KR20160088429A - 케톤-변형된 폴리펩티드에 대한 옥심 접합을 위한 방법 - Google Patents

케톤-변형된 폴리펩티드에 대한 옥심 접합을 위한 방법 Download PDF

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KR20160088429A
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노파르티스 아게
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Abstract

본 발명은 케톤-변형된 단백질로부터 단백질 접합체를 제조하는 개선된 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 단백질은 1,3-디할로아세톤 또는 유사한 케톤-함유 반응물과의 반응에 의해, 2개의 시스테인의 황 원자를 함께 연결시켜 2개의 유리 시스테인을 연결시킴으로써 제조된다. 이어서, 황 원자 사이에 삽입된 케톤이 옥심을 형성하는데 사용되고, 이에 따라 단백질이 페이로드에 접합된다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 시스테인 잔기는 1,3-디할로아세톤 또는 유사한 반응물과의 반응에 의해 함께 묶이고, 새로운 케톤이 적합한 페이로드 분자와 옥심을 형성하는데 사용되고, 이에 따라 단백질이 페이로드에 접합된다. 이러한 방법은 옥심 형성을 위한 개선된 반응 조건을 제공하며, 그에 의해 더 높은 수율 및 개선된 생성물 균질성이 달성된다.

Description

케톤-변형된 폴리펩티드에 대한 옥심 접합을 위한 방법 {METHODS FOR OXIME CONJUGATION TO KETONE-MODIFIED POLYPEPTIDES}
매우 다양한 화학적 모이어티 ('페이로드')는 효소, 항체, 및 다른 큰 폴리펩티드 또는 단백질에 공유 부착되어, 접합체를 형성한다. 페이로드는 그가 부착되는 단백질의 위치를 찾기 위해 (예를 들면, 표지), 단백질의 물리화학적 특성 또는 안정성을 변형하기 위해 (예를 들면, PEG화), 단백질을 또 다른 분자 또는 단백질에 부착되도록 하기 위해 (접합체를 또 다른 화합물 또는 또 다른 접합체에 연결시키기 위한 커플링 기), 또는 페이로드 또는 단백질의 기능 또는 활성을 변형시키기 위해 (예를 들면, 백신 접합체) 사용될 수 있다. 단백질은 또한 예컨대 항체-약물 접합체 (ADC)에서, 부착된 페이로드를 특정한 조직 또는 세포 유형에 전달하는 담체로서 작용할 수 있다. 단백질에 유용하게 연결될 수 있는 페이로드의 부류는 검출가능한 모이어티 (표지), 단백질을 표면 또는 또 다른 화합물에 부착시키는 앵커링 모이어티, 단백질에 접합될 때 면역 반응을 도출하는 항원, 화학적으로 상보적 커플링 파트너와 용이하게 반응하는 (따라서 단백질을 또 다른 엔티티에 연결시키는) 커플링 기, 및 치료 모이어티, 예컨대 세포독소 및 다른 생물활성제를 포함한다. 이들 다양한 구조를 제어되고 재현가능한 방식으로 단백질에 부착시키는 것은 종종 접합체가 정확하게 기능하는데 매우 중요하다. 따라서, 많은 유형의 페이로드를 많은 상이한 단백질 또는 폴리펩티드에 부착시키는 다양한 방법에 대한 필요가 존재한다.
페이로드를 단백질에 부착시켜 단백질 접합체를 형성하기 위한 다수의 방법이 개발되었다. 예를 들면, 문헌 [Sletten, E. M. and Bertozzi, C. R. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6974 - 6998; Basle, E.; Joubert, N.; and Pucheault, M. Chemistry & Biology 2010, 17, 213-227]을 참조한다. 일부 단백질 접합체에서, 단백질과 페이로드가 연결되는 방법은 접합체의 활성 또는 관련 특성에 대해 검출불가능한 영향을 미칠 수 있고; 다른 경우에, 단백질과 페이로드 사이의 연결 특성은 접합체의 활성 또는 특성에 유의하게 영향을 미칠 수 있다. 때때로, 예를 들어 단백질당 페이로드 모이어티의 수를 제어하거나, 페이로드가 부착되는 정확한 위치를 제어하여, 그들이 단백질의 기능을 방해하지 않도록 하는 것이 중요하다. ADC는, 예를 들어 선택성을 부여하기 위해 표적화된 세포 상의 표면 구조를 인식하고 이에 결합하는 단백질을 필요로 하며, 따라서 페이로드는 항체가 인식해야 하는 표면 구조 (항원)에 대한 항체의 결합을 방해하도록 위치되지 않아야 한다. 예를 들면, 문헌 [Expert Opin. Biol. Ther. 2012, 12, 1191-1206; Toxins 2011, 3, 848-883; 및 Laurent Ducry Drug Delivery in Oncology: From Basic Research to Cancer Therapy, 1st Edition. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 2012, 12, 355-374]을 참조한다.
페이로드를 단백질에 부착시키기 위한 대부분의 방법은 단백질과 특정한 관심 페이로드 사이에 화학적 연결 구조 (링커)를 첨가하는 것을 수반한다. 링커는 각각의 모이어티 상의 이용가능한 관능기를 사용하여 관심 페이로드를 단백질에 연결시키는 방도를 제공한다. 링커는 종종 페이로드와 단백질 사이의 거리가 조정되도록 하고, 또한 생체내에서 용해되거나 분해되어 페이로드를 단백질로부터 방출시킬 수 있는 절단가능한 부분을 포함할 수 있으며, 여기서 방출은 페이로드가 그의 목적을 달성하는데 중요하다. 예를 들어, ADC에서, 접합체가 페이로드를 목적하는 효과를 가질 수 있는 위치에서 분해하여 방출시키는 것은 중요할 수 있다. 페이로드 및 단백질이 연결되는 방식에 대한 요구가 상이한 다양한 유형의 단백질-페이로드 접합체 때문에, 페이로드를 단백질에 지속적으로 및 효율적으로 연결시키는 신규 방법에 대한 지속적인 필요가 존재한다.
단백질 접합체를 형성하기 위한 가장 통상적인 방법은 많은 천연 단백질에서 자연 발생하는 특정 아미노산의 화학적 반응성에 의존한다: 리신 및 시스테인은 페이로드를 단백질에 연결시키기 위한 반응성 부위를 제공하기 때문에 종종 사용된다. 리신은 연결기 또는 페이로드 상의 적합한 친전자성 관능기와 반응할 수 있는 유리 아민 기를 갖고, 시스테인은 그의 유리 술프히드릴 기를 통해 반응할 수 있다. 그러나, 이들 자연 발생 반응성 부위에 의존하는 것은 복잡할 수 있다: 예를 들어 관심 단백질에 특정한 유형의 아미노산이 너무 많거나 너무 적을 때, 단백질 상에 페이로드의 정확한 '로딩'을 얻는 것이 어려워 진다. 단백질 표면 상의 리신의 높은 풍부도는 부위- 및 영역-선택적 접합을 어렵게 만들고, 불균질 생성물을 유발한다. 이와 대조적으로, 시스테인은 비교적 드물고, 단백질에 주로 디술피드-연결된 쌍으로 존재한다. 시스테인에서의 접합은 종종 디술피드의 환원에 이어서, 개개의 시스테인을 개별적으로 표지하기 위한 접합 시약 (예를 들면, 말레이미드)과의 반응을 필요로 한다. 이는 디술피드 연결을 제거하기 때문에, 이러한 과정에 의해 단백질 구조 및 안정성이 약화될 수 있다.
단백질은 또한 종종 부착될 페이로드의 최적 수보다 많은 리신을 갖는다: 지속적인 균질 생성물을 보장하기 위해 모든 이용가능한 리신을 점유하기에 충분한 페이로드 모이어티를 첨가하는 것은 최적의 효능에는 너무 많은 페이로드 분자를 첨가하는 것일 수 있다. 이는 접합을 위한 리신 중 일부만을 사용하여 피할 수 있지만, 이러한 부분 또는 불완전 로딩은 일반적으로 불균질 생성물을 제공할 수 있고, 이것은 다양한 이유로 문제가 될 수 있다 - 예를 들어 최초로 시판된 ADC인 밀로타르그(Mylotarg)TM의 경우, ADC 생성물의 불균질성은 생성물의 등록 취소 결정을 유발한 문제에 기여한 것으로 보인다. Fuenmayor, et al., Cancers, vol. 3, 3370-93 (2011). 또한, 최적의 로딩에 충분한 특정한 유형의 아미노산 기 (예를 들면, 리신)가 존재할 때에도, 이 중 일부 또는 모두는, 단백질이 그의 용액 입체형태로 존재할 때 단백질 내에 '매립'되어, 접합에 효과적으로 이용하지 못하게 되거나, '부분적으로' 접근가능하게 되어 접합체의 불균질성을 초래할 수도 있다. 따라서, 리신은 접합에 유용한 부위일 수 있으나, 많은 상황에서 이상적이지는 않다.
천연 단백질에서 시스테인의 발생 빈도는 리신의 발생 빈도보다 더 낮고, 시스테인은 적절한 수로 이용가능한 경우에 접합 부위로서 사용하는데 적합할 수 있고; 너무 적은 시스테인이 존재할 경우, 하나 이상이 표준 단백질 변형 방법에 의해 삽입될 수 있다. 그러나, 시스테인 삽입에 의한 천연 단백질의 서열 변형을 방지하는 것이 종종 바람직하고; 게다가, 천연 단백질 내의 표면-접근가능한 시스테인은 종종 다른 시스테인 근처에 위치하여, 단백질의 활성 입체형태를 유지하는데 중요할 수 있는 디술피드를 형성한다. 디술피드를 환원시킴으로써 디술피드를 2개의 유리 시스테인으로 전환시키는 것은 어렵지 않으나, 이와 같이 하는 것은 단백질의 2차 또는 3차 구조를 파괴할 수 있다.
단백질 상의 디술피드를 환원시킴으로써 형성된 시스테인 잔기 사이로의 테더의 삽입을 시도한 일부 방법이 보고되었다. 하나의 이러한 방법은 술폰-치환된 메타크릴레이트 유도체를 수반한다. US2006/0210526. 이 방법은 고리화 전에 제거 단계를 필요로 하는 반응성 중간체를 형성하고, 그러한 다-단계 과정을 위한 조건은 시스테인 사이에 링커 (테더)의 불완전한 형성을 초래할 수 있고, 반응 조건은 심지어 단백질 변성을 초래할 수도 있다. 또 다른 접근법은 말레이미드 유도체를 사용한다. WO2011/018613. 그러나, 이 과정에서 형성된 접합체는, 말레이미드 상의 티올의 마이클(Michael) 첨가가 가역적이기 때문에 안정성 문제를 겪는다. 따라서, 화학적 모이어티를 디술피드 연결을 함유하는 단백질에 접합시켜 단백질 접합체를 형성하는 개선된 방법에 대한 필요가 존재한다. 특히, 디술피드의 입체형태 제어 효과를 포기하지 않으면서, 또한 효율적인 접합, 안정성, 및 일관된 페이로드/단백질 비를 또한 제공하는 디술피드 성분 (술프히드릴) 사용 방법이 요구되고 있다. 추가로, 스테이플링된 단백질을 페이로드와 접합시키기 위한 수단을 또한 제공하는, 단백질을 특정한 입체형태로 유지시키는 스테이플링 방법에 대한 필요가 존재한다 (예를 들면, 문헌 [Expert Opin . Drug Discov . (2011) 6(9):937-963; Tetrahedron 55 (1999) 11711-11743] 참조). 본 발명은 케톤-변형된 단백질 또는 폴리펩티드와 알콕시아민 화합물 사이에 옥심을 형성하기 위한 개선된 방법을 비롯하여, 이러한 방법을 제공한다.
본 발명은 하기 반응에 예시된 바와 같이, 케톤-변형된 폴리펩티드 또는 단백질을 아미노옥시 화합물 (예를 들어, 알콕시아민 또는 아릴옥시아민)과 접합시켜 옥심-변형된 폴리펩티드 또는 단백질을 형성하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 방법은 고도로 효율적인 옥심 형성을 촉진하는 조건의 선택을 수반하며, 이는 더 높은 수율의 옥심 및 보다 완전한 옥심 형성을 제공하고; 결과는 개선된 수율의 옥심 형성, 및 2개 이상의 케톤 변형을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질의 경우 개선된 생성물 균질성이다. 방법은, 전형적으로 pH 3-8에서의 완충제 중에서, 프로모터로서 아민 또는 아민 염을 사용하는 것을 포함한다. 통상적으로, 프로모터 또는 완충제 또는 둘 다는 카르복실산을 함유할 것이고, 예를 들면 아세테이트 또는 벤조에이트 완충제가 사용될 수 있다. 임의로, 아민은 카르복실레이트 염로서 사용될 수 있거나, 쯔비터이온성일 수 있는 카르복시-치환된 아민 화합물일 수 있다. 아닐린, 아미노벤조산, 3,5-디아미노벤조산, 히드라진, 및 3,5-디카르복시아닐린이 이들 방법에 사용하는데 적합한 아민이다.
Figure pct00001
바람직한 실시양태에서, 케톤-변형된 폴리펩티드 및 옥심은 하기 나타낸 화학식을 가지며, 여기서 황 원자는 폴리펩티드 내의 시스테인 기로부터의 것이다:
Figure pct00002
상기 식에서 n은 2-8, 바람직하게는 2 또는 4이며, n은 폴리펩티드 상에 존재하는 케톤 변형 또는 케톤 변형으로부터 유래된 옥심의 수를 나타낸다. 폴리펩티드는 항체 또는 항체 단편일 수 있으며, 여기서 2개의 황 원자는 폴리펩티드의 쇄간 디술피드 결합으로부터 유래된 것이다. 개선된 방법이 옥심 형성의 효율을 증가시키기 때문에, 이들 방법은 n이 1 초과인 펩티드에서 특히 유용하며, 이는 이들이 접합 생성물의 균질성을 개선시키기 때문이다. 특히, 케톤 변형에 이용가능한, 전형적으로 4개의 디술피드가 존재하는 항체에서, 개선된 방법은 접합 생성물, 예컨대 항체 분자당 4개의 페이로드 기 (DAR = 4)를 갖는 항체-약물 접합체 (ADC)의 수율을 증가시킨다. 불균질성이 최초로 US FDA 승인된 ADC의 시장으로부터의 회수에 기여한 것으로 여겨지는, 밀로타르그TM 이야기에 의해 예시된 바와 같이, ADC에서 균질성의 중요성은 널리 확립되어 있다.
한 측면에서, 본 발명은 단백질의 표면 상에서 디술피드를 형성하는 2개의 시스테인 잔기를 사용하여 페이로드를 단백질에 연결시켜, 단백질 접합체를 형성하는 방법을 제공한다. 방법은 디술피드를 환원시켜 2개의 유리 티올 기를 제공하는 것, 및 2개의 티올 기가 디술피드를 형성할 때 이들이 점유한 곳과 거의 동일한 위치에 이들을 유지시키는 테더로 2개의 티올 기를 함께 묶는 것을 수반한다. 시스테인 기를 그들의 거의 동일한 위치에 유지시키는 것은, 디술피드의 환원시에 발생할 수 있는 단백질의 입체형태에 대한 임의의 유해 효과를 최소화한다. 2개의 티올 기를 함께 연결시키기 위해 도입된 테더는 관심 페이로드를 부착시키는데 사용될 수 있는 반응성 관능기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 테더는 외부 아민 기와 이민 또는 옥심 또는 히드라존 연결을 형성하기에 충분히 반응성인 카르보닐 기를 함유하고, 페이로드는 이러한 연결을 형성함으로써 활성화된 단백질에 접합된다. 예를 들어, 환원된 단백질은 1,3-디할로 아세톤, 예컨대 디클로로아세톤 또는 디브로모아세톤과 반응할 수 있고, 그에 의해 2개의 황 원자를 함께 연결시키는 3-탄소 테더가 삽입된다. 이는 디술피드의 효과를 적합하게 시물레이션하여, 즉 단백질을 디술피드가 존재할 때 갖는 것과 매우 유사한 입체형태로 유지시키는 한편, 이는 또한 디술피드보다 더 큰 안정성뿐만 아니라 페이로드가 부착될 장소를 제공한다. 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용되는 테더는 화학적 반응성 관능기를 제공하고, 이러한 유형의 테더를 2개의 시스테인 황 원자 사이에 함유하는 단백질이 본원에서 활성화된 단백질로서 지칭된다. 바람직한 테더는 환원된 디술피드 기를 1,3-디클로로아세톤, 즉 -CH2-C(O)-CH2-와 반응시킴으로써 수득된 케톤 링커이다. 페이로드는 테더 상의 관능기를 사용하여 활성화된 단백질에 부착될 수 있다.
단백질의 티올을 디할로아세톤과 반응시킴으로써 형성된 테더는, 예를 들어 접합 부위로서 카르보닐을 제공한다. 적합한 아민 (아민화된 페이로드), 바람직하게는 본원에 추가로 기재된 바와 같은 화학식 R-O-NH2의 아미노옥시를 함유하는 페이로드는, 페이로드의 아미노옥시 관능기와 테더의 카르보닐 기 (케톤) 사이에 옥심을 형성함으로써 이러한 활성화된 단백질에 용이하게 접합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 2개의 시스테인 잔기 사이에 삽입된 케톤을 갖는 활성화된 폴리펩티드 또는 단백질은 아민 프로모터의 존재 하에 알콕시아민 (RONH2)과 접촉시키며, 여기서 알콕시 기 (R)는 페이로드, 예컨대 치료제 또는 치료제를 부착시키는데 사용가능한 반응성 기를 포함한다. 적합한 아민 프로모터는 아닐린 또는 아닐리늄 염 (예를 들면, 아닐리늄 아세테이트, 아닐리늄 벤조에이트 등), 아실히드라진 (예를 들면, 아세틸 히드라진), 또는 아미노벤조산, 예컨대 PABA, 3-아미노벤조산, 3,5-디아미노벤조산, 3,5-디카르복시아닐린 등을 포함한다. 효율적인 옥심 형성을 촉진하는데 적합한 반응 조건은 본원에서 제공된다.
이들 방법은 하나 이상의 접근가능한 디술피드 연결을 갖는 임의의 단백질에 적용될 수 있고, 분자량이 500 Da 초과, 전형적으로는 2,000Da 초과인 천연 단백질에 전형적으로 유용하며, 여기서 디술피드는 단백질의 천연 또는 활성 형태로 존재한다. 이들 방법은 1개 초과의 디술피드, 예컨대 2-10개, 또는 전형적으로 6개 이하의 디술피드 기를 함유하는 단백질과 함께 사용될 수 있고, 디술피드 기 중 적어도 1개는 통상적인 디술피드 환원제에 의해 환원되기에 충분히 표면 접근가능하다. 이들 방법은 사용되는 각각의 디술피드 기에 대해 적어도 하나의 페이로드를 함유하는 접합체를 생산하고, 테더는 실질적으로 단백질의 천연 또는 활성 입체형태를 보유한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 2개의 시스테인 잔기를 함께 묶음으로써 단백질을 스테이플링하여, 단단한 입체형태를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 스테이플링 방법은 추후에 스테이플링된 단백질을 페이로드에 접합시키는데 사용가능한 케톤-함유 연결을 사용하여 2개의 시스테인을 함께 묶는다. 적어도 2개의 시스테인 잔기를 함유하는 단백질을 디할로케톤, 예컨대 1,3-디클로로아세톤 또는 1,3-디브로모아세톤과 반응시켜, [cys1]-S-CH2-C(=O)-CH2-S-[cys2] 연결을 함유하는 고리화된 단백질을 형성한 다음, 연결을 화학식 H2N-O-L-PL의 아미노옥시 화합물과 반응하도록 하여, 본원에 추가로 기재된 바와 같이 옥심 형성을 통해 접합체를 형성함으로써 스테이플링이 달성된다. 본 발명은 이러한 스테이플링된 접합된 펩티드를 만드는 개선된 방법을 제공한다.
도 1은 디술피드-함유 단백질로 시작하고 단백질-페이로드 접합체를 제공하는, (X가 O일 때) 본 발명의 응용을 도시하는 반응식이다.
도 2는 그들의 페이로드로서 상보적 커플링 기를 갖는 2개의 단백질-페이로드 접합체의 커플링을 도시한다.
도 3은 실시예 1의 출발 단백질, 활성화된 단백질 및 단백질 접합체에 대한 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 4는 실시예 1로부터의 아지도 치환된 CRM197 구축물의 SDS Page 겔 분석을 보여준다.
도 5는 실시예 4에 대한 활성화된 단백질의 개략도 및 활성화된 (케톤-변형된) 단백질에 대한 LC-MS 데이터를 보여준다.
도 6은 실시예 4에 기재된 단백질-페이로드 접합체의 개략도 및 생성물에 대한 LC-MS 데이터를 보여준다.
도 7은 비교를 위한 분자량 래더가 동반된, 실시예 6, 방법 A의 접합체 및 환원된 접합체의 겔을 보여준다. 이는 또한 여러 상이한 접합체의 형성을 보여주는, 방법 B의 생성물의 LC-MS를 보여준다.
도 8은 실시예 7로부터의 단계 1; 단계 2, 방법 A (PL1); 및 단계 2, 방법 B (PL2)의 생성물에 대한 LC-MS 데이터를 보여준다.
도 9는 실시예 8의 생성물에 대한 SDS PAGE 겔 및 LC-MS 데이터를 보여준다.
본원에 사용된 '단백질' 및 폴리펩티드는 아미드 (펩티드) 결합에 의해 연결된, 5개 이상, 전형적으로 10개 이상의 아미노산 잔기을 함유하는 펩티드를 지칭한다. 전형적으로 본원에 기재된 단백질은 주로 또는 단지 자연 발생 아미노산을 포함하지만, 방법은 1개 이상의 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드에도 동등하게 유용하다. 통상적으로 (반드시는 아니지만) 아미노산은 대부분 또는 전적으로 L 배위이고, 통상적인 '필수' 아미노산으로부터 선택된다.
약어
DAR 약물 대 항체 비
DCM 디클로로메탄
DIC 디이소프로필 카르보디이미드
DIPEA 디이소프로필 에틸 아민
EDT 에탄 디티올
HBTU N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트
MeCN 아세토니트릴
NMP N-메틸 피롤리디논
PBS 포스페이트-완충 염수
TCEP 트리스(카르복시에틸)포스핀
TFA 트리플루오로아세트산
TIPS 트리이소프로필 실란
본 발명은 케톤-변형된 폴리펩티드를 치환된 알콕시아민과 접합시킬 때의 옥심 형성을 위한 개선된 조건을 제공한다. 개선된 조건은 아민 프로모터를 사용하여 옥심 형성을 용이하게 한다: 아닐린이 사용될 수 있으나, 치환된 아닐린, 특히 카르복시-치환된 아닐린, 예컨대 본원에 개시된 것들이 보다 더 적합하다. 아실히드라지드, 예컨대 아세틸히드라진 또는 벤조일히드라지드가 또한 사용될 수 있다. 아민 프로모터는 유리 아민으로서, 또는 임의의 적합한 반대이온을 갖는 아민 염으로서 첨가될 수 있고; 일부 실시양태에서, 아세테이트 또는 시트레이트와 같은 카르복실레이트 반대이온이 바람직하다. 전형적으로, 과량의 아민 프로모터가 사용된다.
반응은 전형적으로 pH 3-8, 바람직하게는 pH 4-8에서의 완충제 중에서 실행된다. PBS, 트리스, 인산나트륨, 아세테이트, 포르메이트, 시트레이트 등을 포함하는 다양한 완충제가 사용되어, 적합한 pH를 유지할 수 있다. 반응에 적합한 폴리펩티드 농도는 통상적으로 사용되는 농도보다 더 높다: 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 농도는 적어도 1 mg/mL, 또는 적어도 2 mg/mL이고, 바람직하게는 약 5 mg/mL 이상, 용해도가 절충되는 농도 이하, 예를 들면 약 25 mg/mL 이하이다.
반응은 전형적으로 폴리펩티드의 구조 및 기능을 유지하는데 적합한 온도에서 수행되고; 온도는 통상적으로 4 내지 70℃, 바람직하게는 10 내지 30℃이다. 0.5 내지 48시간의 반응 시간이 사용될 수 있다: 적절한 반응 시간은 공지된 방법에 의해 반응의 진행을 모니터링함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 약 4℃ 내지 약 25℃의 온도에서, 1시간 미만 내지 약 4시간의 반응 시간이 일반적으로 충분하다.
일부 실시양태에서, 방법은 1,3-디클로로아세톤의 존재 하에 폴리펩티드의 디술피드를 환원시키는 것을 포함한다. 본원에 제공된 데이터는, 디클로로아세톤을 폴리펩티드의 완충 용액에 첨가한 후, 디술피드 결합을 개방시키는 환원제를 첨가하는 것이 놀랍게도 생성물 수율에 있어서 실질적인 개선을 제공함을 입증한다. 디술피드 환원이 개시될 때 디클로로아세톤이 존재하는 것은, 1개 초과의 디술피드 결합이 폴리펩티드 상에서 환원될 때 특히 중요하다. 예를 들어, 폴리펩티드가 항체일 때, TCEP를 사용하는 환원은 4개의 쇄간 디술피드 결합을 환원시켜, 디클로로아세톤과의 반응이 4개의 케톤-함유 테더링 기를 도입하도록 한다. 먼저 TCEP를 첨가하여 환원 단계를 개시한 후에 디클로로아세톤을 첨가함으로써 반응이 수행되었을 때, 완전히 변형된 항체의 수율은 약 33-35% (완충제로서 pH 8.0, 50 mM 트리스, 주위 온도)였다. 약 50%의 폴리펩티드 생성물은 경쇄 단편에 공유 연결된 중쇄 단편을 함유하였다. 1,3-디클로로아세톤을 폴리펩티드 기질과 사전인큐베이션 한 후 동일한 조건 하에 TCEP를 첨가했을 때, 완전히 변형된 항체의 수율은 75-77%로 증가하였다. 이들 반응에 대한 생성물 조성은 마이크로칩 전기영동 SDS 방법 (참조: Electrophoresis 2012, 33, 765-772)에 의해 평가되었다. HC-HC, HC-LC, 및 HC-HC-LC 단편의 검출은 관심 공유 테더링된 생성물로의 부분 변형을 나타내고 (1개 또는 2개의 쇄간 디술피드가 디클로로아세톤-유래 테더에 의해 대체되었음), (HC)2(LC)2에 상응하는 '무손상' 항체는 디클로로아세톤-유래 테더에 의해 대체된 각각의 쇄간 디술피드를 갖는 완전-변형된 사량체 항체에 상응한다.
본 발명의 응용의 예는 도 1에 제시된다. 상기 도면은, 원으로서 표현되고 노출된 디술피드 기를 갖는 단백질을 도시한다. 디술피드는 환원되어, 디술피드로부터 유래된 2개의 유리 티올을 갖는 환원된 단백질을 형성한다. 이어서, 환원된 단백질은 디할로아세톤 또는 유사한 비스-친전자체 (예를 들면, 1,3-디클로로아세톤 또는 1,3-디브로모아세톤)과 반응하도록 하여, 활성화된 단백질을 형성하며, 여기서 2개의 티올은 관능화된 테더를 통해 함께 연결된다: 이 예에서 테더는 쉬프(Schiff) 염기 형성을 향하여 비교적 반응성인 케톤 기를 함유한다. 이어서, 페이로드 분자는 활성화된 단백질의 테더에 쉬프 염기 형성을 통해 연결되어, 단백질 접합체를 제공한다. 이 예에서 페이로드는 테더에 연결기를 통해 부착된다. PL이 페이로드 화합물인 화학식 H2N-X-L-PL의 화합물은, 링커 L에 의해 PL에 연결된 활성화된 아민 기 (H2N-)를 함유하고, 케톤 카르보닐과 PL에 부착된 아민 사이의 쉬프 염기 형성을 용이하게 하는 아미노옥시 또는 유사한 활성화된 아민, -X-NH2 (여기서 X는 O임)를 사용함으로써 아민은 특히 반응성이 된다. 대안적 실시양태는 2개의 유리 시스테인 기를 갖는 단백질, 예컨대 도 1에서의 환원된 단백질로 시작하고, 이를 사용하여, 단백질을 제한된 입체형태로 '스테이플링'하는 한편, 페이로드가 스테이플링된 단백질 상에 접합되는 부착점을 또한 제공한다.
본 발명의 방법은 임의의 케톤-변형된 폴리펩티드와 함께 사용하는데 적합하지만, 2개의 시스테인 사이에 적어도 1개의 디술피드 연결을 함유하거나, 1,3-디할로아세톤 반응물과의 반응에 의해 함께 연결될 수 있는 2개의 유리 시스테인 잔기를 함유하는 단백질로부터 접합체를 형성하는데 특히 유용하다. 전형적으로, 단백질은, 2개의 티올이 본원에 기재된 조건 하에 디클로로아세톤 또는 디브로모아세톤과 반응하여, 2개의 티올의 적어도 50% 가교를 생성한 것이고, 빈번하게 가교의 정도는 적어도 약 70%, 80% 또는 90%이다.
함께 연결되는 2개의 시스테인은 단일 폴리펩티드 상에 존재할 수 있거나, 단백질 복합체를 형성하는 개별 폴리펩티드 상에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 1-6개의 디술피드 연결, 또는 2-6개의 유리 시스테인 잔기를 갖는 단백질을 사용하고, 이들 디술피드 중 적어도 하나의 환원을 수반한다. 디술피드-함유 단백질은 단일 폴리펩티드 서열 내에 디술피드 연결을 함유하는, 적어도 5개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 적어도 10개의 아미노산을 갖는 임의의 폴리펩티드이거나, 디술피드가 하나의 폴리펩티드 서열을 또 다른 아미노산 또는 폴리펩티드에 연결시킨 단백질 복합체일 수 있으며, 단 이러한 복합체는 디술피드가 황 원자 사이로의 테더의 삽입을 위해 환원될 때에 빨리 해리되지 않는다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 전형적인 단백질은 약 5 내지 약 5000개의 아미노산, 전형적으로 적어도 10개의 아미노산 및 약 1000개 이하의 아미노산을 함유하는 시클릭 펩티드 및 선형 펩티드 (기능적 단백질, 예컨대 효소 또는 수용체 포함); 적어도 1개의 디술피드 연결 (종종 2개의 개별 폴리펩티드 가닥을 연결함)을 갖는 단백질 복합체; 구조 단백질; 백신 스캐폴드로서 사용되는 단백질, 예컨대 CRM197 또는 아주반트 활성을 갖는 다른 단백질; 및 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 이들 방법에 특히 유용한 단백질은 항체, 특히 조작된 항체, 변형된 항체 및 항체 단편을 포함하는 모노클로날 항체; 백신 담체 단백질, 예컨대 CRM197; 및 적어도 1개의 디술피드 연결 또는 적어도 2개의 시스테인 잔기를 갖고 분자량이 500 내지 500,000, 전형적으로 1,000 내지 200,000인 단일-가닥 단백질을 포함한다. 예를 들어, 1개 이상의 시스테인 잔기를 도입하기 위해 항체 또는 다른 단백질을 조작하는 방법, 및 항체를 변형시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
방법은 IgG 및 Fc를 비롯한, 적어도 2개의 쇄간 디술피드를 갖는 항체 및 항체 변이체를 사용할 때 특히 유용하다. 방법은 또한 백신 담체 단백질, 예컨대 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소(197)의 비-독성 교차-반응성 물질 (CRM197), 파상풍 톡소이드, 키홀 림펫 헤모시아닌, 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis) 외막 단백질, 및 비-피막형 에이치. 인플루엔자(H. influenza)-유래 단백질 D를 사용할 때 유용하다. 이들 백신 담체 단백질은 공지된 방법에 의해 및/또는 본원에 개시된 방법에 의해 항원을 사용하여 관능화될 수 있다. 본 방법은 또한 아주반트 화합물, 예컨대 이미퀴모드, 이미다조퀴놀린, 및 가르디퀴모드, PRR 리간드, RLR 리간드, NOD2 리간드, 시클릭 디-AMP, 시클릭 디-GMP, 플라젤린, 모노포스포릴 지질 A, N-글리콜화 무라물디펩티드, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG ODN), 트리아실화 지단백질, 또는 폴리 (I:C)를 포함하는 TLR 효능제 (TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, 또는 TLR9의 리간드)를 부착시켜, 증진된 면역 반응을 제공하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기 위한 디술피드-함유 단백질의 디술피드 연결은 환원되어 2개의 유리 티올기를 형성한다: 이러한 환원을 위한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 환원은 단백질 주위의 용매에 용이하게 접근가능한 디술피드 연결을 선택적으로 환원시키는 환원제를 사용하여 수행된다: 하나의 적합한 환원제는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP) 및 그의 염이다-문헌 [Analytical Biochemistry 273, 73-80 (1999)]을 참조한다. 다른 공지된 디술피드-환원제, 예컨대 디티오트레이톨, 2-메르캅토에탄올, 시스테아민, 및 디티오부틸아민 (JM Perkel, Chem. Eng'g News, Feb. 29, 2012; Lukesh, et al., J. Am. Chem. Soc., 134, 4057-59 (2012)) 및 트리알킬 포스핀, 예컨대 트리부틸 포스핀 (WO2008/157380)이 또한 사용될 수 있다. 단백질 내의 디술피드를 환원시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
연결기 L은 페이로드 화합물을 -X-NH2 (여기서, X는 O를 나타냄)에 연결시키는 임의의 적합한 유기 연결일 수 있다. 적합한 연결의 일부 예는 [X]-(CH2)1-6-[PL]; [X]-CH2C(=O)-[PL]; [X]-CH2C(=O)-NH-[PL]; [X]-CH2C(=O)-O-[PL]; [X]-(CH2CH2O)n-[PL]; [X]-페닐-C(O)NH-[PL], [X]-(CH2)1-10-C(=O)-NH-(CH2)2-10-NH-C(=O)-(CH2)0-10-(OCH2CH2)0-10-(AA)0-10-[PL] (AA는 필수 아미노산 중 임의의 것, 예를 들면 glu, gly, ala, asp 등 일 수 있음) 등을 포함하며, 여기서 n은 전형적으로 1-20이고, [X] 및 [PL]은 각각 링커의 어느 말단이 X에 및 PL에 부착되는지를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 링커 L은 접합체 상의 페이로드 로딩을 증가시키기 위해 부착된 2 또는 3개의 페이로드를 가질 수 있고, 1개 초과의 페이로드가 주어진 링커에 부착되는 경우, 페이로드는 동일하거나 상이할 수 있다. 적합한 링커는 또한 이들 기의 성분의 조합을 포함한다: 링커의 특성은 본 발명의 실시에 중요하지 않고, 적어도 1개의 페이로드 PL로의 부착을 위한 방법의 편리성 및 이용가능성, 또는 접합체에 요구되는 물리화학적 특성을 기초로 할 수 있다. 적합한 링커의 선택은 통상의 기술 수준 범위 내에 있고, 페이로드의 구조 및 링커 L에 부착시키기 위해 페이로드를 변경시키는데 이용가능한 방법에 좌우된다. 전형적으로, 링커는 아미드 또는 에스테르 기를 통해 한쪽 또는 양쪽의 말단에 부착되고; 빈번하게 링커 L은 펩티드 결합 또는 에스테르를 함유하여, 프로테아제 또는 에스테라제 활성에 의한 생체내 용해를 허용하고 (예를 들어, 카텝신 B에 의해 절단되는 디펩티드인 val-cit, 또는 카텝신 B에 의해 또한 절단가능한 Gly-phe-leu-gly); 임의로 1개 이상의 에틸렌 옥시드 단위 (-OCH2CH2-)를 함유하고; 다수의 실시양태에서 적어도 1개 및 6개 이하의 아미노산 모이어티를 함유한다. L의 적합한 실시양태는 또한 하기 기로부터 선택될 수 있는, 1종 이상의 스페이서를 포함할 수 있다:
(a) 결합, -O-, -S-, -S-S-, -NH-, -N((C1-C6)알킬)-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-;
(b) (C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌, -Z-(C1-C20)알킬렌-, -Z-(C2-C20)알케닐렌, -Z-(C2-C20)알키닐렌, (C1-C20)알킬렌-Z-(C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌-Z-(C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌-Z-(C2-C20)알키닐렌 (여기서, Z는 -NH-, -N(C1-C6)알킬)-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, (C3-C7)시클로알킬렌, 페닐렌, 헤테로아릴렌, 또는 헤테로시클렌이고, 상기 (C1-C20)알킬렌, 상기 (C2-C20)알케닐렌, 및 상기 (C2-C20)알키닐렌 모이어티는 각각 독립적으로, 산소 원자가 적어도 1개, 바람직하게는 2개의 탄소 원자에 의해 분리되도록 상기 모이어티 내에 분산된 1개 이상의 산소 원자를 임의로 함유함);
(c) (C3-C7)시클로알킬렌, (C3-C7)시클로알킬렌-Y-(C3-C7)시클로알킬렌, -Y-(C3-C7)시클로알킬렌, 페닐렌, -Y-페닐렌, 페닐렌-Y-페닐렌, 헤테로아릴렌, Y-헤테로아릴렌, 헤테로아릴렌-Y-헤테로아릴렌, 헤테로시클렌, -Y-헤테로시클렌, 또는 헤테로시클렌-Y-헤테로시클렌 (여기서, Y는 (C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌, -O-, -C(O)-, -S-, -NH-, -N((C1-C6)알킬)-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, 또는 -NH-C(O)-이고, 상기 (C3-C7)시클로알킬렌, 상기 페닐렌, 상기 헤테로아릴렌, 및 상기 헤테로시클렌 모이어티는 각각 개별적으로 할로, (C1-C4)알킬 또는 할로-치환된 (C1-C4)알킬로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환됨);
(d) -[OCH2CH2]v- (여기서, v는 1-2,000, 바람직하게는 1-10임);
(e) 1 내지 100개의 아미노산, 바람직하게는 1-30 또는 1-6개의 아미노산을 포함하는 펩티드;
(f) 2, 3, 4, 5, 또는 6, 또는 2-10개의 페이로드 모이어티를 운반할 수 있는 다가 링커.
게다가, L은 절단가능한 링커, 예컨대 Val-Cit (발린-시트룰린, 카텝신 B에 의해 선택적으로 절단되는 디펩티드) 또는 val-cit-PABC (발린-시트룰린 p-아미노벤질카르바메이트, 문헌 [Bioconjugate Chem. 19(10), 1960-63 (2008)] 참조), 디술피드, 또는 글루쿠로니다제에 의해 절단되는 링커, 예컨대 하기 화학식에 존재하는 링커일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다:
Figure pct00003
여기서 단백질은 접합을 위한 단백질을 나타내고, PL은 본원에 기재된 바와 같은 페이로드를 나타내고, L1 및 L2는 독립적으로 임의의 링커, 예컨대 상기 기재된 L 기이다. (ACS Med. Chem. Letters, vol. 1, 277-280 (2010)).
페이로드 (PL)는 단백질에 부착하기에 유용한 임의의 모이어티일 수 있다. 단백질에 유용하게 부착될 수 있는 화합물의 많은 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예는, 금속 이온에 결합하여 접합체의 검출가능성을 제공하는 킬레이터를 비롯한, 사용자가 단백질의 위치를 찾고 확인할 수 있도록 하는 표지 모이어티; 단백질을 정제하거나 단리하는 것 또는 이를 표면에 부착시키는 것을 용이하게 하는 결합 모이어티, 예컨대 비오틴 또는 아비딘, 폴리뉴클레오티드, 항체 또는 그의 단편, 5-15개의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리-Arg 또는 폴리-lys 등; 특성-변형 기, 예컨대 지방산 기 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 항원성 기, 예컨대 특정한 유형의 세포 또는 박테리아의 특징을 갖는 다당류 또는 세포 표면 단백질; 변형된 단백질 또는 펩티드를 또 다른 분자에 부착되게 하여, 보다 복잡한 접합체, 예컨대 이중특이적 항체를 만들 수 있는 커플링 기 (도 2 참조); 및 RNA, DNA, mRNA, siRNA와 같은 핵산 및 이들의 단편을 포함하는 생물활성 화합물; 제약 화합물, 예컨대 다양한 치료 약물; 및 방사선핵종 및 세포독소가 목적하는 효과를 생성할 수 있는, 목적하는 조직 또는 세포까지 단백질 상에 편승할 수 있는 방사선핵종 및 세포독소를 포함한다. 이들 편승 화합물은 단백질 또는 그의 일부에 접합된 상태로 존재하면서 작용할 수 있거나, 연결기가 생체내에서 용이하게 절단할 수 있는 것인 경우에 단백질로부터 먼저 분리될 수 있다. 이들 방법과 함께 사용하기에 적합한 제약 페이로드는 미세관 억제제, 토포이소머라제 I 억제제, 삽입제, 세포내 신호전달 경로의 억제제, 키나제 억제제, 전사 억제제, 예컨대 siRNA, aRNA, 및 miRNA, 및 DNA 작은 홈 결합제를 포함하고; 이들 페이로드는 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 아마니틴, 칼리케아마이신, 사임베린, 두오카르마이신, 안트라시클린, 캄프토테신, 독소루비신, 탁솔, 피롤로벤조디아제핀 등과 같은 화합물 부류를 포함한다.
치료 또는 진단 용도를 갖는 이들 제약 페이로드의 구체적 예는 파클리탁셀, 도세탁셀, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 미트라마이신, 악티노마이신, 글루코티코이드, 퓨로마이신, 에피루비신, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 시타라빈, f-플루오로우라실, 플라틴, 스트렙토조토신, 마이노마이신 C, 안트라시클린, 닥티노마이신 또는 악티노마이신, 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신, 두오카르마이신, 이포스파미드, 미톡산트론, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아니모테린, 멜팔란, 에스페라미신, 렉시트롭신, 아우리스타틴 (예를 들면, 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 F, AEB, AEVB, AEFP, MMAE, MMAF), 엘류토로빈, 네트롭신, 포도필로톡신, 메이탄신 및 DM1을 포함하는 메이탄시노이드, 및 콤브레테스타틴을 포함한다.
페이로드로서 사용될 수 있는 적합한 커플링 기 (접합체를 또 다른 모이어티에 커플링시키는데 사용될 수 있는 기)는 말레이미드, 티올, 알파-할로 케톤 (예를 들면, --C(=O)-CH2-X, 여기서 X는 클로로, 브로모 또는 아이오도임), 카르복실산, 아민, 히드록실, 알켄, 구리-무함유 '클릭' 화학에 사용될 수 있는 시클릭 옥틴을 포함하는 알킨, 아지드 등을 포함한다. 이들 커플링 기를 사용하여, 본 발명의 접합체를 상보적 커플링 기를 갖는 다른 화합물에 연결시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 티올의 말레이미드로의 마이클 첨가, 알파-할로케톤을 사용한 티올의 알킬화, 아민과 카르복실산 사이의 아미드 결합 형성, 1,2,3-트리아졸 고리 형성에 의해 아지드를 알킨에 연결시키는 '클릭' 화학 (예를 들면, 문헌 [Meldal, et al., Chem Rev., vol 108, 2952-3015 (2008)] 참조), 및 '구리-무함유 클릭' 화학을 포함한다. 예를 들면, 문헌 [Meeuwissen, et al. Polymer Chemistry, vol. 3, 1783-95 (2012)]을 참조한다. '상보적' 커플링 기는 용이하게 조합되어 공유 결합을 형성하는 2개의 커플링 기, 예컨대 상기 언급된 쌍 (아미드를 형성하는 카르복실레이트 + 아민; 1,2,3-트리아졸을 형성하는 아지드 + 알킨; 티올이 마이클 첨가를 통해 이중 결합에 첨가되는 말레이미드 + 티올; 티올의 알킬화에 의해 알파-티오 케톤을 형성하는 알파-할로 케톤 + 티올; 등)이다. 상보적 커플링 기를 함유하는 제2 접합체와 커플링되는 페이로드로서 커플링 기를 함유하는 접합체의 도시가 도 2에 제공된다. 특정한 예에서, 페이로드 (PL)로서 기능하는 커플링 기는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 할로겐, -C≡CH, -C=CH2, -OH, -SH, -SO2-CH=CH2, -O-NH2, -N3, -O-P(O)(OH)2, -C(O)-H, -C(O)-CH3, -NH-C(O)-CH2-I, 말레이미딜, 3,5-디옥소-1,2,4-트리아졸리딘-4-일, 1H-피롤-2,5-디온-1-일, 피리딘-2-일-디술파닐, 테트라히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-2(3H)-온-4-일, 1-카르보닐옥시-2,5-디옥소피롤리딘, 소듐 1-카르보닐옥시-2,5-디옥소피롤리딘-3-술포네이트, -SSR1, -C(O)-OR1-, -N(R1)H, -NH-N(R1)H (여기서 R1은 H 또는 (C1-C6)알킬임), 및 -C(O)-R2 (여기서 R2는 H, (C1-C4)알킬, 할로-치환된 (C1-C4)알킬, -CH=CH2, N(R1)H, 또는 -NH-N(R1)H임)이다. 이들 페이로드가 첫번째 페이로드 (PLa)로서 사용될 때, 접합체는 제2 페이로드 (PLb)를 포함하는 화합물과 반응할 수 있고, 새로운 접합체를 형성하는데 있어서 추가의 링커 L'를 도입할 수 있다:
Figure pct00004
PLa는 커플링 기, 예를 들면 말레이미드, 보호된 티올, N3, 알킨이다.
R은 PLa에 대한 상보적 반응성 기이다.
PLb는 새로운 페이로드, 예컨대 단백질, 항체, si-RNA, 독소 등을 포함하는, 표지 또는 생물제제이다.
이들 반응에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 L 및 L'가 새로운 페이로드 PLb를 연결하는데 사용되는 반응에 따라, PLa 및/또는 R의 부분을 보유할 수 있는 것으로 이해할 것임에 유의한다.
하기 열거되는 실시양태는 본 발명의 특정한 측면을 설명한다.
1. 케톤-변형된 폴리펩티드를 아민 프로모터의 존재 하에 화학식 R-O-NH2의 기와 접촉시키는 것을 포함하는, 케톤-변형된 폴리펩티드를 옥심-변형된 폴리펩티드로 전환시키는 방법.
2. 실시양태 1에 있어서, 아민 프로모터가 아닐린, 3,5-디아미노벤조산 또는 3,5-디카르복시아닐린을 포함하는 치환된 아닐린, 또는 아실 히드라지드, 예컨대 아세틸 히드라지드인 방법.
이들 방법의 한 실시양태에서, 케톤 변형된 폴리펩티드는, 디술피드를 환원시켜 2개의 유리 티올을 형성함으로써, 디술피드로부터 형성되고; 유리 티올은 1,3-디클로로아세톤 또는 1,3-디브로모아세톤과의 반응에 의해 함께 연결된다. 이 방법의 특정한 실시양태에서, 환원가능한 디술피드 결합을 갖는 폴리펩티드는 완충제, 예컨대 비제한적으로 트리스 또는 PBS 중에서 환원제, 예컨대 비제한적으로 TCEP 및 1,3-디클로로아세톤과 접촉된다. 바람직하게는, 폴리펩티드 및 완충제는 환원제가 첨가되기 전에 1,3-디클로로아세톤과 합하여, 환원 발생 시에 1,3-디클로로아세톤이 존재하도록 한다.
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 화학식 R-O-NH2의 기가 화학식 H2N-O-L-PL의 화합물이며, 여기서 L은 링커를 나타내고 PL은 페이로드 기를 나타내는 것인 방법.
4. 실시양태 1에 있어서, 케톤-변형된 폴리펩티드가 하기 화학식
Figure pct00005
을 가지며,
상기 식에서 원은 폴리펩티드를 나타내고, 각각의 황 원자는 폴리펩티드의 시스테인 잔기의 술프히드릴이고, z는 1 내지 10의 정수인 방법.
5. 실시양태 1-4 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단백질-페이로드 접합체가 하기 화학식
Figure pct00006
을 가지며,
상기 식에서 X는 O이고, L은 링커를 나타내고, PL, PL1, 및 PL2는 독립적으로 각 경우에 페이로드 기를 나타내며, 여기서 m 및 n이 각각 독립적으로 1 내지 10이고; z는 1-10, 바람직하게는 1-5이고, 단 m 및 n이 둘 다 0은 아닌 것인 방법.
6. 실시양태 1-5 중 어느 한 실시양태에 있어서, 폴리펩티드가 항체 (예를 들면, IgG, Fab 또는 F(ab)2, Fc)인 방법.
7. 실시양태 1-5 중 어느 한 실시양태에 있어서, 폴리펩티드가 백신 담체인 방법.
8. 실시양태 1-8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 페이로드가 치료제를 포함하는 것인 방법.
9. 실시양태 1-7 중 어느 한 실시양태에 있어서, 페이로드가 상보적 반응성기를 포함하는 페이로드 기를 부착시키는데 적합한 검출가능한 표지 또는 반응성 기를 포함하는 것인 방법.
10. 실시양태 8에 있어서, L이 절단가능한 연결 모이어티를 포함하는 것인 방법.
11. 실시양태 1-10 중 어느 한 실시양태에 있어서, L이
(a) 결합, -O-, -S-, -NH-, -N((C1-C6)알킬)H-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-;
(b) (C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌, -Z-(C1-C20)알킬렌-, -Z-(C2-C20)알케닐렌, -Z-(C2-C20)알키닐렌, (C1-C20)알킬렌-Z-(C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌-Z-(C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌-Z-(C2-C20)알키닐렌 (여기서, Z는 -NH-, -N(C1-C6)알킬)-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, (C3-C7)시클로알킬렌, 페닐렌, 헤테로아릴렌, 또는 헤테로시클렌이고, 상기 (C1-C20)알킬렌, 상기 (C2-C20)알케닐렌, 및 상기 (C2-C20)알키닐렌 모이어티는 각각 독립적으로 상기 모이어티 내에 분산된 1-10개의 산소 원자를 임의로 함유함);
(c) (C3-C7)시클로알킬렌, (C3-C7)시클로알킬렌-Y-(C3-C7)시클로알킬렌, -Y-(C3-C7)시클로알킬렌, 페닐렌, -Y-페닐렌, 페닐렌-Y-페닐렌, 헤테로아릴렌, Y-헤테로아릴렌, 헤테로아릴렌-Y-헤테로아릴렌, 헤테로시클렌, -Y-헤테로시클렌, 또는 헤테로시클렌-Y-헤테로시클렌 (여기서, Y는 (C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌, -O-, -C(O)-, -S-, -NH-, -N((C1-C6)알킬)H-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, 또는 -NH-C(O)-이고, 상기 (C3-C7)시클로알킬렌, 상기 페닐렌, 상기 헤테로아릴렌, 및 상기 헤테로시클렌 모이어티는 각각 개별적으로 할로, (C1-C4)알킬 또는 할로-치환된 (C1-C4)알킬로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환됨);
(d) -[OCH2CH2]v-, -X-{CH2[OCH2CH2]v}w- (여기서, v는 1-2,000이고, w는 1-4이고, X는 C 또는 N임);
(e) 1 내지 100개의 아미노산을 포함하는 펩티드; 및
(f) 덴드리머, 덴드론, 및 과분지형 중합체를 포함하는 수지상 거대분자
로부터 선택된 적어도 1종의 스페이서를 포함하는 것인 방법.
12. 환원가능한 디술피드 결합을 함유하는 폴리펩티드, 수성 완충제, 및 1,3-디할로아세톤의 혼합물을 형성한 다음, 디술피드 결합을 환원시킬 수 있는 환원제를 첨가하는 것을 포함하는, 환원가능한 디술피드 결합을 포함하는 폴리펩티드를 화학식 [PP]-S-CH2-C(=O)-CH2-S-[PP]의 기를 포함하는 케톤-변형된 폴리펩티드로 전환시키는 방법이며, 여기서 각 S는 디술피드 결합으로부터의 황이고, [PP]는 연결기의 말단이 폴리펩티드에 부착되는 곳을 나타내는 것인 방법.
13. 실시양태 12에 있어서, 1,3-디할로아세톤이 1,3-디클로로아세톤인 방법.
14. 실시양태 12 또는 13에 있어서, 환원제가 수용성 포스핀 또는 포스핀 염인 방법. TCEP는 적합한 환원제이다.
15. 실시양태 12-14 중 어느 한 실시양태에 있어서, 폴리펩티드가 항체 또는 항체 단편인 방법. 적합하게, 폴리펩티드는 모노클로날일 수 있으며, 인간화될 수 있는 항체이다. 암 세포의 특징을 갖는 항원에 대한 항체가 적합한 폴리펩티드이다.
16. 케톤-변형된 폴리펩티드를 아민 프로모터의 존재 하에 적어도 약 1 mg/mL의 폴리펩티드 농도에서 화학식 R-O-NH2의 기와 접촉시키는 것을 포함하는, 케톤-변형된 폴리펩티드를 옥심-변형된 폴리펩티드로 전환시키는 방법. 전형적으로, 이들 방법에서의 R은 본원에 기재된 바와 같은 페이로드, 및 링커를 포함한다. 적합한 페이로드는 메이탄시노이드 (예를 들면, DM1, DM4), 아우리스타틴 (예를 들면, MMAE, MMAF), 아마니틴, 칼리케아마이신, 사임베린, 두오카르마이신, 안트라시클린, 캄프토테신, 독소루비신, 탁솔, 피롤로벤조디아제핀 등을 포함한다.
17. 제5항에 있어서, 케톤-변형된 폴리펩티드는 실시양태 12-16 중 어느 한 실시양태의 방법에 의해 만들어지는 것인 방법.
18. 실시양태 17에 있어서, 아민 프로모터가 카르복시-치환된 아닐린 또는 아실 히드라진인 방법.
19. 실시양태 12-17 중 어느 한 실시양태에 있어서, 화학식 R-O-NH2의 기가 화학식 H2N-O-L-PL의 화합물이며, 여기서 L은 링커를 나타내고 PL은 페이로드 기를 나타내는 것인 방법.
20. 실시양태 16에 있어서, 케톤-변형된 폴리펩티드가 하기 화학식
Figure pct00007
을 가지며, 상기 식에서 원은 폴리펩티드를 나타내고, 각각의 황 원자는 폴리펩티드의 시스테인 잔기의 술프히드릴인 방법.
21. 실시양태 16-20 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단백질-페이로드 접합체가 하기 화학식
Figure pct00008
을 가지며, 상기 식에서 X는 O이고, L은 링커를 나타내고, z는 1 내지 10의 정수이고, PL, PL1, 및 PL2는 독립적으로 각 경우에 페이로드 기를 나타내는 것인 방법.
22. 실시양태 12-21 중 어느 한 실시양태에 있어서, 폴리펩티드가 항체인 방법.
23. 실시양태 12-21 중 어느 한 실시양태에 있어서, 폴리펩티드가 백신 담체인 방법.
24. 실시양태 16-23 중 어느 한 실시양태에 있어서, 페이로드가 치료제를 포함하는 것인 방법.
25. 실시양태 16-24 중 어느 한 실시양태에 있어서, 페이로드가 검출가능한 표지 또는 결합 기를 포함하는 것인 방법.
26. 실시양태 25에 있어서, L이 절단가능한 연결 모이어티를 포함하는 것인 방법.
27. 실시양태 16-26 중 어느 한 실시양태에 있어서, L이
(a) 결합, -O-, -S-, -NH-, -N((C1-C6)알킬)-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-;
(b) (C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌, -Z-(C1-C20)알킬렌-, -Z-(C2-C20)알케닐렌, -Z-(C2-C20)알키닐렌, (C1-C20)알킬렌-Z-(C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌-Z-(C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌-Z-(C2-C20)알키닐렌 (여기서, Z는 -NH-, -N(C1-C6)알킬)H-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, (C3-C7)시클로알킬렌, 페닐렌, 헤테로아릴렌, 또는 헤테로시클렌이고, 상기 (C1-C20)알킬렌, 상기 (C2-C20)알케닐렌, 및 상기 (C2-C20)알키닐렌 모이어티는 각각 독립적으로 상기 모이어티 내에 분산된 1-10개의 산소 원자를 임의로 함유함);
(c) (C3-C7)시클로알킬렌, (C3-C7)시클로알킬렌-Y-(C3-C7)시클로알킬렌, -Y-(C3-C7)시클로알킬렌, 페닐렌, -Y-페닐렌, 페닐렌-Y-페닐렌, 헤테로아릴렌, Y-헤테로아릴렌, 헤테로아릴렌-Y-헤테로아릴렌, 헤테로시클렌, -Y-헤테로시클렌, 또는 헤테로시클렌-Y-헤테로시클렌 (여기서, Y는 (C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌, -O-, -C(O)-, -S-, -NH-, -N((C1-C6)알킬)H-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, 또는 -NH-C(O)-이고, 상기 (C3-C7)시클로알킬렌, 상기 페닐렌, 상기 헤테로아릴렌, 및 상기 헤테로시클렌 모이어티는 각각 개별적으로 할로, (C1-C4)알킬 또는 할로-치환된 (C1-C4)알킬로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환됨);
(d) -[OCH2CH2]v- 또는 -J-{CH2[OCH2CH2]v}w- (여기서, v는 1-2,000이고, w는 1-4이고, J는 CH2 또는 NH임);
(e) 1 내지 100개의 아미노산을 포함하는 펩티드; 및
(f) 덴드리머, 덴드론, 및 과분지형 중합체를 포함하는 수지상 거대분자
로부터 선택된 적어도 1종의 스페이서를 포함하는 것인 방법.
본 발명의 방법은 도 1에 요약된 바와 같이, 변형될 단백질의 디술피드를 환원시켜, 2개의 유리 티올 기를 함유하는 환원된 단백질을 형성하는 것을 수반한다. 환원된 단백질은, 환원된 단백질 상의 유리 티올 둘 다와 반응하여 유리 티올을 함께 테더링할 수 있으며, 또한 페이로드를 부착시키는데 적합한 테더 상의 적어도 하나의 관능기를 보유하는 관능화된 테더링 화합물과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 테더 상의 관능기는 카르보닐 기, 예를 들면 유리 티올이 1,3-디할로케톤과 반응하도록 할 때 수득된 케톤이다. 유리 티올은 강한 친핵성이기 때문에, 이들은 이탈기를 대체하는 것 및 공유 황-탄소 결합을 형성하는 것을 수반하는 비가역적인 반응을 통해, 친전자체, 예컨대 알킬 할라이드 또는 알킬 토실레이트와 용이하게 반응한다. 관능화된 카르보닐-함유 테더링 화합물의 일부 적합한 예는 1,3-디클로로아세톤 및 1,3-디브로모아세톤을 포함한다. 이들 시약은 술프히드릴을 함께 테더링함으로써 작은 시클릭 펩티드 내의 디술피드 모이어티의 안정화를 제공하는데 사용되었다. 예를 들면, WO2008/157380 (디클로로아세톤과 환원된 시클릭 펜타펩티드의 반응, 이어서 카르보닐의 환원)을 참조한다. 1,3-디히드록시아세톤의 술포네이트 (예를 들면, 메실레이트, 트리플레이트, 페닐술포네이트, 토실레이트 등)가 또한 사용될 수 있다. 이들 시약은 합리적으로 신속한 반응을 제공하여 함께 테더링된 2개의 시스테인 잔기를 갖는 활성화된 단백질을 형성하기에 환원된 단백질의 유리 티올을 향해 충분히 반응성이며, 여기서 각각의 유리 티올은 관능화된 테더링 기에 공유 부착된다.
환원된 단백질 및 관능화된 테더링 화합물은, 테더링 화합물과 환원된 단백질의 2개의 유리 티올 사이의 반응을 촉진하기에 적합한 조건 하에, 및 특히 이전에 디술피드 결합으로 연결된 유리 티올 둘 다가 테더링 화합물의 단일 분자와 반응하여, 다시 한번 함께 묶이지만 이제는 직접적인 디술피드 결합 대신에 이들을 연결하는 짧은 테더를 갖도록 하기에 유리한 농도 및 온도의 조건 하에 접촉된다. 이 반응은 도 1에 도시된 바와 같이 활성화된 단백질을 형성하고, 이는 2개의 황 원자 사이에 관능화된 테더 [-CH2C(O)-CH2-]를 갖는다. 도 1에서의 테더는 깨끗하고 효율적인 쉬프 염기 형성 화학을 통해 페이로드를 효율적으로 부착시키는데 사용될 수 있는 카르보닐을 포함한다.
단백질은, 원 또는 구체로 도시될지라도, 10개 미만의 아미노산의 작은 폴리펩티드, 또는 2개 이상의 서브유닛 또는 별개의 단백질의 큰 효소 또는 복합체일 수 있음이 본 논의 전체에 걸쳐 이해된다. 디술피드의 2개의 황 원자는 다량체 복합체의 하나의 서브유닛 상에 존재할 수 있거나, 상이한 서브유닛 상에 존재할 수 있다. 본원에 기재된 변환에 참여하는 디술피드 이외에, 단백질은 또한 환원 및 관능화될 수 있거나 단백질 내의 그의 위치로 인해 환원될 수 없는 다른 디술피드 연결을 함유할 수 있다. 단지 단일 디술피드, 테더링 기, 또는 접합이 제시되지만, 하나의 이러한 디술피드, 테더링 기 또는 접합을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질은 하나 초과를 또한 함유할 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명의 방법은 종종 단백질의 전체적인 형태 및 관능기를 유지하는데, 또는 2개의 서브유닛을 다중-서브유닛 복합체 내에서 함께 연결된 상태로 유지하는데 필수적일 수 있는 '매립된' 디술피드를 환원시키지 않으면서, 공지된 방법을 사용하여, 폴딩된 단백질의 표면 근처의 용매-접근가능한 디술피드 연결을 선택적으로 환원시킬 수 있다. 실시예에서 예시되는 바와 같이, 단백질 또는 폴리펩티드는 하나 초과의 관능화된 테더링 기를 함유할 수 있고, 따라서 단순성을 위해 전형적으로 단지 하나만 도시될지라도, 하나 초과의 접합 부위를 함유할 수 있다.
활성화된 단백질이 형성되면, 페이로드는 관능화된 테더에 부착될 수 있다. 예를 들어, 아민-함유 (또는 아민화) 페이로드는, 페이로드의 아민과 테더의 케톤 사이에 쉬프 염기를 형성함으로써 디할로아세톤으로부터 형성되는 테더에 부착될 수 있다. 적합한 페이로드 화합물은 접근가능하고 반응성인 -NH2 아민 기를 함유하고; 바람직한 실시양태에서, 아민은 쉬프 염기 형성을 향해 활성화된 것이다. 적합한 아민의 예는, 예를 들어 옥시아민 (X = O), 티오아민 (X = S), 및 히드라진 (X = NH)을 포함한다: 이들 헤테로원자-치환된 아민은 케톤, 예컨대 도 1에 나타난 바와 같이 디할로아세톤으로부터 형성된 활성화된 단백질의 테더 상의 것과 용이하게 축합되는 것으로 알려져 있다.
활성화된 단백질은 전형적으로 활성화된 단백질의 정제 또는 단리 없이 아미노-함유 페이로드와 접촉된다. 페이로드 (PL) 상의 유리 -NH2 기는 이용가능한 경우에 사용될 수 있지만, 이용가능하지 않은 경우에는 도 1 및 실시예에 도시된 바와 같이 연결기를 통해 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성화된 단백질이 생성되면, 아미노-페이로드는 반응 혼합물에 첨가되며, 여기서 활성화된 단백질은 목적하는 쉬프 염기의 형성을 촉진하는 조건 하에 형성되었다. 이어서, 아미노-페이로드는 도 1에 도시된 바와 같이 그의 아민 기를 통해 활성화된 단백질의 카르보닐과 반응하여, 그에 의해 X가 O, NH 또는 치환된 N이고; L이 연결기이고; PL이 페이로드를 나타내는, 목적하는 단백질-페이로드 접합체를 형성한다.
실시예
다음 HPLC 방법을 하기 실시예에서 사용하였다.
방법 A : 용리액 A : 물 + 0.1% 포름산, 용리액 B : 아세토니트릴 + 0.08% 포름산
구배 : 2분 내 3에서 80% B - 유량 1.0 ml/분. 칼럼 : 프로스위프트 모노리스(Proswift Monolith) 4.6*50mm 40℃
방법 B : 용리액 A : 물 + 0.1% 포름산, 용리액 B : 아세토니트릴 + 0.04% 포름산
구배 : 2분 내 3에서 80% B - 유량 1.0 ml/분. 칼럼 : 프로스위프트 모노리스 4.6*50mm 40℃
방법 C : 용리액 A : 물 + 3.75mM 아세트산암모늄 + 2% 아세토니트릴, 용리액 B : 아세토니트릴
구배 : 1.7분 내 2에서 98% B - 유량 1.0 ml/분. 칼럼 : 액퀴티(Acquity) CSH 2.1*50mm 50℃
방법 D (HRMS) : 용리액 A : 물 + 0.05% 포름산 + 3.75 mM 아세트산암모늄, 용리액 B : 아세토니트릴 + 0.04% 포름산.
구배 : 4.4분 내 2에서 98% B - 유량 1.0 ml/분. 칼럼: 액퀴티 CSH 2.1*50mm 50℃
링커의 합성
Figure pct00009
100 mL 유리용기 내의 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 (1.55 mmol/g) (0.500 g, 0.775 mmol)를 DCM (20 ml) 중에 30분 동안 팽창시키고, 배수시켰다. NMP (7 ml)/DCM (4 ml) 중 2-(아미노옥시)아세트산 헤미히드로클로라이드 (0.338 g, 3.10 mmol) 및 DIPEA (1.354 ml, 7.75 mmol)의 현탁액을 수지에 첨가하고, 이를 5시간 동안 진탕시켰다. 용매를 배수시켰다. 수지를 DCM/MeOH/DIPEA (17/2/1, 40 mL), DCM (50 mL), NMP (50 mL) 및 DCM (50 mL)로 각각 헹구었다. 생성된 수지를 KOH/NaOH로 밤새 건조시켰다.
Figure pct00010
100 mL 유리용기 내의 수지 (0.775 mmol)를 DCM (20 ml) 중에 30분 동안 팽창시키고, 배수시켰다. NMP (8 ml) 중 (9H-플루오렌-9-일)메틸 2-아미노에틸카르바메이트 히드로클로라이드 (0.081 g, 0.775 mmol), HOAt (0.422 g, 3.10 mmol) 및 DIPEA (1.354 ml, 7.75 mmol)의 현탁액에, NMP (2.5 ml) 중 HBTU (1.176 g, 3.10 mmol)를 첨가하고, 이를 2시간 동안 실온에서 진탕시켰다. 용매를 배수시키고, 수지를 NMP (10 mL) 및 DCM (10 mL)으로 순차적으로 헹구었다. 생성된 수지를 밤새 건조시켰다.
Figure pct00011
수지 (0.775 mmol)를 반응 용기 안에 채웠다. 10 mL의 20% 피페리딘/NMP (v/v)를 첨가하고, 현탁액을 5분 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 배수시킨 후, 추가의 10 mL의 20% 피페리딘/NMP (v/v)를 첨가하고, 20분 동안 실온에서 교반하였다. NMP (8 mL) 중 HOAt (0.316 g, 2.325 mmol) 및 1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-오산 (0.896 g, 2.325 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, NMP (1 ml) 중 DIC (0.362 ml, 2.325 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하고, 수지를 여과하고, NMP (10 ml)로 4회 헹구었다. 생성된 수지를 밤새 건조시켰다.
Figure pct00012
수지 (0.775 mmol)를 반응 용기 안에 채웠다. 10 mL의 20% 피페리딘/NMP (v/v)를 수지에 첨가하고, 현탁액을 5분 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 배수시킨 후, 추가의 10 mL의 20% 피페리딘/NMP (v/v)를 첨가하고, 20분 동안 실온에서 교반하였다. NMP (8 ml) 중 HOAt (0.316 g, 2.325 mmol) 및 Fmoc-Glu-OtBu (0.989 g, 2.325 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, NMP (2.00 ml) 중 DIC (0.362 ml, 2.325 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하고, NMP (10 ml)로 4회 헹구었다. 생성된 수지를 밤새 건조시켰다.
페이로드를 링커에 부착시키기
Figure pct00013
수지 (2-클로로트리틸 클로라이드 수지, 0.775 mmol)를 반응 용기 안에 채웠다. 10 mL의 20% 피페리딘/NMP (0.775 mmol, v/v)를 수지에 첨가하고, 현탁액을 5분 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 배수시킨 후, 추가의 10 mL의 20% 피페리딘/NMP (0.775 mmol)를 첨가하고, 20분 동안 실온에서 교반하였다. NMP (8 mL) 중 18-tert-부톡시-18-옥소옥타데칸산 (0.862 g, 2.325 mmol) 및 HOAt (0.316 g, 2.325 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, NMP (2.00 ml) 중 DIC (0.362 mL, 2.325 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하고, NMP (10 ml)로 4회 헹구었다. 생성된 수지를 밤새 건조시켰다.
Figure pct00014
상기 단계로부터의 수지 (0.775 mmol)를 20 mL의 절단 칵테일 (TFA/TIPS/물 = 95/2.5/2.5, v/v)로 1.5시간 동안 실온에서 처리하였다. 수지를 여과에 의해 분리하고, TFA로 헹구었다. 여과물을 진공 하에 농축시켰다. 15-50% MeCN/ 물 + 0.1% TFA로 용리하는 C18 칼럼을 사용하는 RP-HPLC로 2,2,2-트리플루오로아세트산과의 (S)-1-(아미노옥시)-19-카르복시-2,7,16,21-테트라옥소-9,12-디옥사-3,6,15,20-테트라아자옥타트리아콘탄-38-오산 (1:1) (207 mg, 0.294 mmol, 37.9% 수율) (PL1)을 수득하였다. HRMS[M+1] (방법 D); 704.4459 (관찰치), 704.4486 (예상치).
실시예 1
CRM197 (참조: G. Giannini and R. Rappuoli, Nucleic Acids Res., 1984, 25, 4063.)을 TCEP (xx)로 처리하였고, 이는 C451-C471 디술피드의 환원은 거의 또는 전혀 없이, C201-C185 디술피드의 환원을 초래하였다 (실시예 3 참조). 환원된 CRM197을 1,3-디클로로아세톤으로 처리하여, 무손상 C451-C471 디술피드를 가지며 -CH2-C(=O)-CH2- 연결을 통해 C185에 테더링된 C201을 포함하는 활성화된 단백질을 수득하였다. 이 활성화된 단백질을 PL1 (아미노옥시 기를 함유하는 아민화된 지방산 유도체, 그의 제조는 상기 기재되어 있음)과 접촉시켜, 지방산 유도체를 단백질에 연결하는 옥심을 형성하였다. 부착된 지방산 기를 갖는 접합체는 신장 클리어런스를 감소시키고, 따라서 CRM197 단백질의 순환 반감기를 연장시키고, 접합체 백신에서 담체로서 그의 유용성을 증가시킬 것으로 예상되었다. 천연 단백질 (도 3A, 방법 A 이용), 활성화된 단백질 (도 3B) 및 단백질 접합체 (도 3C)에 대한 질량 스펙트럼 데이터를 도 3에 제공하였다.
Figure pct00015
CRM197을 보유하는 부위-한정 아지도 화합물의 합성
방법 A -
용리액 A : 물 + 0.1% 포름산, 용리액 B : 아세토니트릴 + + 0.1% 포름산
구배 : 2분 내 3에서 80% B - 유랑 1.8 ml/분. 칼럼 : 액퀴티 BEH300 SEC 4.6x30 mm 50℃
SDS Page 겔 분석 - NuPage 4-12% 비스-트리스 겔; 1.5mm*10 웰
Figure pct00016
인산나트륨 완충제 pH 7.4 (230 μL) 중 CRM197 (32.5 mg/ml) (185 μL, 0.103 μmol)에, TCEP HCl (3 mg/mL, 물, 58.9 μL, 0.616 μmol)을 첨가하였다. 반응물을 16시간 동안 실온에서 교반한 후에, 1,3-디클로로프로판-2-온 (20 mg/mL, DMSO 중, 13.04 μL, 2.054 μmol)을 첨가하였다. 반응물을 3.5시간 동안 교반한 후, 0.5 mL 제바(Zeba)TM 스핀 크기 배제 칼럼 (7K MWCO, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific))을 통해 통과시키고, 완충제를 0.1 M 인산나트륨 완충제 pH 6로 교환하여, 케톤-보유 CRM197 (6.78 mg/ml, 1.3 mL, 나노드롭 방법)을 수득하였다.
LCMS [M+1] = 58465
Figure pct00017
케톤-변형된 CRM197 (6.78 mg/ml - 인산나트륨 완충제 pH 6, 1.3 mL, 0.151 μmol)의 용액에, O-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸)히드록실아민 (300 mg/ml - DMSO) (0.044 mL, 0.045 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 36시간 동안 23℃에서 교반한 후, 5 mL 제바TM 스핀 칼럼을 통해 통과시키고 PBS 7.4로 용리하여, 표제 화합물 (4.41 mg/ml, 1.6 mL, 80% 수율, 나노드롭 방법)을 수득하였다.
LCMS [M+1] = 58682.5
도 4는 표제 화합물, 변형된 CRM197에 대한 SDS Page를 보여준다.
실시예 2
출발 물질 제조: pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-F-OH (디술피드 C6-C12) (8)의 합성
Figure pct00018
중간체 8a의 제조
(Fmoc-F-OH를 포함하는 2-클로로트리틸 클로라이드 수지의 로딩, Fmoc 제거 및 수지의 로딩의 결정)
2-클로로트리틸 클로라이드 수지 (40.0 g, 64.0 mmol)를 DCM (3x)으로 세척하였다. DCM (400 mL) 및 DIPEA (44.7 mL, 256 mmol) 중 Fmoc-F-OH (24.8 g, 64.0 mmol)의 용액을 첨가하고, 현탁액을 22시간 동안 실온에서 진탕시켰다. 수지를 DCM/MeOH/DIPEA (17:2:1) (3x), DCM (3x), DMA (3x), DCM (3x)으로 완전히 세척하였다. 이어서, 수지를 피페리딘/DMA (1:4)의 혼합물 (400 mL)로 10분 동안 4회 처리한 다음, DMA (2 x 180 ml)로 세척하였다. 피페리딘/DMA 용액 및 DMA 세척 용액을 수지의 로딩의 결정을 위해 수집하였다. 1 mL의 합한 용액을 MeOH를 사용하여 500 mL로 희석하였고, 299.8 nm에서의 UV 흡수는 A = 0.368인 것으로 측정되었다. 이는 46.2 mmol의 Fmoc 양에 상응하였다. 수지를 DCM (3x), DMA (3x), DCM (3x)으로 완전히 세척하고, 진공 하에 건조시켜, 중간체 8a (50.7 g; 로딩 = 0.91 mmol/g)를 수득하였다.
중간체 8b의 제조 (선형 펩티드의 어셈블리)
중간체 8a (2.64 g, 2.40 mmol)를 프렐류드(Prelude)™ 펩티드 합성기 상의 고체 상 펩티드 합성에 적용하였다. 커플링을 하기와 같이 수행하였다:
Figure pct00019
중간체 8c의 제조 (보호기 제거로 수지로부터의 절단)
중간체 8b (2.40 mmol)를 DCM (4x)으로 조심스럽게 세척하였다. 95% 수성 TFA/EDT/TIPS (95:2.5:2.5)의 혼합물 (50 mL)을 첨가하고, 현탁액을 1시간 동안 실온에서 진탕시켰다. 절단 용액을 여과하고, 새로운 절단 용액 (35 mL)을 첨가하였다. 현탁액을 1시간 동안 실온에서 진탕시킨 후, 절단 용액을 여과하였다. 새로운 용액 (35 mL)을 첨가하고, 현탁액을 1시간 동안 실온에서 진탕시켰다. 절단 용액을 여과하였다. 합한 절단 용액을 차가운 헵탄/디에틸 에테르 (1:1) (500 mL)의 교반된 혼합물에 천천히 부어, 침전물을 수득하였다. 현탁액을 2시간 동안 실온에서 교반한 후, 침전물을 가라앉혔다. 상청액을 프릿으로 흡입해내었다. 잔류물을 차가운 헵탄/디에틸 에테르 (1:1) (2 x 100 mL)로 세척하고, 상청액을 프릿으로 흡입해내었다. 고체를 고진공 하에 건조시켜, 중간체 8c를 회백색 고체 (3.75 g, 1.88 mmol)로서 수득하였다.
시클릭 펩티드 8의 제조 (고리화 및 정제)
중간체 8c (3.75 g, 1.88 mmol)를 H2O (375 mL) 중에 용해시켰다. AcOH 중 50 mM I2의 용액 (45.1 mL, 2.26 mmol)을 교반 용액에 한 번에 첨가하고, 용액을 10분 동안 실온에서 교반하였다. H2O 중 0.5 M 아스코르브산 (5.64 mL, 2.82 mmol)을 첨가하여, 과량의 I2를 켄칭하였다. 용액을 거의 농축 건조시켰다. 반응을 2 부분으로 실온에서 수행하였다: 0.188 mmol 규모 및 1.69 mmol 규모. 조 물질을 정제를 위해 합하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 정제하고, ACN/H2O로부터 동결건조시켜 화합물 8을 백색 고체 (1.53 g, 0.767 mmol)로서 수득하였다.
순수한 생성물을 분석용 HPLC (분석 방법 C: tR=3.43분) 및 UPLC-MS (분석 방법 B; 측정치: [M+3]/3=512.4; 계산치: [M+3]/3=512.6)에 의해 분석하였다.
본 실시예는 시클릭 펩티드 8로 시작하는, 활성화된 단백질의 형성을 설명한다.
Figure pct00020
시클릭 펩티드 8 (12 mg, 6.76 μmol)을 50mM Na 포스페이트 완충제 pH 6.5 (1.5 ml) 중에 용해시키고, 여기에 TCEP HCl (2.91 mg, 10.13 μmol)을 실온에서 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 상기 용액에, 1,3-디클로로프로판-2-온 (4.29 mg, 0.034 mmol)을 실온에서 첨가하고, 이를 30분 동안 실온에서 교반하였다. 15-60% MeCN/물 + 0.1% TFA로 용리하는 RP-HPLC로 활성화된 단백질 8d (6 mg, 2.93 μmol, 43.4% 수율)를 수득하였다. HRMS[M+1] (방법 D); 1590.7911 (관측치), 1590.7912 (예상치).
pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-F-OH + 위치 6 및 12 [C6-C12]에서 2개의 시스테인 사이의 -S-CH2-C(=Z)-CH2-S- 연결, 및 Z는 하기와 같다:
Figure pct00021
Figure pct00022
100nM Na 포스페이트 완충제 pH 6.0 (1 ml) 중 화합물 8 ((S)-2-((3S,6R,14R,17S,20S,28aS)-17-((1H-이미다졸-5-일)메틸)-20-(4-아미노부틸)-3-부틸-14-((S)-2-((S)-5-구아니디노-2-((S)-1-((S)-5-구아니디노-2-((S)-5-옥소피롤리딘-2-카르복스아미도)펜타노일)피롤리딘-2-카르복스아미도)펜탄아미도)-4-메틸펜탄아미도)-1,4,10,15,18,21,24-헵타옥소헥사코사히드로피롤로[2,1-i][1,23,4,7,10,13,16,19]디티아헥사아자시클로헥사코신-6-카르복스아미도)-3-페닐프로판산) (11.5 mg, 5.62 μmol) 및 2,2,2-트리플루오로아세트산과의 (S)-1-(아미노옥시)-19-카르복시-2,7,16,21-테트라옥소-9,12-디옥사-3,6,15,20-테트라아자옥타트리아콘탄-38-오산 화합물 (1:1) (9.19 mg, 0.011 mmol)의 용액에, 아닐린 (2.051 μl, 0.022 mmol)을 실온에서 첨가하였다. DMSO (50 μl)의 첨가로 균질 용액을 수득하였다. 이 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 15-60% MeCN/물 + 0.1% TFA로 용리하는 RP-HPLC로 예상 접합체, (1-((Z)-((3S,6R,14R,17S,20S,28aS)-17-((1H-이미다졸-5-일)메틸)-20-(4-아미노부틸)-3-부틸-6-((S)-1-카르복시-2-페닐에틸카르바모일)-14-((S)-2-((S)-5-구아니디노-2-((S)-1-((S)-5-구아니디노-2-((S)-5-옥소피롤리딘-2-카르복스아미도)펜타노일)피롤리딘-2-카르복스아미도)펜탄아미도)-4-메틸펜탄아미도)-1,4,15,18,21,24-헥사옥소도코사히드로피롤로[2,1-i][1,23,4,7,10,13,16,19]디티아헥사아자시클로헥사코신-10(1H,9H,11H)-일리덴)아미노옥시)-19-카르복시-2,7,16,21-테트라옥소-9,12-디옥사-3,6,15,20-테트라아자옥타트리아콘탄-38-오산) (4.5 mg, 1.646 μmol, 29.3% 수율)을 수득하였다. HRMS (방법 D) [(M+3)/3]; 759.7487 (관측치), 759.7462 (예상치). 체류 시간 4.12분.
실시예 3
Figure pct00023
50mM Na 포스페이트 완충제 pH 7.4 (10 μl) 중 CRM197 (200 μg, 6.2 ul, 0.0034 μmol)의 용액에, TCEP HCl (5.89 μg, 0.021 μmol)의 수용액을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 15시간 동안 실온에서 방치하였다. 1,3-디클로로프로판-2-온 (4.58 μg, 0.034 μmol 10당량)을 혼합물에 첨가하였다. 이 반응물을 2시간 동안 실온에서 방치하였다. 조 물질을 제바TM 크기 배제 칼럼을 통해 통과시켰다. LCMS; [M+1] = 58465. 이 활성화된 단백질을 아민화된 페이로드, 예컨대 TLR 효능제와 반응시켜, 담체 단백질에 첨가된 임의의 항원에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있는 화합물과 접합된 담체 단백질을 형성할 수 있다.
Figure pct00024
케톤-변형된 CRM197 (5 mg/ml, Na 포스페이트 완충제, pH 6.0) (50 μg, 0.00086 μmol)의 용액에, N-(3-(4-(2-(4-(2-(5-아미노-8-메틸벤조[f][1,7]나프티리딘-2-일)에틸)-3-메틸페녹시)에틸)피페라진-1-일)프로필)-2-(아미노옥시)아세트아미드 (66.8 μg, 0.064 μmol) 및 아닐린 (0.0020 μl, 0.021 μmol)을 첨가하였다. 이 반응물을 14시간 동안 23℃에서 방치하여, LCMS 분석에 기초하여 목적하는 접합체 A를 수득하였다. 반응 혼합물을 0.5 mL 제바TM 크기 배제 칼럼을 통해 통과시키고 PBS pH 7.2 완충제로 용리하였다. LCMS; [M+1] = 59032.
PL의 합성:
Figure pct00025
DMF (0.5 ml) 중 tert-부틸 2-(3-브로모프로필아미노)-2-옥소에톡시카르바메이트 (53.3 mg, 0.171 mmol) 및 8-메틸-2-(2-메틸-4-(2-(피페라진-1-일)에톡시)페네틸)벤조[f][1,7]나프티리딘-5-아민 (52 mg, 0.114 mmol)의 용액에, 탄산칼륨 (39.4 mg, 0.285 mmol)을 실온에서 첨가하고, 이를 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 물 및 EtOAc를 첨가하였다. 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켜, 조 Boc-보호된 물질을 수득하였다. 이를 DMF (0.5 ml) 중에 용해시키고, 여기에 TFA (0.5 mL, 6.49 mmol)를 첨가하였다. 이를 30분 동안 실온에서 교반하였다. 용매의 제거 후에, 15-60% MeCN/물 + 0.1% TFA로 용리하는 RP-HPLC 정제로 N-(3-(4-(2-(4-(2-(5-아미노-8-메틸벤조[f][1,7]나프티리딘-2-일)에틸)-3-메틸페녹시)에틸)피페라진-1-일)프로필)-2-(아미노옥시)아세트아미드 (25 mg, 0.024 mmol, 21.02% 수율)를 수득하였다. LCMS; [M+1] = 586.
실시예 4
하기 실시예에서는 항-VEGF 항체 단편 (VEGF-Fab), 및 첨가되어 항체 단편의 혈청 반감기를 증가시키는 지방산 유도체를 이용하였다. 몇몇의 덜 접근가능한 쇄내 디술피드 연결의 존재 하의 쇄간 디술피드의 선택적 환원을 pH 7에서 PBS 중 TCEP를 사용하여 달성하였다. 환원된 단백질을 디할로아세톤 (디브로모아세톤 또는 디클로로아세톤)과 반응시켜, 황 원자들을 함께 연결시키는 3-탄소 테더 -CH2-C(=O)-CH2-를 갖는 활성화된 단백질을 수득하였다. 활성화된 단백질을 반응성 부분으로서 아미노옥시를 갖는 링커-페이로드 모이어티와 접촉시켜, 디할로아세톤으로부터 유래된 케톤과의 옥심을 형성하였다. 본 실시예에서 연결기 L은
Figure pct00026
이며,
여기서 [X] 및 [PL]은 각각 -X-NH2 및 페이로드 PL에 대한 부착 지점을 나타내고, 페이로드는 C18 지방산 기이다. 상기 실시예에서, X는 -ONH2이고, 이는 활성화된 단백질의 아세토닐 케톤의 카르보닐과 함께 옥심을 형성한다. 도 5는 본 실시예에 대한 활성화된 단백질의 형성을 도시하고, 그의 형성에 대한 질량 스펙트럼 증거를 보여준다.
Figure pct00027
PBS pH 7.4 (8 μl) 중 A (72.72 μg, 6.0 uL, 0.0015 μmol)의 용액에, TCEP HCl (2.63 μg, 0.0092 μmol)을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 3시간 동안 실온에서 방치하였다. 1,3-디클로로프로판-2-온 (1.945 μg, 0.015 μmol)을 첨가하고, 반응물을 1시간 동안 실온에서 정치시켰다. A를 소모시켜, 목적하는 생성물 B로 전환시켰다. 조 물질을 크기 배제 칼럼을 통해 통과시켰다. LCMS; [M+1] = 47538
Figure pct00028
PBS pH 7.4 (22.5 μl) 중 B (36.36 μg, 0.00076 μmol)의 용액에, 2,2,2-트리플루오로아세트산과의 (S)-1-(아미노옥시)-19-카르복시-2,7,16,21-테트라옥소-9,12-디옥사-3,6,15,20-테트라아자옥타트리아콘탄-38-오산 화합물 (1:1) (64.33 μg, 0.079 μmol) 및 아닐린 (0.00105 μl, 0.011 μmol)을 실온에서 첨가하고, 이를 14시간 동안 23℃에서 교반하였다. B를 소모시켜, 목적하는 생성물 C로 전환시켰다. 조 물질을 제바TM 스핀 탈염 칼럼, 7K MWCO (써모 사이언티픽)를 통해 통과시켰다. LCMS; [M+1] (방법 A) = 48222. 도 6은 단백질 접합체의 형성을 도시하고, 접합체 형성에 대한 질량 스펙트럼 증거를 보여준다.
실시예 5
Figure pct00029
펩티드 A (1 mg, 0.519 μmol)를 완충제 (2.5 ml) (50mM 인산나트륨 완충제 pH 6.5 (1.5 mL), 40%MeCN (0.9 mL), 2.5% DMF (0.1 mL)) 중에 용해시키고, 여기에 TCEP HCl (0.164 mg, 0.571 μmol)을 실온에서 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 60분 동안 교반하였다. DMF (0.1 ml) 중 1,3-디브로모아세톤 (0.164 mg, 0.571 μmol)을 반응 혼합물에 실온에서 첨가하였다. 3분 동안 교반한 후에, 아세톤 부가물 B가, LCMS 분석에 기초하여 정량적 전환에서 형성되는 것을 관찰하였다. LCMS (방법 C) [M+2]/2 = 991.
실시예 6: 항Her2 항체-약물 접합체의 제조.
방법 A:
단계 1.
Figure pct00030
단계 1: 항- HER2 IgG (0.1M 트리스/HCl 중 20.36 mg/ml, 30 μl, 610.8 μg, 0.0041 μmol) 및 1,3-디클로로프로판-2-온 (66.1 μg, 0.495 μmol)의 용액에, TCEP HCl (14.17 μg, 0.049 μmol)을 첨가하고, 이를 16시간 동안 4℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 0.5 mL 제바TM 스핀 칼럼을 통해 통과시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 용리하였다. 반응 용액으로부터 취한 샘플로 수행한, PNGase F (뉴잉글랜드 바이오랩(New England Biolab)), 엔도프로테이나제 Lys-C (로슈(Roche)) 및 비 환원/환원 SDS PAGE (콜로이달 블루 염색을 포함하는 4-12% 비스-트리스 겔)를 사용하는 분석에 의해, 4개의 쇄간 디술피드의 변형을 확인하였다. LCMS (방법 B); 145394 (PNGase F를 사용한 탈글리코실화 이후).
단계 2:
Figure pct00031
단계 1에서 제조된 변형된 항-HER2 IgG의 용액 (7.14 mg/mL, 100mM 아닐리늄 아세테이트 완충제 pH 4.8, 600 μg, 0.0040 μmol)에, (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(아미노옥시)-N-메틸헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (30 mg/ml, 104 μg, 0.121 μmol)을 실온에서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 19시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 0.5 ml 제바TM 스핀 칼럼을 통해 통과시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 1회 용리하였다. 반응 용액으로부터 취한 샘플로 수행한, PNGase F (뉴잉글랜드 바이오랩), 엔도프로테이나제 Lys-C (로슈) 및 비 환원/환원 SDS PAGE (콜로이달 블루 염색을 포함하는 4-12% 비스-트리스 겔)를 사용하는 분석에 의해, 케톤의 변형을 확인하였다. DAR (약물-항체 비)는 3.2였다. LCMS (방법 B); 148770 (탈글리코실화 이후). 도 7은 접합체 및 환원 후의 접합체를 보여준다 (하기 참조). 시블루 플러스2® 프리스테인드 스탠다드(SeeBlue Plus2® Pre-Stained Standard) (인비트로젠(Invitrogen))를 겉보기 분자량 래더로서 사용하였다. 이는 비접합된 항체가 접합 생성물 중에 거의 또는 전혀 존재하지 않음을 입증한다: 오직 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 항체의 해리로 인해, 비접합된 항체는 환원 시에 보다 낮은-분자량 밴드를 생성할 것이다. -S-CH2-C(=X)-CH2-S- 연결을 통해 공유 연결된 단편을 갖는 접합체는 환원 시에 해리될 수 없다.
방법 B:
단계 1
Figure pct00032
항-HER2 IgG (0.1M 트리스/HCl 중 20.36 mg/ml) (610.8 μg, 0.0041 μmol) (30 ul) 및 1,3-디클로로프로판-2-온 (66.1 μg, 0.495 μmol)의 용액에, TCEP HCl (14.17 μg, 0.049 μmol)을 첨가하고, 이를 16시간 동안 4℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 0.5 mL 제바TM 스핀 칼럼을 통해 통과시키고 PBS pH 7.2로 용리하였다. 반응 용액으로부터 취한 샘플로 수행한, PNGase F (뉴잉글랜드 바이오랩), 엔도프로테이나제 Lys-C (로슈) 및 비 환원/환원 SDS PAGE (콜로이달 블루 염색을 포함하는 4-12% 비스-트리스 겔)를 사용하는 분석에 의해, 4개의 아세톤 형성에 의한 쇄간 디술피드에서의 성공적인 변형을 확인하였다. LCMS (방법 B); 145394 (탈글리코실화 이후). SDS PAGE를 위한 환원된 샘플은 이전에 기재된 절차에 따라 제조하였다.
단계 2:
Figure pct00033
변형된 항- HER2 IgG (7.14 mg/mL, 100mM 아닐리늄 아세테이트 완충제 pH 4.8) (600 μg, 0.0040 μmol)의 용액에 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(아미노옥시)-N-메틸헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (30 mg/ml, 104 μg, 0.121 μmol)을 실온에서 첨가하고, 이를 19시간 동안 실온에서 교반하였다. 생성된 혼합물을 0.5 ml 제바TM 스핀 칼럼을 통해 통과시키고 PBS pH 7.2로 1회 용리하였다. 반응 용액으로부터 취한 샘플로 수행한, PNGase F (뉴잉글랜드 바이오랩), 엔도프로테이나제 Lys-C (로슈) 및 비 환원/환원 SDS PAGE (콜로이달 블루 염색을 포함하는 4-12% 비스-트리스 겔, 도 8에 도시함)를 사용하는 분석에 의해, 케톤의 성공적 변형을 확인하였다. DAR은 3.8이었다. LCMS (방법 B); 148770 (탈글리코실화 이후). 시블루 플러스2TM 프리스테인드 스탠다드 (인비트로젠)를 겉보기 분자량 래더로서 사용하였다. SDS PAGE를 위한 환원된 샘플은 이전에 기재된 절차에 따라 제조하였다. SDS PAGE는 도 8에 제시된다.
실시예 7: 항체 B-DM1 접합체의 제조:
단계 1:
Figure pct00034
트리스 완충제 (4800 ul) 중 디클로로아세톤 (7.35 mg, 0.055 mmol, 368 ul)의 용액에 항체 B IgG (항체 B IgG는 Her2와 상이한 항원을 인식함: 68.2 mg, 0.458 μmol, 400 ul)를 첨가하고, 이를 60분 동안 4℃로 냉각시켰다. 4℃에서의 TCEP HCl (1.576 mg, 5.50 μmol, 524 ul)을 16시간 동안 4℃ 실내에서 방치하였다. 혼합물을 10K 아미콘(Amicon)® 막 여과를 통해 농축시키고, PBS로 희석하였다. 이 사이클을 2회 반복하였다. 여과 후에, 샘플을 5 ml 제바TM 탈염 칼럼을 통해 통과시켰다. 반응 용액으로부터 취한 샘플로 수행한, PNGase F (뉴잉글랜드 바이오랩) 및 비 환원/환원 SDS PAGE (콜로이달 블루 염색을 포함하는 4-12% 비스-트리스 겔)를 사용하는 분석에 의해, 4개의 아세톤 형성에 의한 쇄간 디술피드에서의 성공적인 변형을 확인하였다. LCMS (방법 B); 146020 (탈글리코실화 이후). SDS PAGE를 위한 환원된 샘플은 이전에 기재된 절차에 따라 제조하였다.
단계 2:
PL1 (방법 A):
Figure pct00035
변형된 항체 B IgG (48 mg, 0.322 μmol, 1.2 ml)의 용액에 DM-1 유도체 (10.00 mg, 8.05 μmol, 67 ul) 및 3,5-디아미노벤조산 (14.70 mg, 0.097 mmol, 30 ul)의 DMSO 용액을 첨가하고, 이를 15시간 동안 23℃에서 교반하였다. 혼합물을 10K 아미콘® 막 여과를 통해 농축시키고, PBS로 희석하였다. 이 사이클을 3회 반복하였다. 여과 후에, 샘플을 5 ml 제바TM 탈염 칼럼을 통해 통과시켰다. 케톤의 성공적인 변형을, PNGase F (뉴잉글랜드 바이오랩)를 사용하는 분석에 의해 확인하였다. DAR은 LCMS에 기초하여 4였다. LCMS (방법 B); 150915 (탈글리코실화 이후).
PL1 (방법 B):
Figure pct00036
0.1M Na 포스페이트 pH 6.0 중 변형된 항체 B IgG (679 μg, 0.0046 μmol)의 용액에 DMSO 중 2-(아미노옥시)-N-(1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4,13-디옥소-6,9,15,18-테트라옥사-3,12-디아자이코산-20-일)아세트아미드 (563 μg, 0.911 μmol, 2.25 ul)를 실온에서 첨가하고, 이를 20시간 동안 23℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 0.5 ml 탈염 칼럼을 통해 통과시키고 100mM HEPES + EDTA로 3회 용리하였다. 3.8 말레이미드 링커 / 항체 (DAR = 3.8)의 도입을 LCMS에 의해 확인하였다. LCMS (방법 B); 147968 (PNGase F (뉴잉글랜드 바이오랩)을 사용한 탈글리코실화 이후).
Figure pct00037
10mM EDTA를 포함하는 100mM HEPES 완충제 중 변형된 항체 B IgG (177 μg, 0.0012 μmol)의 용액에 DMSO 중 DM-1 (8.65 μg, 0.012 μmol, 0.288 ul)을 실온에서 첨가하고, 이를 6시간 동안 23℃에서 교반하였다. N-메틸말레이미드 (DMSO 중 1.3 mg/ml) (2.083 μg, 0.019 μmol)를 반응 용액에 첨가하고, 이를 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.5 mL 탈염 칼럼을 통해 통과시키고, 100mM HEPES 완충제로 용리하였다. DAR은 LCMS에 기초하여 3.7이었다. LCMS (방법 B); 153967 (DAR4) (글리코실화).
PL2:
Figure pct00038
10mM EDTA를 포함하는 HEPES 완충제 중 변형된 항체 B IgG (420 μg, 0.0028 μmol)의 용액에 DMSO 중 DM-1 (10.61 μg, 0.014 μmol, 0.55 ul)을 실온에서 첨가하고, 이를 8시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을, EDTA를 포함하는 0.5 ml 탈염 칼럼을 통해 통과시키고 100mM HEPES로 3회 용리하였다. 반응 혼합물을 0.5 mL 탈염 칼럼을 통해 통과시키고 100mM HEPES 완충제로 용리하였다. DAR은 LCMS에 기초하여 3.6이었다. LCMS (방법 B); 150101 (DAR4) (PNGase F (뉴잉글랜드 바이오랩)를 사용한 탈글리코실화 이후).
Figure pct00039
10mM EDTA를 포함하는 HEPES 완충제 중 변형된 항체 B IgG (420 μg, 0.0028 μmol)의 용액에 DMSO 중 DM-1 (10.61 μg, 0.014 μmol, 0.55 ul)을 실온에서 첨가하고, 이를 8시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 0.5 ml 탈염 칼럼을 통해 통과시키고 EDTA를 포함하는 100mM HEPES로 3회 용리하였다. 반응 혼합물을 0.5 mL 탈염 칼럼을 통해 통과시키고 100mM HEPES 완충제로 용리하였다. DAR은 LCMS에 기초하여 3.6이었다. LCMS (방법 B); 150101 (DAR4) (PNGase F (뉴잉글랜드 바이오랩)을 사용한 탈글리코실화 이후).
PL3:
Figure pct00040
변형된 항체 B IgG (47.3 mg, 0.317 μmol, 1.1 ml)의 용액에 DM-1 유도체 (6.34 mg, 6.35 μmol, 42.3 ul) 및 3,5-디아미노벤조산 (13.52 mg, 0.089 mmol, 27 ul)의 DMSO 용액을 첨가하고, 이를 15시간 동안 23℃에서 교반하였다. 혼합물을 10K 아미콘® 막 여과를 통해 농축시키고, PBS로 희석하였다. 이 사이클을 2회 반복하였다. 여과 후에, 샘플을 5 ml 제바TM 탈염 칼럼을 통해 통과시켰다. 케톤의 성공적인 변형을, PNGase F (뉴잉글랜드 바이오랩)을 사용하는 분석에 의해 확인하였다. DAR은 LCMS에 기초하여 4였다. LCMS (방법 B); 150910 (탈글리코실화 이후).
PL4:
Figure pct00041
PBS 중 변형된 항체 B IgG (250 μg, 0.0017 μmol, 10 ul)의 용액에 상기 나타낸 요구되는 알콕시아민 (21.66 μg, 0.025 μmol, 0.245 ul) 및 3,5-디아미노벤조산 (383 μg, 2.52 μmol, 0.43 ul)을 실온에서 첨가하고, 이를 24시간 동안 23℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 0.5 mL 탈염 칼럼을 통해 통과시키고 PBS로 2회 용리하였다. DAR은 LCMS에 기초하여 4였다. LCMS (방법 B); 152446 (글리코실화).
PL1 합성:
Figure pct00042
tert-부틸 (2-(2-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트 (245 mg, 0.746 mmol)를 디옥산 중 4N HCl (2 mL, 8.00 mmol)에 실온에서 용해시키고, 이를 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매의 제거 후에, 조 물질을 추가 정제 없이 다음 반응에 사용하였다.
Figure pct00043
DCM (8 mL) 중 2-(((tert-부톡시카르보닐)아미노)옥시)아세트산 (185 mg, 0.970 mmol) 및 TEA (0.520 mL, 3.73 mmol)의 용액에 EDC (172 mg, 0.895 mmol) 및 HOBT (114 mg, 0.746 mmol)를 실온에서 첨가하고, 이를 5분 동안 실온에서 교반하였다. DCM (4 mL) 중 1-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)-1H-피롤-2,5-디온 (197 mg, 0.746 mmol)을 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후에, DCM 및 물을 첨가하였다. 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 15-65% MeCN/물 + 0.1% TFA로 용리하는 RP-HPLC 정제로 tert-부틸 2-((2-(2-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에톡시)에톡시)에틸)아미노)-2-옥소에톡시카르바메이트 (62 mg, 0.154 mmol, 2 단계에 대해 20.70% 수율)를 무색 오일로서 수득하였다. ESI-MS (방법 A) m/z: 402[M+1]+, 체류 시간: 1.60분. 1H-NMR (CDCl3-d, 400 MHz); 1.48 (s, 9H), 3.49-3.75 (m, 14H), 6.71 (s, 2H).
Figure pct00044
DCM (400 μl) 중 tert-부틸 2-((2-(2-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에톡시)에톡시)에틸)아미노)-2-옥소에톡시카르바메이트 (62 mg, 0.154 mmol)의 용액에 TFA (400 μl)를 실온에서 첨가하고, 이를 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매의 제거 후에, 조 물질을 밤새 진공 내에 두었고, 추가 정제 없이 사용하였다. ESI-MS (방법 A) m/z: 302[M+1]+
PL2 합성:
Figure pct00045
DCM (8 mL)/DMF (4 mL) 중 2-Cl Trt 수지 (1.70 mmol/g) (0.086 g, 1.7 mmol) 및 1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-오산 (2 g, 5.19 mmol)의 현탁액에 DIPEA (2.67 mL, 15.30 mmol)를 적가하고, 이를 15시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 배수시켰다. 수지를 DCM/MeOH/DIPEA (17/2/1, 40 ml), DCM (8 mL * 2), DMF (8 mL * 2), DCM (8 mL * 2)으로 헹구고, 진공 하에 건조시켰다.
Figure pct00046
수지 (0.679 g, 1.7 mmol)를 반응 용기 안에 채웠다. DMF 중 20% 피페리딘 5 mL를 첨가하고, 이를 1분 동안 부드럽게 교반하고, 제거하였다. 또 다른 DMF 중 20% 피페리딘 10 mL를 첨가하고, 간헐적으로 교반하면서 20분 동안 기다리고, 제거하였다. DMF (10 ml)를 첨가하고, 15초 동안 교반하고, 진공 여과를 통해 제거하였다. 이 단계를 4회 반복하였다 (카이저(Kaiser) 검정으로 검토함; 양성, 자색-진청색). DMF (8 mL) 중 HOAt (0.463 g, 3.40 mmol) 및 2-(((tert-부톡시카르보닐)아미노)옥시)아세트산 (0.650 g, 3.40 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, DMF (4 mL) 중 DIC (0.530 mL, 3.40 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하고, DMF (10 ml)로 4회 헹구고, 진공 하에 건조시켰다.
Figure pct00047
수지 (0.926 g, 1.7 mmol)를 반응 용기 안에 채웠다. DMF 중 20% 피페리딘 5 mL를 첨가하고, 이를 1분 동안 부드럽게 교반하고, 제거하였다. 또 다른 DMF 중 20% 피페리딘 10 mL를 첨가하고, 간헐적으로 교반하면서 20분 동안 기다리고, 제거하였다. DMF (10 ml)를 첨가하고, 15초 동안 교반하고, 진공 여과를 통해 제거하였다. 이 단계를 4회 반복하였다 (카이저 검정으로 검토함; 양성, 자색-진청색). DMF (8 mL) 중 HOAt (0.463 g, 3.40 mmol) 및 2-(((tert-부톡시카르보닐)아미노)옥시)아세트산 (0.650 g, 3.40 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, DMF (4 mL) 중 DIC (0.530 mL, 3.40 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하고, DMF (10 ml)로 4회 헹구고, 진공 하에 건조시켰다.
Figure pct00048
수지를 30%HFIP (헥사플루오로이소프로판올)와 CHCl3 (20 mL, 1.700 mmol) 중에 현탁시키고, 이를 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 배수된 용매를 농축시켜, 조 2,2-디메틸-4,8,17-트리옥소-3,6,12,15,21,24-헥사옥사-5,9,18-트리아자헥사코산-26-오산 (1.13 g, 2.347 mmol, 138% 수율)을 수득하였다. 이를 추가 정제 없이 다음 반응에 사용하였다. ESI-MS m/z: 482[M+1]+, 체류 시간: 1.10분 (방법 B).
Figure pct00049
DMF (6 mL) 중 2,2-디메틸-4,8,17-트리옥소-3,6,12,15,21,24-헥사옥사-5,9,18-트리아자헥사코산-26-오산 (819 mg, 1.7 mmol)의 용액에 HOAt (463 mg, 3.40 mmol) 및 DIC (0.530 mL, 3.40 mmol)을 각각 실온에서 첨가하고, 이를 5분 동안 실온에서 교반하였다. 상기 혼합물에 1-(2-아미노에틸)-1H-피롤-2,5-디온 (518 mg, 2.040 mmol) 및 DIPEA (디이소프로필 에틸아민, 0.594 mL, 3.40 mmol)을 실온에서 첨가하고, 이를 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물 및 EtOAc (에틸 아세테이트)로 희석하였다. 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 목적하는 화합물은 LCMS에 기초하여 대부분 수성 층에 존재하였다. 수성 층의 동결건조 후에, 조 물질을 15-70% MeCN/물 + 0.1% TFA로 용리하는 RP-HPLC을 통해 정제하여, tert-부틸 (23-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,11,20-트리옥소-6,9,15,18-테트라옥사-3,12,21-트리아자트리코실)옥시카르바메이트 (600 mg, 0.994 mmol, 58.5% 수율)를 수득하였다. ESI-MS m/z: 604[M+1]+, 체류 시간: 1.14분 (방법 B). 1H-NMR (CDCl3-d, 400 MHz); 1.48 (s, 7.5H),1.55 (s, 1.5H), 3.47-3.71 (m, 20H), 3.97 (s, 2H), 4.04 (s, 2H), 4.37 (s, 1.65 H), 4.47 (s, 0.35H), 6.72 (s, 2H).
Figure pct00050
DCM (100 μl) 중 tert-부틸 (23-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,11,20-트리옥소-6,9,15,18-테트라옥사-3,12,21-트리아자트리코실)옥시카르바메이트 (8.4 mg, 0.014 mmol)의 용액에 TFA (100 μl)를 실온에서 첨가하고, 이를 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 제거하여 2-(아미노옥시)-N-(1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4,13-디옥소-6,9,15,18-테트라옥사-3,12-디아자이코산-20-일)아세트아미드를 수득하였다. 이를 추가 정제 없이 다음 반응에 사용하였다. ESI-MS m/z: 504[M+1]+, 체류 시간: 0.69분 (방법 A).
Figure pct00051
PL3 합성: DMA (0.6 mL) 중 2-(아미노옥시)-N-(1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4,13-디옥소-6,9,15,18-테트라옥사-3,12-디아자이코산-20-일)아세트아미드 (22.79 mg, 0.031 mmol)의 용액에 DM-1 (23 mg, 0.031 mmol) 및 100mM Na 포스페이트 pH 7.4 (0.600 mL)를 5℃에서 첨가하였다. DIPEA (10.88 μl, 0.062 mmol)를 동일한 온도에서 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 1.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM 및 포화 중탄산나트륨 (수성)으로 희석하였다. 유기 층을 포화 NH4Cl (수성) 및 염수로 세척하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 0-15% MeOH/DCM으로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피로 목적하는 화합물 (21 mg, 0.017 mmol, 54.3% 수율)을 수득하였다. ESI-MS m/z: 1242[M+1]+, 체류 시간: 1.00분 (방법 A). 1H-NMR (CDCl3-d, 400 MHz); 0.80 (s, 3H), 1.21-1.33 (m, 9H), 1.41-1.51 (m, 1H), 1.56-1.59 (m, 1H), 2.31-2.39 (m, 1H), 2.57-2.65 (m, 2H), 2.79-2.88 (m, 1H), 2.86 (s, 3H), 2.91-3.13 (m, 5H), 3.16-3.24 (m, 1H), 3.20 (s, 3H), 3.36 (s, 3H), 3.43-3.76 (m, 25H), 3.90 (d, J = 3.6Hz, 2H), 3.98 (s, 3H), 4.02 (s, 2H), 4.17 (s, 2H), 4.25-4.32 (m, 1H), 4.77-4.80 (m, 1H), 5.30-5.37 (m, 1H), 5.62-5.69 (m, 1H), 6.26 (s, 1H), 6.38-6.45 (m ,1H), 6.63-6.68 (m, 2H), 6.82-6.84 (m, 1H), 6.92 (brs, 1H), 7.14-7.24 (2H).
Figure pct00052
DCM (3 mL) 중 tert-부틸 (2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트 (320 mg, 1.289 mmol)의 용액에 2-브로모아세틸 브로마이드 (0.225 mL, 2.58 mmol) 및 DIPEA (0.563 mL, 3.22 mmol)를 5℃에서 첨가하고, 이를 실온으로 가온되도록 하면서 15분 동안 교반하였다. 용매의 제거 후에, 0-40-100% EtOAc/헵탄으로 용리하는 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 정제로 tert-부틸 (2-(2-(2-(2-브로모아세트아미도)에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트 (317 mg, 0.858 mmol, 66.6% 수율)를 수득하였다. ESI-MS m/z: 269[M+1 -Boc]+, 체류 시간: 1.41분 (방법 A). H-NMR (CDCl3, 400 MHz); 1.45 (s, 9H), 3.34 (brs, 2H, 3.48-3.52 (m, 2H), 3.53-3.60 (m, 4H), 3.63 (s, 4H), 3.88 (s, 2H).
Figure pct00053
DCM (1 mL) 중 tert-부틸 (2-(2-(2-(2-브로모아세트아미도)에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트 (317 mg, 0.858 mmol)의 용액에 TFA (1 mL)를 첨가하고, 이를 30분 동안 실온에서 교반하였다. 용매의 제거 후에, 생성되는 조 물질을 추가 정제 없이 다음 반응에 사용하였다.
Figure pct00054
DCM (1.5 mL) 중 N-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)-2-브로모아세트아미드 (329 mg, 0.858 mmol)의 용액에 (5분 동안 실온에서 교반하면서, DMF (1.5 mL) 중 2-(((tert-부톡시카르보닐)아미노)옥시)아세트산 (328 mg, 1.716 mmol), HOAt (175 mg, 1.287 mmol) 및 DIC (0.267 mL, 1.716 mmol)로부터 제조된) 예비-활성화된 에스테르 및 DIPEA (0.749 mL, 4.29 mmol)를 5℃에서 첨가하고, 이를 실온으로 가온되도록 하면서 20분 동안 교반하였다. EtOAc 및 물을 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 0-5% MeOH/DCM으로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피 정제로 tert-부틸 (14-브로모-2,13-디옥소-6,9-디옥사-3,12-디아자테트라데실)옥시카르바메이트 (150 mg, 0.339 mmol, 39.5% 수율)를 수득하였다. ESI-MS m/z: 343[M+1 -Boc]+, 체류 시간: 1.30분 ((방법 A). H-NMR (CDCl3, 400 MHz); 1.49 (s, 9H), 3.47-3.55 (m ,4H), 3.59-3.63 (m ,4H), 3.65 (s, 4H), 3.88 (s, 2H), 4.34 (s, 2H).
Figure pct00055
tert-부틸 (14-브로모-2,13-디옥소-6,9-디옥사-3,12-디아자테트라데실) 옥시카르바메이트 (150 mg, 0.339 mmol)를 DCM (부피: 1 mL, 비: 1.000) 중에 용해시켰고, 여기에 TFA (부피: 1, 비: 1.000)를 실온에서 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하였다. 용매의 제거 후에, 10-25% MeCN/물 + 0.1%TFA로 용리하는 RP-HPLC로 2-(아미노옥시)-N-(2-(2-(2-(2-브로모아세트아미도)에톡시)에톡시)에틸)아세트아미드 (110 mg, 0.241 mmol, 71.1% 수율)를 수득하였다. ESI-MS m/z: 344[M+2]+, 체류 시간: 0.44분 (방법 A).
Figure pct00056
DMA (1 mL) 중 2-(아미노옥시)-N-(2-(2-(2-(2-브로모아세트아미도)에톡시)에톡시)에틸)아세트아미드 (42.9 mg, 0.075 mmol)의 용액에 DM-1 (37 mg, 0.050 mmol) 및 75mM Na 포스페이트 pH8.5 (1 mL)를 5℃에서 첨가하였다. DIPEA (0.026 mL, 0.150 mmol)를 동일한 온도에서 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM 및 포화 중탄산나트륨 (수성)으로 희석하고, 유기 층을 포화 NH4Cl (수성) 및 염수로 세척하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 여과하고, 농축시켰다. 0-15% MeOH/DCM으로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피로 목적하는 화합물 (31 mg, 0.031 mmol, 61.9% 수율)을 수득하였다. ESI-MS m/z: 1000[M+1]+, 체류 시간: 1.61분 (방법 A). 1H-NMR (CDCl3-d, 400 MHz); 0.79 (s, 3H), 1.20-1.33 (m, 9H), 1.41-1.50 (m, 2H), 2.17-2.22 (m, 1H), 2.50-2.63 (m, 2H), 2.70-2.81 (m, 2H), 2.86-2.94 (m, 3H), 2.99-3.01 (m, 1H), 3.10-3.13 (m, 1H), 3.18-3.20 (m, 4H), 3.36 (s, 3H), 3.45-3.62 (m, 14H), 3.98 (s, 3H), 4.17 (s, 2H), 4.25-4.31 (m, 1H), 4.78-4.82 (m, 1H), 5.30-5.35 (m, 1H), 5.63-5.69 (m, 1H), 6.27 (s, 1H), 6.39-6.45 (m ,1H), 6.61-6.64 (m, 2H), 6.83 (s,1H), 6.87 (brs, 1H).
실시예 8: 항체 C Fab 접합체:
단계 1:
Figure pct00057
EDTA, pH 7.4를 포함하는 100mM Na 포스페이트 중 항체 C Fab (항체 C는 Her2 및 항체 B와 상이한 표적 항원에 결합함: 1668 μg, 0.035 μmol, 120 ul)의 용액에 TCEP HCl (35.2 μg, 0.123 μmol, 11.73 ul)을 실온에서 첨가하고, 1.5시간 동안 23℃에서 교반하였다. 1,3-디클로로프로판-2-온 (117 μg, 0.878 μmol, 5.85 ul)을 상기 반응 혼합물에 첨가하고, 이를 40분 동안 23℃에서 교반하였다. 하나의 아세톤 가교 변형을 LCMS에 의해 관찰하였다. 반응 혼합물을 0.5 탈염 칼럼을 통해 통과시키고 100mM NaOAc 완충제 pH5.2로 용리하였다. LCMS (방법 B); 47554.
단계 2:
Figure pct00058
100mM NaOAc 완충제 pH5.2 및 제시된 아미노옥시-치환된 지방산 (1852 μg, 2.63 μmol) 중 변형된 항체 C Fab (1668 μg, 0.035 μmol, 148 ul)의 용액에 3,5-디아미노벤조산 (694 μg, 4.56 μmol, 5.34 ul)을 실온에서 첨가하고, 이를 20시간 동안 23℃에서 교반하였다. 추가의 아미노옥시-지방산 (1852 μg, 2.63 μmol)을 혼합물에 첨가하고, 이를 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 5 ml 탈염 칼럼을 통해 통과시키고 PBS pH7.4로 용리하여, 예상된 항체 C Fab-지방산 접합체 (30% 수율)를 수득하였다. LCMS (방법 B); 48238.
접합체에 대한 SDS PAGE 이미지 및 질량 스펙트럼은 도 9에 제공된다.
실시예 9: 디클로로아세톤 및 TCEP의 첨가의 순서의 효과.
모든 반응을 pH 8.0에서의 50 mM 완충제 (달리 명시되지 않는 한, 트리스)를 사용하여, 25℃에서 실행하였다. 반응을 웰 중 (58.8 마이크로리터) 및 완충제 (20 마이크로리터의 1M 완충제)를 사용하여 실행시킨 다음, IgG1 (170.5 mg/mL를 함유하는 6.6 마이크로리터의 용액) 및 TCEP (3 mg/mL TCEP를 포함하는 8.6 마이크로리터의 수용액)를 첨가하였다. 지시된 시간 동안 기다린 후, 1,3-디클로로아세톤 (DMSO 중 20 mg/mL를 포함하는 6 마이크로리터의 용액)을 첨가하였다.
실험의 제1 시리즈에서, 반응을, 환원제 (TCEP-HCl)를 먼저 첨가하고, 1,3-디클로로아세톤을 1시간 후에 첨가함으로써 실행하였다. 생성물 분포는 DTT 또는 TCEP에 의한 생성물 혼합물의 환원 후에 마이크로칩 전기영동-SDS 방법에 의해 분석하였다 (Electrophoresis 2012, vol. 33, 765-72). 결과를 하기 표에 나타내었다: LC = 경쇄, HC = 중쇄, HL = 중쇄 + 경쇄, HH = 중쇄 + 중쇄; HHL = HC + HC + LC; 및 LHHL = LC + HC + HC + LC. 데이터는, 임의의 남아있는 디술피드를 절단하기 위한 환원 후, 주요 생성물은 HC-LC (중쇄-경쇄) 부가물임을 나타낸다. 이는 단지 부분 반응이 이들 조건 하에 발생함을 입증한다. 데이터는 또한, 반응은 본질적으로 첫 30분 이내에 실행됨을 입증한다.
Figure pct00059
실험의 제2 세트는, 1,3-디클로로아세톤을 폴리펩티드/완충제 반응 혼합물에 첨가한 다음, 환원제를 첨가하는 것을 제외하고는, 동일한 조건 하에 실행되었다. 이들 실험으로부터의 결과를 LHHL에서의 유의한 증가를 보여주는 하기 표에 나타내었으며, 이는 항체의 4개의 디술피드 중 적어도 3개가 1,3-디클로로아세톤과 디술피드로부터의 두 황 원자와의 반응에 의해 형성된 공유 연결로 전환되었음에 해당한다. 다시, 반응은 30분 이내에 본질적으로 완료되는 것으로 보인다.
Figure pct00060
이들 실험은 디클로로아세톤을 첨가한 후에 디술피드의 환원을 개시하는 것이 놀랍게도 술프히드릴-대-술프히드릴 가교 반응의 효율에 있어서 큰 증가를 제공함을 입증한다. 생성물 수율은 완충제로서 PBS를 사용할 때 더 낮았다.
별도의 실험에서, 사용되는 디클로로아세톤의 양을 10배로 증가시키는 것은 반응을 방해하고, pH를 7.40, 7.10, 6.80 및 6.60으로 감소시키는 것은 LHHL 생성물의 유사한 또는 다소 개선된 수율을 발생시킴을 입증하였다.
실시예 10: 완충제의 스크린.
실온에서 완충제 중 1,3-디클로로아세톤 및 IgG의 예비혼합된 용액 (100mM)에 환원제 (TCEP-HCl)를 첨가함으로써, 반응을 실행하였다. 생성물 분포를 7시간 후 DTT 또는 TCEP에 의한 생성물 혼합물의 환원 후에 마이크로칩 전기영동-SDS 방법에 의해 분석하였다. 결과를 하기 표에 나타내었다: LC = 경쇄, HC = 중쇄, HL = 중쇄 + 경쇄, HH = 중쇄 + 중쇄; HHL = HC + HC + LC; 및 '무손상' = (HC)2(LC)2; LHHL = LC + HC + HC + LC. 수율은 LHHL의 백분율로부터 유래되었다.
Figure pct00061

Claims (16)

  1. 환원가능한 디술피드 결합을 함유하는 폴리펩티드, 수성 완충제, 및 1,3-디할로아세톤의 혼합물을 형성한 다음, 디술피드 결합을 환원시킬 수 있는 환원제를 첨가하는 것을 포함하는, 환원가능한 디술피드 결합을 포함하는 폴리펩티드를 화학식 [PP]-S-CH2-C(=O)-CH2-S-[PP]의 기를 포함하는 케톤-변형된 폴리펩티드로 전환시키는 방법이며,
    여기서 각 S는 디술피드 결합으로부터의 황이고, [PP]는 연결기의 말단이 폴리펩티드에 부착되는 곳을 나타내는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 1,3-디할로아세톤이 1,3-디클로로아세톤인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 환원제가 수용성 포스핀 또는 포스핀 염인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 항체 또는 항체 단편인 방법.
  5. 케톤-변형된 폴리펩티드를 아민 프로모터의 존재 하에 및 적어도 약 1 mg/mL의 폴리펩티드 농도에서 화학식 R-O-NH2의 기와 접촉시키는 것을 포함하는, 케톤-변형된 폴리펩티드를 옥심-변형된 폴리펩티드로 전환시키는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 케톤-변형된 폴리펩티드가 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 만들어진 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 아민 프로모터가 카르복시-치환된 아닐린 또는 아실 히드라진인 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 R-O-NH2의 기가 화학식 H2N-O-L-PL의 화합물이며, 여기서 L은 링커를 나타내고, PL은 페이로드 기를 나타내는 것인 방법.
  9. 제5항에 있어서, 케톤-변형된 폴리펩티드가 하기 화학식
    Figure pct00062

    을 가지며, 상기 식에서 원은 폴리펩티드를 나타내고, 각각의 황 원자는 폴리펩티드의 시스테인 잔기의 술프히드릴인 방법.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질-페이로드 접합체가 하기 화학식
    Figure pct00063

    을 가지며, 상기 식에서 X는 O이고, L은 링커를 나타내고, z는 1 내지 10의 정수이고, PL, PL1, 및 PL2는 독립적으로 각 경우에 페이로드 기를 나타내는 것인 방법.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 항체인 방법.
  12. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 백신 담체인 방법.
  13. 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드가 치료제를 포함하는 것인 방법.
  14. 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드가 검출가능한 표지 또는 결합 기를 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, L이 절단가능한 연결 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  16. 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, L이
    (a) 결합, -O-, -S-, -NH-, -N((C1-C6)알킬)H-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-;
    (b) (C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌, -Z-(C1-C20)알킬렌-, -Z-(C2-C20)알케닐렌, -Z-(C2-C20)알키닐렌, (C1-C20)알킬렌-Z-(C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌-Z-(C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌-Z-(C2-C20)알키닐렌 (여기서, Z는 -NH-, -N(C1-C6)알킬)-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, (C3-C7)시클로알킬렌, 페닐렌, 헤테로아릴렌, 또는 헤테로시클렌이고, 상기 (C1-C20)알킬렌, 상기 (C2-C20)알케닐렌, 및 상기 (C2-C20)알키닐렌 모이어티는 각각 독립적으로 상기 모이어티 내에 분산된 1-10개의 산소 원자를 임의로 함유함);
    (c) (C3-C7)시클로알킬렌, (C3-C7)시클로알킬렌-Y-(C3-C7)시클로알킬렌, -Y-(C3-C7)시클로알킬렌, 페닐렌, -Y-페닐렌, 페닐렌-Y-페닐렌, 헤테로아릴렌, Y-헤테로아릴렌, 헤테로아릴렌-Y-헤테로아릴렌, 헤테로시클렌, -Y-헤테로시클렌, 또는 헤테로시클렌-Y-헤테로시클렌 (여기서, Y는 (C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌, -O-, -C(O)-, -S-, -NH-, -N((C1-C6)알킬)-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, 또는 -NH-C(O)-이고, 상기 (C3-C7)시클로알킬렌, 상기 페닐렌, 상기 헤테로아릴렌, 및 상기 헤테로시클렌 모이어티는 각각 개별적으로 할로, (C1-C4)알킬 또는 할로-치환된 (C1-C4)알킬로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환됨);
    (d) -[OCH2CH2]v- 또는 -J-{CH2[OCH2CH2]v}w- (여기서, v는 1-2,000이고, w는 1-4이고, J는 CH2 또는 NH임);
    (e) 1 내지 100개의 아미노산을 포함하는 펩티드; 및
    (f) 덴드리머, 덴드론, 및 과분지형 중합체를 포함하는 수지상 거대분자
    로부터 선택된 적어도 1종의 스페이서를 포함하는 것인 방법.
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