KR20160088996A

KR20160088996A - 중증 아벨리노 각막이상증과 관련된 돌연변이 및 그 용도

Info

Publication number: KR20160088996A
Application number: KR1020150008017A
Authority: KR
Inventors: 김응권; 지용우; 최승일; 맹용선; 이보람; 조소연
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2015-01-16
Filing date: 2015-01-16
Publication date: 2016-07-27
Also published as: KR101692545B1

Abstract

본 발명은 종래에 알려진 아벨리노 각막이상증의 유전자 마커인 TGFBI 유전자 상의 R124H 변이에 더하여, H174D, I247N 및 R179X 중 하나 이상의 변이를 추가적으로 검출하는 검출수단을 포함하는 중증 아벨리노 각막이상증의 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명은 간단한 면역학적 분석 또는 유전자형 분석을 통해 중증 아벨리노 각막이상증의 유전적 위험성을 높은 신뢰도로 예측할 수 있다. 또한 본 발명은 부모가 일반적인 아벨리노 각막이상증을 가지는 경우 자녀에게서 중증 아벨리노 각막이상증이 발병할 가능성을 조기에 측정 또는 예측하는 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

중증 아벨리노 각막이상증과 관련된 돌연변이 및 그 용도{Mutations Related to Severe Avellino Corneal Dystrophies and Use Thereof}

본 발명은 중증 아벨리노 각막이상증과 관련된 돌연변이 및 이를 진단마커로 이용한 중증 아벨리노 각막이상증의 진단방법에 관한 것이다.

단백질 컨포메이션 장애는 세포 및 조직 내 단백질 축적 또는 세포내 응집형성을 그 특징으로 하는 질병군 중의 하나이다. 미스폴딩 단백질의 세포 내 축적은 노화-관련 질병의 원인이기도 하다. 미스폴딩 단백질은 일반적으로 세포나 조직에 독성을 갖는 다량체 복합물을 형성하여 궁극적으로 세포사멸을 촉진한다. 따라서 모든 세포는 단백질 및 세포 기관을 통제하는 감시 메키니즘에 의존하여, 미스폴딩, 부작동 또는 손상된 세포 구성 성분을 단백질분해 시스템으로 제거하지만, 이러한 시스템의 부작동 또는 변형이 있는 경우, 손상되거나 미스 폴딩된 단백질 및 손상된 기관이 세포 내 축적되어 질병이 발생하게 된다.

TGFBI 유전자는 분비 신호부위와 인테그린의 리간드 인식 부위인 Arg-Gly-Asp(RGD) 모티브를 포함하는 683개 아미노산으로 이루어진 단백질을 인코딩하는 유전자이다. TGFBI 단백질은 인테그린과 상호작용하여 세포 부착 및 이동을 매개하며, TGFBI 유전자 녹아웃 마우스에서 TGFBI 단백질의 결여가 세포 증식 및 종양을 유도한다는 보고가 있었다. 지금까지 각막 이상증과 관련하여, 38 개의 다른 TGFBI 유전자 변이가 알려졌다. 흥미롭게도, 각각의 다른 변이는 독특한 각막 이상증 표현형을 나타내는데, 예를 들면 R124H 변이는 제2형 과립형 각막이상증, R124C 변이는 제1형 격자형 각막 이상증을, R555W 변이는 제1형 과립형 각막 이상증을, 그리고 R555Q 변이는 티엘-벵케(Thiel-Behnke) 각막 이상증을 나타낸다.

TGFBI 유전자 변이를 원인으로 하는 각막이상증 중 다수를 차지하는 제2형 과립형 각막이상증(아벨리노 각막이상증)에 있어서, 다른 임상적 특이사항이 없음에도 동일한 연령대의 다른 환자에 비하여 매우 심한 증상을 보이고 빠른 시일 내에 실명에 이르는 중증의 환자가 관찰되고 있으나, 이러한 중증 질환의 유전적 특징은 아직 규명된 바가 없다. 따라서, 효율적인 치료전략 수립을 위해 중증 각막이상증을 조기에 진단할 수 있는 유전자 마커의 발굴이 요구되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 TGFBI(TGF beta induced) 유전자 변이와 관련된 각막 이상증(corneal dystrophy) 중 가장 많은 유병률을 보이는 제2형 과립형 각막이상증(아벨리노 각막이상증) 환자 중에서, 과립상으로 각막에 침착되는 변이형 TGFBI 단백질의 양이 다른 환자에 비하여 크게 증가된 중증의 환자가 존재한다는 사실에 주목하고 일반적인 환자들과 구분되는 이들 중증 환자들의 유전적 특징을 규명하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 아벨리노 각막이상증의 특징적인 변이인 R124H 외에도 H174D, I247N 및 R179X 중 하나 이상의 변이를 추가적으로 가지는 경우 중증의 아벨리노 각막이상증이 발병하며, 이에 상기 돌연변이를 복합마커로 하여 진단을 수행할 경우 중증 아벨리노 각막이상증의 유전적 위험성을 높은 신뢰도로 예측할 수 있다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 중증 아벨리노 각막이상증(severe Avellino corneal dystrophy)의 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 중증 아벨리노 각막이상증(severe Avellino corneal dystrophy)의 진단용 키트를 제공한다:

(a)서열목록 제1서열의 124번째 아미노산 잔기가 R에서 H로 치환된 변이 아미노산(R124H)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 및

(b) 서열목록 제1서열의 174번째 아미노산 잔기가 H에서 D로 치환된 변이 아미노산(H174D); 서열목록 제1서열의 247번째 아미노산 잔기가 I에서 N으로 치환된 변이 아미노산(I247N); 및 서열목록 제1서열의 179번째 아미노산 잔기가 R에서 종결코돈(stop codon)으로 치환된 변이 아미노산(R179X)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브.

본 발명자들은 TGFBI(TGF beta induced) 유전자 변이와 관련된 각막 이상증(corneal dystrophy) 중 가장 많은 유병률을 보이는 제2형 과립형 각막이상증(아벨리노 각막이상증) 환자 중에서, 과립상으로 각막에 침착되는 변이형 TGFBI 단백질의 양이 다른 환자에 비하여 크게 증가된 중증의 환자가 존재한다는 사실에 주목하고 일반적인 환자들과 구분되는 이들 중증 환자들의 유전적 특징을 규명하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 아벨리노 각막이상증의 특징적인 변이인 R124H 외에도 H174D, I247N 및 R179X 중 하나 이상의 변이를 추가적으로 가지는 경우 중증의 아벨리노 각막이상증이 발병하며, 이에 상기 돌연변이를 복합마커로 하여 진단을 수행할 경우 중증 아벨리노 각막이상증의 유전적 위험성을 높은 신뢰도로 예측할 수 있다는 사실을 발견하였다.

본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열은 야생형 TGFBI 단백질의 아미노산 서열이다.

본 명세서에서 용어“중증 아벨리노 각막이상증(severe Avellino corneal dystrophy)”은 TGFBI 유전자 상에서 c.418G>A(R124H) 변이만을 가지는 일반적인 아벨리노 각막이상증 환자에 비하여 그 병적 상태(pahological condition)가 임상적으로 명확하게 구분될 정도로 각막에 축적되는 변이 단백질의 양이 유의하게 증가한 질환을 의미하며, 보다 구체적으로는 각막에 축적된 과립형 또는 격자형 변이 단백질 콜로니의 숫자 또는 이의 면적이 동일한 연령대의 일반적인 아벨리노 각막이상증 환자의 150% 이상인 경우를 의미하고, 보다 더 구체적으로는 200% 이상인 경우를 의미하며, 보다 더 구체적으로는 250% 이상인 경우를 의미하며, 가장 구체적으로는 300% 이상인 경우를 의미한다. 본 명세서에서 용어“일반적인 아벨리노 각막이상증”은 TGFBI 유전자 상에 R124H, H174D, I247N 및 R179X의 변이 중 R124H 변이 만을 가지는 아벨리노 각막이상증을 의미한다. 따라서,용어“일반적인 아벨리노 각막이상증”및“R124H 변이 아미노산만을 가지는 아벨리노 각막이상증”은 모두 TGFBI 유전자 상에 R124H, H174D, I247N 및 R179X의 변이 중 R124H 변이 만을 가지는 아벨리노 각막이상증을 의미하는 것으로서, 동일한 의미를 가진다.

본 명세서에서 용어“동일한 연령대”는 기준 환자와 연령의 차이가 6년 이하인 연령대를 의미하며, 보다 구체적으로는 5년 이하인 연령대를 의미한다.

본 명세서에서 용어“진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 복합 마커로 사용되는 변이 아미노산(또는 유전자)이 발현된다는 사실이 당업계에 통상적인 기술을 통해 확인되면 중증 아벨리노 각막이상증의 유전적 위험도가 높은 것으로 판단된다.

본 명세서에서, 용어“뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지한다.

본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어“상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 따라서 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지고, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서, 프라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어, “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어“어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 키트에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich (1994)). 출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 인간(예컨대, 아벨리노 각막이상증 환자)으로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명의 키트에 있어서, 상기 특정 서열을 규명하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화(FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질(예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 본 발명의 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 질환의 위험도를 결정한다.

본 명세서에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수 도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 본 발명의 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3’-말단 또는 5’-말단은 상기 뉴클레오타이드에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3’-말단 또는 5’-말단에 상기 뉴클레오타이드 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 R124H 변이 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에서 418번째 뉴클레오타이드가 G에서 A로 치환된 변이 뉴클레오타이드이다.

본 발명에 따르면, 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열은 야생형 TGFBI (TGF beta induced) 유전자의 뉴클레오타이드 서열이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 H174D 변이 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에서 520번째 뉴클레오타이드가 C에서 G로 치환된 변이 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 I247N 변이 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에서 740번째 뉴클레오타이드가 T에서 A로 치환된 변이 뉴클레오타이드이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 R179X 변이 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에서 535번째 뉴클레오타이드가 C에서 T로 치환된 변이 뉴클레오타이드이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 중증 아벨리노 각막이상증의 진단용 키트를 제공한다:

(a)서열목록 제1서열의 124번째 아미노산 잔기가 R에서 H로 치환된 변이 아미노산(R124H)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머; 및

(b) 서열목록 제1서열의 174번째 아미노산 잔기가 H에서 D로 치환된 변이 아미노산(H174D); 서열목록 제1서열의 124번째 아미노산 잔기가 I에서 N으로 치환된 변이 아미노산(I124N); 및 서열목록 제1서열의 179번째 아미노산 잔기가 R에서 종결코돈(stop codon)으로 치환된 변이 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 변이 아미노산에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머.

본 발명에 따르면, 본 발명의 변이 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 항원-항체 반응을 이용한 면역분석(immunoassay) 방법에 따라 검출하여 중증 아벨리노 각막이상증을 진단하는 데 이용될수 있다.

본 명세서에서 용어 “폴리펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.

본 발명의 키트는 항체 대신에 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수도 있다. 본 명세서에서 용어“앱타머”는 단일 줄기의(single-stranded) 핵산(RNA 또는 DNA) 분자 또는 펩타이드 분자로서 특정 표적물질에 높은 친화력과 특이성으로 결합하여 작용을 나타내는 것을 의미한다. 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명을 통해 진단되는 아벨리노 각막이상증에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 종래에 알려진 아벨리노 각막이상증의 유전자 마커인 TGFBI 유전자 상의 R124H 변이에 더하여, H174D, I247N 및 R179X 중 하나 이상의 변이를 추가적으로 검출하는 검출수단을 포함하는 중증 아벨리노 각막이상증의 진단용 키트를 제공한다.

(b) 본 발명은 간단한 면역학적 분석 또는 유전자형 분석을 통해 중증 아벨리노 각막이상증의 유전적 위험성을 높은 신뢰도로 예측할 수 있다.

(c) 본 발명은 부모가 일반적인 아벨리노 각막이상증을 가지는 경우 자녀에게서 중증 아벨리노 각막이상증이 발병할 가능성을 조기에 측정 또는 예측하는 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 TGFBI 유전자 상의 R124H 변이를 가진 35세 여성의 좌안과 우안을 촬영한 사진이다.
도 2는 R124H 및 R179X 변이를 동시에 가지는 35세 여성의 우안을 촬영한 사진(도 2a)과, 동일한 환자의 TGFBI 유전자 상의 유전자 변이 및 이의 크로마토그램을(도 2b) 보여주는 그림이다.
도 3은 R124H 및 I274N 변이를 동시에 가지는 25세 남성의 좌안(left eye)을 촬영한 사진(도 3a)과, 동일한 환자의 TGFBI 유전자 상의 유전자 변이(도 3b) 및 이의 크로마토그램(도 3c)을 보여주는 그림이다.
도 4는 R124H만 가지는 상기 도 3 피험자의 어머니의 우안 및 좌안을 촬영한 사진(도 4a)과, 동일한 환자의 TGFBI 유전자 상의 유전자 변이 및 이의 크로마토그램(도 4b)을 보여주는 그림이다.
도 5는 R124H 및 H174D 변이를 동시에 가지는 35세 여성의 우안 및 좌안을 촬영한 사진(도 5a)과, 동일한 환자의 TGFBI 유전자 상의 유전자 변이 및 이의 크로마토그램(도 5b)을 보여주는 그림이다.
도 6은 R124H 및 H174D 변이를 동시에 가지는 38세 남성의 우안 및 좌안을 촬영한 사진(도 6a)과, 동일한 환자의 TGFBI 유전자 상의 유전자 변이 및 이의 크로마토그램(도 6b)을 보여주는 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

혈액 시료의 채취

중증의 아벨리노 각막이상증 환자 및 각 환자의 가족구성원에게서 서면 동의서를 통한 동의 하에 혈액을 채취하였으며, 모든 실험은 연세대학교 연구윤리 심의위원회의 승인 하에 진행되었다.

DNA 정제

시료로부터의 DNA 정제는 QIAamp(R) DNA Blood 미니 킷(250)(QIAGEN, cat. NO. 51106)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 수행하였다. 이를 요약하면, 우선 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브의 바닥에 20 QIAGEN 프러테아제(또는 프로티네이즈 K)를 파이펫팅하고, 200 전혈 시료를 마이크로원심분리 튜브에 첨가하였다. 이후 시료에 AL 완충액 200 를 첨가하고 펄스-볼텍싱을 통해 15초 간 혼합하였다. 이를 물수조 또는 가열 블록에서 56℃까지 가열하면서 10분간 배양하고 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브에서 짧게 원심분리하여 눈꺼풀 안쪽의 물방울을 제거하였다. 시료에 200 에탄올(96-100%)을 첨가하고 다시 펄스-볼텍싱으로 15초 간 혼합하였다. 이후 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브에서 짧게 원심분리하여 눈꺼풀 안쪽의 물방울을 제거하였다. 수득한 혼합물을 가장자리가 젖지 않도록 하면서 2 ml 수집 튜브 내의 QIAamp Mini 스핀 컬럼에 옮기고, 뚜껑을 닫은 후 6000 x g (8000 rpm)로 1분 간 원심분리하였다. QIAamp Mini 스핀 컬럼을 깨끗한 2 ml 수집 튜브에 위치시키고, 여과물을 포함한 튜브는 버렸다. QIAamp Mini 스핀 컬럼을 조심스럽게 열고 가장자리가 젖지 않도록 하면서 AW1 완충액 500 를 첨가한 다음 뚜껑을 닫고 6000 x g (8000 rpm)로 1분 간 원심분리하였다. 다시 QIAamp Mini 스핀 컬럼을 깨끗한 2 ml 수집 튜브에 위치시키고, 여과물을 포함한 튜브는 버렸다. QIAamp Mini 스핀 컬럼을 조심스럽게 열고 가장자리가 젖지 않도록 하면서 AW2 완충액 500 를 첨가한 다음 뚜껑을 닫고 최대속도(20,000 x g; 14,000 rpm)로 3분 간 원심분리하였다. QIAamp Mini 스핀 컬럼을 깨끗한 1.5 ml 수집 튜브에 위치시키고, 여과물을 포함한 튜브는 버렸다. QIAamp Mini 스핀 컬럼을 조심스럽게 열고 AE 완충액 또는 증류수 200 를 첨가한 후 상온(15-25℃)에서 1분 간 배양한 뒤 6000 x g (8000 rpm)에서 1분 간 원심분리하였다. 모든 원심분리는 상온(15-25℃)에서 수행하였다.

PCR

Mixed PCR Premix (i-starTag) 20μl(iNtRON biotechnology, cat. NO.25167)를 이용하여 TGFBI 유전자에 대한 PCR을 수행하였다. PCR Premix에 농도를 아는 DNA 100ng과 프라이머(역방향, 정방향 각각 1μl씩)을 섞고 총 부피가 20μl이 되도록 하였다. 개시단계 변성은 94℃에서 2분 간의 30 사이클, 변성은 94℃에서 20초 간, 어닐링은 58℃에서 15간, 연장은 72℃에서 50초 간, 그리고 최종 연장은 72℃에서 5분 간 수행하였다. 프라이머는 10 pmol로 사용하고 각 엑손의 프라이머 서열은 아래 표와 같다.

TGFBI 유전자 프라이머 서열

엑손	프라이머	서열	Tm	증폭물 크기
1	ex1 F	5'- CGCTCTCACTTCCCTGGAG (19)	54.4	323
1	ex1 R	5'- TTTTAGTTCGGGCTTTGTCC (20)	53.3	323
2	ex2 F	5'- GGGAGTCATTAAAGTGGGGTGGA (23)	59.8	196
2	ex2 R	5'- AGCTTGGTCTCCTGGCTGGTTAC (23)	59.5	196
3	Ex3 F	5'- CAACTTAGTGGAGAGGGGCCAGA (23)	60.3	206
3	Ex3 R	5'- CTCTCTCCCACCATTCCCTTCC (22)	59.6	206
4	Ex4 F	5'- GCCATCCCTCCTTCTGTCTTCTG (23)	59.9	217
4	Ex4 R	5'- CCGGGCAGACGGAGGTCATC (20)	63.3	217
5	Ex5 F	5'- ACTGACACCCTGTCCTTCCTCCT (23)	58.9	261
5	Ex5 R	5'- AGCCCACACATGGAACAGAAATG (23)	59.6	261
6	Ex6 F	5'- CTGCTCATCCTTGCTGCTTCTCT (23)	58.8	249
6	Ex6 R	5'- AGAGTTCCTGCTAGGCCCCTCTT (23)	59.6	249
7	Ex7 F	5'- TCTGTGGGGAGTGCCAGAGTC (21)	58.6	234
7	Ex7 R	5'- CAAATGAGGCAGCAGCAGGA (20)	58.4	234
8	Ex8 F	5'- TGGACCCTGACTTGACCTGAGTC (23)	58.9	311
8	Ex8 R	5'- AAAGGATGGCAGAAGAGATGGTG (23)	58.1	311
9	Ex9 F	5'- CCCTGGGGTGGATGAATGATAAA (23)	60.4	251
9	Ex9 R	5'- GCCTCCAGGGACAATCTAACAGG (23)	59.7	251
10	Ex10 F	5'- ATTGCAGGAGCACATCTCTCTGG (23)	59.2	230
10	Ex10 R	5'- GCTTCCCAGGAGCATGATTTAGG (23)	59.8	230
11	Ex11 F	5'- GCCCCTCGTGGAAGTATAACCAG (23)	59.6	248
11	Ex11 R	5'- ATCCCACTCCAGCATGACCACT (22)	59.2	248
12	Ex12 F	5'- TGACAGGTGACATTTTCTGTGTGTG (25)	58.4	224
12	Ex12 R	5'- GGGCCCTGAGGGATCACTACTTT (23)	60.4	224
13	Ex13 F	5'- TGACCAGGCTAATTACCATTCTTGG (25)	59.2	210
13	Ex13 R	5'- CAGCCTTTGATTTGCAGGACACT (23)	59.2	210
13-1	Ex13 F	5 - CTTGACCAGGCTATTTACCATTCTT (25)	57.3	281
13-1	Ex13 R	5'- GGTTGTGTGTGTATAATTCCATCC (24)	57	281
14	Ex14 F	5'- TGCTCTACTTTCAACCACTACTCTG (25)	53.7	198
14	Ex14 R	5'- CCAACTGCCACATGAAGAAAAGG (23)	59.4	198
15	Ex15 F	5'- TCACTCTGGTCAAACCTGCCTTT (23)	58.7	183
15	Ex15 R	5'- CCTCTATGGCCCAAACAGAGGAC (23)	59.7	183
16	Ex16 F	5'- GCCATTGTCATAAGCAGTTGCAG (23)	58.3	176
16	Ex16 R	5'- ATACAGCAGATGGCAGGCTTGG (22)	59.9	176
17	Ex17 F	5'- TGGGGAGATCTGCACCTATTTGA (23)	59.3	710
17	Ex17 R	5'- GGTCAGCACACTGTACCATGCAC (23)	58.9	710

이후, DNA 젤 전기영동을 통해 PCR 산물의 크기를 확인하였으며, 생어(Sanger) DNA 시퀀싱을 수행하였다(Cosmogenetech co, Ltd, Korea).

정상군과 비교

환자들의 TGFBI 유전자 염기서열을 이미 보고된 TGFBI의 cDNA(Gene bank NC_000005.10)의 배열과 비교하였으며, 임상적으로 또래에 비해 증세가 중한 환자의 경우, R124H 돌연변이가 있는 환자에게 I247N, H174D 또는 R179X 돌연변이가 추가적으로 존재하는지 여부를 확인하였다.

TGFBI 유전자 아미노산 서열 및 관련 돌연변이 부위

TGFBI 아미노산 서열

돌연변이 발생부위

MALFVRLLAL/ALALALGPAA/TLAGPAKSPY/
QLVLQHSRLR/GRQHGPNVCA/VQKVIGTNRK/
YFTNCKQWYQ/RKICGKSTVI/SYECCPGYEK/
VPGEKGCPAA/LPLSNLYETL/GVVGSTTTQL/
YTDRTEKLRP/EMEGPGSFTI/FAPSNEAWAS/
LPAEVLDSLV/SNVNIELLNA/LRYHMVGRRV/
LTDELKHGMT/LTSMYQNSNI/QIHHYPNGIV/
TVNCARLLKA/DHHATNGVVH/LIDKVISTIT/
NNIQQIIEIE/DTFETLRAAV/AASGLNTMLE/
GNGQYTLLAP/TNEAFEKIPS/ETLNRILGDP/
EALRDLLNNH/ILKSAMCAEA/IVAGLSVETL/
EGTTLEVGCS/GDMLTINGKA/IISNKDILAT/
NGVIHYIDEL/LIPDSAKTLF/ELAAESDVST/
AIDLFRQAGL/GNHLSGSERL/TLLAPLNSVF/
KDGTPPIDAH/TRNLLRNHII/KDQLASKYLY/
HGQTLETLGG/KKLRVFVYRN/SLCIENSCIA/
AHDKRGRYGT/LFTMDRVLTP/PMGTVMDVLK/
GDNRFSMLVA/AIQSAGLTET/LNREGVYTVF/
APTNEAFRAL/PPRERSRLLG/DAKELANILK/
YHIGDEILVS/GGIGALVRLK/SLQGDKLEVS/
LKNNVVSVNK/EPVAEPDIMA/TNGVVHVITN/
VLQPPANRPQ/ERGDELADSA/LEIFKQASAF/
SRASQRSVRL/APVYQKLLERM/KH

R124H
H174D R179X

I247N

실험결과

중증 환자의 유전자 검사

본 발명에서 각막에의 과립형 및 격자형 변이 단백질 침착량이 매우 심각한 환자들을 유전자 분석 대상으로 선정하였으며, 이들 환자들에서 각각 TGFBI 유전자의 단일염기 변형(Single Nucleotide Polymorphism)을 관찰 할 수 있었다. 이들은 모두 공통적으로 R124H의 이형접합의 돌연변이가 관찰되었고 동시에 각각 H174D, R179X 또는 I247N의 이형접합 돌연변이가 추가적으로 관찰되었다. 이는 가족구성원의 혈액으로 유전자 검사를 진행한 결과 각각의 부모에게서 하나씩 유전된 것으로 확인되었다.

단일 돌연변이 및 복합 돌연변이를 가진 환자들의 표현형

R124H 변이만을 가지는 환자의 경우 약 12세를 전후하여 각막 침착물이 1-2개 정도의 콜로니를 이루다가 연령이 증가함에 따라 콜로니의 수와 면적이 증가하며, 이에 따라 각막의 혼탁함이 심해지게 된다(도 1). 그러나, R124H 변이를 가지지 않은 채 부모 중 한쪽 즉 I247N, H174D 또는 R179X 변이만을 가지는 가족 구성원의 경우는 정상적인 각막 표현형을 보였다. 즉 유전자 변이는 있으나 표현형으로 나타나지 않는 침묵 돌연변이이다.

반면, 도 2(R124H + R179X), 도 3(R124H + I247N) 및 도 5(R124H + H174D)에서 보는 바와 같이, R124H와 I247N, H174D 또는 R179X이 혼인에 의해 결합할 경우 자손에서 아주 심한 증상의 각막이상증이 발생함을 관찰하였다. 이들 복합 돌연변이를 가진 환자는 R124H 변이만을 가지는 부모님(도 4)보다도 훨씬 더 많은 면적의 각막 침착물이 생긴 것을 확인하였으며, 증상의 정도는 나이와 비례하지 않았다.

복합 돌연변이를 가진 환자들의 표현형 정량분석

본 발명에서 발굴한 복합 돌연변이를 가진 환자들의 증상의 정도를 정량화 하기 위해 R124H + (H174D, R179X or I247N)의 변이를 가진 환자와 일반적인 아벨리노 각막이상증(R124H 변이만 보유)의 변이 단백질 축적(과립 + 격자)의 면적을 측정하였다. 각 환자들의 각막 촬영 당시 연령은 33.25 ± 5.68 세였고 전체 각막 면적 대비 축적(deposit)의 면적은 22.58 ± 7.51 % 였다(과립 14.28 ± 9.25 % / 격자 8.30 ± 7.06 %). 각 유전자형 별 환자들의 각막 측적량은 다음과 같다:

R124H + H174D : OD, 16.27; OS, 13.78

R124H + H174D: OD, 29.01; OS 30.55

R124H + I247N :OS 15.02

R124H + R179X : OD, 30.24; OS, 23.18

비슷한 연령대(33.56 ± 3.36세)의 아벨리노 이형접합체 환자 113명 226안의 전체 각막 면적 대비 축적의 평균 면적은 4.47 ± 3.59 % 였다(과립 3.44 ± 3.06 % / 격자 0.81 ± 1.30 %). 따라서, 복합 돌연변이를 가지는 환자는 동일 연령대로서 R124H 변이만 보유하는 일반적인 아벨리노 각막이상증의 평균에 비해 5.05 배 넓은 면적의 축적을 보임을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 복합 마커는 일반적인 아벨리노 각막이상증과 임상적으로 명확히 구분되는 중증의 아벨리노 각막이상증의 유전적 위험성을 예측할 수 있는 유전자 마커로 이용될 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation Yonsei University <120> Mutations Related to Severe Avellino Corneal Dystrophies and Use Thereof <130> PN140600 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 683 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Leu Phe Val Arg Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Pro Ala Ala Thr Leu Ala Gly Pro Ala Lys Ser Pro Tyr Gln Leu 20 25 30 Val Leu Gln His Ser Arg Leu Arg Gly Arg Gln His Gly Pro Asn Val 35 40 45 Cys Ala Val Gln Lys Val Ile Gly Thr Asn Arg Lys Tyr Phe Thr Asn 50 55 60 Cys Lys Gln Trp Tyr Gln Arg Lys Ile Cys Gly Lys Ser Thr Val Ile 65 70 75 80 Ser Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Glu Lys Val Pro Gly Glu Lys Gly 85 90 95 Cys Pro Ala Ala Leu Pro Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Val 100 105 110 Val Gly Ser Thr Thr Thr Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu 115 120 125 Arg Pro Glu Met Glu Gly Pro Gly Ser Phe Thr Ile Phe Ala Pro Ser 130 135 140 Asn Glu Ala Trp Ala Ser Leu Pro Ala Glu Val Leu Asp Ser Leu Val 145 150 155 160 Ser Asn Val Asn Ile Glu Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val 165 170 175 Gly Arg Arg Val Leu Thr Asp Glu Leu Lys His Gly Met Thr Leu Thr 180 185 190 Ser Met Tyr Gln Asn Ser Asn Ile Gln Ile His His Tyr Pro Asn Gly 195 200 205 Ile Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala 210 215 220 Thr Asn Gly Val Val His Leu Ile Asp Lys Val Ile Ser Thr Ile Thr 225 230 235 240 Asn Asn Ile Gln Gln Ile Ile Glu Ile Glu Asp Thr Phe Glu Thr Leu 245 250 255 Arg Ala Ala Val Ala Ala Ser Gly Leu Asn Thr Met Leu Glu Gly Asn 260 265 270 Gly Gln Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Ile 275 280 285 Pro Ser Glu Thr Leu Asn Arg Ile Leu Gly Asp Pro Glu Ala Leu Arg 290 295 300 Asp Leu Leu Asn Asn His Ile Leu Lys Ser Ala Met Cys Ala Glu Ala 305 310 315 320 Ile Val Ala Gly Leu Ser Val Glu Thr Leu Glu Gly Thr Thr Leu Glu 325 330 335 Val Gly Cys Ser Gly Asp Met Leu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Ile Ile 340 345 350 Ser Asn Lys Asp Ile Leu Ala Thr Asn Gly Val Ile His Tyr Ile Asp 355 360 365 Glu Leu Leu Ile Pro Asp Ser Ala Lys Thr Leu Phe Glu Leu Ala Ala 370 375 380 Glu Ser Asp Val Ser Thr Ala Ile Asp Leu Phe Arg Gln Ala Gly Leu 385 390 395 400 Gly Asn His Leu Ser Gly Ser Glu Arg Leu Thr Leu Leu Ala Pro Leu 405 410 415 Asn Ser Val Phe Lys Asp Gly Thr Pro Pro Ile Asp Ala His Thr Arg 420 425 430 Asn Leu Leu Arg Asn His Ile Ile Lys Asp Gln Leu Ala Ser Lys Tyr 435 440 445 Leu Tyr His Gly Gln Thr Leu Glu Thr Leu Gly Gly Lys Lys Leu Arg 450 455 460 Val Phe Val Tyr Arg Asn Ser Leu Cys Ile Glu Asn Ser Cys Ile Ala 465 470 475 480 Ala His Asp Lys Arg Gly Arg Tyr Gly Thr Leu Phe Thr Met Asp Arg 485 490 495 Val Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp 500 505 510 Asn Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr 515 520 525 Glu Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn 530 535 540 Glu Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly 545 550 555 560 Asp Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu 565 570 575 Ile Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu 580 585 590 Gln Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val 595 600 605 Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val 610 615 620 Val His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Arg Pro Gln 625 630 635 640 Glu Arg Gly Asp Glu Leu Ala Asp Ser Ala Leu Glu Ile Phe Lys Gln 645 650 655 Ala Ser Ala Phe Ser Arg Ala Ser Gln Arg Ser Val Arg Leu Ala Pro 660 665 670 Val Tyr Gln Lys Leu Leu Glu Arg Met Lys His 675 680 <210> 2 <211> 2052 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggcgctct tcgtgcggct gctggctctc gccctggctc tggccctggg ccccgccgcg 60 accctggcgg gtcccgccaa gtcgccctac cagctggtgc tgcagcacag caggctccgg 120 ggccgccagc acggccccaa cgtgtgtgct gtgcagaagg ttattggcac taataggaag 180 tacttcacca actgcaagca gtggtaccaa aggaaaatct gtggcaaatc aacagtcatc 240 agctacgagt gctgtcctgg atatgaaaag gtccctgggg agaagggctg tccagcagcc 300 ctaccactct caaaccttta cgagaccctg ggagtcgttg gatccaccac cactcagctg 360 tacacggacc gcacggagaa gctgaggcct gagatggagg ggcccggcag cttcaccatc 420 ttcgccccta gcaacgaggc ctgggcctcc ttgccagctg aagtgctgga ctccctggtc 480 agcaatgtca acattgagct gctcaatgcc ctccgctacc atatggtggg caggcgagtc 540 ctgactgatg agctgaaaca cggcatgacc ctcacctcta tgtaccagaa ttccaacatc 600 cagatccacc actatcctaa tgggattgta actgtgaact gtgcccggct gctgaaagcc 660 gaccaccatg caaccaacgg ggtggtgcac ctcatcgata aggtcatctc caccatcacc 720 aacaacatcc agcagatcat tgagatcgag gacacctttg agacccttcg ggctgctgtg 780 gctgcatcag ggctcaacac gatgcttgaa ggtaacggcc agtacacgct tttggccccg 840 accaatgagg ccttcgagaa gatccctagt gagactttga accgtatcct gggcgaccca 900 gaagccctga gagacctgct gaacaaccac atcttgaagt cagctatgtg tgctgaagcc 960 atcgttgcgg ggctgtctgt agagaccctg gagggcacga cactggaggt gggctgcagc 1020 ggggacatgc tcactatcaa cgggaaggcg atcatctcca ataaagacat cctagccacc 1080 aacggggtga tccactacat tgatgagcta ctcatcccag actcagccaa gacactattt 1140 gaattggctg cagagtctga tgtgtccaca gccattgacc ttttcagaca agccggcctc 1200 ggcaatcatc tctctggaag tgagcggttg accctcctgg ctcccctgaa ttctgtattc 1260 aaagatggaa cccctccaat tgatgcccat acaaggaatt tgcttcggaa ccacataatt 1320 aaagaccagc tggcctctaa gtatctgtac catggacaga ccctggaaac tctgggcggc 1380 aaaaaactga gagtttttgt ttatcgtaat agcctctgca ttgagaacag ctgcatcgcg 1440 gcccacgaca agagggggag gtacgggacc ctgttcacga tggaccgggt gctgaccccc 1500 ccaatgggga ctgtcatgga tgtcctgaag ggagacaatc gctttagcat gctggtagct 1560 gccatccagt ctgcaggact gacggagacc ctcaaccggg aaggagtcta cacagtcttt 1620 gctcccacaa atgaagcctt ccgagccctg ccaccaagag aacggagcag actcttggga 1680 gatgccaagg aacttgccaa catcctgaaa taccacattg gtgatgaaat cctggttagc 1740 ggaggcatcg gggccctggt gcggctaaag tctctccaag gtgacaagct ggaagtcagc 1800 ttgaaaaaca atgtggtgag tgtcaacaag gagcctgttg ccgagcctga catcatggcc 1860 acaaatggcg tggtccatgt catcaccaat gttctgcagc ctccagccaa cagacctcag 1920 gaaagagggg atgaacttgc agactctgcg cttgagatct tcaaacaagc atcagcgttt 1980 tccagggctt cccagaggtc tgtgcgacta gcccctgtct atcaaaagtt attagagagg 2040 atgaagcatt ag 2052

Claims

다음을 포함하는 중증 아벨리노 각막이상증(severe Avellino corneal dystrophy)의 진단용 키트:
(a)서열목록 제1서열의 124번째 아미노산 잔기가 R에서 H로 치환된 변이 아미노산(R124H)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 및
(b) 서열목록 제1서열의 174번째 아미노산 잔기가 H에서 D로 치환된 변이 아미노산(H174D); 서열목록 제1서열의 247번째 아미노산 잔기가 I에서 N으로 치환된 변이 아미노산(I247N); 및 서열목록 제1서열의 179번째 아미노산 잔기가 R에서 종결코돈(stop codon)으로 치환된 변이 아미노산(R179X)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브.
제 1 항에 있어서, 상기 R124H 변이 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에서 418번째 뉴클레오타이드가 G에서 A로 치환된 변이 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 H174D 변이 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에서 520번째 뉴클레오타이드가 C에서 G로 치환된 변이 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 I247N 변이 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에서 740번째 뉴클레오타이드가 T에서 A로 치환된 변이 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 R179X 변이 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에서 535번째 뉴클레오타이드가 C에서 T로 치환된 변이 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 중증 아벨리노 각막이상증(severe Avellino corneal dystrophy)은 각막에 축적된 변이 단백질 콜로니의 숫자 또는 이의 면적이 동일한 연령대의 R124H 변이 아미노산만을 가지는 아벨리노 각막이상증 환자의 150% 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
다음을 포함하는 중증 아벨리노 각막이상증의 진단용 키트:
(a)서열목록 제1서열의 124번째 아미노산 잔기가 R에서 H로 치환된 변이 아미노산(R124H)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머; 및
(b) 서열목록 제1서열의 174번째 아미노산 잔기가 H에서 D로 치환된 변이 아미노산(H174D); 서열목록 제1서열의 124번째 아미노산 잔기가 I에서 N으로 치환된 변이 아미노산(I124N); 및 서열목록 제1서열의 179번째 아미노산 잔기가 R에서 종결코돈(stop codon)으로 치환된 변이 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 변이 아미노산에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머.
제 7 항에 있어서, 상기 중증 아벨리노 각막이상증(severe Avellino corneal dystrophy)은 각막에의 변이 단백질의 축적량이 동일한 연령대의 R124H 변이 아미노산만을 가지는 아벨리노 각막이상증 환자의 150% 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.