KR20160098838A - 차세대염기서열분석기술 기반의 고효율, 고해상도 조직적합성 형별 분석 방법 및 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 차세대염기서열분석기술 (Next Generation Sequencing,NGS)을 이용하여 HLA-A, B, DRB1 대립유전자 형별을 고해상도 분석으로 동시에 검사할 수 있는 방법 및 키트에 관한 것이다.

Description

차세대염기서열분석기술 기반의 고효율, 고해상도 조직적합성 형별 분석 방법 및 키트{Method and kit for NGS-based high efficiency, high resolution HLA typing}
본 발명은 차세대염기서열분석기술 (Next Generation Sequencing, NGS)을 이용하여 HLA-A, B, DRB1 대립유전자 형별을 고해상도 분석으로 동시에 검사할 수 있는 방법 및 키트에 관한 것이다.
사람 백혈구 항원(Human Leukocyte Antigen, HLA)은 조혈모세포(골수) 및 장기 등의 이식 시 거부 반응을 일으키는 주요 인자를 생성하는 면역 반응 조절 유전자로, 조직적합항원으로도 알려져 있다. 타인의 골수 세포나 바이러스 등 외래 물질이 신체에 들어올 경우 사람의 신체는 자신을 보호하기 위하여 이를 제거하기 위한 행동을 취하게 되며, 이때, 그 물질이 자기 자신과 같은 것인지 여부의 판단에서 중요한 역할을 하는 것이 HLA이다.
골수나 장기 이식 시 성공률을 높이기 위해서는 환자와 공여자의 HLA 형별이 일치되어야 하고, 만약 HLA가 불일치할 경우는 이식된 조혈모세포가 환자로부터 이물질로 간주되어 공격을 당하는 거부 반응이 일어나거나 또는 반대로 공여자의 T-림프구가 환자를 이물질로 간주하고 환자를 공격하는 이식편대숙주 질환이 발생하여 피부 질환, 설사, 간 기능 이상 등의 증상이 유발되고 심할 경우는 사망을 초래할 수 있다. 두 경우 모두 조혈모세포나 장기 이식을 실패로 만드는 요인이기 때문에 장기 및 조혈모세포 이식 전에 HLA 검사는 환자의 생명과도 직결되는 중요한 필수적인 검사로 시행되고 있다.
현재 시행되고 있는 HLA 검사 방법으로는 검사의 해상도(resolution)에 따라 저해상도(low resolution), 중해상도(middle resolution), 고해상도(high resolution)로 분류된다.
저해상도 분석인 혈청학적 방법은 고도의 숙련된 기술과 경험이 요구되며, DNA 검사법들과 비교하여 불일치하는 결과가 보고되면서, 점차 소규모 검사실에서도 쉽게 수행할 수 있는 DNA 검사법이 기존의 혈청학적 검사 방법을 급속히 대체하고 있다.
중해상도 분석을 위해 이용되는 SSOP(sequence specific oligonucleotide probe) 방법은 PCR 증폭 후에 스트립에 고정된 프로브와의 혼성화 반응 양상을 토대로 결과를 판정하는 방법이다. SSOP 방법은 혈청학적 검사법에서 흔히 보이는 교차 반응 및 약한 반응성 등으로 인해 모호한 결과가 보이는 현상이 적어 판독이 다소 용이하다는 점과 많은 양의 검체를 동시에 처리할 수 있는 장점이 있으나, PCR 후에 혼성화 과정을 거치므로 시간이 다소 걸린다는 점과 양성 밴드 판정에 있어 애매한 경우가 간혹 발생한다는 단점이 있다.
중해상도 분석을 위해 이용되는 PCR-SSP(Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primer) 기법은 PCR 프라이머의 염기서열 차이를 이용하여 유전자를 선택적으로 증폭하며, PCR 프라이머 세트의 수를 조절하여 원하는 수준의 형별을 판정하는 기법이다. PCR-SSP 기법은 PCR 과정에서 특정 대립유전자군만 증폭하여 그 결과를 판정하기 때문에 PCR 이후 전기영동을 통해 바로 결과를 확인할 수 있다는 장점이 있는 반면 다수의 검체를 동시에 검사하기가 어렵다는 단점이 있다.
고해상도 방법으로 이용되는 SBT(sequence-based typing) 방법은 새로운 형별 분석을 위한 가장 우수한 방법이며, HLA 형별 수의 급격한 증가에 기여한 방법이기도 하다. 그러나, 대립유전자의 변이부분이 시스(cis)형인지 트랜스(trans)형인지를 구별하지 못하는 위상 모호성(phase ambiguity) 문제가 있고, 시간과 노동력, 비용이 많이 드는 단점이 있다.
저해상도 형별분석에 기반한 이식 성적이 좋지 않다는 보고가 누적되면서 고해상도 분석 필요성에 대한 공감대가 형성되고 있고, 비혈연 조혈모세포이식의 경우에는 혈청학적 수준에서 HLA 형별이 일치하여도 고해상도 수준에서 불일치하면 거부반응, 급성 이식편대숙주병, 사망률 등이 높아진다는 연구 결과가 보고되었다(N Engl J Med 1998;92:3515-20).
따라서, HLA 고해상도 분석법의 사용의 중요성이 증대되고 있고, 현재 국제 표준 HLA 고해상도 분석 기술인 SBT (sequence-based typing) 분석법의 이용이 요구되고 있다. 그러나, 높은 비용, 낮은 처리량, 내재적 한계인 위상 모호성 등의 단점이 있어서, 대량 HLA 분석 검출이 요구되는 조혈모세포 지원자 등록 데이터베이스를 위한 적용에는 한계가 있다.
2009년 이후 NGS 기기를 이용한 HLA 형별 분석에 대한 활발한 연구가 진행되고 있으며, 기존 고해상도 방법인 SBT(sequence-based typing)를 사용한 결과에 비해 현저히 모호성이 줄어든 결과가 보고되고 있다 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 May 29;109(22):8676-81). 그러나, 아직까지는 NGS 기기를 이용한 서열분석(sequencing) 비용이 상대적으로 높기 때문에 서열분석 처리량과 비용 면에서 기존 SBT에 기초한 HLA 분석 방법에 비해 NGS 기반 방법이 현저히 우수한 것으로 인정될 수 없으며, 또한, 특정 NGS 기기에 의존적이라는 단점이 있다. HLA 고해상도 분석법의 내재적 한계인 위상 모호성의 문제를 근원적으로 해결하고 낮은 비용으로 대량 샘플 처리가 용이한 HLA 고해상도 검사법의 개발이 여전히 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 NGS에 기반한 HLA 고해상도 분석방법을 이용하여, 다량의 샘플을 효율적으로 분석할 수 있는 방법에 대한 연구를 수행하여, 다중 PCR과 Fusion PCR의 조합에 의한 NGS용 라이브러리 제작을 통해 비용 및 시간을 단축하고, 특정 NGS 기기에 대한 의존성을 해소할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 차세대염기서열분석기술 (NGS)을 이용하여 HLA-A, B, 및 DRB1 대립유전자 형별을 고해상도 분석으로 동시에 검사할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, NGS를 이용하여 HLA-A, B, 및 DRB1 대립유전자 형별을 고해상도 분석으로 동시에 검사하기 위해 이용될 수 있는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, NGS를 위한 라이브러리 제작을 위해 유용하게 이용될 수 있는 범용 프라이머를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 양태는 차세대 염기서열분석(NGS)을 이용하여 고해상도 조직적합성(HLA) 형별 분석을 수행하는 방법으로서,
샘플 중 HLA-A, B, 및 DRB1의 엑손 영역을 증폭시켜 표적 PCR 산물을 수득하는 단계,
수득된 표적 PCR 산물을 주형으로 이용하고, 서열분석용 유니버설 프라이머 서열, 샘플 식별용 바코드 서열 및 어댑터 서열을 포함하는 바코딩 프라이머를 이용한 융합(Fusion) PCR을 수행하여 NGS용 어댑터 및 샘플 식별용 바코드가 결합된 바코딩된 PCR 산물을 수득하는 단계,
바코딩된 PCR 산물을 대상으로 NGS를 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "차세대염기서열분석(Next Generation Sequencing, NGS)"은 서열을 단편화하여 신속하고 정확하게 서열을 읽어내는 기술로서, Sanger 방식과 달리 대량의 병렬 데이터 생산을 통해 유전체 해독에 소요되는 비용과 시간을 획기적으로 줄이며, 현재 유전체 해독에 가장 많이 활용되고 있는 기술을 의미한다. NGS에서는 기종에 따라 약간의 차이는 있지만 기본적으로 DNA 서열을 증폭하고 그 후 형광 표식 등을 카메라로 찍어 이미지 처리를 하는 과정을 거쳐 염기를 읽어낸다. PCR 증폭 방식에 따라서 로슈 (Roche, 454)와 라이프 테크놀로지스 (Life Technologies)의 기종들은 emulsion PCR (emPCR) 방식으로, 일루미나 (Illumina)의 기종들은 solid-phase amplification을 사용하는 것으로 나눌 수 있다(Michael, L.. Metzker. (2010) Sequencing technologies-the next generation. Nature Reviews Genetics. 11, 31-46).
본 명세서에서 사용되는 용어 "고해상도 HLA 형별 분석"은 SBT(sequence based typing)에 의한 HLA 형별을 결정하는 방법, 보다 구체적으로, NGS에 기반한 HLA 형별 분석을 의미한다. 혈청학적 분석인 저해상도나 SSOP 또는 PCR-SSP에 의한 중해상도 분석에 비해 보다 구체적으로, HLA 유전자의 하위 분류군의 아형까지 HLA 형별을 결정할 수 있다. 예를 들면, 고해상도 HLA 형별은 HLA-A*02:06:01, HLA-A*26:02:01 등을 의미하고, 중해상도 HLA 형별은 HLA-A*02:06, HLA-A*26:02 등을 의미하며, 저해상도 HLA 형별은 HLA-A*01, HLA-A*02 등을 의미한다.
조혈모세포 이식 시 거부반응, 이식편대숙주 질환 등을 방지하기 위해서는 고해상도 HLA 형별 분석이 요구된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "서열분석용 유니버설 서열" 또는 "서열분석용 유니버설 프라이머 서열"은 NGS 기기의 종류에 관계없이 서열분석(sequencing)을 위해 범용적으로 이용되는 프라이머 서열을 의미한다. 예를 들면, SP1 및 SP2를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "샘플 식별용 바코드(barcode)"는 다수의 샘플을 동시에 분석하는 경우, 각 샘플을 식별하기 위해 샘플에 연결 또는 결합시키는 서열로서, 필요에 따라 적절한 개수의 뉴클레오티드로 이루어진 길이일 수 있다. 바코드 서열을 샘플에 결합시키면, 샘플 간의 식별이 가능하므로 샘플을 통합(pool)하여 동시에 분석할 수 있어 시간과 비용, 및 노동을 단축할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 NGS용 "어댑터(adapter)"는 NGS 기기에서의 분석을 위해 서열결정용 칩이나 마이크로입자에 분석 대상 DNA를 고정 또는 결합시키는 서열 및 서열분석용 유니버설 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "바코딩(barcoding) 프라이머"는 샘플 식별용 바코드 서열을 포함하는 프라이머를 의미한다. 바코딩 프라이머는 샘플 식별용 바코드 서열 외에, 서열분석용 유니버설 프라이머 서열 및 사용할 NGS 기기에 적합한 어댑터 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "어댑터 프라이머"는 NGS 기기에 적합한 어댑터를 NGS 분석 대상 DNA에 결합시키기 위해 이용되는 프라이머를 의미하며, 어댑터 서열과 유니버설 프라이머 서열로 구성된다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "표적(target) PCR"은 DNA 상의 표적으로 하는 영역에 특이적인 프라이머 쌍을 이용하여 표적 영역을 증폭시키는 PCR을 의미하며, NGS용 어댑터가 연결 가능한 유니버설 프라이머 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "Fusion PCR" 또는 "융합 PCR"은 NGS용 어댑터 및 바코드 서열을 표적 영역을 증폭시켜 수득된 PCR 산물에 결합 또는 연결시키기 위해 수행되는 PCR을 의미한다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 고해상된 HLA 형별 분석에서 분석 대상인 HLA 클래스 I에 속하는 HLA-A 및 HLA-B와 클래스 II에 속하는 HLA-DRB1의 유전자의 개략도와 함께, PCR에 의해 증폭되는 표적 영역(target region)을 보여준다.
HLA 유전자는 변이가 가장 많은 유전자 중 하나로 알려져 있으며, 자기와 비자기를 구별하는 중요한 기능 때문에 장기 및 조혈모이식에 있어서, HLA 형별 분석은 필수적이 검사로 시행되고 있다. 특히, 비혈연 조혈모세포나 장기 이식의 경우 고해상도 HLA 형별 분석이 요구된다. 현재까지 알려진 형별 수는 HLA-A가 2,946개, HLA-B가 3,693개, 및 DRB1은 1,582개로 매우 많다(2014년 10월 기준, IMGT/HLA Database, Release 3.18.0). 따라서, HLA 형별 분석을 위해 염기서열이 상이한 형별을 모두 증폭할 수 있고, 비 특이 증폭을 초래하지 않는 프라이머를 디자인하는 것이 중요하다. 또한, 다중 PCR을 수행할 수 있도록 프라이머 디자인시 어닐링 온도를 고려할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DRB1의 엑손 영역을 증폭시켜 PCR 산물을 수득하는 단계는 다중 PCR로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DRB1의 엑손 영역을 증폭시켜 PCR 산물을 수득하는 단계는 서열번호 1 내지 6의 HLA-A 증폭용 프라이머, 서열번호 7 내지 12의 HLA-B 증폭용 프라이머, 및 서열번호 13 및 14의 HLA-DR 증폭용 프라이머로 구성된 군으로부터 선택된 프라이머의 조합을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 서열번호 1 내지 14의 프라이머는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 표적 영역에 존재하는 모든 대립 형질을 증폭할 수 있도록 보존성이 높은 염기 서열 부위를 선택하고, 하나의 위치에 2개 이상의 염기를 갖는 축퇴성(degenerate) 부위를 갖도록 디자인된 것이다. 예를 들면, 서열번호 13은 6개의 축퇴성 부위를 갖는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 다중 PCR은 HLA-A의 엑손 2, 3, 4, HLA-B의 엑손 2, 3, 4, 및 HLA-DRB1의 엑손 2를 증폭시킬 수 있다.
각각의 표적 영역, HLA-A 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, HLA-B 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4 , 및 HLA-DRB1의 엑손 2를 개별적인 PCR로 증폭시킬 수 있으나, 시간 및 노동력을 줄이기 위해 이들을 다중 PCR로 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 다중 PCR은 HLA-A-엑손 4, HLA-B-엑손 2, HLA-B-엑손 4를 하나의 PCR 반응에서 증폭시키고, HLA-A-엑손 2, HLA-A-엑손 3, HLA-B 엑손 3, 및 HLA-DRB1-엑손 2를 하나의 PCR 반응에서 증폭시켜 2개의 다중 PCR 반응으로 수행할 수 있다.
다중 PCR 반응에서 특정한 표적에 편향되어 수행되지 않도록 하기 위해 각 표적에 대한 프라이머의 비율을 조정할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 HLA-A-엑손 4, HLA-B-엑손 2, HLA-B-엑손 4의 다중 PCR은 HLA-A-엑손 4, HLA-B-엑손 2, HLA-B-엑손 4의 프라이머를 3:3:1로 혼합한 조건에서 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 HLA-A-엑손 2, HLA-A-엑손 3, HLA-B-엑손 3, HLA-DRB1-엑손 2의 다중 PCR은 HLA-A-엑손 2, HLA-A-엑손 3, HLA-B-엑손 3, HLA-DRB1-엑손 2 프라이머를 1:1:1:1.5의 비율로 혼합한 조건에서 수행할 수 있다.
표적 PCR에서 증폭 산물이 동일한 비율로 생성되면, Fusion PCR 후 NGS 전에 정량 단계에서 각 산물의 양을 동일하게 맞춰주기 위한 희석 등이 간소화되거나 제거될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 표적 PCR용 프라이머는 샘플 식별 바코드 염기서열이 포함된 어댑터가 연결 가능하도록 유니버설(universal) 서열을 공통적으로 포함할 수 있다.
상기 샘플 식별용 바코드 서열 및 유니버설 서열은 NGS 기기 특성에 맞게 설계할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 샘플 식별용 바코드 서열은 서열번호 15 내지 110 중 하나일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 유니버설 서열은 서열번호 111 또는 112일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 표적 PCR 후 수득된 PCR 산물을 주형으로 이용하고, 서열분석용 유니버설 서열, 샘플 식별용 바코드 서열, 및 어댑터 서열을 포함하는 바코딩 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 NGS용 어댑터 및 샘플 식별용 바코드가 결합된 바코딩된 PCR 산물을 수득하는 단계는 서열번호 115 내지 210의 바코딩 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택된 바코딩 프라이머와 서열번호 211의 어댑터 프라이머를 이용하여 수행될 수 있다.
NGS에 의한 샘플 분석을 위해, NGS용 어댑터 및 복수 샘플의 분석을 위한 샘플 식별용 바코드를 결합시켜 샘플을 준비한다.
바코드 서열은 각 샘플을 식별하는 표지로 작용하므로, 바코딩된 다수의 샘플을 통합하여 동시에 분석할 수 있다.
바코드 서열을 포함하는 어댑터를 샘플에 라이게이션하는 상업용 키트를 이용한 기존의 NGS용 바코딩 방법과 달리, 본 발명의 방법은 분석 대상 영역과 NGS 용 어댑터 서열이 연결가능한 유니버설 서열이 결합된 표적 PCR 산물을 수득한 후, 이 산물에 어댑터 서열 및 바코드 서열을 포함하는 바코딩 프라이머에 의한 Fusion PCR을 수행하여, 표적 PCR 산물에 NGS용 어댑터와 샘플 식별용 바코드를 결합시킨다. 현재 시판되는 NGS 기기별로 고유한 어댑터가 요구되나, 본 발명은 NGS 기기에서 요구되는 어댑터 서열을 표적 PCR 산물에 연결함으로써 사용하고자 하는 NGS 기기에 적합한 서열분석용 산물을 수득할 수 있다.
따라서 특정 NGS 기기나 이를 위한 키트에 의존하지 않으면서 필요에 따라 바코드 서열의 종류를 증가시켜 동시에 분석할 수 있는 샘플의 수를 증가시킬 수 있다.
또한, Fusion PCR 에 의한 바코드 연결 방법은 라이게이션에 의한 바코드 연결 시 수행되어야 하는 타겟 산물 말단수복(end-repair) 과정, A-테일 생성(A-tailing 과정), 효소에 의한 바코드 라이게이션 과정, 정제 과정, 및 산물을 증폭하기 위한 PCR 과정이 생략될 수 있어서, 시간 및 비용을 절감하고, 단계가 적어 오류율이 낮다는 장점을 갖는다.
따라서, 본 발명의 일 구체예에 따른 방법은 어댑터 및 바코드 서열을 프라이머로 이용한 Fusion PCR에 의해 분석 대상 DNA에 결합시키는 것에 의해 라이게이션에 의한 방법에 비해 낮은 비용 및 높은 자유도로 고해상도 HLA 형별 분석을 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, NGS에 의한 서열 분석은 Illumina사의 MiSeq, NextSeq 500, Hiseq 2000, Hiseq 2500, Hiseq 3000, Hiseq 4000, Roche사의 454 FLX Titanium, GS Junior, Life Technologies 사의 Ion Torrent PGM, Ion Proton, SOLiD3, SOLiD4 등을 이용하여 수행될 수 있다. 각 NGS 장비에 적합한 어댑터 및 바코드를 포함하는 프라이머를 디자인하거나 선택하여 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 차세대 염기서열분석을 이용하여, 고해상도 조직접합성 형별 분석을 수행하는 방법은 NGS를 수행하여 서열을 결정한 후, 그에 근거하여 HLA 형별을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, NGS에 의해 결정된 서열에 근거하여 HLA 형별을 결정하는 단계는 소프트웨어를 이용하여 수행될 수 있다(Omixon Target HLA Typing 프로그램: http://www.omixon.com/hla/).
본 발명의 일 양태는 서열번호 1 내지 6의 HLA-A 증폭용 프라이머, 서열번호 7 내지 12의 HLA-B 증폭용 프라이머, 및 서열번호 13 및 14의 HLA-DRB1 증폭용 프라이머 및 서열번호 115 내지 210의 바코딩 프라이머와 서열번호 211의 어댑터 프라이머를 포함하는, NGS를 이용한 고해상도 조직적합성(HLA) 형별 분석용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 키트는 사용되는 NGS 기기에 적합한 어댑터를 바코드 서열과 결합한 바코딩 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 키트는 다수의 샘플을 대하여 고해상도 HLA 형별 분석을 동시에 수행하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 시약들을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 서열분석용 유니버설 프라이머 서열과 샘플 식별용 바코드 서열을 포함하는, 차세대 염기서열분석(NGS)을 위한 라이브러리 제작에 이용되는 프라이머를 제공한다.
상기 프라이머는 NGS 기기에 의한 제한 없이, NGS를 위한 라이브러리를 제작하기 위해, 샘플에 서열분석용 유니버설 프라이머 서열과 샘플 식별용 바코드 서열을 PCR에 의해 결합시키기 위해 이용될 수 있다. 상기 프라이머는 HLA 형별 분석 외에 target-resequencing 기법에도 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 서열분석용 유니버설 프라이머 서열은 서열번호 111 또는 112일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 통상적으로 서열분석을 위해 이용되는 프라이머가 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 샘플 식별용 바코드 서열은 서열번호 15 내지 110 중 하나 이상일 수 있다.
샘플 식별용 바코드 서열은 동시에 분석되어야 하는 샘플의 수를 고려하여 설계될 수 있고, 길이는 그 샘플 수에 따라, 4 내지 20 bp, 또는 그 이상일 수 있다. 바코딩에 의해 복수 개의 샘플, 예를 들면, 96개 또는 그 이상을 동시에 분석할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 프라이머는 사용되는 NGS 기기에 따른 어댑터 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 어댑터 서열은 Miseq에 적합한 서열번호 113 또는 114일 수 있다.
이하에서 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따른 차세대염기서열분석기술 (NGS)을 이용한 고해상도 HLA-A, B, DRB1 대립유전자 형별 분석 방법은 기존 HLA 고해상도 분석 방법인 SBT(sequence-based typing)의 문제점을 해결하고, 기술적 편의성을 고려하여, 고해상도 및 저비용으로 위상 모호성(phase-ambiguity)이 없는 정확한 결과 분석을 가능하게 하므로, 이식 전 검사로 사용되기에 적합하며, 또한 대량 HLA 분석 검출이 요구되는 조혈모 세포 지원자 등록 데이터베이스를 위한 적용에도 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 HLA 형별 분석을 위해 분석되는 HLA 클래스 I 및 클래스 II 유전자의 구조를 보여준다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 HLA 형별 분석을 위한 표적 PCR 및 어댑터와 바코드를 결합시키는 PCR(fusion PCR)을 보여주는 개략도이다. 도 2a는 표적 서열의 양 말단에 바코드를 결합시키는 PCR, 도 2b는 표적 서열의 한쪽 말단에만 바코드를 결합시키는 PCR을 보여준다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 HLA 형별 분석을 위한 표적 PCR 산물 및 어댑터와 바코드를 결합시키는 PCR(fusion PCR) 산물과 이를 위해 이용되는 프라이머의 구조를 보여주는 개략도이다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 다중 표적 PCR에서 HLA-A의 엑손 2, 3, 4, HLA-B의 엑손 2, 3, 4, 및 HLA-DRB1의 엑손 2를 증폭한 결과를 보여준다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 다중 표적 PCR의 산물을 풀링(pooling)한 후 수행된 Fusion PCR 결과를 보여준다.
실시예 1. HLA -A, HLA -B, HLA - DRB1 특이적 프라이머의 제작
HLA 형별 분석을 위해 고안된 프라이머들은 IMGT/HLA Database, Release v.3.18.0 (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/, October 2014) 염기서열을 기준으로, HLA class I에서 A, B를, HLA class II에서는 DRB1 부분의 형별 분석이 가능하고, 수천개의 형별(allele)의 증폭이 가능하도록 개발되었다.
도 1은 HLA 클래스 I 및 II의 유전자 구조 및 HLA 형별 분석을 위한 표적 영역을 도시한다.
현재까지 알려진 HLA 형별(allele)은 HLA-A가 2,946개, HLA-B가 3,693개, DRB1은 1,582개로 매우 다양하다(2014년 10월 기준).
따라서, 고해상도 HLA 형별 분석을 위해서는 염기서열이 상이한 형별 모두 증폭이 가능하며, 비 특이 증폭을 초래하지 않는 프라이머를 디자인하는 것이 중요하다. 모든 형별의 염기서열을 정렬(alignment)하여 염기 서열의 변이부분이 모두 적용되고, PCR 온도 조건을 일원화할 수 있도록 프라이머의 길이 및 Tm(Melting Temperature) 조건을 확립하였다. 또한, 모든 표적 증폭용 프라이머에는 샘플 식별용 바코드 염기 서열이 포함된 어댑터를 후속 PCR에서 연결 가능하도록 유니버설(universal) 염기 서열을 공통적으로 붙여주었다.
본 실시예는 Illumina Miseq 서열화 기술에 기초한 고해상도 HLA 형별 분석에 이용할 수 있는 프라이머를 제공하나, 개인식별 바코드 및 유니버설(universal) 염기서열을 기기 특성에 맞게 염기 서열이 수정 가능하도록 고안되어 기기에 한정되지 않는다.
본 실시예에서 신규 고안된 프라이머들은 HLA-A, B 유전자의 엑손(Exon) 2, 3, 4, 및 HLA-DRB1 유전자의 엑손 2를 독립적으로 증폭시키며, 그의 PCR 생성물들의 길이는 550bp 미만(NGS 기기 특이적인 바코드 어댑터 염기서열 길이에 따라 줄어들 수 있음), 다중(multiplex) PCR이 가능하도록 프라이머들의 어닐링 온도를 고려하여 제작하였다.
HLA는 사람에게서 발견되는 가장 다형성이 큰 유전자이므로, HLA-A, B, DRB1 각각의 특이적인 증폭, 및 그들의 모든 형별, 즉, 대립 유전자의 증폭이 가능하도록 보존성이 높은 염기서열 부위를 선택하고, 하나의 위치에 2개 이상의 염기를 갖는 축퇴성(degenerate) 코돈을 이용하여 프라이머를 디자인하였다.
본 실시예에서 제작된 HLA-A, B의 엑손 2, 3, 4 및 HLA-DRB1의 엑손 2를 증폭하기 위한 프라이머 서열은 하기의 표 1에 표시된다.
서열 번호 프라이머 명칭 프라이머 서열(5'말단 -> 3'말단) 프라이머
용도		 생성물 길이
1 HL-A-E2-F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTCTGYGGGGAGAAGCAA HLA-A 유전자의
엑손 2 증폭		 524bp
2 HL-A-E2-R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTCGGACCCGGAGACTG
3 HL-A-E3-F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACYGGGCTGACCKYGGG HLA-A 유전자의
엑손 3 증폭		 414bp
4 HL-A-E3-R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGAYCTAYAGGCGATCAGG
5 HL-A-E4-F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCCTGAATKWTCTGACTCTTCC HLA-A 유전자의
엑손 4 증폭		 446bp
6 HL-A-E4-R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCCTGACCCTGCTAAAGGT
7 HL-B-E2-F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGAGMRAGGGGACCGCAGG HLA-B 유전자의
엑손 2 증폭		 425bp
8 HL-B-E2-R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGKCCTCGCTCTGGTTGTAGT
9 HL-B-E3-F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTKRGGCCAGGGTCTCACA HLA-B 유전자의
엑손 3 증폭		 403bp
10 HL-B-E3-R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATCCCSGGCGAYCTATAG
11 HL-B-E4-F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCGCCTGAATTTTCTGACTCTT HLA-B 유전자의
엑손 4 증폭		 415bp
12 HL-B-E4-R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGATATGACCCCTCATCCC
13 HL-DR-E2-F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCYGGATSSTTYKTGYCCCC HLA-DRB1 유전자의 엑손 2 증폭 356bp
14 HL-DR-E2-R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGCTGCACYGTGAAGCT
프라이머 중 축퇴성(degenerate) 부위:R=A/G, Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, W=A/T, H=A/C/T, B=C/G/T, V=A/C/G, D=A/G/T, N=A/C/G/T.
표 1에서 밑줄 친 부분은 서열분석용 유니버설 서열을 나타낸다.
실시예 2. 다중 PCR ( multiplex PCR )을 이용한 HLA -A, HLA -B, HLA - DRB1 유전자 증폭
고해상도 HLA 형별 분석을 위해 HLA-A, B, 및 DRB1의 모든 가능한 형별을 증폭시킬 수 있도록 실시예 1에서 설계된 프라이머를 이용하여 표적 PCR를 수행했다. PCR은 각각의 표적 영역별로 별개로 수행될 수 있으나, 본 실시예에서는 분석 시간 단축, 비용 절감 및 분석의 용이성을 위해 복수의 표적을 동시에 증폭시키는 다중 PCR 방법을 이용했다. 실시예 1에서 제작된 각 표적 영역의 증폭을 위한 프라이머는 어닐링 온도 및 PCR 조건을 통합할 수 있도록 설계되었으므로, 다중 PCR을 수행할 수 있다.
96개의 혈액 샘플에서 DNA를 추출하고 각각의 샘플을 바코드 01 내지 96으로 명명하였다. 표적 PCR 반응은 총 2개의 96 웰 플레이트, 플레이트 1 및 2에서 수행하고, 각각의 96 플레이트에는 HLA-A, B의 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4 및 DRB1의 엑손 2가 증폭 가능하도록 혼합된 프라이머를 주입하였다.
96 웰 플레이트 1에는 HLA-A-엑손 4, HLA-B-엑손 2, HLA-B-엑손 4의 프라이머 10 μM을 3:3:1로 혼합된 비율로 주입하고, 96 웰 플레이트 2에는 HLA-A-엑손 2, HLA-A-엑손 3, HLA-B-엑손 3, HLA-DRB1-엑손 2 프라이머 비율이 1:1:1:1.5의 비율로 혼합하여 주입하였다.
표적 영역을 증폭시키는 PCR에 의해 수득된 산물에 NGS 용 어댑터 및 샘플 식별용 바코드 서열을 결합시키는 PCR을 통해 NGS를 위한 라이브러리를 제작하고, 그 후, NGS에 의해 서열을 분석한다. NGS를 위한 라이브러리 제작시, 표적 영역의 양은 동일하거나 유사해야 모든 표적 영역에 대한 NGS 결과를 동일한 정확도로 얻을 수 있으므로 각 표적 영역의 정량이 요구된다. 이러한 정량 단계의 단순화를 위해, 모든 표적 영역, 즉, HLA-A-엑손 4(AE4), HLA-B-엑손 2(BE2), HLA-B-엑손 4(BE4), HLA-A-엑손 2(AE2), HLA-A-엑손 3(AE3), HLA-B-엑손 3(BE3), HLA-DRB1-엑손 2(DRB1E2)의 증폭 산물의 비율이 거의 동일하도록 하기 위해, 표적 영역의 증폭을 위한 PCR에서 프라이머 쌍의 비율을 조정했다.
2개의 96 웰 플레이트에 중합반응 완충용액, DNA 중합 효소를 주입하고, 프라이머 1.5 ㎕및 샘플 DNA 1 ㎕를 각각의 96 웰 플레이트 해당 위치에 넣어 중합효소연쇄반응 기기를 이용한 증폭 과정을 수행하였다.
dNTP 0.2 mM, 베타인 0.3M, 1X Phusion buffer를 포함하는 중합반응 완충용액을 사용하고, DNA 중합효소로 Phusion Hot Start Ⅱ High-Fidelity DNA polymerase 0.2 unit (Themo Scientific)을 사용하였다.
중합 효소 연쇄반응 조건은 98℃에서 30초간 1회, 98℃에서 1분, 60℃에서 30초, 및 72℃에서 30초로 이루어진 사이클을 총 20회 실시한 후, 마지막으로, 72℃에서 5분간 1회 실시였고, PCR 기기는 Bio-Rad의 C1000을 사용하였다. 도 4는 HLA 표적 다중 PCR의 전기영동 및 Bioanalyzer 확인 결과를 보여준다.
실시예 3. 샘플 식별 바코딩을 위한 Fusion PCR
실시예 2에서 수득된 HLA 표적 PCR 산물에 샘플 식별용 바코드 서열 및 어댑터를 연결하는 Fusion PCR을 수행하였다. 이 방법은 고가의 NGS 라이브러리 제조 키트(library preparation kit)을 사용하지 않고 PCR을 통해 어댑터와 바코드를 결합시키는 방법으로, 시간과 비용의 절감 효과가 있으며, 또한 HLA 검사 외에 target-resequencing 기법에도 적용 가능하다.
표적 PCR에서 증폭된 96 웰 플레이트 1 과 96 플레이트 2 증폭 산물을 하나의 플레이트에 같은 샘플별로 통합(pool)하여, 96 종류의 NGS-Miseq 식별용 바코드가 연결된 프라이머를 이용하여 Fusion PCR을 수행하였다.
96 종류의 NGS-Miseq 식별 바코딩 프라이머를 96 웰 플레이트 3에 5 μM 농도로 주입하였다. 96 웰 플레이트 3에 중합반응 완충용액, 중합반응 효소를 주입하고, 샘플별로 통합된 PCR 산물 1 ㎕를 각각의 96 웰 플레이트 해당 위치에 넣어 중합효소연쇄반응 기기를 이용한 증폭 과정을 수행하였다. 이때 사용된 중합반응 완층용액은 dNTP 0.2 mM, 베타인 0.3M, 1X Phusion buffer를 포함했고, DNA 중합효소는 Phusion Hot Start Ⅱ High-Fidelity DNA polymerase 0.4 unit (Themo Scientific) 사용하였다.
이때 중합 효소 연쇄반응 조건은 98℃에서 30초간 1회, 98℃에서 15초, 60℃에서 30초, 및 72℃에서 30초로 이루어진 사이클을 총 23회 실시한 후, 마지막으로, 72℃에서 5분간 1회 실시였고, PCR 기기는 Bio-Rad의 C1000을 사용하였다.
도 2a 및 2b는 HLA의 표적 증폭 PCR 및 뒤이은 Fusion PCR을 수행하는 방법을 개략적으로 표시한다. 또한, 도 3은 표적 증폭 PCR과 Fusion PCR에서 사용되는 프라이머와 PCR 산물의 구조를 보여준다.
샘플 식별용 바코드 및 어댑터를 포함하는 바코딩 프라이머는 표적 PCR 증폭 산물에 상보적으로 결합가능한 유니버설 프라이머를 포함한다. 식별 바코드 프라이머 서열은 어댑터 서열-바코드 서열-유니버설 프라이머 서열의 구조로 이루어진다. 본 실시예에서 제작하여 사용한 96 종류의 NGS-Miseq 식별 바코딩 프라이머 서열 중 어댑터 서열과 유니버설 프라이머 서열 및 바코드 서열이 각각 하기의 표 2 및 표 3에 표시된다. 또한, Fusion PCR에서 바코딩 프라이머와 쌍으로 이용되는 어댑터 프라이머 중 어댑터 서열 및 유니버설 프라이머 서열이 하기 표 4에 기재한다.
웰 Line 웰 No. 명칭 어댑터 유니버설 프라이머
A - H 01~96 Mi-HL-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTT
웰 Line 웰 No. 명칭 바코드
A 01 Mi-HL-R-01 ACGACGATAC
B 01 Mi-HL-R-02 ACGCATACAC
C 01 Mi-HL-R-03 ACTACGAGCA
D 01 Mi-HL-R-04 AGACGACGAC
E 01 Mi-HL-R-05 ACACACGCAC
F 01 Mi-HL-R-06 TACACGACGC
G 01 Mi-HL-R-07 AGTACACGAC
H 01 Mi-HL-R-08 ACGCTACATC
A 02 Mi-HL-R-09 ACGATCACTC
B 02 Mi-HL-R-10 ACTGATAGCG
C 02 Mi-HL-R-11 GACTACAGCG
D 02 Mi-HL-R-12 ACTCACTAGC
E 02 Mi-HL-R-13 TCACTAGCTC
F 02 Mi-HL-R-14 TGACAGCACG
G 02 Mi-HL-R-15 AGAGACGATC
H 02 Mi-HL-R-16 ACGACAGCAC
A 03 Mi-HL-R-17 AGCACGCTCA
B 03 Mi-HL-R-18 TGACGACATG
C 03 Mi-HL-R-19 GAGACACTGA
D 03 Mi-HL-R-20 ACATGAGCAC
E 03 Mi-HL-R-21 TCGAGATACG
F 03 Mi-HL-R-22 GACGCATGAC
G 03 Mi-HL-R-23 GATCGCATAG
H 03 Mi-HL-R-24 CAGCATAGCA
A 04 Mi-HL-R-25 CATGCACACA
B 04 Mi-HL-R-26 AGTGACACTC
C 04 Mi-HL-R-27 ACGAGACTAG
D 04 Mi-HL-R-28 AGATGCACTC
E 04 Mi-HL-R-29 CGACTACGCA
F 04 Mi-HL-R-30 GACGACACAG
G 05 Mi-HL-R-31 CGCACTACAG
H 06 Mi-HL-R-32 ACTAGCGCAC
A 05 Mi-HL-R-33 TGCGAGCACA
B 05 Mi-HL-R-34 AGCTCGCATC
C 05 Mi-HL-R-35 TCACGTACAG
D 05 Mi-HL-R-36 TCATCATCGC
E 05 Mi-HL-R-37 TGACTCGACA
F 05 Mi-HL-R-38 GACAGTAGAC
G 05 Mi-HL-R-39 ACTCTGACTG
H 05 Mi-HL-R-40 ATAGACTGCG
A 06 Mi-HL-R-41 GTGCTCATAC
B 06 Mi-HL-R-42 ACAGCACTCG
C 06 Mi-HL-R-43 GCGTGCTATA
D 06 Mi-HL-R-44 TCGCGCATGA
E 06 Mi-HL-R-45 GCAGCGCATA
F 06 Mi-HL-R-46 TGCACAGAGA
G 06 Mi-HL-R-47 CACGCGATAG
H 06 Mi-HL-R-48 CAGCAGCGTA
A 07 Mi-HL-R-49 GATCATGCAG
B 07 Mi-HL-R-50 ATGATACGCG
C 07 Mi-HL-R-51 CGAGAGATAC
D 07 Mi-HL-R-52 GCATATGAGC
E 07 Mi-HL-R-53 CGACATAGTG
F 07 Mi-HL-R-54 CTACGCGCTA
G 07 Mi-HL-R-55 TACTGTGACG
H 07 Mi-HL-R-56 TCTCACGCGA
A 08 Mi-HL-R-57 CAGCGATGTA
B 08 Mi-HL-R-58 TGTCTCTCAC
C 08 Mi-HL-R-59 ACGTACAGTC
D 08 Mi-HL-R-60 AGCTACGTGC
E 08 Mi-HL-R-61 CATAGCGTGA
F 08 Mi-HL-R-62 ACGTAGTACG
G 08 Mi-HL-R-63 TACTCAGCTG
H 08 Mi-HL-R-64 GACTGATCTC
A 09 Mi-HL-R-65 CAGCTCAGTA
B 09 Mi-HL-R-66 CGCGCTACTA
C 09 Mi-HL-R-67 AGCAGACGTC
D 09 Mi-HL-R-68 TCGCGAGTAC
E 09 Mi-HL-R-69 TGCGCTCAGA
F 09 Mi-HL-R-70 AGCACGTCTA
G 09 Mi-HL-R-71 GACGAGTCAC
H 09 Mi-HL-R-72 CGCTACTCGA
A 10 Mi-HL-R-73 ACATCATACG
B 10 Mi-HL-R-74 TGACAGACTA
C 10 Mi-HL-R-75 GATAGAGACA
D 10 Mi-HL-R-76 GATACTCTAG
E 10 Mi-HL-R-77 GCACATGATA
F 10 Mi-HL-R-78 TACACTCATG
G 10 Mi-HL-R-79 TATGACGACA
H 10 Mi-HL-R-80 GCATGAGATA
A 11 Mi-HL-R-81 TAGTGACACA
B 11 Mi-HL-R-82 AGCATCGATA
C 11 Mi-HL-R-83 ACAGACTCTA
D 11 Mi-HL-R-84 ATGATGCATG
E 11 Mi-HL-R-85 TGACTGATCA
F 11 Mi-HL-R-86 ATCATAGACG
G 11 Mi-HL-R-87 TCAGTATCAC
H 11 Mi-HL-R-88 TCAGATCTAG
A 12 Mi-HL-R-89 CAGACTGATA
B 12 Mi-HL-R-90 TAGCATCTGA
C 12 Mi-HL-R-91 CACGTACATA
D 12 Mi-HL-R-92 CACTGTATAG
E 12 Mi-HL-R-93 CAGAGTATCA
F 12 Mi-HL-R-94 ATATCGCTGA
G 12 Mi-HL-R-95 TCATCAGTAG
H 12 Mi-HL-R-96 TGTGTACTAC
웰 Line 웰 No. 명칭 어댑터 유니버설 프라이머
A ~ H 01-96 Mi-HL-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCT ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
실시예 4. NGS 를 이용한 서열분석 및 HLA 형별 결정
실시예 3에서 수득된 Fusion PCR 생성물을 정제하고 정량하였다.
먼저, 96 웰 각각으로부터 채취한 5㎕의 PCT 생성물을 1개의 1.5 ml 튜브에 혼합하여 100 ㎕ 를 수득하고, Agencourt AMPure XP bead 100 ㎕를 섞어 마그네틱 비드에 붙여 프라이머 및 dNTP 잔여물을 제거하고, 80% 에탄올로 비드를 세척한 후, Qiagen Elution buffer 50 ㎕로 PCR 산물을 녹였다.
이후 QuantusTM Fluorometer(Promega,USA)기기를 이용하여 정제된 혼합 바코드 샘플 시료를 정량 하였다. 측정을 위해, Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Reagent Kit의 Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA reagent 시약 1.5 ㎕를 1X TE 시약 298.5 ㎕에 희석시켜 준비했다. Blank시약 200 ㎕ (1X TE 시약 100 ㎕에 희석된 Quant-iTTM PicoGreen○R dsDNA Reagen시약 100㎕), 표준시약 200 ㎕(1X TE 시약 98 ㎕에 Lambda DNA standard 시약 2 ㎕와 희석된 Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Reagen시약 100 ㎕), 샘플시약 200 ㎕(1X TE 시약 99㎕에 샘플시료 1 ㎕ 와 희석된 Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Reagen 시약 100 ㎕)를 0.5ml 튜브에 넣어 준비한 후, 차례로 QuantusTM Fluorometer 에 넣어 측정하였다. 바코드 01 내지 96으로 명명된 최종 혼합 샘플을 QuantusTM Fluorometer로 측정한 결과 약 30-50 nM로 결정되었다.
Miseq 샘플 준비 설명서에 따라, 10 nM로 준비된 Miseq 라이브러리 산물을 150 pM 최종 농도로 희석하여 540 ㎕를 취득하고, 12.5 pM Phix library 60 ㎕를 더해, 총 600 ㎕의 최종 산물을 준비하였다. 이후 Illumina Miseq 프로그램에 의하여 각 샘플의 서열을 결정하였다. 요약하면, Illumina Miseq 프로그램에 의하여 결정된 서열은 fastq 파일 형태의 데이터로 출력되며 이후, N base, GC content, Q30 base fraction 등 결정된 서열의 품질을 확인한 후 결정된 서열에 근거하여 소프트웨어 (Omixon Target HLA Typing 프로그램: http://www.omixon.com/hla/)를 이용, 각 샘플의 HLA 형별을 결정하였다.
상기 NGS에 의해 수득된 결과를 동일한 샘플에 대한 중해상도 분석 방법인 SSOP에 의한 결과와 비교하였다.
하기 표 5 내지 7은 각각 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DRB1에 대한 결과를 보여준다.
Sample Allele SSOP NGS
Barcode1_1.fastq Allele 1 HLA-A*02:06G HLA-A*02:06:01
Allele 2 HLA-A*26:02G HLA-A*26:02:01
Sample Allele SSOP NGS
Barcode5_1.fastq Allele 1 HLA-A*02:06G HLA-A*02:06:01
Allele 2 HLA-A*26:02G HLA-A*26:02:01
Sample Allele SSOP NGS
Barcode6_1.fastq Allele 1 HLA-A*02:07G HLA-A*02:07:01
Allele 2 HLA-A*31:01G HLA-A*31:01:02
Sample Allele SSOP NGS
Barcode13_1.fastq Allele 1 HLA-A*02:07G HLA-A*02:07:01
Allele 2 HLA-A*33:03G HLA-A*33:03:01
Sample Allele SSOP NGS
Barcode19_1.fastq Allele 1 HLA-A*02:01G HLA-A*02:01:01
Allele 2 HLA-A*33:03G HLA-A*33:03:01
Sample Allele SSOP NGS
Barcode24_1.fastq Allele 1 HLA-A*02:06G HLA-A*02:06:01
Allele 2 HLA-A*33:03G HLA-A*33:03:01
Sample Allele SSOP NGS
Barcode33_1.fastq Allele 1 HLA-A*24:02G HLA-A*24:02:011
　 HLA-A*24:02:40
Allele 2 _ HLA-A*24:02:01
　 HLA-A*24:02:40
Sample Allele SSOP NGS
Barcode34_1.fastq Allele 1 HLA-A*33:03G HLA-A*33:03:01
Allele 2 _ _
Sample Allele SSOP NGS
Barcode37_1.fastq Allele 1 HLA-A*02:01G HLA-A*02:01:01
Allele 2 _ _
Sample Allele SSOP NGS
Barcode49_1.fastq Allele 1 HLA-A*11:01G HLA-A*11:01:01
Allele 2 HLA-A*24:02G HLA-A*24:02:01
　 HLA-A*24:02:40
Sample Allele SSOP NGS
Barcode66_1.fastq Allele 1 HLA-A*24:02G HLA-A*24:02:011
　 HLA-A*24:02:40
Allele 2 _ HLA-A*24:02:01
　 HLA-A*24:02:40
Sample Allele SSOP NGS
Barcode77_1.fastq Allele 1 HLA-A*24:02G HLA-A*24:02:011
　 HLA-A*24:02:40
Allele 2 _ HLA-A*24:02:01
　 HLA-A*24:02:40
Sample Allele SSOP NGS
Barcode81_1.fastq Allele 1 HLA-A*33:03G HLA-A*33:03:01
Allele 2 _ _
1. SSOP 결과: homozygote 이나, NGS 결과로 heterozygote 가능성을 보여 주고 있음.
Sample Allele SSOP NGS
Barcode19 _1. fastq Allele 1 HLA -B*13:01G HLA -B*13:01:01
　 HLA -B*13:01:05
Allele 2 HLA -B*58:01G HLA -B*58:01:01
Sample Allele SSOP NGS
Barcode24 _1. fastq Allele 1 HLA -B*27:05G HLA -B*27:05:04
　 HLA -B*27:13
　 HLA -B*27:05:02
Allele 2 HLA -B*44:03G HLA -B*44:03:01
Sample Allele SSOP NGS
Barcode33 _1. fastq Allele 1 HLA -B*40:01G HLA -B*40:01:01
　 HLA -B*40:01:02
Allele 2 HLA -B*51:01G HLA -B*51:01:01
Sample Allele SSOP NGS
Barcode34 _1. fastq Allele 1 HLA -B*44:03G HLA -B*44:03:02
Allele 2 HLA -B*51:01G HLA -B*51:76
　 HLA -B*51:01:01
Sample Allele SSOP NGS
Barcode37 _1. fastq Allele 1 HLA -B*15:01G HLA -B*15:212
　 HLA -B*15:01:01
Allele 2 HLA -B*40:01G HLA -B*40:21
　 HLA -B*40:01:01
　 HLA -B*40:01:02
Sample Allele SSOP NGS
Barcode49 _1. fastq Allele 1 HLA -B*54:01G HLA -B*54:01:01
　 HLA -B*35:60
　 HLA -B*35:57
　 HLA -B*35:01:01
　 HLA -B*35:01:23
　 HLA -B*35:42:01
　 HLA -B*35:178
　 HLA -B*35:101:02
　 HLA -B*35:101:01
Allele 2 HLA -B*35:01G HLA -B*54:01:01
　 HLA -B*35:60
　 HLA -B*35:57
　 HLA -B*35:01:01
　 HLA -B*35:01:23
　 HLA -B*35:42:01
　 HLA -B*35:178
　 HLA -B*35:101:02
　 HLA -B*35:101:01
Sample Allele SSOP NGS
Barcode66 _1. fastq Allele 1 HLA -B*15:02G HLA -B*15:02:01
Allele 2 HLA -B*35:01G HLA -B*35:01:01
　 HLA -B*35:01:23
　 HLA -B*35:42:01
　 HLA -B*35:101:02
　 HLA -B*35:101:01
　 HLA -B*35:178
Sample Allele SSOP NGS
Barcode77 _1. fastq Allele 1 HLA -B*54:01G HLA -B*54:01:01
Allele 2 _ _
Sample Allele SSOP NGS
Barcode81 _1. fastq Allele 1 HLA -B*44:03G HLA -B*44:03:01
Allele 2 _ _
Sample Allele SSOP NGS
Barcode1_1.fastq Allele 1 HLA-DRB1*04:06G HLA-DRB1*04:06:01
　 HLA-DRB1*04:06:02
Allele 2 HLA-DRB1*09:01G HLA-DRB1*09:01:02
Sample Allele SSOP NGS
Barcode5_1.fastq Allele 1 HLA-DRB1*04:06G HLA-DRB1*04:06:01
　 HLA-DRB1*04:06:02
Allele 2 HLA-DRB1*09:01G HLA-DRB1*09:01:02
Sample Allele SSOP NGS
Barcode6_1.fastq Allele 1 HLA-DRB1*08:02G HLA-DRB1*08:02:02
Allele 2 HLA-DRB1*08:03G HLA-DRB1*08:03:02
Sample Allele SSOP NGS
Barcode13_1.fastq Allele 1 HLA-DRB1*07:01G HLA-DRB1*07:01:01
Allele 2 HLA-DRB1*08:03G HLA-DRB1*08:03:02
Sample Allele SSOP NGS
Barcode19_1.fastq Allele 1 HLA-DRB1*12:02G HLA-DRB1*12:02:01
Allele 2 HLA-DRB1*13:02G HLA-DRB1*13:02:01
Sample Allele SSOP NGS
Barcode24_1.fastq Allele 1 HLA-DRB1*01:01G HLA-DRB1*01:50
　 HLA-DRB1*01:01:01
Allele 2 HLA-DRB1*13:02G HLA-DRB1*13:02:01
Sample Allele SSOP NGS
Barcode33_1.fastq Allele 1 HLA-DRB1*04:05G HLA-DRB1*04:05:04
　 HLA-DRB1*04:05:01
Allele 2 　 HLA-DRB1*04:05:04
HLA-DRB1*09:01G HLA-DRB1*09:01:02
Sample Allele SSOP NGS
Barcode34_1.fastq Allele 1 HLA-DRB1*07:01G HLA-DRB1*07:01:01
Allele 2 HLA-DRB1*13:01G HLA-DRB1*13:01:01
　 HLA-DRB1*13:117
Sample Allele SSOP NGS
Barcode37_1.fastq Allele 1 HLA-DRB1*14:05G HLA-DRB1*14:05:01
Allele 2 HLA-DRB1*15:01G HLA-DRB1*15:01:17
　 HLA-DRB1*15:01:01
Sample Allele SSOP NGS
Barcode49_1.fastq Allele 1 HLA-DRB1*11:01G HLA-DRB1*11:01:01
　 HLA-DRB1*11:01:08
　 HLA-DRB1*11:97
Allele 2 HLA-DRB1*12:01G HLA-DRB1*12:01:01
　 HLA-DRB1*12:10
　 HLA-DRB1*12:06
　 HLA-DRB1*12:17
Sample Allele SSOP NGS
Barcode66_1.fastq Allele 1 HLA-DRB1*09:01G HLA-DRB1*09:01:02
Allele 2 HLA-DRB1*12:02G HLA-DRB1*12:02:01
Sample Allele SSOP NGS
Barcode77_1.fastq Allele 1 HLA-DRB1*08:03G HLA-DRB1*08:03:021
Allele 2 _ HLA-DRB1*08:03:03
Sample Allele SSOP NGS
Barcode81_1.fastq Allele 1 HLA-DRB1*13:02G HLA-DRB1*13:02:01
Allele 2 _ _
1: SSOP 결과: homozygote 이나, NGS 결과로 heterozygote 결과를 보여 주고 있음.
SSOP와의 비교 결과는 NGS에 의한 분석이 보다 정확하고 고해상도의 HLA 형별 결정을 가능하게 한다는 것을 보여준다.
<110> Lab Genomics <120> Method and kit for NGS-based high efficiency, high resolution HLA typing <130> PN107739 <160> 211 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL-A-E2-F <400> 1 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctctctgyg gggagaagca a 51 <210> 2 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL-A-E2-R <400> 2 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttctcgg acccggagac tg 52 <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL-A-E3-F <400> 3 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctacygggc tgacckyggg 50 <210> 4 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL-A-E3-R <400> 4 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagayct ayaggcgatc agg 53 <210> 5 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL-A-E4-F <400> 5 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgcctga atkwtctgac tcttcc 56 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL-A-E4-R <400> 6 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgccctg accctgctaa aggt 54 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL-B-E2-F <400> 7 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgagmrag gggaccgcag g 51 <210> 8 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL-B-E2-R <400> 8 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgagmrag gggaccgcag g 51 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL-B-E3-F <400> 9 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctkrggcca gggtctcaca 50 <210> 10 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL-B-E3-R <400> 10 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcatccc sggcgaycta tag 53 <210> 11 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL-B-E4-F <400> 11 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgcgcctg aattttctga ctctt 55 <210> 12 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL-B-E4-R <400> 12 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagatat gacccctcat ccc 53 <210> 13 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL-DR-E2-F <400> 13 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcyggats sttyktgycc cc 52 <210> 14 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL-DR-E2-R <400> 14 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccgctg cacygtgaag ct 52 <210> 15 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 1 <400> 15 acgacgatac 10 <210> 16 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 2 <400> 16 acgcatacac 10 <210> 17 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 3 <400> 17 actacgagca 10 <210> 18 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 4 <400> 18 agacgacgac 10 <210> 19 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 5 <400> 19 acacacgcac 10 <210> 20 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 6 <400> 20 tacacgacgc 10 <210> 21 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 7 <400> 21 agtacacgac 10 <210> 22 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 8 <400> 22 acgctacatc 10 <210> 23 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 9 <400> 23 acgatcactc 10 <210> 24 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 10 <400> 24 actgatagcg 10 <210> 25 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 11 <400> 25 gactacagcg 10 <210> 26 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 12 <400> 26 actcactagc 10 <210> 27 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 13 <400> 27 tcactagctc 10 <210> 28 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 14 <400> 28 tgacagcacg 10 <210> 29 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 15 <400> 29 agagacgatc 10 <210> 30 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 16 <400> 30 acgacagcac 10 <210> 31 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 17 <400> 31 agcacgctca 10 <210> 32 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 18 <400> 32 tgacgacatg 10 <210> 33 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 19 <400> 33 gagacactga 10 <210> 34 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 20 <400> 34 acatgagcac 10 <210> 35 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 21 <400> 35 tcgagatacg 10 <210> 36 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 22 <400> 36 gacgcatgac 10 <210> 37 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 23 <400> 37 gatcgcatag 10 <210> 38 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 24 <400> 38 cagcatagca 10 <210> 39 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 25 <400> 39 catgcacaca 10 <210> 40 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 26 <400> 40 agtgacactc 10 <210> 41 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 27 <400> 41 acgagactag 10 <210> 42 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcode 28 <400> 42 agatgcactc 10 <210> 43 <211> 10 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cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 158 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 44 <400> 158 caagcagaag acggcatacg agattcgcgc atgagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 159 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 45 <400> 159 caagcagaag acggcatacg agatgcagcg catagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 160 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 46 <400> 160 caagcagaag acggcatacg agattgcaca gagagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 161 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 47 <400> 161 caagcagaag acggcatacg agatcacgcg ataggtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 162 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 48 <400> 162 caagcagaag acggcatacg agatcagcag cgtagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 163 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 49 <400> 163 caagcagaag acggcatacg agatgatcat gcaggtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 164 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 50 <400> 164 caagcagaag acggcatacg agatatgata cgcggtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 165 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 51 <400> 165 caagcagaag acggcatacg agatcgagag atacgtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 166 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 52 <400> 166 caagcagaag acggcatacg agatgcatat gagcgtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 167 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 53 <400> 167 caagcagaag acggcatacg agatcgacat agtggtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 168 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 54 <400> 168 caagcagaag acggcatacg agatctacgc gctagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 169 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 55 <400> 169 caagcagaag acggcatacg agattactgt gacggtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 170 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 56 <400> 170 caagcagaag acggcatacg agattctcac gcgagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 171 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 57 <400> 171 caagcagaag acggcatacg agatcagcga tgtagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 172 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 58 <400> 172 caagcagaag acggcatacg agattgtctc tcacgtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 173 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 59 <400> 173 caagcagaag acggcatacg agatacgtac agtcgtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 174 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 60 <400> 174 caagcagaag acggcatacg agatagctac gtgcgtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 175 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 61 <400> 175 caagcagaag acggcatacg agatcatagc gtgagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 176 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 62 <400> 176 caagcagaag acggcatacg agatacgtag tacggtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 177 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 63 <400> 177 caagcagaag acggcatacg agattactca gctggtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 178 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 64 <400> 178 caagcagaag acggcatacg agatgactga tctcgtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 179 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 65 <400> 179 caagcagaag acggcatacg agatcagctc agtagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 180 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 66 <400> 180 caagcagaag acggcatacg agatcgcgct actagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 181 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 67 <400> 181 caagcagaag acggcatacg agatagcaga cgtcgtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 182 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 68 <400> 182 caagcagaag acggcatacg agattcgcga gtacgtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 183 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 69 <400> 183 caagcagaag acggcatacg agattgcgct cagagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 184 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 70 <400> 184 caagcagaag acggcatacg agatagcacg tctagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 185 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 71 <400> 185 caagcagaag acggcatacg agatgacgag tcacgtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 186 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 72 <400> 186 caagcagaag acggcatacg agatcgctac tcgagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 187 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 73 <400> 187 caagcagaag acggcatacg agatacatca tacggtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 188 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 74 <400> 188 caagcagaag acggcatacg agattgacag actagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 189 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 75 <400> 189 caagcagaag acggcatacg agatgataga gacagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 190 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 76 <400> 190 caagcagaag acggcatacg agatgatact ctaggtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 191 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 77 <400> 191 caagcagaag acggcatacg agatgcacat gatagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 192 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 78 <400> 192 caagcagaag acggcatacg agattacact catggtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 193 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 79 <400> 193 caagcagaag acggcatacg agattatgac gacagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 194 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 80 <400> 194 caagcagaag acggcatacg agatgcatga gatagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 195 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 81 <400> 195 caagcagaag acggcatacg agattagtga cacagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 196 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 82 <400> 196 caagcagaag acggcatacg agatagcatc gatagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 197 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 83 <400> 197 caagcagaag acggcatacg agatacagac tctagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 198 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 84 <400> 198 caagcagaag acggcatacg agatatgatg catggtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 199 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 85 <400> 199 caagcagaag acggcatacg agattgactg atcagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 200 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 86 <400> 200 caagcagaag acggcatacg agatatcata gacggtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 201 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 87 <400> 201 caagcagaag acggcatacg agattcagta tcacgtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 202 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 88 <400> 202 caagcagaag acggcatacg agattcagat ctaggtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 203 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 89 <400> 203 caagcagaag acggcatacg agatcagact gatagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 204 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 90 <400> 204 caagcagaag acggcatacg agattagcat ctgagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 205 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 91 <400> 205 caagcagaag acggcatacg agatcacgta catagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 206 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 92 <400> 206 caagcagaag acggcatacg agatcactgt ataggtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 207 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 93 <400> 207 caagcagaag acggcatacg agatcagagt atcagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 208 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 94 <400> 208 caagcagaag acggcatacg agatatatcg ctgagtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 209 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 95 <400> 209 caagcagaag acggcatacg agattcatca gtaggtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 210 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoding primer 96 <400> 210 caagcagaag acggcatacg agattgtgta ctacgtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60 tccgatct 68 <210> 211 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adapter primer <400> 211 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

Claims (10)

  1. 차세대 염기서열분석(NGS)을 이용하여 고해상도 조직적합성(HLA) 형별 분석을 수행하는 방법으로서,
    샘플 중 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DRB1의 엑손 영역을 증폭시켜 표적 PCR 산물을 수득하는 단계,
    수득된 표적 PCR 산물을 주형으로 이용하고, 서열분석용 유니버설 프라이머 서열, 샘플 식별용 바코드 서열, 및 어댑터 서열을 포함하는 바코딩 프라이머와 어댑터 프라이머를 이용한 융합(Fusion) PCR을 수행하여 NGS용 어댑터 및 샘플 식별용 바코드가 결합된 바코딩된 PCR 산물을 수득하는 단계,
    바코딩된 PCR 산물을 대상으로 NGS를 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DRB1의 엑손 영역을 증폭시켜 표적 PCR 산물을 수득하는 단계는 다중 PCR로 수행되는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 HLA-A, B 및 DRB1의 엑손 영역을 증폭시켜 표적 PCR 산물을 수득하는 단계는 서열번호 1 내지 6의 HLA-A 증폭용 프라이머, 서열번호 7 내지 12의 HLA-B 증폭용 프라이머, 및 서열번호 13 및 14의 HLA-DRB1 증폭용 프라이머로 구성된 군으로부터 선택된 프라이머의 조합을 이용하여 수행되는 것인 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 다중 PCR은 HLA-A의 엑손 2, 3, 4, HLA-B의 엑손 2, 3, 4, 및 HLA-DRB1의 엑손 2를 증폭시키는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 바코딩된 PCR 산물을 수득하는 단계는 서열번호 115 내지 210의 바코딩 프라이머로 구성된 군으로부터 선택된 프라이머와 서열번호 211의 어댑터 프라이머를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  6. 서열번호 1 내지 6의 HLA-A 증폭용 프라이머, 서열번호 7 내지 12의 HLA-B 증폭용 프라이머, 및 서열번호 13 및 14의 HLA-DRB1 증폭용 프라이머 및 서열번호 115 내지 210의 바코딩 프라이머와 서열번호 211의 어댑터 프라이머를 포함하는, 고해상도 조직적합성(HLA) 형별 분석용 키트.
  7. 서열분석용 유니버설 프라이머 서열과 샘플 식별용 바코드 서열을 포함하는, 차세대 염기서열분석(NGS)을 위한 라이브러리 제작에 이용되는 프라이머.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 서열분석용 유니버설 프라이머 서열은 서열번호 111 또는 112인 것인 프라이머.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 샘플 식별용 바코드 서열은 15 내지 110에서 선택되는 것인 프라이머.
  10. 청구항 7 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머는 사용되는 NGS 기기에 따른 어댑터 서열을 더 포함하는 것인 프라이머.
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