KR101832892B1

KR101832892B1 - 면역억제제로 유발되는 미토콘드리아 질환 및 면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 메트포민을 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR101832892B1
Application number: KR1020160106750A
Authority: KR
Inventors: 조미라; 양철우; 박성환; 이선영; 박민정; 전주연; 임선우; 정병하; 김은경; 김재경; 나현식; 김세영; 이은정; 서현범
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2015-08-24
Filing date: 2016-08-23
Publication date: 2018-02-27
Also published as: KR20170023724A; WO2017034315A1; KR20170106283A; US20180256519A1

Abstract

본 발명은 면역억제제로 유발되는 미토콘드리아 질환 및 면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 메트포민을 포함하는 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는 면역억제제로 유발되는 미토콘드리아 질환 치료를 위한 메트포민을 포함하는 조성물, 메트포민과 라파마이신 표적 억제제(mTOR inhibitor)인 면역억제제를 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 메트포민과 포유류 라파마이신 표적 억제제를 구성요소로 포함하며 이들을 동시에 또는 개별적으로 또는 정해진 순서로 투여하는 것을 특징으로 하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합 제제에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 기존 면역억제제의 부작용으로 생기는 미토콘드리아의 기능 손상을 효과적으로 완화하고 면역억제 치료 효과는 더욱 향상되어, 면역억제가 필요한 이식거부반응, 자가면역 질환, 염증성 질환 등을 예방하거나 치료하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

면역억제제로 유발되는 미토콘드리아 질환 및 면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 메트포민을 포함하는 조성물{Metformin-comprising compositions for preventing or treating mitochondrial diseases caused by immunosuppressive drugs and immune diseases}

본 출원은 2015년 8월 24일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2015-0118934호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.

본 발명은 면역억제제로 유발되는 미토콘드리아 질환 및 면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 메트포민을 포함하는 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는 면역억제제로 유발되는 미토콘드리아 질환의 예방 또는 치료를 위한 메트포민을 포함하는 조성물, 메트포민과 라파마이신 표적 억제제(mTOR inhibitor)인 면역억제제를 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 메트포민과 라파마이신 표적 억제제를 구성요소로 포함하며 이들을 동시에 또는 개별적으로 또는 정해진 순서로 투여하는 것을 특징으로 하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합 제제에 관한 것이다.

면역억제제는 항원에 대하여 항체를 만드는 체액성 면역 반응이나 세포성 면역 반응을 차단하거나 저하시키는 약물로, 주로 장기 이식 후 발생하는 면역 거부반응이나 골수이식 후의 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)을 치료하는데 사용되어 왔다. 뿐만 아니라, 면역억제제는 낭창(lupus), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)과 같은 자가면역 질환과 알러지, 아토피와 같은 과면역 반응, 염증성 질환의 증상을 장기간에 걸쳐 치료하는 데에도 중요하게 쓰인다.

현재 사용되고 있는 면역억제제는 작용기작에 따라 코티코스테로이드(corticosteroid), 대사길항물질(antimetabolite), 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor), 포유류 라파마이신 표적 억제제(mammalian target of rapamycin inhibitor), 항체(antibody) 등으로 나뉘는데, 이들은 각기 다른 단계에서 면역계의 T 세포의 증식 또는 활성화를 차단함으로써 면역억제 효과를 낸다(Dalal, P. et al. Int. J. Nephrol. Renovasc. Dis. 3:107-115 (2010)). 면역억제제의 주요 표적인 T 세포는 인체의 흉선에서 생성되어 주로 세포 매개성 면역에 관여하는 1형 보조 세포(Th1) 또는 체액성 면역에 관여하는 2형 보조 세포(Th2)로 분화한다. 두 T 세포군은 서로 과활성되지 않도록 견제하고 있다가 균형이 깨지면 자가면역이나 과민반응 같은 이상 반응이 일어나는 것으로 알려져 있다.

이외에도 면역 반응을 조절할 수 있는 면역조절 T 세포(Treg)나 Th17과 같은 새로운 종류의 T 세포들이 알려졌다. Treg은 Th1 세포 활성을 조절할 수 있으며, 비정상적으로 활성화된 면역 세포의 기능을 억제하고 염증 반응을 조절한다. 이와 반대로 Th17 세포는 IL-17을 분비하며, 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시킨다. 최근 Treg이나 Th17이 면역 질환 치료제의 새로운 표적으로 크게 부각되어 다양한 면역조절 치료제 연구가 이루어지고 있다(Wood, K. J. et al. Nat. Rev. Immunol. 12(6):417-430 (2012), Miossec, P. et al. Nat. Rev. Drug Discov. 11(10):763-776 (2012), Noack, M. et al. Autoimmun. Rev. 13(6):668-677 (2014)).

T 세포를 비특이적으로 억제하는 기존의 면역억제제는 일반적으로 세포독성, 면역저하로 인한 감염, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용을 동반하기 때문에 치료 효과가 장기간 지속되기 어렵다는 단점이 있다. 면역억제제의 심각한 부작용을 줄이고 면역억제 치료 효과를 높이기 위해 특히 장기 이식 분야에서 서로 다른 작용기작의 면역억제제를 병용투여하거나, 일정 기간 한 종류의 약물을 투여 후 다른 약물로 대체하는 방법들이 시도되고 있으나, 최적화된 면역억제제의 병용투여의 조합이나 치료법은 아직 미비한 상태이다.

따라서 기존 면역억제제의 부작용은 줄이고 치료 효과는 향상시킬 수 있는 새로운 면역억제 또는 면역조절 치료법과 더욱 안전하고 부작용이 적은 새로운 면역억제제 후보 물질의 개발이 시급한 실정이다.

이에 본 발명자들은 부작용이 적고 지속적인 치료 효과를 낼 수 있는 새로운 면역조절제에 대한 연구를 수행하던 중, 메트포민과 라파마이신 표적(mTOR) 억제제 계열의 면역억제제를 병용처리하면 염증성 사이토카인의 분비 억제와 Treg 세포 활성화 등과 같은 면역 조절 또는 억제에 대한 상승효과가 발생함을 확인하였고, 특히 메트포민이 기존 면역억제제의 부작용으로 손상된 미토콘드리아의 기능을 개선시키는 효과가 있음을 처음으로 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은

메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제제로 유발되는 미토콘드리아 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은

mTOR 억제제와 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은

(a) mTOR 억제제와 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 1:500 내지 1:200,000의 중량비로 포함하며,

(b) mTOR 억제제와 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 동시에 또는 개별적으로 또는 정해진 순서로 투여하는 것을 특징으로 하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합 제제를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은

메트포민(metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제제로 유발되는 미토콘드리아 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여

mTOR 억제제와 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여

(b) mTOR 억제제와 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 동시에 또는 개별적으로 또는 정해진 순서로 투여하는 것을 특징으로 하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합 제제를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 메트포민 ( metformin ) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제제로 유발되는 미토콘드리아 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

'메트포민(metformin)'은 하기 화학식(화학식 C₄H₁₁N₅)의 구조를 갖는 분자량 129.16Da의 바이구아나이드(biguanide) 계열의 화합물이다. 메트포민은 오랫동안 특히 제2형 당뇨병을 치료하는데 쓰이는 항당뇨제로 사용되어 왔다. 시중에서 Glucophage라는 트레이드마크로 유통되며, 다양한 제네릭 의약품도 판매되고 있다.

<메트포민 구조>

'면역억제제'는 면역 체계의 활성을 억제하는 약물이다. 본 발명에서의 면역억제제는 바람직하게는 라파마이신 표적(mammalian target of rapamycin, mTOR) 억제제일 수 있으며, 가장 바람직하게는 라파마이신(rapamycin) 또는 이의 유도체일 수 있다.

'라파마이신 표적 억제제(mTOR inhibitor)'는 라파마이신 표적의 활성을 저해하거나 억제하는 제제를 의미한다. 라파마이신 표적(mammalian target of rapamycin 또는 mechanistic target of rapamycin, mTOR) 은 phosphoinositide 3-kinase(PI3K)-related kinase family에 속하는 분자량 289kDa의 세린/쓰레오닌 인산화효소(serine/thereonin kinase)로, 세포의 대사, 성장, 증식과 생존의 중요 조절 인자이다. mTOR는 FRAP, FRAP1, FRAP2, RAFT1, RAPT1 등으로도 알려져 있다. mTOR는 다른 단백질과 결합하여 mTOR Complex 1(mTORC1) 또는 mTOR Complex 2(mTORC2) 복합체를 형성하여 기능한다. mTOR는 종양 형성, 혈관신생(angiogenesis), 인슐린 내성(insulin resistance), 지방형성(adipogenesis), 면역계 T 세포 활성화(T-lymphocyte activation) 등에 관련되어 있고, 특히 종양성 질환을 비롯한 다양한 질환에서 비정상적으로 조절되어 있기 때문에 mTOR 저해제는 이들 질환의 치료제로 사용되고 있다.

'라파마이신(rapamycin)'은 시롤리무스(sirolimus)라고도 불리우며, 하기의 화학식(C₅₁H₇₉NO₁₃)의 구조를 갖는 분자량이 914.2Da인 마크로라이드 락톤(macrolide lactone) 화합물이다. 라파마이신은 세포질 내 FK-binding protein 12(FKBP12)와 결합하여 복합체를 형성하고, mTOR 활성을 억제한다. 면역계에서 라파마이신은 IL-2와 다른 사이토카인 수용체 관련 신호전달을 저해하고 면역계의 T 세포와 B 세포의 증식과 활성화를 막는다. 이 같은 면역 억제효과로 인해 라파마이신은 장기 이식 또는 자가면역 질환을 위한 면역억제제로 널리 사용되고 있으며, 특히 사이클로스포린(cyclosporin)이나 타크로리무스(tacrolimus)와 같은 칼시뉴린 (calcineurin)을 억제하는 면역억제제에 비해 신장 독성이 낮다는 장점이 있어서 신장 이식 분야에 활용되고 있다. 그럼에도 라파마이신은 동물 모델에서 위장점막 궤양, 체중 감소, 설사 및 혈소판 감소증과 같은 독성을 나타내며, 위장장애, 고지혈증, 폐 독성(lung toxicity), 면역억제로 인한 암 유발 가능성 등의 부작용이 있어 보다 광범위한 사용이 제한되고 있다. 면역억제제로서의 라파마이신은 대표적으로 Pfizer사의 라파뮨(Rapamune) 등으로 시판되고 있는데, 최근 장기이식거부 반응 억제에 대한 라파마이신의 특허가 만료됨에 따라 라파마이신의 면역억제 효능은 향상시키고 부작용은 보완할 수 있는 투여 방법과 다른 약물과의 병용투여 등의 개발 전략들이 시도되고 있다.

라파마이신의 유사체인 라파로그(rapalog)로는 템시롤리무스, 에버롤리무스, 데포롤리무스 등이 있다. 템시롤리무스(temsirolimus)는 Torisel 또는 CCI-779로도 알려져 있는 mTOR 특이적 억제제이다(화학식C₅₆H₈₇NO₁₆, 분자량 1030.3Da). 에버롤리무스(everolimus)는 라파마이신의 40-O-(2-hydroxyethyl) 유도체로, RAD001 또는 Zortress, Certican, Afinitor 등의 트레이드마크로 알려져 있으며, 라파마이신과 유사하게 작용한다(화학식 C₅₃H₈₃NO₁₄, 분자량 958.2Da). 현재 장기 이식의 면역억제제로 사용되고 있다. 데포롤리무스(deforolimus)는 리다포롤리무스(ridaforolimus) 또는 AP23573, MK-8669 등으로도 알려져 있는 mTOR 억제제이다(화학식 C₅₃H₈₄NO₁₄P, 분자량 990.22Da).

<라파마이신 구조>

본 명세서에서‘치료’는 질환의 발생 또는 재발 억제, 증상의 완화, 질병의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선, 호전, 완화 또는 개선된 예후를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 ‘예방’은 질환의 발병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

'미토콘드리아 질환(mitochondrial disease)'은 미토콘드리아의 기능 이상에 기인한 질환으로, 미토콘드리아 막전위 이상으로 인산 팽윤, 활성산소종 또는 자유 라디칼 등에 의한 산화적 스트레스로 인한 기능 이상, 미토콘드리아 DNA나 세포핵의 미토콘드리아 기능 관련 유전자 변이와 같은 유전적 요인으로 인한 기능 이상, 미토콘드리아의 에너지 생성을 위한 산화적 인산화(oxidative phosphorylation) 기능의 결함 등으로 인한 질환 등을 포함한다. 미토콘드리아(mitochondria)는 세포 에너지인 ATP를 생성하는 필수 세포 소기관으로, 미토콘드리아의 기능 이상은 미토콘드리아가 없는 적혈구 이외 미토콘드리아를 포함하는 모든 세포 기능을 저해하며, 특히 근육이나 뇌와 같이 에너지 수요가 높은 기관에 영향을 미치게 된다.

미토콘드리아의 기능 이상이 직접적인 원인으로 발생하는 질환으로는 레버씨선천성시신경병증(Leber's hereditary optic neuropathy), 레이 증후군(Leigh syndrome), 신경병증(neuropathy), 보행실조(ataxia), 망막색소변성(neuropathy, ataxia, retinitis pigmentosa, and ptosis, NARP), 뇌척수염(encephalomyelitis), 간대근육경련성간질(myoclonic epilepsy and ragged red fibers, MERRF), 멜라스(mitochondrial myopathy, encephalomyopathy, lactic acidosis, stroke-like symptoms, MELAS), 사립체 근육병증(mitochondrial myopathy), 라이 증후군(Reye syndrome), 알퍼 질환(Alper's disease), 프리드리히 보행실조(Friedrich`s Ataxia) 등이 있다. 최근 들어, 기존에 알려져 있던 다양한 다른 질병, 예를 들어 허혈성 뇌질환, 허혈성 심장질환과 같은 허혈성 질환, 다발성경화증(multiple sclerosis), 말초신경변증(polyneuropathies), 편두통(Migraine), 정신병, 우울증(depression), 발작(seizure), 치매(dementia), 중풍(palsy), 시신경위축(optic atrophy), 시신경병증(optic neuropathy), 녹내장(glaucoma), 망막색소변성(retinitis pigmentosa; RP), 백내장(cataract), 고알도스테론혈증(hyperaldosteronism), 부갑상선 기능저하증(hypoparathyroidism), 근육병증(myopathy), 근육위축(myatrophy), 미오글로빈뇨(myoglobinuria), 근육긴장저해, 근육통, 운동내성저하, 세뇨관증, 신장기능부전(renal insufficiency), 간부전(hepaticinsufficiency), 간기능부전(hepatic dysfunction), 간비대(hypertrophy), 철적혈구 빈혈(anaemia), 호중성백혈구 감소증(neutropenia), 저혈소판증(thrombocytopenia), 설사(diarrhea), 융모위축(villous atrophy), 다발성구토, 연하곤란(dysphagia), 변비(constipation), 감각신경난청(sensorineural deafness), 정신지체, 간질(epilepsy), 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 파킨슨 질환(Parkinson's disease), 헌팅턴 질환(Huntington's disease) 등의 유발과 진행에도 미토콘드리아의 기능이 중요한 것으로 알려지고 있다.

특히 세포 에너지 대사에 필수적인 미토콘드리아의 기능 이상은 당뇨병, 비만, 대사증후군(metabolic syndrom) 등과 같은 각종 에너지와 대사성 질환에도 중요한 것으로 밝혀지고 있다. 인간의 미토콘드리아 DNA의 3243 위치의 점돌연변이를 직접적인 원인으로 당뇨병과 청각손실(diabetes mellitus and deafness, DAD)이 발생하며, 체내 산화 스트레스 등으로 인한 미토콘드리아 크기 감소, 미토콘드리아 호흡 활성과 전자전달계 활성의 감소 등의 미토콘드리아의 활성 저하가 당뇨병의 발병과 높은 상관관계가 있음이 보고되고 있다.

본 발명에서 '면역억제제로 유발되는 미토콘드리아 질환'은 면역억제제의 부작용으로 유발되는 미토콘드리아의 활성 저하에 기인한 것으로서, 예를 들어 미토콘드리아의 호흡 장애, 미토콘드리아 막전위 유지 기능의 장애, 미토콘드리아의 양적인 감소, 미토콘드리아 기능 관련 유전자 발현 이상 등을 포함한다. 바람직하게는 미토콘드리아 호흡 억제, 미토콘드리아 막전위 감소 및 미토콘드리아 활성 감소 중에서 선택된 하나 이상의 미토콘드리아의 기능 장애로 유발되는 것일 수 있다. 앞서 서술한 바와 같이, 면역억제제로 유발되는 미토콘드리아의 기능 이상은 특히 당뇨병과 같은 대사성 질환으로 나타날 수 있다.

본 발명자들은 세포 실험을 통해 라파마이신이 미토콘드리아의 기능 장애를 유발하며, 라파마이신과 메트포민을 병용처리하면 라파마이신으로 인한 미토콘드리아 기능 장애가 개선되는 것을 처음으로 관찰하였다. 또한 라파마이신을 장기 투여한 동물에서는 당뇨병 유사 증상이 나타나며, 라파마이신과 메트포민을 병용투여함으로써 당뇨병 증상을 개선시킬 수 있다는 것도 확인하였다. 이에 따라 본 발명에 따른 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 조성물은 라파마이신 등 mTOR 억제제로 유발되는 미토콘드리아 기능 장애를 개선하는데 이용할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명자들이 밝힌 메트포민과 라파마이신의 병용투여의 미토콘드리아 기능 개선의 효과는 다음과 같다.

본 발명의 일실시예에서 라파마이신은 활막세포에서 미토콘드리아 산소소모량(oxygen consumption rate)으로 측정되는 미토콘드리아의 호흡을 감소시키며, 특히 언커플링 제제(uncoupling 제제)인 FCCP 처리로 인한 호흡량의 증가폭을 현저하게 감소시키는 것으로 나타났다. 라파마이신을 메트포민과 함께 처리한 경우에는 라파마이신을 단독으로 처리했을 때보다 기저(baseline) 미토콘드리아 호흡량이 증가하였으며, ATP synthase 억제제인 올리고마이신(oligomycin)을 처리했을 때 또는 FCCP를 처리했을 때에도 메트포민의 병용투여로 미토콘드리아 호흡량이 증가하는 것으로 나타났다. 즉, 메트포민은 라파마이신으로 인한 미토콘드리아 호흡 장애를 개선시키는 것을 알 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 라파마이신(1nM)을 단독으로 처리한 활막세포에서는 미토트랙커(mitotracker)로 염색되는 미토콘드리아의 양을 크게 감소하였으나, 라파마이신과 메트포민(200nM 또는 1mM)을 함께 처리한 경우에는 미토콘드리아의 양이 약물 처리하지 않은 대조군 수준으로 유지되는 것으로 나타났다. 즉, 메트포민은 라파마이신으로 인한 미토콘드리아의 양적인 감소를 회복시키는 것을 알 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 라파마이신(1nM)을 단독으로 처리한 활막세포에서는 JC-1 염색으로 관찰되는 미토콘드리아 막전위가 정상적으로 유지되지 않은 반면, 라파마이신과 메트포민(200nM 또는 1mM)을 함께 처리한 경우에는 막전위가 정상 수준으로 유지되는 것을 확인하였다. 즉, 메트포민은 라파마이신으로 인한 미토콘드리아 막전위 이상을 방지하는 것을 알 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 NIH3T3 세포에서 미토콘드리아의 필수적인 기능에 연관된 NADH dehydrogenase(ubiquinone) 1 beta subcomplex, 5, 16kDa(Ndufb5), ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein(Uqcrb), cytochrome c(Cycs)의 발현 수준을 RT-PCR로 측정한 결과, 라파마이신(1nM)을 단독처리했을 때보다 라파마이신과 메트포민(200μM 또는 1mM)을 같이 처리한 경우 이들 유전자의 발현량이 현저하게 증가하는 것으로 나타났다. 메트포민은 미토콘드리아 관련 유전자 발현을 촉진하며, 이는 메트포민이 미토콘드리아 기능 관련 유전자 발현을 증가시킴으로써 다른 미토콘드리아 기능 장애를 개선시킬 가능성이 있음을 시사한다.

본 발명의 다른 실시예서는 랫(rat)에 6주 동안 라파마이신(0.3mg/kg)을 피하 주사로 투여한 결과, 대조군에 비하여 체중이 감소하고 소변량은 증가하였으며, 특히 당부하 검사(glucose tolerance test)와 인슐린 저항성 검사(또는 인슐린 내성 검사; insulin tolerance test) 등에서 당뇨병 증상을 나타냈다. 한편 라파마이신 투여 3.5주 후부터 라파마이신과 메트포민을 병용투여한 랫에서는 라파마이신을 단독으로 투여한 군에 비하여 당뇨병 증상이 개선되는 것을 확인하였다.

이상의 본 발명의 실시예들은 라파마이신을 면역억제제로 사용할 경우, 염증과 같은 면역 반응은 억제될 수 있지만, 미토콘드리아의 기능을 손상시키는 부작용을 동반함을 보여준다. 라파마이신에 의한 미토콘드리아 기능 장애는 라파마이신을 메트포민과 동시에 투여하거나, 라파마이신을 투여하는 기간 동안 라파마이신과 별도로 투여하거나, 또는 라파마이신의 투여의 시작 전 또는 투여 기간이 끝난 뒤에 메트포민을 투여함으로써 예방 또는 개선될 수 있음을 알 수 있다.

또한 본 발명은 mTOR 억제제와 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 mTOR 억제제는 바람직하게는 라파마이신 또는 이의 유도체일 수 있다. mTOR 억제제, 라파마이신, 라파마이신의 유도체에 대하서는 앞서 설명한 바와 같다.

최근 본 발명자들은 메트포민이 병인성 Th17 세포는 억제하고, 염증을 조절하는 Treg 세포의 분화를 유도하여 Treg/Th17 면역 세포의 균형을 조절하는 효과가 있음을 처음 발견하여 보고한 바 있다(Song, J. H. et al. Mediators Inflamm. 2014, Article ID 973986 (2014)). 이에 본 발명자들은 면역세포를 이용한 실험을 통해 메트포민과 라파마이신을 병용투여함으로써 라파마이신의 면역 억제 효과를 더욱 상승시킬 수 있음을 확인하였다. 앞선 실시예에서 본 발명자들이 확인한 바와 같이 메트포민은 라파마이신의 미토콘드리아 기능 장애를 개선하는 효과가 있기 때문에, 메트포민과 라파마이신의 병용투여는 라파마이신의 부작용은 감소시키면서 라파마이신의 면역 억제 작용은 상승시킴으로써 면역 억제 치료의 효율을 더욱 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.

본 발명자들이 확인한 라파마이신과 메트포민의 병용투여에 의한 면역 억제 또는 조절의 상승효과는 다음과 같다.

본 발명의 일실시예에서는 in vitro allo response 조건의 림프구 혼합배양 실험에서 라파마이신(1nM 또는 100nM)과 메트포민(1mM)을 동시에 처리한 경우, 라파마이신이나 메트포민을 각각 처리한 경우에 비하여 장기 이식 거부 반응에 중요한 동종이형 반응성 T 세포의 증식이 더욱 효과적으로 감소하였으며, 동종이형 반응성 T 세포에서 분비되는 염증성 사이토카인인 IFNγ의 분비도 더욱 억제되는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 T 세포 활성 조건에서 라파마이신(100nM)과 메트포민(1mM)을 함께 처리한 경우, 라파마이신이나 메트포민을 각각 처리한 경우에 비하여 염증 조절 기능을 하는 Treg 세포의 활성은 현저하게 증가하며, 병인세포에서 분비되는 염증성 사이토카인인 IL-17의 분비는 크게 감소하는 것을 확인하였다. 한편 T 세포 활성 조건에서 라파마이신과 메트포민을 동시에 처리하더라도 비특이적인 세포 독성을 유발하지 않는 것으로 나타났다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 염증유발인자인 LPS로 자극한 비장세포에서 분비하는 사이토카인과 면역글로불린(IgG)의 양을 측정하였다. 라파마이신(100nM)과 메트포민(1mM)을 동시에 처리한 경우에는 라파마이신이나 메트포민을 각각 처리한 경우에 비하여 IL-6, TNF-α그리고 IgG의 수준은 더욱 효과적으로 감소하였다.

나아가 본 발명자들은 대표적인 자가면역질환인 관절염의 동물 모델에서 메트포민과 라파마이신의 병용투여에 의하여 치료 효과가 상승하는 것을 확인하였다. 콜라겐으로 유발한 관절염의 마우스 모델에서, 라파마이신을 단독으로 투여한 실험군과 비교하여 라파마이신과 메트포민을 병용투여한 실험군에서는 관절염의 유발율도 크게 감소하였으며, 관절염 중증도를 나타내는 관절염 지수도 감소하는 것을 확인하였다. 라파마이신과 메트포민을 병용투여함으로써 관절염 치료 효과를 배가할 수 있을 뿐만 아니라, 혈당과 혈청 내 지질 함량, 그리고 간 손상의 지표인 AST와 ALT 수준을 낮추는 등, 관절염으로 인해 야기되는 당 대사 이상 및 비만, 지방 간 등의 부대 증상도 동시에 더욱 효과적으로 대응할 수 있음을 확인하였다.

이상의 실시예에서는 메트포민과 라파마이신을 동시 또는 병용투여하면 각각을 단독으로 투여한 경우보다 다양한 면역 반응을 보다 효과적으로 조절할 수 있음을 보여준다. 또한 메트포민은 라파마이신으로 유발되는 미토콘드리아의 기능 장애를 예방 및/또는 회복하는 효과가 있기 때문에 메트포민과 라파마이신의 병용투여는 면역 억제나 조절의 치료가 필요한 면역 질환에 효과적으로 이용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명에서 '면역 질환'은 면역 체계의 기능 이상으로 유발되는 질환으로서, 바람직하게는 급성 또는 만성 장기 이식 거부 반응, 자가면역 질환 및 염증성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 면역 질환일 수 있다.

상기 급성 또는 만성 장기 이식 거부 반응은 이에 한정되는 것은 아니나, 예를 들어, 심장, 폐, 심장 및 폐 복합, 간, 신장, 췌장, 피부, 장(bowel) 또는 각막 이식 후 급성 또는 만성 이식 거부 반응, 그리고 골수 이식후 이식대숙주병(graft-versus-host disease)일 수 있으며, 특히 T 세포가 매개하는 이식후 거부 반응일 수 있다.

또한 상기 자가면역 질환 또는 염증성 질환은 하기 예에 한정되지는 않으나 예를 들어, 패혈증, 동맥경화, 균혈증, 전신염증반응증후군, 다장기기능부전, 골다공증, 치주염, 전신성 홍반성 루푸스, 골관절염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 유년형 만성 관절염, 척추관절증, 다발성 경화증, 전신성 경화증, 특발성 염증성 근장애, 쇼그렌 증후군(Sjoegren's syndrome), 전신성 맥관염, 유육종증(sarcoidosis), 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판감소증, 갑상선염, 진성당뇨병, 면역 매개성 신장 질환, 중추신경계 또는 말초신경계의 탈수초 질환, 특발성 탈수초 다발성 신경염, 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome), 만성 염증성 탈수초 다발성 신경염, 간담즙성 질환, 감염성 또는 자가면역성 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염, 경화성 담관염, 비만, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 글루텐(gluten) 민감성 장질환, 휘플병(Whipple's disease), 자가면역성 또는 면역 매개성 피부 질환, 수포성 피부질환 다형홍반, 접촉성 피부염, 건선, 알레르기성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증, 여드름, 두드러기, 폐의 면역 질환, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증, 과민성 폐렴으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명에서 메트포민과 라파마이신 또는 그 유도체들은 그 자체 또는 염, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에서 '약학적으로 허용가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

또한 본 발명에서 메트포민과 라파마이신 또는 그 유도체들은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 mTOR 억제제 및/또는 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 만을 포함하거나 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 유효한 양이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며, 바람직하게는 급성 또는 만성 장기 이식 거부 반응, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 치료 또는 예방하는데 있어서 mTOR 억제제와 메트포민을 병용투여로 면역 조절 또는 억제의 상승 효과를 낼 수 있고, 메트포민이 mTOR 억제제로 유발되는 미토콘드리아 기능 장애를 완화하는데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 mTOR 억제제의 약학적으로 유효한 양으로는 mTOR 억제제가 라파마이신인 경우, 0.75 내지 16mg/day/체중kg, 메트포민의 경우 5 내지 35mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 mTOR 억제제와 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 1:500 내지 1:200,000의 중량비로 포함할 수 있다.

'약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 본 발명의 약학적 조성물은 미토콘드리아의 기능 장애를 개선하거나 면역 조절 또는 억제의 효과를 내기 위해 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.

투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 경피 투여는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.

흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 미토콘드리아의 기능 장애를 개선하거나, 급성 또는 만성 장기 이식 거부 반응, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있는 공지의 화합물과 병용하여 투여할 수 있다.

또한 본 발명은

(a) mTOR 억제제와 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 1:500 내지 1:200,000의 중량비로 포함하며,

(b) mTOR 억제제와 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 동시에 또는 개별적으로 또는 정해진 순서로 투여하는 것을 특징으로 하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합 제제를 제공한다.

상기 mTOR 억제제는 바람직하게는 라파마이신 또는 이의 유도체일 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 복합 제제는 투여 방법과 투여 경로에 따라 구성요소인 mTOR 억제제와 메트포민이 하나의 제형에 동시에 포함되도록 제형화될 수도 있고, mTOR 억제제와 메트포민이 개별적으로 제형화되어 일일 또는 일회 등의 투여 단위에 따라 하나의 포장에 포함될 수 있다. 개별적으로 제형화된 mTOR 억제제와 메트포민의 제형은 동일할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 약학적 복합 제제의 구체적인 제형화 방법과 제형에 포함될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 본 발명의 약학적 조성물에서 설명한 바와 같으며, 다음의 문헌을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

상기 '약학적으로 유효한 양'이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며, 바람직하게는 급성 또는 만성 장기 이식 거부 반응, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 치료 또는 예방하는데 있어서 본 발명의 약학적 복합 제제의 mTOR 억제제와 메트포민을 투여함으로써 면역 조절 또는 억제의 상승 효과를 내고 mTOR 억제제가 유발하는 미토콘드리아 기능 장애를 완화시키는데 충분한 양을 말한다.

본 발명의 복합제제의 mTOR 억제제가 라파마이신일 때에는 라파마이신의 일일 투여량이 0.75 내지 16mg/day/체중 kg인 것으로, 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 투여량은 5 내지 35mg/day/체중 kg인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 복합 제제의 구성 요소인 mTOR 억제제와 메트포민은 동시에 또는 개별적으로 또는 정해진 순서에 따라 적절한 방법에 따라 투여할 수 있다. 투여 경로의 구체적인 예는 앞서 서술한 바와 같다. '동시에 투여' 란 mTOR 억제제와 메트포민을 함께 또는 실질적으로 동일한 시간(예를 들어 투여 시간 간격이 15분 또는 그 이하)에 복용하여, 경구 투여의 경우에는 두 가지 구성요소가 위에 동시에 존재하게 되는 것을 의미한다. 동시에 투여하는 경우, mTOR 억제제와 메트포민은 하나의 제형에 동시에 포함되도록 제형화될 수 있다. 경구 투여의 경우 바람직하게는 일일 투여량이 일회 투여량에 모두 포함되도록 제형화될 수 있지만, 하루에 2, 3, 4회 등으로 나누어 투여하도록 제형화될 수 있다.

본 발명의 약학적 복합 제제의 바람직한 투여량은 질환 및 이의 중증 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화할 수 있다. mTOR 억제제와 메트포민의 생물학적 이용가능성(bioavailability)은 개인차가 있기 때문에 본 발명의 약학적 제제 투여 초기에는 당업계에 알려져 있는 단일 클론 항체(monoclonal antibody) 등에 기반한 어세이로 각 약물의 혈중 농도를 확인하는 것이 바람직할 수도 있다.

따라서 본 발명은 면역억제제로 손상된 미토콘드리아 기능 개선용 메트포민 함유 조성물, 메트포민과 라파마이신 타겟 억제제(mTOR inhibitor)를 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 약학적 복합 제제를 제공한다. 본 발명의 조성물은 기존 면역억제제의 부작용으로 생기는 미토콘드리아의 기능 손상을 효과적으로 완화하고 면역억제 치료 효과가 더욱 향상되어, 면역억제가 필요한 이식 거부 반응, 자가면역 질환, 염증성 질환 등을 예방하거나 치료하는데 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 라파마이신이 미토콘드리아 호흡에 미치는 영향을 보여주는 미토콘드리아의 산소소모율(oxygen consumption rate, OCR) 측정 실험을 나타낸다. 가로축은 시간(분), 세로축은 OCR(pmol/min)을 표시한 것이다. 도 1A와 도 1B에서 Control은 음성대조군, Control+Rapamycin은 라파마이신을 단독처리한 세포, Control+Rapamycin+Metformin은 라파마이신과 메트포민을 병용처리한 세포의 실험 결과를 나타낸다.

도 2는 메트포민과 라파마이신이 미토콘드리아 함유량(mitochondrial content)에 미치는 영향을 보여주는 mitotracker로 염색된 미토콘드리아의 형광현미경 사진을 나타낸다. 적색은 미토콘드리아(Mitotracker), 녹색은 알파 튜불린(α-tubulin), 청색은 DAPI를 나타낸다. Nil은 대조군을 나타낸다. 적색 형광 강도(mean fluorescence intensity, MFI)로 측정되는 미토콘드리아 함유량은 하단의 그래프로 정량화하였다.

도 3은 메트포민과 라파마이신이 미토콘드리아 막전위(mitochondrial membrane potential)에 미치는 영향을 보여주는 JC-1 염색의 형광현미경 사진을 나타낸다. 형광 강도(mean fluorescence intensity, MFI)로 측정되는 미토콘드리아 막전위은 하단의 그래프로 정량화하였다.

도 4는 메트포민과 라파마이신이 미토콘드리아 기능에 관련된 유전자인 Ndufb5, Uqcrb, Cycs의 발현에 미치는 영향을 보여주는 real time RT-PCR 실험 결과를 나타낸다.

도 5는 라파마이신으로 유발되는 당뇨 부작용에 대한 메트포민 병용투여의 효과를 확인하기 위한 랫을 이용한 동물 실험의 개요를 나타낸다.

도 6은 도 5의 개요에 도시된 실험 조건에 따라 각각 약물처리하지 않은 대조군(VH), 라파마이신 투여군(Rapa), 라파마이신과 메트포민의 병용투여군(Rapa+Met)의 랫의 체중(도 6A)과 24시간 동안의 소변량(도 6B)을 나타낸다.

도 7은 도 5의 개요에 도시된 실험 조건에 따라 각각 약물처리하지 않은 대조군(VH), 라파마이신 투여군(Rapa), 라파마이신과 메트포민의 병용투여군(Rapa+Met)의 랫의 복강내 당부하 검사(intraperitoneal glucose tolerancec test) 결과를 혈중 포도당 수준(blood glucose leve)의 시간(분, min)에 따른 변화로 표시한 그래프(도 7A)와 상기 그래프의 면적(AUCg)을 이용한 막대 그래프(도 7B)를 나타낸다.

도 8은 도 5의 개요에 도시된 실험 조건에 따라 각각 약물처리하지 않은 대조군(VH), 라파마이신 투여군(Rapa), 라파마이신과 메트포민의 병용투여군(Rapa+Met)의 랫의 인슐린 저항성 검사 결과를 혈중 포도당 수준(blood glucose leve)의 시간(분, min)에 따를 변화로 표시한 그래프(도 7A)와 상기 그래프의 면적(AUCg)을 이용한 막대 그래프(도 7B)를 나타낸다.

도 9는 림프구 혼합배양실험에서 메트포민과 라파마이신이 동종이형반응성 T 세포 증식에 미치는 영향을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. * p<0.05

도 10은 림프구 혼합배양실험에서 메트포민과 라파마이신이 동종이형반응성 T 세포에서 분비되는 염증성 사이토카인 IFN-γ의 분비량에 미치는 영향을 보여주는 엘라이자(ELISA) 실험 결과를 나타낸다.

도 11은 T 세포 활성 조건의 비장세포에서의 메트포민과 라파마이신의 세포 독성을 측정하는 MTT 실험 결과를 나타낸다.

도 12는 T 세포 활성 조건의 비장세포에서 메트포민과 라파마이신이 염증성 사이토카인 IL-17의 발현량에 미치는 영향을 보여주는 엘라이자(ELISA) 실험 결과를 나타낸다. * p<0.05

도 13은 T 세포 활성 조건의 비장세포에서 메트포민과 라파마이신이 Treg 세포의 활성에 미치는 영향을 나타내는 유세포분석 실험 결과를 나타낸다. 도 13A는 CD25와 Foxp3를 발현하는 세포를 분류(gating)하여 분석하는 유세포분석 데이터이며, 도 13B는 Foxp3+CD25+ 세포가 차지하는 비율을 나타낸 막대그래프이다.

도 14는 메트포민과 라파마이신이 LPS로 자극한 비장세포에서 분비되는 염증성 사이토카인 IL-6(도 14A)와 TNF-α(도 14B)분비량에 미치는 영향을 보여주는 엘라이자(ELISA) 실험 결과를 나타낸다. * p<0.05

도 15는 메트포민과 라파마이신이 LPS로 자극한 비장세포에서 분비되는 면역글로불린(immunoglobulin, IgG)의 분비량에 미치는 영향을 보여주는 엘라이자(ELISA) 실험 결과를 나타낸다. * p<0.05

도 16은 콜라겐으로 유도한 관절염의 마우스 모델에서 약물처리하지 않은 대조군(Vehicle), 라파마이신 투여군(Rapamycin), 메트포민과 라파마이신의 병용투여군(Met+Rapa)의 시간 경과에 따른 관절염 지수(Arthritis score; 도 16A)와 유병률(Incidence, %; 도 16B)을 나타낸다.

도 17은 콜라겐으로 유도한 관절염의 마우스 모델에서 약물처리하지 않은 대조군(Vehicle), 라파마이신 투여군(Rapa), 메트포민과 라파마이신의 병용투여군(M+R)의 당부하 검사(도 17A)와 인슐린 내성 검사(도 17B) 결과를 나타낸다.

도 18은 콜라겐으로 유도한 관절염의 마우스 모델에서 약물처리하지 않은 대조군(Vehicle), 라파마이신 투여군(Rapa), 메트포민과 라파마이신의 병용투여군(Met+Rapa)의 혈당과 혈액지질 검사(도 18A)와 지방간 개선 효과를 확인하기 위한 간 손상 지표 AST와 ALT 수준 측정(도 18) 결과를 나타낸다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

메트포민이 라파마이신으로 유발되는 미토콘드리아 기능 장애에 미치는 영향

<1-1> 미토콘드리아 호흡 측정

라파마이신이 미토콘드리아의 기능에 미치는 영향을 미토콘드리아 호흡을 측정하여 알아보았다(도 1).

류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis, RA) 환자에서 분리한 활막세포에 실험 조건에 따라 라파마이신(100nM)을 처리하고, 미토콘드리아 호흡 측정 초기에는 oliomycin(2μM)을 처리하여 호흡기능을 저하시키고, 측정 중기에는 다시 미토콘드리아 호흡을 증가시키는 FCCP(3μM)를 처리하여 미토콘드리아 호흡량의 변화를 산소소모량(oxygen consumption rate, OCR)을 측정하여 관찰하였다.

도 1A에서 나타나듯이, 라파마이신을 처리한 실험군에서는 oligomycin을 처리하기 전부터 대조군에 비하여 호흡 능력이 저하되어 있으며, FCCP에 의한 미토콘드리아 호흡 증가량도 대조군에 비해 현저히 낮은 것을 확인하였다. 따라서 라파마이신의 면역 억제 기능을 통해 염증 반응은 완화될 수 있지만, 미토콘드리아 호흡을 감소시키는 기능 장애를 일으키는 것을 알 수 있다.

이와 같은 라파마이신에 의한 미토콘드리아의 호흡 저하에 메트포민이 어떤 효과를 갖는지 확인하였다. 실험 조건에 따라 라파마이신 단독(100nM)으로 처리하거나 라파마이신(100nM)과 메트포민(1mM)을 함께 처리하고 미토콘드리아의 호흡량을 산소소모량을 측정하여 확인하였다. Oligomycin과 FCCP 처리 조건은 동일하였다.

도 1B에 도시된 바와 같이, 라파마이신을 메트포민과 함께 처리한 실험군에서는 oligomycin 처리 전 후로 모두 라파마이신을 단독으로 처리했을 때보다 미토콘드리아 호흡량이 증가한 것으로 나타났다. 또한 FCCP에 의한 미토콘드리아 호흡 증가량도 메트포민을 함께 처리했을 때 더욱 높은 것으로 나타났다. 즉 메트포민은 라파마이신과 함께 처리했을 때 라파마이신으로 인한 미토콘드리아 호흡 감소를 완화시키는 효과가 있으며, 따라서 메트포민은 라파마이신과 병용투여하여 염증 억제 효과는 증대시키고, 라파마이신에 의한 미토콘드리아 기능 장애는 개선할 수 있는 것을 확인하였다.

<1-2> 미토콘드리아 함유량 분석

메트포민이 라파마이신에 의한 미토콘드리아 기능 장애를 개선시키는 효과를 미토콘드리아의 함유량(mitochondrial content)을 관찰하여 확인하였다(도 2).

NIH3T3 세포에 메트포민(200μM 또는 1mM)과 라파마이신(1nM)를 처리하고 72시간 배양한 뒤 Mitotracker로 미토콘드리아를 염색하고, α-tubulin 염색으로 세포의 전체적인 형태가 나타나도록 하여 각각의 실험 조건에서의 미토콘드리아를 형광현미경으로 관찰하였다. 구체적으로, Mitotracker는 DMEM 배지에 100nM 농도로 희석하고 NIH3T3 plate에 첨가한 후 37℃에서 15분간 배양하고 PBS로 세척하였다. 이후 α-tubulin 염색을 위해 세포를 아세톤과 메탄올(1:1)로 15분간 고정하고 PBS로 15분간 세척하였다. 10% normal goat serum으로 30분간 블락킹(blocking)한 후, α-tubulin(1:500) 항체로 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 뒤 PBS로 세척하고 DAPI(1:500)로 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다.

도 2에서 나타나듯이, 아무 약물 처리하지 않은 음성대조군(Nil)에 비하여 라파마이신을 처리한 세포의 미토콘드리아는 미토콘드리아 호흡 억제의 부작용으로 미토콘드리아의 함유량이 감소하였다. 이에 반하여 라파마이신과 메트포민을 함께 처리한 세포에서는 라파마이신을 처리한 세포에 비해 미토콘드리아의 함유량이 크게 증가한 것을 확인하였다. 즉 메트포민을 라파마이신과 함께 처리하면, 라파마이신에 의한 미토콘드리아 함유량의 감소를 개선하는 효과가 있음을 확인하였다.

<1-3> 미토콘드리아 막전위 분석

메트포민이 라파마이신에 의한 미토콘드리아 기능 장애를 개선시키는 효과를 미토콘드리아의 막전위(mitochondrial membrane potential)를 관찰하여 확인하였다(도 3).

NIH3T3 세포에 실험 조건에 따라 메트포민(200μM 또는 1mM) 및/또는 라파마이신(1nM)를 처리하고 72시간 배양한 뒤 미토콘드리아 막전위를 나타내는 JC-1 염색하고 각각의 실험 조건에서의 미토콘드리아의 막전위 변화를 형광현미경으로 관찰하였다. JC-1 염색은 세포를 최종농도 100nM로 DMEM에 희석한 JC-1로 37℃에서 15분간 배양한 후 새 DMEM 배지로 교환하고 형광현미경으로 관찰하였다.

도 3에 도시된 바와 같이, 아무 것도 처리 하지 않은 세포(Nil)의 미토콘드리아는 막전위가 잘 유지가 잘 되고 있어서 적색 형광으로 염색되었으나, 라파마이신을 처리한 조건에서는 녹색 형광이 증가되어 있어 미토콘드리아 막전위가 정상적으로 유지되지 않고 있음을 확인하였다. 한편 메트포민과 라파마이신을 함께 처리한 세포에서는 다시 막전위가 회복되어 적색 형광이 크게 증가한 것을 관찰하였다. 즉, 메트포민을 라파마이신과 함께 처리하면, 라파마이신으로 인한 미토콘드리아 막전위 손상을 완화시킬 수 있음을 확인하였다.

<1-4> 미토콘드리아 기능 관련 유전자 발현

메트포민이 라파마이신에 의한 미토콘드리아 기능 장애를 개선시키는 효과를 미토콘드리아의 기능에 중요한 유전자 발현 양상을 통해 확인하였다(도 4).

NIH3T3 세포를 각 실험 조건(라파마이신 1nM, 메트포민 200μM 또는 1mM)에 따라 3일 동안 배양한 뒤, 세포에서 전체 RNA를 추출하여 미토콘드리아 막전위 유지 또는 호흡 기능에 관련된 Ndufb5, Uqcrb, Cycs 유전자의 발현 양상을 실시간 역전사중합효소연쇄반응(real-time RT-PCR)로 관찰하였다. RT-PCR에 사용한 프라이머 염기서열은 표 1에 기재한 바와 같다.

도 4에 도시된 바와 같이, 메트포민과 라파마이신을 함께 처리한 경우에는 라파마이신을 단독으로 처리한 경우보다 Ndufb5, Uqcrb, Cycs 유전자의 발현이 증가한 것을 확인하였다. 즉, 메트포민은 미토콘드리아의 기능에 관련된 유전자의 발현을 향상시켜 라파마이신으로 유발되는 미토콘드리아의 기능 장애를 개선시키는 효과를 나타낼 가능성을 제시한다.

<실시예 2>

라파마이신으로 유발되는 당뇨 증상과 메트포민 병용투여의 효과

라파마이신에 의한 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 체내 부작용을 알아보기 위하여 랫에 라파마이신을 투여한 뒤 체내 대사 작용의 변화를 관찰하고, 라파마이신과 메트포민의 병용투여의 효과를 알아보았다.

실험동물은 200~220 그램의 Sprague-Dawley rat을 이용하여, 0.05% 저염식이를 제공하고 실험 조건에 따라 약물을 투여하면서 총 6주간 실험을 진행하였다(도 5). 대조군으로 vehicle군(VH), 실험군으로 라파마이신 단독투여군(Rapamycin), 라파마이신과 메트포민 병용투여군(Rapa+Met)의 세 그룹으로 나누어 각 그룹당 9마리의 랫으로 구성되었다. 라파마이신은 올리브유에 용해시켜 0.3mg/체중kg의 용량으로 라파마이신 단독투여군(Rapamycin)과 병용투여군(Rapa+Met)에 6주간 매일 피하 주사하였다. 메트포민은 250mg/체중kg의 용량으로 라파마이신 투여 3.5주째부터 병용투여군에 매일 2.5주간 구강으로 투여하였다. 라파마이신 단독투여군과 대조군은 메트포민 대신 증류수(DW, 3mL/kg)를 구강투여하였다. 실험 시작 6주 후 대조군과 실험군의 체중과 24시간 소변량을 측정하였다(도 6). 소변량은 대사 케이지에서 측정하였다. 각 그룹의 동물에 대하여 복강내 당부하 검사(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)와 인슐린 내성 검사(insulin tolerance test, ITT)를 실시하고 시간에 따른 혈중 포도당의 변화를 관찰하였다(도 7, 도 8). 복강내 당부하 검사(IPGTT)는 공복 후 포도당을 1.5g/체중kg으로 복강내 투여하여 실시하였다. 인슐린 내성 검사는 5시간 공복 후 인슐린을 0.8U/체중kg으로 피하주사한 후 30분 간격으로 혈당을 측정하였다. 시간당 혈당 변화의 그래프를 이용하여 양적 형태의 지표(area under the curve of glucose, AUCg)를 도출하여 막대그래프로 나타내었다. 데이터는 평균값±표준오차로 표시하였고, 통계적 유의성은 student's t-test로 판단하였다.

<2-1> 체중과 소변량의 변화

도 6A에 도시된 바와 같이 메트포민 투여 2.5주 후 체중을 측정한 결과, 라파마이신 단독투여군(Rapa)과 병용투여군(Rapa+Met)은 대조군(VH)에 비해 유의한 감소를 나타내었다. 한편 도 6B에 도시된 바와 같이, 24시간 소변량에 있어서는 라파마이신 단독투여군은 대조군에 비하여 소변량이 현저하게 증가하였으나, 병용투여군은 대조군과 비슷한 수준을 유지하였다. 라파마이신과 메트포민을 병용투여함으로써 라파마이신으로 인한 소변량의 변화를 방지할 수 있음을 확인하였다.

상기 라파마이신 투여로 유발된 체중 감소와 소변량 증가는 혈중 포도당이 증가하면서 나타나는 대표적인 당뇨병 초기 증상이다. 이에 대조군과 실험군 마우스의 당 대사 활성을 당부하 검사와 인슐린 내성 검사를 통해 알아보았다.

<2-2> 당부하 검사

도 7A에 도시된 바와 같이, 복강내 당부하 검사(IPGTT) 결과, 라파마이신 단독투여군(Rapa)에서는 세 그룹 중 혈당이 가장 높게 유지되었다. 메트포민 병용투여군(Rapa+Met)도 대조군(VH)에 비하여 혈당 수준이 높았으나, 라파마이신 단독투여군과 비교하여서는 혈당 수준이 낮아진 것을 알 수 있었다. 도 7B에 도시한 IPGTT 결과 그래프의 아래 영역(area under the curve of glucose, AUCg)으로 도출한 분당 단위 부피당 포도당에서도 메트포민 병용투여군은 라파마이신 단독투여군에 비하여 혈당 수준이 통계적으로 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었다.

<2-3> 인슐린 내성 검사

도 8A에 도시된 바와 같이, 인슐린 내성 검사(ITT) 결과, 라파마이신 단독투여군(Rapa)에서는 세 그룹 중 혈당이 가장 높게 유지되었다. 메트포민 병용투여군(Rapa+Met)도 대조군(VH)에 비하여 혈당이 높았으나, 라파마이신 단독투여군과 비교하여서는 혈당 수준이 낮아진 것을 알 수 있었다. 도 8B에 도시한 ITT 결과 그래프 아래 영역(area under the curve of glucose, AUCg)으로 도출한 분당 단위 부피당 포도당에서도 메트포민 병용투여군은 라파마이신 단독투여군에 비하여 혈당 수준이 통계적으로 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었다.

이상의 동물 실험 결과를 통해 라파마이신의 투여로 당뇨병 증상이 유발되며, 메트포민을 라파마이신과 병용투여함으로써 당뇨 증상을 완화할 수 있음을 확인하였다.

< 실시예 3>

메트포민과 라파마이신이 동종이형 면역반응에 미치는 영향

<3-1> 동종이형반응성 T 세포의 증식 분석

메트포민과 라파마이신의 동시처리에 의한 면역조절능력의 증대효과를 in vitro allo response 조건에서 알아보았다. 림프구 혼합배양 반응(mixed lymphocyte reaction, MLR)을 통해 메트포민과 라파마이신이 동종이형 반응성 T 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하였다(도 9).

96웰 플레이트의 각 웰에 정상 수여자(Balb/c, responder)의 CD4+ T 세포(2×10⁵cells/well), 그리고 방사선 조사한 수여자(동종동형) 또는 공여자(C57BL/6, stimulator, 동종이형)에서 유래하고 T 세포를 제거한 비장세포(2×10⁵cells/well)를 각각 넣어 혼합 배양하였다. 이 때 동종이형 반응에는 메트포민(1000μM)과 라파마이신(1nM 또는 100nM)을 실험 조건에 따라 각각 처리한 후 3일 동안 배양하였다. 배양 마지막 날 [³H]-thymidine을 첨가하여 18시간 추가 배양한 뒤 Liquid Scintillation Counter(Beckman, USA)로 세포의 [³H]-thymidine 흡수 정도를 측정하여 cpm 수치로 표시하였다. 통계분석은 Graph prism(t-test, ANOVA)을 이용하였고, 통계적 의의는 p<0.05로 하였다.

그 결과, 도 9에서 알 수 있듯이, 메트포민을 단독으로 처리했을 때 또는 라파마이신을 단독으로 처리했을 때 모두 [³H]-thymidine 흡수로 인한 cpm 수치가 감소하여 T 세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였다. 이 같은 T 세포 증식 억제 효과는 메트포민과 라파마이신을 동시에 처리하였을 때 더욱 유의한 것으로 나타났다. 즉 메트포민과 라파마이신을 병용처리하면, 동종이형 반응성 T 세포에 대한 증식 억제 효과가 극대화되는 것을 알 수 있다.

<3-2> 동종이형 반응성 T 세포의 염증성 사이토카인 분비량 측정

메트포민과 라파마이신이 동종이형반응성 T 세포의 염증성 사이토카인 분비에 미치는 영향을 알아보았다(도 10).

실시예 <3-1>과 동일한 in vitro allo response 조건에서 메트포민(1000μM)이나 라파마이신(1nM 또는 100nM)을 실험 조건에 따라 각각 처리하고 3일 동안 배양한 배양액에서 분비된 IFN-γ의 양을 엘라이자(ELISA)로 측정하였다.

도 10에 나타나듯이, 메트포민과 라파마이신 각각 단독처리에 의해서 IFN-γ의 분비가 감소하지만, 메트포민과 라파마이신을 함께 처리했을 때 이같은 IFN-γ의 분비 억제 효과는 더욱 현저한 것으로 관찰되었다(Rapamycin+Metformin 100nM). 즉 림프구 혼합배양 조건에서 메트포민과 라파마이신을 병용처리하면, 동종이형 반응성 T 세포의 염증성 사이토카인의 분비를 더욱 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.

< 실시예 4>

메트포민과 라파마이신이 T 세포 활성에 미치는 영향

<4-1> T 세포 활성 조건에서의 비특이적 세포 독성 평가

메트포민과 라파마이신이 활성화된 T 세포에 대하여 비특이적인 세포 독성을 나타내는지 MTT 실험을 통해 확인하였다(도 11).

정상 C57BL/6 마우스로부터 얻은 비장세포를 96웰 plate에 2x10⁵개의 세포로 anti-CD3 활성조건(0.5μg/ml)에서 메트포민(1000μM)이나 라파마이신(100nM)을 실험 조건에 따라 각각 처리한 후 3일 동안 배양하였다. MTT 분석을 위해 세포 수확 4시간 전에 3-(4,5 dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide 화합물을 첨가하여 4시간 동안 반응 후 DMSO를 각 웰에 처리하여 540nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

도 11에서 나타나듯이, 메트포민(Metformin) 또는 라파마이신(Rapamycin)을 단독으로 처리한 경우에나, 동시에 처리한 경우(Met+Rapamycin) 모두 대조군(niI)과 큰 차이를 보이지 않았다. 따라서 실험 조건에 따른 약물 처리의 비특이적 세포독성은 없는 것을 확인하였다.

<4-2> 염증성 사이토카인 IL -17의 분비량 측정

메트포민과 라파마이신이 염증성 사이토카인인 IL-17의 발현에 미치는 영향을 알아보았다(도 12).

실시예 <4-1>과 같은 방법으로 쥐의 비장세포를 수득하여 T 세포 활성 조건(anti-CD3 0.5μg/ml)에서 배양하였다. 실험 조건에 따라 메트포민(1000μM)이나 라파마이신(100nM)을 각각 처리한 후 3일 동안 배양하고, 배양액에 존재하는 IL-17의 양을 엘라이자(ELISA)로 측정하였다.

도 12에서 나타나듯이, 메트포민(Metformin)이나 라파마이신(Rapamycin)을 단독으로 처리한 경우, 아무 약물도 처리하지 않았을 때(nil) 보다 배양액에 존재하는 IL-17의 양이 감소하였으나, 메트포민과 라파마이신을 동시에 처리했을 때(Met+Rapamycin) IL-17의 농도는 더욱 현저하게 감소하였다. 즉, 메트포민과 라파마이신을 병용처리하면 T 세포에서 분비되는 염증성 사이토카인의 발현을 더욱 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.

<4-3> Treg 세포 활성 분석

메트포민과 라파마이신이 Treg 세포의 활성에 미치는 영향을 알아보았다(도 13).

정상 C57BL/6 마우스로부터 얻은 비장세포를 24웰 플레이트에 넣고(1x10⁶cells/well), anti-CD3 활성 조건(0.5μg/ml)에서 메트포민(1000μM)이나 라파마이신(100nM)을 실험 조건에 따라 각각 처리한 후 3일 동안 배양하였다. 유세포 분석을 위하여 세포를 anti-CD4-percp 항체와 anti-CD25-APC 항체로 처리하고 4℃에서 30분간 반응시킨 다음, 세포를 투과화하고(permeabilization), anti-Foxp3-PE 항체로 각각 반응시켰다. Treg의 활성을 분석하기 위해 CD4+CD25+Foxp3+ 마커를 발현하는 세포를 분류(gating)하여 분석하였다. 결과는 배양된 전체 CD4+ T 세포 중 차지하는 Foxp3+CD25+ 세포의 비율을 막대그래프로 나타내었다.

도 13에서 나타나듯이, 메트포민(Metformin)이나 라파마이신(Rapamycin)을 단독으로 처리하였을 때 대조군((-))에 비하여 각각 Treg의 활성이 증가하였지만, 메트포민과 라파마이신을 동시에 처리했을 때(Met+Rapamycin) Treg의 활성이 더욱 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 즉 메트포민과 라파마이신을 병용처리하면 각 약물의 Treg 활성화 효과가 더욱 증진되는 것을 알 수 있다.

< 실시예 5>

메트포민과 라파마이신이 염증 반응에 미치는 영향

<5-1> 염증성 사이토카인 측정

메트포민과 라파마이신이 염증성 사이토카인의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 LPS로 자극한 비장세포가 분비하는 염증성 사이토카인의 양을 측정하였다(도 14).

정상 C57BL/6 마우스로부터 얻은 비장세포를 24웰 플레이트에 넣고(1x10⁶cells/well), LPS(100ng/ml)로 자극하고 실험 조건에 따라 메트포민(1000μM)이나 라파마이신(100nM)을 각각 처리한 후 3일 동안 배양하였다. 배양액에 존재하는 IL-6와 TNF-α의 농도를 ELISA로 측정하였다. 통계분석은 Graph prism(t-test, ANOVA)을 이용하였고, 통계적 의의는 p<0.05로 하였다.

도 14에서 도시한 바와 같이, 메트포민(Metformin) 또는 라파마이신(Rapamycin)을 단독으로 처리했을 때에는 각각 대조군(LPS)에 비하여 배양액에 존재하는 IL-6(도 14A)와 TNF-α(도 14B)의 농도가 감소하였다. 메트포민과 라파마이신을 동시에 처리했을 때에는(Met+Rapamycin) 각각을 단독으로 처리했을 때에 비하여 IL-6와 TNF-α의 농도가 각각 더욱 감소하는 것을 확인했다. 즉, 메트포민과 라파마이신을 병용처리하면 염증 유발 상황에서 염증성 사이토카인의 분비가 더욱 효과적으로 억제되는 것을 알 수 있다.

<5-2> 면역글로불린 측정

메트포민과 라파마이신이 염증 반응을 조절하는 효과를 확인하기 위하여 LPS로 자극한 비장세포의 배양액 내 면역글로불린(immunoglobulin, IgG)의 양을 측정하였다(도 15).

실시예 <5-1>에서와 같은 방법으로 마우스 비장세포를 배양하여 LPS로 자극하고, 실험 조건에 따라 실시예 <5-1>과 동일한 농도로 메트포민 또는 라파마이신을 처리한 후, 배양액에 존재하는 IgG의 수준을 엘라이자로 측정하였다.

도 15에서 나타나듯이, 메트포민(Metformin)이나 라파마이신(Rapamycin)을 단독으로 처리하였을 때는 대조군(LPS)에 비교하여 배양액에 존재하는 면역글로불린의 농도가 감소하였으나, 메트포민과 라파마이신을 동시에 처리했을 때는(Met+Rapamycin) 면역글로불린의 양이 더욱 유의하게 감소하였다. 메트포민과 라파마이신을 병용처리하면 면역글로불린 양의 감소 효과에서 나타나듯이, 염증을 보다 효과적으로 조절할 수 있음을 알 수 있다.

< 실시예 6>

관절염에 대한 라파마이신과 메트포민의 병용투여의 효과

<6-1> 관절염 동물 모델의 관절염 지수와 유병률

자가면역질환의 동물 모델에서 라파마이신과 메트포민의 병용투여의 치료 효과를 알아보았다. 이를 위하여 고지방 식이와 동시에 콜라겐(collagen)으로 유발되는 비만성 관절염의 마우스 모델에서 라파마이신의 단독투여와 라파마이신과 메트포민의 병용투여의 효과를 비교하였다.

DBA1/J 마우스에 고지방 식이(high fat diet, 60kcal)를 공급하면서, chicken type II collagen(100μg/mouse)의 양으로 피하 주사하여 관절염이 유발된 마우스 모델을 제작하였다. 콜라겐 주사한지 1주일 경과 후에 라파마이신(1mg/kg)을 단독으로 또는 메트포민(50mg/kg)을 함께 함유하는 단독 또는 복합제제를 마우스에 경구투여한 후, 12주 동안 관절염 지수와 유병률을 관찰하였다.

관절염 평가(arthritis score)는 마리당 아래의 척도에 따라 매긴 점수를 합산한 값을 관찰자 간의 평균치로 산출하였다. 관절염 평가에 따른 점수와 기준은 다음과 같다: 0점: 부종이나 종창이 없음; 1점: 발 또는 발목 관절에 국한된 경한 부종과 발적; 2점: 발목 관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경미한 부종과 발적; 3점: 발목 관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적; 4점: 발목에서 다리 전체에 걸친 부종과 발적. 발병 지수(incidence)는 마우스 4발은 100%로 부은 한발을 25%로 산정하여 계산하였다.

도 16에서 확인할 수 있듯이, 라파마이신을 단독으로 처리한 군에 비해 메트포민과 라파마이신을 병용투여한 경우, 관절염의 지수(도 16A)및 유병률(도 16B)이 더욱 낮아지는 것으로 나타났다.

<6-2> 관절염 동물 모델의 당부하와 인슐린 내성 검사

실시예 <6-1>과 동일한 방법으로 마우스에 고지방 식이와 동시에 콜라겐으로 관절염을 유발하고, 12주 뒤에 각 그룹의 마우스에 대하여 복강 내 글루코스 주입에 의한 당부하 검사와 인슐린 내성 검사를 실시하고 시간에 따른 혈중 포도당의 변화를 관찰하였다(도 17).

복강 내 당부하 검사는 12시간 공복 후 포도당을 1g/체중kg으로 복강 내 투여하여 실시하였다. 인슐린 내성 검사는 인슐린을 1U/체중kg으로 피하주사한 후 30분 간격으로 혈당을 측정하였다.

복강 내 당부하 검사 결과(도 17A), 라파마이신 단독투여군(Rapa)에서는 세 그룹 중 혈당이 가장 높게 유지되었다. 메트포민 병용투여군(M+R)군은 대조군(Vehicle)과 비슷한 수준으로 유지되었으며, 라파마이신 단독투여군과 비교하여서는 혈당 수준이 크게 낮아진 것을 알 수 있었다.

인슐린 내성 검사 결과(도 17B), 라파마이신 단독투여군(Rapa)에서는 세 그룹 중 혈당이 측정 시작점에서 가장 높게 유지되었다. 이 후 혈당은 메트포민 병용투여군(Rapa+Met), 라파마이신 단독투여군 및 대조군(Vehicle)은 비슷한 수준으로 유지되고 있었다.

<6-3> 관절염 동물 모델의 혈액 검사

관절염의 동물 모델에서 라파마이신과 메트포민의 병용투여의 치료 효과를 알아보았다. 실시예 <6-1>과 동일한 방법으로 고지방 식이와 콜라겐으로 유도한 관절염의 마우스 모델에서 라파마이신의 단독투여와 라파마이신과 메트포민의 병용투여의 효과를 비교하였다.

7주령의 DBA1/J 마우스에 12주 동안 관절염 유도 자극 및 고지방 식이를 급여하면서 라파마이신(1mg/kg) 단독 또는 메트포민(50mg/kg)을 함께 경구투여한 후, 희생하여 혈청에서 당, 중성지방 및 유리지방산 수치를 측정하였다.

도 18A에서 나타나듯이, 라파마이신 단독군 대비 메트포민과 라파마이신 병용투여군에서 혈당(glucose), 중성지방(triglyceride) 및 유리지방산(free fatty acid)의 수치가 감소하는 것을 알 수 있었다.

또한 관절염의 동물 모델에서 메트포민과 라파마이신의 병용투여가 지방 간 증상에 미치는 영향을 알아보기 위하여 혈청 내 AST와 ALT 수치를 측정하였다. 세포막의 구조와 기능이 파괴되게 되면 간 세포의 세포질 내에 널리 존재하는 효소인 AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransferase)가 혈액으로 유출되므로 혈액 내 AST 및 ALT 수치는 간 손상의 지표로 빈번히 사용되고 있다.

AST와 ALT 활성은 정량용 kit 시약(영동제약, 한국)으로 측정하였다. AST와 ALT 기질액 1.0mL를 37℃ 수조에서 2분간 가온한 다음, 혈장 0.2mL을 넣고 37℃ 수조에서 30분간 반응시켰다. 30분 후 발색시약을 1.0mL 넣고 실온에서 20분간 방치한 다음, 0.4 N NaOH 10.0mL을 넣고 505nm에서 흡광도를 측정하였다. AST와 ALT 기준액(2mM pyruvate)을 농도별로 위의 방법과 동일하게 발색시켜 흡광도를 측정한 후, 표준 곡선에 외삽시켜 시료의 활성을 계산하였다.

도 18B에서 나타나듯이, 라파마이신 단독군 대비 메트포민과 라파마이신 병용투여군에서 AST 및 ALT의 수치가 크게 감소되는 것을 알 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이 본 발명의 조성물은 기존 면역억제제의 부작용으로 유발되는 미토콘드리아 기능 장애를 효과적으로 완화하여 면역억제가 필요한 질병의 치료 효과를 높이는데 유용하게 이용될 수 있다. 또한 본 발명의 또 다른 약학적 조성물 또는 복합 제제는 기존의 면역억제제와 메트포민을 병용투여하는 다양한 방법을 제시하여 기존 면역억제제의 미토콘드리아 기능 저하 부작용은 줄이고, 면역억제 또는 면역조절 효과는 극대화함으로써, 장기 이식 거부 반응, 자가면역 질환, 염증성 질환 등을 예방하거나 치료하는데 효과적이어서 산업상 이용가능성이 높다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Metformin-comprising compositions for preventing or treating mitochondrial diseases caused by immunosuppressive drugs and immune diseases <130> NP16-0096 <150> KR 10-2015-0118934 <151> 2015-08-24 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Ndufb5 forward <400> 1 tcccagaagg ctacatccct 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Ndufb5 reverse <400> 2 attccgggcg atccatcttg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Uqcrb forward <400> 3 tcaagcaagt ggctggatgg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Uqcrb reverse <400> 4 tcaggtccag ggctctctta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Cycs forward <400> 5 aatctccacg gtctgttcgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Cycs reverse <400> 6 ggtctgccct ttctcccttc 20

Claims

라파마이신, 템시롤리무스(temsirolimus), 에버롤리무스(everolimus), 및 데포롤리무스(deforolimus)로 이루어진 군에서 선택된 mTOR 억제제와 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하며, 급성 또는 만성 장기 이식 거부 반응, 골관절염, 류마티스성 관절염, 및 유년형 만성 관절염으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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제1항에 있어서, 라파마이신, 템시롤리무스(temsirolimus), 에버롤리무스(everolimus), 및 데포롤리무스(deforolimus)로 이루어진 군에서 선택된 mTOR 억제제와 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 중량비가 1:500 내지 1:200,000인 것을 특징으로 조성물.
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(a) 라파마이신, 템시롤리무스(temsirolimus), 에버롤리무스(everolimus), 및 데포롤리무스(deforolimus)로 이루어진 군에서 선택된 mTOR 억제제와 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 1:500 내지 1:200,000의 중량비로 포함하며,
(b) 라파마이신, 템시롤리무스(temsirolimus), 에버롤리무스(everolimus), 및 데포롤리무스(deforolimus)로 이루어진 군에서 선택된 mTOR 억제제와 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 동시에 또는 개별적으로 또는 정해진 순서로 투여하는 것을 특징으로 하며, 급성 또는 만성 장기 이식 거부 반응, 골관절염, 류마티스성 관절염, 및 유년형 만성 관절염으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합 제제.
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