KR20160074415A

KR20160074415A - 메트포민을 포함하는 면역억제제로 인한 신장 독성 완화용 조성물 및 이를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20160074415A
Application number: KR1020150179374A
Authority: KR
Inventors: 조미라; 양철우; 최종영; 박성환; 박민정; 이선영; 전주연; 이은정; 김재경; 김은경; 임선우
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2016-06-28
Also published as: KR101760510B1; US10016376B2; US20170348256A1; KR20180036688A; KR20170054359A; KR101909269B1

Abstract

본 발명은 메트포민(metformin)을 포함하는 면역억제제로 인한 신장 독성 완화용 조성물 및 이를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 메트포민을 유효성분으로 포함하는 면역억제제로 유발된 신장 독성 감소용 조성물, 메트포민과 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 메트포민과 칼시뉴린 억제제를 구성요소로 포함하며 이들을 동시에, 개별적으로 또는 정해진 순서로 투여하는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합 제제에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 기존 면역억제제의 부작용으로 생기는 신장 기능 저하를 효과적으로 완화하여 면역억제가 필요한 질병의 치료 효과를 높이는데 유용하게 이용될 수 있으며, 더 나아가 기존의 면역억제제와 메트포민을 병용투여하는 다양한 방법을 제시하여 기존 면역억제제의 신장 독성 부작용은 줄이고, 면역억제 또는 면역조절 효과는 극대화함으로써, 장기이식 거부 반응, 자가면역질환, 염증성 질환 등을 예방하거나 치료하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

메트포민을 포함하는 면역억제제로 인한 신장 독성 완화용 조성물 및 이를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 조성물 {Metformin-comprising compositions for reducing nephrotoxicity caused by immunosuppressive drugs and for the prevention or treatment of immune diseases}

본 출원은 2014년 12월 18일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2014-0183462호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.

본 발명은 메트포민(metformin)을 포함하는, 면역억제제로 인한 신장 독성 완화용 조성물 및 이를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 메트포민을 유효성분으로 포함하는 면역억제제로 유발된 신장 독성 감소용 조성물, 메트포민과 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)인 면역억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 메트포민과 칼시뉴린 억제제인 면역억제제를 구성요소로 포함하며 이들을 동시에 또는 개별적으로 또는 정해진 순서로 투여하는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합 제제에 관한 것이다.

면역억제제는 항원에 대하여 항체를 만드는 체액성 면역반응이나 세포성 면역반응을 차단하거나 저하시키는 약물로, 주로 장기이식 후 발생하는 면역 거부반응이나 골수이식 후의 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)을 치료하는데 사용되어 왔다. 뿐만 아니라, 면역억제제는 낭창(lupus), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)과 같은 자가면역질환과 알러지, 아토피와 같은 과면역반응, 염증성 질환의 증상을 장기간에 걸쳐 치료하는 데에도 중요하게 쓰인다.

현재 사용되고 있는 면역억제제는 작용기작에 따라 코티코스테로이드(corticosteroid), 대사길항물질(antimetabolite), 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor), 라파마이신 타겟 억제제(mammalian target of rapamycin inhibitor), 항체(antibody) 등으로 나뉘는데, 이들은 각기 다른 단계에서 면역계의 T 세포의 증식 또는 활성화를 차단함으로써 면역억제 효과를 낸다(Dalal, P. et al. Int. J. Nephrol. Renovasc. Dis. 3:107-115 (2010)). 면역억제제의 주요 표적인 T 세포는 인체의 흉선에서 생성되어 주로 세포 매개성 면역에 관여하는 1형 보조 세포(Th1) 또는 체액성 면역에 관여하는 2형 보조 세포(Th2)로 분화한다. 두 T 세포군은 서로 과활성되지 않도록 견제하고 있다가 균형이 깨지면 자가면역이나 과민반응 같은 이상 반응이 일어나는 것으로 알려져 있다.

이외에도 면역반응을 조절할 수 있는 면역조절 T 세포(Treg)나 Th17과 같은 새로운 종류의 T 세포들이 알려졌다. Treg은 Th1 세포 활성을 조절할 수 있으며, 비정상적으로 활성화된 면역 세포의 기능을 억제하고 염증 반응을 조절한다. 이와 반대로 Th17 세포는 IL-17을 분비하며, 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시킨다. 최근 이들 Treg이나 Th17이 면역질환 치료제의 새로운 표적으로 크게 부각되어 다양한 면역조절 치료제 연구가 이루어지고 있다(Wood, K. J. et al., Nat. Rev. Immunol. 12(6):417-430, 2012; Miossec, P. et al., Nat. Rev. Drug Discov. 11(10):763-776, 2012; Noack, M. et al., Autoimmun. Rev. 13(6):668-677, 2014).

T 세포를 비특이적으로 억제하는 기존의 면역억제제는 일반적으로 세포독성, 면역저하로 인한 감염, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용을 동반하기 때문에 장기간 치료 효과가 지속되기 어렵다는 단점이 있다. 이에 심각한 부작용을 줄이고 면역억제 치료 효과를 높이기 위해 특히 장기이식 분야에서 서로 다른 작용기작의 면역억제제를 병용투여하거나 대체하는 방법들이 시도되어 오고 있으나, 최적화된 면역억제제의 병용투여의 조합이나 치료법은 아직 미비한 상태이다.

따라서 기존 면역억제제의 부작용을 줄이고 치료 효과는 향상시킬 수 있는 새로운 면역억제 또는 면역조절 요법의 개발과 더욱 안전하고 부작용이 적은 새로운 면역억제제 후보 물질의 발굴이 시급한 실정이다.

이에 본 발명자들은 부작용이 적고 지속적인 치료 효과를 낼 수 있는 새로운 면역조절제에 대한 연구를 수행하던 중, 메트포민과 칼시뉴린 억제제 계열의 면역억제제를 병용처리하면 염증성 사이토카인의 분비 억제와 Treg 세포 활성화 등과 같은 면역억제와 조절에 대한 상승 효과가 발생함을 확인하였고, 특히 메트포민이 기존 면역억제제의 부작용으로 유발되는 신장 독성을 완화시키는 효과가 있음을 처음으로 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제제로 유발된 신장 독성 감소용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)와 메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은

(a) 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)와 메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 1:1 내지 1:3,500의 중량비로 포함하며,

(b) 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)와 메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 동시에 또는 개별적으로 또는 정해진 순서로 투여하는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합 제제를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제제로 유발된 신장 독성 감소용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여,

칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)와 메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여,

(b) 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)와 메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 동시에 또는 개별적으로 또는 정해진 순서로 투여하는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합 제제를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 면역억제제로 유발된 신장 독성 감소용 조성물은 특히 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)인 면역억제제로 유발된 신장 독성 감소용 조성물일 수 있으며, 보다 구체적으로는 사이클로스포린(cyclosporine) 또는 타크로리무스(tacrolimus)로 유발된 신장 독성 감소용 조성물일 수 있다.

현재 사용되고 있는 면역억제제 중 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor, CNI) 계열의 면역억제제는 환자에서의 단기적인 예후가 특히 좋아서 1970년대 도입된 이래 가장 널리 사용되며 장기이식 분야의 발전을 가능케 했다. 칼시뉴린은 칼슘과 칼모듈린 의존적인 단백질 포스파타아제(calcium- and calmodulin-dependent protein phosphatase)로, T 세포 분화에 중요한 전사인자인 nuclear factor of activated T cells, cytoplasmic(NFATc)을 탈인산화시켜 활성화시킨다. 칼시뉴린에 의해 활성화된 NFATc는 세포핵으로 이동하여 인터루킨 2(interleukin 2, IL-2)의 발현을 증가시키고, IL-2는 T 세포의 증식과 분화를 촉진한다. 이같이 T 세포의 활성에 중요한 칼시뉴린을 억제하여 면역억제 효과를 내는 CNI 계열 면역억제제로는 대표적으로 사이클로스포린(cyclosporine)과 타크로리무스(tacrolimus)가 있다.

사이클로스포린 또는 시클로스포린(ciclosporin, cyclosporine 또는 cyclosporin)은 사이클로스포린 A(ciclosporin A, cyclosporine A, 또는 cyclosporin A, 약어로는 CsA 또는 Cys) 등으로도 알려져 있으며, 균류 Tolypocladium inflatum에서 처음 발견되었다. 사이클로스포린은 11개 아미노산으로 이루어진 펩타이드로, 하기의 구조를 가지고 있다(화학식 C₆₂H₁₁₁N₁₁O₁₂, 분자량 1202.61). 사이클로스포린은 특히 T 세포와 같은 림프구(lymphocyte)가 발현하는 이뮤노필린(immunophilin) 단백질인 사이클로필린(cyclophilin)에 결합하고, 사이클로스포린과 사이클로필린의 복합체가 칼시뉴린에 결합함으로써 칼시뉴린의 탈인산화 효소 활성을 억제한다. 사이클로스포린은 시중에서 SANDIMMUNE, NEORAL 등의 브랜드명으로 유통되며 제네릭 의약품도 판매되고 있다.

<사이클로스포린 구조> < 타크로리무스 구조 >

타크로리무스(tacrolimus)는 FK506(또는 FK-506), 후지마이신(fujimycin) 등으로도 알려져 있으며, 일본 토양에 서식하는 박테리아 Streptomyces tsukubaensis로부터 발견되었다. 타크로리무스는 마크로라이드 락톤(macrolide lactone) 구조의 화합물로 상기와 같은 구조를 가지고 있다(화학식 C₄₄H₆₉NO₁₂, 분자량 804.02). 타크로리무스는 사이클로스포린과 화학 구조는 상이하지만 매우 유사한 작용기작을 가지고 있는데, 이뮤노필린(immunophilin) 단백질인 FKBP12에 결합하고, 이어 타크로리무스와 FKBP12의 복합체가 칼시뉴린에 결합하여 칼시뉴린의 효소 활성을 억제한다. 타크로리무스는 시중에서 Prograf, Advagraf, Astagraf XL 등의 브랜드명으로 유통되며, 제네릭 의약품도 판매되고 있다.

칼시뉴린은 면역계의 T 세포뿐 아니라 다른 세포와 조직에서도 발현되기 때문에 사이클로스포린이나 타크로리무스의 칼시뉴린 억제 작용은 면역억제 외에 다양한 부작용을 동반한다(Liu, E. H. et al., Nat. Immunol. 8(1):25-30, 2007). 면역억제제의 부작용은 장기적으로 안정적이고 성공적인 장기이식과 이식 환자의 생존률에 심각한 영향을 미치며, 나아가 면역억제가 필요한 장기이식 이외의 질환의 치료에도 큰 문제가 된다. CNI 면역억제제의 부작용 중 특히 중요한 것으로 급성, 만성 신장 독성(nephrotoxicity)이 있다(Naesens, M. et al., Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 4(2):481-508, 2009). CNI 면역억제제가 유발하는 신장 독성은 세뇨관내 공포생성, 간질 섬유화, 세동맥의 초자화 등의 신장의 조직적 변화와 유효신혈류와 사구체 여과율 감소 등의 신장 기능 저하로 나타난다.

이에 본 발명에서는 면역억제제, 바람직하게는 CNI 계열 면역억제제의 부작용으로 유발된 신장 독성을 완화시켜 면역억제제의 지속적 치료 효과를 향상시킬 수 있는, 메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제제 유발 신장 독성 감소용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 일실시예에서 CNI 계열 억제제인 타크로리무스가 유발하는 신장 독성의 동물 모델에서 메트포민(metformin)이 타크로리무스의 신장 독성을 완화시키는 효과가 있음을 처음으로 발견하였다. 구체적으로는 타크로리무스와 메트포민을 병용투여받은 실험군이 타크로리무스 단독투여군보다 통계적으로 유의하게 개선된 신장 기능 지표를 나타냈다. 또한 CNI 계열의 다른 면역억제제인 사이클로스포린 역시 신장 손상을 야기하며, 메트포민과 병용투여함으로써 신장 기능을 개선할 수 있음을 동물 실험을 통해 확인하였다.

메트포민은 하기 화학식의 구조를 갖는 바이구아나이드(biguanide) 계열의 화합물로, 특히 제2형 당뇨병을 치료하는데 쓰이는 항당뇨제이다. 시중에서 Glucophage라는 트레이드마크로 유통되며, 다양한 제네릭 의약품도 판매되고 있다(화학식 C₄H₁₁N₅, 분자량 129.16).

< 메트포민 구조 >

본 발명에 따른 조성물의 메트포민(metformin)은 그 자체 또는 염, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에서 '약학적으로 허용가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 조성물의 메트포민 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)와 메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 약학적 조성물의 유효성분인 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)는 바람직하게는 사이클로스포린(cyclosporine) 또는 타크로리무스(tacrolimus)일 수 있다.

본 발명자들은 면역억제제와 메트포민의 동시투여로 인해 면역억제의 치료 효과는 더욱 향상되고 신장 독성의 부작용은 완화된 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)와 메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

최근 본 발명자들은 메트포민이 Th17 세포는 억제하고 Treg 세포의 분화를 유도하여 Treg/Th17 균형을 조절하는 효과가 있음을 처음 발견하여 보고한 바 있다(Son, J. H. et al., Mediators Inflamm. volume 2014, Article ID 973986, 2014). 본 발명의 실시예에서도 메트포민을 단독처리했을 때, 동종이형면역반응의 조건에서 T 세포의 증식과 사이토카인의 분비를 억제하는 등 T 세포에 대한 면역 조절 효과가 있음을 관찰하였다. 나아가 본 발명자들은 메트포민과 타크로리무스를 동시에 처리했을 때, 각각을 단독처리했을 때보다 더욱 현저한 면역억제 또는 조절의 상승 효과가 발생함을 발견하였다. 뿐만 아니라, 타크로리무스와 메트포민을 병용투여하면, 타크로리무스로 유발된 신장 독성이 감소함을 실시예의 동물실험을 통해 확인하였다. 메트포민의 병용투여로 인한 면역 조절의 상승 효과와 신장 독성 개선 효과는 타크로리무스 뿐 아니라 사이클로스포린에서도 동일하게 관찰되었다. 특히 사이클로스포린 단독으로는 염증을 조절하는 Treg 세포를 크게 억제하였으나(실시예 <5-2> 참조), 메트포민과 병용투여하면 Treg 수준이 크게 증가하는 효과가 있었다.

본 발명의 약학적 조성물의 메트포민과 사이클로스포린 또는 타크로리무스는 그 자체 또는 염, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 앞서 서술한 바와 같다.

본 발명의 약학적 조성물의 메트포민과 사이클로스포린 또는 타크로리무스는 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)와 메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 중량비는 1:1 내지 1:3,500일 수 있으며, 바람직하게는 1:5 내지 1:500일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 칼시뉴린 억제제와 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 만을 포함하거나 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 ‘약학적으로 유효한 양’이란 음성대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며, 바람직하게는 급성 또는 만성 장기이식 거부 반응, 자가면역질환 또는 염증성 질환을 치료 또는 예방하는데 있어서 칼시뉴린 억제제와 메트포민을 동시투여함으로써 면역억제와 조절의 상승 효과를 내고 칼시뉴린 억제제가 유발하는 신장 독성을 완화시키는데 충분한 양을 의미하는 것으로, 특히 약학적 조성물 안에 칼시뉴린 억제제와 메트포민이 상기 중량비로 포함되는 것을 말한다.

본 발명의 약학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 칼시뉴린 억제제의 약학적으로 유효한 양으로는 사이클로스포린의 경우 1 내지 5mg/day/체중kg, 타크로리무스의 경우 0.01 내지 0.1mg/day/체중kg, 메트포민의 경우 5 내지 35mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 칼시뉴린 억제제와 메트포민 병용투여의 면역억제 또는 조절의 상승 효과를 내기 위해 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. ‘약학적으로 허용되는’이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.

투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 ‘경피투여’는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.

흡입투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

그밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 급성 또는 만성 장기이식 거부 반응, 자가면역질환 또는 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있는 공지의 화합물과 병용하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 급성 또는 만성 장기이식 거부 반응, 자가면역질환 및 염증성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.

상기 본 발명의 약학적 조성물의 치료 또는 예방 적응증은 구체적으로는 심장, 폐, 심장 및 폐 복합, 간, 신장, 췌장, 피부, 장(bowel) 또는 각막의 이식 후에 발생하는 급성 또는 만성 이식 거부 반응, 그리고 골수이식 후 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)일 수 있으며, 특히 T 세포가 매개하는 이식 후 거부 반응일 수 있다.

또한 상기 본 발명의 약학적 조성물의 치료 또는 예방 적응증은 자가면역질환 또는 염증성 질환일 수 있으며, 하기 예에 한정되지는 않으나 구체적으로는 패혈증, 동맥경화, 균혈증, 전신염증반응증후군, 다장기기능부전, 골다공증, 치주염, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 골관절염, 유년형 만성 관절염, 척추관절증, 다발성 경화증, 전신성 경화증, 특발성 염증성 근장애, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 전신성 맥관염, 유육종증(sarcoidosis), 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판감소증, 갑상선염, 진성당뇨병, 면역매개성 신장 질환, 중추신경계 또는 말초신경계의 탈수초 질환, 특발성 탈수초 다발성 신경염, 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 만성 염증성 탈수초 다발성 신경염, 간담즙성 질환, 감염성 또는 자가면역성 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염, 경화성 담관염, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 글루텐(gluten) 민감성 장질환, 휘플병(Whipple's disease), 자가면역성 또는 면역매개성 피부질환, 수포성 피부질환 다형홍반, 접촉성 피부염, 건선, 알레르기성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증, 여드름, 두드러기, 폐의 면역질환, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증, 과민성 폐렴으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명은 또한

본 발명의 상기 약학적 복합 제제는 칼시뉴린 억제제와 메트포민을 구성요소로 포함하며, 상기 칼시뉴린 억제제는 바람직하게는 사이클로스포린 또는 타크로리무스일 수 있다.

본 발명의 약학적 복합 제제의 구성요소인 타크로리무스 또는 사이클로스포린, 그리고 메트포민은 그 자체 또는 염, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서 ‘약학적으로 허용가능한’의 의미는 앞서 서술한 바와 같다.

본 발명의 상기 약학적 복합 제제는 투여 방법과 투여 경로에 따라 구성요소인 칼시뉴린 억제제와 메트포민이 하나의 제형에 동시에 포함되도록 제형화될 수도 있고, 칼시뉴린 억제제와 메트포민이 개별적으로 제형화되어 일일 또는 일회 등의 투여 단위에 따라 하나의 포장에 포함될 수 있다. 개별적으로 제형화된 칼시뉴린 억제제와 메트포민의 제형은 동일할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 약학적 복합 제제의 구체적인 제형화 방법과 제형에 포함될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 본 발명의 약학적 조성물에서 설명한 바와 같으며, 다음의 문헌을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

상기 ‘약학적으로 유효한 양’이란 음성대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며, 바람직하게는 급성 또는 만성 장기이식 거부 반응, 자가면역질환 또는 염증성 질환을 치료 또는 예방하는데 있어서 본 발명의 약학적 복합 제제의 칼시뉴린 억제제와 메트포민을 병용투여함으로써 면역억제와 조절의 상승 효과를 내고 칼시뉴린 억제제가 유발하는 신장 독성을 완화시키는데 충분한 양을 말한다. 또한 약학적 복합제제의 투여 단위 안에서 칼시뉴린 억제제와 메트포민이 구성요소로 1:1 내지 1:3,500의 중량비로 포함되는 것을 말한다.

이에 따라 본 발명의 상기 약학적 복합 제제의 구성요소인 칼시뉴린 억제제의 투여량은 사이클로스포린의 경우 1 내지 5mg/day/체중kg, 타크로리무스의 경우 0.01 내지 0.1mg/day/체중kg일 수 있으며, 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 일일 투여량은 5 내지 35mg/day/체중kg일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 복합 제제의 투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 하기 예에 한정되지 않으나, 예를 들면 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다. 개별적으로 제형화된 칼시뉴린 억제제와 메트포민의 투여 경로는 동일할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.

본 발명에 따른 약학적 복합 제제의 구성요소인 칼시뉴린 억제제와 메트포민은 동시에 또는 개별적으로 또는 정해진 순서에 따라 투여할 수 있다. '동시에 투여'란 칼시뉴린 억제제와 메트포민을 함께 또는 실질적으로 동일한 시간(예를 들어 투여 시간 간격이 15분 또는 그 이하)에 복용하여, 경구투여의 경우에는 두 가지 구성요소가 위에 동시에 존재하게 되는 것을 의미한다. 동시에 투여하는 경우, 칼시뉴린 억제제와 메트포민은 하나의 제형에 동시에 포함되도록 제형화될 수 있다. 경구투여의 경우 바람직하게는 일일 투여량이 일회 투여량에 모두 포함되도록 제형화될 수 있지만, 하루에 2, 3, 4회 등으로 나누어 투여하도록 제형화될 수 있다.

본 발명의 약학적 복합 제제의 바람직한 투여량은 질환 및 이의 중증 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화할 수 있다. 칼시뉴린 억제제와 메트포민의 생물학적 이용가능성(bioavailability)은 개인차가 있기 때문에 본 발명의 약학적 제제 투여 초기에는 당업계에 알려져 있는 단일 클론 항체(monoclonal antibody) 등에 기반한 어세이로 각 약물의 혈중 농도를 확인하는 것이 바람직할 수도 있다.

본 발명의 약학적 복합 제제는 급성 또는 만성 장기이식 거부 반응, 자가면역질환 및 염증성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 복합 제제의 치료 또는 예방 적응증의 구체적인 예는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 본 발명의 약학적 조성물의 치료 또는 예방 적응증의 구체적인 예와 같다.

따라서 본 발명은 메트포민(metformin)을 유효성분으로 포함하는 면역억제제로 유발된 신장 독성 감소용 조성물, 메트포민과 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 약학적 복합 제제를 제공한다. 본 발명의 조성물은 기존 면역억제제의 부작용으로 생기는 신장 기능 저하를 효과적으로 완화하고 면역억제 치료 효과가 더욱 향상되어, 면역억제가 필요한 이식 거부 반응, 자가면역질환, 염증성 질환 등을 예방하거나 치료하는데 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 쥐(rat)에서 FK506로 유발된 신장 독성에 대한 메트포민의 효과를 확인하기 위한 동물 실험의 개요(도 1A), 그리고 4주간 약물 투여 후 측정한 대조군과 실험군의 체중(body weight), 혈청 크레아티닌(serum creatinine, Scr), 그리고 혈액요소성질소(blood urea nitrogen, BUN) 수준(도 1B)을 나타낸다.
도 2는 쥐(rat)에서 CsA로 유발된 신장 독성에 대한 메트포민의 효과를 확인하기 위한 동물 실험의 개요(도 2A), 그리고 3주간 약물 투여 후 측정한 대조군과 실험군의 체중(body weight), 혈청 크레아티닌(serum creatinine, Scr), 그리고 혈액요소성질소(blood urea nitrogen, BUN) 수준(도 2B)을 나타낸다.
도 3은 림프구 혼합배양실험(MLR)에서 메트포민과 FK506이 동종이형반응성 T 세포의 증식에 미치는 영향을 보여준다. *는 통계적 유의성을 나타낸다.
도 4는 림프구 혼합배양실험(MLR)에서 메트포민과 CsA가 동종이형반응성 T 세포의 증식에 미치는 영향을 보여준다.
도 5는 림프구 혼합배양실험에서 메트포민과 FK506이 동종이형반응성 T 세포가 분비하는 염증성 사이토카인 IFN-γ와 IL-17의 분비량에 미치는 영향을 보여주는 엘라이자(ELISA) 실험 결과를 나타낸다. *는 통계적 유의성을 나타낸다.
도 6은 림프구 혼합배양실험에서 메트포민과 CsA가 동종이형반응성 T 세포가 분비하는 염증성 사이토카인 IFN-γ와 IL-17의 분비량에 미치는 영향을 보여주는 엘라이자(ELISA) 실험 결과를 나타낸다. *는 통계적 유의성을 나타낸다.
도 7은 CD3 항체를 이용한 T 세포 활성조건에서 메트포민과 FK506의 세포독성 여부를 보여주는 엠티티 어세이(MTT assay) 실험결과를 나타낸다.
도 8은 CD3 항체를 이용한 T 세포 활성조건에서 메트포민과 FK506이 Treg 세포의 활성에 비치는 영향을 보여주는 유세포분석(FACS) 실험 결과를 나타낸다. 도 8A는 scatter plot이고, 도 8B는 Foxp3+CD25+ cell의 비율(%)을 나타낸다. *는 통계적 유의성을 나타낸다.
도 9는 CD3 항체를 이용한 T 세포 활성조건에서 메트포민과 CsA가 Treg 세포의 활성에 비치는 영향을 보여주는 유세포분석(FACS) 실험 결과를 나타낸다. 도 9A는 scatter plot이고, 도 9B는 Foxp3+CD25+ cell의 비율(%)을 나타낸다. *는 통계적 유의성을 나타낸다.
도 10은 메트포민과 FK506이 LPS 처리하여 배양한 비장세포에서 분비되는 염증성 사이토카인 TNF-α와 IL-6의 분비량에 미치는 영향을 보여주는 엘라이자(ELISA) 실험결과를 나타낸다. *, **는 통계적 유의성을 나타낸다.
도 11은 메트포민과 FK506이 LPS 처리하여 배양한 비장세포에서 분비되는 면역글로불린(IgG)의 양에 미치는 영향을 보여주는 엘라이자(ELISA) 실험결과를 나타낸다. **는 통계적 유의성을 나타낸다.
도 12는 간이식 환자에서 FK506과 메트포민의 병용투여가 T 세포군에 미치는 효과를 보여주는 유세포분석(FACS) 실험결과를 나타낸다. *, **는 통계적 유의성을 나타낸다.
도 13은 간이식 환자에서 사이클로스포린과 메트포민 병용투여가 T 세포군에 미치는 효과를 보여주는 유세포분석(FACS) 실험결과를 나타낸다. *, **는 통계적 유의성을 나타낸다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

칼시뉴린 억제제로 유발된 신장 독성에 대한 메트포민의 효과

<1-1> FK506 으로 유발된 신장 독성에 대한 메트포민의 효과

FK506(타크로리무스)로 유발되는 신장 독성의 동물 모델에서 메트포민의 신장 보호 효과를 알아보았다. 체중 200~220g의 Sprague-Dawley rat을 이용하여 도 1A의 실험 개요에 따라 총 4주간 0.05% 저염식이와 약물을 투여하고 혈액 내 신장 기능 지표를 비교하였다. 음성대조군인 vehicle군(VH), FK506 단독투여군(FK506), 메트포민 단독투여군(Met) 그리고 병용투여군(FK506+Met)의 총 네 개의 군으로, 각각 8마리의 rat으로 구성되었다.

FK506을 투여한 실험군, 즉 FK506 단독투여군과 병용투여군은 올리브유(olive oil)에 녹인 FK506을 1.5mg/체중kg의 용량으로 일일 일회 피하주사하였으며(subcutaneous injection, s.c.), FK506을 투여하지 않은 실험군, 즉 VH군과 메트포민 단독투여군은 동량의 올리브유를 같은 방법으로 투여하였다. 메트포민을 투여한 실험군, 즉 메트포민 단독투여군과 병용투여군은 증류수에 녹인 메트포민을 250mg/체중kg의 용량으로 일일 일회 경구투여(oral gavage)하였으며, 메트포민 비투여군, 즉 VH군과 FK506 단독투여군은 동량의 증류수(DW)를 같은 방법으로 투여하였다.

약물 투여 4주 뒤, 각 군의 체중을 측정하고, 동물을 희생하여 채취한 전혈에서 FK506의 혈중농도를 Mass spectrometer(API 3000 LC/MS/MS, Applied Biocystem, Foster City, CA)로 측정하였다. 채취한 혈액을 원심분리한 혈청에서는 신장 기능 지표인 혈청 크레아티닌(serum creatinine, Scr)과 혈액요소성질소(blood urea nitrogen, BUN)를 측정하였다(Cobas analyzer, Roche Diagnostics, Montclair, NJ). 데이터는 평균값±표준오차로 표시하였고, 통계분석은 SPSS (Statistical Package for the Social Sciences version 9.0; Chicago, IL)를 이용하여 Kruskal-Wallis test한 후 Turkey 또는 Dunnett test를 이용한 ANOVA와 Pearson 상관계수를 계산하였다. 통계적 유의성의 기준은 p<0.05으로 하였다.

실험이 진행된 4주 뒤 측정한 각 약물투여군과 대조군의 체중에는 통계적으로 유의한 차이는 없었다(도 1B, VH군, 315.5±11.7g; 메트포민 단독투여군, 303.17±8.4g; FK506 단독투여군, 297.11±5.9g; 병용투여군, 292.33±3.6g).

신장 기능 지표 측정에서는 VH군과 메트포민 단독투여군에서는 Scr과 BUN 모두 비슷한 수치를 보여(도 1B, Scr, VH군, 0.35±0.02mg/dL; 메트포민 단독투여군, 0.35±0.03mg/dL; VH군 vs. 메트포민 단독투여군, p>0.05; BUN, VH군, 12.2±0.7 mg/dL; 메트포민 단독투여군, 11.6±0.7mg/dL; VH군 vs. 메트포민 단독투여군, p>0.05), 메트포민 단독투여는 신장 독성을 일으키지 않음을 알 수 있었다. 이에 비해 FK506 단독투여군에서는 대조군인 VH군에 비해 Scr과 BUN 모두 통계적으로 유의한 큰 증가를 보여(Scr, FK506 단독투여군, 0.76±0.04mg/dL; FK506 단독투여군 vs. VH군, p<0.05; BUN, FK506 단독투여군, 63.1±5.3mg/dL; FK506 단독투여군 vs. VH군, p<0.05), FK506 투여가 알려진 대로 신장 독성을 유발하였음을 알 수 있었다.

한편 병용투여군에서는 FK506 단독투여군과 비교하여 Scr과 BUN 모두 통계적으로 유의한 현저한 감소를 보였다(Scr, 병용투여군, 0.56±0.07mg/dL; 병용투여군 vs. FK506 단독투여군, p<0.05; BUN, 병용투여군, 44.4±6.9mg/dL; 병용투여군 vs. FK506 단독투여군, p<0.05). 즉 병용투여군의 신장 기능이 FK506 단독투여군보다 양호한 상태로서, 이상의 결과는 메트포민을 FK506과 병용투여시 FK506에 의해 유발된 신장 독성을 완화하여 신장 기능 저하에 대해 치료 효과가 있음을 보여준다.

나아가 혈중 FK506 농도는 FK506 단독투여군과 병용투여군 간에 크게 다르지 않아(FK506 단독투여군 10.2±1.3ng/mL; 병용투여군 10.7±0.9ng/mL), 병용투여군에서 메트포민이 FK506의 약물동태(pharmacokinetics)를 저해하지 않음을 시사한다.

<1-2> 사이클로스포린으로 유발된 신장 독성에 대한 메트포민의 효과

사이클로스포린으로 유발되는 신장 독성의 동물 모델에서 메트포민의 신장 보호 효과를 알아보았다. 체중 200~220g의 Sprague-Dawley rat을 이용하여 도 2A의 실험 개요에 따라 총 3주간 0.05% 저염식이와 약물을 투여하고 혈액 내 신장 기능 지표를 비교하였다. 음성대조군인 vehicle군(VH), 사이클로스포린 단독투여군(CsA), 메트포민 단독투여군(Met) 그리고 병용투여군(CsA+Met)의 총 네 개의 군으로, 각각 6마리의 rat으로 구성되었다.

CsA을 투여한 실험군, 즉 CsA 단독투여군과 병용투여군은 올리브유(olive oil)에 녹인 CsA을 15mg/체중kg의 용량으로 일일 일회 피하주사하였으며, CsA를 투여하지 않은 실험군, 즉 VH군과 메트포민 단독투여군은 동량의 올리브유를 같은 방법으로 투여하였다. 메트포민을 투여한 실험군, 즉 메트포민 단독투여군과 병용투여군은 증류수(DW)에 녹인 메트포민을 250mg/체중kg의 용량으로 일일 일회 경구투여(oral gavage)하였으며, 메트포민 비투여군, 즉 VH군과 CsA 단독투여군은 동량의 증류수를 같은 방법으로 투여하였다.

약물 투여 3주 뒤, 각 군의 체중을 측정하고, 동물을 희생하여 전혈을 채취하고 원심분리하여 혈청을 수득하였다. 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 혈청에서 신장 기능 지표인 혈청 크레아티닌(Scr)과 혈액요소성질소(BUN)를 측정하고 통계분석하였다. 데이터는 평균값±표준오차로 표시하였고, 통계적 유의성의 기준은 p<0.05으로 하였다.

실험이 진행된 3주 뒤 측정한 각 약물 투여군과 대조군의 체중에는 통계적으로 유의한 차이는 없었다(도 2B, VH, 283.0±9.8g; Met, 288.0±6.1g; CsA, 275.0±4.3g; CsA+Met, 283.0±6.8g).

신장 기능 지표 측정에서는 VH군과 메트포민 단독투여군에서는 Scr과 BUN 모두 비슷한 수치를 보여(도 2B) 메트포민의 단독투여는 신장 독성을 일으키지 않음을 다시 확인하였다. 이에 비해 CsA 단독투여군에서는 대조군인 VH군에 비해 Scr 수치가 크게 증가하였으며(CsA, 0.63±0.03mg/dL; VH, 0.43±0.01mg/dL; CsA vs. VH, p<0.05), BUN 수치도 크게 증가하여(CsA, 35.2±1.8mg/dL; VH, 17.0±0.8mg/dL; CsA vs. VH, p<0.05), CsA의 투여로 인해 신장 기능이 손상된 것을 알 수 있었다.

한편 병용투여군에서는 CsA 단독투여군과 비교하여 Scr 수치가 통계적으로 유의하게 감소하였으며(CsA+Met, 0.49±0.02mg/dL; CsA+Met vs. CsA, p<0.05), BUN 수치도 크게 감소하였다(CsA+Met, 28.7±1.7mg/dL; CsA+Met vs. CsA, p<0.05). 이상의 결과는 병용투여군의 신장 기능이 CsA 단독투여군보다 개선되었으며, 메트포민을 CsA와 병용투여하면 CsA에 의한 신장 독성을 완화하고, 신장 기능 저하에 대한 치료 효과가 있음을 보여주는 것이다.

< 실시예 2>

메트포민의 병용투여가 동종이형반응성 T 세포의 증식에 미치는 영향

<2-1> 메트포민과 FK506

In vitro allo response 조건에서 메트포민과 FK506 동시처리에 의한 면역조절 효과를 조사하기 위해, 림프구 혼합배양방법(mixed lymphocyte reaction, MLR)을 이용하여 메트포민과 FK506이 동종이형반응성 T 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하였다(도 3). 림프구 혼합배양을 위해, 먼저 in vitro에서 96웰 둥근 바닥 플레이트 내에 각 웰당 2×10⁵개의 정상 수여자(Balb/c, responder)의 CD4+ T 세포와 2×10⁵개의 방사선으로 조사시킨 수여자(동종동형) 또는 공여자(C57BL/6, stimulator, 동종이형) 유래 T 세포를 제거한 비장세포를 각각 넣고 혼합배양하였다. 이때 동종이형반응에는 메트포민(200μM)이나 FK506(1nM 또는 100nM)을 실험 조건에 따라 각각 또는 함께 처리한 후 3일 동안 배양하였다. 배양 마지막 날 [³H]-thymidine을 첨가하여 18시간 동안 추가 배양한 뒤 Liquid Scintillation Counter(Beckman, USA)로 [³H]-thymidine uptake 정도를 측정하여 cpm 값으로 표시하였다. 통계분석은 Graph prism(t-test, ANOVA)을 이용하였고, 통계적 의의는 p<0.05로 하였다.

그 결과, 메트포민을 단독으로 처리하였을 때(도 3, Met) 대조군(약물처리하지 않은 Allo)에 비해 T 세포 증식이 억제되었으며, FK506를 단독 처리했을 때(FK-506)에도 농도의존적으로 T 세포의 증식이 크게 감소함을 확인하였다. 한편 FK506과 메트포민을 동시에 처리했을 때에는(FK-506+Metformin), 동일 농도로 메트포민이나 FK506을 단독 처리했을 때보다 더욱 탁월한, 통계적으로 유의한 T 세포 증식 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 즉 림프구 혼합배양 세포실험조건에서 메트포민과 FK506을 병용처리하면, 각각의 T 세포 증식 억제 효과가 극대화될 수 있음을 알 수 있다.

<2-2> 메트포민과 사이클로스포린

In vitro allo response 조건에서 메트포민과 사이클로스포린(CsA)의 동시처리에 의한 면역조절 효과를 조사하기 위하여, 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 림프구 혼합배양방법(MLR)을 이용하여 메트포민과 CsA가 동종이형반응성 T 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하였다(도 4).

실시예 <2-1>에서 관찰한 바와 유사하게, 메트포민을 단독으로 처리하였을 때(도 4, Met, 200μM 또는 1000μM) 대조군(약물처리하지 않은 Allo)에 비해 T 세포 증식이 억제되었으며, CsA를 단독 처리했을 때(CsA, 10nM 또는 100nM)에도 농도의존적으로 T 세포의 증식이 감소함을 확인하였다. 한편 CsA와 메트포민을 동시에 처리했을 때에는(CsA+Metformin, 병용투여한 메트포민의 농도 200μM), 동일한 농도로 메트포민이나 CsA를 단독처리한 경우보다 더욱 뛰어난 T 세포의 증식 억제 효과를 나타냈다. 이는 림프구 혼합배양 세포실험조건에서 메트포민과 CsA를 병용처리하면, 각각의 T 세포 증식 억제 효과가 최대로 발휘될 수 있음을 보여준다.

< 실시예 3>

메트포민의 병용투여가 T 세포의 염증성 사이토카인 분비량에 미치는 영향

<3-1> 메트포민과 FK506

메트포민과 FK506이 동종이형반응성 T 세포의 염증성 사이토카인 분비에 미치는 영향을 알아보기 위하여 <실시예 2>와 동일한 in vitro allo response 조건에서 메트포민(200μM)이나 FK506(1nM 또는 100nM)을 실험 조건에 따라 각각 처리하고 3일 동안 배양한 배양액에서 T 세포로부터 분비된 IFN-γ와 IL-17의 양을 ELISA로 측정하였다(도 5). 통계분석은 Graph prism(t-test, ANOVA)을 이용하였고, 통계적 의의는 p<0.05로 하였다.

그 결과, 메트포민과 FK506 동시처리시 염증성 사이토카인 분비 억제에 대한 상승 효과를 관찰하였다. 메트포민(도 5, Met) 또는 FK506(FK-506)을 단독으로 처리했을 때 각각 대조군에 비해 배양액내 IFN-γ와 IL-17의 농도가 감소하였으나, 메트포민과 FK506을 동시에 처리했을 때(FK-506+Metformin), IFN-γ와 IL-17의 농도가 더욱 현저하게 감소하였다. 즉 림프구 혼합배양 세포실험조건에서 메트포민과 FK506을 병용처리하면, T 세포에서 분비되는 염증성 사이토카인을 더욱 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.

<3-2> 메트포민과 사이클로스포린

메트포민과 사이클로스포린(CsA)이 동종이형반응성 T 세포의 염증성 사이토카인 분비에 미치는 영향을 알아보기 위하여 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 in vitro allo response 조건에서 메트포민(200μM)이나 CsA(10nM 또는 100nM)을 실험 조건에 따라 각각 처리하고 3일 동안 배양한 배양액에서 T 세포로부터 분비된 IFN-γ와 IL-17의 양을 ELISA로 측정하였다(도 6). 통계분석은 Graph prism(t-test, ANOVA)을 이용하였고, 통계적 의의는 p<0.05로 하였다.

FK506과 병용투여한 경우와 유사하게, 메트포민과 CsA를 동시에 처리한 경우에도 염증성 사이토카인 분비를 억제하는 상승 효과를 관찰하였다. 메트포민(도 6, Met) 또는 CsA(CsA)를 단독으로 처리했을 때, 대조군과 비교하여 배양액으로 분비된 IFN-γ와 IL-17의 농도가 감소하였으며, 메트포민과 CsA를 함께 처리한 경우(CsA+Metformin), IFN-γ와 IL-17의 농도가 더욱 현저하게 감소하였다. 즉 림프구 혼합배양 세포실험조건에서 메트포민과 CsA를 병용처리하면, T 세포에서 분비되는 염증성 사이토카인을 더욱 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.

< 실시예 4>

T 세포 활성조건에서의 세포독성 실험

메트포민과 칼시뉴린 억제제가 비특이적인 세포독성을 갖는지 알아보기 위하여, T 세포 활성조건(anti-CD3 조건)에서 MTT 어세이를 실시하였다(도 7). 정상 C57BL/6 마우스로부터 얻은 비장세포를 96well plate에 2×10⁵개의 세포로 anti-CD3 활성조건(1μg/ml)에서 메트포민(200μM)이나 FK506(100nM)을 실험 조건에 따라 각각 처리한 후 3일 동안 배양하였다. MTT 분석은 세포 수확 4시간 전에 3-(4,5 dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide 화합물을 첨가하여 4시간 동안 반응 후 DMSO를 각 웰에 처리하여 540nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 메트포민(도 7, Metformin)이나 FK506(FK506)을 단독으로 처리하거나 동시에 처리한 경우(Met+FK506) 모두 대조군(aCD3)과 큰 차이를 보이지 않았다. 따라서 약물 처리에 따른 세포독성은 없는 것을 확인하였다.

< 실시예 5>

메트포민의 병용투여가 Treg 세포의 활성에 비치는 영향

<5-1> 메트포민과 FK506

T 세포 활성조건(anti-CD3 조건)에서 메트포민과 FK506이 Treg의 활성에 미치는 영향을 알아보았다(도 8). 정상 C57BL/6 마우스로부터 얻은 비장세포를 24 well plate에 1×10⁶개의 세포로 anti-CD3 활성조건(1μg/ml)에서 메트포민(200μM)이나 FK506(100nM)을 실험 조건에 따라 각각 처리한 후 3일 동안 배양하였다. 유세포기를 이용한 분석은 anti-CD4-percp antibody와 anti-CD25-APC antibody를 세포에 처리하고 4℃에서 30분간 반응시킨 다음, 세포를 permeabilization하고, anti-Foxp3-PE antibody로 각각 반응시킨 후, 유세포분석기로 분석하였다. Treg의 활성을 분석하기 위해 CD4+CD25+Foxp3 마커를 발현하는 세포를 gating하여 분석하였다. 결과는 배양된 전체 CD4+ T cell 중 차지하는 Foxp3+CD25+ cell의 비율을 막대그래프로 나타내었다. 통계분석은 Graph prism(t-test, ANOVA)을 이용하였고, 통계적 의의는 p<0.05로 하였다.

그 결과, 메트포민(도 8B, Met)이나 FK506(FK506)을 단독으로 처리하였을 때 대조군((-))에 비하여 각각 Treg의 활성이 증가하였지만, 메트포민과 FK506를 동시에 처리했을 때(Met+FK506) Treg의 활성이 더욱 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 즉 T 세포 활성조건의 세포실험에서 메트포민과 FK506을 병용처리하였을 때, 각 약물의 Treg 활성 향상 효과가 더욱 증진되는 것을 알 수 있다.

<5-2> 메트포민과 사이클로스포린

메트포민과 사이클로스포린(CsA)이 Treg의 활성에 미치는 영향을 알아보았다(도 9). 실시예 <5-1>과 동일한 방법으로 메트포민(1mM) 또는 CsA(100nM)을 처리하여 마우스의 비장 세포를 배양하고, 전체 CD4+ T cell 중 차지하는 Foxp3+CD25+ 세포의 비율을 분석하였다.

대조군(도 9B, (-))과 비교하여, 메트포민(Met)을 단독으로 처리한 경우에는 Treg의 수준이 증가하였으나, CsA를 단독으로 처리하면(CsA) Treg의 수준이 현저하게 감소하였다. 한편 메트포민과 CsA를 동시에 처리했을 때(Met+CsA), Treg의 활성은 CsA 단독처리한 경우는 물론, 메트포민을 단독으로 처리한 경우보다 더욱 현저하게 증가하였다. 메트포민과 CsA를 병용처리하면, CsA로 억제되는 Treg의 활성이 크게 개선되는 효과가 있음을 확인하였다.

< 실시예 6>

메트포민의 병용투여가 비장세포에서 분비되는 염증성 사이토카인과 면역글로불린 수준에 미치는 영향

메트포민과 칼시뉴린 억제제가 염증성 사이토카인의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 메트포민과 FK506이 비장세포에서 분비되는 염증성 사이토카인(도 10)과 면역글로불린(도 11)의 양에 미치는 영향을 비교하였다. 정상 C57BL/6 마우스로부터 얻은 비장세포를 24well plate에 1×10⁶개의 세포로 LPS(100ng/ml)로 자극하고 메트포민(200μM)이나 FK506(100nM)을 실험 조건에 따라 각각 처리한 후 3일 동안 배양시켰다. 배양액에 존재하는 TNF-α와 IL-6의 농도를 측정하여 약물 효과를 비교하였다(도 10). 또한 동일한 세포 배양조건에서 배양액에 존재하는 면역글로불린(immunoglobulin, IgG)의 농도를 측정하여 약물 효과를 비교하였다(도 11). 통계분석은 Graph prism(t-test, ANOVA)을 이용하였고, 통계적 의의는 p<0.05로 하였다.

그 결과, 메트포민(도 10, Metformin) 또는 FK506(FK506)을 단독으로 처리했을 때에는 각각 대조군(LPS)에 비하여 배양액내 TNF-α그리고 IL-6의 농도를 크게 감소시키지 못하였다. 이에 반해 메트포민과 FK506을 동시에 처리했을 때에는(Met+FK506), 메트포민 또는 FK506 단독처리군과 비교하여, TNF-α그리고 IL-6의 농도 모두 통계적으로도 유의미한 현저한 감소 경향을 보였다. 이는 <실시예 3>에서 확인한 메트포민과 FK506 병용처리가 T 세포의 염증성 사이토카인의 분비량에 미치는 효과와 유사한 것으로, LPS로 자극한 비장세포에서도 메트포민과 FK506를 병용처리하면 염증성 사이토카인의 분비 억제 효과가 더욱 상승되는 것을 알 수 있다.

마찬가지로 면역글로불린의 경우에도 메트포민(도 11, Metformin)이나 FK506(FK506)을 단독으로 처리하였을 때는 대조군(LPS)에 비교하여 배양액에 존재하는 면역글로불린의 농도가 크게 변하지 않았으나, 메트포민과 FK506를 동시에 처리했을 때(Met+FK506) 메트포민 또는 FK506 단독처리군과 비교하여 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.

< 실시예 7>

메트포민의 병용투여가 간이식 환자의 Th17 과 Treg 세포군에 미치는 영향

<7-1> 메트포민과 FK506

장기이식을 받은 환자에서 메트포민과 FK506의 병용투여가 T 세포군에 미치는 영향을 조사하였다(도 12). 간이식 후 면역억제제로 FK506(투여량 2mg/day/60체중kg 환자기준)을 복용해 온 6명의 환자에게 메트포민(투여량 1000mg/day/60체중kg 환자기준)을 3개월간 추가로 복용하게 하고, 메트포민 복용 전, 후로 환자의 혈액을 채취하여 Treg과 Th17 세포군의 비율을 측정하였다. 간 이식 환자들은 이식 후 5 내지 10년의 기간이 경과하고, 당뇨가 발생한 상태였다.

구체적으로 각 환자의 혈액에서 말초단핵세포를 분리하고, anti-CD4-percp, anti-CD8-APC, anti-CD25-APC, anti-CCR7 Percp를 각각의 조건의 세포에 처리하고 4℃에서 30분간 반응시켰다. 이어 세포를 permeabilization하고 anti-Foxp3-FITC, anti-IL-17-PE의 형광 항체로 각각 반응시킨 후, 유세포분석기와 FlowJo 프로그램을 이용하여 각각의 세포들을 분석하였다. 유세포분석을 통한 세포 분류 기준으로는 CD4 Th17 세포는 CD4와 IL-17 모두 발현 하는 세포, CD8 Th17 세포는 CD8, CCR7, IL-17를 모두 발현하는 세포, CD4 Treg은 CD4와 Foxp3를 발현하고 CD25의 발현수준이 높은 세포, CD8 Treg은 CD8, Foxp3를 발현하고 CD25 발현 수준이 높은 세포로 하였다. 데이터는 메트포민 복용 전의 Th17 또는 Treg 세포 발현양을 100%로 하여 복용 후의 각각 세포의 감소율과 증가율을 백분율로 환산하여 나타내었고, 통계적 유의성은 Prism 소프트웨어를 이용하여 T-test로 판단하였다(도 12에서 * p<0.05, ** p<0.01).

그 결과, 메트포민의 복용 전, 즉 FK506 단독투여(도 12, FK506-2mg/-)와 비교하여 FK506과 메트포민을 3개월간 병용투여(FK506-2mg/Metformin-1000mg)한 후에는 CD4 Th17과 CD8 Th17 세포군은 큰 감소를 보였으며, 반대로 CD4 Treg과 CD8 Treg 세포군은 현저하게 증가하였음을 알 수 있었다. 따라서 FK506과 메트포민의 병용투여는 세포 실험에서 관찰된 바와 일관되게, 간이식 환자에서도 면역거부반응을 일으키는 Th17는 효과적으로 억제하고, 면역 관용 역학을 담당하는 Treg은 증가시키는 효과가 있음을 알 수 있다.

<7-2> 메트포민과 사이클로스포린

장기이식을 받은 환자에서 메트포민과 사이클로스포린(Cys)의 병용투여가 T 세포군에 미치는 영향을 조사하였다(도 13). 간이식 후 면역억제제로 사이클로스포린(Cys, 150mg/day/60체중kg 환자기준)을 복용해 온 3명의 환자에게 메트포민(1000 mg/day/60체중kg 환자기준)을 3개월간 추가로 복용하게 하고, 메트포민 복용 전, 후로 환자의 혈액을 채취하여 Treg과 Th17 세포군의 비율을 측정하였다. 간이식 환자들은 이식 후 5 내지 10년의 기간이 경과하고, 당뇨가 발생한 상태였다. 실험방법과 데이터 분석 방법은 실시예 <7-1>과 동일하였다.

그 결과, 메트포민의 복용 전, 즉 사이클로스포린 단독투여(도 13, Cys-150mg/-)와 비교하여 사이클로스포린과 메트포민을 병용투여 (Cys-150mg/Metformin-1000mg)한 후에는 Th17 세포군은 감소하였으며, 반대로 Treg 세포군은 크게 증가하였음을 알 수 있었다. 따라서 사이클로스포린과 메트포민의 병용투여는 실시예 <7-1>에서 FK506과 메트포민의 병용투여에서 관찰된 바와 같이 간이식 환자에서 면역거부반응을 일으키는 Th17는 억제하고, 면역 관용 역학을 담당하는 Treg은 증가시키는데 더욱 효과적임을 알 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이 본 발명의 조성물은 기존 면역억제제의 부작용으로 생기는 신장 기능 저하를 효과적으로 완화하여 면역억제가 필요한 질병의 치료 효과를 높이는데 유용하게 이용될 수 있다. 또한 본 발명의 또 다른 약학적 조성물 또는 복합 제제는 기존의 면역억제제와 메트포민을 병용투여하는 다양한 방법을 제시하여 기존 면역억제제의 신장 독성 부작용은 줄이고, 면역억제 또는 면역조절 효과는 극대화함으로써, 장기이식 거부 반응, 자가면역질환, 염증성 질환 등을 예방하거나 치료하는데 효과적이어서 산업상 이용가능성이 높다.

Claims

메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제제로 유발된 신장 독성 감소용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 면역억제제는 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)인 것을 특징으로 하는 면역억제제로 유발된 신장 독성 감소용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)는 사이클로스포린(cyclosporine) 또는 타크로리무스(tacrolimus)인 것을 특징으로 하는 면역억제제로 유발된 신장 독성 감소용 조성물.
칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)와 메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)는 사이클로스포린(cyclosporine) 또는 타크로리무스(tacrolimus)인 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)와 메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 중량비가 1:1 내지 1:3,500인 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제6항에 있어서, 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)와 메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 중량비가 1:5 내지 1:500인 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 면역질환은 급성 또는 만성 장기이식 거부 반응, 자가면역질환 및 염증성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
(a) 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)와 메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 1:1 내지 1:3,500의 중량비로 포함하며,
(b) 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)와 메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 동시에 또는 개별적으로 또는 정해진 순서로 투여하는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합 제제.
제9항에 있어서, 상기 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)는 사이클로스포린(cyclosporine) 또는 타크로리무스(tacrolimus)인 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합 제제.
제10항에 있어서, 사이클로스포린(cyclosporine)의 일일 투여량이 1 내지 5mg/day/체중kg인 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합 제제.
제10항에 있어서, 타크로리무스(tacrolimus)의 일일 투여량이 0.01 내지 0.1mg/day/체중kg인 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합 제제.
제10항에 있어서, 메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 투여량이 5 내지 35mg/day/체중kg인 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합 제제.
제9항에 있어서, 상기 면역질환은 급성 또는 만성 장기이식 거부 반응, 자가면역질환, 및 염증성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합 제제.