KR20160058708A - 지방산 및 유도체 제조 - Google Patents

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KR20160058708A
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마르쿠스 푀터
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에보니크 데구사 게엠베하
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Abstract

본 발명은
(c) 수성 배지 중에 유전자 변형된 수소 산화 박테리아를 제공하는 단계; 및
(d) 상기 수성 배지를, H2, CO2 및 O2를 20 내지 70:10 내지 45:5 내지 35의 중량비로 포함하는 가스와 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서 지방산은 5개 이상의 탄소 원자를 포함하고, 수소 산화박테리아는 야생형 박테리아에 비해 말로닐 CoA를 통한 아세틸 CoA의 아실 ACP로의 전환을 촉매할 수 있는 효소 E1의 발현이 증가되도록, 그리고 아실 ACP의 지방산으로의 전환을 촉매할 수 있는 효소 E2의 발현이 증가되도록 유전자 변형된 것인, H2, CO2 및 O2를 포함하는 가스로부터 1종 이상의 지방산 및/또는 그의 유도체를 제조하는 1종 이상의 방법에 관한 것이다.

Description

지방산 및 유도체 제조{FATTY ACID AND DERIVATIVES PRODUCTION}
본 발명은 생물공학적 수단에 의한 지방산 제조에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 재생가능한 공급원으로부터의 5개 초과의 탄소 원자를 갖는 지방산의 생물공학적 제조에 관한 것이다.
지방산 및/또는 트리아실글리세리드는 수많은 산업에서 다양한 용도를 갖는다. 예를 들어 식품 산업에서, 지방산 및/또는 트리아실글리세리드는 동물 사료에, 그리고 영양 보충을 위해 사용될 수 있다. 지방산 및/또는 트리아실글리세리드는 또한 화장품 및 약학 분야에서 사용될 수 있다. 이러한 적용은 유리 지방산 또는 트리아실글리세리드를 필요로 할 수 있다. 이러한 지방산 및/또는 트리아실글리세리드의 천연 공급원은 상당히 제한되어 있다.
예를 들면, 다양한 다중불포화 지방산 (PUFA) 및 PUFA-함유 트리글리세리드가 주로 모르티에렐라(Mortierella ) 및 쉬조키트리움(Schizochytrium)과 같은 미생물, 또는 대두 또는 유지종자 평지(oilseed rape)와 같은 오일-생성 식물, 크립테코디니움 (Crypthecodinium) 또는 파에오닥틸룸(Phaeodactylum)과 같은 조류 등으로부터 수득되는데, 일반적으로 그의 트리아실글리세리드의 형태로 수득된다. 유리 PUFA는 일반적으로 가수분해에 의해 트리아실글리세리드로부터 제조된다. 그러나, 장쇄 다중불포화 지방산은 천연 오일 작물 식물로부터 효율적으로 단리될 수 없다.
통상적으로, 산업 규모로 제조되는 지방산 및/또는 트리아실글리세리드는 석유화학제품 유래의 물질로부터 시작된다. 이는 일반적으로 환경에 좋지 않은 가솔린 또는 석유를 분해증류하는 것으로부터 시작된다. 또한, 이러한 출발 물질들의 비용은 석유의 가격과 연계될 것이기 때문에, 미래 석유 가격의 예상되는 증가로 인하여, 지방산 및/또는 트리아실글리세리드의 가격 역시 석유 가격의 증가에 비례하여 증가할 수 있다.
따라서, 환경에 대하여 보다 적은 손상을 야기하기도 하는 지방산 및/또는 트리아실글리세리드 제조용 출발 물질로서, 순수하게 석유 기재가 아닌 다른 보다 지속가능한 원료를 찾는 것이 바람직하다.
지방산의 제조를 위한 일련의 생물공학적 경로들이 지금까지 기술되어 왔다. 그러나, 낮은 수율, 불충분한 순도, 그리고 다-단계 정제 절차의 필요성으로 인하여, 그들 중 어느 것도 재생가능한 에너지 공급원으로부터의 지방산의 상업적인 대규모 제조에는 적절하지 않다. 구체적으로, 생물공학적으로 유용한 유기체에 공급되는 탄소 기질 중 적은 비율만이 실제로 수요가 많은 생성물로 전환되는 반면, 그중 많은 것이 일차 대사 반응에 의해 소비된다.
생물공학적 경로와 연관된 또 다른 문제점은 생성물의 혼합물이 수득되며 그에 따라 조성을 조절하는 것이 어렵다는 사실이다. 보다 구체적으로, 단일 첨가생성물의 생성이 바람직할 수 있음에도 불구하고, 일련의 지방산들이 생성될 수 있다. 혼합물이 화학 구조 면에서 고도로 관련되어 있는 화합물들을 포함하기 때문에, 효율적이고 간단한 방식으로 단일 성분을 정제하거나 적어도 강화하는 것은 일반적으로 기술적 실현가능성을 능가하는 것이다.
따라서, 관련 기술분야에서 재생가능한 에너지 공급원으로부터의 보다 효율적인 지방산 제조 수단이 요망된다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 상기에서 언급된 문제점들의 해결을 시도한다. 구체적으로, 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 먼저 탄소 공급원을 아실 CoA로 전환시킨 다음, 아실 CoA를 말로닐 CoA로 전환시키고, 이후 마지막으로 말로닐 CoA를 5개 초과의 탄소 원자를 갖는 1종 이상의 지방산으로 전환시키는 것에 의해 탄소 공급원을 1종 이상의 지방산 및/또는 그의 유도체로 전환시키는 1종 이상의 유전자 변형된 수소 산화 박테리아를 사용할 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 이러한 방법은 에너지-풍부 유기 화합물의 부재 하에서의 지방산 및 그의 유도체의 제조를 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 지방산 및 그의 유도체의 제조를 위한 효율적인 생물공학적 경로를 제공한다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법에서는, 수득되는 지방산 및 그의 유도체 중에 보다 많은 탄소 원자가 이산화탄소 분자로부터 유래되며, 즉 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법을 사용하면, 관련 기술분야에 공지된 다른 방법과 비교하여 임의의 다른 유기 분자, 예를 들면 알콜 또는 탄수화물로부터 유래되기 보다는 이산화탄소로부터 유래된 탄소 원자의 비율이 보다 높다.
본 발명의 한 측면에 따라,
(a) 수성 배지 중에 유전자 변형된 수소 산화 박테리아를 제공하는 단계; 및
(b) 상기 수성 배지를, H2, CO2 및/또는 O2를 20 내지 70:10 내지 45:5 내지 35의 중량비로 포함하는 가스와 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서 지방산은 5개 이상의 탄소 원자를 포함하고, 수소 산화 박테리아는 야생형 박테리아에 비해 말로닐 CoA를 통한 아세틸 CoA의 아실 ACP로의 전환을 촉매할 수 있는 효소 E1의 발현이 증가되도록, 그리고 아실 ACP의 지방산으로의 전환을 촉매할 수 있는 효소 E2의 발현이 증가되도록 유전자 변형된 것인, H2, CO2 및/또는 O2를 포함하는 가스로부터 1종 이상의 지방산 및/또는 그의 유도체를 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 수소 산화 박테리아는 비제한적으로 단쇄 알콜, 예컨대 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 및 부탄올, 지방 알콜, 지방산 에스테르, 탄화수소, 왁스 에스테르 등을 포함한 다양한 유형의 지방산 및 그의 유도체를 산출하도록 조작되었을 수 있는 재조합 수소 산화 박테리아를 지칭한다.
한 예에서, 본 개시내용은 재생가능한 탄소 공급원으로부터 생성되는 지방산 및/또는 그의 유도체를 생성하고, 임의적으로는 방출하도록 수소 산화 박테리아를 변형시키는 방법을 제공한다. 이러한 수소 산화 박테리아는 예를 들면 재생가능한 탄소 공급원을 대사하여 지방산 유도체를 생성하고, 일부 예에서는 분비할 수 있는 1종 이상의 단백질을 코딩하는 외인성 DNA 서열을 도입하는 것에 의해 유전자 조작된다. 변형된 수소 산화 박테리아는 이후 출발 물질로서 재생가능한 탄소 공급원 (바이오매스)을 사용하여 유용한 지방산 및/또는 그의 유도체를 생성하기 위한 발효 공정에 사용될 수 있다. 일부 예에서는, 기존의 유전적으로 다루기 쉬운 수소 산화 박테리아가 사용되며, 이는 성장, 생성을 조절하고, 생합성 경로 효율을 감소시키는 부반응을 감소시키거나 또는 제거하기 위해 그의 경로를 조작하는 것이 용이하기 때문이다. 또한, 이러한 변형된 수소 산화 박테리아는 특수한 저장 또는 수송 방법을 필요로 하지 않으면서 생물연료로서 직접 사용될 수 있는 연료를 생성하기 위해 재생가능한 탄소 공급원을 소비하는데 사용될 수 있다. 다른 예에서, 탄화수소를 자연적으로 생성하는 미생물은 지방산 생성을 증가시키는 외인성 핵산 서열을 발현시켜 탄화수소가 과다생성되도록 조작된다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 정해진 탄소 쇄 길이, 분지화 및 포화 수준을 갖는 지방산 및/또는 그의 유도체를 생성하는데 사용될 수 있다. 구체적인 예에서, 균질 생성물의 생성은 발효 및 분리와 관련된 전체적인 비용을 감소시킨다. 구체적으로, 상기 지방산은 5개 이상의 탄소 원자를 포함한다. 예를 들면, 지방산은 포화 또는 불포화일 수 있다. 지방산은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 지방산은 20개 초과의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 지방산 및/또는 그의 유도체는 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 34개 이상의 탄소 길이인 탄소 쇄를 포함할 수 있다. 일부 예에서는, 제조되는 지방산 및/또는 그의 유도체의 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상이 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 34개 탄소 길이인 탄소 쇄를 함유한다. 또 다른 예에서는, 지방산 및/또는 유도체 생성물의 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상이 1, 2, 3, 4 또는 5개의 불포화점을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 지방산 조합을 생성할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 결과는 2, 3, 4, 5 또는 6종 이상의 지방산의 조합이 생성되는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따르면, 단계 (b)에서 사용되는 탄소 공급원은 임의의 재생가능한 탄소 공급원일 수 있다. 구체적으로, 상기 탄소 공급원은 H2, CO2 및/또는 O2를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 탄소 공급원은 호기성 조건에서의 지방산의 생성을 가능하게 하는 산소 가스를 포함한다.
단계 (b)에서 도입되는 H2, CO2 및 O2 가스 중 수소의 분압은 0.1 내지 100 bar, 0.2 내지 10 bar, 특히 0.5 내지 4 bar일 수 있다. 단계 (b)에서 도입되는 H2, CO2 및 O2 함유 가스 중 이산화탄소의 분압은 0.03 내지 100 bar, 특히 0.05 내지 1 bar, 더욱 특히는 0.05 내지 0.3 bar일 수 있다. 단계 (b)에서 도입되는 H2, CO2 및 O2 가스 중 산소의 분압은 0.001 내지 100 bar, 특히 0.04 내지 1 bar, 더욱 특히는 0.04 내지 0.5 bar일 수 있다. 구체적으로, 단계 (b)에서의 H2 및/또는 CO2의 공급원은 합성 가스일 수 있다. 상기 합성 가스는 산소와 함께 사용되어, 단계 (b)에서 도입되는 H2, CO2 및 O2 가스의 공급원이 될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 임의의 측면에 따라 단계 (b)에서 도입되는 H2, CO2 및 O2 가스는 합성 가스를 포함할 수 있다.
합성 가스는 예를 들면 석탄 가스화의 부산물로부터 제공될 수 있다. 따라서, 상기 수소 산화 박테리아는 폐기물인 물질을 가치있는 원료로 전환시킨다.
대안적으로, 합성 가스는 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법에서 광범위하게 이용가능한 저-비용 농업 원료 물질의 가스화에 의해 제공될 수 있다. 거의 모든 형태의 식물이 이와 같은 목적에 사용될 수 있기 때문에, 합성 가스로 전환될 수 있는 원료의 수많은 예들이 존재한다. 원료의 예는 다년생 초본, 예컨대 억새, 옥수수 잔류물, 가공 폐기물, 예컨대 톱밥이다. 일반적으로, 합성 가스는 주로 열분해, 부분 산화 및/또는 수증기 개질을 통해 H2, CO2 및 O2와 같은 일차 생성물을 생성하는 건조 바이오매스 가스화 장치에서 수득될 수 있다. 일반적으로 생성물 가스 중 일부는 생성물 수율을 최적화하고 타르의 형성을 회피하기 위해 처리된다. 원치 않는 합성 가스 중 타르 및 CO의 분해증류는 석회 및/또는 돌로마이트를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 과정에 대해서는 문헌 [Reed, TB, 1981]에 상세하게 기술되어 있다. 상이한 합성 가스 생성용 공급원들의 혼합물 역시 사용될 수 있다.
구체적으로, 단계 (b)의 합성 가스에 함유되어 있는 탄소는 방법 단계 (b)에서 수소 산화 박테리아에 이용가능한 전체 탄소 공급원의 탄소의 50 중량% 이상, 또는 70 중량%, 90 중량% 이상을 구성하는데, 여기서 석탄 물질의 중량%는 탄소 원자에 관한 것이다. 합성 가스 유래의 CO2를 제외한 다른 탄소 공급원은 예를 들면 수성 배지 중 탄수화물의 형태로 수소 산화 박테리아에 이용가능할 수 있다.
연도 가스, 석유 정제소 가스, 효모 발효 또는 클로스트리디움 발효의 생성물, 셀룰로스-함유 물질의 가스화 또는 석탄 가스화로부터의 배기 가스 등과 같은 추가의 CO2 공급원들이 단계 (b)에서 도입되는 H2, CO2 및 O2 가스 중 CO2 공급원으로 사용될 수 있다.
구체적으로, 단계 (b)에서 도입되는 H2, CO2 및/또는 O2를 포함하는 가스는 각각 20 내지 70:10 내지 45:5 내지 35의 중량비를 구성한다. H2 및 O2의 비는 공급원에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, H2 대 O2의 중량비는 2:1, 4:1, 5:1 등일 수 있다.
"수소 산화 박테리아"라는 용어는 "크날가스(knallgas) 박테리아"라는 용어와 교환가능하게 사용될 수 있는데, 최종 전자 수용체로서 산소를 사용하여 수소를 산화시키고 호기성 조건하에서 이산화탄소를 고정할 수 있는 임의의 박테리아를 지칭한다. 구체적으로, 크날가스 박테리아는 메타노박테리움 ( Methanobacterium ), 아세토박테리움 (Acetobacterium), 데술포비브리오 ( Desulfovibrio ), 데술포모나 스(Desulfomonas), 파라코쿠스 ( Paracoccus ), 아크로모박터( Achromobacter ), 알칼리 게네스(Alcaligenes), 슈도모나스( Pseudomonas ), 노카르디아 ( Nocardia ) 및 쿠프리 아비두스(Cupriavidus)로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다. 보다 구체적으로, 크날가스 박테리아는 쿠프리아비두스 균주, 더욱 보다 구체적으로는 쿠프리아비두스 네카토 르(Cupriavidus necator ) H16일 수 있다. 대표적인 크날가스 박테리아는 아시도보락스 파실리스(Acidovorax facilis ), 아시도보락스 ( Acidovorax ) 종, 알칼리게네스 유트로파 ( Alcaligenes eutropha ), 알칼리게네스( Alcaligenes ) 종, 브라디 리조비움 자포니쿰 ( Bradyrhizobium japonicum ), 브라디리조비움 ( Bradyrhizobium ) 종, 쿠프리아비두스 네카토르 ( Cupriavidus necator ) DSM 531, 헬리오박 터(Heliobacter) 종, 히드로게노박터 ( Hydrogenobacter ) 종, 히드로게노박터 써모필루스 (Hydrogenobacter thermophilus ), 히드로게노모나스 유트로파 ( Hydrogenomonas eutropha), 히드로게노모나스 판토트로파 ( Hydrogenomonas pantotropha ), 히드로게노모나스 ( Hydrogenomonas ) 종, 히 드로게노모나스 파실리스 ( Hydrogenomonas facilis ), 히 드로게노파가 ( Hydrogenophaga ) 종, 히드로게노비브리오 마리누스 ( Hydrogenovibrio marinus ) (균주 MH -110)), 히드로게노비브리오 (Hydrogenovibrio) 종, 옥시히드로젠 미생물( Oxyhydrogen microorganism), 슈도모나스 히드로게노써모필라 ( Pseudomonas hydrogenothermophila), 슈도모나스 히드로게노보라 ( Pseudomonas hydrogenovora ), 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 랄스토니아 유트로파 ( Ralstonia eutropha ), 랄스토니아 (Ralstonia) 종, 리조비움 자포니쿰 ( Rhizobium japonicum ), 리조비움 ( Rhizobium ) 종, 로도코쿠스 오파쿠스 ( Rhodococcus opacus ), 로도코쿠스 (Rhodococcus) 종, 로도슈도모나스 아시도필라 ( Rhodopseudomonas acidophila ), 로도슈도모나스 블라스티카 ( Rhodopseudomonas blastica), 로도슈도모나스 캅술라타 ( Rhodopseudomonas capsulata ), 로도슈도모나스 팔루스트리스 ( Rhodopseudomonas palustris ), 로도슈도모나스 세로이데스(Rhodopseudomonas sheroides ), 로도슈도모나스 술포비리디 스(Rhodopseudomonas sulfoviridis ), 로도슈도모나스 비리디 스 ( Rhodopseudomonas viridis ), 로도슈도모나스 ( Rhodoseudomonas ) 종, 로도스피릴룸 루브럼 ( Rhodospirillum rubrum ), 로도스피릴룸 (Rhodospirillum) 종, 티오캅사 로세오페르시시나 ( Thiocapsa roseopersicina ), 티오캅수스 ( Thiocapsus ) 종, 바리오보락스 파라독수 스(Variovorax paradoxus ), 바리오보락스 ( Variovorax ) 종, 크산토박 터(Xanthobacter) 종, 히드로게노써무스 마리누스 ( Hydrogenothermus marinus ), 랄스토니아 유트로파 ( Ralstonia eutropha ), 쿠프리아비두스 네카토르 ( Cupriavidus necator ), 알칼리게네스 유트로푸스 ( Alcaligenes eutrophus ), 알칼리게네스 파라독수스 ( Alcaligenes paradoxus ), 파라코쿠스 데니트리피칸스 ( Paracoccus denitrificans ), 슈도모나스 파실리스 ( Pseudomonas facilis ), 슈도 모나스 플라바 ( Pseudomonas flava ), 슈도모나스 팔 레로니이 ( Pseudomonas palleronii ), 슈도모나스 사카로필라 (Pseudomonas saccharophila ), 및 로도코쿠스 ( Rhodococcus ) 종 ( 노 카르디아 오파카 ( Nocardia opaca )), 슈도모나스 슈도플라바 ( Pseudomonas pseudoflava)로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 한 예에서, 크날가스 박테리아는 크날가스 박테리아가면서도 해당 야생형 균주는 아니도록 유전자 변형된 박테리아일 수 있다. 이러한 경우, 박테리아는 해당 변형에 순응성인 임의의 유기체, 예를 들면 이. 콜라이(E. Coli)일 수 있다.
본원에 사용된 "증가된 효소 활성"이라는 어구는 증가된 세포내 활성으로 이해되어야 한다. 기본적으로, 효소 활성의 증가는 강한 프로모터를 사용하여 그 효소를 코딩하는 유전자 서열 또는 유전자 서열들의 카피 수를 증가시키는 것, 또는 증가된 활성을 갖는 해당 효소를 코딩하는 유전자 또는 대립유전자를 사용하는 것, 그리고 임의적으로 이러한 수단들을 조합하는 것에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 유전자 변형된 세포 또는 유기체는 예를 들면 원하는 유전자, 그 유전자의 대립유전자 또는 그의 일부를 함유하는 벡터, 및 유전자의 발현을 가능하게 하는 벡터를 사용한 형질전환, 형질도입, 접합 또는 이러한 방법들의 조합에 의해 제조된다. 구체적으로, 이종유래 발현은 세포의 염색체 또는 염색체-외 복제 벡터에서의 유전자 또는 대립유전자의 통합에 의해 달성된다.
유전자 변형된 세포는 야생형 세포와 유전적으로 상이할 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 세포와 야생형 세포 사이의 유전적 차이는 야생형 세포에는 부재할 수 있는 유전자 변형된 세포 내의 완전한 유전자, 아미노산, 뉴클레오티드 등의 존재일 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 세포는 세포가 1종 이상의 지방산 및/또는 그의 아실 조효소 A를 생성하고; 그 지방산 및/또는 그의 아실 조효소 A를 지방산 에스테르로 전환시키는 것을 가능하게 하는 효소를 포함할 수 있다. 본 발명의 유전자 변형된 세포와 비교하여 야생형 세포는 유전자 변형된 세포가 1종 이상의 지방산 및/또는 그의 유도체를 생성하는 것을 가능하게 하는 효소가 없거나 그의 검출가능한 활성이 없는 것일 수 있다.
세포와 관련하여 본원에 사용된 "야생형"이라는 어구는 야생에서 자연적으로 발견되는 것과 같은 형태인 게놈 구성을 갖는 세포를 나타낼 수 있다. 상기 용어는 전체 세포 및 개별 유전자 모두에 적용가능할 수 있다. 따라서, "야생형"이라는 용어는 유전자 서열이 인간에 의해 재조합 방법을 사용하여 적어도 부분적으로 변경되어 있는 해당 세포 또는 해당 유전자는 포함하지 않는다.
통상의 기술자라면, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 세포를 유전자 변형시킬 수 있을 것이다. 본 발명의 임의의 측면에 따르면, 상기 유전자 변형된 세포는 정해진 시간 간격인 2시간 이내, 특히 8시간 또는 24시간 이내에 그것이 야생형 세포에 비해 2배 이상, 특히 10배 이상, 100 배 이상, 1000배 이상 또는 10000배 이상 보다 많은 지방산 및/또는 그의 유도체를 형성하도록 유전자 변형된 것일 수 있다. 생성물 형성의 증가는 예를 들면 적합한 영양 배지 내에서 특정 시간 간격 동안 동일한 조건 (동일한 세포 밀도, 동일한 영양 배지, 동일한 배양 조건)하에 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포 및 야생형 세포를 각각 별도로 배양한 다음, 영양 배지 중 표적 생성물 (지방산, 그의 아실 조효소 A 및 각 지방산 에스테르)의 양을 측정하는 것에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따르면, 수소 산화 박테리아는 야생형 박테리아와 비교하여 아실-ACP 또는 아실-CoA의 생성이 증가되도록, 지방산 유도체 및 중간물의 이화가 감소되도록, 또는 생합성 경로의 특정 지점에서의 피드백 억제가 감소되도록 유전자 변형될 수 있다. 한 예에서는, 세포 자원이 지방산의 과다생성을 돕도록 전환될 수도 있는데, 예를 들면 락테이트, 숙시네이트 및/또는 아세테이트 경로는 감쇠될 수 있으며, 아세틸-CoA 카르복실라제 (ACC)는 과다발현될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 임의의 측면에 따른 수소 산화 박테리아에서는, 말로닐 CoA를 통한 아세틸 CoA의 아실 ACP로의 전환을 촉매할 수 있는 효소 E1의 발현이 증가될 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 수소 산화 박테리아는 또한 아실 ACP의 지방산으로의 전환을 촉매할 수 있는 효소 E2의 발현 증가를 포함할 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 수소 산화 박테리아는 E1 및 E2의 발현 증가를 포함할 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 수소 산화 박테리아는 원하는 환경, 예를 들면 제한된 글리세롤 (배양 배지 중 1% w/v 미만)을 포함하는 환경에서 배양될 수 있다. 이에 따라, 이러한 수소 산화 박테리아는 증가된 아세틸-CoA 생성 수준을 가지게 된다. 아세틸-CoA 생성 수준의 증가로 인하여, 새로 합성된 플라스미드에 포함되어 있는 accABCD (아세틸 CoA 카르복실라제, 예를 들면 등록 번호 AAC73296, EC 6.4.1.2)를 코딩하는 DNA를 갖는 상기한 바와 같은 유전자 변형된 수소 산화 박테리아에 의해, 말로닐-CoA 생성 역시 증가될 수 있다. 지방산 과다생성은 새로 합성되는 플라스미드에 리파제 (예를 들면 등록 번호 CAA89087, CAA98876)를 코딩하는 DNA를 추가로 포함하는 것에 의해 달성될 수 있다.
일부 예에서, 아세틸-CoA 카르복실라제 (ACC)는 예를 들면 원래 발현 수준과 비교하여 2-배 이상, 예컨대 5-배 이상 또는 10-배 이상까지 그의 세포내 농도가 증가되도록 과다발현된다.
한 예에서는, 아실-CoA의 풀(pool)에 대한 제한을 제거하기 위해, plsB (예를 들면 등록 번호 AAC77011) D311E 돌연변이가 사용될 수 있다.
단일불포화 지방산의 생성을 증가시키기 위해, sfa 유전자 (Fab A의 억제인자, 예를 들면 등록 번호 AAN79592를 가짐)의 과다발현이 유전자 변형된 수소 산화 박테리아에 포함될 수도 있다 (문헌 [Rock et al., 1996]).
구체적으로, E1은 말로닐 CoA를 통한 아세틸 CoA의 아실 ACP로의 전환을 촉매할 수 있는 효소의 군에서 선택될 수 있다. 따라서, E1은 E1a accA (EC 6.4.1.2), E1b accB (EC 6.4.1.2), E1c accC (EC 6.3.4.14), E1d accD (EC 6.4.1.2) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 수소 산화 박테리아는 E1a, E1b, E1c, E1d, E1aE1b, E1aE1c, E1aE1d, E1bE1c, E1bE1d, E1cE1d, E1aE1bE1c , E1aE1bE1d, E1bE1cE1d 또는 E1aE1bE1cE1d의 발현이 증가되도록 유전자 변형될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 수소 산화 박테리아는 아실 ACP의 지방산, 가능하면 유리 지방산으로의 전환을 촉매할 수 있는 1종 이상 효소 E2를 과다발현하도록 변형될 수 있다. 보다 구체적으로 E2는 티오에스테라제일 수 있다. 더욱 보다 구체적으로, E2는 아실-ACP 티오에스테라제 E2a, 아실-CoA 티오에스테라제 E2b, 아실-티오에스테라제 E2c 등으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다. 구체적으로, E2a (EC 3.1.2.14 또는 EC 3.1.2.22)는 아실-ACP 티오에스테르의 가수분해를 촉매할 수 있는 임의의 효소일 수 있으며; E2b (EC 3.1.2.2, EC 3.1.2.18, EC 3.1.2.19, EC 3.1.2.20 또는 EC 3.1.2.22)는 아실-CoA 티오에스테르의 가수분해를 촉매할 수 있는 임의의 효소일 수 있고; E2c (EC 3.1.2.2, EC 3.1.2.4, EC 3.1.2.18, EC 3.1.2.19, EC 3.1.2.20 또는 EC 3.1.2.22)는 알콜을 사용하는 아실-티오에스테르의 카르복실산 에스테로의 전환을 촉매할 수 있는 임의의 효소일 수 있다. E2는 균질한 생성물을 제공하도록 선택될 수 있다.
더 구체적으로, E2는 E2a일 수 있다. 예를 들면, C18:1-ACP를 사용하는 티오에스테라제 C18 (예를 들면 등록 번호 AAC73596 및 POADA1)을 감쇠시키고 C10-ACP를 사용하는 티오에스테라제 C10 (예를 들면 등록 번호 Q39513)을 발현시킴으로써, C10 지방산 및 그의 유도체가 생성될 수 있다. 따라서, 10의 탄소 쇄 길이를 갖는 지방산 및/또는 그의 유도체의 비교적 균질한 집단이 생성된다. 또 다른 예에서는, 비-C14 지방산을 생성하는 내인성 티오에스테라제를 감쇠시키고 C14-ACP를 사용하는 등록 번호 Q39473의 티오에스테라제를 발현시킴으로써, C14 지방산 및 유도체가 생성될 수 있다. 또 다른 예에서는, C12-ACP를 사용하는 티오에스테라제 (예를 들면 등록 번호 Q41635)를 발현시키고 비-C12 지방산을 생성하는 티오에스테라제를 감쇠시킴으로써, C12 지방산 및 그의 유도체가 생성될 수 있다. 특정 지방산을 생성하는데 사용될 수 있는 E2의 예를 하기 표 1에 제공하였다. 아세틸 CoA, 말로닐 CoA 및 지방산 과다생성은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들면 세포 용해 이후 방사성 전구체, HPLC 및 GC-MS를 사용하는 것에 의해 확인될 수 있다.
<표 1>
아실-ACP로부터의 지방산의 생성을 위한 티오에스테라제의 예
Figure pat00001
본 발명의 임의의 측면에 따르면, 수소 산화 박테리아는 E1a, E1b, E1c, E1d, E1aE1b, E1aE1c, E1aE1d, E1bE1c, E1bE1d, E1cE1d, E1aE1bE1c , E1aE1bE1d, E1bE1cE1d 또는 E1aE1bE1cE1d와 조합된, E2a, E2b 및 E2c로 이루어지는 군에서 선택되는 E2를 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 보다 구체적으로, 수소 산화 박테리아는 E1aE1bE1cE1dE2a를 발현하도록 유전자 변형될 수 있다.
한 예에서, E1a는 AAC73296 또는 EG11647의 폴리펩티드와 50% 이상의 서열 동일성을 갖고/거나; E1b는 EG10275의 폴리펩티드와 50% 이상의 서열 동일성을 갖고/거나; E1c는 EG10276의 폴리펩티드와 50% 이상의 서열 동일성을 갖고/거나; E1d는 EG10217의 폴리펩티드와 50% 이상의 서열 동일성을 갖거나, 이들이 조합된다. 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 E1a, E1b, E1c 및 E1d는 accA (AAC73296 또는 EG11647), accB (EG10275), accC (EG10276), accD (EG10217) 및 이들의 조합인 서열들 중 어느 하나의 폴리펩티드와 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 구체적으로, 수소 산화 박테리아는 적어도 말로닐 CoA를 통한 아세틸 CoA의 아실 ACP로의 전환을 촉매하기 위한 폴리펩티드 중 어느 것의 기능적 단편을 포함하도록 유전자 변형될 수 있다.
한 예에서, E2는 AAC79596, ACC49269, CAA58388, NP189147, NP193041, AAC72883, AAC72881.1, ABB71579.1, CAC19934.1, AAC49180.1 (서열 10에 의해 코딩됨), AAC49783.1, AAC49179.1, CAB60830.1, ABB71581.1, AAC49269.1, CAC19933.1, CAA54060.1, AAC72882.1, Q39513.1, AAC49784.1, ABO38558.1, ABO38555.1, ABO38556.1, ABO38554.1, ADB79568.1, ADB79569.1, ACQ57188.1, ACQ57189.1, ABK96561.1, ACQ63293.1, ACQ57190.1, Q9SQI3.1, ABU96744.1, ABC47311.1, XP_002324962.1, AAD01982.1, AAB51525.1, ACV40757.1, XP_002309244.1, CBI28125.3, ABD91726.1, XP_002284850.1, XP_002309243.1, XP_002515564.1, ACR56792.1, ACR56793.1, XP_002892461.1, ABI18986.1, NP_172327.1, CAA85387.1, CAA85388.1, ADA79524.1, ACR56795.1, ACR56794.1, CAN81819.1, ACF17654.1, AAB71729.1, ABH11710.1, ACQ57187.1, AAX51637.1, AAB88824.1, AAQ08202.1, AAB71731.1, AAX51636.1, CAC80370.1, CAC80371.1, AAG43858.1, ABD83939.1, AAD42220.2, AAG43860.1, AAG43861.1, AAG43857.1, AAL15645.1, AAB71730.1, NP_001068400.1, EAY86877.1, NP_001056776.1, XP_002436457.1, NP_001149963.1, ACN27901.1, EAY99617.1, ABL85052.1, XP_002437226.1, NP_001151366.1, ACF88154.1, NP_001147887.1, XP_002453522.1, BAJ99650.1, EAZ37535.1, EAZ01545.1, AAN17328.1, EAY86884.1, EEE57469.1, Q41635.1, AAM09524.1, Q39473.1, NP_001057985.1, AAC49001.1, XP_001752161.1, XP_001770108.1, XP_001784994.1, XP_002318751.1, NP_001047567.1, XP_002322277.1, XP_002299627.1, XP_002511148.1, CBI15695.3, XP_002299629.1, XP_002280321.1, CAN60643.1, XP_002459731.1, XP_002975500.1, XP_002962077.1, XP_001773771.1, NP_001151014.1, XP_002317894.1, XP_002971008.1, XP_001774723.1, XP_002280147.1, XP_002526311.1, XP_002517525.1, XP_001764527.1, ABI20759.1, BAD73184.1, XP_002987091.1, XP_002985480.1, CBI26947.3, ABI20760.1, XP_002303055.1, XP_002885681.1, ADH03021.1, XP_002532744.1, EAY74210.1, EEC84846.1, EEE54649.1, AAG35064.1, AAC49002.1, CAD32683.1, ACF78226.1, BAJ96402.1, XP_002462626.1, NP_001130099.1, XP_002462625.1, ABX82799.3, Q42712.1, NP_193041.1, AAB51524.1, NP_189147.1, ABR18461.1, XP_002863277.1, AAC72883.1, AAA33019.1, CBI40881.3, XP_002262721.1, AAB51523.1, NP_001063601.1, ADB79567.1, AAL77443.1, AAL77445.1, AAQ08223.1, AAL79361.1, CAA52070.1, AAA33020.1, CAA52069.1, XP_001785304.1, CAC39106.1, XP_002992591.1, XP_002968049.1, XP_001770737.1, XP_001752563.1, AAG43859.1, XP_002978911.1, XP_002977790.1, ACB29661.1, XP_002314829.1, XP_002991471.1, EAZ45287.1, XP_002986974.1, EEC73687.1, XP_002312421.1, ACJ84621.1, NP_001150707.1, AAD28187.1, XP_001759159.1, XP_001757193.1, XP_002322077.1, ABE01139.1, XP_002447294.1, AAX54515.1, AAD33870.1로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리펩티드와 50% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 구체적으로, E2는 AAC72881.1, ABB71579.1, CAC19934.1, AAC49180.1, AAC49783.1, AAC49179.1, CAB60830.1, ABB71581.1, AAC49269.1, CAC19933.1, CAA54060.1, AAC72882.1, Q39513.1, AAC49784.1, AAC72883.1, Q41635.1 및 AAC49001.1, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 E2는 상기에서 제공된 서열들 및 그들의 조합 중 어느 하나의 폴리펩티드와 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 구체적으로, 수소 산화 박테리아는 적어도 아실 ACP의 1종 이상 지방산으로의 전환을 촉매하기 위한 폴리펩티드 중 어느 것의 기능적 단편을 포함하도록 유전자 변형될 수 있다.
일부 예에서, 지방산은 추가로 부탄올, 지방 알콜, 지방산 에스테르, 탄화수소, 왁스 에스테르 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 지방산 유도체를 생성하는 단계에 적용될 수 있다.
한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 수소 산화 박테리아는 1종 이상의 왁스 에스테르 신타제 (EC 2.3.1.75) (E21)를 과다발현하도록 변형될 수 있다. 유전자 변형된 수소 산화 박테리아는 E1aE1bE1cE1dE2E21을 발현하도록 변형될 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 수소 산화 박테리아는 1종 이상의 알콜 아세틸트랜스퍼라제 (2.3.1.84) (E22)를 과다발현하도록 변형될 수 있다. 또 다른 예에서, 유전자 변형된 수소 산화 박테리아는 E1aE1bE1cE1dE2E21E22, E1aE1bE1cE1dE2E22 등을 발현하도록 변형될 수 있다.
또 다른 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 수소 산화 박테리아는 1종 이상의 아실-CoA 리덕타제 (EC 1.2.1.50) (E23) 및 1종 이상의 알콜데히드로제나제 (EC 1.1.1.1) (E24)를 과다발현하도록 변형될 수 있다. 구체적으로, 유전자 변형된 수소 산화 박테리아는 E1aE1bE1cE1dE2E23E24, E1aE1bE1cE1dE2E23, E1aE1bE1cE1dE2E24 등을 발현하도록 변형될 수 있다.
추가 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 수소 산화 박테리아는 1종 이상의 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타제 (1.1.1.*) (E25)를 과다발현하도록 변형될 수 있다. 구체적으로, 유전자 변형된 수소 산화 박테리아는 E1aE1bE1cE1dE2E25 등을 발현하도록 변형될 수 있다.
한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전적 수소 산화 박테리아는 야생형 박테리아와 비교하여 효소 E26인 지방산 메틸 트랜스퍼라제 (EC 2.1.1.15)의 발현이 증가되도록 변형될 수 있다. 구체적으로, 유전자 변형된 수소 산화 박테리아는 E1aE1bE1cE1dE2E26 등을 발현하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 수소 산화 박테리아는 지방산 및/또는 그의 유도체의 생성을 돕기 위해 1종 이상의 내인성 유전자가 기능상 결실 또는 감쇠되도록 변형될 수도 있다. 예를 들면, ackA (EC 2.7.2.1), ackB (EC 2.7.2.1), adhE (EC 1.1.1.1, 1.2.1.10), fabF (EC 2.3.1.179), fabR (등록 NP_418398), fadE (EC 1.3.99.3, 1.3.99.-), GST (EC 6.3.2.3), gpsA (EC 1.1.1.94), ldhA (EC 1.1.1.28), pflB (EC EC 2.3.1.54), plsB (EC 2.3.1.15), poxB (EC 1.2.2.2), pta (EC 2.3.1.8), 글루타티온 신타제 (EC 6.3.2.3) 및 이들의 조합이다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 수소 산화 박테리아는 또한 1종 이상의 내인성 유전자가 과다발현되도록 변형될 수 있다. 예를 들면, pdh, panK, aceEF (피루베이트 및 2-옥소글루타레이트 데히드로제나제 복합체의 Elp 데히드로제나제 구성요소 및 E2p 디히드로리포아미드 아실트랜스퍼라제 구성요소를 코딩함, 등록 번호: NP_414656, NP_414657, EC: 1.2.4.1. 2.3.1.61, 2.3.1.12), accABCD/fabH/fabD/fabG/acpP/fabF (등록 번호: Q0KCA7, G0EWI2, F8GYI0, G0EWI3, F8GWN5, G0ERC9, CAD85557, CAD85558, NP_842277, NP_841683, NP_415613, EC 6.4.1.2 C, EC: 2.3.1.180, 2.3.1.39, 1.1.1.100, 1.6.5.3, 2.3.1.179), 지방-아실-CoA 리덕타제를 코딩하는 유전자 (등록 번호: AAC45217, EC 1.2.1.-), UdhA 또는 유사 유전자 (피리딘 뉴클레오티드 트랜스히드로제나제를 코딩함, 등록 번호: CAA46822, EC: 1.6.1.1) 및 지방-아실-CoA 리덕타제를 코딩하는 유전자 (등록 번호: AAC45217, EC 1.2.1.-)이다.
지방산 신타제 (FAS)는 아실 쇄의 개시 및 연장을 촉매하는 펩티드 군이다 (문헌 [Marrakchi et al., 2002]). 아실 운반체 단백질 (ACP)은 FAS 경로의 효소들과 함께 생성되는 지방산의 길이, 포화도 및 분지화도를 조절한다. FAS에 포함될 수 있는 효소에는 AccABCD, FabD, FabH, FabG, FabA, FabZ, FabI, FabK, FabL, FabM, FabB, FabF 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 유전자들은 지방산 생성을 위한 적합한 조건을 제공하기를 원하는 구체적인 지방산에 따라 과다발현되거나 감쇠될 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 지방산 제조의 전구체는 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA이다. 이들 구성요소를 과다생성하도록 조작된 수소 산화 박테리아는 지방산 에스테르, 탄화수소, 지방 알콜 등과 같은 지방산 유도체를 제공하는 이후의 유전자 조작 단계를 위한 개시점으로 작용할 수 있다. 증가된 아세틸-CoA/말로닐-CoA/지방산 및 지방산 유도체 생성을 달성하기 위해, 숙주 수소 산화 박테리아 균주에 조합인 것 또는 개별적인 것 중 어느 하나로 몇 가지 상이한 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들면, 아세틸 CoA 생성을 증가시키기 위해서는, 모두 구성적이거나 다른 조절가능한 프로모터의 조절 하에 pdh, panK, aceEF (피루베이트 및 2-옥소글루타레이트 데히드로제나제 복합체의 Elp 데히드로제나제 구성요소 및 E2p 디히드로리포아미드 아실트랜스퍼라제 구성요소를 코딩함), fabH/fabD/fabG/acpP/fabF, 및 일부 예에서는 지방-아실-CoA 리덕타제 및 알데히드 데카르보닐라제를 코딩하는 추가의 DNA를 포함하는 플라스미드가 구성될 수 있다. 이러한 유전자들의 대표적인 진뱅크(Genbank) 등록 번호는 하기이다: pdh (BAB34380, AAC73227, AAC73226), panK (coaA로도 알려져 있음, AAC76952), (E3 및 E4) aceEF (AAC73227, AAC73226), (E12) fabH (AAC74175), (E10) fabD (AAC74176), (E11) fabG (AAC74177), (E5) acpP (AAC74178) 및 fabF (AAC74179).
fadE , gpsA , IdhA , pflb , adhE , pta, poxB , ackA 및/또는 ackB와 같은 다른 효소들은 해당 유전자의 무효화 또는 결실 돌연변이를 포함하는 조건 복제성 또는 비-복제성 플라스미드를 사용한 형질전환에 의해, 또는 프로모터 또는 인핸서 서열을 치환하는 것에 의해, 본 발명의 임의의 측면에 따른 조작된 수소 산화 박테리아에서 녹아웃될 수 있거나, 그의 발현 수준이 감소될 수 있다. 이러한 유전자들의 대표적인 진뱅크 등록 번호는 하기이다: fadE (AAC73325), gspA (AAC76632), IdhA (AAC74462), pflb (AAC73989), adhE (AAC74323), pta (AAC75357), poxB (AAC73958), ackA (AAC75356) 및 ackB (BAB81430).
더욱 보다 구체적으로, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 수소 산화 박테리아는 E3 aceE (EC 1.2.4.1, 2.3.1.61, 2.3.1.12), E4 aceF (EC 1.2.4.1, 2.3.4.16, 2.3.1.12), E5 acpP (AAC74178), E6 fadD (EC 2.3.1.86), E7 cerl (EC 4.1.99.5), E8 fabA (EC4.2.1.60), E9 fabB (EC 2.3.1.41), E10 fabD (EC 2.3.1.39), E11 fabG (EC 1.1.1.100), E12 fabH (EC 2.3.1.180), E13 fabI (EC 1.3.1.9), E14 fabZ (EC 4.2.1.-), E15 리파제 (EC 3.1.1.3), E16 말로닐-CoA 데카르복실라제 (EC 4.1.1.9, 4.1.1.41), E17 panD (EC 4.1.1.11), E18 panK (EC 2.7.1.33), E19 pdh (EC 1.2.4.1), E20 udhA (EC 1.6.1.1) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 효소를 과다발현하도록 변형될 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 수소 산화 박테리아는 E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, E10, E11, E12, E13, E14, E15, E16, E17, E18, E19 및 E20에서 선택되는 1종 이상 효소와의 조합으로써 상기에서 언급된 바와 같은 E1a, E1b, E1c 및/또는 E1d 및 이들의 조합을 과다발현하도록 변형될 수 있다. 한 예에서, 수소 산화 박테리아는 E1aE1bE1cE1d, 및 E3 내지 E20에서 선택되는 1종 이상의 효소 또는 E3 내지 E20 효소 모두를 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 임의의 측면에 따른 수소 산화 박테리아는 적어도 E6과의 조합으로써 E1aE1bE1cE1d를 과다발현할 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 관련 기술분야에 공지된 어떠한 방법도 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있다. 이러한 방법 중 일부 예는 본 상세한 설명에 제공되어 있다. 물질, 방법 및 예들은 단지 예시적인 것으로써, 제한하고자 하는 것이 아니다.
본 상세한 설명 전체에 걸쳐 사용되는 등록 번호들은 미국 국립 보건 연구소(National Institute of Health)에 의해 유지되는 NCBI 데이터베이스 (국립 생물공학 정보 센터(National Centre for Biotechnology　Information)로부터 유래한다. 상기 등록 번호들은 2014년 6월 30일자 데이터베이스에서 제공된 바와 같다. 마찬가지로, 본 상세한 설명 전체에 걸쳐 제공되는 EC 번호들은 부분적으로 도쿄 대학교(University of Tokyo)에 의해 후원되는 교토 유전자 및 게놈 백과(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics)에 의해 유지되는 KEGG 리간드 데이터베이스로부터 유래한다. 상기 EC 번호들은 2014년 6월 30일자 데이터베이스에서 제공된 바와 같다.
[ 실시예 ]
전기는 바람직한 실시양태들을 기술하는 것으로써, 통상의 기술자라면 알고 있을 바와 같이, 청구범위의 영역에서 벗어나지 않고도 설계, 구축 또는 작동에 있어서의 변경 또는 변형에 적용될 수 있다. 이러한 변경은 예를 들면 청구범위의 영역에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
실시예 1
랄스토니아 유트로파를 사용한 지방산 제조용 플라스미드의 구성
알. 유트로파로부터의 지방산의 생성을 위한 플라스미드의 구성을 위해, 하기의 구성요소들로 구성되는 3종의 합성 발현 카세트를 합성하였다:
1. 알. 유트로파 groEL 유전자의 리보솜 결합 부위 (서열 1), 플라스티드 표적화 서열에서 5'-말단절단되어 있는 쿠페아 후케리아나 ChFATB2 유래 티오에스테라제를 코딩하는 유전자 (서열 2), 이. 콜라이 rrnB 유전자의 종결인자 (서열 5)로써, 여기서 알. 유트로파 번역에서의 ChFATB2의 코딩 영역은 코돈 최적화되어 있음 (RBS RegroEL-ChFATB2-T; 서열 6).
2. 알. 유트로파 groEL 유전자의 리보솜 결합 부위 (서열 1), 코코스 누시페라 (Cocos nucifera ) CnFATB3의 티오에스테라제를 코딩하는 유전자 (서열 3), 이. 콜라이 rrnB 유전자의 종결인자 (서열 5)로써, 여기서 알. 유트로파 번역에서의 ChFATB3의 코딩 영역은 코돈 최적화되어 있음 (RBS RegroEL-ChFATB3-T; 서열 7).
3. 알. 유트로파 groEL 유전자의 리보솜 결합 부위 (서열 1), 움벨룰라리아 칼리포르니카 UcFATB1의 티오에스테라제를 코딩하는 유전자 (서열 4), 이. 콜라이 rrnB 유전자의 종결인자 (서열 5)로써, 여기서 알. 유트로파 번역에서의 UcFATB1의 코딩 영역은 코돈 최적화되어 있음 (RBS RegroEL-UCTE-T; 서열 8).
다음에, 발현 카세트 RBS RegroEL-ChFATB2-T, RBS RegroEL-CnFATB3-T 및 RBS RegroEL-UcFATB1-T를 KpnI/HindIII를 통하여 광범위 숙주 발현 벡터 pBBR1MCS-2 (서열 9)에 클로닝함으로써, 유전자들의 발현을 이. 콜라이 lacZ 프로모터의 조절하에 두었다. 생성되는 발현 플라스미드들을 서열 10, 11 및 12의 각 서열을 사용하여 PbBr-ChFATB2, PbBr-CnFATB3 및 PbBr-UcFATB1으로 설계하였다.
실시예 2
랄스토니아 유트로파에서의 지방산 생성을 위한 플라스미드의 도입
상기로부터의 플라스미드를 다른 균주들 사이에서의 랄스토니아 유트로파 유래 플라스미드의 접합 전달이 가능한 균주인 컴피턴트 이. 콜라이 S17-1 세포에 형질감염시켰다. 이와 같은 목적으로, 이. 콜라이 S17-1 균주가 공여자이며 알. 유 트로파 H16 (알칼리게네스 유트로푸스로 재분류, DSMZ 428) 및 알. 유트로파 PHB-4 (알칼리게네스 유트로푸스로 재분류, DSMZ 541)가 수용자인 각 플라스미드를 사용한 스폿메이팅(Spotmating) 접합 (문헌 [FRIEDRICH et al., 1981]에서와 같음)을 수행하였다. 각 플라스미드를 보유하는 모든 종류에서 피전달접합균주 (transconjugant)를 수득하였으며, 해당 균주들은 하기와 같이 지명되었다:
- 알. 유트로파 H16 PbBr-ChFATB2, 알. 유트로파 H16 PbBr-CnFATB3, 알. 유 트로파 H16 PbBr-UcFATB1, 알. 유트로파 PHB-4-PbBr ChFATB2, 알. 유트로파 PHB-4-PbBr CnFATB3 및 알. 유트로파 PHB-4-PbBr UcFATB1.
실시예 3
지방산의 정량화
모든 분석물에 대하여 내부 보정을 기준으로 하고, 옥탄산의 D3 라우르산 (메틸-D3, 99%), 3-히드록시데칸산, 데칸산, 라우르산, 3 히드록시미리스트산, 미리스트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 및 팔미트산의 D3 (D3-메틸, 98%), 올레산, 스테아르산 내부 표준을 사용하는 HPLC-ESI/MS에 의해, 발효 샘플에서 옥탄산, 3-히드록시데칸산, 데칸산, 라우르산, 3-히드록시미리스트산, 미리스트산, 팔미톨레산, 팔미트산, 올레산 및 스테아르산의 정량화를 수행한다.
하기 장치들이 사용된다:
ㆍ HPLC 시스템: 서베이어(Surveyor) MS 펌프, 서베이어 오토샘플러 플러스 및 서베이어 서베이어 PDA로 구성되는 서베이어 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 미국 매사추세츠 왈탐)
ㆍ 질량 분광계: TSQ 밴티지(Vantage) HESI II - 공급처 (써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠 왈탐)
ㆍ HPLC 칼럼: 엑스브릿지(XBridge) BEH C8, 100×2.1 mm, 입자 크기: 2.5 마이크로미터, 세공 크기 130 Å (워터스(Waters), 미국 매사추세츠 밀포드)
1200 μl의 아세톤과 300 μl의 샘플을 약 10초 동안 혼합한 다음 약 13,000 rpm으로 5분 동안 원심분리함으로써, 샘플을 제조한다. 투명 상청액을 제거하고, 아세톤을 사용한 적절한 희석 후 분석한다. 희석된 샘플 각 900 μl에, 100 μl의 ISTD 용액을 피펫팅 투입한다.
HPLC 분리는 상기 HPLC 칼럼을 사용하여 수행한다. 주입 부피는 2 μl이며, 칼럼 온도는 25 ℃이고, 유량은 0.3 mL/분이다. 이동상은 용리액 A (암모니아를 사용하여 중화된 pH=9로 조정된 물 + 10 mM 암모늄 아세테이트) 및 용리액 B (아세토니트릴/이동상 A 95/5)로 구성된다. 하기의 구배가 사용된다:
Figure pat00002
ESI-MS 분석은 ESI 공급원으로부터의 하기 파라미터들을 사용한 음성 이온화(negative ionization)로 수행한다:
ㆍ 스프레이 전압(Spray Voltage): 3000 V
ㆍ 증발기 온도: 380 ℃
ㆍ 시스 가스(Sheath gas) 압력: 40
ㆍ 옥스 가스(Aux Gas) 압력: 15
ㆍ 모세관 온도: 380 ℃
개별 화합물의 검출 및 정량화는 하기의 파라미터들을 사용한 '단일 이온 모니터링 (SIM)'에 의해 이루어진다:
Figure pat00003
하기 균주들의 배양 후, 지방산의 형성이 검출될 수 있다:
ㆍ 알. 유트로파 H16 pBBR-ChFATB2
ㆍ 알. 유트로파 H16 pBBR-CnFATB3
ㆍ 알. 유트로파 H16 pBBR-UcFATB1
ㆍ 알. 유트로파 PHB-4 pBBR-ChFATB2
ㆍ 알. 유트로파 PHB-4 pBBR-CnFATB3
ㆍ 알. 유트로파 PHB-4 pBBR-UcFATB1
실시예 4
크날가스의 사용을 통한 지방산 제조를 위한 유전적 변형 세포의 사용
지방산 형성용 유전적 변형 세포:
ㆍ 알. 유트로파 H16 pBBR-ChFATB2
ㆍ 알. 유트로파 H16 pBBR-CnFATB3
ㆍ 알. 유트로파 H16 pBBR-UcFATB1
ㆍ 알. 유트로파 PHB-4 pBBR-ChFATB2
ㆍ 알. 유트로파 PHB-4 pBBR-CnFATB3
ㆍ 알. 유트로파 PHB-4 pBBR-UcFATB1
모든 균주는 배플이 구비된 2×250 ml 진탕 플라스에서 문헌 [Vollbrecht et al. 1978]에 따라 25 ml의 배지 중에 배양한다.
상기 배지는 (NH4)2HPO4 2.0 g/l; KH2PO4 2.1 g/l; MgSO4×7 H2O 0.2 g/l; FeCl3×6 H2O 6 mg/l; CaCl2×2 H2O 10 mg; 미량 원소 용액 (문헌 [Pfennig and Lippert, 1966]) 0.1 ml를 함유한다. 상기 미량 원소 용액은 티트리플렉스(Titriplex) III 10 g/l, FeSO4×7 H2O 4 g/l, ZnSO4×7 H2O 0.2 g/l, MnCl2×4 H2O 60 mg/l, H3BO3 0.6 g/l, CoCl2×6 H2O 0.4 g/l, CuCl2×2 H2O 20 mg/l, NiCl2×6 H2O 40 mg/l, Na2Mo4×2 H2O 60 mg/l을 함유한다. 예비배양 배지에 프럭토스 5 g/l, 카나마이신 300 ㎍/ml를 보충한 후, 냉동배양물(cryoculture) (1% (v/v))로부터 접종한다. 배양은 30 ℃ 및 150 rpm으로 24시간 동안 수행한다.
생성물 형성은 사토리우스(Satorius) 사의 2 l 스테인리스강 반응기인 바이오스타트(Biostat) B에서 하기를 함유하는 1 l의 배지를 사용하여 화학무기독립영양 조건하에 수행된다: (NH4)2HPO4 2.0 g/l, KH2PO4 2.1 g/l, MgSO4×7 H2O 3 g/l, FeCl3×6 H2O 6 mg/l, CaCl2×2 H2O 10 mg, 비오틴 1 mg/l, 티아민-HCl 1 mg/l, Ca-판토테네이트 1 mg/l, 니코틴산 20 mg/l, 미량 원소 용액 0.1 ml 및 폴리프로필렌글리콜 (30 ℃로 조정된 물과 1:5 희석된 PPG 1000).
배양 조건은 30 ℃, 500-1500 rpm이다. 배양 시간은 76-150시간이다. 7의 pH는 1 M NaOH를 사용하여 조정한다. 가스화는 H2 90 부피%, CO2 6 부피%, O2 4 부피%를 함유하는 가스 혼합물을 사용하여 0-2 bar의 과다압력 및 1.9 vvm의 환기 유량으로 수행된다.
50 ml 팔콘 튜브에서 원심분리함으로써 (20 ℃ 및 4500 rpm에서 10분), 반응기를 접종하기 위한 필요한 부피의 예비배양물 (0.1% (v/v))을 수확한다. 3회 반복되는 세척 단계에서는, 10 ml 포스페이트 완충 식염수에 펠릿을 용해시키고, 현탁액을 다시 원심분리한다 (20 ℃ 및 4500 rpm에서 10분). 마지막으로, 10 ml의 배지 ((NH4)2HPO4 2.0 g/l, KH2PO4 2.1 g/l, MgSO4×7 H2O 3 g/l, FeCl3×6 H2O 6 mg/l, CaCl2×2 H2O 10 mg, 비오틴 1 mg/l, 티아민-HCl 1 mg/l, Ca-판토테네이트 1 mg/l, 니코틴산 20 mg/l, 미량 원소 용액 0.1 ml 및 폴리프로필렌글리콜 (30 ℃로 조정된 물과 1:5 희석된 PPG 1000))에 펠릿을 용해시킨다. 배양 후, 기술되어 있는 바와 같이 지방산의 농도를 측정한다.
[참고문헌]
[Reed, TB, 1981, Biomass: principles and technology, Noves Data Corporation, Park Ridge, NJ.]
[Marrakchi et al., Biochemical Society, 30:1050-1055, 2002]
[Rock et al., J. Bacteriology 178:5382-5387, 1996]
[FRIEDRICH et al., 1981, Naturally Occurring genetic transfer of hydrogen-oxidizing ability in between strains of Alcaligenes eutrophus J Bacteriol 147:198-205]
[Vollbrecht et al. 1978]
[Pfennig and Lippert, 1966]
SEQUENCE LISTING <110> Evonik Industries AG <120> FATTY ACID AND DERIVATIVES PRODUCTION <130> 2013P00096EP <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Ralstonia eutropha <400> 1 tttcaggaga ttcaaga 17 <210> 2 <211> 305 <212> PRT <213> Cuphea hookeriana <400> 2 Met His Asp Arg Lys Ser Lys Arg Pro Asp Met Leu Val Asp Ser Phe 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ser Thr Val Gln Asp Gly Leu Val Phe Arg Gln Ser Phe 20 25 30 Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Thr Asp Arg Thr Ala Ser Ile Glu 35 40 45 Thr Leu Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ser Leu Asn His Cys Lys Ser 50 55 60 Thr Gly Ile Leu Leu Asp Gly Phe Gly Arg Thr Leu Glu Met Cys Lys 65 70 75 80 Arg Asp Leu Ile Trp Val Val Ile Lys Met Gln Ile Lys Val Asn Arg 85 90 95 Tyr Pro Ala Trp Gly Asp Thr Val Glu Ile Asn Thr Arg Phe Ser Arg 100 105 110 Leu Gly Lys Ile Gly Met Gly Arg Asp Trp Leu Ile Ser Asp Cys Asn 115 120 125 Thr Gly Glu Ile Leu Val Arg Ala Thr Ser Ala Tyr Ala Met Met Asn 130 135 140 Gln Lys Thr Arg Arg Leu Ser Lys Leu Pro Tyr Glu Val His Gln Glu 145 150 155 160 Ile Val Pro Leu Phe Val Asp Ser Pro Val Ile Glu Asp Ser Asp Leu 165 170 175 Lys Val His Lys Phe Lys Val Lys Thr Gly Asp Ser Ile Gln Lys Gly 180 185 190 Leu Thr Pro Gly Trp Asn Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val Ser Asn 195 200 205 Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser Met Pro Thr Glu Val Leu 210 215 220 Glu Thr Gln Glu Leu Cys Ser Leu Ala Leu Glu Tyr Arg Arg Glu Cys 225 230 235 240 Gly Arg Asp Ser Val Leu Glu Ser Val Thr Ala Met Asp Pro Ser Lys 245 250 255 Val Gly Val Arg Ser Gln Tyr Gln His Leu Leu Arg Leu Glu Asp Gly 260 265 270 Thr Ala Ile Val Asn Gly Ala Thr Glu Trp Arg Pro Lys Asn Ala Gly 275 280 285 Ala Asn Gly Ala Ile Ser Thr Gly Lys Thr Ser Asn Gly Asn Ser Val 290 295 300 Ser 305 <210> 3 <211> 327 <212> PRT <213> Cocos nucifera <400> 3 Met Pro Asp Trp Ser Met Leu Leu Ala Ala Ile Arg Thr Ile Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ala Glu Lys Gln Trp Thr Leu Leu Asp Ser Lys Lys Arg Gly Ala 20 25 30 Asp Ala Val Ala Asp Ala Ser Gly Val Gly Lys Met Val Lys Asn Gly 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Artificial Sequence <220> <223> codon optimised gene <400> 6 ggtacctttc aggagattca agaatgcatg atcggaaatc caaacgcccc gatatgctcg 60 tggactcgtt cggcctggaa agcaccgtcc aggatgggct ggtgtttcgg caatcgtttt 120 cgatccggag ctatgaaatt ggcaccgacc ggacggcgag cattgaaacg ctgatgaacc 180 atctgcagga aacctccctg aaccactgca aatccaccgg cattctcctc gatgggtttg 240 ggcgcacgct cgaaatgtgt aagcgcgatc tgatctgggt ggtgattaag atgcagatta 300 aagtgaaccg gtatcccgcg tggggcgaca ccgtggagat caatacccgg ttttcgcgcc 360 tcgggaagat tgggatgggg cgggactggc tgattagcga ctgcaacacg ggcgagattc 420 tcgtccgggc cacctcggcc tatgccatga tgaatcagaa aacccgccgg ctgagcaaac 480 tgccctacga agtgcaccag gaaatcgtcc cgctcttcgt cgactccccg gtgatcgaag 540 attcggacct gaaggtgcat aagttcaagg tgaagacggg ggatagcatt cagaagggcc 600 tgacgccggg ctggaacgat ctcgacgtga accagcatgt gtccaacgtc aaatacatcg 660 gctggattct ggaatcgatg ccgacggaag tcctggagac ccaagaactg tgctccctcg 720 ccctcgagta tcgccgggag tgtggccgcg actcggtcct cgaatcggtg accgccatgg 780 acccgtcgaa ggtcggggtg 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ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 4380 agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 4440 tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg 4500 aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgcatgcata aaaactgttg 4560 taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacaa acggcatgat gaacctgaat 4620 cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatgg gggtgggcga 4680 agaactccag catgagatcc ccgcgctgga ggatcatcca gccggcgtcc cggaaaacga 4740 ttccgaagcc caacctttca tagaaggcgg cggtggaatc gaaatctcgt gatggcaggt 4800 tgggcgtcgc ttggtcggtc atttcgaacc ccagagtccc gctcagaaga actcgtcaag 4860 aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa 4920 gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc 4980 ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt 5040 ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc 5100 gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc 5160 gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg 5220 atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca gccgccgcat 5280 tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg 5340 ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagcac 5400 agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag 5460 ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga 5520 cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa 5580 tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt caatcatgcg 5640 aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc agatccttgg 5700 cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag agggcgcccc 5760 agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagct atcgccatgt 5820 aagcccactg caagctacct gctttctctt tgcgcttgcg ttttcccttg tccagatagc 5880 ccagtagctg acattcatcc caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg cccgcgttcc 5940 tgctggcgct gggcctgttt ctggcgctgg acttcccgct gttccgtcag cagcttttcg 6000 cccacggcct tgatgatcgc ggcggccttg gcctgcatat cccgattcaa cggccccagg 6060 gcgtccagaa cgggcttcag gcgctcccga aggt 6094

Claims (11)

  1. (a) 수성 배지 중에 유전자 변형된 수소 산화 박테리아를 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 수성 배지를, H2, CO2 및 O2를 20 내지 70:10 내지 45:5 내지 35의 중량비로 포함하는 가스와 접촉시키는 단계
    를 포함하며, 여기서 지방산은 5개 이상의 탄소 원자를 포함하고, 수소 산화박테리아는 야생형 박테리아와 비교하여 말로닐 CoA를 통한 아세틸 CoA의 아실 ACP로의 전환을 촉매할 수 있는 효소 E1의 발현이 증가되도록, 그리고 아실 ACP의 지방산으로의 전환을 촉매할 수 있는 효소 E2의 발현이 증가되도록 유전자 변형된 것인, H2, CO2 및 O2를 포함하는 가스로부터 1종 이상의 지방산 및/또는 그의 유도체를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, E1이 E1a accA (EC 6.4.1.2), E1b accB (EC 6.4.1.2), E1c accC (EC 6.4.1.2) 및 E1d accD (EC 6.4.1.2) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되고/거나, E2가 1종 이상의 티오에스테라제 (EC 3.1.2.14 및 EC 3.1.2.22)인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 수소 산화 박테리아가 야생형 박테리아와 비교하여 효소 E1a, E1b, E1c 및 E1d의 발현이 증가되도록 유전자 변형된 것인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    (a) E1a가 등록 번호 AAC73296 또는 EG11647 및 이들의 조합의 폴리펩티드와 50% 이상의 서열 동일성을 갖고;
    (b) E1b가 등록 번호 EG10275 및 그의 조합의 폴리펩티드와 50% 이상의 서열 동일성을 갖고;
    (c) E1c가 등록 번호 EG10276 및 그의 조합의 폴리펩티드와 50% 이상의 서열 동일성을 갖고;
    (d) E1d가 등록 번호 EG10217 및 그의 조합의 폴리펩티드와 50% 이상의 서열 동일성을 갖거나,
    또는 (a)-(d)의 E1a-E1d가 말로닐 CoA를 통한 아세틸 CoA의 아실 ACP로의 전환을 촉매하기 위한 폴리펩티드 중 어느 것의 기능적 단편과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, E2가 아실-ACP 티오에스테라제인 방법.
  6. 제5항에 있어서, E2가 AAC72881.1, ABB71579.1, CAC19934.1, AAC49180.1, AAC49783.1, AAC49179.1, CAB60830.1, ABB71581.1, AAC49269.1, CAC19933.1, CAA54060.1, AAC72882.1, Q39513.1, AAC49784.1, AAC72883.1, Q41635.1 및 AAC49001.1, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 등록 번호를 갖는 폴리펩티드와 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 수소 산화 박테리아가 추가로 야생형 박테리아와 비교하여 E3 aceE (EC 1.2.4.1, 2.3.1.61, 2.3.1.12), E4 aceF (EC 1.2.4.1, 2.3.4.16, 2.3.1.12), E5 acpP (AAC74178), E6 fadD (EC 2.3.1.86), E7 cerl (EC 4.1.99.5), E8 fabA (EC 4.2.1.60), E9 fabB (EC 2.3.1.41), E10 fabD (EC 2.3.1.39), E11 fabG (EC 1.1.1.100), E12 fabH (EC 2.3.1.180), E13 fabI (EC 1.3.1.9), E14 fabZ (EC 4.2.1.-), E15 리파제 (EC 3.1.1.3), E16 말로닐-CoA 데카르복실라제 (EC 4.1.1.9, 4.1.1.41), E17 panD (EC 4.1.1.11), E18 panK (EC 2.7.1.33), E19 pdh (EC 1.2.4.1), E20 udhA (EC 1.6.1.1) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상 효소의 발현이 증가되도록 유전자 변형된 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 수소 산화 박테리아가 아크로모박터(Achromobacter), 아시디티오바실루스(Acidithiobacillus), 아시도보락 스(Acidovorax), 알칼리게네스(Alcaligenes), 아나베나(Anabena), 아퀴펙 스(Aquifex), 아트로박터(Arthrobacter), 아조스피릴룸(Azospirillum), 바실루 스(Bacillus), 브라디리조비움(Bradyrhizobium), 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 데르시아(Derxia), 헬리코박터(Helicobacter), 헤르바스피릴룸(Herbaspirillum), 히드로게노박터(Hydrogenobacter), 히드로게노바쿨룸(Hydrogenobaculum), 히드로게노 파가(Hydrogenophaga), 히드로게노필루스(Hydrogenophilus), 히드로게노써무 스(Hydrogenothermus), 히드로게노비브리오(Hydrogenovibrio), 이데오넬 라(Ideonella) 종 01, 키르피디아(Kyrpidia), 메탈로스파에라(Metallosphaera), 메타노브레비박터(Methanobrevibacter), 미오박테리움(Myobacterium), 노카르디 아(Nocardia), 올리고트로파(Oligotropha), 파라코쿠스(Paracoccus), 펠로모나 스(Pelomonas), 폴라로모나스(Polaromonas), 슈도모나스(Pseudomonas), 슈도노카르 디아(Pseudonocardia), 리조비움(Rhizobium), 로도코쿠스(Rhodococcus), 로도슈도 모나스(Rhodopseudomonas), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 스트렙토미세스(Streptomyces), 티오캅사(Thiocapsa), 트레포네마(Treponema), 바리오보락스(Variovorax), 크산토박터(Xanthobacter) 및 와우테르시아(Wautersia)로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 수소 산화 박테리아가 추가로 야생형 박테리아와 비교하여 효소 E21 왁스 에스테르 신타제 (EC 2.3.1.75)의 발현이 증가되도록 유전자 변형된 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 수소 산화 박테리아가 추가로 야생형 박테리아와 비교하여 효소 E26 지방산 메틸 트랜스퍼라제 (EC 2.1.1.15)의 발현이 증가되도록 유전자 변형된 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아가 ACP, Sfa 또는 이들의 조합을 코딩하는 외인성 핵 서열을 포함하는 것인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2944697A1 (en) 2014-05-13 2015-11-18 Evonik Degussa GmbH Method of producing nylon
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US10655150B2 (en) 2016-01-07 2020-05-19 Conagen Inc. Methods of making capsinoids by biosynthetic processes
AU2017299615A1 (en) 2016-07-19 2019-01-17 Conagen Inc. Method for the microbial production of specific natural capsaicinoids
CN109790106A (zh) 2016-07-27 2019-05-21 赢创德固赛有限公司 N-乙酰基高丝氨酸
WO2018119343A1 (en) * 2016-12-22 2018-06-28 Conagen Inc. Method for the microbial production of 8-methyl nonanoic acid
US11439172B2 (en) * 2017-07-03 2022-09-13 Oakbio, Inc. Microbial biomass based feed products
CN110760455B (zh) * 2019-03-04 2022-05-17 西北大学 一株产铁载体的氢氧化细菌及其分离方法和应用
CN110408641A (zh) * 2019-07-23 2019-11-05 湖北大学 一种假诺卡氏菌株的遗传转化方法及其应用
CN111057570B (zh) * 2019-11-26 2022-05-27 大连立和盈海科技有限公司 一种用于制备生物燃料的系统及方法
CN112812868B (zh) * 2021-01-11 2022-05-17 南京工业大学 Sdr家族氧化还原酶e26作为乳化剂的应用
CN116445440B (zh) * 2022-10-26 2024-01-02 华南理工大学 黏性聚羟基脂肪酸酯及其制备和应用
CN116926092B (zh) * 2022-10-28 2024-04-26 昆明理工大学 一种泛酸激酶基因RkPank及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2674489A1 (en) * 2012-06-15 2013-12-18 Evonik Industries AG Biotechnological 2-hydroxyisobutyric acid production
KR20150036502A (ko) * 2012-07-13 2015-04-07 칼리스타, 인코포레이티드 바이오리파이너리 시스템, 이의 방법 및 조성물
KR20150094741A (ko) * 2012-12-12 2015-08-19 알이지 라이프 사이언시스, 엘엘씨 지방산 유도체의 ａｃｐ­매개 생성
US9388434B2 (en) * 2013-01-28 2016-07-12 William Marsh Rice University Synthesis of short chain fatty acids from bacteria

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