CN112292600A - 用于鉴定被表达在肿瘤浸润性淋巴细胞上的t细胞受体识别的抗原的系统 - Google Patents
用于鉴定被表达在肿瘤浸润性淋巴细胞上的t细胞受体识别的抗原的系统 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112292600A CN112292600A CN201980040057.5A CN201980040057A CN112292600A CN 112292600 A CN112292600 A CN 112292600A CN 201980040057 A CN201980040057 A CN 201980040057A CN 112292600 A CN112292600 A CN 112292600A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- barcode
- cell
- tcr
- gene
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 125
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 title claims abstract description 101
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 31
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 title description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 103
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 99
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 69
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 58
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 85
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 81
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 81
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 61
- 101000634835 Homo sapiens M1-specific T cell receptor alpha chain Proteins 0.000 claims description 57
- 101000634836 Homo sapiens T cell receptor alpha chain MC.7.G5 Proteins 0.000 claims description 57
- 101000763322 Homo sapiens M1-specific T cell receptor beta chain Proteins 0.000 claims description 46
- 101000763321 Homo sapiens T cell receptor beta chain MC.7.G5 Proteins 0.000 claims description 46
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 41
- 102100029454 T cell receptor alpha chain MC.7.G5 Human genes 0.000 claims description 41
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 35
- BSDCIRGNJKZPFV-GWOFURMSSA-N (2r,3s,4r,5r)-2-(hydroxymethyl)-5-(2,5,6-trichlorobenzimidazol-1-yl)oxolane-3,4-diol Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2N=C1Cl BSDCIRGNJKZPFV-GWOFURMSSA-N 0.000 claims description 32
- 102100026967 T cell receptor beta chain MC.7.G5 Human genes 0.000 claims description 22
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 5
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 claims description 4
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 claims description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 claims description 3
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 claims description 2
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 claims description 2
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- YTAHJIFKAKIKAV-XNMGPUDCSA-N [(1R)-3-morpholin-4-yl-1-phenylpropyl] N-[(3S)-2-oxo-5-phenyl-1,3-dihydro-1,4-benzodiazepin-3-yl]carbamate Chemical compound O=C1[C@H](N=C(C2=C(N1)C=CC=C2)C1=CC=CC=C1)NC(O[C@H](CCN1CCOCC1)C1=CC=CC=C1)=O YTAHJIFKAKIKAV-XNMGPUDCSA-N 0.000 claims 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 33
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 33
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 28
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 12
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 9
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 9
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 6
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 239000012082 adaptor molecule Substances 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 3
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 2
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 2
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011502 immune monitoring Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000012083 mass cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028970 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Human genes 0.000 description 1
- 102100028966 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain F Human genes 0.000 description 1
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 101000986085 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Proteins 0.000 description 1
- 101000986080 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain F Proteins 0.000 description 1
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102000002673 NFATC Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010018525 NFATC Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 102100030569 Nuclear receptor corepressor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710153660 Nuclear receptor corepressor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 102100027881 Tumor protein 63 Human genes 0.000 description 1
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 description 1
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N carbonyl sulfide Chemical compound O=C=S JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 238000003340 combinatorial analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011066 ex-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000007421 fluorometric assay Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000005746 immune checkpoint blockade Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 108010009355 microbial metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000007482 whole exome sequencing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56977—HLA or MHC typing
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明是一种鉴定T细胞受体的同源抗原的方法，其使用来自患者的肿瘤细胞与来自患者的T细胞的组合的新抗原并使用细胞分选、基因组测序，表达TCR基因，将肿瘤新抗原呈递在MHC复合体上并在TCR识别出现之处对T细胞进行独特地条形码编码，以将TCR识别复合体中的所有组分标签化。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学和肿瘤抗原领域，更具体地，涉及使用组合条形码编码来鉴定抗肿瘤免疫细胞和肿瘤抗原。
背景技术
T细胞是适应性免疫系统不可或缺的并且提供保护以抵抗病原体和癌症。它们通过T细胞受体(TCR)对抗原的细胞外识别而发挥作用，TCR对于抗原呈递细胞上的编码人类白细胞抗原(HLA)的MHC(主要组织相容性复合体)结构上呈递的短肽显示特异亲和性。TCR、肽和MHC分子固有的多样性使得鉴定任一TCR的特异性成为一个极其复杂的问题，Gee，M.H.，et al.，Antigen Identification for Orphan T Cell Receptors Expressed onTumor-Infiltrating Lymphocytes.Cell，2017。尽管能够对T细胞及其TCR序列进行分子表征的技术已经有了很大程度的改进，但测定和研究T细胞的抗原特异性的能力仍然是主要的瓶颈。用来测定“孤儿”TCR(即，抗原特异性未知的TCR)的方法将有助于发现癌症免疫疗法、自体免疫和感染的潜在靶标，参见Gee，supra。已经使用许多策略来测定“孤儿”TCR的特异性，参见，Birnbaum，M.E，et al.，Deconstructing the peptide-MHC specificity of Tcell recognition.Cell，2014。157(5)：p.1073-87。质谱可以提供一种抗原分离的无偏方法，Yadav，M.，et al.，Predicting immunogenic tumour mutations by combining massspectrometry and exome sequencing.Nature，2014.515(7528)：p.572-6，但需要巨大的细胞数量，典型为107至109个细胞。大多数T细胞抗原特异性研究牵涉对候选抗原的经验检验。例如，对抗肿瘤T细胞特异性的研究已经显示了T细胞对于新抗原的富有成效的应答。此类研究需要对肿瘤测序以鉴定突变，使用表位预测算法来预测免疫原性突变肽，并且测试针对这些突变肽的T细胞应答，参见，Zolkind，P.，et al.，Neoantigens inimmunotherapyand personalized vaccines：Implications for head and neck squamous cellcarcinoma.Oral Oncology，Snyder，A.and T.A.Chan，Immunogenic peptide discoveryin cancer genomes.Current Opinion in Genetics&Development，2015.30(0)：p.7-16。其他策略使用pHLA多聚体来质询患者体内所建立的T细胞特异性Leong，M.L.andE.W.Newell，Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with MassCytometry.Methods Mol Biol，2015.1346：p.115-31，Newell，E.W.and M.M.Davis，Beyondmodel antigens：high-dimensional methods for the analysis of antigen-specificT cells.Nat Biotechnol，2014.32(2)：p.149-57。
对于将每个独特的T细胞受体与它所识别的肽序列关联仍存在需求。特别有意义的是源自肿瘤的肽与抗肿瘤T细胞的鉴定和匹配。
发明内容
在一个实施例中，本发明是鉴定由α链(TCRα)和β链(TCRβ)构成的T细胞受体(TCR)的同源抗原的方法，该方法包括：从患者获得T细胞群，其中每个T细胞包含TCR，该TCR包含TCRα链和TCRβ链；以细胞特异性条形码对来自每个T细胞的核酸进行条形码编码；对条形码编码的核酸进行测序以获得编码TCRα链和TCRβ链的TCRA基因序列和TCRB基因序列；将具有相同条形码的TCRA基因和TCRB基因鉴定为编码功能性TCR的基因对；将TCRA和TCRB基因对引入接受性T细胞；从该患者获得肿瘤细胞群，每个肿瘤细胞可能包含一个或多个肿瘤新抗原；鉴定肿瘤新抗原基因；从该新抗原基因形成新抗原肽；将该新抗原肽与MHC-1抗原呈递复合体和寡核苷酸条形码组合以形成条形码编码的MHC-新抗原肽复合体；令被转染的T细胞与条形码编码的MHC-新抗原肽复合体接触以形成细胞结合的MHC-新抗原-TCR复合体；以细胞特异性条形码对来自每个T细胞的TCR基因和MHC-新抗原复合体条形码进行条形码编码；以相关联的细胞特异性条形码和与T细胞中的细胞特异性条形码相关联的MHC-新抗原复合体条形码对TCR基因进行测序；如果该TCR基因和MHC-新抗原复合体条形码中的至少一者与相同的细胞特异性条形码相关联，则将该新抗原鉴定为TCR的同源抗原。
T细胞可以通过肿瘤细胞的解离获得。编码TCRα链和TCRβ链的TCRA基因序列和TCRB基因序列可以是重排DNA序列或RNA序列。
T细胞群是通过基于蛋白标记物表达的捕获诸如荧光活化细胞分选(FACS)从肿瘤获得的。T细胞可选择为CD3+/CD8+/TCR+ T细胞、CD45RA+CD45RO-CCR7+CD62L+幼稚T细胞、CD45RA-CD45RO+CCR7+CD62L+中枢记忆性T细胞、CD45RA-CD45RO+CCR7-CD62L-效应记忆性T细胞、CD45RA+CD45RO-CCR7-CD62L-效应性T细胞或CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞。
在一些实施例中，T细胞条形码编码是通过包括以下步骤的方法实施的：令多个T细胞与引物混合物接触，所述引物包含基因特异性序列和条形码寡核苷酸退火区；以及令多个T细胞与条形码寡核苷酸接触，所述条形码寡核苷酸与引物中的条形码寡核苷酸退火区互补；在裂池合成的一个或多个轮次的每一个轮次中，令多个T细胞与另外的条形码寡核苷酸接触，其中在每个轮次中，条形码编码的寡核苷酸包含与来自前一个轮次的条形码寡核苷酸的退火区互补的退火区，从而在多个T细胞中的每一个中，将细胞特异性条形码组装到每个引物上。基因特异性序列可以选自TCRA、TCRB、CD3、CD4、CD8和FoxP3。
在一些实施例中，T细胞条形码编码是通过包括以下步骤的方法实施的：将含有核酸的T细胞群分为多个含有单个细胞的第一部分；将含细胞的部分与多个各自含有条形码编码的寡核苷酸引物的多个拷贝的第二部分混合，所述引物包含基因特异性序列和条形码，其中，在每个部分内部，条形码是相同的，但在不同部分之间，条形码是不同的；将第一部分与第二部分融合；以及形成具有条形码编码的寡核苷酸引物的扩增子，从而对核酸进行条形码编码。基因特异性序列可以选自TCRA、TCRB、CD3、CD4、CD8和FoxP3。
在一些实施例中，T细胞条形码编码和测序是通过包括以下步骤的方法实施的：将T细胞群分为多个含有多组细胞的部分；将条形码编码的衔接子与每个部分中的核酸连接；对已衔接核酸中的TCRA和TCRB进行测序以获得条形码编码的TCRA序列和TCRB序列；基于多个部分中的同现频率，确定TCRA和TCRB基因对。
对条形码编码的TCR基因测序是对该基因的CDR3高变区测序，并且鉴定TCR基因是鉴定该基因的CDR3高变区。
在一些实施例中，新抗原基因是通过下述鉴定的：对肿瘤细胞中的核酸进行测序，并将具有非沉默突变的基因鉴定为新抗原基因。测序可以是全基因组测序或全外显子组测序。新抗原可以通过序列比对鉴定。新抗原也可使用患者血清通过筛查肽阵列鉴定。
在一些实施例中，可将TCR基因在表达载体(例如，包含TCRA基因和TCRB基因中的一者或两者的载体)中引入接受性T细胞内。表达载体还可包含表达CD3蛋白的载体和表达CD8蛋白的载体。在一些实施例中，该接受性T细胞缺少内源性TCR基因表达。
在一些实施例中，将该基因作为转录活性DNA片段或作为mRNA引入接受性细胞中。
在一些实施例中，通过与所述MHC-I分子结合的能力来进一步选择所述鉴定的新抗原。在一些实施例中，通过计算机模拟分析来测定与MHC-I分子结合的能力。
在一些实施例中，新抗原肽的长度为8至100个氨基酸。在一些实施例中，MHC-1蛋白具有患者特异性序列。
在一些实施例中，MHC-新抗原-TCR复合体在形成之后交联。在一些实施例中，对新抗原-TCR复合体中的新抗原和TCR进行条形码编码包含将每个复合体划分到含有条形码的反应体积内。在一些实施例中，该方法中的测序步骤包括大规模平行测序。
附图说明
图1示出了该方法的从获得肿瘤样本到生成新抗原和T细胞受体序列的排序表的步骤示意图。所指示的示例是任意的，并因此与本申请的上下文无关。
图2示出了该方法的从生成新抗原和T细胞受体序列的排序表到解析同源TCR基因对并匹配抗原肽的步骤示意图。
图3例证了在T细胞中使用条形码将T细胞受体与其同源抗原匹配。
具体实施方式
定义
以下定义辅助理解本公开。
术语“样本”是指任何含有或假定含有靶标核酸的组合物。这包括从个体分离的组织或液体的样本，例如，皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、血液细胞、器官和肿瘤，也指从取自个体的细胞建立的体外培养物的样品，包括福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPET)和自其分离的核酸。样本也可包括不含细胞的材料，诸如含有无细胞DNA(cfDNA)或循环肿瘤DNA(ctDNA)的不含细胞的血液级分(fraction)。
术语“核酸”是指核苷酸(例如，核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，天然的和非天然的两者)的聚合物，包括DNA、RNA和它们的子分类诸如cDNA、mRNA等。核酸可以是单链的或双链的，并且通常将会含有5’-3’磷酸二酯键，但在一些情况下，核苷酸类似物可以具有其他链接。核酸可包括天然出现的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶)以及非天然碱基。非天然碱基的一些示例包括在例如Seela et al.，(1999)Helv.Chim.Acta 82：1640中描述的那些。非天然碱基可具有特定功能，例如，增加核酸双螺旋的稳定性、抑制核酸酶消化或阻断引物延伸或链聚合。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。多核苷酸是单链或双链的核酸。寡核苷酸是有时用来描述较短的多核苷酸的术语。寡核苷酸通过本领域已知的任何合适方法制备，例如，通过牵涉如以下文献中所述的直接化学合成的方法制备：Narang et al.(1979)Meth.Enzymol.68：90-99；Brown et al.(1979)Meth.Enzymol.68：109-151；Beaucage etal.(1981)Tetrahedron Lett.22：1859-1862；Matteucci et al.(1981)J.Am.Chem.Soc.103：3185-3191。
术语“引物”是指单链寡核苷酸，它与靶标核酸中的序列(“引物结合位点”)杂交并且能够用作在适用于合成的条件下沿着核酸的互补链启动该合成的点。
术语“衔接子”意为核苷酸序列，可将其加入另一序列中以赋予该另一序列以另外的性质。衔接子典型是寡核苷酸，它可以是单链的或双链的，或者可具有单链部分和双链部分两者。
术语“连接”是指将两条核酸链接合的缩合反应，其中一个分子的5’-磷酸酯基团与另一个分子的3’-羟基基团反应。连接典型是由连接酶或拓扑异构酶催化的酶促反应。连接可将两条单链接合以创建一个单链分子。连接也可将各自属于一个双链分子的两条链接合，从而将两个双链分子接合。连接也可将一个双链分子的两条链与另一个双链分子的两条链接合，从而将两个双链分子接合。连接也可将一个双链分子内的一条链的两端接合，从而修复该双链分子内的缺口。
术语“条形码”是指可被检测和鉴定的核酸序列。可将条形码并入各种核酸中。条形码足够长，例如，2、5、20个核苷酸，使得在样本中，可根据条形码对并入条形码内的核酸进行区分或分组。
术语“多重标识符”或“MID”是指一种条形码，它鉴定靶标核酸的来源(例如，该核酸所衍生自的样本)。来自相同样本的全部或基本上全部靶标核酸将共享相同的MID。来自不同来源或样本的靶标核酸可混合并同时测序。使用MID，可将序列读数分配给靶标核酸自其起源的个体样本。
术语“独特的分子标识符”或“UID”是一种条形码，它鉴定与其附接的核酸分子。来自相同样本的全部或基本上全部靶标核酸将具有不同的UID。源自相同的初始靶标核酸的全部或基本上全部子代(例如，扩增子)将共享相同的UID。
术语“量子条形码编码”或“QBC”)是指一种方法，可通过该方法以独特的核酸条形码标记细胞混合物中的个体细胞，该方法包括以下步骤：令细胞混合物与结合剂混合物接触，该结合剂混合物包含靶标结合序列和条形码寡核苷酸退火区；以及令该细胞与条形码寡核苷酸接触，该条形码寡核苷酸与该结合剂中的条形码寡核苷酸退火区互补；在裂池合成的一个或多个轮次的每一个轮次中，令该细胞与另外的条形码寡核苷酸接触，其中，在每一个轮次中，该条形码编码的寡核苷酸包含与来自前一个轮次的条形码寡核苷酸退火区互补的退火区，从而在每个细胞中组装细胞特异性条形码，参见，2016年4月15日提交的美国专利申请Ser.No.13/981,711。
如本文中所用，术语“靶标序列”、“靶标核酸”或“靶标”是指待检测或分析的样本中的核酸序列的一部分。术语靶标包括靶标序列的全部变体，例如，一种或多种突变变体和野生型变体。
术语“扩增”是指制备靶标核酸的另外的拷贝的方法。扩增可具有超过一个循环，例如，指数式扩增的多个循环。扩增可仅具有一个循环(制备靶标核酸的单个拷贝)。该拷贝可具有另外的序列，例如，用于扩增的引物中存在的那些。扩增也可产生仅一条链的拷贝(线性扩增)或优先产生一条链的拷贝(不对称PCR)。
术语“测序”是指任何测定靶标核酸中核苷酸序列的方法。
术语“MHC”是指主要组织相容性复合体，它是四肽结构，包含α1、α2和α3肽和β2微球蛋白肽的非共价复合体(就MHC-I而言)或α1、α2、β1和β2肽的非共价复合体(就MHC-II而言)。与肽抗原结合的MHC称为“pMHC”。
术语“TCRA和TCRB”、“TCRalpha和TCRbeta”以及“TCRα和TCRβ”可互换使用，是指(依据上下文)T细胞受体α和β肽链及其编码基因。参见，Thomas J.Kindt；RichardA.Goldsby；Barbara Anne Osborne；Janis Kuby(2007).Kuby Immunology.Macmillan。
本发明是鉴定T细胞受体抗原的方法。更准确地说，本发明是本发明是鉴定形成由TCRalpha肽链和TCRbeta肽链组成的功能性T细胞受体的一对T细胞受体编码基因TCRA和TCRB并且进一步鉴定该功能性T细胞受体的同源抗原序列的方法。本发明依赖于几种创新的方法：i.为大规模平行DNA测序进行肿瘤组织的代表性取样；ii利用分子条形码将作为生物相关复合体的一部分的全部系统组分标签化；iii.制备TCR与肽配体之间的高亲和性的、稳定的复合体；以及iv.使用可通过大规模平行DNA测序读取的核酸条形码探究标签化的核酸组分。
如图1中总结的，本发明包括以下步骤：(1)获得肿瘤组织；(2)将该组织解离为细胞或细胞核；(3)分选肿瘤细胞、正常细胞和免疫细胞；(4)获得肿瘤细胞级分、正常细胞级分和免疫细胞级分；(5)从细胞级分中分离DNA；(6)将肿瘤DNA转化为用于肿瘤DNA测序的测序文库；(7)制备用于测序的成对TCRA和TCRB基因；(8)DNA测序；(9)诠释测序数据；(10)形成编码预测的免疫原性新抗原肽的基因的排序表；以及(11)形成具有所观察到的或推定的TCRA/TCRB配对的T细胞受体序列(TCRA和TCRB)的排序表。
如图2中所总结的，从来自图1的(1)编码所预测的免疫原性新抗原肽的排序表和(2)具有所观察到的或推定的TCRA/TCRB配对的T细胞受体序列(TCRA和TCRB)的排序表开始，本发明还包括以下步骤：(3)形成DNA-条形码新抗原肽-MHC复合体的文库；(4)形成表达所鉴定并排序的TCR-A/B序列、CD3受体和CD8辅助受体的转基因T细胞；(5)以DNA-条形码编码的新抗原肽-MHC复合体文库孵育表达TCR的转基因T细胞群；(6)对复合体(5)进行组合条形码编码并进行TCRA mRNA(质粒)、TCRB mRNA(质粒)和来自DNA-条形码肽-MHC复合体的NGS测序；(7)对条形码进行测序，诠释测序数据，解析同源TCR对并进行肽匹配。
参照图1步骤1，从受试者或患者取得样本。在一些实施例中，该样本可包含例如通过生物活检或手术切除而取自该受试者或患者的固体组织或实体肿瘤的片段。参照图1步骤2，该方法包括解离该肿瘤以获得细胞混合物或悬浮液的步骤。肿瘤组织可以是新鲜的、快速冷冻(例如，在液氮中)的、或使用福尔马林、多聚甲醛等固定的。可使用机械解离(掺混，例如，使用均质机诸如试管研磨机(IKA Works，Inc.，Wilmington，NC))与使用蛋白水解酶进行酶促消化的组合，将肿瘤组织均质化。在一些实施例中，组织解聚完全是酶促的，并且采用胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、胶原酶、分散酶(中性蛋白酶)、弹性蛋白酶、透明质酸酶、蛋白酶K和链霉蛋白酶中的一者或多者进行。
典型的组织样本不是均质的，而是含有肿瘤细胞以及正常细胞和免疫细胞的非均质群。肿瘤中的免疫细胞可包含肿瘤浸润性淋巴细胞。肿瘤中每种类型的细胞以一种或多种生物标记物为特征，该生物标记物能用于例如通过荧光活化细胞分选(FACS)进行的细胞分离。参照图1步骤3和步骤4，将细胞分离为多个级分。肿瘤细胞或细胞核可以肿瘤标记物(包括细胞角蛋白、p53、p63蛋白)或DNA含量为特征，因为肿瘤细胞典型是多倍体的。在一些实施例中，该细胞以磷脂质或糖脂质含量为特征。淋巴细胞依据其类型而以用作该类型淋巴细胞的生物标记物的一组表面蛋白(单独或组合)的存在或不存在为特征。在一些实施例中，T细胞通过生物标记物CD3+CD8+TCR+的组合区分开来。在一些实施例中，幼稚T细胞通过生物标记物CD45RA+CD45RO-CCR7+CD62L+的组合区分开来。在一些实施例中，中枢记忆性T细胞通过生物标记物CD45RA-CD45RO+CCR7+CD62L的组合区分开来。在一些实施例中，效应记忆性T细胞通过生物标记物CD45RA-CD45RO+CCR7-CD62L-的组合区分开来。在一些实施例中，效应性T细胞通过生物标记物CD45RA+CD45RO-CCR7-CD62L-的组合区分开来。在一些实施例中，调节性T细胞通过生物标记物CD4+CD25+FoxP3+的组合区分开来。
在一些实施例中，通过对从分级的细胞分离的核酸进行测序而测定抗原序列和TCR序列(图1，步骤5)。
在一些实施例中，编码形成功能性TCR的肽的TCRA序列和TCRB序列是使用以下方法鉴定的，该方法牵涉TCR序列的划分、PCR扩增和测序以找到相同区块中存在的TCRA和TCRB，参见，例如，Howie，B.，et al.，High-throughput pairing of T cell receptor αandβsequences.Science Translational Medicine，2015.7(301)：p.301ra131-301ra131。简单地说，将T细胞划分成个体区块。从基因组DNA或总细胞RNA(转化为cDNA)获得编码TCR链的核酸。多分子mRNA的存在使得cDNA优于基因组DNA(gDNA)。然后，将TCRA序列和TCRB序列在每孔内进行PCR扩增。
在一些实施例中(参见图1，步骤7)，通过包括以下步骤的方法鉴定成对的TCRA基因和TCRB基因：将T细胞群分成多个含有单个细胞的第一部分；将含有细胞的部分与多个第二部分混合，每个第二部分含有条形码编码的寡核苷酸TCR引物的多个拷贝，该引物包含TCR基因结合序列和条形码，其中，在每个部分内部，条形码是相同的，而在不同部分之间，条形码是不同的；以及拷贝具有条形码编码的TCR引物的TCR基因，从而形成条形码编码的TCR基因扩增子，以及对条形码编码的TCR扩增子进行测序以确定哪些TCRA和TCRB扩增子具有指示在一个细胞内同现的相同条形码。(图1，步骤8)。
在一些实施例中，通过包括测序和组合分析的方法鉴定成对的TCRA基因和TCBR基因，参见，例如，Howie，B et al.，″High-throughput pairing of T cell receptorαandβsequences.″Science translational medicine 7，no.301(2015)：301ra131-301ra131。简单地说，该方法包括将T细胞群分为多个含有多组细胞的部分；将条形码编码的衔接子与每个部分中的核酸连接；对已衔接的核酸中的TCRA和TCRB进行测序以获得条形码编码的TCRA序列和TCRB序列；基于多个部分中的同现频率，确定TCRA和TCRB基因对。在一些实施例中，使用例如对于V和C基因链段或CDR3区中存在的任何链段特异性的引物靶向TCR基因内的CDR3区。在一些实施例中，通过将条形码编码的扩增子聚集在一起进行高通量DNA测序而实施该测序，该高通量DNA测序读取每条链的受体序列和条形码。已测序的条形码允许将受体序列映射到源头的孔。在一些实施例中，TCRA和TCRB的匹配采用了统计学分析。使用统计学分析来比较每个TCRA序列的孔占据模式与每个TCRB序列的孔占据模式；将偶然地共享超预期孔数的序列标记为可能配对伙伴。使用另外的统计学方来鉴定编码功能性TCR的TCRA和TCRB对，例如，包括以下步骤的方法：通过排列生成零分布并且鉴定满足靶标错误发现率的对。参见，US20100330571。
在一些实施例中，从个体T细胞鉴定编码形成功能性TCR的肽的TCRA序列和TCRB序列。可克隆T细胞，并通过例如牵涉杂合体捕获和测序的方法进行TCR基因测序，参见，Linnemann，C.，et al.，High-throughput identification of antigen-specific TCRsby TCR gene capture.Nat Med，2013.19(11)：p.1534-154。简单地说，在一个实例中，使用诱饵文库来靶向TCRA和TCRB基因座内的每一个个体可变元件(V)和接合(J)元件，每个基因座分别有8个和6个诱饵。诱饵从基因组DNA捕获TCR编码序列。通过包括连接条形码编码的衔接子和配对端深度测序的方法对所捕获的序列进行测序。分析序列数据以重构TCR J基因、TCRB D基因和TCR V基因。将CDR3区序列确定为位于保守的TCR V半胱氨酸和TCR J苯丙氨酸残基之间的核苷酸序列。在其他实施例中，将个体T细胞包封在具有器皿特异性条形码(例如，作为逆转录(RT)引物用于TCR基因的mRNA逆转录的寡核苷酸)的器皿(例如，油包水乳液)内。参见，例如，专利申请Ser.No.WO2016176322。
在一些实施例中，本发明包括形成已排序的T细胞受体序列的排序表，每个T细胞受体序列包含编码TCRalpha链和TCRbeta链的一对TCRA基因和TCRB基因。(图1，步骤9和步骤11。)
在一些实施例中，本发明包括形成表达工程化TCR的T细胞的步骤。(图2，步骤4)。该细胞优选为不产生内源性TCR的T细胞，如后续章节中详细解释。几种用来产生表达嵌合抗原受体(CAR)方法是本领域中已知的，参见，例如，Essand，M.and A.S.Loskog，Genetically engineered T cells for the treatment of cancer.J Intern Med，2013.273(2)：p.166-81)。在一些实施例中，使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体)来引入TCRA基因和TCRB基因，其中该基因编码与小核糖核酸病毒2A自裂解肽链接体融合的TCR-alpha链和TCR-beta链，参见，例如，Zhang，Y.，et al.，Transduction of Human T Cellswith a Novel T-Cell Receptor Confers Anti-HCV Reactivity.PLOS Pathogens，2010.6(7)：p.e1001018和Walchli，S.，et al.，A practical approach to T-cellreceptor cloning and expression.PLoS One，2011.6(11)：p.e27930。在一些实施例中，引入元件以提升工程化TCR的形成。该提升包括使用鼠恒定TCR结构域来提升TCR表达，将拉链结构域加入细胞内TCR结构域中以推动链间识别和结合，或将该恒定结构域的细胞外部分中的二硫键工程化以增减链间亲和性，参见，例如，US9624292 B2和Kuball，J.，et al.，Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced intohuman T cells.Blood，2007.109(6)：p.2331。另外的提升包括以MSCV载体和克隆的人类CD3复合体共转染靶标细胞，以便改善TCR的细胞表面表达水平，参见，例如，Guo，X.-z.J.，et al.，Rapid cloning，expression，and functional characterization of pairedαβandγδT-cell receptor chains from single-cell analysis.MolecularTherapy.Methods&Clinical Development，2016.3：p.15054。
在一些实施例中，不使用表达载体，而是将TCRA和TCRB基因对作为转录活性DNA片段诸如PCR扩增子引入细胞内。在一些实施例中，使用促进转染的试剂，例如，TransIT-293试剂(Mirus Bio，Madison，Wisc.)在其他实施例中，将TCRA和TCRB基因对作为功能性mRNA(例如，体外转录的mRNA)引入细胞内。参见，例如，Simon，P.，et al.，Functional TCRRetrieval from Single Antigen-Specific Human T Cells Reveals Multiple NovelEpitopes.Cancer Immunol Res，2014.2(12)：p.1230-1244，其中该mRNA是通过T7聚合酶产生的，并且包含用于增加RNA稳定性和转译效率的3’修饰，诸如人类β-球蛋白基因的3’UTR。
在一些实施例中，将TCRA和TCRB基因对引入接受性T细胞中。(图2，步骤5)。在一些实施例中，该T细胞缺少内源性TCR基因，参见，例如，Zhang，Y.，et al.，Transduction ofHuman T Cells with a Novel T-Cell Receptor Confers Anti-HCV Reactivity.PLOSPathogens，2010.6(7)：p.e1001018和Simon，P.，et al.，Functional TCR Retrieval fromSingle Antigen-Specific Human T Cells Reveals Multiple Novel Epitopes.CancerImmunol Res，2014.2(12)：p.1230-1244，TCRA/B阴性Jurkat76细胞系的示例。在其他实施例中，该细胞是T细胞杂交瘤，参见，例如，Siewert，K.，et al.，Unbiased identificationof target antigens of CD8+ T cells with combinatorial libraries coding forshort peptides.Nat Med，2012.18(5)：p.824-8。在一些实施例中，将T细胞进一步工程化以表达CD4共受体。在一些实施例中，可将T细胞进一步工程化以在进行TCR抗原识别和后续的T细胞活化时表达受体基因(例如，荧光蛋白诸如GFP或荧光素酶)。该受体构造体可包含应答型启动子，诸如在进行T细胞活化时上调的NFAT蛋白应答型启动子。
在一些实施例中，本发明包括制备测序准备就绪的靶标核酸文库并对其测序的步骤。靶标核酸可包含从样本中获得的TCRA基因和TCRB基因。靶标核酸也可以是包含肿瘤新抗原编码序列(肿瘤外显子组)的肿瘤外显子组。如本文所述，该文库包含具有另外的特征的个体分子，该另外的特征包括但不限于衔接子、条形码和引物结合位点。将靶标序列与所述另外的特征缀合(例如，通过连接或通过引物延伸)。
在一些实施例中，对从肿瘤材料分离的核酸进行测序牵涉文库制备步骤。(图1，步骤6。)该步骤包括形成衔接核酸，其中衔接子分子与靶标核酸连接，从而能够进行条形码编码和测序。所述连接可以是平末端连接，也可以是更有效的粘性末端连接。靶标核酸或衔接子可以通过包括链填充的“末端修复”平末端化，即通过DNA聚合酶延伸3’-末端以消除5’-突出端。在一些实施例中，平末端化的衔接子和靶标核酸可以通过向衔接子的3’-端添加单个核苷酸和向靶核酸的3’-端添加单个互补核苷酸(例如，通过DNA聚合酶或末端转移酶)具有粘性。在其他实施例中，所述衔接子和所述靶核酸可以通过使用限制性内切酶消化来获得粘性端(突出端)。就已知含有限制性内切酶识别位点的已知靶标核酸而言，后一种选择更为有利。在一些实施例中，可能需要其他酶步骤来完成所述连接。在一些实施例中，多核苷酸激酶可以用于向所述靶核酸分子和衔接子分子添加5’-磷酸盐。
在将衔接子独立于靶标核酸序列(例如，通过连接)而加入的实施例中，样本中的靶标核酸在每一端接受相同的衔接子分子。为了区分所得衔接靶标核酸的多条链，衔接子可以具有Y结构，参见，例如，美国专利No.8053192、No.8182989和No.8822150。
在一些实施例中，衔接子包含引物结合位点，例如，扩增引物结合位点或测序引物结合位点。在一些实施例中，所述衔接子分子是在体外合成的人工序列。在其他实施例中，所述衔接子分子是在体外合成的天然存在的序列。在其他实施例中，所述衔接子分子是分离的天然存在的分子。
在一些实施例中，本发明是包括扩增靶标核酸的步骤的方法。所述扩增可以通过指数聚合酶链反应(PCR)、仅对一条链进行线性扩增或利用寡核苷酸引物的任何其他方法。各种PCR条件在PCR Strategies(M.A.Innis，D.H.Gelfand，and J.J.Sninsky eds.，1995，Academic Press，San Diego，CA)第14章；PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky和T.J.White编撰，学院出版社，纽约，1990)中描述。
在一些实施例中，扩增利用了与靶标序列缀合的衔接子中存在的通用引物结合位点，如上文所示。在其他实施例中，使用基因特异性(靶标特异性)引物或引物对。在一些实施例中，引物含有包含衔接子序列的5’悬垂，例如，条形码或测序引物结合位点。此类引物的使用省略了本发明方法中的衔接子连接步骤。
在一些实施例中，本发明包括将条形码引入到所述靶核酸中，尤其是用于测序。对单个分子进行测序通常需要分子条形码，诸如例如美国专利号7,393,665、8,168,385、8,481,292、8,685,678和8,722,368以及7,264,929中所述。独特的分子条形码是短人工序列，其通常在体外操作的最初步骤中添加到样本(诸如患者的样本)中的每个分子上。所述条形码标记了分子及其子代。所述独特的分子条形码(UID)有多种用途。条形码可以跟踪样本中的每个单个核酸分子，以评估例如患者的血液中循环肿瘤DNA(ctDNA)分子的存在和数量，以便在不进行活检的情况下检测和监测癌症。参见美国专利申请14/774,518。独特的分子条形码也可用于测序纠错。单个靶分子的整个子代都用相同的条形码标记，并形成条形码家族。不被带条形码家族的所有成员共享的序列变异被作为伪像丢弃而不是真突变。条形码还可以用于位置去重复和靶定量，因为整个家族代表原始样本中的单个分子。参见同上。
在本发明的一些实施例中，衔接子包含一个或多个条形码。条形码可以是在样品被混合(多重化)的情况下用于鉴定样本来源的多重样本ID(MID)。条形码也可以作为UID，用于鉴定每个原始分子及其子代。所述条形码也可以是UID和MID的组合。在一些实施例中，将单个条形码用作UID和MID两者。在一些实施例中，每个条形码包括预定义序列。在其他实施例中，所述条形码包括随机序列。条形码可以是1-20个核苷酸长。
测序可通过本领域已知的任何方法实施。尤其有利的是能够读取循环靶标分子的高通量单分子测序。此类技术的示例包括SOLiD平台(ThermoFisher Scientific，FosterCity，Cal.)、基于荧光的Heliscope测序仪(Helicos Biosciences，Cambridge，Mass.)、利用SMRT的Pacific BioSciences平台(Pacific Biosciences，Menlo Park，Cal.)或利用纳米孔技术的平台诸如Oxford Nanopore Technologies(Oxford，UK)或Roche SequencingSolutions(Roche Genia，Santa Clara，Cal.)制造的那些平台，通过可逆终止子合成测序(SBS)(Illumina，San Diego，Cal.)和牵涉或不牵涉合成测序的任何其它现有或未来DNA测序技术进行测序。测序步骤可利用平台特异性测序引物。可如本文所述，将这些引物的结合位点引入本发明方法中，即，将这些引物的结合位点作为第二衔接子或扩增引物的一部分引入。
分析和误差校正
在一些实施例中，测序步骤牵涉包括序列比对步骤的序列分析。在一些实施例中，比对用于从多个序列(例如，具有相同条形码(UID)的多个序列)中确定共有序列。在一些实施例中，条形码(UID)用于从具有相同条形码(UID)的多个序列中确定共有序列。在其他实施例中，使用条形码(UID)来消除伪像，即，存在于一些但并非全部具有相同条形码(UID)的序列中的变异。源自PCR误差或测序误差的此类伪像可以被消除。
在一些实施例中，通过定量样本中每个条形码(UID)的序列的相对数量，可以定量样本中的每个序列的数量。每个UID代表原始样本中的单个分子，且计数与每个序列变体相关的不同UID可以确定每个序列在原始样本中的比例。本领域技术人员将能够确定为确定共有序列所必需的序列读取的数量。在一些实施例中，为了准确的定量结果，每个UID(“序列深度”)都需要读取相关数量。在一些实施例中，期望的深度是每个UID 5-50次读取。
本发明还包括鉴定肿瘤新抗原的步骤。在一些实施例中，该方法包括通过全基因组测序(WGS)、全外显子测序(WES)或对肿瘤相关表达基因富集的遗传物质进行更具选择性的测序而对肿瘤相关遗传物质进行测序的步骤。(图1，步骤5、步骤6和步骤8)。该方法还包括与参考基因组比对。因此，当与参考基因组对比时，将新抗原鉴定为在编码序列中包含差异(突变)的序列。仅将错义突变(即，改变氨基酸编码的突变)记为潜在的新抗原性突变。
在一些实施例中，使用肽阵列通过血清抗体筛查发现了新抗原。在这一实施例中，如美国专利9346892所述，合成了多达250万个长度介于8到20个氨基酸之间的肽的可寻址阵列。用来自肿瘤患者的血清筛查该阵列，并通过比色或荧光测定(例如，ELISA测定)检测抗体结合。选择被鉴定为具有免疫应答(抗体结合)的阵列肽作为新抗原。
在一些实施例中，鉴定新抗原的步骤还包括试验性新表位预测步骤或试验性抗原肽预测步骤，如以下文献中所述：例如，Kvistborg，P.，et al.，Immune monitoringtechnology primer：whole exome sequencing for neoantigen discovery andprecision oncology.Journal for ImmunoTherapy of Cancer，2016.4(1)：p.22。Tran，E.，P.F.Robbins，and S.A.Rosenberg，′Final common pathway′of human cancerimmunotherapy：targeting random somatic mutations.Nat Immunol，2017.18(3)：p.255-262.；Anagnostou，V.，et al.，Evolution of Neoantigen Landscape DuringImmune Checkpoint Blockade in Non-Small Cell Lung Cancer.Cancer Discov，2016.；Zolkind，P.，et al.，Neoantigens in immunotherapy and personalized vaccines：Implications for head and neck squamous cell carcinoma.Oral Oncology.；Kreiter，S.，et al.，Mutant MHC class II epitopes drive therapeutic immuneresponses to cancer.Nature，2015.520(7549)：p.692-6.；Hegde，P.S.，V.Karanikas，andS.Evers，The Where，the When，and the How of Immune Monitoring for CancerImmunotherapies in the Era of Checkpoint Inhibition.Clin Cancer Res，2016.22(8)：p.1865-74；Yuan，J.，et al.，Novel technologies and emerging biomarkers forpersonalized cancer immunotherapy.J Immunother Cancer，2016.4：p.3。例如，如果发现下列有利特征中的一个或多个，则将突变肽鉴定为新抗原：已知该突变与肿瘤相关，例如，存在于COSMIC数据库(含有在人类癌症中发现的体细胞突变的综合列表的数据库)中；该突变的长度为8至15个氨基酸；突变的肽序列定位在位于推动蛋白酶体裂解的序列附近的蛋白质内；突变的肽序列定位在位于抗原处理相关转运蛋白(TAP)识别位点附近的蛋白质内。
在一些实施例中，本发明还包括预测新抗原与MHC等位基因结合水平的步骤。在一些实施例中，通过基于序列的计算机模拟评估来测定该结合水平(例如，使用HiddenMarkov模型、机械学习算法和神经网络中的一种或多种作出该预测)。在其他实施例中，通过基于结构的计算机模拟评估来测定该水平，例如，使用已知的肽抗体-MHC晶体结构，可作出给定的肽是否将与MHC分子结合的预测，参见，Sharma，G.and R.A.Holt，T-cell epitopediscovery technologies.Human Immunology，2014.75(6)：p.514-519。在其他实施例中，通过实验测定结合水平，其中所测量的肽与MHC的亲和性小于1毫摩尔，例如，500nM、200nM或低至50nM或更低。
在一些实施例中，该方法包括生成源自肿瘤的新抗原序列的排序表的步骤。(图1，步骤9和步骤10)。
本发明还包括形成候选的新抗原肽并将它们与MHC分子偶联以形成抗原呈递复合体的步骤(图2，步骤3)。在一些实施例中，使用现有的体外肽合成方法形成该肽，例如，Merrifield，Science 232：341-347(1986)，Barany&Merrifield，The Peptides，Gross&Meienhofer，eds.(N.Y.，Academic Press)，pp.1-284(1979)和Stewart&Young，SolidPhase Peptide Synthesis，(Rockford，Ill.，Pierce)，第2版(1984)中描述的方法。也可使用微阵列合成该肽，其中，氨基酸与受光不稳定保护基保护的氨基基团一起引入，如美国专利9346892中所述。
本发明还包括形成抗原呈递多肽复合体的步骤。该复合体是包含α1、α2和α3肽以及β2微球蛋白肽的MHC-I复合体或包含α1、α2、β1和β2肽的MHC-II复合体。在一些实施例中，该MHC肽是患者特异性的。通过测定包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G基因座中一者或多者在内的患者的Ia类和Ib类基因序列中一者或多者的核酸序列，获得患者特异性蛋白序列。在一些实施例中，从患者的HLA基因序列形成用于产生MHC肽的表达载体。在一些实施例中，通过将HLA-A和HLA-B基因进行低分辨率分型并将该序列排序以确定最可能的等位基因而测定患者的HLA基因序列，参见，例如，Emerson，R.，et al.Immunosequencingidentifies signatures of cytomegalovirus exposure history and HLA-mediatedeffects on the T cell repertoire.Nature Genetics 49，no.5(2017)：659。
在一些实施例中，使用MHC复合体的多聚体。在一些实施例中，该MHC多聚体是二聚体、四聚体或八聚体。在一些实施例中，通过将多个MHC单体捕获在骨架分子上而产生MHC多聚体。在一些实施例中，该骨架是聚合物分子诸如葡聚糖或另一种碳水化合物聚合物。在一些实施例中，该骨架含有亲和性捕获分子。在一些实施例中，通过将重组产生的生物素化的MHC单体捕获在与葡聚糖结合的链霉亲和素或亲和素上而形成MHC多聚体。在一些实施例中，该多聚体是四聚体。
在一些实施例中，将MHC多聚体与检测分子缀合。在一些实施例中，该检测分子是荧光染料，其与骨架缀合以使得能够通过流式细胞术分离与MHC多聚体结合的T细胞。在一些实施例中，该检测分子是与骨架缀合的重金属(例如，通过Newell，E.W.et al.，(2012).Cytometry bytime-of-flight shows combinatorial cytokine expression andvirus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cellphenotypes.Immunity，36(1)，142-152)中描述的方法缀合)以使其能够通过大量细胞计数法检测。参见，Sharma，G.and R.A.Holt，T-cell epitope discovery technologies.HumanImmunology，2014.75(6)：p.514-519；Altman，J.D.and M.M.Davis，MHC-PeptideTetramers to Visualize Antigen-Specific T Cells.Curr Protoc Immunol，2016.115：p.17 3 1-17 3 44。
本发明还包括对MHC多聚体进行条形码编码。在一些实施例中，该条形码是单链或双链核酸分子。该条形码核酸分子可被捕获到与MHC多聚体相同的骨架上。在一个实例中，该条形码是生物素化的DNA分子，它被捕获到与MHC分子所结合者相同的以链霉亲和素或亲和素修饰的葡聚糖上。参见，Bentzen，A.K.，et al.，Large-scale detection of antigen-specific T cells using peptide-MHC-I multimers labeled with DNA barcodes.NatBiotechnol，2016.34(10)：p.1037-1045。在一些实施例中，该核酸条形码的长度为10、15、20或25个碱基或碱基对。该条形码编码具有标记多达～1010个不同MHC多聚体的潜力。在一些实施例中，将用来捕获细胞的MHC多聚体与寡核苷酸探针缀合。在细胞捕获之后，将与所缀合的寡核苷酸的区域互补的核酸探针与结合至每个细胞的每个pMHC多聚体杂交。
本发明还包括捕获与MHC多聚体结合的T细胞的步骤。在一些实施例中，使用标准免疫学方案，将细胞用条形码编码的p-MHC多聚体染色并且用mAb复染。例如，在QBC过程之前，将人类T细胞用Fc阻断剂孵育，然后用p-MHC多聚体孵育。
本发明还包括对T细胞进行条形码编码的步骤。在一方面，对T细胞进行条形码编码以鉴定在相同T细胞内发现(并因此形成功能性TCR)的TCRA基因和TCRB基因。在另一方面，对T细胞进行条形码编码以鉴定每个与条形码编码的MHC多聚体结合的细胞。
在一些实施例中，该细胞条形码编码是例如2016年4月15日提交的美国专利申请13/981,711中描述的量子条形码编码(QBC)方法。简单地说，令混合物中的多个细胞经历下列过程：令细胞与对于细胞内核酸靶标为特异性的寡核苷酸混合物接触。该寡核苷酸具有基因结合序列和条形码寡核苷酸退火区，令该细胞进一步与条形码寡核苷酸接触，该条形码寡核苷酸与TCR引物中的条形码寡核苷酸退火区互补；在裂池合成的一个或多个轮次的每一个轮次中，令该细胞进一步与另外的条形码寡核苷酸接触，其中在每个轮次中，条形码编码的寡核苷酸包含与来自前一个轮次的条形码寡核苷酸退火区互补的退火区，从而在多个T细胞中的每一个中，将细胞特异性条形码组装到每个TCR引物上。
该探针靶标可以是RNA转录本或DNA序列。在目的在于鉴定TCR基因的条形码编码的第一个轮次中，探针可以是TCR基因特异性的。在目的在于鉴定与MHC结合的细胞的条形码编码的第二个轮次中，探针可以是任何细胞内靶标特异性的，即，选自T细胞标记物转录本(TCRA、TCRB、CD3、CD4、CD8、FoxP3等)、起源自基因组序列或转染的DNA序列的转录本。
本发明还包括从每个抗原结合T细胞获得测序数据以便将T细胞受体与其同源抗原匹配的步骤。(图2，步骤7)。这一步骤包括，在每个细胞中，测定TCRA基因和TCRB基因的序列、独特的细胞条形码(例如，通过QBC获得的)序列和与结合到T细胞的MHC多聚体相关的条形码序列。如图2中所示并且如图3中更详细地所示，该匹配允许根据下列方案鉴定TCR所结合的抗原：
(细胞条形码1+TCRA序列x1)+(细胞条形码1+TCRB序列y1)+(细胞条形码1+pMHC条形码z1)
(细胞条形码2+TCRA序列x2)+(细胞条形码2+TCRB序列y2)+(细胞条形码2+pMHC条形码z2)
(细胞条形码n+TCRA序列xn)+(细胞条形码n+TCRB序列yn)+(细胞条形码n+pMHC条形码zn)。
实例
实例1(预见性的)。
在本实例中，获得了手术切除的肿瘤的片段。使用机械组织解离方法和酶促组织解离方法的组合，将肿瘤样品解离为单个细胞。使用对于每一细胞类型为特异性的表面标记物、细胞内标记物或细胞核标记物，通过荧光活化细胞分选(FACS)将解离的细胞分选为肿瘤细胞、正常组织细胞和免疫细胞(肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL))。肿瘤细胞生物标记物是细胞角蛋白，而T细胞的生物标记物组合是CD3+CD8+TCR+。将核酸从肿瘤细胞、正常细胞和T细胞的独立级分中分离，并且可选地使用KAPA表达萃取试剂盒和KAPA HiFi QC试剂(KapaBiosystems，Wilmington，Mass.)定量。
使用KAPA Hyper Prep试剂盒对来自肿瘤细胞和正常(非淋巴细胞)细胞的核酸进行测序文库制备，并使用
EZ人类外显子组探针v3.0(Roche SequencingSolutions，Madison，Wisc.)对该核酸进行外显子组序列捕获。根据制造商的建议，将所捕获的文库核酸在任何Illumina仪器(
NextSeq、
或
)上测序。
通过序列比对算法比较序列数据，以将编码区内的非同义替换鉴定为潜在的新抗原。通过计算机模拟评估潜在新抗原与患者的MHC-I复合体结合的能力。该评估产生了抗原性新抗原的排序表。使用被预测为以高亲和性与MHC结合的肽来构造新抗原文库。使用美国专利9346892中描述的阵列方法在体外合成该肽。
通过将生物素化的肽链与含有葡聚糖骨架的链霉亲和素组合，形成包含α1链、α2链和β2微球蛋白的MHC分子。令该复合体与生物素化的DNA条形码接触以形成DNA-条形码编码的MHC四聚体。将条形码编码的MHC四聚体与抗原肽组合以形成条形码编码的抗原呈递复合体(APC)。使用该肽形成DNA-条形码编码的肽-MHC复合体的文库。
通过条形码匹配条形码编码的TCRA基因和TCRB基因的序列，并分析出现频率以形成具有观察到的或推定的α/β配对、推定的患者HLA类型的浸润性肿瘤淋巴细胞T细胞受体序列的排序表。用表达人类CD8α和β亚基的质粒以及GFP受体质粒将表达质粒中所选择的TCRA基因和TCRB基因共转染到Jurkat细胞系内。用DNA-条形码编码的肽-MHC复合体孵育TCR特异性转基因T细胞群以进行抗原-TCR结合。使用标准免疫学方案，将细胞用条形码编码的p-MHC多聚体染色并且用mAb复染。可使另外的抗体靶向细胞类型鉴定标记物，例如CD4或CD8等。例如，将人类T细胞在染色缓冲液(含0.5％BSA的磷酸盐缓冲盐水PBS)和Fc阻断剂在0℃孵育30分钟。然后，将细胞在染色缓冲液中洗涤，在0℃或室温用凭经验确定的浓度的p-MHC多聚体和/或抗体孵育30分钟至1小时。染色之后，将细胞在染色缓冲液中洗涤数次，在所希望浓度的PBS中重构以进行下游的组合条形码编码(量子条形码编码或QBC)过程。
对与肽-MHC复合体结合的细胞进行组合条形码编码(QBC)过程，其中，用相同的细胞特异性条形码标记与表达在该细胞表面上的T细胞受体结合的TCRA mRNA、TCRB mRNA和p-MHC(图3)。如图3中所例证，(1)细胞表面表位(a)可以使用以具有靶标特异性核酸条形码(b)进行条形码编码的抗体识别并且进一步使用该细胞特异性核酸条形码(c)进行条形码编码。细胞表面表位(2)可以使用以具有靶标特异性核酸条形码(d)进行条形码编码的抗体识别并且进一步使用相同的细胞特异性核酸条形码(c)进行条形码编码。细胞(3)中的任意核酸靶标具有序列(e)并且可使用相同的细胞特异性核酸条形码(c)进行条形码编码。这些序列的示例包括细胞表征性生物标记物，例如，TCRA、TCRB、CD3、CD4、CD8和FoxP3。TCR基因(4)TCRA(f)和TCRB(g)可使用相同的细胞特异性核酸条形码(c)进行条形码编码。TCRA(f)基因和TCRB(g)基因编码组装到与具有肽相关核酸条形码(h)的MHC-肽多聚体(6)结合的TCR(5)中的肽，肽相关核酸条形码(h)与细胞特异性核酸条形码(c)相同。
QBC过程是包含下述步骤的方法：组装附接至靶标特异性核酸的DNA条形码诸如附接至抗体或直接附接至核酸靶标的条形码。通过裂池合成的几个轮次来组装DNA条形码，其中，条形码编码的寡核苷酸被加入每个轮次中，并且该寡核苷酸包含与来自前一个轮次的条形码寡核苷酸的退火区互补的退火区，从而将细胞特异性条形码组装到每个引物上(参见，2016年4月15日提交的美国专利申请Ser.No.13/981,711)。
在最终步骤中，对条形码编码的TCRA mRNA、条形码编码的TCRB mRNA和来自肽-MHC复合体的DNA条形码进行测序。诠释数据，按照具有相同的细胞条形码而解析同源TCR基因对并且匹配肽。
Claims (17)
1.一种鉴定由α链(TCRα)和β链(TCRβ)构成的T细胞受体(TCR)的同源抗原的方法，所述方法包括：
a.从患者获得T细胞群，其中每个T细胞包含TCR，所述TCR包含TCRα链和TCRβ链；
b.以细胞特异性条形码对来自每个T细胞的核酸进行条形码编码；
c.对条形码编码的核酸进行测序，以获得编码TCRα链和TCRβ链的TCRA基因序列和TCRB基因序列；
d.将具有相同条形码的TCRA基因和TCRB基因鉴定为编码功能性TCR的基因对；
e.将步骤d.中鉴定的TCRA和TCRB基因对引入接受性T细胞中；
f.从所述患者获得肿瘤细胞群，每个肿瘤细胞可能包含一个或多个肿瘤新抗原；
g.鉴定肿瘤新抗原基因；
h.从步骤g.中鉴定的新抗原基因形成新抗原肽；
i.将来自步骤h.的所述新抗原肽与MHC-1抗原呈递复合体和寡核苷酸条形码组合，以形成条形码编码的MHC-新抗原肽复合体；
j.令来自步骤e.的所述T细胞与来自步骤i.的所述条形码编码的MHC-新抗原肽复合体接触，以形成细胞结合的MHC-新抗原-TCR复合体；
k.以细胞特异性条形码对来自步骤j.的来自每个T细胞的所述TCR基因和MHC-新抗原复合体条形码进行条形码编码；
l.对来自步骤k.的所述T细胞中的具有相关联的细胞特异性条形码的TCR基因和与细胞特异性条形码相关联的所述MHC-新抗原复合体条形码进行测序；
m.如果所述TCR基因和所述MHC-新抗原复合体条形码中的至少一者与相同的细胞特异性条形码相关联，则将所述新抗原鉴定为TCR同源抗原。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述T细胞群是通过肿瘤组织的解离获得的。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码TCRα链和TCRβ链的TCRA基因序列和TCRB基因序列选自重排的DNA序列或RNA序列。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述T细胞群是通过基于蛋白标记物表达的捕获从所述肿瘤获得的。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤b.和步骤k.中的一者或两者中，所述T细胞条形码编码是通过包括以下步骤的方法进行的
a.令多个所述T细胞与引物混合物接触，所述引物包含基因特异性序列和条形码寡核苷酸退火区；以及
b.令多个所述T细胞与条形码寡核苷酸接触，所述条形码寡核苷酸与所述引物中的所述条形码寡核苷酸退火区互补；
c.在裂池合成的一个或多个轮次中的每一个中，令多个所述T细胞与另外的条形码寡核苷酸接触，其中在每个轮次中，所述条形码编码的寡核苷酸包含与来自前一个轮次的所述条形码寡核苷酸的所述退火区互补的退火区，从而在多个所述T细胞中的每一个中，将细胞特异性条形码组装到每个引物上。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤b.中，所述核酸的条形码编码是通过包括以下步骤的方法进行的：
a.将含有核酸的所述T细胞群分为多个含有单个细胞的第一部分；
b.将含细胞的部分与多个第二部分混合，每个所述第二部分含有条形码编码的寡核苷酸引物的多个拷贝，所述条形码编码的寡核苷酸引物包含基因特异性序列和条形码，其中在每个部分之内，所述条形码是相同的，但在不同部分之间，所述条形码是不同的；
c.将所述第一部分与所述第二部分融合；以及
d.形成具有条形码编码的寡核苷酸引物的扩增子，从而对所述核酸进行条形码编码。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b.中的所述条形码编码和步骤c.中的所述测序是通过包括以下步骤的方法进行的
a.将所述T细胞群分为多个含有多组细胞的部分；
b.将条形码编码的衔接子与每个部分中的核酸连接；
c.对已衔接核酸中的所述TCRA和TCRB进行测序以获得条形码编码的TCRA序列和TCRB序列；
d.基于多个部分中的同现频率，确定TCRA和TCRB基因对。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对条形码编码的TCR基因的所述测序是对所述基因的CDR3高变区进行测序。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，鉴定所述TCR基因是鉴定所述基因的CDR3高变区。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述新抗原基因是通过下述鉴定的：对所述肿瘤细胞中的所述核酸进行测序，并将具有非沉默突变的基因鉴定为新抗原基因。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述新抗原基因是使用患者血清通过筛查肽阵列鉴定的。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤e.中，将所述基因引入表达载体中。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接受性T细胞缺少内源性TCR基因表达。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤e.中，将所述基因作为转录活性DNA片段引入。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤e.中，将所述基因作为mRNA引入。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过与所述MHC-I分子结合的能力来进一步选择所述鉴定的新抗原。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述新抗原-TCR复合体中的所述新抗原和所述TCR进行条形码编码包括将每个复合体划分到含有条形码的反应体积内。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862685469P | 2018-06-15 | 2018-06-15 | |
| US62/685469 | 2018-06-15 | ||
| PCT/EP2019/065717 WO2019238939A1 (en) | 2018-06-15 | 2019-06-14 | A system for identification of antigens recognized by t cell receptors expressed on tumor infiltrating lymphocytes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112292600A true CN112292600A (zh) | 2021-01-29 |
Family
ID=66912858
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201980040057.5A Pending CN112292600A (zh) | 2018-06-15 | 2019-06-14 | 用于鉴定被表达在肿瘤浸润性淋巴细胞上的t细胞受体识别的抗原的系统 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11603565B2 (zh) |
| EP (1) | EP3807636B1 (zh) |
| JP (1) | JP7145980B2 (zh) |
| CN (1) | CN112292600A (zh) |
| WO (1) | WO2019238939A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2021248941A1 (en) * | 2020-03-31 | 2022-11-17 | Repertoire Immune Medicines, Inc. | Barcodable exchangeable peptide-MHC multimer libraries |
| WO2021222855A1 (en) * | 2020-04-30 | 2021-11-04 | The Translational Genomics Research Institute | Neoantigen-informed tumor-infiltrating lymphocyte cancer immunotherapy |
| WO2024050299A1 (en) * | 2022-08-29 | 2024-03-07 | 10X Genomics, Inc. | Improved methods and compositions for characterization of antigen-binding molecules from single cells |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001007612A2 (en) * | 1999-07-21 | 2001-02-01 | Incyte Genomics, Inc. | Receptors and associated proteins |
| US20040086521A1 (en) * | 2002-10-02 | 2004-05-06 | Harald Kropshofer | Method for the identification of antigenic peptides |
| CN103097888A (zh) * | 2010-05-06 | 2013-05-08 | 赛昆塔公司 | 利用克隆型谱监测健康和疾病状态 |
| US20130150252A1 (en) * | 2011-12-13 | 2013-06-13 | Sequenta, Inc. | Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes |
| WO2015185067A1 (en) * | 2014-06-06 | 2015-12-10 | Herlev Hospital | Determining antigen recognition through barcoding of mhc multimers |
| WO2016100977A1 (en) * | 2014-12-19 | 2016-06-23 | The Broad Institute Inc. | Methods for profiling the t-cel- receptor repertoire |
| WO2016196691A2 (en) * | 2015-06-01 | 2016-12-08 | California Institute Of Technology | Compositions and methods for screening t cells with antigens for specific populations |
| WO2017013170A1 (en) * | 2015-07-22 | 2017-01-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Identification of antigen epitopes and immune sequences recognizing the antigens |
| CA2996887A1 (en) * | 2015-09-11 | 2017-03-16 | Agenus Inc. | Engineered host cells and methods of use thereof |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7244559B2 (en) | 1999-09-16 | 2007-07-17 | 454 Life Sciences Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
| US7393665B2 (en) | 2005-02-10 | 2008-07-01 | Population Genetics Technologies Ltd | Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides |
| EP2121983A2 (en) | 2007-02-02 | 2009-11-25 | Illumina Cambridge Limited | Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates |
| CA2765949C (en) | 2009-06-25 | 2016-03-29 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Method of measuring adaptive immunity |
| ES2595433T3 (es) | 2010-09-21 | 2016-12-30 | Population Genetics Technologies Ltd. | Aumento de la confianza en las identificaciones de alelos con el recuento molecular |
| US9346892B2 (en) | 2011-03-18 | 2016-05-24 | Roche Nimble Gen, Inc. | Methods for synthesis of an oligopeptide microarray |
| EP2502934B1 (en) | 2011-03-24 | 2018-01-17 | Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz | Single chain antigen recognizing constructs (scARCs) stabilized by the introduction of novel disulfide bonds |
| CA2983937A1 (en) | 2015-04-27 | 2016-11-03 | Abvitro Llc | Methods of sequencing, determining, pairing, and validating therapeutic agents and disease specific antigens |
| WO2018057051A1 (en) * | 2016-09-24 | 2018-03-29 | Abvitro Llc | Affinity-oligonucleotide conjugates and uses thereof |
-
2019
- 2019-06-14 JP JP2020568974A patent/JP7145980B2/ja active Active
- 2019-06-14 EP EP19731265.5A patent/EP3807636B1/en active Active
- 2019-06-14 CN CN201980040057.5A patent/CN112292600A/zh active Pending
- 2019-06-14 US US17/252,222 patent/US11603565B2/en active Active
- 2019-06-14 WO PCT/EP2019/065717 patent/WO2019238939A1/en active Application Filing
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001007612A2 (en) * | 1999-07-21 | 2001-02-01 | Incyte Genomics, Inc. | Receptors and associated proteins |
| US20040086521A1 (en) * | 2002-10-02 | 2004-05-06 | Harald Kropshofer | Method for the identification of antigenic peptides |
| CN103097888A (zh) * | 2010-05-06 | 2013-05-08 | 赛昆塔公司 | 利用克隆型谱监测健康和疾病状态 |
| US20130150252A1 (en) * | 2011-12-13 | 2013-06-13 | Sequenta, Inc. | Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes |
| WO2015185067A1 (en) * | 2014-06-06 | 2015-12-10 | Herlev Hospital | Determining antigen recognition through barcoding of mhc multimers |
| WO2016100977A1 (en) * | 2014-12-19 | 2016-06-23 | The Broad Institute Inc. | Methods for profiling the t-cel- receptor repertoire |
| WO2016196691A2 (en) * | 2015-06-01 | 2016-12-08 | California Institute Of Technology | Compositions and methods for screening t cells with antigens for specific populations |
| WO2017013170A1 (en) * | 2015-07-22 | 2017-01-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Identification of antigen epitopes and immune sequences recognizing the antigens |
| CA2996887A1 (en) * | 2015-09-11 | 2017-03-16 | Agenus Inc. | Engineered host cells and methods of use thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王萍: "淋巴瘤病理诊断技术的演变", 上海医学, no. 12, 15 December 1995 (1995-12-15) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US11603565B2 (en) | 2023-03-14 |
| WO2019238939A1 (en) | 2019-12-19 |
| JP7145980B2 (ja) | 2022-10-03 |
| EP3807636B1 (en) | 2024-01-31 |
| US20210285049A1 (en) | 2021-09-16 |
| EP3807636A1 (en) | 2021-04-21 |
| JP2021526382A (ja) | 2021-10-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220251653A1 (en) | Determining Antigen-Specific T-Cells | |
| Bentzen et al. | Large-scale detection of antigen-specific T cells using peptide-MHC-I multimers labeled with DNA barcodes | |
| Kristensen et al. | Neoantigen-reactive CD8+ T cells affect clinical outcome of adoptive cell therapy with tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma | |
| Ma et al. | High-throughput and high-dimensional single-cell analysis of antigen-specific CD8+ T cells | |
| Egorov et al. | Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers | |
| KR102489353B1 (ko) | 특정 집단에 대한 항원으로 t 세포를 스크리닝하기 위한 조성물 및 방법 | |
| Robins | Immunosequencing: applications of immune repertoire deep sequencing | |
| DK2970959T3 (en) | METHODS AND COMPOSITIONS FOR MARKING AND ANALYSIS OF SAMPLES | |
| JP2018535652A5 (zh) | ||
| US11603565B2 (en) | System for identification of antigens recognized by T cell receptors expressed on tumor infiltrating lymphocytes | |
| US11319590B2 (en) | Enhanced immune cell receptor sequencing methods | |
| Briggs et al. | Tumor-infiltrating immune repertoires captured by single-cell barcoding in emulsion | |
| WO2020056173A1 (en) | Antigen specific tcr identification using single-cell sorting | |
| US20220259670A1 (en) | Kit and method for analyzing single t cells | |
| Gupta et al. | Single-cell sequencing of T cell receptors: a perspective on the technological development and translational application | |
| KR101782806B1 (ko) | 차세대염기서열분석기술 기반의 고효율, 고해상도 조직적합성 형별 분석 방법 및 키트 | |
| AU756357B2 (en) | Methods for identifying therapeutic targets | |
| WO2023122237A1 (en) | Kit and method for analyzing t cell receptors from single t cells | |
| US20220034881A1 (en) | Barcoded peptide-mhc complexes and uses thereof | |
| WO2023018782A1 (en) | Methods to determine cd4+ memory t cell responses to sars-cov-2 infection or vaccination |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |