KR20160083692A - 마이크로포레이션을 이용한 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포를 신경세포로 분화 촉진시키는 방법 - Google Patents

마이크로포레이션을 이용한 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포를 신경세포로 분화 촉진시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포를 신경세포로 분화 촉진시키는 방법으로서, 보다 구체적으로는 마이크로포레이션(microporation)을 이용하여 뇌유래 신경 성장인자(BDNF) 유전자를 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포로 이입하여 신경세포로의 분화를 촉진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포를 신경세포로 분화 촉진시키는 방법은 microporation을 이용하여 BDNF 유전자를 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 높은 효율로 이입함으로써, 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포의 재생능과 원래의 특성은 유지하면서 신경세포로 분화를 촉진시키는데 효과가 있으며, 본 발명의 microporation을 이용한 유전자 이입 방법은 줄기세포를 이용한 여러 질환연구에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

마이크로포레이션을 이용한 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포를 신경세포로 분화 촉진시키는 방법{Method for promoting differentiation of human inferior turbinate derived mesenchymal stem cell to neuronal cell using microporation}
본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포를 신경세포로 분화 촉진시키는 방법으로서, 보다 구체적으로는 마이크로포레이션(microporation)을 이용하여 뇌유래 신경 성장인자(BDNF) 유전자를 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포로 이입하여 신경세포로의 분화를 촉진시키는 방법에 관한 것이다.
알츠하이머병, 파킨슨병 및 루게릭병과 같은 신경퇴행성 질환과 허혈성 뇌졸중 등은 대표적인 난치성 신경계질환으로 손꼽힌다. 20세기 이후 이들 질환에 대한 이해가 높아지면서 다양한 치료법들에 대한 연구가 진행되고 있으며, 그 중 20세기 후반부터 줄기세포를 이용한 세포치료법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 줄기세포는 끊임없이 스스로 증식하는 자가 재생능력(self renewal), 다양한 세포와 조직으로 분화할 수 있는 능력(differentiation to specific tissue), 그리고 병소 부위로 찾아갈 수 있는 능력(tropism)을 가지고 있어 여러 질환들의 치료제로서 효과적으로 이용되고 있다. 이에 따라 신경계질환의 경우에는 신경줄기세포(neural stem cell)를 이용한 치료효과가 먼저 입증되었다. 그러나 신경줄기세포는 뇌의 심부에 위치하고 있어 충분한 양을 얻기가 어렵고 뇌 손상의 위험성이 존재하기 때문에 임상치료에 사용되기 힘들다는 한계점이 있다.
중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)는 여러 결합조직의 수선세포(repair cell)로 잘 알려져 있으며, 이들 세포는 중간엽계의 여러 종류의 세포로 분화할 수 있다. 또한 획득이 용이하고 임상적용이 가능하다는 이점 때문에 상기 신경줄기세포의 단점을 보완할 수 있어 신경계질환 치료제의 개발에 있어 관심이 높아지고 있다. 최근 신경줄기세포에 다양한 신경영양인자의 유전자를 도입한 후 뇌손상 부위에 이식하면 이식된 줄기세포가 신경원 세포로 분화가 촉진되고, 손상된 숙주 신경세포의 생존과 성장을 도와주는 신경영양인자를 함께 분비하여 치료효과가 증진된다는 연구결과가 발표되었다. 한 번의 세포이식을 통하여 세포 및 유전자치료가 함께 이루어져 치료효과를 강화시킨다는 점에서 유전자를 이용한 세포치료제 개발에 대한 관심이 높아지고 있다. 하지만 줄기세포를 이용한 신경계 질환 치료제 개발연구에 있어서, 배아줄기세포를 제외하고는 다른 유형의 줄기세포를 이용한 연구가 활발히 진행되고 있지 않다. 또한 현재 시판중이거나 임상시험 중인 줄기세포 치료제의 경우 대부분이 다양한 조직에서 유래하는 중간엽줄기세포를 이용한 치료제이지만 신경계질환을 적응증으로 하는 경우는 드문 실정이다.
뇌유래 신경 성장인자(brain-derived neurotrophic factor; BDNF)는 신경 성장인자(nerve growth factor)의 뉴로트로핀(neurotrophin)의 한 종류로서, 중추신경계에 가장 많이 발현하고 학습과 기억에서 중추적인 역할을 수행하는 해마(hippocampus), 대뇌 피질(cortex), 그리고 기부 전뇌(basal forebrain)에서 활성화되어 있으며, 또한 망막, 운동 뉴런, 신장, 타액, 그리고 전립선에서도 발현된다. neurotrophin은 신경줄기세포가 새로운 뉴런으로 분화되는 신경발생(neurogenesis) 과정을 촉진 및 조절하는 화학물질로서, BDNF는 가장 활발히 작용하는 뉴로트로핀 중 하나이다. 이에 따라 중추신경계와 말초신경계의 뉴런에 작용하여 뉴런의 생존 유지에 도움을 주거나 새로운 뉴런과 시냅스의 성장 및 분화를 촉진하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 BDNF를 만들어내지 못하는 마우스의 경우 뇌와 감각신경계(sensory nervous system)에서 발생학적 결함이 나타나며 태어난 지 얼마 되지 않아 치사한다는 보고가 있다. 따라서 BDNF는 일반적인 신경계 발달에 있어서 매우 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다.
중간엽줄기세포로 유전자를 이입하는 방법으로는 크게 바이러스의 이용 유무로 분류할 수 있다. 바이러스를 이용하는 벡터 시스템(virus vector system)의 경우, 보다 높은 유전자 이입률과 이입된 유전자가 오랜 시간 안정적으로 발현된다는 장점이 있어 널리 사용되고 있다. 그러나 전달된 유전자가 숙주세포의 염색체 속으로 들어가기 때문에 돌연변이가 발생할 수 있어 임상적용에는 문제가 될 수 있다. 바이러스를 이용하지 않는 유전자 전달 방법으로는, 대표적으로 양이온 지질(cationic lipid)을 이용하거나 전기천공법(electroporation)을 이용한 방법이 있다. 이러한 방법들은 바이러스를 이용하지 않기 때문에 안전하기는 하지만 대부분 10% 미만의 낮은 유전자 이입률을 보이는 단점이 있다. 따라서 줄기세포 치료제 개발 시 유전자를 높은 효율로 이입할 수 있는 전달방법이 필요하다.
본 발명자들은, 상기와 같은 종래의 문제점 해결을 위하여 다른 기관이나 조직에서 유래된 것보다 신경세포로의 분화유도가 더욱 용이하다고 알려진 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포를 분리한 후 전기천공법의 원리를 이용한 microporation 기법을 이용하여 BDNF 유전자를 이입한 결과 높은 유전자 전달효율을 확인하였으며, 세포의 증식능, 다분화능. 표현형의 관찰을 통해 신경세포로의 분화가 촉진됨을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 microporation 기법을 이용하여 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 BDNF 유전자를 이입함으로써 신경세포로의 분화를 촉진시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 마이크로포레이션(microporation)을 이용하여 뇌유래 신경 성장인자(BDNF) 유전자를 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포로 이입하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포를 신경세포로 분화 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 뇌유래 신경 성장인자(BDNF)는 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포를 신경세포로 분화를 촉진시키는 기능을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 마이크로포레이션(microporation)은 850 내지 1400V의 전압, 20 내지 30ms의 펄스 폭, 및 1번 내지 3번의 펄스 회수 조건하에서 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포로의 유전자 이입의 효율을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 마이크로포레이션(microporation)을 통하여 유전자를 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포로 이입하는 단계를 포함하고, 상기 유전자는 뇌유래 신경 성장인자(BDNF)인 것을 특징으로 하는, 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포를 신경세포로 분화 촉진시키는 방법은 마이크로포레이션(microporation)을 이용하여 뇌유래 신경 성장인자(BDNF) 유전자를 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 높은 효율로 이입함으로써, 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포의 재생능과 원래의 특성은 유지하면서 신경세포로 분화를 촉진시키는데 효과가 있으며, 본 발명의 마이크로포레이션(microporation)을 이용한 유전자 이입 방법은 줄기세포를 이용한 여러 질환 연구에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은, 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 24가지 microporation 조건으로 EGFP 유전자를 이입한 후 형광현미경 하에서 EGFP의 발현 정도를 관찰함으로써 발현률이 높은 6가지 조건을 선정하여 나타낸 결과이다.
도 2는, 실시예 1-1에서 선정한 6가지 microporation 조건으로 EGFP 유전자 이입 시 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포의 생존율 및 재생능에 미치는 영향을 확인하기 위해 세포 수를 측정하여 그래프로 나타낸 결과이다.
도 3은, EGFP 유전자가 이입된 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에서 생존율과 재생능이 높게 유지된 2가지 microporation 조건 중 정량적으로 EGFP 발현량이 높은 조건을 선택하기 위해 FACS 분석을 수행한 결과이다.
도 4는, 상기 FACS 분석실험을 통해 선정된 가장 유전자 이입률이 높은 microporation 조건으로 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 BDNF-EGFP 유전자를 이입한 후 이입 효율을 확인하기 위해 FACS 분석을 수행한 결과이다.
도 5는, 상기 microporation 조건으로 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 BDNF 유전자를 이입한 후 BDNF의 발현정도를 형광현미경하에서 관찰한 결과이다.
도 6은, microporation을 통한 유전자 이입 후 원래 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포의 특성에 변화가 없는지 검증하기 위해 중간엽줄기세포 면역 표현형 마커들의 발현 양상을 FACS 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 7은, BDNF에 의해 신경세포로의 분화가 유도되는지 검증하기 위해 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 microporation을 이용하여 BDNF 유전자를 이입한 후 15일까지 세포의 형태를 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 8은, BDNF에 의한 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포가 신경세포로 분화되었는지 확인하기 위해 분화된 세포에서 DAPI를 통한 핵 염색과 함께 신경세포 특이적 마커인 NF(neurofilament), Tuj1(tubulin-beta 3 chain; TUBB3), 및 NCAM(Neuronal cell adhesion molecule)의 발현을 확인한 결과이다.
도 9는, BDNF에 의한 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포가 신경세포로 분화되었는지 확인하기 위해 분화된 세포에서 BDNF의 발현과 함께 신경세포 특이적 마커인 GFAP(Glial fibrillary acidic protein), s100, Tuj1, 및 type VI intermediate filament인 Nestin의 발현을 확인한 결과이다.
본 발명은 마이크로포레이션(microporation)을 이용하여 뇌유래 신경 성장인자(BDNF) 유전자를 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포로 이입하는 단계를 포함하는 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포를 신경세포로 분화 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 뇌유래 신경 성장인자(BDNF)는 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포를 신경세포로 분화를 촉진시키는 기능을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 microporation은 기존의 전기천공법(electroporation)에 비하여 세포생존율과 유전자 이입 효율이 개선된 전기천공법을 이용한 기술로서, 850 내지 1400V의 전압, 20 내지 30ms의 펄스 폭, 및 1번 내지 3번의 펄스 회수 조건 하에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포로의 유전자 이입의 효율을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 microporation을 통하여 유전자를 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포로 이입하는 단계를 포함하고, 상기 유전자는 뇌유래 신경 성장인자(BDNF)인 것을 특징으로 하는, 방법을 제공한다.
본 발명에서는 상기 microporation 기법을 이용하여 BDNF 유전자를 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포로 이입함으로써 신경세포로 분화가 촉진되는 것을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 유전자 이입률이 가장 높은 microporation 조건을 확립하기 위해 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 EGFP 유전자를 24가지 다른 조건으로 이입한 후 EGFP의 발현정도를 관찰함으로써 유전자 이입률이 높은 6가지 조건을 선정하였다. 이후 6가지 microporation 조건으로 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 EGFP 유전자를 이입한 후 세포의 생존율 및 재생능을 관찰하여 가장 높게 유지되는 2가지 조건을 선정하였고, FACS 분석을 통하여 정량적으로 EGFP가 더 많이 발현되는 한 가지 조건을 선정하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 실시예 1에서 선정된 microporation 조건으로 EGFP와 연결된 BDNF 유전자(BDNF-EGFP)를 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 이입한 후 FACS 분석을 수행한 결과, 51.7%의 높은 유전자 이입률을 확인하였으며, 형광현미경하에서도 BDNF가 높게 발현하는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, microporation을 통해 BDNF 유전자를 이입하였을 때 하비갑개 유래 중간엽줄기세포의 면역 표현형 마커들에 변화가 없음을 확인하였고(실시예 3 참조), 유전자 이입 후 15일까지 세포의 형태를 현미경으로 관찰한 결과, BDNF가 이입된 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포는 세포질이 세포 핵 쪽으로 움츠러들어 전형적인 뉴런 체세포와 유사하였으며, 세포체의 계속적인 응축에 의해 더 얇아진 형태를 나타내며 점차 신경세포로 분화가 유도되는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포가 신경세포로 분화된 것인지 확인하기 위하여 신경세포 특이적 마커들인 NF(neurofilament), Tuj1(tubulin-beta 3 chain; TUBB3, NCAM(Neuronal cell adhesion molecule), GFAP(Glial fibrillary acidic protein), s100, Nestin의 발현을 확인한 결과, 분화된 세포에서 상기 마커들이 발현되는 것을 확인하였다(실시예 5 참조). 따라서 본 발명의 실시예를 통해 microporation 기법은 높은 효율로 유전자를 이입할 수 있는 전달방법이며, 이를 이용하여 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 BDNF 유전자를 이입하였을 때 신경세포로의 분화가 촉진되며 높은 분화능을 보임을 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: Microporation 을 이용한 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포( hTMSCs )에 유전자 이입조건 확립
1-1. Microporation 을 이용한 EGFP 유전자 이입
우선 microporation기법을 이용하여 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 높은 효율로 유전자를 이입할 수 있는 조건을 확립하기 위한 실험을 수행하였다.
24well plate의 1개 well당 1X105의 하비갑개 유래 중간엽줄기세포가 분주될 수 있도록 세포를 준비한 다음 원심 분리하여 pellet을 만들고, microporation을 위한 준비를 하였다. pellet을 PBS로 세척한 후 다시 원심 분리한 pellet을 well당 10μl의 resuspension buffer에 녹이고 EGFP(enhanced green fluorescence protein)를 발현하는 cDNA(0.5μg/well)를 첨가하였다. 이후 세포를 잘 섞으며 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 각각 다른 pulse voltage(V), pulse width(ms), 그리고 pulse number의 조건대로 microporation을 수행하고 다음날 형광현미경 하에서 초록색 형광의 발현 정도를 통해 EGFP 유전자의 이입효율을 판단하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 24가지의 다른 조건 중 EGFP가 고르게 잘 발현된 2, 6, 13, 14, 17, 19번 조건을 선정하였으며, 향후 유전자 이입조건 확립을 위한 실험을 수행하였다.
[표 1]
Figure pat00001

1-2. 세포의 생존률 및 세포 재생능 검증
상기 실시예 1-1에서 선정한 6가지 microporation 조건으로 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 EGFP 유전자를 이입한 후 세포의 생존율 및 재생능을 검증하였다.
각각의 조건으로 microporation을 수행한 후 0, 1, 3. 7일 후 각 well의 세포수를 세어 세포 생존율과 재생능을 비교하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 모든 조건의 세포들이 7일(day)까지 잘 재생되었으나, 유전자를 이입하고 바로 다음날(1day)은 전기충격으로 인하여 유전자를 이입하지 않은 대조군(control) 세포와는 재생능의 차이가 있었다. 7일까지 관찰한 결과, 6번과 17번 조건의 세포들이 각각 89%, 92%의 생존율을 보였으므로 6번과 17번 조건으로 보다 효과적인 유전자 이입방법을 확립하고자 하였다.
1-3. EGFP 의 발현량 확인
상기 실시예 1-2에서 선정한 6번과 17번의 유전자 이입 조건 중 EGFP 발현량을 정량적으로 비교하기 위해 FACS 분석을 수행하였다.
사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포를 음성 대조군, 6번 microporation 조건으로 EGFP 유전자를 이입시킨 군, 17번 microporation 조건으로 EGFP 유전자를 이입시킨 군으로 나누어 살아있는 상태의 세포를 회수한 후 FACSCalibur flow cytometer를 통해 분석하였다. 측정된 전체 세포 군집 대비 EGFP가 발현되어 초록색 형광을 나타내는 세포의 수와 비율을 정량적으로 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 6번과 17번 조건에서 EGFP 유전자의 이입 효율이 각각 37.1%와 34.5%로, 6번 조건의 경우 17번 조건보다 전체 세포 군집에서 초록색 형광을 나타내는 세포수가 더 많이 측정되었다. 따라서 유전자 이입 효율이 가장 높은 조건으로 6번 조건 즉, 1100V의 전압(pulse voltage)과 30ms의 펄스 폭(pulse width)으로 1회의 펄스를 주는 조건으로 선정하였으며 동일한 조건으로 하기 실험들을 수행하였다.
실시예 2: BDNF 유전자의 이입
2-1. BDNF - EGFP 유전자의 이입효율 검증
상기 실시예 1-3에서 확립한 microporation 조건으로 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 BDNF(brain-derived neurotrophic factor) 유전자를 이입한 후 FACS 분석을 통해 이입효율을 확인하였다.
microporation을 이용하여 BDNF에 초록색 형광을 나타내는 EGFP를 연결한 BDNF-EGFP cDNA를 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 이입한 후 상기 실시예 1-3에서와 같은 방법으로 FACS 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 전체 세포 군집에 대한 BDNF-EGFP 유전자가 이입되어 초록색 형광을 발현하는 세포의 비율 즉, microporation을 통한 BDNF-EGFP 유전자 이입률이 51.7%로 측정되었으며, 이는 일반적인 리포좀(liposome)이나 전기천공법(electroporation)을 사용한 방법보다 유전자 이입률이 높았고, 세포의 손상도 최소로 줄일 수 있었다.
2-2. BDNF 유전자의 발현 확인
상기 2-1에서 검증한 microporation 조건으로 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 BDNF 유전자를 이입한 후 BDNF의 발현정도를 형광현미경하에서 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군(control)에 비해 BDNF 유전자의 발현이 매우 높게 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 3: Microporation 후 hTMSCs 의 특성 변화 유무 검증
microporation을 통한 BDNF 유전자 이입에 의해 원래 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포의 특성에 변화가 없는지 검증하기 위해 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포의 표면에 발현하는 면역 표현형 마커들의 발현양을 FACS 분석을 통해 확인하였다.
BDNF 유전자를 이입한 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포와 유전자 이입을 하지 않은 대조군 세포를 회수한 후 중간엽줄기세포의 면역 표현형 마커들인 CD14, CD19, CD29, CD34, CD73, HLA-DR, CD90, 및 CD105 단백질에 각각 특이적인 항체를 이용하여 FACS 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, microporation을 통한 유전자 이입에 의해 상기 모든 마커들의 발현 양에 변화가 없음을 확인하였다.
실시예 4: BDNF - hTMSCs 의 신경세포로의 분화 유도 검증
BDNF는 중추신경계에서 가장 많이 존재하며 신경줄기세포들의 발생 및 분화에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 따라서 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 BDNF 유전자를 이입하였을 때 신경세포로 분화가 유도되는지 검증하였다.
microporation을 통해 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포에 BDNF 유전자를 이입한 후 유전자를 이입하지 않은 대조군과 함께 1, 5, 10, 15일에 걸쳐 광학현미경하에서 세포의 형태 변화를 관찰하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 시간이 지날수록 BDNF 유전자를 이입한 세포의 경우 확연히 형태가 달라짐을 확인하였다. 대조군 세포는 길쭉한 형태를 나타내는 반면, BDNF 유전자를 이입한 세포는 세포질이 세포 핵 쪽으로 움츠러들어 그 모양이 전형적인 뉴런 체세포와 유사하였으며, 세포체의 계속적인 응축에 의해 더 얇아진 형태를 나타내었다. 따라서 세포의 형태 변화를 통해 BDNF 유전자를 이입한 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포가 신경세포로 분화가 유도되는 것을 확인하였다.
실시예 5: BDNF - hTMSCs 의 신경세포로의 분화능 확인
상기 실시예 4와 같은 방법으로 3주 동안 신경세포로의 분화를 유도한 후 다양한 신경세포 특이적 마커들의 발현을 확인함으로써 BDNF 유전자 이입에 의한 신경세포로의 분화능을 검증하였다.
본 실시예에서 사용한 마커들은 하기와 같다. 신경세포의 신경세사인 NF(neurofilament), 초기 신경원세포의 마커인 Tuj1(tubulin-beta 3 chain; TUBB3), 신경세포 표면에 발현하는 당단백질인 NCAM(Neuronal cell adhesion molecule), 성상세포(astrocyte)를 포함하는 중추신경계의 다양한 세포들에서 발현되는 중간 필라멘트(intermediate filament)인 GFAP(Glial fibrillary acidic protein), 일반적인 뇌세포들에서 발현되는 단백질인 s100, 그리고 대부분의 신경세포에서 발현되는 type VI intermediate filament인 Nestin에 대한 항체를 이용하여 BDNF 유전자가 이입된 하비갑개 유래 중간엽줄기세포가 신경세포로 분화된 것인지 검증하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 분화된 신경세포의 핵을 DAPI로 염색하여 파란색으로 보이도록 표지하고 NF, Tuj1은 붉은색, NCAM은 녹색의 형광으로 보이도록 항체를 붙여 표지하여 형광현미경으로 관찰한 결과 각 단백질들이 분화된 신경세포에서 발현하는 것을 확인하였다.
또한, 도 9에 나타낸 바와 같이. 상기 실시예에서 이입한 유전자인 BDNF와 s100을 붉은색 형광으로 표지하고, GFAP, Tuj1, Nestin은 초록색으로 발현되도록 표지하여 관찰한 결과 BDNF가 분화된 세포들에서 발현되며, 각각의 신경세포 마커들도 발현되고 있는 것을 관찰하였다. 이러한 결과를 통하여 microporation을 통한 BDNF 유전자 이입에 의해 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포가 신경세포로 분화되었으며, 높은 분화능을 가짐을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (4)

  1. 마이크로포레이션(microporation)을 이용하여 뇌유래 신경 성장인자(BDNF) 유전자를 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포로 이입하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포를 신경세포로 분화 촉진시키는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 뇌유래 신경 성장인자(BDNF)는 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포를 신경세포로 분화를 촉진시키는 기능을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 마이크로포레이션(microporation)은 850 내지 1400V의 전압, 20 내지 30ms의 펄스 폭, 및 1번 내지 3번의 펄스 회수의 조건하에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포로의 유전자 이입의 효율을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 마이크로포레이션(microporation)을 통하여 유전자를 사람 하비갑개 유래 중간엽줄기세포로 이입하는 단계를 포함하고, 상기 유전자는 뇌유래 신경 성장인자(BDNF)인 것을 특징으로 하는, 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20190092978A (ko) * 2018-01-31 2019-08-08 가톨릭대학교 산학협력단 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경계질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물

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