전장) 항체는 단일특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 단일특이적 항체는 1가 단일특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 단일특이적 항체는 2가 단일특이적 항체이다.

한 실시양태에서, (전장) 항체는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 2가 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 4가 이중특이적 항체이다.

한 실시양태에서, (전장) 항체는 삼중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 삼중특이적 항체는 3가 삼중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 삼중특이적 항체는 4가 삼중특이적 항체이다.

본원에 보고된 한 양태는 면역글로불린 Fc-영역을 포함하는 (이량체성) 폴리펩티드와 단백질 A의 결합을 증가시키기 위한 돌연변이 Y436A의 용도이다.

본원에 보고된 한 양태는

이때, 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 Y436A(카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링)를 포함하고, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드가 하나 이상의 다이설파이드 가교에 의해 연결되어 있는, (이량체성) 폴리펩티드이다.

본원에 보고된 한 양태는

제1 중쇄 가변 도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH1-도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 힌지 영역, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH2-도메인 및 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제1 폴리펩티드,

제2 중쇄 가변 도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH1-도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 힌지 영역, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH2-도메인 및 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제2 폴리펩티드,

제1 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제3 폴리펩티드, 및

제2 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제4 폴리펩티드

를 포함하는 항체로서,

이때, 제1 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인이 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 결합 부위를 형성하고, 제2 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인이 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부위를 형성하고,

i) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V, L234A, L235A 및 P329G를 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 S354C, T366W, L234A, L235A 및 P329G를 포함하거나, ii) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 S354C, T366S, L368A, Y407V, L234A, L235A 및 P329G를 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 Y349C, T366W, L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,

(카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링에 따를 때) i) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A를 각각 추가로 포함하거나, ii) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L251D, L314D 및 L432D를 각각 추가로 포함하거나, iii) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L251S, L314S 및 L432S를 각각 추가로 포함하고,

제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드가 힌지 영역에서 하나 이상의 다이설파이드 가교에 의해 연결되어 있는, 항체이다.

본원에 보고된 한 양태는

제1 중쇄 가변 도메인, 면역글로불린 경쇄 불변 도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 힌지 영역, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH2-도메인 및 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제1 폴리펩티드,

제1 경쇄 가변 도메인 및 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH1-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제3 폴리펩티드, 및

를 포함하는 항체로서,

본원에 보고된 한 양태는

제1 중쇄 가변 도메인, 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 CH1-도메인, 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 힌지 영역, 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 CH2-도메인 및 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제1 폴리펩티드,

제2 중쇄 가변 도메인, 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 CH1-도메인, 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 힌지 영역, 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 CH2-도메인 및 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제2 폴리펩티드,

를 포함하는 항체로서,

제1 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인이 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 결합 부위를 형성하고,

제2 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인이 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부위를 형성하고,

i) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V, S228P, L235E 및 P329G를 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 S354C, T366W, S228P, L235E 및 P329G를 포함하거나, ii) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 S354C, T366S, L368A, Y407V, S228P, L235E 및 P329G를 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 Y349C, T366W, S228P, L235E 및 P329G를 포함하고,

본원에 보고된 한 양태는

제1 중쇄 가변 도메인, 면역글로불린 경쇄 불변 도메인, 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 힌지 영역, 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 CH2-도메인 및 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제1 폴리펩티드,

제1 경쇄 가변 도메인 및 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 CH1-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제3 폴리펩티드, 및

를 포함하는 항체로서,

본원에 보고된 한 양태는

제1 중쇄 가변 도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH1-도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 힌지 영역, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH2-도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH3-도메인, 펩티드성 링커 및 제1 scFv를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제1 폴리펩티드,

제2 중쇄 가변 도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH1-도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 힌지 영역, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH2-도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH3-도메인, 펩티드성 링커 및 제2 scFv를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제2 폴리펩티드,

를 포함하는 항체로서,

제1 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인이 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 결합 부위를 형성하고, 제2 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인이 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부위를 형성하고, 제1 scFv 및 제2 scFv가 제2 항원에 특이적으로 결합하고,

본원에 보고된 한 양태는

제1 중쇄 가변 도메인, 면역글로불린 경쇄 불변 도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 힌지 영역, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH2-도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH3-도메인, 펩티드성 링커 및 제1 scFv를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제1 폴리펩티드,

를 포함하는 항체로서,

제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 힌지 영역에서 하나 이상의 다이설파이드 가교에 의해 연결되어 있는, 항체이다.

본원에 보고된 한 양태는 하기 단계들을 포함하는, 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드를 제조하는 방법이다:

a) (이량체성) 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 단계,

b) 배양 배지로부터 (이량체성) 폴리펩티드를 회수하는 단계, 및

c) 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 (이량체성) 폴리펩티드를 정제하여 (이량체성) 폴리펩티드를 제조하는 단계.

본원에 보고된 한 양태는 동종이량체성 폴리펩티드로부터 이종이량체성 폴리펩티드를 분리하기 위한 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A의 조합의 용도이다.

본원에 보고된 한 양태는 동종이량체성 폴리펩티드로부터 이종이량체성 폴리펩티드를 분리하기 위한 돌연변이 L251D, L314D 및 L432D의 조합의 용도이다.

본원에 보고된 한 양태는 동종이량체성 폴리펩티드로부터 이종이량체성 폴리펩티드를 분리하기 위한 돌연변이 L251S, L314S 및 L432S의 조합의 용도이다.

본원에 보고된 한 양태는 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체를, 눈 혈관 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 눈 혈관 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이다.

본원에 보고된 한 양태는 유리체내 적용을 위한 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체이다.

본원에 보고된 한 양태는 약제로서 사용되기 위한 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체이다.

본원에 보고된 한 양태는 눈 혈관 질환의 치료를 위한 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체이다.

본원에 보고된 한 양태는 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체 및 임의적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제형이다.

눈뿐만 아니라 나머지 신체에도 존재하는 항원에 표적화/결합하는 항체를 사용하는 경우, 눈으로부터 혈액 내로 혈액-눈-장벽을 통과한 후 짧은 전신 반감기는 전신 부작용을 피하기 위해 유리하다.

추가로, 수용체의 리간드에 특이적으로 결합하는 항체는 항체-항원 복합체가 눈으로부터 제거되는 경우, 즉 항체가 눈으로부터 나오는 수용체 리간드에 대한 수송 비히클로서 기능하여 수용체 신호전달을 억제하는 경우에만 눈 질환의 치료에 효과적이다.

본 발명자는 인간 신생아 Fc-수용체에 결합하지 않는 Fc-영역을 포함하는 항체, 즉 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드가 혈액-눈 장벽을 가로질러 수송된다는 것을 발견하였다. FcRn에의 결합이 혈액-눈-장벽을 가로지른 수송을 위해 요구되는 것으로 간주될지라도, 항체가 인간 FcRn에 결합하지 않기 때문에 이것은 놀라울만한 발견이다.

본원에 보고된 한 양태는 혈액-눈-장벽을 가로질러 눈으로부터 혈액 순환계 내로 가용성 수송체 리간드를 수송하기 위한 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체의 용도이다.

본원에 보고된 한 양태는 눈으로부터 하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 제거하기 위한 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체의 용도이다.

본원에 보고된 한 양태는 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환의 치료를 위한 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체의 용도이다.

본원에 보고된 한 양태는 유리체내 공간으로부터 혈액 순환계 내로 하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 수송하기 위한 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체의 용도이다.

본원에 보고된 한 양태는 눈 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체이다.

본원에 보고된 한 양태는 혈액-눈-장벽을 가로질러 눈으로부터 혈액 순환계 내로 가용성 수용체 리간드를 수송하는 데 사용하기 위한 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체이다.

본원에 보고된 한 양태는 눈으로부터 하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 제거하는 데 사용하기 위한 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체이다.

본원에 보고된 한 양태는 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체이다.

본원에 보고된 한 양태는 유리체내 공간으로부터 혈액 순환계 내로 하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 수송하는 데 사용하기 위한 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체이다.

본원에 보고된 한 양태는 유효량의 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 눈 혈관 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법이다.

본원에 보고된 한 양태는 유효량의 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체를 개체에게 투여하여 혈액-눈-장벽을 가로질러 눈으로부터 혈액 순환계 내로 가용성 수용체 리간드를 수송하는 단계를 포함하는, 개체에서 혈액-눈-장벽을 가로질러 눈으로부터 혈액 순환계 내로 가용성 수용체 리간드를 수송하는 방법이다.

본원에 보고된 한 양태는 유효량의 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체를 개체에게 투여하여 눈으로부터 하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 제거하는 단계를 포함하는, 개체에서 눈으로부터 하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 제거하는 방법이다.

본원에 보고된 한 양태는 유효량의 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체를 개체에게 투여하여 유리체내 공간으로부터 혈액 순환계 내로 하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 수송하는 단계를 포함하는, 개체에서 유리체내 공간으로부터 혈액 순환계 내로 하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 수송하는 방법이다.

본원에 보고된 한 양태는 유효량의 본원에 보고된 (이량체성) 폴리펩티드 또는 항체를 개체에게 투여하여 혈액-눈-장벽을 가로질러 눈으로부터 혈액 순환계 내로 가용성 수용체 리간드를 수송하는 단계를 포함하는, 개체에서 혈액-눈-장벽을 가로질러 유리체내 공간 또는 눈으로부터 혈액 순환계 내로 가용성 수용체 리간드를 수송하는 방법이다.

한 실시양태에서, (이량체성) 폴리펩티드는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 2가 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 4가 이중특이적 항체이다.

한 실시양태에서, (이량체성) 폴리펩티드는 삼중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 삼중특이적 항체는 3가 삼중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 삼중특이적 항체는 4가 삼중특이적 항체이다.

한 실시양태에서, (이량체성) 폴리펩티드는 크로스맙이다.

한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 추가로 포함하고 제2 폴리펩티드는 돌연변이 S354C 및 T366W를 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 돌연변이 S354C, T366S, L368A 및 Y407V를 추가로 포함하고, 제2 폴리펩티드는 돌연변이 Y349C 및 T366W를 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드는 서브클래스 IgG1의 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드는 돌연변이 L234A 및 L235A를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드는 돌연변이 P329G를 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드는 서브클래스 IgG2의 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드는 돌연변이 V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S 및 P331S를 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드는 서브클래스 IgG4의 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드는 돌연변이 S228P 및 L235E를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드는 돌연변이 P329G를 추가로 포함한다.

도 1: IHH-AAA 돌연변이(돌연변이 I253A, H310A 및 H435A의 조합(카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링))를 갖는 IgG1 또는 IgG4 서브클래스의 항-VEGF/ANG2 항체의 개념 및 장점의 도식.
도 2: 소규모 DLS-기초 점도 측정: 200 mM 아르기닌/석시네이트 완충제(pH 5.5)에서 150 mg/㎖에서 외삽된 점도((IHH-AAA 돌연변이를 갖는) 항-VEGF/ANG2 항체 VEGF/ANG2-0016 항체와 (이러한 IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않는) 기준 항체 VEGF/ANG2-0015의 비교).
도 3: 140 mM NaCl을 갖는 20 mM 히스티딘 완충제(pH 6.0)에서 (DLS 응집 시작 온도를 포함하는) 온도에 따른 DLS 응집((IHH-AAA 돌연변이를 갖는) 본원에 보고된 항-VEGF/ANG2 항체 VEGF/ANG2-0016과 (이러한 IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않는) 기준 항체 VEGF/ANG2-0015의 비교).
도 4: 40℃ 및 100 mg/㎖에서 7일 저장(주 피크의 감소 및 고분자량(HMW) 증가)(보다 더 낮은 응집을 보이는 (IHH-AAA 돌연변이를 갖는) 본원에 보고된 항-VEGF/ANG2 항체 VEGF/ANG2-0016과 (이러한 IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않는) 기준 항체 VEGF/ANG2-0015의 비교).
도 5a 및 5b: 도 5a: (IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않는) VEGF/ANG2-0015의 FcRn 정상 상태 친화성; 및 도 5b: (IHH-AAA 돌연변이를 갖는) VEGF/ANG2-0016의 FcRn 정상 상태 친화성.
도 6: IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않는 VEGF/ANG2-0015 및 IHH-AAA 돌연변이를 갖는 VEGF/ANG2-0016(둘 다 P329G LALA 돌연변이를 갖는 IgG1 서브클래스이고; IgG1 서브클래스 및 IgG4-기초 항체의 항-디곡시게닌(digoxigenin) 항체(항-Dig 항체)가 대조군으로서 사용되었음)의 FcγRIIIa 상호작용 측정.
도 7a: 혈청 및 전체 눈 용해물에서 항-VEGF/ANG2 항체의 농도를 측정하기 위한 개략적인 약동학(PK) ELISA 분석 원리.
도 7b: 정맥내(i.v.) 적용 후 혈청 농도: IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않는 VEGF/ANG2-0015와 IHH-AAA 돌연변이를 갖는 VEGF/ANG2-0016의 비교.
도 7c: 유리체내 적용 후 혈청 농도: IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않는 VEGF/ANG2-0015와 IHH-AAA 돌연변이를 갖는 VEGF/ANG2-0016의 비교.
도 7d: (정맥내 적용에 비해 우측 눈 내로만의 유리체내 적용 후) 우측 눈 및 좌측 눈에서 (IHH-AAA 돌연변이를 갖는) VEGF/ANG2-0016의 눈 용해물 농도: 유리체내 적용 후 우측 눈에서만 유의한 농도가 검출될 수 있었고; 정맥내 적용 후 눈 용해물에서의 농도는 (IHH-AAA 돌연변이를 갖는) VEGF/ANG2-0016의 낮은 혈청 반감기로 인해 검출될 수 없었다.
도 7e: (정맥내 적용에 비해 우측 눈 내로만의 유리체내 적용 후) 우측 눈 및 좌측 눈에서 (IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않는) VEGF/ANG2-0015의 눈 용해물 농도: 유리체내 적용 후 우측 눈에서 (및 좌측 눈에서 어느 정도) VEGF/ANG2-0015의 농도가 검출될 수 있었고; 이것은 (IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않는) VEGF/ANG2-0015의 긴 반감기에 의해 설명될 수 있는, 우측 눈으로부터 혈청 내로의 확산 및 혈청으로부터 좌측 눈 내로의 확산을 시사하고; 정맥내 적용 후에도 (IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않는) 혈청-안정성 VEGF/ANG2-0015가 눈 내로 확산되었기 때문에 양 눈의 눈 용해물에서 유의한 농도가 검출될 수 있었다.
도 8: FcRn에 결합하는 능력 면에서 조작된 항체는 SPR 분석에서 기준 야생형(wt) 항체에 비해 연장된(YTE 돌연변이) 또는 단축된 (IHH-AAA 돌연변이) 생체내 반감기, 향상된 (YTE 돌연변이) 또는 감소된 결합(IHH-AAA 돌연변이)을 나타낼 뿐만 아니라 FcRn 컬럼 크로마토그래피에서 향상된 또는 감소된 체류시간도 나타낸다: a) huFcRn 유전자이식 수컷 C57BL/6J 마우스 +/- 276 내로의 10 mg/kg의 단회 정맥내 볼루스 적용 후 PK 데이터: wt IgG, 및 YTE 및 IHH-AAA Fc-영역-변형된 IgG에 대한 AUC 데이터; b) 비아코어 센서그램(BIAcore sensorgram); c) FcRn 친화성 컬럼 용출; 야생형 항-IGF-1R 항체(기준), 항-IGF-1R 항체의 YTE 돌연변이체, 항-IGF-1R 항체의 IHH-AAA 돌연변이체.
도 9: Fc-영역 내로 도입된 돌연변이의 수에 따른 FcRn 친화성 크로마토그래피에서의 체류시간의 변화.
도 10: Fc-영역 내로 도입된 돌연변이의 비대칭 분포에 따른 FcRn 결합의 변화.
도 11: 2개의 연속적 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 중쇄 둘 다에서 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A를 겸비한 이중특이적 항-VEGF/ANG2 항체(VEGF/ANG2-0121)의 용출 크로마토그램.
도 12: 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 중쇄 둘 다에서 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A를 갖는 항-IGF-1R 항체(IGF-1R-0045)의 용출 크로마토그램.
도 13: IgG Fc-영역 변형된 항-VEGF/ANG2 항체와 CM5 칩 상에 고정된 단백질 A의 결합.
도 14: FcRn 친화성 컬럼 상에서 상이한 항-VEGF/ANG2 항체들의 용출 크로마토그램.
도 15: 상이한 융합 폴리펩티드들과 스타필로코커스 단백질 A의 결합(SPR).
도 16: 상이한 항-VEGF/ANG2 항체 및 항-IGF-1R 항체 돌연변이체들과 고정된 단백질 A의 결합(SPR).
도 17: 항체 IGF-1R 0033, 0035 및 0045의 정맥내 적용 후 혈청 농도의 비교.
도 18: 항체 IGF-1R 0033의 유리체내 및 정맥내 적용 후 눈 용해물 농도의 비교.
도 19: 항체 IGF-1R 0035의 유리체내 및 정맥내 적용 후 눈 용해물 농도의 비교.
도 20: 항체 IGF-1R 0045의 유리체내 및 정맥내 적용 후 눈 용해물 농도의 비교.

I. 정의

용어 "약"은 뒤따르는 수치 값의 +/- 20%의 범위를 의미한다. 한 실시양태에서, 용어 "약"은 뒤따르는 수치 값의 +/- 10%의 범위를 의미한다. 한 실시양태에서, 용어 "약"은 뒤따르는 수치 값의 +/- 5%의 범위를 의미한다.

본원의 목적상 "수용자 인간 골격"은 이하에 정의된 바와 같이 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격으로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 골격 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 골격의 아미노산 서열을 포함하는 골격이다. 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격"으로부터 유래된" 수용자 인간 골격은 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 아미노산 서열 변경을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변경의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용자 인간 골격은 VL 인간 면역글로불린 골격 서열 또는 인간 컨센서스 골격 서열과 서열 면에서 동일하다.

"친화 성숙된" 항체는 변경을 보유하지 않는 모 항체에 비해 하나 이상의 초가변 영역(HVR)에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭하고, 이러한 변경은 항원에 대한 항체의 친화성을 개선한다.

용어 "변경"은 변형된 항체 또는 융합 폴리펩티드를 수득하기 위한, 모 항체 또는 융합 폴리펩티드, 예를 들면, 적어도 Fc-영역의 FcRn 결합 부분을 포함하는 융합 폴리펩티드 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이(치환), 삽입(추가) 또는 결실을 의미한다. 용어 "돌연변이"는 특정된 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 잔기로 치환되는 것을 의미한다. 예를 들면, 돌연변이 L234A는 항체 Fc-영역(폴리펩티드) 내의 위치 234에서 아미노산 잔기 라이신이 아미노산 잔기 알라닌으로 치환되어 있다는 것(알라닌에 의한 라이신의 치환)을 의미한다(카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링).

본원에서 사용된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 모든 불변 영역들 및 도메인들의 아미노산 위치는 문헌(Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))에 기재되어 있고 본원에서 "카바트에 따른 넘버링"으로서 지칭되는 카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 구체적으로, 문헌(Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))의 카바트 넘버링 시스템(제647면 내지 제660면 참조)이 카파 및 람다 동종형의 경쇄 불변 도메인 CL을 위해 사용되고, 카바트 EU 지수 넘버링 시스템(제661면 내지 제723면 참조)이 불변 중쇄 도메인(CH1, 힌지, CH2 및 CH3)을 위해 사용된다.

"천연 아미노산 잔기"는 알라닌(3 문자 코드: Ala, 1 문자 코드: A), 아르기닌(Arg, R), 아스파라긴(Asn, N), 아스파르트산(Asp, D), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 글루탐산(Glu, E), 글리신(Gly, G), 히스티딘(His, H), 이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 라이신(Lys, K), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 세린(Ser, S), 쓰레오닌(Thr, T), 트립토판(Trp, W), 티로신(Tyr, Y) 및 발린(Val, V)으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타낸다.

용어 "아미노산 돌연변이"는 또 다른 상이한 아미노산 잔기(= 교체 아미노산 잔기)에 의한 하나 이상의 기존 아미노산 잔기의 치환을 의미한다. 교체 아미노산 잔기는 "천연 아미노산 잔기"일 수 있고 알라닌(3 문자 코드: ala, 1 문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파르트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 라이신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 쓰레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y) 및 발린(val, V)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 교체 아미노산 잔기는 "비-천연 아미노산 잔기"일 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제6,586,207호, 국제 특허출원 공개 제WO 98/48032호, 국제 특허출원 공개 제WO 03/073238호, 미국 특허출원 공개 제2004/0214988호, 국제 특허출원 공개 제WO 2005/35727호, 국제 특허출원 공개 제WO 2005/74524호, 문헌(Chin, J.W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 9026-9027), 문헌(Chin, J.W. and Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137), 문헌(Chin, J.W., et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024) 및 문헌(Wang, L. and Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10)(모두 전체적으로 본원에 참고로 도입됨)을 참조한다.

용어 "아미노산 삽입"은 아미노산 서열의 예정된 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 (추가로) 도입되는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 삽입은 1개 또는 2개의 아미노산 잔기의 삽입일 것이다. 삽입된 아미노산 잔기(들)는 임의의 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기일 수 있다.

용어 "아미노산 결실"은 아미노산 서열의 예정된 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "ANG-2"는 예를 들면, 문헌(Maisonpierre, P.C., et al, Science 277 (1997) 55-60) 및 문헌(Cheung, A.H., et al., Genomics 48 (1998) 389-91)에 기재되어 있는 인간 안지오포이에틴-2(ANG-2)(대안적으로 ANGPT2 또는 ANG2로 약칭됨)(서열번호 31)를 지칭한다. 안지오포이에틴-1(서열번호 32) 및 안지오포이에틴-2는 혈관 내피 내에서 선택적으로 발현되는 티로신 키나제의 패밀리인 Ties에 대한 리간드로서 발견되었다(Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407 (2000) 242-248). 현재 안지오포이에틴 패밀리의 4종의 구별되는 구성원들이 존재한다. 안지오포이에틴-3 및 안지오포이에틴-4(ANG-3 및 ANG-4)는 마우스 및 인간에서 동일한 유전자 좌위의 널리 분기된 대응물을 대표할 수 있다(Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-356; Kim, I., et al., J Biol Chem 274 (1999) 26523-26528). ANG-1 및 ANG-2는 처음에 조직 배양 실험에서 각각 작용제 및 길항제로서 확인되었다(ANG-1에 대해서는 문헌(Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-1169) 참조; 및 ANG-2에 대해서는 문헌(Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60) 참조). 모든 공지되어 있는 안지오포이에틴들이 주로 Tie2(서열번호 33)에 결합하고, ANG-1 및 ANG-2 둘 다가 3 nM(Kd)의 친화성으로 Tie2에 결합한다(Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60).

본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 원하는 항원 결합 활성, 단백질 A 결합 활성 및/또는 FcRn 결합 활성을 나타내는 한, 단일클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 항체 구조물들을 포괄한다.

용어 "비대칭 Fc-영역"은 카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 상응하는 위치에서 상이한 아미노산 잔기를 갖는 한 쌍의 Fc-영역 폴리펩티드를 의미한다.

용어 "FcRn 결합에 대한 비대칭 Fc-영역"은 상응하는 위치에서 상이한 아미노산 잔기를 갖는 2개의 폴리펩티드 쇄들로 구성된 Fc-영역을 의미하고, 이때 상기 위치는 카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따라 결정되고, 상이한 위치는 Fc-영역과 인간 신생아 Fc 수용체(FcRn)의 결합에 영향을 미친다. 본원의 목적상, "FcRn 결합에 대한 비대칭 Fc-영역"에서 Fc-영역의 2개 폴리펩티드 쇄들 사이의 차이는 예를 들면, 이중특이적 항체의 생성을 위해 이종이량체성 Fc-영역의 형성을 용이하게 하도록 도입되어 있는 차이를 포함하지 않는다. 이 차이는 비대칭적일 수도 있다. 즉, 2개의 쇄들이 카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 비-상응하는 아미노산 잔기에서 차이를 갖는다. 이 차이는 이종이량체화를 용이하게 하고 동종이량체화를 감소시킨다. 이러한 차이의 예는 소위 "놉스-인투-홀스" 치환이다(예를 들면, 미국 특허 제7,695,936호 및 미국 특허출원 공개 제2003/0078385호 참조). 서브클래스 IgG1의 IgG 항체의 Fc-영역의 개별 폴리펩티드 쇄에서 하기 놉스 및 홀스 치환들이 이종이량체 형성을 증가시키는 것으로 발견되었고, 이때 나열된 마지막 치환이 특히 적합하다: 1) 한 쇄에서 Y407T, 및 다른 쇄에서 T366Y; 2) 한 쇄에서 Y407A, 및 다른 쇄에서 T366W; 3) 한 쇄에서 F405A, 및 다른 쇄에서 T394W; 4) 한 쇄에서 F405W, 및 다른 쇄에서 T394S; 5) 한 쇄에서 Y407T, 및 다른 쇄에서 T366Y; 6) 한 쇄에서 T366Y 및 F405A, 및 다른 쇄에서 T394W 및 Y407T; 7) 한 쇄에서 T366W 및 F405W, 및 다른 쇄에서 T394S 및 Y407A; 8) 한 쇄에서 F405W 및 Y407A, 및 다른 쇄에서 T366W 및 T394S; 및 9) 한 쇄에서 T366W, 및 다른 쇄에서 T366S, L368A 및 Y407V. 추가로, 2개의 Fc-영역 폴리펩티드 쇄들 사이에 새로운 다이설파이드 가교를 생성하는 변화는 이종이량체 형성을 용이하게 한다(예를 들면, 미국 특허출원 공개 제2003/0078385호 참조). 서브클래스 IgG1의 IgG 항체의 Fc-영역의 개별 폴리펩티드 쇄에서 새로운 쇄내 다이설파이드 결합을 형성하도록 시스테인 잔기들을 적절하게 공간적으로 분리시키는 하기 치환들이 이종이량체 형성을 증가시키는 것으로 발견되었다: 한 쇄에서 Y349C, 및 다른 쇄에서 S354C; 한 쇄에서 Y349C, 및 다른 쇄에서 E356C; 한 쇄에서 Y349C, 및 다른 쇄에서 E357C; 한 쇄에서 L351C, 및 다른 쇄에서 S354C; 한 쇄에서 T394C, 및 다른 쇄에서 E397C; 또는 한 쇄에서 D399C, 및 다른 쇄에서 K392C. 이종이량체화를 용이하게 하는 아미노산 변화의 추가 예는 소위 "전하 쌍 치환"이다(예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2009/089004호 참조). 서브클래스 IgG1의 IgG 항체의 Fc-영역의 개별 폴리펩티드 쇄에서 하기 전하 쌍 치환들이 이종이량체 형성을 증가시키는 것으로 발견되었다: 1) 한 쇄에서 K409D 또는 K409E, 및 다른 쇄에서 D399K 또는 D399R; 2) 한 쇄에서 K392D 또는 K392E, 및 다른 쇄에서 D399K 또는 D399R; 3) 한 쇄에서 K439D 또는 K439E, 및 다른 쇄에서 E356K 또는 E356R; 4) 한 쇄에서 K370D 또는 K370E, 및 다른 쇄에서 E357K 또는 E357R; 5) 한 쇄에서 K409D 및 K360D, 및 다른 쇄에서 D399K 및 E356K; 6) 한 쇄에서 K409D 및 K370D, 및 다른 쇄에서 D399K 및 E357K; 7) 한 쇄에서 K409D 및 K392D, 및 다른 쇄에서 D399K, E356K 및 E357K; 8) 한 쇄에서 K409D 및 K392D, 및 다른 쇄에서 D399K; 9) 한 쇄에서 K409D 및 K392D, 및 다른 쇄에서 D399K 및 E356K; 10) 한 쇄에서 K409D 및 K392D, 및 다른 쇄에서 D399K 및 D357K; 11) 한 쇄에서 K409D 및 K370D, 및 다른 쇄에서 D399K 및 D357K; 12) 한 쇄에서 D399K, 및 다른 쇄에서 K409D 및 K360D; 및 13) 한 쇄에서 K409D 및 K439D, 및 다른 쇄에서 D399K 및 E356K.

용어 "(항원과의) 결합"은 시험관내 분석, 한 실시양태에서 항체가 표면에 결합되어 있고 항원과 상기 항체의 결합이 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정되는 결합 분석에서 항체와 이의 항원의 결합을 의미한다. 결합은 10^-8 M 이하, 일부 실시양태에서 10^-13 내지 10^-8 M, 일부 실시양태에서 10^-13 내지 10^-9 M의 결합 친화성(K_D)을 의미한다.

결합은 비아코어 분석(지이 헬쓰케어 바이오센서 아베(GE Healthcare Biosensor AB), 스웨덴 업살라 소재))에 의해 조사될 수 있다. 결합의 친화성은 용어 k_a(항체/항원 복합체로부터 항체의 결합에 대한 속도 상수), k_d(해리 상수) 및 K_D(k_d/k_a)에 의해 정의된다.

용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.

용어 "CH2-도메인"은 약 EU 위치 231부터 EU 위치 340까지 걸쳐 있는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분을 의미한다(카바트에 따른 EU 넘버링 시스템). 한 실시양태에서, CH2-도메인은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는다: APELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQE STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAK.

용어 "CH3-도메인"은 약 EU 위치 341부터 EU 위치 446까지 걸쳐 있는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분을 의미한다. 한 실시양태에서, CH3-도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는다: GQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG.

항체의 "클래스"는 그의 중쇄에 의해 보유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5종의 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 서브클래스(동종형), 예를 들면, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 더 나누어질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 도메인들은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로서 지칭된다.

용어 "필적할만한 길이"는 2개의 폴리펩티드들이 동일한 수의 아미노산 잔기를 포함하거나 길이 면에서 1개 이상 내지 최대 10개의 아미노산 잔기에 의해 상이할 수 있다는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, (Fc-영역) 폴리펩티드는 동일한 수의 아미노산 잔기를 포함하거나 1개 내지 10개의 아미노산 잔기에 의해 상이하다. 한 실시양태에서, (Fc-영역) 폴리펩티드는 동일한 수의 아미노산 잔기를 포함하거나 1개 내지 5개의 아미노산 잔기에 의해 상이하다. 한 실시양태에서, (Fc-영역) 폴리펩티드는 동일한 수의 아미노산 잔기를 포함하거나 1개 내지 3개의 아미노산 잔기에 의해 상이하다.

"효과기 기능"은 항체 클래스에 따라 달라지는, 항체의 Fc-영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예에는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체(예를 들면, B 세포 수용체)의 하향조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다.

약제, 예를 들면, 약학 제형의 "유효량"은 필요한 시간 동안 필요한 용량에서 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다.

용어 "Fc-융합 폴리펩티드"는 결합 도메인(예를 들면, 항원 결합 도메인, 예컨대, 단일 쇄 항체, 또는 폴리펩티드, 예컨대, 수용체의 리간드)과, 원하는 표적 결합 활성, 단백질 A 결합 활성 및 FcRn 결합 활성을 나타내는 항체 Fc-영역의 융합체를 의미한다.

용어 "인간 유래의 Fc-영역"은 힌지 영역, CH2-도메인 및 CH3-도메인의 적어도 일부를 함유하는 인간 유래의 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 의미한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226 또는 Pro230부터 중쇄의 카복실-말단까지 걸쳐 있다. 한 실시양태에서, Fc-영역은 서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는다. 그러나, Fc-영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다.

용어 "FcRn"은 인간 신생아 Fc 수용체를 의미한다. FcRn은 라이소좀 분해 경로로부터 IgG를 구제하여 제거를 감소시키고 반감기를 증가시키는 기능을 한다. FcRn은 2개의 폴리펩티드들로 구성된 이종이량체성 단백질이다: 50 kDa 클래스 I 주조직적합성 복합체 유사 단백질(α-FcRn) 및 15 kDa β2-마이크로글로불린(β2m). FcRn은 고친화성으로 IgG의 Fc-영역의 CH2-CH3 부분에 결합한다. IgG와 FcRn 사이의 상호작용은 엄격히 pH 의존적이고 1:2 화학양론으로 일어나고, 이때 1개의 IgG가 그의 2개의 중쇄들을 통해 2개의 FcRn 분자들에 결합한다(Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083). FcRn 결합은 산성 pH(pH < 6.5)의 엔도좀(endosome)에서 일어나고, IgG는 중성 세포 표면(약 7.4의 pH)에서 방출된다. 상기 상호작용의 pH 민감성은 음세포작용(pinocytosis)에 의해 세포 내로 도입된 IgG가 엔도좀의 산성 환경 내에서 상기 수용체에 결합함으로써 세포내 분해로부터의 FcRn-매개된 보호를 받는 것을 용이하게 한다. 그 다음, FcRn은 세포 표면으로의 IgG의 재순환을 용이하게 하고 FcRn-IgG 복합체가 세포 외부의 중성 pH 환경에 노출될 때 혈류 내로의 후속 방출을 용이하게 한다.

용어 "Fc-영역의 FcRn 결합 부분"은 약 EU 위치 243부터 EU 위치 261까지, 약 EU 위치 275부터 EU 위치 293까지, 약 EU 위치 302부터 EU 위치 319까지, 약 EU 위치 336부터 EU 위치 348까지, 약 EU 위치 367부터 EU 위치 393 및 EU 위치 408까지, 및 약 EU 위치 424부터 EU 위치 440까지 걸쳐 있는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분을 의미한다. 한 실시양태에서, 카바트의 EU 넘버링에 따른 하기 아미노산 잔기들 중 하나 이상이 변경된다: F243, P244, P245 P, K246, P247, K248, D249, T250, L251, M252, I253, S254, R255, T256, P257, E258, V259, T260, C261, F275, N276, W277, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, P291, R292, E293, V302, V303, S304, V305, L306, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, G316, K317, E318, Y319, I336, S337, K338, A339, K340, G341, Q342, P343, R344, E345, P346, Q347, V348, C367, V369, F372, Y373, P374, S375, D376, I377, A378, V379, E380, W381, E382, S383, N384, G385, Q386, P387, E388, N389, Y391, T393, S408, S424, C425, S426, V427, M428, H429, E430, A431, L432, H433, N434, H435, Y436, T437, Q438, K439 및 S440(EU 넘버링).

"골격" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인들로 구성된다: FR1, FR2, FR3 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

용어 "전장 항체"는 4개의 폴리펩티드들을 포함하는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본원에 정의된 Fc-영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 의미한다. 전장 항체는 추가 도메인, 예를 들면, 전장 항체의 쇄들 중 하나 이상에 접합된 scFv 또는 scFab를 포함할 수 있다. 이 접합체들도 용어 전장 항체에 의해 포괄된다.

용어 "이량체성 폴리펩티드"는 공유적으로 회합된 2개 이상의 폴리펩티드들을 포함하는 복합체를 의미한다. 상기 복합체는 공유적으로 회합되어 있거나 다른 폴리펩티드와 비-공유적으로 회합되어 있는 추가 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 이량체성 폴리펩티드는 2개 또는 4개의 폴리펩티드들을 포함한다.

용어 "이종이량체" 또는 "이종이량체성"은 (예를 들면, 필적할만한 길이의) 2개의 폴리펩티드들을 포함하는 분자를 의미하고, 이때 상기 2개의 폴리펩티드들은 상응하는 위치에서 하나 이상의 상이한 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 갖고, 이때 상응하는 위치는 카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따라 결정된다.

용어 "동종이량체" 및 "동종이량체성"은 필적할만한 길이의 2개의 폴리펩티드들을 포함하는 분자를 의미하고, 이때 상기 2개의 폴리펩티드들은 상응하는 위치에서 동일한 아미노산 서열을 갖고, 이때 상응하는 위치는 카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따라 결정된다.

본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드는 초점이 맞춰진 돌연변이 또는 성질에 따라 결정되는 동종이량체 또는 이종이량체일 수 있다. 예를 들면, FcRn 및/또는 단백질 A 결합(즉, 초점이 맞추어진 성질)에 대하여, 이량체성 폴리펩티드는 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A(이 돌연변이들은 이량체성 폴리펩티드의 FcRn 및/또는 단백질 A 결합 성질에 대하여 초점이 맞추어짐)에 대한 동종이량체이지만(즉, 이량체성 폴리펩티드의 폴리펩티드들 둘 다가 이 돌연변이들을 포함하지만), 동시에 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V(이 돌연변이들은 이량체성 폴리펩티드의 이종이량체화에 대해 유도되고 FcRn/단백질 A 결합 성질에 대해 유도되지 않기 때문에 초점이 맞추어지지 않음), 및 돌연변이 S354C 및 T366W 각각에 대한 이종이량체이다(제1 세트는 제1 폴리펩티드에만 포함되는 반면, 제2 세트는 제2 폴리펩티드에만 포함됨). 추가로, 예를 들면, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드는 돌연변이 I253A, H310A, H433A, H435A 및 Y436A에 대한 이종이량체일 수 있다(즉, 이 돌연변이들은 모두 이량체성 폴리펩티드의 FcRn 및/또는 단백질 A 결합 성질에 대해 유도된다). 즉, 한 폴리펩티드는 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A를 포함하는 반면, 다른 폴리펩티드는 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A를 포함한다.

용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 외래 핵산이 도입되어 있는 세포(이러한 세포의 자손을 포함함)를 지칭한다. 숙주 세포는 일차 형질전환된 세포 및 계대배양의 수와 관계없이 이로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 핵산 함량 면에서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나 돌연변이를 함유할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 기능 또는 생물학적 활성과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 여기에 포함된다.

"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체이다. 인간 항체의 이 정의는 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특히 배제한다.

"인간 컨센서스 골격"은 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 골격 서열의 선택에서 가장 흔히 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 골격이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터의 선택이다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌(Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3)에 기재된 바와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우 하위군은 상기 문헌(Kabat et al.)에 기재된 바와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우 하위군은 상기 문헌(Kabat et al.)에 기재된 바와 같은 하위군 III이다.

용어 "로부터 유도된"은 하나 이상의 위치에서 변경을 도입함으로써 모 아미노산 서열로부터 아미노산 서열을 유도한다는 것을 의미한다. 따라서, 유도된 아미노산 서열은 하나 이상의 상응하는 위치(항체 Fc-영역에 대한 카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에서 상응하는 모 아미노산 서열과 상이하다. 한 실시양태에서, 모 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열은 상응하는 위치에서 1개 내지 15개의 아미노산 잔기에 의해 상이하다. 한 실시양태에서, 모 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열은 상응하는 위치에서 1개 내지 10개의 아미노산 잔기에 의해 상이하다. 한 실시양태에서, 모 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열은 상응하는 위치에서 1개 내지 6개의 아미노산 잔기에 의해 상이하다. 마찬가지로, 유도된 아미노산 서열은 그의 모 아미노산 서열에 대한 높은 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 한 실시양태에서, 모 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열은 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 한 실시양태에서, 모 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열은 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 한 실시양태에서, 모 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열은 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.

용어 "인간 Fc-영역 폴리펩티드"는 "천연" 또는 "야생형" 인간 Fc-영역 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 의미한다. 용어 "변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드"는 하나 이상의 "아미노산 변경"에 의해 "천연" 또는 "야생형" 인간 Fc-영역 폴리펩티드로부터 유도된 아미노산 서열을 의미한다. "인간 Fc-영역"은 2개의 인간 Fc-영역 폴리펩티드들로 구성된다. "변이체 (인간) Fc-영역"은 2개의 Fc-영역 폴리펩티드들로 구성되고, 이때 이들 둘 다가 변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드일 수 있거나, 하나가 인간 Fc-영역 폴리펩티드이고 나머지 하나가 변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드이다.

한 실시양태에서, 인간 Fc-영역 폴리펩티드는 본원에 보고된 돌연변이를 갖는 서열번호 60의 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드, 서열번호 61의 인간 IgG2 Fc-영역 폴리펩티드 또는 서열번호 63의 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, 변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드는 서열번호 60, 61 또는 63의 Fc-영역 폴리펩티드로부터 유도되고, 서열번호 60, 61 또는 63의 Fc-영역 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는다. 한 실시양태에서, 변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드는 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 돌연변이, 한 실시양태에서 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 돌연변이를 포함한다/갖는다. 한 실시양태에서, 변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드는 서열번호 60, 61 또는 63의 인간 Fc-영역 폴리펩티드에 대한 약 80% 이상의 상동성을 갖는다. 한 실시양태에서, 변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드는 서열번호 60, 61 또는 63의 인간 Fc-영역 폴리펩티드에 대한 약 90% 이상의 상동성을 갖는다. 한 실시양태에서, 변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드는 서열번호 60, 61 또는 63의 인간 Fc-영역 폴리펩티드에 대한 약 95% 이상의 상동성을 갖는다.

서열번호 60, 61 또는 63의 인간 Fc-영역 폴리펩티드로부터 유도된 변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드는 함유된 아미노산 변경에 의해 정의된다. 따라서, 예를 들면, 용어 P329G는 서열번호 60, 61 또는 63의 인간 Fc-영역 폴리펩티드에 비해 아미노산 위치 329에서 글리신으로의 프롤린의 돌연변이를 갖는, 인간 Fc-영역 폴리펩티드로부터 유도된 변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드를 의미한다.

본 발명에서 논의된 모든 위치들의 경우, 넘버링은 카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른다.

인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 60).

돌연변이 L234A 및 L235A를 갖는, 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 64).

돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 갖는, 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 65).

돌연변이 S354C 및 T366W를 갖는, 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 66).

돌연변이 L234A, L235A, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 갖는, 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 67).

돌연변이 L234A, L235A, S354C 및 T366W를 갖는, 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 68).

돌연변이 P329G를 갖는, 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 69).

돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는, 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 70).

돌연변이 P239G, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 갖는, 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 71).

돌연변이 P329G, S354C 및 T366W를 갖는, 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 72).

돌연변이 L234A, L235A, P329G, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 갖는, 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 73).

돌연변이 L234A, L235A, P329G, S354C 및 T366W를 갖는, 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 74).

인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 63).

돌연변이 S228P 및 L235E를 갖는, 인간 IgG4 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 75).

돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 갖는, 인간 IgG4 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 76).

돌연변이 S354C 및 T366W를 갖는, 인간 IgG4 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 77).

돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 갖는, 인간 IgG4 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 78).

돌연변이 S228P, L235E, S354C 및 T366W를 갖는, 인간 IgG4 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 79).

돌연변이 S228P, L235E, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 갖는, 인간 IgG4 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 80).

돌연변이 P329G를 갖는, 인간 IgG4 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 81).

돌연변이 P239G, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 갖는, 인간 IgG4 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 82).

돌연변이 P329G, S354C 및 T366W를 갖는, 인간 IgG4 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 83).

돌연변이 S228P, L235E, P329G, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 갖는, 인간 IgG4 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 84).

돌연변이 S228P, L235E, P329G, S354C 및 T366W를 갖는, 인간 IgG4 Fc-영역으로부터 유도된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 85).

상이한 인간 Fc-영역들의 정렬은 하기 제시되어 있다(카바트 EU 지수 넘버링 시스템):

"인간화된 항체"는 비-인간 HVR들로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR들로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 인간화된 항체는 실질적으로 모든 하나 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인들을 포함할 것이고, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 HVR들(예를 들면, CDR들)은 비-인간 항체의 HVR들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR들은 인간 항체의 FR들에 상응한다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열 면에서 초가변성("상보성 결정 영역" 또는 "CDR들")을 갖고/갖거나 구조적으로 정의된 루프("초가변 루프")를 형성하고/하거나 항원 접촉 잔기("항원 접촉부")를 함유하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR들을 포함한다: VH에서 3개(H1, H2 및 H3), 및 VL에서 3개(L1, L2 및 L3). 본원에 표시된 HVR들은 (a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)에 존재하는 초가변 루프(Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917); (b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)에 존재하는 CDR들(Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242); (c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2) 및 93-101(H3)에 존재하는 항원 접촉부(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및 (d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3) 및 94-102(H3)를 포함하는, (a), (b) 및/또는 (c)의 조합을 포함한다.

달리 표시되어 있지 않은 한, HVR 잔기 및 가변 도메인 내의 다른 잔기(예를 들면, FR 잔기)는 본원에서 카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다(상기 문헌(Kabat et al.)).

달리 표시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 용어 "IGF-1R"은 포유동물, 예컨대, 영장류(예를 들면, 인간) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 IGF-1R을 지칭한다. 상기 용어는 "전장" 비-프로세싱된 IGF-1R뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 형태의 IGF-1R도 포괄한다. 상기 용어는 IGF-1R의 천연 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체도 포괄한다. 인간 IGF-1R의 아미노산 서열은 서열번호 11에 제시되어 있다.

"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 사육 동물(예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들면, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대, 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.

"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리되어 있는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들면, 전기영동(예를 들면, SDS-PAGE, 등전점 포커싱(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정될 때 95% 또는 99% 초과의 순도까지 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌(Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87)을 참조한다.

"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리되어 있는 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 염색체 외부에 존재하거나 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.

"항-IGF-1R 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이들의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자(단일 벡터 또는 별개의 벡터들 내의 이러한 핵산 분자(들) 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)를 포함함)를 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 즉, 예를 들면, 천연 돌연변이 또는 단일클론 항체 제형의 제조 동안 발생되는 돌연변이를 함유하는 가능한 변이체 항체(이러한 변이체는 일반적으로 미미한 양으로 존재함)를 제외하고 상기 집단을 구성하는 개별 항체들은 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체들을 포함하는 다중클론 항체 제형과 대조적으로, 단일클론 항체 제형의 각각의 단일클론 항체는 한 항원 상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 특성을 항체들의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 것으로서 표시하고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 요구하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 좌위들의 전부 또는 일부를 함유하는 유전자이식 동물을 사용하는 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 기법들에 의해 제조될 수 있고, 이러한 방법들 및 단일클론 항체의 다른 예시적인 제조 방법은 본원에 기재되어 있다.

"천연 항체"는 상이한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는 다이설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄들 및 2개의 동일한 중쇄들로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. 각각의 중쇄는 N-말단부터 C-말단까지 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로서도 지칭되는 가변 영역(VH)에 이어서 3개의 불변 도메인들(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, 각각의 경쇄는 N-말단부터 C-말단까지 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로서도 지칭되는 가변 영역(VL)에 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여 카파(κ) 및 람다(λ)로서 지칭되는 두 유형들 중 하나로 배정될 수 있다.

용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 상업적 포장물 내에 통상적으로 포함되는 설명서로서, 증상, 용법, 용량, 투여, 병용 치료, 사용금지사유, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고에 대한 정보를 함유하는 설명서를 지칭하기 위해 사용된다.

기준 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고 필요하다면 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입하고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 후 기준 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 정렬은 당분야의 기술 내에 있는 다양한 방식들, 예를 들면, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 이용함으로써 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2의 이용을 통해 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 만들어졌고, 소스 코드는 미국 저작권 협회(U.S. Copyright Office, 미국 워싱톤 디씨 20559 소재)에 사용자 문서로 출원되었고, 상기 코드는 상기 미국 저작권 협회에서 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)로부터 공개적으로 입수될 수 있거나 상기 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 작동 시스템 상에서의 사용을 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터들은 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변경되지 않는다.

ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:

100 곱하기 분율 X/Y

여기서, X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 정렬에서 이 프로그램에 의해 동일한 일치(match)로서 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 존재하는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동등하지 않을 것임이 인식될 것이다. 달리 구체적으로 명시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값들은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램의 이용을 통해 바로 이전 단락에 기재된 바와 같이 수득된다.

용어 "약학 제형"은 그 내부에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게 하는 형태로 존재하고 이 제형이 투여되는 대상체에게 허용불가능한 독성을 나타내는 추가 성분을 함유하지 않는 제형을 지칭한다.

"약학적으로 허용가능한 담체"는 대상체에게 독성을 나타내지 않는, 약학 제형 중의 활성 성분 이외의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "펩티드성 링커"는 한 실시양태에서 합성 유래의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 의미한다. 펩티드성 링커는 한 실시양태에서 30개 이상의 아미노산의 길이, 한 실시양태에서 32개 내지 50개의 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 한 실시양태에서, 펩티드성 링커는 32개 내지 40개의 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 한 실시양태에서, 펩티드성 링커는 (G_xS)_n이고, 이때 G는 글리신이고, S는 세린이고, x는 3이고 n은 8, 9 또는 10이거나, x는 4이고 n은 6, 7 또는 8이고, 한 실시양태에서 x는 4이고 n은 6 또는 7이고, 한 실시양태에서 x는 4이고 n은 7이다. 한 실시양태에서, 펩티드성 링커는 (G₄S)₆G₂이다.

본원에서 사용된 용어 "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 모든 항체들(키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체)을 의미한다. 이것은 숙주 세포, 예컨대, NS0 또는 CHO 세포로부터, 또는 인간 면역글로불린 유전자에 대한 유전자이식 동물(예를 들면, 마우스)로부터 단리된 항체, 또는 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터의 사용을 통해 발현된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 항체는 재배열된 형태로 가변 영역 및 불변 영역을 갖는다. 재조합 항체는 생체내 체세포 과다돌연변이를 겪을 수 있다. 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역들의 아미노산 서열들은 인간 생식세포주 VH 및 VL 서열들로부터 유래되고 이들과 관련되어 있지만 생체내에서 인간 항체 생식세포주 레퍼토리 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료"(및 이의 문법적 어미변화, 예컨대, "치료한다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연 경과를 변형시키기 위한 시도에서의 임상 중재를 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 경감, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 보고된 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드는 질환의 발생을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.

본원에서 사용된 용어 "가(valent)"는 특정된 수의 결합 부위가 (항체) 분자에 존재한다는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 각각 2개의 결합 부위들, 4개의 결합 부위들 및 6개의 결합 부위들이 (항체) 분자에 존재한다는 것을 의미한다. 본원에 보고된 이중특이적 항체는 한 바람직한 실시양태에서 "2가" 항체이다.

용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체와 이의 항원의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 이때 각각의 도메인은 4개의 골격 영역들(FR들) 및 3개의 초가변 영역들(HVR들)을 포함한다(예를 들면, 문헌(Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91) 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 나아가, 특정 항원에 결합하는 항체는 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다(예를 들면, 문헌(Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887); 및 문헌(Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628) 참조).

용어 "눈 혈관 질환"은 눈내 신생혈관 증후군, 예컨대, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 미숙아의 망막병증, 신생혈관 녹내장, 망막 정맥 폐색, 중심 망막 정맥 폐색, 황반 변성, 연령 관련 황반 변성, 색소성 망막염, 망막 혈관종성 증식, 황반 모세혈관확장증, 허혈성 망막병증, 홍채 신생혈관형성, 눈내 신생혈관형성, 각막 신생혈관형성, 망막 신생혈관형성, 맥락막 신생혈관형성 및 망막 변성을 포함하나 이들로 한정되지 않는다(예를 들면, 문헌(Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G.K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625-1710) 참조).

본원에서 사용된 용어 "벡터"는 그 자신에 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어는 자가 복제 핵산 구조물로서의 벡터뿐만 아니라 그 자신이 도입되어 있는 숙주 세포의 게놈 내로 삽입된 벡터도 포함한다. 일부 벡터들은 이들에 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터들은 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.

본원에서 사용된 용어 "VEGF"는 문헌(Leung, D.W., et al., Science 246 (1989) 1306-1309), 문헌(Houck et al., Mol. Endocrin. 5 (1991) 1806-1814), 문헌(Keck, P.J., et al., Science 246 (1989) 1309-1312) 및 문헌(Connolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-2024)에 기재된 바와 같이 인간 혈관 내피 성장인자(VEGF/VEGF-A), 165개 아미노산 인간 혈관 내피세포 성장인자(인간 VEGF165의 전구체 서열의 아미노산 27-191: 서열번호 30; 아미노산 1-26은 신호 펩티드를 나타냄), 및 관련된 121, 189 및 206 혈관 내피세포 성장인자 동형체들과 함께; 이 성장인자들의 천연 대립형질 형태 및 프로세싱된 형태를 지칭한다. VEGF는 종양 및 눈내 장애와 관련된 정상적인 혈관신생 및 비정상적인 혈관신생, 및 신생혈관형성의 조절에 관여한다(Ferrara, N., et al., Endocrin. Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R.A., et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91; Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735; Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934; and Dvorak, H.F., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039). VEGF는 여러 공급원들로부터 단리되어 있고 여러 동형체들을 포함하는 동종이량체성 당단백질이다. VEGF는 내피세포에 대한 고도로 특이적인 유사분열촉진 활성을 보인다.

본원에서 사용된 용어 "돌연변이 IHH-AAA를 갖는"은 돌연변이 I253A(Ile253Ala), H310A(His310Ala) 및 H435A(His435Ala)의 겸비를 지칭하고, 본원에서 사용된 용어 "돌연변이 HHY-AAA를 갖는"은 돌연변이 H310A(His310Ala), H433A(His433Ala) 및 Y436A(Tyr436Ala)의 겸비를 지칭하고, 본원에서 사용된 용어 "돌연변이 YTE를 갖는"은 IgG1 또는 IgG4 서브클래스의 불변 중쇄 영역 내에서의 돌연변이 M252Y(Met252Tyr), S254T(Ser254Thr) 및 T256E(Thr256Glu)의 겸비를 지칭하는데, 이때 넘버링은 카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른다.

본원에서 사용된 용어 "돌연변이 P329G LALA를 갖는"은 IgG1 서브클래스의 불변 중쇄 영역 내에서의 돌연변이 L234A(Leu235Ala), L235A(Leu234Ala) 및 P329G(Pro329Gly)의 겸비를 지칭하는데, 이때 넘버링은 카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른다. 본원에서 사용된 용어 "돌연변이 SPLE를 갖는"은 IgG4 서브클래스의 불변 중쇄 영역 내에서의 돌연변이 S228P(Ser228Pro) 및 L235E(Leu235Glu)의 겸비를 지칭하는데, 이때 넘버링은 카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른다. 본원에서 사용된 용어 "돌연변이 SPLE 및 P329G를 갖는"은 IgG4 서브클래스의 불변 중쇄 영역 내에서의 돌연변이 S228P(Ser228Pro), L235E(Leu235Glu) 및 P329G(Pro329Gly)의 겸비를 지칭하는데, 이때 넘버링은 카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른다.

II. 조성물 및 방법

한 양태에서, 본 발명은 면역글로불린 Fc-영역과 신생아 Fc-수용체(FcRn)의 결합에 영향을 미치는, 즉 Fc-영역과 FcRn의 결합을 감소시키거나 심지어 제거하는 특이적 돌연변이 또는 돌연변이들의 조합이 Fc-영역과 스타필로코커스 단백질 A의 결합을 동시적으로 제거하지 않는다는 발견에 부분적으로 근거한다. 이것은 예를 들면, 카파 경쇄를 포함하는 항체에만 결합하는 특이적 및 종 제한된 친화성 크로마토그래피 물질, 예컨대, 카파셀렉트가 요구되지 않기 때문에 이용될 수 있는 정제 과정에 상당한 효과를 갖는다. 따라서, 본원에 보고된 돌연변이들의 조합으로 스타필로코커스 단백질 A와의 결합을 유지하면서 동시에 FcRn과의 결합을 감소시키거나 심지어 제거하는 것이 가능하다.

한 양태에서, 본 발명은 각각의 중쇄의 Fc-영역에서 상이한 돌연변이들을 사용함으로써 한편으로 FcRn과의 결합을 감소시키거나 심지어 제거하되, 다른 한편으로 스타필로코커스 단백질 A에 결합하는 능력을 유지하는 이종이량체성 분자, 예를 들면, 이중특이적 항체를 제공할 수 있다는 발견에 부분적으로 근거한다. 스타필로코커스 단백질 A와의 이 결합은 동종이량체성 부산물로부터 이종이량체성 분자를 분리하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 놉스-인투-홀스 방법을 이용하여 한 중쇄 Fc-영역 내의 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A를 다른 중쇄 Fc-영역 내의 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A와 조합함으로써 한편으로 FcRn에 결합하지 않지만(상기 두 돌연변이 세트들이 인간 FcRn에 대하여 침묵 상태이지만) 스타필로코커스 단백질 A와의 결합을 유지하는 이종이량체성 Fc-영역을 수득할 수 있다(돌연변이 I253A, H310A 및 H435A를 갖는 중쇄 Fc-영역은 FcRn에 결합하지 않고 스타필로코커스 단백질 A에 결합하지 않는 반면, 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A를 갖는 중쇄 Fc-영역은 FcRn에 결합하지 않지만 여전히 스타필로코커스 단백질 A에 결합한다). 따라서, 표준 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 동종이량체성 홀-홀 부산물을 제거할 수 있는데, 이는 이것이 스타필로코커스 단백질 A에 더 이상 결합하지 않기 때문이다. 따라서, 놉스-인투-홀스 방법을 홀 쇄 내의 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A 및 놉 쇄 내의 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A와 병용함으로써 동종이량체성 홀-홀 부산물로부터 이종이량체성 놉스-인투-홀스 생성물의 정제/분리를 용이하게 할 수 있다.

한 양태에서, 본 발명은 FcRn 결합을 갖지 않는, 유리체내 적용을 위한 항체가 혈액-망막-장벽을 횡단할 수 있고 눈에서 실질적으로 연장된 또는 단축된 반감기를 갖지 않고 혈액 순환계로부터 신속히 제거되어 눈 외부에서 전신 부작용을 초래하지 않거나 매우 제한된 전신 부작용을 초래하기 때문에 유리하다는 발견에 부분적으로 근거한다. 본 발명의 항체는 예를 들면, 눈 혈관 질환의 진단 또는 치료에 유용하다.

본 발명은 Fc-영역의 각각의 Fc-영역 폴리펩티드에서 상이한 돌연변이들을 사용함으로써 조정된 FcRn 결합을 갖는 이종이량체성 분자, 예를 들면, 이중특이적 항체를 제공할 수 있고 이와 더불어 조정된 전신 반감기를 갖는 항체를 제공할 수 있는 발견에 적어도 부분적으로 근거한다.

돌연변이 I253A, H310A 및 H435A, 또는 L251D, L314D 및 L432D, 또는 L251S, L314S 및 L432S의 조합은 단백질 A와의 결합을 상실시키는 반면, 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A, 또는 H310A, H433A 및 Y436A, 또는 L251D, L314D 및 L432D의 조합은 인간 신생아 Fc 수용체와의 결합을 상실시킨다.

하기 표는 상호작용에 관여하거나 상호작용을 변형시키도록 변화된 Fc-영역 내의 아미노산 잔기의 예시적인 개요를 제공한다.

본원에 보고된 변형은 하나 이상의 Fc 수용체, 예컨대, 인간 FcRn에 대한 결합 특이성을 변경시킨다. 동시에, 인간 FcRn과의 결합을 변경시키는 돌연변이들 중 일부는 스타필로코커스 단백질 A와의 결합을 변경시키지 않는다.

한 실시양태에서, 본원에 보고된 돌연변이들의 조합은 돌연변이들의 이 조합을 결여하는 상응하는 이량체성 폴리펩티드에 비해 이량체성 폴리펩티드의 혈청 반감기를 변경시키거나 실질적으로 변경시킨다. 한 실시양태에서, 돌연변이들의 조합은 돌연변이들의 이 조합을 결여하는 상응하는 이량체성 폴리펩티드에 비해 이량체성 폴리펩티드와 스타필로코커스 단백질 A의 결합을 변경시키지 않거나 실질적으로 변경시키지 않는다.

A. 신생아 Fc-수용체(FcRn)

신생아 Fc-수용체(FcRn)는 생체내 IgG 클래스의 항체의 대사적 운명에 중요하다. FcRn은 라이소좀 분해 경로로부터 야생형 IgG를 구제하여 제거를 감소시키고 반감기를 증가시키는 기능을 한다. 이것은 2개의 폴리펩티드들로 구성된 이종이량체성 단백질이다: 50 kDa 클래스 I 주조직적합성 복합체 유사 단백질(α-FcRn) 및 15 kDa β2-마이크로글로불린(β2m). FcRn은 클래스 IgG의 항체의 Fc-영역의 CH2-CH3 부분에 고친화성으로 결합한다. 클래스 IgG의 항체와 FcRn 사이의 상호작용은 pH 의존적이고 1:2 화학양론으로 일어난다. 즉, 1개의 IgG 항체 분자가 그의 2개의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드들을 통해 2개의 FcRn 분자들과 상호작용할 수 있다(예를 들면, 문헌(Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083) 참조).

따라서, IgG 시험관내 FcRn 결합 성질/특성은 혈액 순환계에서 그의 생체내 약동학적 성질을 표시한다.

중쇄 CH2-도메인 및 CH3-도메인의 상이한 아미노산 잔기들이 FcRn과 IgG 클래스의 항체의 Fc-영역 사이의 상호작용에 참여한다. FcRn과 상호작용하는 아미노산 잔기는 약 EU 위치 243과 EU 위치 261 사이, 약 EU 위치 275와 EU 위치 293 사이, 약 EU 위치 302와 EU 위치 319 사이, 약 EU 위치 336과 EU 위치 348 사이, 약 EU 위치 367과 EU 위치 393 또는 EU 위치 408 사이, 및 약 EU 위치 424와 EU 위치 440 사이에 위치한다. 보다 구체적으로, 카바트의 EU 넘버링에 따른 하기 아미노산 잔기들이 Fc-영역과 FcRn 사이의 상호작용에 관여한다: F243, P244, P245 P, K246, P247, K248, D249, T250, L251, M252, I253, S254, R255, T256, P257, E258, V259, T260, C261, F275, N276, W277, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, P291, R292, E293, V302, V303, S304, V305, L306, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, G316, K317, E318, Y319, I336, S337, K338, A339, K340, G341, Q342, P343, R344, E345, P346, Q347, V348, C367, V369, F372, Y373, P374, S375, D376, I377, A378, V379, E380, W381, E382, S383, N384, G385, Q386, P387, E388, N389, Y391, T393, S408, S424, C425, S426, V427, M428, H429, E430, A431, L432, H433, N434, H435, Y436, T437, Q438, K439 및 S440.

부위-지정된 돌연변이유발 연구는 FcRn에 대한 IgG의 Fc-영역 내의 매우 중요한 결합 부위가 히스티딘 310, 히스티딘 435 및 이소류신 253이고, 다소 덜 중요한 결합 부위가 히스티딘 433 및 티로신 436이라는 것을 입증하였다(예를 들면, 문헌(Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2825); 문헌(Raghavan, M., et al., Biochem. 34 (1995) 14649-14657); 및 문헌(Medesan, C., et al., J Immunol. 158 (1997) 2211-2217) 참조).

IgG와 FcRn의 결합을 증가시키는 방법은 다양한 아미노산 잔기들에서 IgG를 돌연변이시킴으로써 수행되었다: 쓰레오닌 250, 메티오닌 252, 세린 254, 쓰레오닌 256, 쓰레오닌 307, 글루탐산 380, 메티오닌 428, 히스티딘 433 및 아스파라긴 434(문헌(Kuo, T.T., et al., J. Clin. Immunol. 30 (2010) 777-789) 참조).

일부 경우, 혈액 순환계에서 감소된 반감기를 갖는 항체가 요구된다. 예를 들면, 유리체내 적용을 위한 약물은 환자의 눈에서 긴 반감기를 가져야 하고 환자의 혈액 순환계에서 짧은 반감기를 가져야 한다. 이러한 항체는 질환 부위, 예를 들면, 눈에의 증가된 노출이라는 장점도 갖는다.

FcRn 결합 및 이와 더불어 혈액 순환계에서의 반감기에 영향을 미치는 상이한 돌연변이들이 공지되어 있다. 마우스 Fc-영역-마우스 FcRn 상호작용에 매우 중요한 Fc-영역 잔기는 부위-지정된 돌연변이유발에 의해 확인되었다(예를 들면, 문헌(Dall'Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180) 참조). 잔기 I253, H310, H433, N434 및 H435(카바트에 따른 EU 넘버링)가 상기 상호작용에 관여한다(Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533-2536; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542-548). 잔기 I253, H310 및 H435는 인간 Fc와 뮤린 FcRn의 상호작용에 매우 중요한 것으로 발견되었다(Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2855). 잔기 M252Y, S254T 및 T256E는 단백질-단백질 상호작용 연구에 의해 FcRn 결합을 개선한다고 기재되어 있다(Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524). 인간 Fc-인간 FcRn 복합체의 연구는 잔기 I253, S254, H435 및 Y436이 상기 상호작용에 매우 중요하다는 것을 밝혔다(Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). 문헌(Yeung, Y.A., et al., J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671)에는 잔기 248 내지 259, 301 내지 317, 376 내지 382, 및 424 내지 437의 다양한 돌연변이체들이 보고되어 있고 조사되어 있다. 예시적인 돌연변이들 및 FcRn 결합에 대한 이들의 영향은 하기 표에 나열되어 있다.

1개의 Fc-영역 폴리펩티드에서 한쪽으로 치우친 1개의 돌연변이가 결합을 유의하게 약화시키기에 충분하다는 것을 발견하였다. Fc-영역 내로 도입되는 돌연변이가 더 많을수록 FcRn과의 결합이 더 약해진다. 그러나, 한쪽으로 치우친 비대칭 돌연변이는 FcRn 결합을 완전히 억제하기에 충분하지 않다. 양 측면 상에서의 돌연변이가 FcRn 결합을 완전히 억제하기 위해 필요하다.

FcRn 결합에 영향을 미치기 위한 IgG1 Fc-영역의 대칭 조작의 결과는 하기 표에 제시되어 있다(돌연변이의 정렬, 및 FcRn 친화성 크로마토그래피 컬럼 상에서의 체류시간).

3분 미만의 체류시간은 물질이 관류할 때 결합이 없다는 것에 상응한다(빈 피크).

단일 돌연변이 H310A는 임의의 FcRn 결합을 제거하는 가장 강한 침묵 대칭 돌연변이이다.

대칭 단일 돌연변이 I253A 및 H435A는 0.3분 내지 0.4분의 체류시간의 상대적 이동을 초래한다. 이것은 일반적으로 검출불가능한 결합으로서 간주될 수 있다.

단일 돌연변이 Y436A는 FcRn 친화성 컬럼에 대한 검출가능한 상호작용 강도를 야기한다. 이 이론에 의해 구속받지 않지만, 이 돌연변이는 상호작용 부재, 예컨대, 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A의 조합(IHH-AAA 돌연변이)으로부터 식별될 수 있는 생체내 FcRn-매개된 반감기에 영향을 미칠 수 있었다.

대칭적으로 변형된 항-HER2 항체를 사용하여 수득한 결과는 하기 표에 제시되어 있다(참고를 위해서는 국제 특허출원 공개 제WO 2006/031370호 참조).

Fc-영역 내로의 비대칭 FcRn 결합 영향 돌연변이의 도입 효과는 놉스-인투-홀스 기술을 이용하여 조립한 이중특이적 항체에 의해 예시되었다(예를 들면, 미국 특허 제7,695,936호 및 미국 특허출원 공개 제2003/0078385호 참조; "홀 쇄" 돌연변이: S354C/T366W, "놉 쇄" 돌연변이: Y349C/T366S/L368A/Y407V). FcRn 친화성 크로마토그래피 방법을 이용하여 FcRn 결합에 대한 비대칭적으로 도입된 돌연변이의 효과를 용이하게 측정할 수 있다(도 9 및 하기 표 참조). FcRn 친화성 컬럼으로부터 나중에 회수되는, 즉 FcRn 친화성 컬럼 상에서 보다 더 긴 체류시간을 갖는 항체는 생체내에서 보다 더 긴 반감기를 갖는다(역의 경우도 마찬가지임).

Fc-영역 내로의 비대칭 FcRn 결합 영향 돌연변이의 도입 효과는 비대칭 돌연변이의 도입을 허용하기 위해 놉스-인투-홀스 기술을 이용하여 조립한 단일특이적 항-IGF-1R 항체에 의해 더 예시되었다(예를 들면, 미국 특허 제7,695,936호 및 미국 특허출원 공개 제2003/0078385호 참조; "홀 쇄" 돌연변이: S354C/T366W, "놉 쇄" 돌연변이: Y349C/T366S/L368A/Y407V). FcRn 친화성 크로마토그래피 방법을 이용하여 FcRn 결합에 대한 비대칭적으로 도입된 돌연변이의 효과를 용이하게 측정할 수 있다(하기 표 참조). FcRn 친화성 컬럼으로부터 나중에 회수되는, 즉 FcRn 친화성 컬럼 상에서 보다 더 긴 체류시간을 갖는 항체는 생체내에서 보다 더 긴 반감기를 갖는다(역의 경우도 마찬가지임).

비대칭 IHH-AAA 돌연변이 및 LLL-DDD 돌연변이(LLL-DDD 돌연변이 = 돌연변이 L251D, L314D 및 L432D의 조합)는 상응하는 모 또는 야생형 항체보다 더 약한 결합을 보인다.

대칭 HHY-AAA 돌연변이(= 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A의 조합)는 인간 FcRn에 더 이상 결합하지 않는 반면 단백질 A와의 결합을 유지하는 Fc-영역을 생성한다(도 11, 12, 13 및 14 참조).

Fc-영역 내로의 비대칭 FcRn 결합 영향 돌연변이의 도입 효과는 비대칭 돌연변이의 도입을 허용하기 위해 놉스-인투-홀스 기술을 이용하여 조립한 단일특이적 항-IGF-1R 항체(IGF-1R), 이중특이적 항-VEGF/ANG2 항체(VEGF/ANG2), 및 두 중쇄의 C-말단에 융합된 전장 항체(융합체)에 의해 더 예시되었다(예를 들면, 미국 특허 제7,695,936호 및 미국 특허출원 공개 제2003/0078385호 참조; "홀 쇄" 돌연변이: S354C/T366W, "놉 쇄" 돌연변이: Y349C/T366S/L368A/Y407V). FcRn 친화성 크로마토그래피 방법, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 방법 및 SPR-기초 방법을 이용하여 FcRn 결합 및 단백질 A 결합에 대한 도입된 돌연변이의 효과를 용이하게 측정할 수 있다(하기 표 참조).

본원에 보고된 한 양태는 본원에 보고된 변이체 인간 IgG 클래스 Fc-영역을 포함하는 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드이다.

Fc-영역 융합 폴리펩티드 또는 전장 항체에 함유될 때 본원에 보고된 Fc-영역(이량체성 폴리펩티드)은 전술된 특성을 분자에게 부여한다. 융합 파트너는 생물학적 활성을 갖는 임의의 분자일 수 있고, 그의 생체내 반감기는 감소되거나 증가될 것이다. 즉, 그의 생체내 반감기는 명확히 한정될 것이고 그의 의도된 적용을 위해 조정될 것이다.

Fc-영역 융합 폴리펩티드, 예를 들면, TNFR-Fc-영역 융합 폴리펩티드(TNFR = 인간 종양 괴사 인자 수용체), IL-1R-Fc-영역 융합 폴리펩티드(IL-1R = 인간 인터류킨-1 수용체), VEGFR-Fc-영역 융합 폴리펩티드(VEGFR = 인간 혈관 내피 성장인자 수용체), 또는 ANG2R-Fc-영역 융합 폴리펩티드(ANG2R = 인간 안지오포이에틴(angiopoietin) 2 수용체)는 예를 들면, 본원에 보고된 변이체 (인간) IgG 클래스 Fc-영역, 및 리간드를 포함하는 표적에 결합하는 수용체 단백질을 포함할 수 있다.

Fc-영역 융합 폴리펩티드는 예를 들면, 본원에 보고된 변이체 (인간) IgG 클래스 Fc-영역, 및 표적에 결합하는 항체 단편(예를 들면, 항체 Fab 단편, scFv(예를 들면, 문헌(Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1126-1136) 참조) 또는 도메인 항체(dAb)(예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2004/058821호 및 제WO 2003/002609호 참조)를 포함함)을 포함할 수 있다.

Fc-영역 융합 폴리펩티드는 예를 들면, 본원에 보고된 변이체 (인간) 인간 IgG 클래스 Fc-영역 및 (천연 또는 인공) 수용체 리간드를 포함할 수 있다.

항체, 예를 들면, 전장 항체 또는 크로스맙은 본원에 보고된 변이체 (인간) 인간 IgG 클래스 Fc-영역을 포함할 수 있다.

B. 눈 혈관 질환

눈 혈관 질환은 새로운 혈관의 변형된 또는 조절되지 않은 증식 및 눈 조직의 구조물, 예컨대, 망막 또는 각막 내로의 침습을 특징으로 하는 임의의 병리학적 상태이다.

한 실시양태에서, 눈 혈관 질환은 습성 연령 관련 황반 변성(습성 AMD), 건성 연령 관련 황반 변성(건성 AMD), 당뇨병성 황반 부종(DME), 낭포 황반 부종(CME), 비-증식성 당뇨병성 망막병증(NPDR), 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR), 낭포 황반 부종, 혈관염(예를 들면, 중심 망막 정맥 폐색), 유두부종, 망막염, 결막염, 포도막염, 맥락막염, 다초점 맥락막염, 눈 히스토플라스마증, 안검염, 건성안(쇼그렌병) 및 기탁 안과 질환으로 구성된 군으로부터 선택되고, 이때 상기 눈 질환 또는 장애는 눈 신생혈관형성, 혈관 누출 및/또는 망막 부종과 관련되어 있다.

본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드를 포함하는 항체는 습성 AMD, 건성 AMD, CME, DME, NPDR, PDR, 안검염, 건성안 및 포도막염, 한 바람직한 실시양태에서 습성 AMD, 건성 AMD, 안검염 및 건성안, 한 바람직한 실시양태에서 CME, DME, NPDR 및 PDR, 한 바람직한 실시양태에서 안검염 및 건성안, 특히 습성 AMD 및 건성 AMD, 특히 습성 AMD의 예방 및 치료에 유용하다.

일부 실시양태에서, 눈 혈관 질환은 습성 연령 관련 황반 변성(습성 AMD), 황반 부종, 망막 정맥 폐색, 미숙아의 망막병증 및 당뇨병성 망막병증으로 구성된 군으로부터 선택된다.

각막 신생혈관형성과 관련된 다른 질환들은 유행성 각막결막염, 비타민 A 결핍, 접촉 렌즈 과다착용, 아토피성 각막염, 상윤부 각막염, 익상편 건조각막염, 쇼그렌병, 여드름 장미증, 필렉테눌로시스(phylectenulosis), 매독, 마이코박테리아 감염, 지질 변성, 화학적 화상, 세균성 궤양, 진균성 궤양, 헤르페스 심플렉스(Herpes simplex) 감염, 헤르페스 조스터(Herpes zoster) 감염, 원생동물 감염, 카포시 육종, 무렌(Mooren) 궤양, 테리엔(Terrien) 변연부 퇴화, 변연부 각질용해증, 류마티스 관절염, 전신 루푸스, 다발동맥염, 외상, 베게너 육아종증, 공막염, 스티븐스 존슨병(Steven's Johnson disease), 유사천포창, 방사상 각막절개, 및 각막 이식 거부를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

망막/맥락막 신생혈관형성과 관련된 질환은 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 겸상적혈구 빈혈, 사르코이드, 매독, 탄력섬유가성황색종, 파게트병(Paget's disease), 정맥 폐색, 동맥 폐색, 경동맥 폐쇄성 질환, 만성 포도막염/유리체염, 마이코박테리아 감염, 라임병(Lyme's disease), 전신홍반루푸스, 미숙아의 망막병증, 색소성 망막염, 망막 부종(황반 부종을 포함함), 일스병(Eale's disease), 베체트병(Bechet's disease), 망막염 또는 맥락막염을 야기하는 감염, 추정된 눈 히스토플라스마증, 베스트병(Best's disease), 근시, 시신경유두, 스타가르트병(Stargart's disease), 평면부염, 만성 망막 탈착, 과다점성 증후군, 톡소플라스마증, 외상 및 레이저 후 합병증을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

다른 질환은 피부홍조와 관련된 질환(각의 신생혈관형성), 및 모든 형태의 증식성 유리체망막병증을 포함하는 섬유혈관성 또는 섬유성 조직의 비정상적인 증식에 의해 야기된 질환을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

미숙아의 망막병증(ROP)은 조산된 신생아에게 영향을 미치는 눈 질환이다. 이 질환은 흉터형성 및 망막 탈착을 초래할 수 있는 망막 혈관의 무질서한 성장에 의해 야기되는 것으로 생각된다. ROP는 경미할 수 있고 자발적으로 해소될 수 있으나, 심각한 경우 실명을 유발할 수 있다. 따라서, 모든 미숙아들은 ROP에 대한 위험을 갖고 매우 낮은 출생 체중은 추가 위험 인자이다. 산소 독성 및 상대적인 저산소 둘 다가 ROP의 발생에 기여할 수 있다.

황반 변성은 노인에서 주로 발견되는 의학적 상태이고, 이때 망막의 황반 영역으로서 공지되어 있는 눈의 내층 중심이 얇아짐, 위축 및 일부 경우 출혈을 겪는다. 이것은 미세한 세부사항을 보거나, 글을 읽거나 얼굴을 인식하는 능력의 상실을 수반하는 중심 시력의 상실을 초래할 수 있다. 미국 안과 학회에 따르면, 이 질환은 오늘날 미국에서 50세 이상의 연령을 갖는 개체들에서 중심 시력 상실(실명)의 주된 원인이다. 보다 더 젊은 개체에게 영향을 미치는 일부 황반 퇴행위축은 종종 황반 변성으로서 지칭되지만, 상기 용어는 일반적으로 연령 관련 황반 변성(AMD 또는 ARMD)을 지칭한다.

연령 관련 황반 변성은 망막 색소 상피와 기저 맥락막 사이의 황반에서 드루젠(drusen)으로서 지칭되는 특징적인 황색 침착물로 시작된다. 이 초기 변화(연령 관련 황반병증으로서 지칭됨)를 갖는 대다수의 사람들은 우수한 시력을 갖는다. 드루젠을 갖는 사람들은 진행된 AMD를 발생시킬 수 있다. 드루젠이 크고 많고 황반 아래의 착색된 세포 층에서의 장애와 관련되어 있을 때 위험은 상당히 더 높다. 크고 부드러운 드루젠은 상승된 콜레스테롤 침착물과 관련되어 있고 콜레스테롤 강하제 또는 Rheo 절차에 반응할 수 있다.

심각한 시력 상실의 원인이 되는 진행된 AMD는 2가지 형태를 갖는다: 건성 및 습성. 진행된 AMD의 건성 형태인 중심 지도모양 위축은 눈의 중심 부분에서 광수용체(막대 및 원뿔)의 상실을 통해 시력 상실을 야기하는, 망막 아래의 망막 색소 상피 층까지의 위축으로부터 발생한다. 이 질환에 대한 이용가능한 치료는 없지만, 고용량의 항산화제, 루테인(lutein) 및 제아잔틴(zeaxanthin)과 함께 비타민 보충이 건성 황반 변성의 진행을 늦추고 일부 환자들에서 시력을 개선한다는 것이 국립 눈 연구소 등에 의해 입증되었다.

색소성 망막염(RP)은 일군의 유전성 눈 질환이다. RP에 대한 증상의 진행에서, 야맹증은 일반적으로 수년 또는 심지어 수십년까지 터널 시력에 앞선다. RP를 갖는 많은 사람들이 그들의 40대 또는 50대까지 법률적으로 맹인이 되지 않고 그들의 인생 전체에서 약간의 시력을 보유한다. 다른 일부 사람들은 RP로부터 완전히 실명하고, 일부 경우 어린 시절만큼 이른 시기에 실명한다. RP의 진행은 각각의 경우에서 상이하다. RP는 일군의 유전 장애인 유전성 망막 퇴행위축의 일종이고, 이때 망막의 광수용체(막대 및 원뿔) 또는 망막 색소 상피(RPE)의 비정상이 진행성 시력 상실 유발한다. 영향받은 개체는 먼저 암(dark) 적응의 결함 또는 밤소경증(야맹증)을 경험한 후, 주변 시야의 감소(터널 시력으로서 공지되어 있음) 및 종종 질환의 경과에서 늦게 중심 시력의 상실을 경험한다.

황반 부종은 망막의 황색 중심 영역인 눈의 황반 위에서 또는 아래에서 유체 및 단백질 침착물이 모아짐으로써 상기 황반이 두꺼워지고 팽창될 때 일어난다. 황반이 안구 후방에서 망막의 중심 근처에 있기 때문에 상기 팽창은 사람의 중심 시력을 왜곡시킬 수 있다. 이 영역은 사람이 직접적으로 시선에 있는 형태, 색채 및 세부사항을 볼 수 있도록 날카롭고 선명한 중심 시력을 제공하는 조밀하게 팩킹된 원뿔을 유지한다. 낭포 황반 부종은 낭포 형성을 포함하는 황반 부종의 일종이다.

C. 스타필로코커스 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼을 사용한 항체 정제

한 양태에서, 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는, 면역글로불린 힌지 영역의 적어도 일부, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 각각 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이량체성 폴리펩티드로서,

i) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A를 각각 포함하거나,

ii) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L251D, L314D 및 L432D를 각각 포함하거나,

iii) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L251S, L314S 및 L432S를 각각 포함하거나,

iv) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A를 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A를 포함하거나,

v) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A를 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L251D, L314D 및 L432D를 포함하거나,

vi) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A를 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L251S, L314S 및 L432S를 포함하는, 이량체성 폴리펩티드가 제공된다.

이 이량체성 폴리펩티드들은 상기 돌연변이들로 인해 인간 FcRn과 결합하지 않는 성질을 갖는 반면, 스타필로코커스 단백질 A와의 결합은 유지된다.

따라서, 이 항체들은 통상적인 단백질 A 친화성 물질, 예컨대, 맙셀렉트슈어(MabSelectSure)를 사용함으로써 원치 않는 부산물로부터 정제, 즉 분리될 수 있다. 카파 서브클래스의 경쇄를 포함하는 항체와 함께만 사용될 수 있는 매우 정교하지만 종 제한된 친화성 물질, 예컨대, 카파셀렉트(KappaSelect)를 사용하는 것이 요구되지 않는다. 추가로, 경쇄 서브클래스의 변형/교환이 이루어진다면 정제 방법을 채택하는 것이 요구되지 않는다(각각 도 11 및 12 참조).

본원에 보고된 한 양태는 하기 단계들을 포함하는, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드를 제조하는 방법이다:

a) 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 단계,

b) 배양 배지로부터 이량체성 폴리펩티드를 회수하는 단계, 및

c) 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 이량체성 폴리펩티드를 정제하여 이량체성 폴리펩티드를 제조하는 단계.

본원에 보고된 한 양태는 동종이량체성 폴리펩티드로부터 이종이량체성 폴리펩티드를 분리하기 위한 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A의 용도이다.

본원에 보고된 한 양태는 동종이량체성 폴리펩티드로부터 이종이량체성 폴리펩티드를 분리하기 위한 돌연변이 L251D, L314D 및 L432D의 용도이다.

본원에 보고된 한 양태는 동종이량체성 폴리펩티드로부터 이종이량체성 폴리펩티드를 분리하기 위한 돌연변이 L251S, L314S 및 L432S의 용도이다.

본원에 보고된 한 양태는 동종이량체성 Fc-영역으로부터 제1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체성 Fc-영역을 분리하기 위한, 제2 Fc-영역 폴리펩티드 내의 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A와 조합된 제1 Fc-영역 폴리펩티드 내의 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A의 용도이다.

본원에 보고된 한 양태는 동종이량체성 Fc-영역으로부터 제1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체성 Fc-영역을 분리하기 위한, 제2 Fc-영역 폴리펩티드 내의 돌연변이 L251D, L314D 및 L432D와 조합된 제1 Fc-영역 폴리펩티드 내의 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A의 용도이다.

본원에 보고된 한 양태는 동종이량체성 Fc-영역으로부터 제1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체성 Fc-영역을 분리하기 위한, 제2 Fc-영역 폴리펩티드 내의 돌연변이 L251S, L314S 및 L432S와 조합된 제1 Fc-영역 폴리펩티드 내의 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A의 용도이다.

상기 3개의 양태들의 한 실시양태에서, 제1 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 추가로 포함하고 제2 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 S354C 및 T366W를 추가로 포함한다.

상기 3개의 양태들의 한 실시양태에서, 제1 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 S354C, T366S, L368A 및 Y407V를 추가로 포함하고 제2 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 Y349C 및 T366W를 추가로 포함한다.

본원에 보고된 한 양태는 이량체성 Fc-영역 폴리펩티드와 단백질 A의 결합을 증가시키기 위한 돌연변이 Y436A의 용도이다.

돌연변이 Y436A를 도입함으로써 Fc-영역과 스타필로코커스 단백질 A(SPA)의 결합을 증가시킬 수 있다는 것이 발견되었다. 이것은 예를 들면, SPA와의 결합을 감소시키는 추가 돌연변이, 예를 들면, I253A 및 H310A 또는 H310A 및 H435A가 도입되는 경우 유리하다(도 15 참조).

본원에 보고된 한 양태는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는, 면역글로불린 힌지 영역의 적어도 일부, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 각각 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이량체성 폴리펩티드로서, 이때 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 Y436A(카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링)를 포함하는, 이량체성 폴리펩티드이다.

본원에 보고된 한 양태는 상이하게 변형되어 있는 면역글로불린 중쇄 Fc-영역을 포함하는, 단리/정제의 용이성을 제공하는 이중특이적 항체로서, 이때 하나 이상의 상기 변형이 i) 단백질 A에 대한 이중특이적 항체의 상이한 친화성, 및 ii) 인간 FcRn에 대한 이중특이적 항체의 상이한 친화성을 야기하고, 상기 이중특이적 항체가 단백질 A에 대한 그의 친화성에 근거하여 파괴된 세포, 배지 또는 항체들의 혼합물로부터 단리될 수 있는, 이중특이적 항체이다.

한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 pH 4.0 초과의 pH 값에서 용출된다.

한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 pH 구배 또는 pH 단계를 이용함으로써 단리되고, 이때 pH 구배 또는 pH 단계는 염의 추가를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 염은 약 0.5 몰 내지 약 1 몰의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, 염은 아세테이트의 리튬, 나트륨 및 칼륨 염; 나트륨 및 칼륨 바이카보네이트; 리튬, 나트륨 및 칼륨 카보네이트; 리튬, 나트륨, 칼륨 및 마그네슘 클로라이드; 나트륨 및 칼륨 플루오라이드; 나트륨, 칼륨 및 칼슘 니트레이트; 나트륨 및 칼륨 포스페이트; 및 칼슘 및 마그네슘 설페이트로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 염은 알칼리성 금속 또는 알칼리성 토금속의 할라이드 염이다. 한 바람직한 실시양태에서, 염은 염화나트륨이다.

한 양태에서, 이량체성 폴리펩티드는 본원에 보고된 바와 같이 변형된 제1 폴리펩티드, 및 단백질 A 및 FcRn 결합에 대하여 변형되지 않은 제2 폴리펩티드를 포함함으로써 이종이량체성 폴리펩티드를 형성하는데, 이때 상이한 변형은 상이한 변형을 결여하는 상응하는 이량체성 폴리펩티드보다 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.3 또는 1.4 pH 유닛(들)만큼 더 높은 pH에서 상기 이량체성 폴리펩티드가 단백질 A 친화성 물질로부터 용출되게 한다. 한 실시양태에서, 상이하게 변형된 이량체성 폴리펩티드는 4 이상의 pH에서 용출되는 반면, 변형되지 않은 이량체성 폴리펩티드는 3.5 이하의 pH에서 용출된다. 한 실시양태에서, 상이하게 변형된 이량체성 폴리펩티드는 약 4의 pH에서 용출되는 반면, 변형되지 않은 이량체성 폴리펩티드는 약 2.8 내지 3.5, 2.8 내지 3.2, 또는 2.8 내지 3의 pH에서 용출된다. 이 실시양태들에서, "변형되지 않은"은 상기 폴리펩티드들 둘 다에서 변형 H310A, H433A 및 Y436A(카바트 EU 지수 넘버링 시스템)의 결여를 지칭한다.

크로마토그래피 실시의 경우, 0.5 몰 내지 1 몰 염(예를 들면, NaCl)의 첨가는 특히 인간 IgG1 서브클래스로부터 유래된 경우 동종이량체성 폴리펩티드와 이종이량체성 폴리펩티드의 분리를 개선할 수 있다. pH 값을 증가시키는, 용출 용액에의 염의 첨가는 예를 들면, pH 단계 구배가 상기 2개의 종들을 성공적으로 분리시킬 수 있도록 용출을 위한 pH 범위를 넓힐 수 있다.

따라서, 한 실시양태에서, 본원에 보고된 돌연변이를 포함하는 한 쇄를 갖는 이종이량체성 IgG Fc-영역을 포함하는 이중특이적 항체를 분리하는 방법은 염의 존재 하에 pH 구배를 사용하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 염은 IgG Fc-영역 동종이량체의 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터의 용출과 IgG Fc-영역 이종이량체의 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터의 용출 사이의 pH 차이를 최대화하기에 충분한 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, 염은 약 0.5 몰 내지 약 1 몰의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, 염은 알칼리성 금속 또는 알칼리성 토금속 및 할로겐의 염이다. 한 실시양태에서, 염은 알칼리성 금속 또는 알칼리성 토금속의 클로라이드 염, 예컨대, NaCl, KCl, LiCl, CaCl₂ 또는 MgCl₂이다. 한 실시양태에서, pH 구배는 약 pH 4 내지 약 pH 5이다. 한 실시양태에서, 구배는 선형 구배이다. 한 실시양태에서, pH 구배는 단계 구배이다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 약 pH 4의 용액을 평형화된 단백질 A 친화성 컬럼에 적용하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에 보고된 변형에 대하여 이종이량체성 IgG Fc-영역을 포함하는 이중특이적 항체는 비-이종이량체성 이중특이적 항체를 실질적으로 함유하지 않는 하나 이상의 분획으로 단백질 A 친화성 크로마토그래피 물질로부터 용출된다.

본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드는 재조합 수단에 의해 제조된다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이고, 추가 양태는 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포이다. 재조합 제조 방법은 최신기술 수준에서 널리 공지되어 있고 원핵 세포 및 진핵 세포에서 단백질을 발현하는 단계 및 이량체성 폴리펩티드를 단리하고 통상적으로 약학적으로 허용가능한 순도까지 정제하는 후속 단계를 포함한다. 숙주 세포에서 전술된 이량체성 폴리펩티드를 발현하기 위해, 각각의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 표준 방법으로 발현 벡터 내로 삽입한다. 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포, 예컨대, CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, 효모 또는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 세포에서 발현을 수행하고, 세포(배양 상청액 또는 용해 후 세포)로부터 이량체성 폴리펩티드를 회수한다.

일반적인 항체 재조합 제조 방법은 최신기술 수준에서 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌(Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202), 문헌(Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282), 문헌(Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160) 및 문헌(Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880)에 기재되어 있다.

따라서, 본원에 보고된 한 양태는 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서,

a) 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키는 단계,

b) 상기 이량체성 폴리펩티드의 합성을 허용하는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계, 및

c) 배양물로부터 상기 이량체성 폴리펩티드를 회수하여 이량체성 폴리펩티드를 제조하는 단계

를 포함하는 방법이다.

한 실시양태에서, 회수 단계 c)는 면역글로불린 Fc-영역 특이적 포획 시약의 사용을 포함한다. 한 실시양태에서, 이 Fc-영역 특이적 포획 시약은 결합-및-용출-모드로 사용된다. 이러한 Fc-영역 특이적 포획 시약의 예는 예를 들면, 대규모에서 높은 유속 및 낮은 배압을 허용하는 고도 강성 아가로스 베이스 매트릭스를 기제로 한 스타필로코커스 단백질 A-기제 친화성 크로마토그래피 컬럼이다. 이것은 이량체성 폴리펩티드, 즉 그의 Fc-영역에 결합하는 리간드를 특징으로 한다. 상기 리간드는 그가 표적 분자와의 결합에 용이하게 사용될 수 있게 하기 위해 긴 친수성 스페이서 아암을 통해 매트릭스에 부착된다.

본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드는 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지로부터 적절하게 분리된다. B-세포 또는 하이브리도마 세포는 이량체성 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 RNA의 공급원으로서 작용할 수 있다. 단일클론 항체를 코딩하는 DNA 및 RNA는 통상적인 절차를 이용함으로써 용이하게 단리되고 서열결정된다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있고, 그 후 상기 발현 벡터를, 이량체성 폴리펩티드를 생성하지 않는 숙주 세포, 예컨대, HEK 293 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜 상기 숙주 세포에서 재조합 단일클론 이량체성 폴리펩티드의 합성을 수득한다.

세포 성분 또는 다른 오염물질들, 예를 들면, 다른 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당분야에서 잘 공지되어 있는 다른 방법으로 항체의 정제를 수행한다(문헌(Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)) 참조). 다양한 방법들, 예컨대, 미생물 단백질을 사용한 친화성 크로마토그래피(예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, 양이온 교환(카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노 에틸 수지) 및 혼합 방식 교환), (예를 들면, β-머캡토에탄올 및 다른 SH 리간드를 사용한) 티오친화성(thiophilic) 흡착, (예를 들면, 페닐-세파로스, 아자-아레노친화성(arenophilic) 수지 또는 m-아미노페닐보론산을 사용한) 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피, (예를 들면, Ni(II)-친화성 및 Cu(II)-친화성 물질을 사용한) 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 전기영동 방법(예컨대, 겔 전기영동, 모세관 전기영동)이 잘 확립되어 있고, 단백질 정제를 위해 널리 사용된다(Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

본 발명의 한 양태는 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 약학 제형이다. 본 발명의 또 다른 양태는 약학 제형의 제조를 위한 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 또는 항체의 용도이다. 본 발명의 추가 양태는 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 약학 제형의 제조 방법이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 약학 담체와 함께 제형화된, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 또는 항체를 함유하는 제형, 예를 들면, 약학 제형을 제공한다.

본원에 보고된 제형은 당분야에서 공지되어 있는 다양한 방법들에 의해 투여될 수 있다. 당업자가 인식할 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 화합물을 특정 투여 경로로 투여하기 위해, 상기 화합물의 불활성화를 방지하는 물질로 상기 화합물을 코팅하거나 이러한 물질과 함께 상기 화합물을 공-투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들면, 적절한 담체, 예를 들면, 리포좀 또는 희석제 중의 화합물을 대상체에게 투여할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제는 식염수 및 완충제 수용액을 포함한다. 약학 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 성분을 위한 이러한 매질 및 물질의 사용은 당분야에서 공지되어 있다.

눈내 적용 또는 국소 적용을 포함하나 이들로 한정되지 않는 많은 가능한 전달 방식이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 적용은 눈내 적용이고, 결막하 주입, 전방내 주입, 측두 윤부를 통한 전방 내로의 주입, 간질내 주입, 각막내 주입, 망막하 주입, 수성 체액 주입, 테논낭하(subtenon) 주입 또는 지속 전달 장치, 유리체내 주입(예를 들면, 전방, 중간 또는 후방 유리체 주입)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 적용은 국소 적용이고, 각막으로의 점안제를 포함하나 이것으로 한정되지 않는다.

한 실시양태에서, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 또는 본원에 보고된 약학 제형은 유리체내 적용, 예를 들면, 유리체내 주입을 통해 투여된다. 이것은 당분야에서 공지되어 있는 표준 절차에 따라 수행될 수 있다(예를 들면, 문헌(Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-3276), 문헌(Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206) 및 문헌(Wray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-185) 참조).

일부 실시양태에서, 본 발명의 치료 키트는 본원에 기재된 약학 제형에 존재하는 1회 이상 용량의 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드, 약학 제형의 유리체내 주입에 적합한 장치, 및 주입을 수행하기에 적합한 대상체 및 프로토콜을 상세히 설명하는 설명서를 함유할 수 있다. 이 실시양태에서, 제형은 전형적으로 유리체내 주입을 통해 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 이것은 당분야에서 공지되어 있는 표준 절차에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-3276), 문헌(Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206), 및 문헌(Wray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-185)을 참조한다.

제형은 보조제, 예컨대, 방부제, 습윤화제, 유화제 및 분산제도 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 상기 멸균 절차 및 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 포함 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 등장제, 예컨대, 당, 염화나트륨 등을 제형 내에 포함시키는 것도 바람직할 수 있다. 추가로, 주입가능한 약학 제형의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 달성될 수 있다.

적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본원에 보고된 화합물, 및/또는 본원에 보고된 약학 제형은 선택된 투여 경로와 관계없이 당업자에게 공지되어 있는 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 제형으로 제형화된다.

본원에 보고된 약학 제형 중의 활성 성분의 실제 용량 수준은 환자에게 독성을 나타내지 않으면서 구체적인 환자, 조성물 및 투여 방식에 대한 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 변형될 수 있다. 선택된 용량 수준은 사용되는 본 발명의 구체적인 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 구체적인 화합물의 배출 속도, 치료의 지속시간, 사용되는 구체적인 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 과거 병력, 및 의학 분야에서 잘 공지되어 있는 다른 인자들을 포함하는 다양한 약동학적 인자들에 의해 좌우될 것이다.

제형은 제형이 주사기에 의해 전달될 수 있는 정도까지 멸균성 및 유동성을 가져야 한다. 한 바람직한 실시양태에서, 담체는 물 이외에 등장성 완충 식염수 용액이다.

적절한 유동성은 예를 들면, 코팅제, 예컨대, 레시틴의 사용, 분산액의 경우 요구된 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장제, 예를 들면, 당, 다가알코올, 예컨대, 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다.

제형은 결막하 투여를 위한 활성 성분을 포함하는 안과 데포 제형을 포함할 수 있다. 안과 데포 제형은 본질적으로 순수한 활성 성분, 예를 들면, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드의 마이크로입자를 포함한다. 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드를 포함하는 마이크로입자는 약학적으로 허용가능한 생체적합성 중합체 또는 지질 캡슐화제 내에 묻혀있을 수 있다. 상기 데포 제형은 연장된 기간에 걸쳐 모든 활성 성분들을 전부 또는 실질적으로 전부 방출시키도록 개조될 수 있다. 존재하는 경우 중합체 또는 지질 매트릭스는 모든 또는 실질적으로 모든 활성 성분의 방출 후 투여 부위로부터 수송되기 위해 충분히 분해되도록 개조될 수 있다. 상기 데포 제형은 약학적으로 허용가능한 중합체 및 용해된 또는 분산된 활성 성분을 포함하는 액체 제형일 수 있다. 주입 시, 상기 중합체는 예를 들면, 겔화 또는 침전에 의해 주입 부위에서 데포를 형성한다.

본 발명의 또 다른 양태는 눈 혈관 질환의 치료에 사용되는 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 또는 항체이다.

본 발명의 한 실시양태는 눈 혈관 질환의 치료에 사용되는 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 또는 항체이다.

본 발명의 또 다른 양태는 눈 혈관 질환의 치료에 사용되는 약학 제형이다.

본 발명의 또 다른 양태는 눈 혈관 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 또는 항체의 용도이다.

본 발명의 또 다른 양태는 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 또는 항체를, 눈 혈관 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 눈 혈관 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이다.

본원에서 사용된 용어 "포함하는"은 용어 "구성된"을 포함한다는 것이 본원에 명확히 언급되어 있다. 따라서 용어 "포함하는"을 함유하는 모든 양태들 및 실시양태들은 마찬가지로 용어 "구성된"으로 개시된다.

D. 변형

추가 양태에서, 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 이량체성 폴리펩티드는 하기 단락 1 내지 6에 기재된 특징들 중 임의의 특징을 단독으로 또는 조합으로 포함할 수 있다:

1. 항체 친화성

한 실시양태에서, 비아코어^® 표면 플라스몬 공명 분석으로 Kd를 측정한다. 예를 들면, 약 10 반응 유닛(RU)에서 고정된 결합 파트너 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어^®-2000 또는 비아코어^®-3000(지이 헬쓰케어 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 이용한 분석을 수행한다. 한 실시양태에서, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 지이 헬쓰케어 인코포레이티드)을 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 약 10 반응 유닛(RU)의 커플링된 결합 파트너를 달성하기 위해 5 ㎕/분의 유속으로 주입하기 전에 결합 파트너를 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 4.8)로 5 ㎍/㎖(약 2 μM)까지 희석한다. 결합 파트너의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 비-반응된 기를 차단한다. 동역학적 측정을 위해, 0.05% 폴리소르베이트 20(트윈-20™) 계면활성제를 갖는 PBS(PBST) 중의 융합 폴리펩티드 또는 항체를 함유하는 이량체성 폴리펩티드의 2배 연속 희석물(0.78 nM 내지 500 nM)을 25℃에서 약 25 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 결합 센서그램 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 1-대-1 랭뮤어 결합 모델(비아코어^® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 결합 속도(k_on) 및 해리 속도(k_off)를 계산한다. 평형 해리 상수(Kd)를 비 k_off/k_on로서 계산한다(예를 들면, 문헌(Chen, Y. et al., J Mol Biol 293, (1999) 865-881) 참조). 상기 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정된 결합 속도가 10⁶ M^-1s^-1을 초과하는 경우, 분광계, 예컨대, 정지-유동 장착된 분광광도계(아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반된 큐빗을 갖는 8000-시리즈 SLM-AMINCO™ 분광광도계(써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정된 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 25℃에서 PBS(pH 7.2) 중의 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 형광 방사 강도의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기법을 이용함으로써 결합 속도를 측정할 수 있다.

2. 키메라 항체 및 인간화된 항체

일부 실시양태에서, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드는 키메라 항체이다. 일부 키메라 항체는 예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호 및 문헌(Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855)에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 모 항체의 클래스 또는 서브클래스로부터 변형되어 있는 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

일부 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR들, 예를 들면, CDR들(또는 이들의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR들(또는 이들의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 불변 영역의 적어도 일부도 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기들은 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 회복시키거나 개선하기 위해 비-인간 항체(예를 들면, HVR 잔기의 기원이 되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.

인간화된 항체 및 이를 제조하는 방법은 예를 들면, 문헌(Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633)에서 검토되어 있고, 예를 들면, 하기 문헌들에 더 기재되어 있다: 문헌(Riechmann, I., et al., Nature 332 (1988) 323-329); 문헌(Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033); 미국 특허 제5,821,337호; 미국 특허 제7,527,791호; 미국 특허 제6,982,321호; 미국 특허 제7,087,409호; 문헌(Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34)(특이성 결정 영역(SDR) 이식이 기재됨); 문헌(Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498)("재표면화"가 기재됨); 문헌(Dall'Acqua, W.F., et al., Methods 36 (2005) 43-60)("FR 셔플링"이 기재됨); 문헌(Osbourn, J., et al., Methods 36 (2005) 61-68); 및 문헌(Klimka, A., et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260)(FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 방법이 기재됨).

인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 골격 영역은 "베스트-피트(best-fit)" 방법을 이용함으로써 선택된 골격 영역(예를 들면, 문헌(Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308) 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 골격 영역(예를 들면, 문헌(Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289) 및 문헌(Presta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632) 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 영역 또는 인간 생식세포주 골격 영역(예를 들면, 문헌(Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633) 참조); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 골격 영역(예를 들면, 문헌(Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684) 및 문헌(Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618) 참조)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

3. 인간 항체

일부 실시양태에서, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드는 인간 항체이다. 인간 항체는 당분야에서 공지되어 있는 다양한 기법을 이용함으로써 제조될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌(van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374) 및 문헌(Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459)에 기재되어 있다.

인간 항체는 항원성 챌린지에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생성하도록 변형된 유전자이식 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내생성 면역글로불린 좌위를 교체하거나, 염색체 외부에 존재하거나 동물의 염색체 내로 무작위적으로 삽입되는 인간 면역글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 유전자이식 마우스에서, 내생성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 불활성화되어 있다. 유전자이식 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해서는 문헌(Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125)을 참조한다. 예를 들면, XENOMOUSE™ 기술이 기재되어 있는 미국 특허 제6,075,181호 및 미국 특허 제6,150,584호; HUMAB^® 기술이 기재되어 있는 미국 특허 제5,770,429호; K-M MOUSE^® 기술이 기재되어 있는 미국 특허 제7,041,870호; 및 VELOCIMOUSE^® 기술이 기재되어 있는 미국 특허출원 공개 제2007/0061900호도 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역을 예를 들면, 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 더 변형시킬 수 있다.

인간 항체는 하이브리도마-기초 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 인간 단일클론 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다(예를 들면, 문헌(Kozbor, D.,J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005); 문헌(Brodeur, B.R., et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63); 및 문헌(Boerner, P., et al., J. Immunol.147 (1991) 86-95) 참조). 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 문헌(Li, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562)에도 기재되어 있다. 추가 방법은 예를 들면, (하이브리도마 세포주로부터의 단일클론 인간 IgM 항체의 제조가 기재되어 있는) 미국 특허 제7,189,826호 및 (인간-인간 하이브리도마가 기재되어 있는) 문헌(Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268)에 기재된 방법들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트라이오마(Trioma) 기술)도 문헌(Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937) 및 문헌(Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191)에 기재되어 있다.

인간 항체는 인간으로부터 유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수도 있다. 그 다음, 이러한 가변 도메인 서열은 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기법은 후술되어 있다.

4. 라이브러리 유래의 항체

특정 실시양태에서, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드는 라이브러리 유래의 항체이다. 라이브러리 유래의 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 원하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법들이 당분야에서 공지되어 있다. 이러한 방법들은 예를 들면, 문헌(Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37)에서 검토되어 있고 예를 들면, 하기 문헌들에도 기재되어 있다: 문헌(McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554); 문헌(Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628); 문헌(Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597); 문헌(Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175); 문헌(Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; 문헌(Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093); 문헌(Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472); 및 문헌(Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132).

특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 유전자 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위적으로 재조합된 후, 문헌(Winter, G., et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455)에 기재된 바와 같이 항원 결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 단일 쇄 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마의 구축을 요구하지 않으면서 면역원에 대한 고친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 문헌(Griffiths, A.D., et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734)에 기재된 바와 같이 무자극(naive) 레퍼토리를 (예를 들면, 인간으로부터) 클로닝하여 임의의 면역화 없이 매우 다양한 비-자가 항원 및 자가-항원에 대한 항체들의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 무자극 라이브러리는 문헌(Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388)에 기재된 바와 같이 비-재배열된 V 유전자 분절을 줄기 세포로부터 클로닝하고 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도 가변 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성함으로써 합성적으로 제조될 수도 있다. 인간 항체 파지 라이브러리가 기재되어 있는 특허 공개문헌들은 예를 들면, 미국 특허 제5,750,373호, 미국 특허출원 공개 제2005/0079574호, 미국 특허출원 공개 제2005/0119455호, 미국 특허출원 공개 제2005/0266000호, 미국 특허출원 공개 제2007/0117126호, 미국 특허출원 공개 제2007/0160598호, 미국 특허출원 공개 제2007/0237764호, 미국 특허출원 공개 제2007/0292936호 및 미국 특허출원 공개 제2009/0002360호를 포함한다.

인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로서 간주된다.

5. 다중특이적 항체

특정 실시양태에서, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드는 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위들에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 제1 항원에 대한 결합 특이성이고, 나머지 하나는 상이한 제2 항원에 대한 결합 특이성이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 동일한 항원의 2개의 상이한 에피토프들에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 세포독성제를, 하나 이상의 항원을 발현하는 세포에 위치시키는 데 사용될 수도 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.

다중특이적 항체를 제조하는 기법은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현(문헌(Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540), 국제 특허출원 공개 제WO 93/08829호, 및 문헌(Traunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659) 참조), 및 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 조작(예를 들면, 미국 특허 제5,731,168호 참조)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다중특이적 항체는 항체 Fc-이종이량체성 분자를 제조하기 위한 정전기 조종 효과의 조작(국제 특허출원 공개 제WO 2009/089004호); 2개 이상의 항체들 또는 단편들의 가교연결(예를 들면, 미국 특허 제4,676,980호 및 문헌(Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83) 참조); 이중특이적 항체를 제조하기 위한 류신 지퍼의 사용(예를 들면, 문헌(Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553) 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술의 이용(예를 들면, 문헌(Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448) 참조); 단일 쇄 Fv(scFv) 이량체의 사용(예를 들면, 문헌(Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374) 참조); 및 예를 들면, 문헌(Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69)에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수도 있다.

3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체("옥토퍼스(Octopus) 항체"를 포함함)도 본원에 포함된다(예를 들면, 미국 특허출원 공개 제2006/0025576호 참조).

본원의 항체 또는 단편은 "이중 작용 Fab" 또는 "DAF"도 포함한다(예를 들면, 미국 특허출원 공개 제2008/0069820호 참조).

본원의 항체 또는 단편은 국제 특허출원 공개 제WO 2009/080251호, 제WO 2009/080252호, 제WO 2009/080253호, 제WO 2009/080254호, 제WO 2010/112193호, 제WO 2010/115589호, 제WO 2010/136172호, 제WO 2010/145792호 및 제WO 2010/145793호에 기재된 다중특이적 항체도 포함한다.

6. 항체 변이체

특정 실시양태에서, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드는 항체이다. 추가 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 변형을, 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 도입하거나 펩티드를 합성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들면, 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기의 결실, 이러한 서열 내로의 잔기의 삽입 및/또는 이러한 서열 내의 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특성, 예를 들면, 항원 결합을 보유하는 한, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 병용을 수행하여 최종 구축물에 도달할 수 있다.

a) 치환, 삽입 및 결실 변이체

일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심있는 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"이라는 표제 하에 하기 표에 제시되어 있다. 보다 더 실질적인 변형은 "예시적인 치환"이라는 표제 하에 하기 표에 제공되어 있고 아미노산 측쇄 클래스와 관련하여 이하에 더 기재되어 있다. 아미노산 치환은 관심있는 항체 내로 도입될 수 있고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들면, 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.

아미노산은 공통 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 이 클래스들 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스의 구성원으로 교체하는 것을 수반할 것이다.

치환 변이체의 한 유형은 모 항체(예를 들면, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 일부 생물학적 성질의 변형(예를 들면, 개선)(예를 들면, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)을 가질 것이고/이거나, 모 항체의 실질적으로 보유된 일부 생물학적 성질을 가질 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들면, 파지 디스플레이-기초 친화 성숙 기법, 예컨대, 본원에 기재된 기법을 이용함으로써 편리하게 생성될 수 있는 친화 성숙된 항체이다. 요약하건대, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체가 파지 상에서 디스플레이되고 특정 생물학적 활성(예를 들면, 결합 친화성)에 대해 스크리닝된다.

변경(예를 들면, 치환)은 예를 들면, 항체 친화성을 개선하기 위해 HVR에서 만들어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스폿(hotspot)", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이되는 코돈에 의해 코딩된 잔기(예를 들면, 문헌(Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196) 참조), 및/또는 항원과 접촉하는 잔기에서 만들어질 수 있고, 이때 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 시험된다. 이차 라이브러리를 구축하고 이 라이브러리로부터 재선택함으로써 달성되는 친화 성숙은 예를 들면, 문헌(Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37)에 기재되어 있다. 친화 성숙의 일부 실시양태에서, 다양성은 다양한 방법들(예를 들면, 오류 유발 PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드-지정된 돌연변이유발) 중 임의의 방법에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 도입된다. 그 다음, 이차 라이브러리가 생성된다. 그 다음, 상기 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-지정된 방법을 포함하고, 이때 여러 HVR 잔기들(예를 들면, 한번에 4개 내지 6개의 잔기들)이 무작위화된다. 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기를 구체적으로 확인할 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 자주 표적화된다.

특정 실시양태에서, 하나 이상의 HVR 내에서 치환, 삽입 또는 결실이 일어날 수 있되, 이러한 변경은 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않아야 한다. 예를 들면, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들면, 본원에서 제공된 보존적 치환)이 HVR에서 만들어질 수 있다. 이러한 변경은 예를 들면, HVR 내의 항원 접촉 잔기의 외부에 존재할 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 일부 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.

돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌(Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085)에 기재된 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로서 지칭된다. 이 방법에서, 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지를 확인하기 위해 잔기 또는 표적 잔기의 군(예를 들면, 하전된 잔기, 예컨대, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu)을 확인하고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 교체한다. 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에서 추가 치환을 도입할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 사용할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기를 치환 후보로서 표적화할 수 있거나 제거할 수 있다. 변이체가 원하는 성질을 함유하는지를 확인하기 위해 변이체를 스크리닝할 수 있다.

아미노산 서열 삽입은 1개 잔기의 길이 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드 길이를 갖는 아미노-말단 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라, 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입도 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 N-말단 또는 C-말단에서 효소(예를 들면, ADEPT) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드와 융합된 융합체를 포함한다.

b) 글리코실화 변이체

일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 항체에의 글리코실화 부위의 추가 또는 항체로부터의 글리코실화 부위의 결실을 편리하게 달성할 수 있다.

항체가 Fc-영역을 포함하는 경우, 그에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 N-연결에 의해 일반적으로 Fc-영역의 CH2-도메인의 Asn297에 부착되어 있는 분지된 바이안테나리(biantennary) 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들면, 문헌(Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32)을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노스, N-아세틸 글루코스아민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산뿐만 아니라 바이안테나리 올리고사카라이드 구조물의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코스도 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 개선된 성질을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 본 발명의 항체에서 올리고사카라이드를 변형시킬 수 있다.

한 실시양태에서, Fc-영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스를 결여하는 탄수화물 구조물을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들면, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65%, 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2008/077546호에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정에 의해 측정될 때 Asn297에 부착된 모든 당구조물(예를 들면, 복합체, 하이브리드 및 고만노스 구조물)의 합계에 비해 Asn297에서 당쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 측정된다. Asn297은 Fc-영역 내의 위치 약 297(Fc-영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치하는 아스파라긴 잔기를 지칭하나; Asn297은 항체에서의 미미한 서열 변이로 인해 위치 297의 약 ± 3개 아미노산 업스트림 또는 다운스트림, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수도 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들면, 미국 특허출원 공개 제2003/0157108호 및 제2004/0093621호를 참조한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스 결핍" 항체와 관련된 공개문헌들의 예에는 하기 문헌들이 포함된다: 미국 특허출원 공개 제2003/0157108호; 국제 특허출원 공개 제WO 2000/61739호; 국제 특허출원 공개 제WO 2001/29246호; 미국 특허출원 공개 제2003/0115614호; 미국 특허출원 공개 제2002/0164328호; 미국 특허출원 공개 제2004/0093621호; 미국 특허출원 공개 제2004/0132140호; 미국 특허출원 공개 제2004/0110704호; 미국 특허출원 공개 제2004/0110282호; 미국 특허출원 공개 제2004/0109865호; 국제 특허출원 공개 제WO 2003/085119호; 국제 특허출원 공개 제WO 2003/084570호; 국제 특허출원 공개 제WO 2005/035586호; 국제 특허출원 공개 제WO 2005/035778호; 국제 특허출원 공개 제WO 2005/053742호; 국제 특허출원 공개 제WO 2002/031140호; 문헌(Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249); 및 문헌(Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622). 탈푸코실화된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예에는 단백질 푸코실화 결핍 Lec13 CHO 세포(문헌(Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545); 미국 특허출원 공개 제2003/0157108호; 및 국제 특허출원 공개 제WO 2004/056312호, 특히 실시예 11), 및 넉아웃(knockout) 세포주, 예컨대, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8 넉아웃 CHO 세포(예를 들면, 문헌(Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622); 문헌(Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688); 및 국제 특허출원 공개 제WO 2003/085107호 참조)가 포함된다.

예를 들면, 항체의 Fc-영역에 부착된 바이안테나리 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분되어 있는 이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체도 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2003/011878호; 미국 특허 제6,602,684호; 및 미국 특허출원 공개 제2005/0123546호에 기재되어 있다. Fc-영역에 부착된 올리고사카라이드에서 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체도 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 1997/30087호, 국제 특허출원 공개 제WO 1998/58964호 및 국제 특허출원 공개 제WO 1999/22764호에 기재되어 있다.

c) Fc-영역 변이체

특정 실시양태에서, 하나 이상의 추가 아미노산 변형을 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 내로 도입하여 Fc-영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc-영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들면, 치환/돌연변이)을 포함하는 인간 Fc-영역 서열(예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc-영역)을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 일부 효과기 기능을 보유하되 모든 효과기 기능을 보유하지는 않아 생체내 이량체성 폴리펩티드의 반감기가 중요하지만 일부 효과기 기능(예컨대, CDC 및 ADCC)이 불필요하거나 유해한 적용분야를 위한 바람직한 후보가 되는 이량체성 폴리펩티드를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들면, 이량체성 폴리펩티드 항체가 FcγR 결합을 결여하되(따라서 ADCC 활성을 결여할 가능성이 있음) FcRn 결합 능력을 보유한다는 것을 확인하기 위해 Fc 수용체(FcR) 결합 분석을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵세포는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포 상에서의 FcR 발현은 문헌(Ravetch, J.V., and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492)의 제464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비-한정적인 예는 미국 특허 제5,500,362호(예를 들면, 문헌(Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063); 및 문헌(Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502) 참조); 및 미국 특허 제5,821,337호(문헌(Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361) 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 분석 방법을 이용할 수 있다(예를 들면, 유동 세포측정을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96^® 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 참조). 이러한 분석에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심있는 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들면, 동물 모델, 예컨대, 문헌(Clynes, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656)에 개시된 동물 모델에서 평가할 수 있다. C1q 결합 분석을 수행하여 이량체성 폴리펩티드가 C1q에 결합할 수 없으므로 CDC 활성을 결여한다는 것을 확인할 수도 있다. 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2006/029879호 및 국제 특허출원 공개 제WO 2005/100402호에 기재된 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌(Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171); 문헌(Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052); 및 문헌(Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743) 참조). 당분야에서 공지되어 있는 방법을 이용하여 FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정도 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌(Petkova, S.B., et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769) 참조).

감소된 효과기 기능을 갖는 이량체성 폴리펩티드는 Fc-영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 Fc-영역 잔기의 치환을 갖는 항체를 포함한다(미국 특허 제6,737,056호 참조). 이러한 Fc-영역 변이체는 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환되어 있는 소위 "DANA" Fc-영역 돌연변이체를 포함하는, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상의 아미노산 위치에서 치환을 갖는 Fc-영역을 포함한다(미국 특허 제7,332,581호).

FcR과의 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체들이 기재되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제6,737,056호; 국제 특허출원 공개 제WO 2004/056312호; 및 문헌(Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604) 참조).

특정 실시양태에서, 이량체성 폴리펩티드 변이체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들면, Fc-영역의 위치 298, 333 및/또는 334(잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc-영역을 포함한다.

일부 실시양태에서, 예를 들면, 미국 특허 제6,194,551호, 국제 특허출원 공개 제WO 99/51642호 및 문헌(Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184)에 기재된 바와 같이 C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 변경시키도록(즉, 개선하거나 감소시키도록) Fc-영역을 변경시킨다.

증가된 반감기를 갖고 태아로의 모체 IgG의 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체(FcRn)(Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, and Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434)와의 개선된 결합을 갖는 항체는 미국 특허출원 공개 제2005/0014934호에 기재되어 있다. 이 항체는 Fc-영역과 FcRn의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 그 내부에 갖는 Fc-영역을 포함한다. 이러한 Fc-영역 변이체는 Fc-영역 잔기 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 및 434 중 하나 이상의 Fc-영역 잔기에서 치환, 예를 들면, Fc-영역 잔기 434의 치환을 갖는 Fc-영역 변이체를 포함한다(미국 특허 제7,371,826호).

Fc-영역 변이체의 다른 예에 대해서는 문헌(Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740); 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 국제 특허출원 공개 제WO 94/29351호 또한 참조한다.

d) 시스테인 조작된 항체 변이체

일부 실시양태에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환되어 있는, 예를 들면, "thioMAb"과 유사한 시스테인 조작된 이량체성 폴리펩티드를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 치환된 잔기는 이량체성 폴리펩티드의 접근가능한 부위에 존재한다. 이러한 잔기가 시스테인으로 치환됨으로써 반응성 티올 기는 이량체성 폴리펩티드의 접근가능한 부위에 위치하고, 본원에 더 기재된 바와 같이 이량체성 폴리펩티드를 다른 모이어티(moiety), 예컨대, 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하기 잔기들 중 어느 하나 이상의 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카바트 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc-영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 이량체성 폴리펩티드는 예를 들면, 미국 특허 제7,521,541호에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.

e) 유도체

특정 실시양태에서, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드는 당분야에서 공지되어 있고 용이하게 입수될 수 있는 추가 비-단백질성 모이어티를 함유하도록 더 변형될 수 있다. 이량체성 폴리펩티드의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이것으로 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 비-한정적인 예에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서의 그의 안정성으로 인해 제조에서 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 갖는 중합체일 수 있고, 분지될 수 있거나 분지되지 않을 수 있다. 이량체성 폴리펩티드에 부착된 중합체의 수는 달라질 수 있고, 1개 초과의 중합체들이 부착되는 경우 이들은 동일한 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 이량체성 폴리펩티드의 구체적인 성질 또는 기능, 이량체성 폴리펩티드 유도체가 한정된 조건 하에 치료에 사용될 것인지 여부 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 고려사항에 근거하여 결정될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 방사선에의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비-단백질성 모이어티와 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비-단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다(Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). 방사선은 임의의 파장의 방사선일 수 있고, 통상의 세포에게 유해하지 않으나 이량체성 폴리펩티드-비-단백질성 모이어티에 인접한 세포가 사멸되는 온도까지 비-단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

f) 이종이량체화

예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 96/27011호, 국제 특허출원 공개 제WO 98/050431호, 유럽 특허 제1870459호, 국제 특허출원 공개 제WO 2007/110205호, 국제 특허출원 공개 제WO 2007/147901호, 국제 특허출원 공개 제WO 2009/089004호, 국제 특허출원 공개 제WO 2010/129304호, 국제 특허출원 공개 제WO 2011/90754호, 국제 특허출원 공개 제WO 2011/143545호, 국제 특허출원 공개 제WO 2012/058768호, 국제 특허출원 공개 제WO 2013/157954호 및 국제 특허출원 공개 제WO 2013/096291호에 잘 기재되어 있는, 이종이량체화하도록 CH3을 변형시키는 여러 방법들이 존재한다. 전형적으로 모든 이러한 방법들에서, 각각의 CH3-도메인(또는 이를 포함하는 중쇄)이 그 자신과 더 이상 동종이량체화할 수 없으나 상보적인 조작된 다른 CH3-도메인과 이종이량체화하도록(즉, 제1 CH3-도메인 및 제2 CH3-도메인이 이종이량체화하고 2개의 제1 CH3-도메인들 또는 2개의 제2 CH3-도메인들 사이에 동종이량체가 형성되지 않도록) 상보적인 방식으로 제1 CH3-도메인 및 제2 CH3-도메인 둘 다가 조작된다. 개선된 중쇄 이종이량체화를 위한 이 다양한 방법들은 본 발명에 따른 다중특이적 항체에서 중쇄-경쇄 변형(1개의 결합 아암에서 VH 및 VL 교환/교체, 및 CH1/CL 계면에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 치환의 도입)과 함께 경쇄 미스페어링(mispairing) 벤스-존스(Bence-Jones) 유형 부산물을 감소시키는 다양한 대안으로서 고려된다.

본 발명의 한 바람직한 실시양태에서(다중특이적 항체가 중쇄에서 CH3-도메인을 포함하는 경우), 본 발명에 따른 상기 다중특이적 항체의 CH3-도메인은 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 96/027011호, 문헌(Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621), 문헌(Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681) 및 국제 특허출원 공개 제WO 98/050431호에 여러 예로 상세히 기재되어 있는 "놉스-인투-홀스" 기술에 의해 변경될 수 있다. 이 방법에서, 2개의 CH3-도메인들의 상호작용 표면은 이 2개의 CH3-도메인들을 함유하는 2개의 중쇄들의 이종이량체화를 증가시키도록 변경된다. (2개의 중쇄들의) 2개의 CH3-도메인들 각각은 "놉"일 수 있는 반면, 나머지 CH3-도메인은 "홀"이다. 다이설파이드 가교의 도입은 이종이량체를 더 안정화시키고(Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) 수율을 증가시킨다.

따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 다중특이적 항체는 (각각의 중쇄에서 CH3-도메인을 포함하고) a)의 항체의 제1 중쇄의 제1 CH3-도메인 및 b)의 항체의 제2 중쇄의 제2 CH3-도메인 각각이 항체 CH3-도메인들 사이의 원래 계면을 포함하는 계면에서 만나는 것을 추가 특징으로 하고, 이때 상기 계면은 다중특이적 항체의 형성을 촉진하도록 변경되고, 이때 상기 변경은 i) 다중특이적 항체 내의 다른 중쇄의 CH3-도메인의 원래 계면과 만나는 한 중쇄의 CH3-도메인의 원래 계면 내에서 아미노산 잔기가 보다 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 다른 중쇄의 CH3-도메인의 계면 내의 캐비티에 위치할 수 있는 돌출부를 한 중쇄의 CH3-도메인의 계면 내에서 발생시키도록 한 중쇄의 CH3-도메인이 변경되고, ii) 다중특이적 항체 내의 제1 CH3-도메인의 원래 계면과 만나는 제2 CH3-도메인의 원래 계면 내에서 아미노산 잔기가 보다 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 제1 CH3-도메인의 계면 내의 돌출부가 위치할 수 있는 캐비티를 제2 CH3-도메인의 계면 내에서 발생시키도록 다른 중쇄의 CH3-도메인이 변경되는 것을 추가 특징으로 한다.

바람직하게는, 보다 더 큰 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 구성된 군으로부터 선택된다.

바람직하게는, 보다 더 작은 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 쓰레오닌(T) 및 발린 (V)으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 한 양태에서, 2개의 CH3-도메인들은 2개의 CH3-도메인들 사이의 다이설파이드 가교가 형성될 수 있도록 각각의 CH3-도메인의 상응하는 위치에서 시스테인(C)을 아미노산으로서 도입함으로써 더 변경된다.

한 바람직한 실시양태에서, 상기 다중특이적 항체는 "놉 쇄"의 제1 CH3-도메인에서 아미노산 돌연변이 T366W를 포함하고 "홀 쇄"의 제2 CH3-도메인에서 아미노산 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다. 예를 들면, 아미노산 돌연변이 Y349C를 "홀 쇄"의 CH3-도메인 내로 도입하고 아미노산 돌연변이 E356C 또는 아미노산 돌연변이 S354C를 "놉 쇄"의 CH3-도메인 내로 도입함으로써 CH3-도메인들 사이의 추가 쇄간 다이설파이드 가교도 사용할 수 있다(Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681).

한 바람직한 실시양태에서, (각각의 중쇄에서 CH3-도메인을 포함하는) 상기 다중특이적 항체는 2개의 CH3-도메인들 중 하나에서 아미노산 돌연변이 S354C 및 T366W를 포함하고 2개의 CH3-도메인들 중 나머지 하나에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다(한 CH3-도메인에서의 추가 아미노산 돌연변이 S354C 및 다른 CH3-도메인에서의 추가 아미노산 돌연변이 Y349C는 쇄간 다이설파이드 가교를 형성함)(카바트에 따른 넘버링).

이종이량체화하도록 CH3을 변형시키는 다른 기법은 본 발명의 대안으로서 고려되고, 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 96/27011호, 국제 특허출원 공개 제WO 98/050431호, 유럽 특허 제1870459호, 국제 특허출원 공개 제WO 2007/110205호, 국제 특허출원 공개 제WO 2007/147901호, 국제 특허출원 공개 제WO 2009/089004호, 국제 특허출원 공개 제WO 2010/129304호, 국제 특허출원 공개 제WO 2011/90754호, 국제 특허출원 공개 제WO 2011/143545호, 국제 특허출원 공개 제WO 2012/058768호, 국제 특허출원 공개 제WO 2013/157954호 및 국제 특허출원 공개 제WO 2013/096291호에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 유럽 특허 제1 870 459A1호에 기재된 이종이량체화 방법을 대안적으로 이용할 수 있다. 이 방법은 2개의 중쇄들 사이의 CH3/CH3-도메인 계면의 특정 아미노산 위치에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 치환/돌연변이의 도입에 근거한다. 상기 다중특이적 항체에 대한 한 바람직한 실시양태는 (다중특이적 항체의) 제1 CH3-도메인 내의 아미노산 돌연변이 R409D 및 K370E; 및 다중특이적 항체의 제2 CH3-도메인 내의 아미노산 돌연변이 D399K 및 E357K(카바트에 따른 넘버링)이다.

또 다른 실시양태에서, 상기 다중특이적 항체는 "놉 쇄"의 CH3-도메인에서 아미노산 돌연변이 T366W를 포함하고 "홀 쇄"의 CH3-도메인에서 아미노산 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함하고, "놉 쇄"의 CH3-도메인에서 아미노산 돌연변이 R409D 및 K370E를 추가로 포함하고 "홀 쇄"의 CH3-도메인에서 아미노산 돌연변이 D399K 및 E357K를 추가로 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 상기 다중특이적 항체는 2개의 CH3-도메인들 중 하나에서 아미노산 돌연변이 S354C 및 T366W를 포함하고 2개의 CH3-도메인들 중 나머지 하나에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함하거나, 상기 다중특이적 항체는 2개의 CH3-도메인들 중 하나에서 아미노산 돌연변이 Y349C 및 T366W를 포함하고 2개의 CH3-도메인들 중 나머지 하나에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함하고, "놉 쇄"의 CH3-도메인에서 아미노산 돌연변이 R409D 및 K370E를 추가로 포함하고 "홀 쇄"의 CH3-도메인에서 아미노산 돌연변이 D399K 및 E357K를 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 국제 특허출원 공개 제WO 2013/157953호에 기재된 이종이량체화 방법을 대안적으로 이용할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 T366K를 포함하고, 제2 CH3-도메인 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 L351D를 포함한다. 추가 실시양태에서, 제1 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 L351K를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 제2 CH3-도메인은 Y349E, Y349D 및 L368E로부터 선택된 아미노산 돌연변이(바람직하게는 L368E)를 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 국제 특허출원 공개 제WO 2012/058768호에 기재된 이종이량체화 방법을 대안적으로 이용할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y 및 Y407A를 포함하고, 제2 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 T366A 및 K409F를 포함한다. 추가 실시양태에서, 제2 CH3-도메인은 위치 T411, D399, S400, F405, N390 또는 K392에서 예를 들면, a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E 또는 T411W, b) D399R, D399W, D399Y 또는 D399K, c) S400E, S400D, S400R 또는 S400K; d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V 또는 F405W; e) N390R, N390K 또는 N390D; 또는 f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F 또는 K392E로부터 선택된 추가 아미노산 돌연변이를 포함한다. 추가 실시양태에서, 제1 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y 및 Y407A를 포함하고, 제2 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 T366V 및 K409F를 포함한다. 추가 실시양태에서, 제1 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함하고, 제2 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 T366A 및 K409F를 포함한다. 추가 실시양태에서, 제2 CH3-도메인은 추가 아미노산 돌연변이 K392E, T411E, D399R 및 S400R을 포함한다.

한 실시양태에서, 국제 특허출원 공개 제WO 2011/143545호에 기재된 이종이량체화 방법을 예를 들면, 368 및 409로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서의 아미노산의 변형과 함께 대안적으로 이용할 수 있다.

한 실시양태에서, 전술된 놉스-인투-홀스 기술도 이용하는 국제 특허출원 공개 제WO 2011/090762호에 기재된 이종이량체화 방법을 대안적으로 이용할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 T366W를 포함하고 제2 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 T366Y를 포함하고 제2 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 Y407T를 포함한다.

한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 IgG2 동종형의 항체이고, 국제 특허출원 공개 제WO 2010/129304호에 기재된 이종이량체화 방법을 대안적으로 이용할 수 있다.

한 실시양태에서, 국제 특허출원 공개 제WO 2009/089004호에 기재된 이종이량체화 방법을 대안적으로 이용할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 CH3-도메인은 음으로 하전된 아미노산(예를 들면, 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D))에 의한 K392 또는 N392의 아미노산 치환, 바람직하게는 K392D 또는 N392D를 포함하고, 제2 CH3-도메인은 양으로 하전된 아미노산(예를 들면, 라이신(K) 또는 아르기닌(R))에 의한 D399, E356, D356 또는 E357의 아미노산 치환, 바람직하게는 D399K, E356K, D356K 또는 E357K, 보다 바람직하게는 D399K 및 E356K를 포함한다. 추가 실시양태에서, 제1 CH3-도메인은 음으로 하전된 아미노산(예를 들면, 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D))에 의한 K409 또는 R409의 아미노산 치환, 바람직하게는 K409D 또는 R409D를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 제1 CH3-도메인은 음으로 하전된 아미노산(예를 들면, 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D))에 의한 K439 및/또는 K370의 아미노산 치환을 추가로 또는 대안적으로 포함한다.

한 실시양태에서, 국제 특허출원 공개 제WO 2007/147901호에 기재된 이종이량체화 방법을 대안적으로 이용할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 K253E, D282K 및 K322D를 포함하고, 제2 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 D239K, E240K 및 K292D를 포함한다.

한 실시양태에서, 국제 특허출원 공개 제WO 2007/110205호에 기재된 이종이량체화 방법을 대안적으로 이용할 수 있다.

E. 재조합 방법 및 조성물

항체는 예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물의 사용을 통해 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산(들)이 제공된다. 이러한 핵산은 이량체성 폴리펩티드의 제1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 이량체성 폴리펩티드의 제2 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들면, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 이량체성 폴리펩티드의 제1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열 및 이량체성 폴리펩티드의 제2 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 이량체성 폴리펩티드의 제1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 이량체성 폴리펩티드의 제2 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예를 들면, 상기 (1) 또는 (2)의 벡터로 형질전환되어 있다). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들면, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프 세포(예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 제공된 이량체성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 상기 이량체성 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 임의적으로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드의 재조합 제조를 위해, 예를 들면, 전술된 바와 같은 이량체성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 단리하고 추가 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 통상적인 절차를 이용하여(예를 들면, 변이체 Fc-영역 폴리펩티드, 및 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 이러한 핵산을 용이하게 단리할 수 있고 서열결정할 수 있다.

이량체성 폴리펩티드 코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들면, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우 이량체성 폴리펩티드를 세균에서 제조할 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는 예를 들면, 미국 특허 제5,648,237호, 미국 특허 제5,789,199호 및 미국 특허 제5,840,523호를 참조한다(에스케리치아 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌(Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254) 또한 참조). 발현 후, 이량체성 폴리펩티드를 가용성 분획 중의 세균 세포 페이스트로부터 단리할 수 있고 더 정제할 수 있다.

원핵 세포 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 있어 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴을 갖는 이량체성 폴리펩티드를 생성하는 진균 및 효모 균주를 포함하는 진핵 미생물, 예컨대, 사상 진균 또는 효모가 이량체성 폴리펩티드 코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌(Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414); 및 문헌(Li, H., et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215)을 참조한다.

글리코실화된 이량체성 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터도 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 세포 및 곤충 세포가 포함된다. 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주들이 확인되어 있다.

식물 세포 배양물도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,959,177호, 미국 특허 제6,040,498호, 미국 특허 제6,420,548호, 미국 특허 제7,125,978호 및 미국 특허 제6,417,429호(유전자이식 식물에서 항체를 제조하는 PLANTIBODIES™ 기술이 기재되어 있음)를 참조한다.

척추동물 세포도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 생장하도록 개조된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, 문헌(Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74))에 기재된 HEK293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들면, 문헌(Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252)에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유선 종양(MMT 060562); 예를 들면, 문헌(Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68)에 기재된 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR^- CHO 세포(Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예컨대, Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 제조에 적합한 일부 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌(Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268)을 참조한다.

F. 조합 치료

특정 실시양태에서, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 또는 본원에 보고된 약학 제형은 본원에 기재된 하나 이상의 눈 혈관 질환의 치료를 위해 (추가 치료제 없이) 단독으로 투여된다.

다른 실시양태에서, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 항체 또는 약학 제형은 본원에 기재된 하나 이상의 눈 혈관 질환의 치료를 위해 하나 이상의 추가 치료제 또는 치료 방법과 함께 투여된다.

다른 실시양태에서, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 또는 약학 제형은 하나 이상의 추가 치료제와 함께 제형화되고 본원에 기재된 하나 이상의 눈 혈관 질환의 치료를 위해 투여된다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 조합 치료는 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 또는 약학 제형이 본원에 기재된 하나 이상의 눈 혈관 질환의 치료를 위해 하나 이상의 추가 치료제와 순차적으로 투여되는 것을 포함한다.

추가 치료제는 하기 치료제들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 트립토파닐-tRNA 신세타제(TrpRS), EyeOO1(항-VEGF PEG화된 앱타머), 스쿠알라민, RETAANE™(데포 현탁액을 위한 아네코르타브(anecortave) 아세테이트; 알콘 인코포레이티드(Alcon, Inc.)), 콤브레타스타틴 A4 전구약물(CA4P), MACUGEN™, MIFEPREX™(미페프리스톤-ru486), 수브테논(subtenon) 트라이암시놀론 아세토나이드, 유리체내 결정질 트라이암시놀론 아세토나이드, 프리노마스타트(Prinomastat)(AG3340-합성 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제, 화이자(Pfizer)), 플루오시놀론 아세토나이드(플루오시놀론 눈내 이식재를 포함함, 바슈 앤드 롬/콘트롤 딜리버리 시스템스(Bausch & Lomb/Control Delivery Systems)), VEGFR 억제제(수젠(Sugen)), VEGF-Trap(리제네론/아벤티스(Regeneron/Aventis)), VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제, 예컨대, 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린(ZD6474), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)퀴나졸린(AZD2171), 바탈라닙(PTK787) 및 SU1 1248(수니티닙), 리노마이드, 및 인테그린 v.베타.3 기능의 억제제 및 안지오스타틴.

본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 또는 약학 제형과 함께 사용될 수 있는 다른 약학 요법은 하기 요법들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 비-열 레이저의 사용과 함께 VISUDYNE™, PKC 412, 엔도비온(Endovion)(뉴로서치(NeuroSearch) A/S), 신경영양 인자(예를 들면, 아교세포 유래의 신경영양 인자 및 섬모 신경영양 인자를 포함함), 다이아타젬(diatazem), 도르졸라마이드(dorzolamide), 포토트롭(Phototrop), 9-시스-레티날(cis-retinal), 포스폴린 요오다이드 또는 에코티오페이트 또는 카보닉 안하이드라제(carbonic anhydrase) 억제제를 비롯한 안약(에코 요법을 포함함), AE-941(애터나 라보라토리스 인코포레이티드(AEterna Laboratories, Inc.)), 시르나(Sirna)-027(시마 쎄라퓨틱스 인코포레이티드(Sima Therapeutics, Inc.)), 페갑타닙(pegaptanib)(넥스스타 파마슈티칼스(NeXstar Pharmaceuticals)/길리드 사이언시스(Gilead Sciences)), 뉴로트로핀(예를 들면, NT-4/5를 포함함(제넨테크(Genentech)), Cand5(액큐어티 파마슈티칼스(Acuity Pharmaceuticals)), INS-37217(인스파이어 파마슈티칼스(Inspire Pharmaceuticals)), 인테그린 길항제(제리니 아게(Jerini AG) 및 애보트 라보라토리스(Abbott Laboratories)의 인테그린 길항제를 포함함), EG-3306(아크 쎄라퓨틱스 리미티드(Ark Therapeutics Ltd.)), BDM-E(바이오다이엠 리미티드(BioDiem Ltd.)), 탈리도마이드(thalidomide)(예를 들면, 엔트레메드 인코포레이티드(EntreMed, Inc.)에 의해 사용된 바와 같음), 카디오트로핀(cardiotrophin)-1(제넨테크), 2-메톡시에스트라다이올(알레르간(Allergan)/오큘렉스(Oculex)), DL-8234(토레이 인더스트리스(Toray Industries)), NTC-200(뉴로텍(Neurotech)), 테트라티오몰리브데이트(미시간 대학), LYN-002(린케우스 바이오텍(Lynkeus Biotech)), 마이크로알갈(microalgal) 화합물(아쿠아서치(Aquasearch)/알바니(Albany), 메라 파마슈티칼스(Mera Pharmaceuticals)), D-9120(셀텍 그룹 피엘씨(Celltech Group plc)), ATX-S10(하마마쓰 포토닉스(Hamamatsu Photonics)), TGF-베타 2(젠자임(Genzyme)/셀트릭스(Celtrix)), 티로신 키나제 억제제(알레르간, 수젠, 화이자), NX-278-L(넥스스타 파마슈티칼스/길리드 사이언시스), Opt-24(옵티스 프랑스 에스에이(OPTIS France SA)), 망막 세포 신경절 신경보호제(코젠트 뉴로사이언시스(Cogent Neurosciences)), N-니트로피라졸 유도체(텍사스 A&M 유니버시티 시스템), KP-102(크레니트스카이 파마슈티칼스(Krenitsky Pharmaceuticals)), 사이클로스포린 A, 티미티드(Timited) 망막 전위, 광역학 요법(예를 들면, 수용체-표적화된 PDT(브리스톨-메이어스 스퀴브 컴파니(Bristol-Myers Squibb, Co.)); PDT와 함께 주사될 포피머(porfimer) 나트륨; 베르테포핀(verteporfin)(큐엘티 인코포레이티드(QLT Inc.)); PDT와 함께 로스타포핀(rostaporfin)(미라벤트 메디칼 테크놀로지스(Miravent Medical Technologies)); PDT와 함께 탈라포핀(talaporfin) 나트륨(니폰 페트롤레움(Nippon Petroleum)); 및 모텍사핀 루테티움(motexafin lutetium)(파마사이클릭스 인코포레이티드(Pharmacyclics, Inc.))을 포함함), 안티센스 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 노바갈리 파마 에스에이(Novagali Pharma SA)에 의해 시험된 제품, 및 ISIS-13650(이이시스 파마슈티칼스(Isis Pharmaceuticals))을 포함함), 레이저 광응고, 드루젠 레이저링, 황반 원공 수술, 황반 전위 수술, 이식가능한 소형 망원경, 파이-모션(Phi-Motion) 혈관조영술(마이크로레이저 치료 및 영양세포 혈관 치료로서도 공지되어 있음), 양성자 광선 요법, 마이크로자극 요법, 망막 탈착 및 유리체 수술, 공막돌륭술, 황반하 수술, 경동공 온열요법, 광시스템 I 요법, RNA 간섭(RNAi)의 이용, 체외 혈액분리반출(막 분별 여과 및 유동치료로서도 공지되어 있음), 마이크로칩 이식, 줄기세포 요법, 유전자 대체 요법, 리보자임 유전자 요법(저산소증 반응 요소를 위한 유전자 요법(옥스포드 바이오메디카(Oxford Biomedica)); 렌티팍(Lentipak)(제네틱스(Genetix)); 및 PDEF 유전자 요법(젠벡(GenVec))를 포함함), 광수용체/망막 세포 이식(이식가능한 망막 상피세포(다이아크린 인코포레이티드(Diacrin, Inc.)); 및 망막 세포 이식물(셀 제네시스 인코포레이티드(Cell Genesys, Inc.))을 포함함) 및 침술.

문헌(Carmeliet and Jain, Nature 407: (2000) 249-257)에 나열된 항-혈관신생 물질들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 항-혈관신생 물질이 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 또는 약학 제형과 함께 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-혈관신생 물질은 또 다른 VEGF 길항제 또는 VEGF 수용체 길항제, 예컨대, VEGF 변이체, 가용성 VEGF 수용체 단편, VEGF 또는 VEGFR을 차단할 수 있는 앱타머, 중화 항-VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제의 저분자량 억제제 및 이들의 임의의 조합물이고, 이들은 항-VEGF 앱타머(예를 들면, 페갑타닙) 및 가용성 재조합 유인 수용체(예를 들면, VEGF 트랩)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-혈관신생 물질은 코르티코스테로이드, 혈관신생억제성 스테로이드, 아네코르타브 아세테이트, 안지오스타틴, 엔도스타틴, VEGFR 또는 VEGF 리간드의 발현을 감소시키는 작은 간섭 RNA, 티로신 키나제 억제제를 사용한 후-VEGFR 차단, MMP 억제제, IGFBP3, SDF-1 차단제, PEDF, 감마-세크레타제, 델타 유사 리간드 4, 인테그린 길항제, HIF-1 알파 차단, 단백질 키나제 CK2 차단, 및 혈관 내피 캐드헤린(CD-144) 및 간질 유래의 인자(SDF)-I 항체를 사용한 신생혈관형성 부위로 향하는 줄기세포(즉, 내피 전구세포)의 억제를 포함한다. VEGF 수용체를 표적화하는 소분자 RTK 억제제(PTK787을 포함함)도 사용될 수 있다. 반드시 항-VEGF 화합물은 아니지만 신생혈관형성에 대한 활성을 갖는 물질도 사용될 수 있고 소염 약물, m-Tor 억제제, 라파마이신, 에버롤리무스, 템시롤리무스, 사이클로스포린, 항-TNF 물질, 항-보체 물질 및 비-스테로이드성 소염제를 포함할 수 있다. 신경보호성을 나타내고 건성 황반 변성의 진행을 잠재적으로 감소시킬 수 있는 물질, 예컨대, "뉴로스테로이드(neurosteroid)"로서 지칭되는 부류의 약물도 사용될 수 있다. 이들은 데하이드로에피안드로스테론(DHEA)(상표명: 프라스테라(Prastera)(R) 및 피델린(Fidelin)(R)), 데하이드로에피안드로스테론 설페이트 및 프레그네놀론 설페이트와 같은 약물을 포함한다. 단독으로 사용되거나 임의의 조합물로 PDT, 페갑타닙 나트륨, 아연 또는 항산화제(들)와 함께 사용되는 베르테포린을 포함하나 이것으로 한정되지 않는 임의의 AMD(연령 관련 황반 변성) 치료제가 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 또는 약학 제형과 함께 사용될 수 있다.

G. 약학 제형

본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드의 약학 제형은 원하는 순도를 갖는 이러한 이량체성 폴리펩티드를 임의적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)). 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 독성을 나타내지 않고, 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실 다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 다른 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본원에서 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 간질 약물 분산제, 예컨대, 가용성 중성-활성 하이알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질, 예컨대, rhuPH20(HYLENEX^®, 박스터 인터내셔날 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rhuPH20을 포함하는 일부 예시적인 sHASEGP들 및 사용 방법은 미국 특허출원 공개 제2005/0260186호 및 미국 특허출원 공개 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가 글리코스아미노글리카나제, 예컨대, 콘드로이티나제와 병용된다.

예시적인 동결건조된 항체 제형은 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 제6,171,586호 및 국제 특허출원 공개 제WO 2006/044908호에 기재된 수성 항체 제형을 포함하고, 이때 후자 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.

본원의 제형은 치료되는 구체적인 증상에 필요한 하나 초과의 활성 성분들, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 활성 성분들도 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분들은 의도된 목적에 효과적인 양으로 함께 적절하게 존재한다.

활성 성분은 예를 들면, 코아세르베이션 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중의 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기법들은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980))에 개시되어 있다.

지속 방출 제형이 제조될 수 있다. 지속 방출 제형의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 상기 매트릭스는 성형된 제품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다.

생체내 투여를 위해 사용되는 제형은 일반적으로 멸균 상태이다. 멸균성은 예를 들면, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.

H. 치료 방법 및 조성물

본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드들 중 임의의 이량체성 폴리펩티드가 치료 방법에서 사용될 수 있다.

한 양태에서, 약제로서 사용되는 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드가 제공된다. 추가 양태에서, 눈 혈관 질환의 치료에 사용되는 이량체성 폴리펩티드가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에서 사용되는 이량체성 폴리펩티드가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드를, 눈 혈관 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에서 사용되는 이량체성 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 한 실시양태에서, 상기 방법은 예를 들면, 상기 단락 D에 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가 치료제를 상기 개체에게 유효량으로 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 눈에서 혈관신생을 억제하는 데 사용하기 위한 이량체성 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 이량체성 폴리펩티드를 개체에게 투여하여 혈관신생을 억제하는 단계를 포함하는, 개체에서 혈관신생을 억제하는 방법에서 사용되는 이량체성 폴리펩티드를 제공한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 한 바람직한 실시양태에서 인간이다.

추가 양태에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에 있어서 이량체성 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 약제는 눈 혈관 질환의 치료를 위한 약제이다. 추가 실시양태에서, 약제는 유효량의 약제를, 눈 혈관 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 눈 혈관 질환의 치료 방법에서 사용되는 약제이다. 이러한 한 실시양태에서, 상기 방법은 예를 들면, 전술된 바와 같은 하나 이상의 추가 치료제를 상기 개체에게 유효량으로 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 약제는 혈관신생의 억제를 위한 약제이다. 추가 실시양태에서, 약제는 유효량의 약제를 개체에게 투여하여 혈관신생을 억제하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 혈관신생을 억제하는 방법에서 사용되는 약제이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.

추가 양태에서, 본 발명은 눈 혈관 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드를, 이러한 눈 혈관 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 한 실시양태에서, 상기 방법은 후술된 바와 같이 유효량의 하나 이상의 추가 치료제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.

추가 양태에서, 본 발명은 개체의 눈에서 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드를 개체에게 투여하여 혈관신생을 억제하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.

추가 양태에서, 본 발명은 예를 들면, 상기 치료 방법들 중 임의의 치료 방법에서 사용되는, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드들 중 임의의 이량체성 폴리펩티드를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 제형은 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드들 중 임의의 이량체성 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 제형은 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드들 중 임의의 이량체성 폴리펩티드, 및 예를 들면, 후술된 바와 같은 하나 이상의 추가 치료제를 포함한다.

본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드는 치료에서 단독으로 사용될 수 있거나 다른 약제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드는 하나 이상의 추가 치료제와 공-투여될 수 있다.

본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드(및 임의의 추가 치료제)는 비경구 투여, 폐내 투여 및 비내 투여, 및 국소 치료가 요구되는 경우 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 관주는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 부분적으로 투여가 단기 투여인지 아니면 장기 투여인지에 따라 임의의 적합한 경로, 예를 들면, 주사, 예컨대, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 달성될 수 있다. 단회 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다회 투여, 볼루스 투여 및 펄스 관주를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 투약 스케쥴이 본원에서 고려된다.

본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드는 우수한 의학적 관행에 일치하는 방식으로 제형화되고 조제되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려될 인자는 치료될 구체적인 장애, 치료될 구체적인 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴 및 의료인에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 상기 이량체성 폴리펩티드는 해당 장애의 예방 또는 치료를 위해 현재 사용되는 하나 이상의 약제와 함께 제형화될 필요는 없지만 임의적으로 이러한 약제와 함께 제형화된다. 이러한 다른 약제의 유효량은 제형에 존재하는 이량체성 폴리펩티드의 양, 장애 또는 치료의 유형 및 상기 논의된 다른 인자에 의해 좌우된다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 용량 및 투여 경로와 동일한 용량 및 투여 경로로 사용되거나, 본원에 기재된 용량의 약 1% 내지 99%의 용량으로 사용되거나, 적절한 용량 및 경로인 것으로 실험적으로/임상적으로 확인된 임의의 용량 및 임의의 경로로 사용된다.

질환의 예방 또는 치료를 위해, (단독으로 사용되거나 하나 이상의 다른 추가 치료제와 함께 사용될 때) 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드의 적절한 용량은 치료되는 질환의 유형, 이량체성 폴리펩티드의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 이량체성 폴리펩티드가 예방 목적으로 투여되는지 아니면 치료 목적으로 투여되는지, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 이량체성 폴리펩티드에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의해 좌우될 것이다. 이량체성 폴리펩티드는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면, 0.5 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 이량체성 폴리펩티드가 예를 들면, 1회 이상의 분리 투여에 의해 또는 연속 관주에 의해 환자에게 투여될 초기 후보 용량일 수 있다. 한 전형적인 1일 용량은 상기 언급된 인자들에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상일 것이다. 수일 또는 이보다 오랜 시간에 걸친 반복된 투여의 경우, 상태에 따라 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 이량체성 폴리펩티드의 한 예시적인 용량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위 내에 있을 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합)의 용량이 환자에게 1회 이상 투여될 수 있다. 이러한 용량은 (예를 들면, 환자가 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들면, 약 6회 용량의 이량체성 폴리펩티드를 제공받도록) 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다. 보다 더 높은 초기 적재 용량에 이어서 보다 더 낮은 용량이 1회 이상 투여될 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.

III. 제품

본 발명의 또 다른 양태에서, 전술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기; 및 용기 상에 존재하거나 용기와 연결되어 있는 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 그 자체로 존재하거나 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 조합되어 있는 조성물을 보유하고, 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들면, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 하나 이상의 활성 성분은 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드이다. 상기 표지 또는 포장 삽입물은 상기 조성물이 선택된 질환의 치료에 사용된다는 것을 표시한다. 나아가, 제품은 (a) 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 그 내부에 함유하는 제1 용기; 및 (b) 추가 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 그 내부에 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 실시양태에서 제품은 상기 조성물이 특정 질환의 치료에 사용될 수 있다는 것을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제품은 약학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대, 정균 주사용수(BWFI), 포스페이트 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하는, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

상기 제품들 중 임의의 제품은 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 대신에 또는 이외에 본원에 보고된 면역접합체를 포함할 수 있다는 것이 이해된다.

IV. 구체적인 실시양태

1. 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는, 면역글로불린 힌지 영역의 적어도 일부, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 각각 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이량체성 폴리펩티드로서,

이때, i) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A를 포함하거나,

ii) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L251D, L314D 및 L432D를 포함하거나,

iii) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L251S, L314S 및 L432S를 포함하거나,

vi) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A를 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L251S, L314S 및 L432S를 포함하는, 이량체성 폴리펩티드.

2. 제1항에 있어서, 이량체성 폴리펩티드가 인간 FcRn에 특이적으로 결합하지 않고 스타필로코커스 단백질 A에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이량체성 폴리펩티드가 동종이량체성 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이량체성 폴리펩티드가 이종이량체성 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, i) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 추가로 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 S354C 및 T366W를 포함하거나, ii) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 S354C, T366S, L368A 및 Y407V를 추가로 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 Y349C 및 T366W를 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인이 인간 IgG1 서브클래스의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L234A 및 L235A를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인이 임의적으로 돌연변이 V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S 및 P331S를 갖는 인간 IgG2 서브클래스의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인이 인간 IgG4 서브클래스의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

10. 제1항 내지 제5항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 S228P 및 L235E를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 P329G를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체성 폴리펩티드가 Fc-영역 융합 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체성 폴리펩티드가 (전장) 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

14. 제1항 내지 제11항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, (전장) 항체가 단일특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

15. 제1항 내지 제11항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단일특이적 항체가 1가 단일특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

16. 제1항 내지 제11항 및 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단일특이적 항체가 2가 단일특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

17. 제1항 내지 제11항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, (전장) 항체가 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

18. 제1항 내지 제11항, 제13항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체가 2가 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

19. 제1항 내지 제11항, 제13항, 제17항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체가 4가 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

20. 제1항 내지 제11항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, (전장) 항체가 삼중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

21. 제1항 내지 제11항, 제13항 및 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 삼중특이적 항체가 4가 삼중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

22. 제1항 내지 제11항, 제13항, 제20항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 삼중특이적 항체가 4가 삼중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

23. 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는, 면역글로불린 힌지 영역의 적어도 일부, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 각각 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 이때 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 Y436A(카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링)를 포함하는, 이량체성 폴리펩티드.

24. 제23항에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 Y436A를 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 이량체성 폴리펩티드가 인간 FcRn에 특이적으로 결합하지 않고 스타필로코커스 단백질 A에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체성 폴리펩티드가 동종이량체성 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

27. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체성 폴리펩티드가 이종이량체성 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,

a) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 추가로 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 S354C 및 T366W를 포함하거나, 제1 폴리펩티드가 돌연변이 S354C, T366S, L368A 및 Y407V를 추가로 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 Y349C 및 T366W를 포함하고/하거나,

b) i) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A를 포함하거나,

vi) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A를 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L251S, L314S 및 L432S를 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인이 인간 IgG1 서브클래스의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L234A 및 L235A를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

31. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인이 임의적으로 돌연변이 V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S 및 P331S를 갖는 인간 IgG2 서브클래스의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

32. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인이 인간 IgG4 서브클래스의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

33. 제23항 내지 제28항 및 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 S228P 및 L235E를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

34. 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 P329G를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

35. 제23항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체성 폴리펩티드가 Fc-영역 융합 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

36. 제23항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체성 폴리펩티드가 (전장) 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

37. 제23항 내지 제34항 및 제36항 중 어느 한 항에 있어서, (전장) 항체가 단일특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

38. 제23항 내지 제34항, 제36항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 단일특이적 항체가 1가 단일특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

39. 제23항 내지 제34항 및 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 단일특이적 항체가 2가 단일특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

40. 제23항 내지 제34항 및 제36항 중 어느 한 항에 있어서, (전장) 항체가 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

41. 제23항 내지 제34항, 제36항 및 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체가 2가 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

42. 제23항 내지 제34항, 제36항, 제40항 및 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체가 4가 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

43. 제23항 내지 제34항 및 제36항 중 어느 한 항에 있어서, (전장) 항체가 삼중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

44. 제23항 내지 제34항, 제36항 및 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 삼중특이적 항체가 3가 삼중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

45. 제23항 내지 제34항, 제36항, 제43항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 삼중특이적 항체가 4가 삼중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 이량체성 폴리펩티드.

46. 제1 중쇄 가변 도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH1-도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 힌지 영역, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH2-도메인 및 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제1 폴리펩티드,

를 포함하는 이량체성 폴리펩티드로서,

이때, 제1 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인이 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 결합 부위를 형성하고,

i) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 S354C 및 T366W를 포함하거나, ii) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 S354C, T366S, L368A 및 Y407V를 추가로 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 Y349C 및 T366W를 포함하고,

제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 추가로 포함하고,

i) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A를 포함하거나,

47. 제1 중쇄 가변 도메인, 면역글로불린 경쇄 불변 도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 힌지 영역, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH2-도메인 및 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제1 폴리펩티드,

를 포함하는 이량체성 폴리펩티드로서,

i) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 S354C 및 T366W를 포함하거나, ii) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 S354C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 Y349C 및 T366W를 포함하고,

48. 제1 중쇄 가변 도메인, 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 CH1-도메인, 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 힌지 영역, 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 CH2-도메인 및 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제1 폴리펩티드,

를 포함하는 이량체성 폴리펩티드로서,

제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 추가로 포함하고,

49. 제1 중쇄 가변 도메인, 면역글로불린 경쇄 불변 도메인, 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 힌지 영역, 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 CH2-도메인 및 서브클래스 IgG4의 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제1 폴리펩티드,

를 포함하는 이량체성 폴리펩티드로서,

50. 제1 중쇄 가변 도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH1-도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 힌지 영역, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH2-도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH3-도메인, 펩티드성 링커 및 제1 scFv를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제1 폴리펩티드,

를 포함하는 이량체성 폴리펩티드로서,

이때, 제1 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인이 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 결합 부위를 형성하고, 제2 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인이 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부위를 형성하고, 제1 scFv 및 제2 scFv가 제2 항원에 특이적으로 결합하고,

51. 제1 중쇄 가변 도메인, 면역글로불린 경쇄 불변 도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 힌지 영역, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH2-도메인, 서브클래스 IgG1의 면역글로불린 CH3-도메인, 펩티드성 링커 및 제1 scFv를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제1 폴리펩티드,

를 포함하는 이량체성 폴리펩티드로서,

52. 하기 단계들을 포함하는, 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 이량체성 폴리펩티드를 제조하는 방법:

a) 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 이량체성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 단계,

c) 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 이량체성 폴리펩티드를 정제하는 단계.

53. 이량체성 폴리펩티드와 단백질 A의 결합을 증가시키기 위한 돌연변이 Y436A의 용도.

54. 동종이량체성 폴리펩티드로부터 이종이량체성 폴리펩티드를 분리하기 위한 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A의 용도.

55. 동종이량체성 폴리펩티드로부터 이종이량체성 폴리펩티드를 분리하기 위한 돌연변이 L251D, L314D 및 L432D, 또는 돌연변이 L251S, L314S 및 L432S의 용도.

56. 동종이량체성 폴리펩티드로부터 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체성 폴리펩티드를 분리하기 위한, 제2 폴리펩티드 내의 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A와 조합된 제1 폴리펩티드 내의 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A의 용도.

57. 동종이량체성 폴리펩티드로부터 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체성 폴리펩티드를 분리하기 위한, 제2 폴리펩티드 내의 돌연변이 L251D, L314D 및 L432D, 또는 돌연변이 L251S, L314S 및 L432S와 조합된 제1 폴리펩티드 내의 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A의 용도.

58. 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 추가로 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 S354C 및 T366W를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.

59. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 이량체성 폴리펩티드를, 눈 혈관 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 눈 혈관 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.

60. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 유리체내 적용을 위한 이량체성 폴리펩티드.

61. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 눈 혈관 질환의 치료를 위한 이량체성 폴리펩티드.

62. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 이량체성 폴리펩티드 및 임의적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제형.

63. 혈액-눈-장벽을 가로질러 가용성 수용체 리간드를 눈으로부터 혈액 순환계 내로 수송하기 위한 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 이량체성 폴리펩티드의 용도.

64. 하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 눈으로부터 제거하기 위한 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 이량체성 폴리펩티드의 용도.

65. 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환의 치료를 위한 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 이량체성 폴리펩티드의 용도.

66. 하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 유리체내 공간으로부터 혈액 순환계 내로 수송하기 위한 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 이량체성 폴리펩티드의 용도.

67. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 눈 질환의 치료에 사용되는 이량체성 폴리펩티드.

68. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액-눈-장벽을 가로질러 가용성 수용체 리간드를 눈으로부터 혈액 순환계 내로 수송하는 데 사용하기 위한 이량체성 폴리펩티드.

69. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 눈으로부터 제거하는 데 사용하기 위한 이량체성 폴리펩티드.

70. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 이량체성 폴리펩티드.

71. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 유리체내 공간으로부터 혈액 순환계 내로 수송하는 데 사용하기 위한 이량체성 폴리펩티드.

72. 눈 혈관 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 이량체성 폴리펩티드를 개체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법.

73. 개체에서 혈액-눈-장벽을 가로질러 가용성 수용체 리간드를 눈으로부터 혈액 순환계 내로 수송하는 방법으로서, 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 이량체성 폴리펩티드를 유효량으로 상기 개체에게 투여하여, 혈액-눈-장벽을 가로질러 가용성 수용체 리간드를 눈으로부터 혈액 순환계 내로 수송하는 단계를 포함하는 방법.

74. 개체에서 하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 눈으로부터 제거하는 방법으로서, 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 이량체성 폴리펩티드를 상기 개체에게 유효량으로 투여하여 눈으로부터 하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 제거하는 단계를 포함하는 방법.

75. 개체에서 하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 유리체내 공간으로부터 혈액 순환계 내로 수송하는 방법으로서, 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 이량체성 폴리펩티드를 상기 개체에게 유효량으로 투여하여 하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 유리체내 공간으로부터 혈액 순환계 내로 수송하는 단계를 포함하는 방법.

76. 개체에서 혈액-눈-장벽을 가로질러 가용성 수용체 리간드를 유리체내 공간 또는 눈으로부터 혈액 순환계 내로 수송하는 방법으로서, 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 이량체성 폴리펩티드를 상기 개체에게 유효량으로 투여하여 혈액-눈-장벽을 가로질러 가용성 수용체 리간드를 눈으로부터 혈액 순환계 내로 수송하는 단계를 포함하는 방법.

V. 실시예

하기 내용은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적인 설명을 고려할 때, 다양한 다른 실시양태들이 실시될 수 있다는 것이 이해된다.

상기 발명이 명확한 이해를 목적으로 설명 및 예에 의해 다소 상세히 기재되어 있지만, 설명 및 예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학 문헌들의 개시내용은 전체적으로 명확히 참고로 도입된다.

방법

전기분무 이온화 질량 분광측정(ESI-MS)

0.5 ㎕ N-글리카나제 플러스(Glycanase plus)(로슈(Roche)) 및 나트륨 포스페이트 완충제(0.1 M, pH 7.1)를 첨가하여 115 ㎕의 최종 샘플 부피를 수득함으로써 단백질 분취물(50 ㎍)을 탈글리코실화하였다. 혼합물을 37℃에서 18시간 동안 항온처리하였다. 그 후, 환원 및 변성을 위해, 4 M 구아니딘*HCl(피어스(Pierce)) 중의 60 ㎕ 0.5 M TCEP(피어스) 및 50 ㎕ 8 M 구아니딘*HCl을 첨가하였다. 혼합물을 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 샘플을 크기 배제 크로마토그래피(세파로스 G-25, 등용매, 2% 포름산을 갖는 40% 아세토니트릴)로 탈염시켰다. 나노 ESI 공급원(트라이버사 나노메이트(TriVersa NanoMate), 애드비온(Advion))을 갖춘 Q-TOF 기계(maXis, 브루커(Bruker)) 상에서 ESI 질량 스펙트럼(+ve)을 기록하였다. MS 파라미터 셋팅은 다음과 같았다: 전달: 깔대기 RF, 400 Vpp; ISCID 에너지, 0 eV; 다중극 RF, 400 Vpp; 사중극: 이온 에너지, 4.0 eV; 낮은 질량, 600 m/z; 공급원: 무수 가스, 8 ℓ/분; 무수 가스 온도, 160℃; 충돌 셀: 충돌 에너지, 10 eV; 충돌 RF: 2000 Vpp; 이온 냉각기: 이온 냉각기 RF, 300 Vpp; 전달 시간: 120 μs; Pre Puls 저장, 10 μs; 스캔 범위 m/z 600 내지 2000. 데이터 평가를 위해 사내 개발된 소프트웨어(매스어날라이저(MassAnalyzer))를 이용하였다.

FcRn 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석

비아코어 T100 기계(비아코어 아베(BIAcore AB), 스웨덴 업살라 소재)를 이용하여 야생형 항체 및 돌연변이체가 FcRn에 결합하는 성질을 표면 플라스몬 공명(SPR)으로 분석하였다. 이 시스템은 분자 상호작용의 연구를 위해 잘 확립되어 있다. 이것은 리간드/분석물 결합의 연속적인 실시간 모니터링 및 이로써 다양한 분석 환경에서 동역학적 파라미터의 측정을 가능하게 한다. SPR-기술은 금으로 코팅된 바이오센서 칩의 표면 근처에서의 굴절 지수의 측정에 근거한다. 굴절 지수의 변화는 고정된 리간드와 용액에 주입된 분석물의 상호작용에 의해 야기된 표면 상에서의 질량 변화를 표시한다. 분자가 표면 상의 고정된 리간드에 결합하는 경우, 질량이 증가하고, 해리하는 경우 질량이 감소한다. 본 분석에서, 아민 커플링을 통해 FcRn 수용체를 400 반응 유닛(RU)의 수준까지 비아코어 CM5-바이오센서 칩(지이 헬쓰케어 바이오사이언스, 스웨덴 업살라 소재) 상에 고정시켰다. 런닝 및 희석 완충제로서 PBS(0.05% 트윈20, pH 6.0)(지이 헬쓰케어 바이오사이언스)를 사용하여 상기 분석을 실온에서 수행하였다. 200 nM의 샘플을 실온에서 50 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. 결합 시간은 180초이었고, 해리 단계는 360초를 소요하였다. HBS-P(pH 8.0)를 짧게 주입하여 칩 표면의 재생에 도달하였다. 주입 후 180초에서의 생물학적 반응 신호 높이를 주입 후 300초에서의 생물학적 반응 신호 높이와 비교하여 SPR-데이터의 평가를 수행하였다. 상응하는 파라미터는 RU 최대 수준(주입 후 180초) 및 후기 안정성(주입의 종결 후 300초)이다.

단백질 A 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석

이 분석은 표면 플라스몬 공명 분광법에 근거한다. 단백질 A를 SPR 바이오센서의 표면 상에 고정시킨다. 샘플을 SPR 분광계의 유동 셀 내로 주입함으로써 고정된 단백질 A를 갖는 복합체를 형성하여 센서 칩 표면 상에서의 질량 증가 및 이로써 보다 더 높은 반응(1 RU가 1 pg/mm²로서 정의되기 때문임)을 야기한다. 그 후, 샘플-단백질 A 복합체를 용해시켜 센서 칩을 재생한다. 그 다음, 획득된 반응을 반응 유닛(RU)에서의 높은 신호 및 해리 거동에 대해 평가한다.

지이 헬쓰케어의 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 4.0에서 약 3500 반응 유닛(RU)의 단백질 A(20 ㎍/㎖)를 CM5 칩(지이 헬쓰케어) 상에 커플링시켰다.

샘플 및 시스템 완충제는 HBS-P+(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20 멸균-여과됨, pH 7.4)이었다. 유동 셀 온도를 25℃로 설정하고, 샘플 구획 온도를 12℃로 설정하였다. 시스템을 런닝 완충제로 프라이밍하였다. 그 다음, 샘플 구축물의 5 nM 용액을 30 ㎕/분의 유속으로 120초 동안 주입한 후, 300초의 해리 단계를 수행하였다. 그 다음, 30 ㎕/분의 유속으로 글리신-HCl(pH 1.5)을 2회 30초 동안 길게 주입함으로써 센서 칩 표면을 재생시켰다. 각각의 샘플을 삼중으로 측정하였다.

본원에 사용된 용어 "돌연변이 IHH-AAA를 갖는"은 IgG1 또는 IgG4 서브클래스의 불변 중쇄 영역 내의 돌연변이 I253A(Ile253Ala), H310A(His310Ala) 및 H435A(His435Ala)의 조합물(카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링)을 지칭하고, 본원에서 사용된 용어 "돌연변이 HHY-AAA를 갖는"은 IgG1 또는 IgG4 서브클래스의 불변 중쇄 영역 내의 돌연변이 H310A(His310Ala), H433A(His433Ala) 및 Y436A(Tyr436Ala)의 조합물(카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링)을 지칭하고, 본원에서 사용된 용어 "돌연변이 P329G LALA를 갖는"은 IgG1 서브클래스의 불변 중쇄 영역 내의 돌연변이 L234A(Leu234Ala), L235A(Leu235Ala) 및 P329G(Pro329Gly)의 조합물(카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링)을 지칭하고, 본원에서 사용된 용어 "돌연변이 SPLE를 갖는"은 IgG4 서브클래스의 불변 중쇄 영역 내의 돌연변이 S228P(Ser228Pro) 및 L235E(Leu235Glu)의 조합물(카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링)을 지칭한다.

일반

인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 대한 일반 정보는 문헌(Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))에서 제공되어 있다. 항체 쇄의 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따라 넘버링되고 지칭된다(Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

재조합 DNA 기법

문헌(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989))에 기재된 바와 같이 표준 방법을 이용하여 DNA를 조작하였다. 분자생물학 시약을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다.

유전자 합성

원하는 유전자 분절은 진아트(Geneart)(독일 레겐스부르그 소재)에서 주어진 요건에 따라 주문되었다.

DNA 서열결정

메디게노믹스 게엠베하(MediGenomix GmbH)(독일 마르틴스리에드 소재) 및 세퀴서브(SequiServe)(독일 바터스테텐 소재)에서 수행된 이중 가닥 서열결정으로 DNA 서열을 결정하였다.

DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리

GCG(제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 소프트웨어 팩키지 버전 10.2 및 인포맥스(Informax)의 벡터 NTI 어드밴스 스위트(Advance suite) 버전 8.0을 서열 생성, 맵핑, 분석, 해독 및 예증을 위해 사용하였다.

발현 벡터

기재된 항체들의 발현을 위해, CMV-인트론 A 프로모터를 갖거나 갖지 않는 cDNA 조직화 또는 CMV 프로모터를 갖는 게놈 조직화에 근거한 (예를 들면, HEK293-F 세포에서의) 일시적 발현용 발현 벡터를 사용하였다.

벡터는 항체 발현 카세트 이외에 하기 요소들을 함유하였다:

- 에스케리치아 콜라이에서 이 벡터의 복제를 가능하게 하는 복제기점,

- 에스케리치아 콜라이에서 앰피실린 내성을 부여하는 β-락타마제 유전자, 및

- 진핵 세포에서 선택 마커로서 머스 머스큘러스(Mus musculus)로부터의 다이하이드로폴레이트 리덕타제 유전자.

항체 유전자의 전사 유닛은 하기 요소들로 구성되었다:

- 5' 말단에서 유일한 제한 부위(들),

- 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 즉시 초기 인핸서 및 프로모터,

- cDNA 조직화의 경우 뒤따르는 인트론 A 서열,

- 인간 면역글로불린 유전자의 5' 비-번역 영역,

- 면역글로불린 중쇄 신호 서열을 코딩하는 핵산,

- cDNA로서, 또는 면역글로불린 엑손-인트론 조직화를 갖는 게놈 조직화에서 인간 항체 쇄(야생형 또는 도메인 교환을 가짐)를 코딩하는 핵산,

- 폴리아데닐화 신호 서열을 갖는 3' 비-번역 영역, 및

- 3' 말단에서의 유일한 제한 부위(들).

항체 쇄를 코딩하는 핵산을 PCR 및/또는 유전자 합성으로 생성하고, 예를 들면, 각각의 벡터 내의 유일한 제한 부위를 사용하여 일치하는 핵산 분절들을 연결함으로써 공지되어 있는 재조합 방법 및 기법으로 조립하였다. 서브클로닝된 핵산 서열을 DNA 서열결정으로 검증하였다. 일시적 형질감염을 위해 보다 더 많은 양의 벡터를 형질전환된 에스케리치아 콜라이 배양물로부터의 벡터 제조로 제조하였다(뉴클레오본드 에이엑스(Nucleobond AX), 마슈레이-나겔(Macherey-Nagel)).

세포 배양 기법

표준 세포 배양 기법을 문헌(Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc)에 기재된 바와 같이 이용하였다.

이하에 기재된 바와 같이 현탁액으로 생장하는 HEK29-F 세포에서 각각의 발현 벡터를 일시적으로 공-형질감염(co-transfection)시켜 이중특이적 항체를 발현하였다.

실시예 1

발현 및 정제

HEK293-F 시스템에서의 일시적 형질감염

HEK293-F 시스템(인비트로겐(Invitrogen))을 제조자의 설명서에 따라 사용하여 (예를 들면, 중쇄 및 변형된 중쇄뿐만 아니라 상응하는 경쇄 및 변형된 경쇄를 코딩하는) 각각의 벡터를 사용한 일시적 형질감염으로 단일특이적 항체 및 이중특이적 항체를 생성하였다. 요약하건대, 진탕 플라스크 또는 교반된 발효기 내의 무혈청 프리스타일(FreeStyle)™ 293 발현 배지(인비트로겐)에서 현탁액으로 생장하는 HEK293-F 세포(인비트로겐)를 각각의 발현 벡터와 293펙틴(fectin)™ 또는 펙틴(인비트로겐)의 혼합물로 형질감염시켰다. 2 ℓ 진탕 플라스크(코닝(Corning))의 경우, HEK293-F 세포를 600 ㎖ 중의 1x10⁶개 세포/㎖의 밀도로 시딩하고 120 rpm 및 8% CO₂에서 항온처리하였다. 다음 날, 세포를 약 1.5x10⁶개 세포/㎖의 세포 밀도에서 하기 A와 B의 약 42 ㎖ 혼합물로 형질감염시켰다: A) 등몰 비로 각각 중쇄 또는 변형된 중쇄 및 상응하는 경쇄를 코딩하는 600 ㎍ 총 벡터 DNA(1 ㎍/㎖)를 갖는 20 ㎖ Opti-MEM(인비트로겐), 및 B) 1.2 ㎖ 293펙틴 또는 펙틴(2 ㎕/㎖)을 갖는 20 ㎖ Opti-MEM. 글루코스 소비에 따라 글루코스 용액을 발현 과정 동안 첨가하였다. 분비된 항체를 함유하는 상청액을 5일 내지 10일 후 회수하고 항체를 상청액으로부터 직접적으로 정제하였거나 상청액을 동결하여 저장하였다.

정제

맙셀렉트슈어(MabSelectSure)-세파로스™(비-IHH-AAA 돌연변이체의 경우)(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 또는 카파셀렉트-아가로스(IHH-AAA 돌연변이체의 경우)(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재)를 사용한 친화성 크로마토그래피, 부틸-세파로스(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재)를 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 수퍼덱스 200 크기 배제(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 크로마토그래피로 세포 배양물 상청액으로부터 이중특이적 항체를 정제하였다.

요약하건대, 멸균 여과된 세포 배양물 상청액을 PBS 완충제(10 mM Na₂HPO₄, 1 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4)로 평형화된(비-IHH-AAA 돌연변이 및 야생형 항체) 맙셀렉트슈어 수지 상에 포획하고 평형화 완충제로 세척하고 pH 3.0에서 25 mM 나트륨 시트레이트로 용출하였다. IHH-AAA 돌연변이체를 25 mM 트라이스 및 50 mM NaCl(pH 7.2)로 평형화된 카파셀렉트 수지 상에서 포획하고 평형화 완충제로 세척하고 25 mM 나트륨 시트레이트(pH 2.9)로 용출하였다. 용출된 항체 분획을 풀링하고 2 M 트라이스(pH 9.0)로 중화시켰다. 1.6 M 암모늄 설페이트 용액을 0.8 M 암모늄 설페이트의 최종 농도까지 첨가함으로써 소수성 상호작용 크로마토그래피를 위한 항체 풀을 제조하고 아세트산을 사용하여 pH를 pH 5.0으로 조절하였다. 부틸-세파로스 수지를 35 mM 나트륨 아세테이트 및 0.8 M 암모늄 설페이트(pH 5.0)로 평형화시킨 후, 항체를 상기 수지에 적용하고 평형화 완충제로 세척하고 35 mM 나트륨 아세테이트(pH 5.0)까지 선형 구배로 용출하였다. (단일특이적 또는 이중특이적) 항체 함유 분획을 풀링하고, 20 mM 히스티딘 및 140 mM NaCl(pH 6.0)로 평형화된 수퍼덱스 200 26/60 GL(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 컬럼을 사용한 크기 배제 크로마토그래피로 더 정제하였다. (단일특이적 또는 이중특이적) 항체 함유 분획을 풀링하고 비바스핀(Vivaspin) 한외여과 장치(사르토리우스 스테딤 바이오텍 에스에이(Sartorius Stedim Biotech S.A.), 프랑스 소재)를 이용하여 요구된 농도까지 농축하고 -80℃에서 저장하였다.

순도 및 항체 온전성을 각각의 정제 단계 후 마이크로플루이딕 랩칩 기술(칼리퍼 라이프 사이언스(Caliper Life Science), 미국 소재)을 이용한 CE-SDS로 분석하였다. 제조자의 설명서에 따라 HT 단백질 발현 시약 키트를 사용하여 CE-SDS 분석을 위한 5 ㎕의 단백질 용액을 제조하고 HT 단백질 발현 칩을 사용하여 랩칩 GXII 시스템 상에서 분석하였다. 랩칩 GX 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.

25℃에서 2xPBS(20 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, 274 mM NaCl 및 5.4 mM KCl, pH 7.4) 런닝 완충제에서 수퍼덱스 200 분석 크기 배제 컬럼(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재)을 사용한 고성능 SEC로 항체 샘플의 응집체 함량을 분석하였다. 25 ㎍의 단백질을 0.75 ㎖/분의 유속으로 상기 컬럼 상에 주입하고 50분에 걸쳐 등용매 용출하였다.

유사하게, 항-VEGF/ANG2 항체 VEGF/ANG2-0012 및 VEGF/ANG2-0201을 제조하고 하기 수율로 정제하였다:

또한, IHH-AAA 돌연변이 및 SPLE 돌연변이를 갖는 항-VEGF/ANG2 이중특이적 항체 항-VEGF/ANG2 크로스맙 IgG4(서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45), IHH-AAA 돌연변이를 갖는 항-VEGF/ANG2 OAscFab IgG1(서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48), IHH-AAA 돌연변이 및 SPLE 돌연변이를 갖는 항-VEGF/ANG2 OAscFab IgG4(서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51), HHY-AAA 돌연변이 및 P329G LALA 돌연변이를 갖는 항-VEGF/ANG2 크로스맙 IgG1(서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 40, 서열번호 41), HHY-AAA 돌연변이 및 SPLE 돌연변이를 갖는 항-VEGF/ANG2 크로스맙 IgG4(서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 44, 서열번호 45), HHY-AAA 돌연변이를 갖는 항-VEGF/ANG2 OAscFab IgG1(서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 48), 및 HHY-AAA 돌연변이 및 SPLE 돌연변이를 갖는 항-VEGF/ANG2 OAscFab IgG4(서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 51)뿐만 아니라, 항-IGF-1R 단일특이적 항체 항-IGF-1R 야생형(서열번호 88, 서열번호 89), IHH-AAA 돌연변이를 갖는 항-IGF-1R IgG1(서열번호 88, 서열번호 90), YTE 돌연변이를 갖는 항-IGF-1R IgG1(서열번호 88, 서열번호 91), KiH 돌연변이를 갖는 항-IGF-1R IgG1 야생형(서열번호 88, 서열번호 92, 서열번호 93), 홀 쇄 내의 KiH 돌연변이 및 IHH-AAA 돌연변이를 갖는 항-IGF-1R IgG1(서열번호 88, 서열번호 94, 서열번호 95), 홀 쇄 내의 KiH 돌연변이 및 HHY-AAA 돌연변이를 갖는 항-IGF-1R IgG1(서열번호 88, 서열번호 96, 서열번호 97), KiH 돌연변이 및 YTE 돌연변이를 갖는 항-IGF-1R IgG1(서열번호 88, 서열번호 98, 서열번호 99), KiH 돌연변이 및 DDD 돌연변이를 갖는 항-IGF-1R IgG1(서열번호 88, 서열번호 100, 서열번호 101), 및 HHY-AAA 돌연변이를 갖는 항-IGF-1R IgG1(서열번호 88, 서열번호 112)도 유사하게 제조될 수 있고 정제될 수 있다.

실시예 2

분석 및 개발가능성

소규모 DLS-기초 점도 측정

점도 측정을 본질적으로 문헌(He, F. et al., Analytical Biochemistry 399 (2009) 141-143)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 요약하건대, 샘플을 200 mM 아르기닌 석시네이트(pH 5.5)에서 다양한 단백질 농도로 농축한 후, 폴리스티렌 라텍스 비드(300 nm 직경) 및 폴리소르베이트 20(0.02% 부피/부피)을 첨가한다. 0.4 ㎛ 필터 플레이트를 통한 원심분리로 샘플을 광학 384-웰 플레이트 내로 옮기고 파라핀 오일로 덮는다. 상기 라텍스 비드의 겉보기 직경을 25℃에서 동적 광 산란으로 측정한다. 용액의 점도를 η=η0((rh/rh,0)(η: 점도; η0: 물의 점도; rh: 라텍스 비드의 겉보기 수력학적 반경; rh,0: 물에서 라텍스 비드의 수력학적 반경)로서 계산할 수 있다.

동일한 농도에서 다양한 샘플들을 비교하기 위해, 점도-농도 데이터를 무니(Mooney) 수학식(수학식 1)(Mooney, M., Colloid. Sci., 6 (1951) 162-170; Monkos, K., Biochem. Biophys. Acta 304 (1997) 1339)으로 피팅하였고, 이에 따라 데이터를 내삽하였다:

[수학식 1]

(S: 단백질의 수력학적 상호작용 파라미터; K: 자가-응집 인자; Φ: 용해된 단백질의 부피 분율)

결과는 도 2에 제시되어 있다: Fc-영역 내에 돌연변이 IHH-AAA를 갖는 VEGF/ANG2-0016은 Fc-영역 내에 돌연변이 IHH-AAA를 갖지 않는 VEGF/ANG2-0015에 비해 모든 측정된 온도에서 더 낮은 점도를 보인다.

DLS 응집 시작 온도

샘플을 20 mM 히스티딘/히스티딘 하이드로클로라이드 및 140 mM NaCl(pH 6.0)에서 1 mg/㎖의 농도로 제조하고 0.4 ㎛ 필터 플레이트를 통한 원심분리로 광학 384-웰 플레이트 내로 옮기고 파라핀 오일로 덮는다. 샘플이 25℃부터 80℃까지 0.05℃/분의 속도로 가열되는 동안 수력학적 반경을 동적 광 산란으로 반복하여 측정한다. 응집 시작 온도는 수력학적 반경이 증가하기 시작하는 온도로서 정의된다. 결과는 도 3에 제시되어 있다. 도 3에서, 돌연변이 IHH-AAA를 갖지 않는 VEGF/ANG2-0015 대 Fc-영역 내에 돌연변이 IHH-AAA를 갖는 VEGF/ANG2-0016의 응집이 제시되어 있다. VEGF/ANG2-0016은 61℃의 응집 시작 온도를 보인 반면, IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않는 VEGF/ANG2-0015는 60℃의 시작 온도를 보였다.

DLS 시간-경과

샘플을 20 mM 히스티딘/히스티딘 하이드로클로라이드 및 140 mM NaCl(pH 6.0)에서 1 mg/㎖의 농도로 제조하고 0.4 ㎛ 필터 플레이트를 통한 원심분리로 광학 384-웰 플레이트 내로 옮기고 파라핀 오일로 덮는다. 샘플이 최대 145시간 동안 50℃의 일정한 온도에서 유지되는 동안 수력학적 반경을 동적 광 산란으로 반복하여 측정한다. 이 실험에서, 승온에서 천연 비-폴딩된 단백질의 응집 경향은 시간 경과에 따른 평균 입자 직경의 증가를 유발하였을 것이다. 이 DLS-기초 방법은 응집체들이 산란된 광 강도에 과도하게 비례적으로 기여하기 때문에 응집체들에 대해 매우 민감하다. 심지어 50℃(응집 시작 온도에 가까운 온도, 상기 참조)에서 145시간 후, 0.5 nm 미만의 평균 입자 직경 증가만이 VEGF/ANG2-0015 및 VEGF/ANG2-0016 둘 다에 대해 발견되었다.

100 mg/㎖로 40℃에서 7일 동안 저장

샘플을 200 mM 아르기닌 석시네이트(pH 5.5)에서 100 mg/㎖의 최종 농도까지 농축하고 멸균 여과하고 40℃에서 7일 동안 정지 상태로 저장한다. 저장 전 및 후, 고분자량 종 및 저분자량 종(각각 HMW 및 LMW)의 함량을 크기 배제 크로마토그래피로 측정한다. 저장된 샘플과 제조 직후 측정된 샘플 사이에 HMW 및 LMW 함량에서의 차이는 각각 "HMW 증가" 및 "LMW 증가"로서 보고된다. 결과는 하기 표 및 도 4에 제시되어 있는데, 이들은 VEGF/ANG2-0015(IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않음)가 VEGF/ANG2-0016(IHH-AAA 돌연변이를 가짐)에 비해 더 높은 주 피크 감소 및 더 높은 HMW 증가를 보인다는 것을 보여준다. 놀랍게도, VEGF/ANG2-0016(IHH-AAA 돌연변이를 가짐)은 VEGF/ANG2-0015(IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않음)에 비해 더 낮은 응집 경향을 보였다.

25℃에서 비아코어^® T100 또는 T200 기계(지이 헬쓰케어)를 이용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)으로 항-VEGF/ANG2 이중특이적 항체의 기능성 분석을 평가하였다. 비아코어^® 시스템은 분자 상호작용의 연구용으로 잘 확립되어 있다. SPR-기술은 금 코팅된 바이오센서 칩의 표면에 가까운 굴절 지수의 측정에 기초한다. 굴절 지수의 변화는 고정된 리간드와 용액으로 주입된 분석물의 상호작용에 의해 야기된 표면 상의 질량 변화를 표시한다. 분자가 표면 상의 고정된 리간드에 결합하는 경우 질량이 증가하고, 역으로 분석물이 고정된 리간드로부터 해리되는 경우(복합체 해리를 반영함) 질량이 감소한다. SPR은 리간드/분석물 결합의 연속적인 실시간 모니터링 및 이로써 결합 속도 상수(k_a), 해리 속도 상수(k_d) 및 평형 상수(K_D)의 측정을 가능하게 한다.

실시예 3

VEGF, ANG2, FcγR 및 FcRn과의 결합

종-교차반응성의 평가를 포함하는 VEGF 동형체 동역학적 친화성

지이 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 약 12,000 공명 유닛(RU)의 포획 시스템(10 ㎕/㎖ 염소 항-인간 F(ab)'₂ 주문 코드: 28958325; 지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스 아베(GE Healthcare Bio-Sciences AB), 스웨덴 소재)을 CM5 칩(지이 헬쓰케어 BR-1005-30) 상에 커플링시켰다. 샘플 및 시스템 완충제는 PBS-T(0.05% 트윈20을 포함하는 10 mM 포스페이트 완충 식염수)(pH 7.4)이었다. 유동 셀을 25℃로 설정하고, 샘플 블록을 12℃로 설정하고 런닝 완충제로 2회 프라이밍하였다. 50 nM 용액을 5 ㎕/분의 유속으로 30초 동안 주입하여 이중특이적 항체를 포획하였다. 용액 중의 다양한 농도의 인간 hVEGF121, 마우스 mVEGF120 또는 래트 rVEGF164를 1:3 희석물로 300 nM부터 시작하여 30 ㎕/분의 유속으로 300초 동안 주입함으로써 결합을 측정하였다. 해리 단계는 최대 1200초 동안 모니터링되었고 샘플 용액을 런닝 완충제로 교체함으로써 유발되었다. 30 ㎕/분의 유속으로 글리신(pH 2.1) 용액을 사용하여 60초 동안 세척함으로써 표면을 재생시켰다. 염소 항-인간 F(ab')₂ 표면으로부터 수득된 반응을 공제함으로써 벌크 굴절 지수 차이를 보정하였다. 블랭크 주입도 공제한다(= 이중 표준화). 겉보기 K_D 및 다른 동역학적 파라미터의 계산을 위해 랭뮤어 1:1 모델을 이용하였다. 결과는 하기 제시되어 있다.

종 교차반응성의 평가를 포함하는 ANG2 용액 친화성

용액 친화성은 평형 혼합물에서 자유 상호작용 파트너의 농도를 측정함으로써 상호작용의 친화성을 측정한다. 용액 친화성 분석은 일정한 농도로 유지된 항-VEGF/ANG2 항체를 다양한 농도의 리간드(= ANG2)와 혼합하는 단계를 포함한다. 지이 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 최대 가능한 공명 유닛(예를 들면, 17,000 공명 유닛(RU))의 항체를 pH 5.0에서 CM5 칩(지이 헬쓰케어 BR-1005-30) 표면 상에 고정시켰다. 샘플 및 시스템 완충제는 pH 7.4의 HBS-P이었다. 유동 셀을 25℃로 설정하고 샘플 블록을 12℃로 설정하고 런닝 완충제로 2회 프라이밍하였다. 보정 곡선을 생성하기 위해, 증가하는 농도의 ANG2를, 고정된 항-VEGF/ANG2 항체를 함유하는 비아코어 유동 셀 내로 주입하였다. 결합된 ANG2의 양을 공명 유닛(RU)으로서 측정하여 농도에 대해 작도하였다. 각각의 리간드의 용액(항-VEGF/ANG2 항체의 경우 0 nM부터 200 nM까지 11개 농도)을 10 nM ANG2와 함께 항온처리하고 실온에서 평형에 도달하게 하였다. 공지된 양의 ANG2를 갖는 용액의 반응을 측정하기 전 및 후에 생성된 보정 곡선으로부터 자유 ANG2 농도를 측정하였다. 자유 ANG2 농도를 y-축으로서 사용하고 억제될 항체의 농도를 x-축으로서 사용하는 모델 201을 사용하여 4-파라미터 피트를 XLfit4(IDBS 소프트웨어)로 설정하였다. 이 곡선의 변곡점을 측정함으로써 친화성을 계산하였다. 30 ㎕/분의 유속으로 0.85% H₃PO₄ 용액을 사용하여 30초 동안 1회 세척함으로써 표면을 재생시켰다. 블랭크-커플링된 표면으로부터 수득된 반응을 공제함으로써 벌크 굴절 지수 차이를 보정하였다. 결과는 하기 표에 제시되어 있다.

FcRn 정상 상태 친화성

FcRn 측정을 위해, 정상 상태 친화성을 이용하여 이중특이적 항체를 서로 비교하였다. 인간 FcRn을 커플링 완충제(10 ㎕/㎖, Na-아세테이트 pH 5.0)로 희석하고, 비아코어 위자드를 사용하여 표적화된 고정 절차로 200 RU의 최종 반응까지 C1-칩(지이 헬쓰케어 BR-1005-35) 상에 고정시켰다. 유동 셀을 25℃로 설정하고 샘플 블록을 12℃로 설정하고 런닝 완충제로 2회 프라이밍하였다. 샘플 및 시스템 완충제는 PBS-T(0.05% 트윈20을 포함하는 10 mM 포스페이트 완충 식염수)(pH 6.0)이었다. 각각의 항체에 대한 상이한 IgG 농도를 평가하기 위해, 62.5 nM, 125 nM, 250 nM 및 500 nM의 농도를 제조하였다. 유속을 30 ㎕/분으로 설정하였고, 180초의 결합 시간을 선택하면서 상이한 샘플들을 칩 표면 상에 연속적으로 주입하였다. 표면을 30 ㎕/분의 유속으로 60초 동안 주입된 PBS-T(pH 8)로 재생시켰다. 블랭크 표면으로부터 수득된 반응을 공제함으로써 벌크 굴절 지수 차이를 보정하였다. 완충제 주입도 공제한다(= 이중 표준화). 정상 상태 친화성의 계산을 위해, 비아-에발루션(BIA-Evaluation) 소프트웨어로부터의 방법을 이용하였다. 요약하건대, RU 값을 분석된 농도에 대해 작도하여 용량-반응 곡선을 생성하였다. 2-파라미터 피트에 근거하여 상부 점근선을 계산함으로써 절반-최대 RU 값 및 이로써 친화성의 측정을 가능하게 한다. 결과는 도 5 및 하기 표에 제시되어 있다. 유사하게, 사이노몰구스, 마우스 및 토끼 FcRn에 대한 친화성을 측정할 수 있다.

FcγRIIIa 측정

FcγRIIIa 측정을 위해, 직접적인 결합 분석을 이용하였다. 지이 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 약 3,000 공명 유닛(RU)의 포획 시스템(1 ㎕/㎖ 펜타-His; 퀴아젠(Qiagen))을 pH 5.0에서 CM5 칩(지이 헬쓰케어 BR-1005-30) 상에 커플링시켰다. 샘플 및 시스템 완충제는 HBS-P+(pH 7.4)이었다. 유동 셀을 25℃로 설정하고 샘플 블록을 12℃로 설정하고 런닝 완충제로 2회 프라이밍하였다. 5 ㎕/분의 유속으로 60초 동안 100 nM 용액을 주입함으로써 FcγRIIIa-His-수용체를 포획하였다. 30 ㎕/분의 유속으로 180초 동안 100 nM의 이중특이적 항체 또는 단일특이적 대조군 항체(IgG1 서브클래스 및 IgG4 서브클래스 항체의 경우 항-디곡시게닌 항체)를 주입함으로써 결합을 측정하였다. 30 ㎕/분의 유속으로 글리신(pH 2.5) 용액을 사용하여 120초 동안 세척함으로써 표면을 재생시켰다. FcγRIIIa 결합이 랭뮤어 1:1 모델과 상이하기 때문에, 결합/비-결합만을 이 분석으로 확인하였다. 유사한 방식으로 FcγRIa 및 FcγRIIa 결합을 확인할 수 있다. 결과는 도 6에 제시되어 있는데, 여기서 당연히 돌연변이 P329G LALA의 도입에 의해 FcγRIIIa와의 결합이 더 이상 검출될 수 없었다는 결론이 도출된다.

항-VEGF/ANG2 항체에 대한 독립적인 VEGF 및 ANG2 결합의 평가

지이 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 약 3,500 공명 유닛(RU)의 포획 시스템(10 ㎕/㎖ 염소 항-인간 IgG; 지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스 아베, 스웨덴 소재)을 pH 5.0에서 CM4 칩(지이 헬쓰케어 BR-1005-34) 상에 커플링시켰다. 샘플 및 시스템 완충제는 PBS-T(0.05% 트윈20을 포함하는 10 mM 포스페이트 완충 식염수)(pH 7.4)이었다. 유동 셀의 온도를 25℃로 설정하고 샘플 블록의 온도를 12℃로 설정하였다. 포획 전에, 유동 셀을 런닝 완충제로 2회 프라이밍하였다.

5 ㎕/분의 유속으로 60초 동안 10 nM 용액을 주입하여 이중특이적 항체를 포획하였다. 순차적으로 또는 동시에 (30 ㎕/분의 유속으로) 첨가된 각각의 리간드에 대한 활성 결합 능력을 측정함으로써 각각의 리간드와 이중특이적 항체의 독립적인 결합을 분석하였다.

1. 180초 동안 200 nM의 농도로 인간 VEGF를 주입한다(항원의 단일 결합을 확인한다).

2. 180초 동안 100 nM의 농도로 인간 ANG2를 주입한다(항원의 단일 결합을 확인한다).

3. 180초 동안 200 nM의 농도로 인간 VEGF를 주입한 후 180초 동안 100 nM의 농도로 인간 ANG2를 추가 주입한다(VEGF의 존재 하에 ANG2의 결합을 확인한다).

4. 180초 동안 100 nM의 농도로 인간 ANG2를 주입한 후 200 nM의 농도로 인간 VEGF를 추가 주입한다(ANG2의 존재 하에 VEGF의 결합을 확인한다).

5. 180초 동안 200 nM의 농도의 인간 VEGF 및 100 nM의 농도의 인간 ANG2를 공-주입한다(VEGF 및 ANG2의 결합을 동시에 확인한다).

30 ㎕/분의 유속으로 3 M MgCl₂ 용액을 사용하여 60초 동안 세척함으로써 표면을 재생시켰다. 염소 항-인간 IgG 표면으로부터 수득된 반응을 공제함으로써 벌크 굴절 지수 차이를 보정하였다.

방법 3, 4 및 5의 생성된 최종 신호가 방법 1 및 2의 개별 최종 신호의 합계와 동일하거나 유사한 경우 이중특이적 항체는 두 항원들에 서로 독립적으로 결합할 수 있다. 결과는 하기 표에 제시되어 있는데, 여기서 항체 VEGF/ANG2-0016 및 VEGF/ANG2-0012 둘 다가 VEGF 및 ANG2에 서로 독립적으로 결합할 수 있다는 것이 입증된다.

항-VEGF/ANG2 이중특이적 항체에 대한 동시적인 VEGF 및 ANG2 결합의 평가

첫째, 지이 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 약 1,600 공명 유닛(RU)의 VEGF(20 ㎕/㎖)를 pH 5.0에서 CM4 칩(지이 헬쓰케어 BR-1005-34) 상에 커플링시켰다. 샘플 및 시스템 완충제는 PBS-T(0.05% 트윈20을 포함하는 10 mM 포스페이트 완충 식염수)(pH 7.4)이었다. 유동 셀을 25℃로 설정하고 샘플 블록을 12℃로 설정하고 런닝 완충제로 2회 프라이밍하였다. 둘째, 30 ㎕/분의 유속으로 180초 동안 50 nM의 이중특이적 항체 용액을 주입하였다. 셋째, 30 ㎕/분의 유속으로 180초 동안 hANG2를 주입하였다. hANG2의 결합 반응은 VEGF에 결합된 이중특이적 항체의 양에 의해 좌우되고 동시적인 결합을 보여준다. 30 ㎕/분의 유속으로 0.85% H₃PO₄ 용액을 사용하여 60초 동안 세척함으로써 표면을 재생시켰다. 동시적인 결합은 이미 VEGF에 결합된 항-VEGF/ANG2 항체에 대한 hANG2의 추가 특이적 결합 신호에 의해 입증된다. 이중특이적 항체 VEGF/ANG2-0015 및 VEGF/ANG2-0016 둘 다의 경우, 항-VEGF/ANG2 항체에 대한 동시적인 VEGF 및 ANG2 결합이 검출될 수 있었다(데이터는 제시되어 있지 않음).

실시예 4

질량 분광측정

본 단락은 정확한 조립을 강조하면서 항-VEGF/ANG2 항체의 특징규명을 기술한다. 탈글리코실화된 온전한 또는 IdeS(스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes)의 IgG 분해 효소)-분해된 항-VEGF/ANG2 항체의 전기분무 이온화 질량 분광측정(ESI-MS)으로 예측된 일차 구조를 확인하였다. 37℃에서 100 mmol/ℓ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄(pH 7.1)에서 100 ㎍의 정제된 항체를 2 ㎍의 IdeS 프로테아제(패브리케이터(Fabricator))와 함께 5시간 동안 항온처리함으로써 IdeS 분해를 수행하였다. 그 후, 37℃의 100 mmol/ℓ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄(pH 7.1)에서 1 mg/㎖의 단백질 농도로 N-글리코시다제 F, 뉴라미니다제 및 O-글리코시다제(로슈)를 사용하여 항체를 최대 16시간 동안 탈글리코실화한 후, 세파덱스 G25 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에서 HPLC를 통해 탈염시켰다. 트라이버사 나노메이트(TriVersa NanoMate) 공급원(애드비온)을 갖춘 maXis 4G UHR-QTOF MS 시스템(브루커 달토닉(Bruker Daltonik)) 상에서 ESI-MS를 통해 총 질량을 측정하였다.

IdeS에 의해 분해되고 탈글리코실화된 분자(하기 표) 또는 온전한 탈글리코실화된 분자(하기 표)에 대해 수득된 질량은 2개의 상이한 경쇄 LC_ANG2 및 LC_루센티스 및 2개의 상이한 중쇄 HC_ANG2 및 HC_루센티스로 구성된 항-VEGF/ANG2 항체에 대한 아미노산 서열로부터 유추된 예측된 질량에 상응한다.

실시예 5

FcRn 크로마토그래피

스트렙타비딘 세파로스에의 커플링:

1 g의 스트렙타비딘 세파로스(지이 헬쓰케어)를 바이오티닐화되고 투석된 수용체에 첨가하고 진탕하면서 2시간 동안 항온처리하였다. 수용체 유도체화된 세파로스를 1 ㎖ XK 컬럼(지이 헬쓰케어) 내에 충전시켰다.

FcRn 친화성 컬럼을 사용한 크로마토그래피:

조건:

컬럼 치수: 50 mm x 5 mm

층 높이: 5 cm

적재량: 50 ㎍ 샘플

평형화 완충제: pH 5.5로 조절된, 150 mM NaCl을 갖는 20 mM MES

용출 완충제: pH 8.8로 조절된, 150 mM NaCl을 갖는 20 mM 트라이스/HCl

용출: 7.5 CV 평형화 완충제, 30 CV 내지 100% 용출 완충제, 10 CV 용출 완충제

인간 FcRn 친화성 컬럼 크로마토그래피

하기 표에는 인간 FcRn을 포함하는 친화성 컬럼 상에서의 항-VEGF/ANG2 항체의 체류 시간이 제시되어 있다. 상기 조건을 이용하여 데이터를 수득하였다.

실시예 6

IHH-AAA 돌연변이를 갖는 항체의 약동학적(PK) 성질

인간 FcRn에 대한 유전자이식 FcRn 마우스를 사용하여 수득한 PK 데이터

생활상:

본 연구는 암컷 C57BL/6J 마우스(배경); 및 FcRn을 결여하되 인간 FcRn에 대한 반접합성 유전자이식체인 마우스(huFcRn, 계통 276 -/tg)를 포함하였다.

파트 1:

동물 당 2 ㎕의 적절한 용액(즉, 동물 당 21 ㎍ 화합물(VEGF/ANG2-0015(IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않음)) 또는 동물 당 23.6 ㎍ 화합물(VEGF/ANG2-0016(IHH-AAA 돌연변이를 가짐)))을 모든 마우스들의 우측 눈 내로 1회 유리체내 주입하였다.

마우스들을 각각 6마리의 동물들을 갖는 2개의 군으로 배정하였다. 투약 후 2시간, 24시간 및 96시간에서 군 1로부터 혈액 샘플을 채취하고 투약 후 7시간, 48시간 및 168시간에서 군 2로부터 혈액 샘플을 채취한다.

나노리터 주입을 위한 나노필 마이크로시린지(NanoFil Microsyringe) 시스템(월드 프리시전 인스트루먼츠 인코포레이티드(World Precision Instruments, Inc.), 독일 베를린 소재)을 이용하여 우측 마우스 눈의 유리체 내로의 주입을 수행하였다. 마우스들을 2.5% 이소플루란으로 마취하고 마우스 눈의 가시화를 위해 40배 확대율 및 고리-광을 갖는 레이카(Leica) MZFL 3 현미경을 레이카 KL 2500 LCD 전광과 함께 이용하였다. 그 후, 35-게이지 바늘을 이용하여 2 ㎕의 화합물을 주입하였다.

혈청 중의 화합물 수준을 측정하기 위해 각각의 동물로부터 반대쪽 눈의 안구뒤 정맥얼기를 통해 혈액을 채취하였다.

실온에서 1시간 동안 놓아둔 후 4℃에서 3분 동안 원심분리하여(9,300xg) 혈액으로부터 50 ㎕ 이상의 혈청 샘플을 수득하였다. 원심분리 후 혈청 샘플을 직접적으로 동결하고 분석할 때까지 -80℃에서 동결된 상태로 저장하였다. 군 1의 동물들의 처리된 눈을 처리 후 96시간에서 단리하고 군 2의 동물들의 처리된 눈을 처리 후 168시간에서 단리하였다. 샘플을 분석할 때까지 -80℃에서 동결된 상태로 저장하였다.

파트 2:

동물 당 200 ㎕의 적절한 용액(즉, 동물 당 21 ㎍ 화합물(VEGF/ANG2-0015(IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않음)) 또는 동물 당 23.6 ㎍ 화합물(VEGF/ANG2-0016(IHH-AAA 돌연변이를 가짐)))을 모든 마우스들에게 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 1회 주입하였다.

마우스들을 각각 5마리의 동물들을 갖는 2개의 군으로 배정하였다. 투약 후 1시간, 24시간 및 96시간에서 군 1로부터 혈액 샘플을 채취하고 투약 후 7시간, 48시간 및 168시간에서 군 2로부터 혈액 샘플을 채취한다. 혈청 중의 화합물 수준을 측정하기 위해 각각의 동물로부터 안구뒤 정맥얼기를 통해 혈액을 채취하였다.

실온에서 1시간 동안 놓아둔 후 4℃에서 3분 동안 원심분리하여(9,300xg) 혈액으로부터 50 ㎕ 이상의 혈청 샘플을 수득하였다. 원심분리 후 혈청 샘플을 직접적으로 동결하고 분석할 때까지 -80℃에서 동결된 상태로 저장하였다.

전체 눈 용해물의 제조(마우스)

실험 동물의 전체 눈을 물리화학적으로 붕해시켜 눈 용해물을 획득하였다. 기계적 파괴를 위해, 각각의 눈을 원뿔형 바닥을 갖는 1.5 ㎖ 마이크로바이알 내로 옮겼다. 동결 및 해동 후, 눈을 1 ㎖ 세포 세척 완충제(바이오-라드(Bio-Rad), 바이오-플렉스(Bio-Plex) 세포 용해 키트, 카탈로그 번호 171-304011)로 1회 세척하였다. 하기 단계에서, 500 ㎕의 새로 제조된 세포 용해 완충제를 첨가하고 1.5 ㎖ 조직 분쇄 막자(킴블 체이스(Kimble Chase), 1.5 ㎖ 막자, 제품 번호 749521-1500)를 이용하여 눈을 분쇄하였다. 그 다음, 혼합물을 5회 동결하고 해동하고 다시 분쇄하였다. 남은 조직으로부터 용해물을 분리하기 위해, 샘플을 4,500xg에서 4분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상청액을 수집하고 정량 ELISA에서 추가 분석할 때까지 -20℃에서 저장하였다.

분석

마우스 혈청 및 눈 용해물 중의 항-VEGF/ANG2 항체의 농도를 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA)으로 측정하였다.

마우스 혈청 샘플 및 눈 용해물에서 항-VEGF/ANG2 항체를 정량하기 위해, 포획 항체 및 검출 항체로서 사용된 바이오티닐화된 단일클론 항체 및 디곡시게닐화된 단일클론 항체를 사용한 표준 고체상 연속 샌드위치 면역분석을 수행하였다. 분석물의 이중특이성의 온전성을 검증하기 위해, 바이오티닐화된 포획 항체는 VEGF 결합 부위를 인식하는 반면, 디곡시게닐화된 검출 항체는 분석물의 ANG2 결합 부위에 결합할 것이다. 그 다음, 스트렙타비딘으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트(SA-MTP)의 고체상에서 포획 항체, 분석물 및 검출 항체로 이루어진 결합된 면역 복합체를 항-디곡시게닌 항체에 커플링된 호스라디쉬-퍼록시다제로 검출한다. SA-MTP로부터 비-결합된 물질을 세척하고 ABTS-기질을 첨가한 후, 수득된 신호는 SA-MTP의 고체상에 결합된 분석물의 양에 비례한다. 그 다음, 동시에 분석된 보정제를 참조하면서 샘플의 측정된 신호를 농도로 전환함으로써 정량을 수행한다.

제1 단계에서, MTP-진탕기 상에서 500 rpm에서 1시간 동안 1 ㎍/㎖의 농도로 웰 당 100 ㎕의 바이오티닐화된 포획 항체 용액(mAb<Id<VEGF>>M-2.45.51-IgG-Bi(DDS), 항-이디오타입 항체)을 사용하여 SA-MTP를 코팅하였다. 한편, 보정제, QC-샘플 및 샘플을 제조하였다. 보정제 및 QC-샘플을 2% 혈청 매트릭스까지 희석하고; 신호가 보정제의 선형 범위 내에 있을 때까지 샘플을 희석한다.

SA-MTP를 포획 항체로 코팅한 후, 플레이트를 웰 당 300 ㎕의 세척 완충제로 3회 세척하였다. 그 후, 웰 당 100 ㎕의 보정제, QC-샘플 및 샘플을 SA-MTP 상에 피펫팅하고 500 rpm에서 1시간 동안 다시 항온처리하였다. 분석물은 포획 항체를 통해 그의 VEGF 결합 부위로 SA-MTP의 고체상에 결합되었다. 항온처리 및 플레이트의 세척에 의한 비-결합된 분석물의 제거 후, 250 ng/㎖의 농도로 웰 당 100 ㎕의 제1 검출 항체(mAb<Id-<ANG2>>M-2.6.81-IgG-Dig(XOSu), 항-이디오타입 항체)를 SA-MTP에 첨가하였다. 다시, 플레이트를 진탕기 상에서 500 rpm에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세척 후, 50 mU/㎖의 농도로 웰 당 100 ㎕의 제2 검출 항체(pAb<디곡시게닌>S-Fab-POD(poly))를 SA-MTP의 웰에 첨가하고, 플레이트를 500 rpm에서 1시간 동안 다시 항온처리하였다. 여분의 검출 항체를 제거하기 위한 최종 세척 단계 후, 웰 당 100 ㎕의 기질(ABTS)을 첨가한다. 항체-효소 접합체는 ABTS^® 기질의 발색 반응을 촉진한다. 그 다음, 405 nm 파장(기준 파장: 490 nm([405/490] nm))에서 ELISA 판독기로 신호를 측정하였다.

약동학적 평가

약동학적 평가 프로그램 윈놀린(WinNonlin)™(파사이트(Pharsight))), 버전 5.2.1을 이용하여 비-구획 분석으로 약동학적 파라미터를 계산하였다.

결과:

A) 혈청 농도

혈청 농도에 대한 결과는 하기 표, 및 도 7b 및 7c에 제시되어 있다.

결과:

B) 좌측 눈 및 우측 눈의 눈 용해물에서의 농도

눈 용해물에서의 농도에 대한 결과는 하기 표, 및 도 7d 및 7e에 제시되어 있다.

결과의 요약:

유리체내 적용 후, 본원에 보고된 이중특이적 항-VEGF/ANG2 항체인 VEGF/ANG2-0016(IHH-AAA 돌연변이를 가짐)은 IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않는 이중특이적 항-VEGF/ANG2 항체인 VEGF/ANG2-0015에 비해 눈 용해물에서 (96시간 및 168시간 후) 유사한 농도를 보인다.

또한, 유리체내 적용 후, 본원에 보고된 이중특이적 항-VEGF/ANG2 항체인 VEGF/ANG2-0016(IHH-AAA 돌연변이를 가짐)은 IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않는 이중특이적 항-VEGF/ANG2 항체인 VEGF/ANG2-0015에 비해 혈청에서 보다 더 빠른 제거 및 보다 더 짧은 반감기도 보인다.

실시예 7

마우스 각막 마이크로포켓 혈관신생 분석

각각 서열번호 20 및 서열번호 21의 VEGF 결합 VH 및 VL, 및 서열번호 28 및 서열번호 29의 ANG2 결합 VH 및 VL을 갖는 이중특이적 항-VEGF/ANG2 항체가 생체내에서 VEGF-유도된 혈관신생에 미치는 항-혈관신생 효과를 시험하기 위해, 마우스 각막 혈관신생 분석을 수행하였다. 이 분석에서, VEGF-함침된 나일라플로(Nylaflo) 디스크를 윤부 혈관으로부터 고정된 거리를 두고 무혈관 각막의 포켓 내로 이식한다. 혈관은 발생하는 VEGF 구배를 향하여 각막 내로 즉시 성장하였다. 8주령 내지 10주령의 암컷 Balb/c 마우스들을 찰스 리버(Charles River)(독일 슐츠펠트 소재)로부터 구입하였다. 프로토콜을 문헌(Rogers, M.S., et al., Nat. Protoc. 2 (2007) 2545-2550)에 기재된 방법에 따라 변형시킨다. 요약하건대, 마취된 마우스에서 수술용 칼 및 날카로운 집게를 이용하여 윤부부터 각막의 상부까지 약 1 mm에서 약 500 ㎛의 폭을 갖는 마이크로포켓을 현미경 하에 제조한다. 0.6 mm의 직경을 갖는 디스크(나일라플로^®, 팔 코포레이션(Pall Corporation), 미국 미시간주 소재)를 이식하고 이식 영역의 표면을 매끄럽게 하였다. 디스크를 30분 이상 동안 상응하는 성장인자 또는 비히클과 함께 항온처리한다. 3일, 5일 및 7일(또는 대안적으로 단지 3일, 5일 또는 7일) 후, 눈을 촬영하고 혈관 반응을 측정한다. 각막의 총 면적 당 신생 혈관의 면적의 백분율을 계산함으로써 분석을 정량한다.

디스크를 300 ng의 VEGF, 또는 대조군인 PBS로 적재하고 7일 동안 이식한다. 윤부부터 디스크까지 혈관의 과다성장을 3일째 날, 5일째 날 및/또는 7일째 날에 시간의 경과에 따라 모니터링한다. 디스크 이식 1일 전, 생체내에서 VEGF-유도된 혈관신생에 대한 항-혈관신생 효과를 시험하기 위해 항체를 10 mg/kg의 용량으로 정맥내로 투여하였다(정맥내 적용으로 인해, IHH-AAA 돌연변이에 의해서만 VEGF/ANG2-0016과 구별되고 효능을 매개하기 위해 동일한 VEGF 및 ANG2 결합 VH 및 VL을 갖는 혈청 안정성 VEGF/ANG2-0015(IHH-AAA 돌연변이를 갖지 않음)가 대용물로서 사용되었다). 대조군의 동물들은 비히클을 제공받았다. 적용 부피는 10 ㎖/kg이다.

실시예 8

HHY-AAA 돌연변이를 갖는 항체의 약동학적(PK) 성질

생활상:

파트 1:

IGF-1R 0033, IGF-1R 0035 또는 IGF-1R 0045의 적절한 용액(즉, 22.2 ㎍ 화합물/동물의 IGF-1R 0033, 24.4 ㎍ 화합물/동물의 IGF-1R 0035, 32.0 ㎍ 화합물/동물의 IGF-1R 및 32.0 ㎍ 화합물/동물의 IGF-1R 0045)을 모든 마우스들의 우측 눈 내로 1회 유리체내 주입하였다.

13마리의 마우스들을 각각 6마리 및 7마리의 동물들을 갖는 2개의 군으로 배정하였다. 투약 후 2시간, 24시간 및 96시간에서 군 1로부터 혈액 샘플을 채취하고 투약 후 7시간, 48시간 및 168시간에서 군 2로부터 혈액 샘플을 채취하였다.

나노리터 주입을 위한 나노필 마이크로시린지 시스템(월드 프리시전 인스트루먼츠 인코포레이티드, 독일 베를린 소재)을 이용하여 우측 마우스 눈의 유리체 내로의 주입을 수행하였다. 마우스들을 2.5% 이소플루란으로 마취하고 마우스 눈의 가시화를 위해 40배 확대율 및 고리-광을 갖는 레이카 MZFL 3 현미경을 레이카 KL 2500 LCD 전광과 함께 이용하였다. 그 후, 35-게이지 바늘을 이용하여 2 ㎕의 화합물을 주입하였다.

파트 2:

IGF-1R 0033, IGF-1R 0035 또는 IGF-1R 0045의 적절한 용액(즉, 22.2 ㎍ 화합물/동물의 IGF-1R 0033, 24.4 ㎍ 화합물/동물의 IGF-1R 0035, 32.0 ㎍ 화합물/동물의 IGF-1R 및 32.0 ㎍ 화합물/동물의 IGF-1R 0045)을 모든 마우스들에게 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 1회 주입하였다.

12마리의 마우스들을 각각 6마리의 동물들을 갖는 2개의 군으로 배정하였다. 투약 후 1시간, 24시간 및 96시간에서 군 1로부터 혈액 샘플을 채취하고 투약 후 7시간, 48시간 및 168시간에서 군 2로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 혈청 중의 화합물 수준을 측정하기 위해 각각의 동물로부터 안구뒤 정맥얼기를 통해 혈액을 채취하였다.

세포 용해 완충제의 제조

100 ㎕의 인자 1, 50 ㎕의 인자 2 및 24.73 ㎖의 세포 용해 완충제(모두 바이오-라드의 바이오-플렉스 세포 용해 키트, 카탈로그 번호 171-304011)를 조심스럽게 혼합하고 125 ㎕의 PMSF- 용액(2.0 ㎖ DMSO로 희석된 174.4 mg 페닐메틸설포닐플루오라이드)을 첨가한다.

전체 눈 용해물의 제조(마우스)

실험 동물의 전체 눈을 물리화학적으로 붕해시켜 눈 용해물을 획득하였다. 기계적 파괴를 위해, 각각의 눈을 원뿔형 바닥을 갖는 1.5 ㎖ 마이크로바이알 내로 옮겼다. 해동 후, 눈을 1 ㎖ 세포 세척 완충제(바이오-라드, 바이오-플렉스 세포 용해 키트, 카탈로그 번호 171-304011)로 1회 세척하였다. 하기 단계에서, 500 ㎕의 새로 제조된 세포 용해 완충제를 첨가하고 1.5 ㎖ 조직 분쇄 막자(브이더블유알 인터내셔날(VWR Int.), 제품 번호 431-0098)를 이용하여 눈을 분쇄하였다. 그 다음, 혼합물을 5회 동결하고 해동하고 다시 분쇄하였다. 남은 조직으로부터 용해물을 분리하기 위해, 샘플을 4,500xg에서 4분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상청액을 수집하고 정량 ELISA에서 추가 분석할 때까지 -20℃에서 저장하였다.

분석(혈청)

마우스 혈청 샘플에서 항체를 정량하기 위해, 포획 항체 및 검출 항체로서 사용된 바이오티닐화된 단일클론 항체 및 디곡시게닐화된 단일클론 항체를 사용한 표준 고체상 연속 샌드위치 면역분석을 수행한다. 혈청은 전체 혈액 샘플 부피의 약 50%를 차지한다.

보다 상세하게는, 마우스 혈청 샘플 중의 항체의 농도를 인간-IgG(Fab) 특이적 효소 연결된 면역흡착 분석으로 측정하였다. 스트렙타비딘으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 분석 완충제로 희석된 포획 항체인 바이오티닐화된 항-인간 Fab(카파) 단일클론 항체 M-1.7.10-IgG와 함께 교반하면서 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 포스페이트 완충 식염수-폴리소르베이트 20(트윈-20)으로 3회 세척한 후, 다양한 희석비의 혈청 샘플을 첨가한 후 실온에서 1시간 동안 두 번째 항온처리를 수행하였다. 3회 반복 세척 후, 결합된 항체를 디곡시게닌에 접합된 항-인간 Fab(CH1) 단일클론 항체 M-1.19.31-IgG에 이어서 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP)에 접합된 항-디곡시게닌 항체와의 후속 항온처리로 검출하였다. ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산); 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 만하임 소재)를 HRP 기질로서 사용하여 착색된 반응 생성물을 형성하였다. 생성된 반응 생성물의 흡광도를 405 nm에서 판독하였다(ABTS; 기준 파장: 490 nm).

모든 샘플들, 양성 대조군 샘플 및 음성 대조군 샘플을 반복 분석하고 제공된 항체 표준물에 대해 보정하였다.

분석(눈 용해물)

비-GLP 조건 하에 엘렉시스(ELECSYS)^® 기계 플랫폼(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 만하임 소재)에 기초한 조건부 전기-화학발광 면역분석(ECLIA) 방법을 이용하여 마우스 눈 용해물 샘플에서 분석물의 농도를 측정하였다.

희석되지 않은 상청액(눈 용해물)을 37℃에서 9분 동안 포획 및 검출 분자와 함께 항온처리하였다. 바이오티닐화된 항-인간-Fab(카파) 단일클론 항체 M-1.7.10-IgG를 포획 분자로서 사용하였고, 루테늄(II)트라이스(비스피리딜)₃ ²⁺로 표지된 항-인간-Fab(CH1) 단일클론 항체 M-1.19.31-IgG를 검출을 위해 사용하였다. 스트렙타비딘으로 코팅된 자성 마이크로입자를 첨가하고 37℃에서 추가 9분 동안 항온처리하여 미리 형성된 면역 복합체가 바이오틴-스트렙타비딘 상호작용으로 인해 결합되게 하였다. 마이크로입자를 전극 상에서 자기적으로 포획하였고, 보조반응물 트라이프로필 아민(TPA)를 사용하여 화학발광 신호를 생성하였다. 획득된 신호를 광전증배관 검출기로 측정하였다.

결과:

A) 혈청 농도

혈청 농도에 대한 결과는 하기 표 및 도 17에 제시되어 있다.

결과:

B) 좌측 눈 및 우측 눈의 눈 용해물에서의 농도

눈 용해물에서의 농도에 대한 결과는 하기 표 및 도 18 내지 20에 제시되어 있다.

결과의 요약

유리체내 적용 후, 본원에 보고된 항-IGF-1R 항체 0035 및 0045(한쪽 또는 양쪽에서 HHY-AAA 돌연변이를 가짐)는 HHY-AAA 돌연변이를 갖지 않는 항-IGF-1R 항체(IGF-1R 0033)에 비해 눈 용해물에서 (96시간 및 168시간 후) 유사한 농도를 보인다.

또한, 유리체내 적용 후, 본원에 항-IGF-1R 항체 0035 및 0045(한쪽 또는 양쪽에서 HHY-AAA 돌연변이를 가짐)는 HHY-AAA 돌연변이를 갖지 않는 항-IGF-1R 항체(IGF-1R 0033)에 비해 혈청에서 보다 더 빠른 제거 및 보다 더 짧은 반감기도 보인다.

상기 발명이 명확한 이해를 목적으로 설명 및 예에 의해 다소 상세히 기재되어 있지만, 설명 및 예는 본원에 보고된 범위를 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학 문헌들의 개시내용은 전체적으로 명확히 참고로 도입된다.

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> FC-REGION VARIANTS WITH MODIFIED FCRN-BINDING PROPERTIES <130> 31952 <140> PCT/EP2015/050425 <141> 2015-01-12 <150> EP14151319.2 <151> 2014-01-15 <150> EP14165922.7 <151> 2014-04-25 <160> 112 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 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<VEGF-ANG-2> OAscFab IgG4 with AAA mutations and with SPLE mutations <400> 50 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val 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polypeptide with S354C, T366W mutations <400> 66 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 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P329G mutation <400> 70 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 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P329G mutations and S354C, T366W mutations <400> 74 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 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108 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain 1 of <VEGF-ANG-2> OAscFab IgG1 with AAA mutations <400> 108 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 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10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val 195 200 205 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 210 215 220 Tyr Gly Pro 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Claims

하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는, 면역글로불린 힌지(hinge) 영역의 적어도 일부, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 각각 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드로서,
이때, i) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A를 포함하거나,
ii) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L251D, L314D 및 L432D를 포함하거나,
iii) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L251S, L314S 및 L432S를 포함하는,
폴리펩티드.
제1항에 있어서,
폴리펩티드가 인간 FcRn에 특이적으로 결합하지 않고 스타필로코커스(Staphylococcal) 단백질 A에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 또는 제2항에 있어서,
폴리펩티드가 동종이량체성 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 또는 제2항에 있어서,
폴리펩티드가 이종이량체성 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
i) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 추가로 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 S354C 및 T366W를 포함하거나, ii) 제1 폴리펩티드가 돌연변이 S354C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함하고 제2 폴리펩티드가 돌연변이 Y349C 및 T366W를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인이 인간 IgG1 서브클래스의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 L234A 및 L235A를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인이 인간 IgG2 서브클래스의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인이 인간 IgG4 서브클래스의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제5항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 S228P 및 L235E를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 돌연변이 P329G를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리펩티드가 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
유리체내 적용을 위한 폴리펩티드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
혈관 눈 질환의 치료를 위한 폴리펩티드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 임의적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제형.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
눈 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
혈액-눈-장벽을 가로질러 가용성 수용체 리간드를 눈으로부터 혈액 순환계 내로 수송하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 눈으로부터 제거하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드.