KR20160057042A - 초임계 잣송이 추출물을 포함하는 체지방 감소용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명에 따른 초임계 잣송이 추출물을 포함하는 조성물은 세포 독성을 나타내지 않는 범위 내에서 지방 세포의 분화를 억제하고, 지방 세포의 분해를 촉진시킴으로써 체지방 감소용 천연 물질로 다양한 분야에 활용될 수 있다.

Description

초임계 잣송이 추출물을 포함하는 체지방 감소용 조성물{COMPOSITION FOR REDUCING BODY FAT COMPRISING SUPERCRITICAL EXTRACT OF PINE CONE}

본 발명은 초임계 잣송이 추출물을 포함하는 체지방 감소용 조성물에 관한 것이다.

비만은 에너지의 축적과 소비의 불균형으로 인하여 신체에 지방이 과도하게 축적되어 발생하는 만성 대사성 질환으로서 당뇨병, 고혈압, 심근경색, 암, 관절염 및 뇌졸중 등 다양한 합병증을 유발할 가능성이 높다고 알려져 있다. 국민건강영양조사에 따르면 비만율이 2001년도에는 32.7%에서 2005년도에는 34.9%로, 지방에너지 섭취 비중이 2001년도에는 19.5%에서 2005년도에는 20.3%로, 이는 현대인들의 서구화된 식생활에 따른 육류 등의 고칼로리 음식의 섭취량이 증가함에 따라, 비만인구가 점점 증가하고 있는 추세이다.

따라서, 비만을 해소하기 위한 방법으로 식이요법, 운동요법, 행동수정요법, 그리고 약물 및 수술요법 등 다양한 방법들이 개발되고 있다. 그 중 대표적인 약물요법으로 미국 FDA에서 승인을 받고 국내외에서 판매되고 있는 비만치료제 '제니칼’(한국로슈)과 '리덕틸'(일성신약)이 있으며, 그 외에도 프랑스에서 개발된 비처방의 약품으로 녹차 카테콜 성분을 주원료로 하는‘엑소리제’(구주제약) 등이 있다. 그러나, 제니칼의 경우 지방변 가스생성, 지용성비타민 흡수저하 등의 위장계 부작용을 일으키며, 리덕틸의 경우에는 교감신경계의 세로토닌과 노르아드레날린 농도를 증가 시킴으로써 두통, 식욕부진, 불면증 또는 변비 등의 부작용을 일으킴이 보고되어, 부작용 없는 비만 치료제로서는 한계가 존재하여 왔다. 그 외, 지방분해 효과가 알려진 아미노필린은 신경계, 순환기계, 소화기계에 걸친 폭넓은 부작용이 나타나는 것으로 알려져 있으며, 펜프루라민, 덱스펜플루라민, 토피라메이, 에페드린 및 이소프로테레놀 등도 비만치료 부적합 약물로 판정되어 식품의약품안전청에 의해 현재 판매가 금지된 상태이다.

이와 같이 약물요법에 따른 부작용으로 인하여 식품 소재를 이용한 항비만 천연물질에 대한 관심이 증가되고 있는 추세이다.

한국공개특허공보 제10-2011-0035054호

본 발명은 식품 소재를 이용한 항비만 천연 물질을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 초임계 잣송이 추출물을 포함하는 체지방 감소용 조성물이 제공될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 peroxisome proliferation activated receptors-γ (PPAR- γ), CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) 및 fatty acid synthase (FAS)로부터 선택되는 적어도 하나의 발현을 억제할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 lipoprotein lipase (LPL) 및 hormone-sensitive lipase (HSL)로부터 선택되는 적어도 하나의 발현을 증가시킬 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 추출물은 초임계 이산화탄소를 사용하여 추출될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 추출물은 150 ~ 400 bar의 압력 조건 하에서 추출될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 추출물은 31 ~ 70 ℃의 온도 조건 하에서 추출될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 추출물의 농도는 10 μg/mL 미만일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 추출물의 농도는 1 μg/mL를 초과할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 초임계 잣송이 추출물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 경구 투여용 제제가 제공될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 경구 투여용 제제의 제형은 캡슐, 정제, 알약, 드라제, 분말 또는 과립일 수 있다.

본 발명에 따른 초임계 잣송이 추출물을 포함하는 조성물은 세포 독성을 나타내지 않는 범위 내에서 지방 세포의 분화를 억제하고, 지방 세포의 분해를 촉진시킴으로써 체지방 감소용 천연 물질로 다양한 분야에 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 초임계 잣송이 추출물에 대한 세포 독성 실험(MTT assay) 결과를 나타낸 것이다.
도 2 및 도 3은 본 발명에 따른 초임계 잣송이 추출물이 지방 분화에 미치는 영향을 확인하기 위한 Oil red O staining 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 초임계 잣송이 추출물이 지방 분화에 미치는 영향을 확인하기 위한 glycerol release assay 결과를 나타낸 것이다.
도 5 내지 도 8은 본 발명에 따른 초임계 잣송이 추출물이 지방 분화에 미치는 영향을 확인하기 위한 real time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 9 및 도 10은 본 발명에 따른 초임계 잣송이 추출물이 지방 분해에 미치는 영향을 확인하기 위한 Oil red O staining 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에 따른 초임계 잣송이 추출물이 지방 분해에 미치는 영향을 확인하기 위한 glycerol release assay 결과를 나타낸 것이다.
도 12 및 도 13은 본 발명에 따른 초임계 잣송이 추출물이 지방 분해에 미치는 영향을 확인하기 위한 real time PCR 결과를 나타낸 것이다.

본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 초임계 잣송이 추출물을 포함하는 체지방 감소용 조성물이 제공될 수 있다.

초임계 잣송이 추출물은 잣을 수확하고 남겨진 잣송이를 초임계 조건 하에서 추출할 것으로서, 상기 추출물은 초임계 이산화탄소를 사용하여 추출된 것일 수 있다.

종래 일반적으로 사용되는 추출 공정은 에탄올 등과 같은 유기 용매를 사용하는데, 이 때 의약품 및 식품 가공 물질을 대상으로 하는 경우, 최종 추출물로부터 미량의 잔류 용매를 완전히 제거하는 것이 어려워 인체 유해성을 나타낼 수 있는 반면, 초임계 이산화탄소를 사용한 본 발명에 있어서, 이산화탄소는 무독성이고 상온 및 상압에서 잔존하지 않기 때문에 유기 용매를 사용하는 종래의 추출 공정보다 뛰어난 안정성을 제공할 수 있다.

또한, 유기 용매를 사용하지 않더라도 물을 이용한 열수 추출 역시 통상적으로 사용되고 있으나, 이러한 경우 최종 단계에서 원하는 추출물만을 선택적으로 얻기 위해 증류 공정을 거쳐야 한다. 게다가, 증류 공정의 경우 지속적인 상전이에 필요한 막대한 잠열 수요로 인하여 가장 많은 에너지를 필요로 하는 반면, 초임계 추출의 경우 상전이를 수반하지 않기 때문에 상기와 같은 불필요한 에너지 소비를 감소시킬 수 있다.

순수한 물질은 온도와 압력의 변화에 따라서 기체와 액체의 물성을 모두 지니는 상태가 존재하며 이를 임계점(Critical Point)라 하며, 임계점 이상의 온도와 압력 조건에 상태에 있는 유체를 초임계 유체(Supercritical Fluid)라고 한다. 초임계 유체는 온도와 압력의 변화로 물리화학적 특성(밀도, 확산계수, 열전도도, 부분 몰부피, 용해도, 수소결합의 세기 등)을 기체에서 액체까지의 넓은 범위에서 자유롭게 조절이 가능하다.

일반적으로 초임계 유체를 이용하는 공정은 고압을 유지할 수 있는 용기와 유체를 이 용기 내로 공급하며 압력을 올려줄 수 있는 가압장치가 주요 장비이다. 용기 내에 처리하고자 하는 물질이나 부품을 넣고 밀봉한 후, 가압장치를 이용하여 유체를 용기 내로 공급하여, 압력과 온도를 올려 초임계 상태로 만든다. 초임계 상태에서 일정시간 유지함으로써 원하는 추출 또는 반응 공정을 진행시킨다. 이후 한쪽으로 유체를 방출하여 용기의 압력을 낮추어 공정을 마치거나, 방출된 유체를 다시 가압장치로 보내어 용기 내부로 공급하는 순환방식의 공정으로 진행된다.

상기 추출물은 초임계 이산화탄소(임계 온도: 31.1 ℃ 임계압력: 7.4 ㎫)를 사용하여 추출한 것으로, 이와 같이 초임계 이산화탄소를 이용한 추출은 인체에 무해할 뿐 아니라 불연성이고 화학적으로 안정하며 임계 온도가 낮으므로 추출하는 활성 성분의 변질을 일으키지 않는 장점이 있다.

상기 추출물은 150 ~ 400 bar의 압력 조건 및 31 ~ 70 ℃의 온도 조건 하에서 추출될 수 있다.

잣송이를 초임계 추출할 경우, 3-carene, limonene, α-pinene과 같은 휘발성 정유들이 검출될 수 있으므로, 150 ~ 400 bar의 범위로부터 선택되는 일정한 압력 조건 하에서 추출하는 것이 바람직하며, 초임계 추출 온도는 이산화탄소의 임계 온도인 약 31 ℃ 이상으로 진행하되, 초임계 추출물의 열변성을 방지하기 위하여 70 ℃ 이하의 온도로 수행하는 것이 바람직하다.

또한, 상기의 추출 압력과 온도 조건은 용해력에 변화를 줌으로써 잣송이 중의 생리 활성, 특히 체지방 감소, 을 가지는 유효 물질의 선택적인 추출을 위한 조건에 해당한다.

상기 조성물은 상기 초임계 잣송이 추출물을 유효 성분으로 포함할 수 있다. 달리 말하면, 상기 조성물은 상기 초임계 잣송이 추출물을 유효량으로 포함할 수 있다.

여기서, 상기 "유효량"은 원하는 결과를 달성 위해 필요한, 예를 들어 대상의 지방 세포의 분화를 억제하고, 지방 세포의 분해를 촉진하기 위해 충분한 투여량 및 기간의 효과적인 양을 포함한다. 상기 추출물의 유효량은 질병 상태, 나이, 대상의 체중 및 대상에게 원하는 반응을 유도하는 추출물의 능력과 같은 요소에 따라 다양할 수 있다. 투여법은 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 또한 상기 유효량은 어떠한 독성, 또는 치료상 유용한 효과를 능가하는 본 발명에 따른 조성물의 역효과(예를 들어, 부작용)가 없는 양을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.

대상의 지방 세포의 분화를 억제하고, 지방 세포의 분해를 촉진하기 위해 충분한 투여량으로서 언급될 수 있는 유효량과 관련하여, 상기 추출물의 유효량, 즉 상기 조성물 중 상기 추출물의 농도는 10 μg/mL 미만일 수 있다. 상기 조성물 중 상기 추출물의 농도가 10 μg/mL을 초과할 경우, 세포 독성(세포 생존률 저하)이 나타날 수 있다. 또한, 상기 조성물 중 상기 추출물의 농도는 1 μg/mL를 초과할 수 있다. 상기 조성물 중 상기 추출물의 농도가 1 μg/mL 미만일 경우, 대상의 지방 세포의 분화를 억제하고, 지방 세포의 분해를 촉진하기에 불충분할 수 있다.

본 발명에 따른 초임계 잣송이 추출물 및/또는 이를 포함하는 조성물은 지방 세포(adipocyte)의 분화를 억제, 즉 지방 생성을 억제할 수 있다. 또한, 상기 추출물 및/또는 조성물은 지방 세포가 분화하는 동안, 지방의 축적 정도를 감소시킬 수 있다. 또한, 상기 추출물 및/또는 조성물은 지방 세포가 분화하는 동안, 글리세롤의 방출량을 증가시킬 수 있다.

여기서, 상기 추출물 및/또는 조성물은 지방 세포의 분화 과정 중, peroxisome proliferation activated receptors-γ (PPAR- γ) 및/또는 CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP)의 발현 정도를 감소시킴으로써 지방 세포의 분화를 억제할 수 있다. 상기 peroxisome proliferation activated receptors-γ (PPAR- γ) 및 CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP)는 지방 세포의 분화 초기에 발현되는 유전자이다.

또한, 상기 추출물 및/또는 조성물은 지방 세포의 분화 과정 중, 지방의 합성과 관련된 유전자인 fatty acid synthase (FAS)의 발현 정도를 감소시킴으로써 지방의 생성 및 축적 정도를 감소시킬 수 있다.

게다가, 상기 추출물 및/또는 조성물은 지방 세포의 분화 과정 중, 지방의 분해와 관련된 유전자인 lipoprotein lipase (LPL)의 발현 정도를 증가시킴으로써 지방의 생성 및 축적 정도를 감소시킬 수 있다.

본 발명에 따른 초임계 잣송이 추출물 및/또는 이를 포함하는 조성물은 지방 세포(adipocyte)의 분해를 촉진 또는 활성화할 수 있다. 또한, 상기 추출물 및/또는 조성물은 지방 세포가 분해되는 동안, 지방의 축적 정도를 감소시킬 수 있다. 또한, 상기 추출물 및/또는 조성물은 지방 세포가 분해되는 동안, 글리세롤의 방출량을 증가시킬 수 있다.

여기서, 상기 추출물 및/또는 조성물은 지방 세포의 분해 과정 중, 지방의 분해와 관련된 유전자인 lipoprotein lipase (LPL) 및/또는 hormone-sensitive lipase (HSL)의 발현 정도를 증가시킴으로써 지방의 분해를 촉진시킬 수 있다.

또한, 상기 추출물 및/또는 조성물은 지방의 합성 억제와 관련된 유전자인 adiponectin의 발현 정도를 증가시킴으로써 지방의 생성 및 축적 정도를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본원에 기재된 유효량의 초임계 잣송이 추출물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공될 수 있다. 상기 유효량은 상술한 바와 같이, 대상의 지방 세포의 분화를 억제하고, 지방 세포의 분해를 촉진하는데 효과적이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 조성물은 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 제제의 형태로서 대상에게 투여되고, 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 제제가 대상에게 투여된 후 적어도 12 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간, 1 주, 2 주, 3 주 또는 4 주 동안 대상에게 본 발명에 따른 조성물의 지속적인 전달을 제공하는 약학적으로 허용 가능한 제제이다.

일 실시예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 대상에게 국소, 경구, 구강 또는 설하 투여하기에 적합하다. 다른 실시예에 있어서, 하기에 상세히 기재한 바와 같이, 상기 약학적 조성물은 하기와 같이 고체 및/또는 액체 형태로 투여하기 위해 제제의 형태로 제조될 수 있다:

(1) 경구 투여, 예를 들어, 용액(수용성 또는 비수용성 용액 또는 현탁액), 정제, 볼러스, 분말, 과립, 페이스트; (2) 예를 들어, 피하, 근내 또는 정맥내 주사에 의한 비경구 투여, 예를 들어, 멸균액 또는 현탁액; (3) 국소 적용, 예를 들어, 피부에 적용되는 크림, 연고 또는 스프레이; (4) 직장내, 예를 들어, 페서리, 크림 또는 폼; 또는 (5) 에어로졸, 예를 들어, 본원의 화합물 또는 조성물을 포함하는 수용성 에어로졸, 리포좀 제제 또는 고체 입자.

본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 합리적인 이득/위험비에 비례하도록 인간 및 동물의 조직과의 접촉에 사용하기에 적합한 정상적인 의학적 판단의 범위 내의 본 발명의 추출물, 상기 추출물을 포함하는 조성물 및/또는 제제 형태를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 액체 또는 고체 필러, 희석제, 첨가제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같이 대상 화학 물질을 신체의 하나의 기관 또는 부분에서 신체의 다른 기관 또는 부분으로 운반 또는 수송하는데 관련된 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 운반체를 포함한다. 각 담체는 제제의 다른 성분과 양립 가능하고 환자에 무해하여야 한다.

약학적으로 허용 가능한 담체로서 제공될 수 있는 물질의 일부 예는: (1) 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스와 같은 당; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3) 셀룰로오스 및 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 이의 유도체; (4) 분말화된 트래거캔스; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 첨가제; (9) 낙화생유, 목화씨유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수기름 및 대두유와 같은 오일; (10) 프로필렌 글라이콜과 같은 글라이콜; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글라이콜과 같은 폴리올; (12) 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; (13) 아가; (14) 마그네슘 히드록사이드 및 알루미늄 히드록사이드와 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 증류수; (17) 등장액; (18) Ringer's 용액; (19) 에틸 알코올; (20) 포스페이트 완충용액; 및 (21) 약학적 제제에 적용될 수 있는 다른 비독성의 호환 가능한 물질을 포함한다.

또한 조성물 내에 소듐 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 습윤제, 유화제 및 윤활제뿐만 아니라 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 착향제, 방향제, 보존제 및 항산화제도 존재할 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 항산화제의 예는: (1) 아스코르빈산, 시스테인 히드로클로라이드, 소듐 비설페이트, 소듐 메타비설파이트 및 소듐 설파이트 등과 같은 수용성 항산화제; (2) 아스코르빌 팔미테이트, 뷰틸화 히드록시아니졸(BHA), 뷰틸화 히드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 및 등과 같은 지용성 항산화제; 및 (3) 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산 및 인산 등과 같은 금속 킬레이트화제를 포함한다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은 경구, 비강, (구강 및 설하를 포함하는) 국소, 직장, 에어로졸 및/또는 비경구 투여하기에 적합한 제제의 형태로 제조될 수 있다.

상기 조성물은 복용량 단위 형태로 용이하게 존재할 수 있으며, 약학 분야에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 담체 물질과 혼합되어 단일 복용 형태를 제조할 수 있는 초임계 잣송이 추출물의 양은 치료받고 있는 대상, 특정 투여법에 따라 달라질 수도 있다.

경구 투여에 적합한 본 발명의 조성물은 초임계 잣송이 추출물의 일정량을 각각 포함하는 캡슐, 교갑, 알약, 정제, (대개 수크로오스 및 아카시아 또는 트래거캔스인 착향 기재를 사용하는) 로젠지, 분말, 과립 또는 수용성 또는 비수용성 액체 내의 용액 또는 현탁액, 수중유적형 또는 유중수적형 액체 에멀젼, 엘릭서 또는 시럽, (젤라티 및 글리세린 또는 수크로오스 및 아카시아와 같은 비활성 기재를 사용하는) 파스틸 및/또는 구강세척제 등의 형태일 수 있다.

경구 투여를 위한 제제의 형태(캡슐, 정제, 알약, 드라제, 분말 및 과립 등)에 있어서, 추출물은 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트와 같은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 하기의 임의의 것과 혼합된다: (1) 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨 및/또는 규산과 같은 필러 또는 증량제; (2) 예를 들어, 카복시메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로오스 및/또는 아카시아와 같은 바인더; (3) 글리세롤과 같은 보습제; (4) 아가-아가, 칼슘 카보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염, 및 소듐 카보네이트와 같은 붕해제; (5) 파라핀과 같은 용액 완염제; (6) 4차 암모늄 화합물과 같은 흡수 촉진제; (7) 아세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제; (8) 카올린 및 벤토나이트 점토와 같은 흡수제; (9) 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글라이콜, 소듐 라우릴 설페이트 및 이의 혼합물과 같은 윤활제; 및 (10) 착색제. 또한 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 상기 약학적 조성물 완충제를 포함할 수 있다. 또한 유사한 형태의 고체 조성물은 락토오스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글라이콜 등과 같은 첨가제를 사용하는 약 및 강하게 충진된 젤라틴 캡슐에서 필러로서 적용될 수 있다.

정제는 선택적으로 하나 이상의 부성분과 압축 또는 성형되어 제조될 수 있다. 압축된 정제는 바인더(예를 들어, 젤라틴 또는 히드록시프로필메틸 셀룰로오스), 윤활제, 비활성 희석제, 보존제, 붕해제(예를 들어, 소듐 전분 글리콜레이트 또는 가교결합된 소듐 카복시메틸 셀룰로오스), 표면활성 또는 분산제를 사용하여 제조될 수 있다. 성형된 정제는 비활성 액체 희석제로 습윤된 초임계 잣송이 추출물의 분말을 적합한 기기 내에서 성형하여 제조될 수 있다.

드라제, 캡슐, 알약 및 과립과 같이 본 발명의 약학적 조성물의 정제 및 다른 고체 복용 형태는 장용 코팅 및 제약 분야에 잘 알려진 다른 코팅과 같은 코팅 및 쉘로 선택적으로 처리되거나 제조될 수 있다. 또한 이들은 예를 들어, 원하는 방출 양상, 다른 고분자 기재, 리포좀 및/또는 마이크로스피어를 제공하는 다양한 비율의 히드록시프로필메틸 셀룰로오스를 사용하여 내부의 초임계 잣송이 추출물의 지연 또는 조절 방출을 제공하기 위해 제조될 수 있다. 이들은 예를 들어, 박테리아-고정 필터를 통한 여과 또는 멸균수에 용해될 수 있거나 사용하기 바로 전 어떤 다른 멸균 주사 가능한 매체일 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태인 멸균제를 포함함으로써 멸균될 수 있다.

또한 상기 조성물은 선택적으로 불투명화제를 포함할 수 있으며, 초임계 잣송이 추출물만을, 바람직하게는 위장관의 특정 부분으로, 선택적으로, 지연 방법을 통해 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 포매 조성물의 예는 고분자 물질 및 왁스를 포함한다. 또한 상기 초임계 잣송이 추출물은 적합한 경우, 하나 이상의 상기에 기재된 첨가제를 가지는 마이크로-캡슐화 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 경구 투여를 위한 액체 복용 형태는 약학적으로 허용 가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서를 포함한다,

초임계 잣송이 추출물 외에, 상기 액체 복용 형태는 기술분야에 일반적으로 사용되는 예를 들어, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글라이콜, 1,3-뷰틸렌 글라이콜, 오일(특히, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 배아, 올리브, 카스토르 및 참기름), 글리세롤, 테트라히드로퓨릴 알코올, 폴리에틸렌 글라이콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르 및 이의 혼합인 물 또는 다른 용매, 용매화제 및 유화제와 같은 비활성 희석제를 포함할 수 있다.

비활성 희석제 외에, 상기 경구 조성물 습윤제, 에멀젼화제 및 현탁화제, 감미제, 착향제, 착색제, 방향제 및 보존제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.

초임계 잣송이 추출물 외에 현탁액은 예를 들어, 에톡시화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트래거캔스 및 이의 혼합과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 적용될 수 있는 적합한 수용성 및 비수용성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글라이콜 및 폴리에틸렌 글라이콜 등) 및 이의 적합한 혼합믈, 올리브유와 같인 식물성 오일 및 에틸 올리에이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르를 포함한다. 적합한 유동성은 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분산제의 경우 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.

상기 조성물은 보존제, 습윤제, 에멀젼화제 및 분산제와 같은 보조제를 더 포함할 수 있다. 미생물의 활동 예방은 예를 들어, 파라벤, 클로로뷰탄올 및 페놀 소르빅산과 같은 다양한 항생제 및 항진균제의 포함을 통해 이루어질 수 있다. 또한 조성물 내에 당 및 소듐 클로라이드와 같은 등장제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사 가능한 약학적 형태의 지속 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연 시키는 제제를 포함함으로써 이루어질 수 있다.

어떤 경우에 있어서, 약물의 효과를 지속시키기 위해, 피하 또는 근내 주사로부터 약물의 흡수를 느리게 하는 것이 바람직하다. 이는 미정질의 액체 현탁액 또는 낮은 수용성을 가지는 비정질 물질의 사용을 통해 이루어질 수 있다. 약물의 흡수 속도는 결국 결정 크기 및 결정 형태에 따라 달라질 수 있는 용해 속도에 의존한다. 또한, 비경구적으로 투여된 약물 형태의 지연 흡수는 운반체약물을 오일 운반체 내에 용해 또는 현탁화함에 의해 이루어질 수 있다.

주사 가능한 데포 형태(depot form)는 폴리락타이드-폴리글라이콜라이드와 같은 생분해성 고분자로 본 발명(들)의 화합물의 마이크로캡슐화 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 고분자에 대한 약물의 비율 및 적용되는 특정 고분자의 특성에 따라 약물 방출의 속도가 조절될 수 있다. 다른 생분해성 고분자의 예는 폴리(오쏘에스테르) 및 폴리(무수물)을 포함한다. 또한 주사 가능한 데포 제제는 신체 조직과 호환되는 리포좀 또는 에멀젼 내에 약물을 포함시킴으로써 제조된다.

본 발명에 따른 조성물이 사람 및 동물에게 약제로서 투여된 경우, 이는 그 자체 또는 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합된 예를 들어, 0.1 내지 15% (보다 바람직하게는, 0.5 내지 10%)의 추출물을 포함하는 약학적 조성물로서 제공될 수 있다.

선택된 투여 경로와 무관하게, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 약학적 조성물은 통상의 기술자에게 알려진 기존의 방법에 의해 약학적으로 허용 가능한 복용 형태로 제형화된다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예

1. 실험 방법

(1) 재료

3T3-L1 preadipocyte는 American Type Cultured Collection(ATCC; Rockuille, MD, USA)에서 분주받아 실험하였다. High-glucose Dulbeco's modified Eagle's medium(DMEM), new born calf serum(NCS), fetal bovine serum(FBS), PBS, penicillin-streptomycin, L-glutamin, sodium pyruvate, hepes, NEAA mixture은 Thermo scientiric(hyclone, thermo fisher scientific, MA, USA)에서 구입하였고, gentamicin reagent solution은 Gibco-BRL(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. Thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT), dimethyl sulfoixde(DMSO), insulin, dexamethasone(DEX), 3-isobutyl-1-methylzanthine(IBMX), oil red o, free glycerol reagent은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 그 외의 모든 시약 및 용매는 일급 또는 특급 이상의 등급을 사용하였다.

초임계 잣송이 추출물은 하기에 기재된 방법을 통해 제조되었다.

건조된 잣송이 5 ㎏을 분쇄기를 이용하여 직경 0.5㎝ 이하로 잘게 분쇄한 후, 10 L 초임계 추출조에 투입하고 초임계 추출조를 밀봉하였다. CO₂ 펌프(Haskel Gas Booster, Model No.:AGT-30/75)를 이용하여 CO₂ 저장소 내의 CO₂를 60 L/hr의 유량으로 초임계 추출조의 하부로 주입하였다. 이때, 초임계 추출조의 내부 압력은 150 bar이고, 내부 온도는 40 ℃였다. 초임계 추출은 420분 동안 수행되었으며, 조추출물의 성상은 녹갈색의 고점액성이었다. 150 ~ 400 bar의 압력 조건 및 40 ~ 70 ℃의 온도 조건 하에서 모두 20 종류의 시료(PC1 ~ PC 20)를 추출하였다.

(2) 3 T3 - L1 preadipocyte 배양 및 분화 유도

3T3-L1 preadipocyte (PA)를 10% newborn calf serum(NCS)과 1% penicilline-streptomycin, 1% L-glutamin, 1% sodium pyruvate, 1% hepes, 1% NEAA mixture를 함유한 High-glucose Dulbeco's modified Eagle's medium(DMEM)을 사용하여 37 ℃, 5% CO2가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 2일마다 배양액을 교환하였고 세포가 단일 층으로 플라스크 바닥에 70% 이상 부착하면 PBS 용액을 사용하여 세포표면을 세척하였으며, 0.25% trypsin-EDTA를 첨가한 뒤, 배양기에서 3분간 방치하여 세포를 분리하였다. 그 후 원심분리기(GYROZEN 416G)를 사용하여 1600 rpm에서 5분간 원심분리 하여 세포를 모았다. 이들 세포를 6 well plate(TPP)에 1 X 10⁵ cells/well이 되게끔 균등하게 분주하였고, 100% confluent 상태인 4일 후, 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% sodium pyruvate, 1% hepes, 1% NEAA mixture를 함유한 High-glucose Dulbeco's modified Eagle's medium(DMEM)에 adipogenic cocktail(MDI solution인 3-isobutyl-1-methylaxanthine(IBMX, 0,5 mM), insulin(5 μg/mL), dexabethasone(DEX, 0.25 μM)을 혼합하여 분화 유도를 시작하였다. 분화기간은 총 9일간 지속 되었으며, 분화 초기 3일 동안 매일 같은 배양액을 교환해 주었다. 분화 중기 3일 동안 배양액을 insulin (5 μg/mL)만을 포함하는 10% FBS를 함유한 DMEM으로 교환하여 매일 교환해 주었고, 분화 후기 3일 동안은 10% FBS를 함유한 DMEM 배양액으로 매일 교환해 주었다.

(3) 세포 독성 실험( MTT assay )

초임계 잣송이 추출물이 지방 세포에 독성을 나타내는지를 측정하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. MTT solution(5 mg/mL)은 PBS에 녹인 뒤 여과하여 사용하였다. 분화하기 직전의 상태인 3T3-L1 preadipocyte를 96 well plate에 1 X 10⁴ cells/well로 총 용적을 100 μL이 되도록 분주하였으며, 배양액은 10% NCS를 함유한 DMEM을 사용하였다. 12시간 동안 배양한 후 초임계 잣송이 추출물들을 각각 5, 10 μg/mL로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후, MTT reagent 20 μL를 첨가하여 빛에 의한 MTT 환원을 최소화하기 위해서 호일로 빛을 차단하고 4시간 동안 반응시켰다. 배양액과 MTT reagent를 suction하고 PBS 용액으로 2회 세척한 후, 각 well 당 DMSO 200 μL를 첨가하여 배양기에서 용해 시켰으며, 20분 후 iMARKTM Microplate Reader (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)를 이용하여 560 nm 파장에서 optical density를 측정하였다.

(4) Oil red O 염색

세포배양 및 분화 유도 protocol에 따라 분화시키면서 세포독성이 나타나지 않는 범위 내에서 추출물을 분화초기, 분화중기, 분화후기에 처리하였다. 지방 세포의 분화에 미치는 영향을 측정하기 위해 분화초기(3일째), 분화중기(6일째), 분화후기(9일째), 지방 세포의 분해에 미치는 영향을 측정하기 위해 분화후기(11일째)에 각각 Oil red O staining을 실시하였다. 배양액을 suction하고 PBS 용액으로 2회 세척 한 뒤 PBS 용액을 완전히 suction하였고, 10% formalin을 넣고 5분간 실온에서 고정시킨 후, 10% formalin을 suction하고 다시 새로운 10% formalin을 넣어 2시간 이상 실온에서 고정시켰다. 그 후 formalin을 suction하고 60% isopropanol을 넣어 바로 suction한 후 flask를 완전히 건조시켰으며, Oil red O solution 용액을 첨가하여 60분 동안 지방구를 염색하였다. 염색 후 증류수로 4번 세척하여 지방구의 세포내 축적을 현미경을 이용하여 관찰하였으며 사진촬영을 통해 육안으로 초임계 잣송이 추출물이 지방세포 분화에 미치는 영향을 관찰하였다. 지방 정량을 위해 잘 건조된 상태에서 100% isopropanol을 첨가하여 Oil red O dye를 용출한 뒤 iMARK^TM Microplate Reader (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)를 이용하여 560 nm 파장에서 optical density를 측정하였다. 이때 100% isopropanol을 blank로 사용하였다.

(5) glycerol release assay

초임계 잣송이 추출물이 지방 세포의 분화 과정 및 분해 과정에서 글리세롤 방출량에 미치는 영향은 glycerol phosphate oxidase-TRINDER 효소반응법을 적용한 free glycerol reagent를 이용하여 배양액 내 glycerol 함량을 측정하였다. 지방세포의 분화 과정에서의 glycerol을 측정하기 위해 분화초기(3일째), 분화중기(6일째), 분화후기(9일째), 지방 세포의 분해과정에서의 free glycerol을 측정하기 위해 분화후기(11일째)에 각각 배양액을 모아 사용하였다. Free glycerol reagent 800 μL과 배양액 10 μL을 혼합하여 37?에서 5분간 반응시킨 후, iMARK^TM Microplate Reader(Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)를 이용하여 560 nm 파장에서 optical density를 측정하였다. 글리세롤 함량은 유리글리세롤을 표준시약으로 사용한 표준곡선을 작성함으로써 측정하였다.

(6) RNA 추출 및 real time PCR

초임계 잣송이 추출물을 처리하였을 때 지방 대사 관여 효소의 발현을 확인하기 위해 real time PCR을 실시하였다. 지방 세포를 수집하여 RNeasy extraction kit (Qiagen, Gaithersburg, Maryland, USA)로 제조사의 protocol에 따라 RNA 추출을 실시하였다. iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 SYBR Green (iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Bio-Rad Laboratories Inc.)을 이용한 실시간 정량 PCR을 실시하였고, 기기는 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하였다. Real time PCR 반응은 총 20 μL 내에 cDNA 2 μL와 2X SYBR mix 10 μL, forward, reverse primer는 각각 100 pmol/μL를 1 μL씩 첨가하였고, 나머지는 H₂O로 채워주었다. PCR 증폭 단계는 다음과 같고 증폭 cycle은 40 cycle을 실시하였다. Hot start를 위해 95 ℃에서 8분, 증폭 단계의 denaturation을 95 ℃에서 15초, annealing을 52 ℃에서 30초, extension을 72 ℃에서 30초간 반복하며, 각 cycle의 extension 후에 값이 기록되었다. 모든 cycle이 완료된 후 primer의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석을 실시하였다. 결과의 분석은 Applied Biosystems에서 제공하는 One step system software v2.1로 분석하였다.

(7) 통계 처리

실험 결과는 SPSS (Statistical Package for the Social Science) version 20 프로그램을 이용하여 분석하였다. 모든 측정항목의 결과는 평균(mean) ± 표준편차 (standard deviation, SD)로 표시하였고 실험군간 평균의 차이는 one-way ANOVA와 Student's t-test로 유의성을 확인한 후 Duncan's multiple range test를 이용하여 사후 검증 하였으며 p<0.05 수준에서 유의성의 여부를 검증하였다.

2. 세포 독성 실험( MTT assay ) 결과

초임계 잣송이 추출물을 3T3-L1 preadipocyte에 처리 가능한 최적 농도를 알아보기 위해 MTT assay를 실시하였다. 초기 실험에서 초임계 잣송이 추출물을 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL을 실시한 결과, 3T3-L1 preadipocyte에 24시간 처리 시 세포생존율이 90% 미만임을 확인하였다(data not shown). 이에 농도를 낮춰 추출물 20가지를 3T3-L1 preadipocyte에 24시간 처리하여 세포 생존율을 측정한 결과는 도 1에 도시되어 있다. 초임계 잣송이 추출물을 5, 10 μg/mL을 처리한 결과, 10 μg/mL 이상 농도부터 세포 독성이 나타났다.

3. 초임계 잣송이 추출물이 지방 분화에 미치는 영향

(1) Oil Red O staining

초임계 잣송이 추출물이 지방 세포가 분화하는 과정에서, 지방의 축적 정도에 미치는 영향을 측정하기 위해 지방 세포가 분화하는 동안 초임계 잣송이 추출물 처리한 후, 분화초기(3일째), 분화중기(6일째), 후기(9일째)에 각각 Oil red O staining을 수행하였다. 상기 결과는 도 2 및 도 3에 나타내었다.

분화 초기의 경우, 전지방세포군(preadipocyte; PA)에 비해 지방 분화 유도군(control)이 7.4% 유의적으로 증가하였고, PC16(300 bar, 70 ℃ 추출), 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 7.7% 유의적으로 감소하였다(p<0.05). PC1 (150 bar, 40℃ 추출), 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 15.6% 유의적으로 증가하였고, PC1 5 μg/mL 처리군과 PC16 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 0.8%, 0.5% 감소하였다.

분화 중기의 경우, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 341.6% 유의적으로 증가하였고, PC1 1 μg/mL 처리군과 PC16 1 μg/mL은 지방 분화 유도군에 비해 각각 28.6%, 26.1% 유의적으로 증가하였다(p<0.05). PC1 5 μg/mL 처리군과 PC16 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 4.2%, 15.6% 유의적으로 감소하였다(p<0.05).

분화 후기의 경우, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 502.9% 유의적으로 증가하였고, PC1 1 μg/mL 처리군과 PC16 1 μg/mL은 지방 분화 유도군에 비해 각각 10.3%, 7.1% 유의적으로 증가하였다(p<0.05). PC1 5 μg/mL 처리군과 PC16 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 10.3%, 15.3% 유의적으로 감소하였다(p<0.05).

따라서, 초임계 잣송이 추출물 5 μg/mL 처리군은 지방 분화를 억제하지만, 1 μg/mL 처리군은 지방 분화를 촉진하는 것을 확인할 수 있었다.

(2) glycerol release assay

초임계 잣송이 추출물이 지방 세포의 분화과정에서 글리세롤 방출량에 미치는 영향을 알아보기 위해 분화와 동시에 각 추출물을 처리한 후, 분화 초기(3일째), 분화 중기(6일째), 분화 후기(9일째)에 배양액 내 유리 글리세롤(free glycerol)의 함량을 측정하였다. 상기 결과는 도 4에 나타내었다.

분화 초기의 경우, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 100% 유의적으로 증가하였고, PC16 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 100% 유의적으로 감소하였다(p<0.05). PC1 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 20.0% 증가하였고, PC1 5 μg/mL 처리군과 PC16 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 60.0%, 60.0% 감소하였다.

분화 중기의 경우, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 79.4% 유의적으로 증가하였고, PC1 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 24.1% 유의적으로 증가하였다(p<0.05). PC1 5 μg/mL 처리군과 PC16 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해각각 31.7%, 47.6% 유의적으로 감소하였다(p<0.05). PC16 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 15.9% 감소하였다(p<0.05).

분화 후기의 경우, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 92.5% 유의적으로 증가하였고, PC1 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 5.8% 감소하였다. PC1 1 μg/mL 처리군, PC16 1 μg/mL 처리군과 PC16 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 20.6%, 35.4%, 14.8% 유의적으로 증가하였다(p<0.05).

상기 결과를 토대로, 분화 초기와 중기에 있어서 초임계 잣송이 추출물 5 μg/mL 처리군은 지방 분화를 억제하지만, 1 μg/mL 처리군은 지방 분화를 촉진하는 것을 확인할 수 있었다.

(3) adipogenic transcription factor ( PPAR -γ C/ EBP ) 발현 측정

초임계 잣송이 추출물이 지방 세포 분화에서 분화 초기에 발현되는 유전자인 peroxisome proliferation activated receptors-γ (PPAR-γ) 및 CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) 발현에 미치는 영향을 RNA 수준에서 확인하기 위하여 real time PCR을 실시하였다. PPAR-γ에 대한 결과는 도 5, C/EBP에 대한 결과는 도 6에 나타내었다.

PPAR-γ의 발현 정도는 분화 초기의 경우, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 52.1% 유의적으로 증가하였다. PC1 1 μg/mL 처리군, PC1 5 μg/mL 처리군과 PC16 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 20.2%, 31.8%, 25.7% 유의적으로 감소하였다(p<0.05).

분화 중기의 경우, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 14.9% 감소하였으나 유의성은 나타나지 않았고, PC1 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 50.3% 유의적으로 감소하였다(p<0.05). PC1 5 μg/mL 처리군, PC16 1 μg/mL 처리군과 PC16 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 10.7%, 4.6%, 0.1% 감소하거나 증가하였으나 유의성은 나타나지 않았다(p<0.05).

분화 후기의 경우, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 81.0% 유의적으로 증가하였고, PC1 1 μg/mL 처리군, PC 5 μg/mL 처리군과 PC16 5 μg/mL처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 34.7%, 58.8%, 51.8% 유의적으로 증가하였다(p<0.05). PPC16 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 20.3% 증가하였으나 유의성은 나타나지 않았다(p<0.05).

C/EBP의 발현 정도는 분화 초기의 경우, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 72.6% 유의적으로 증가하였다(p<0.05). PC1 1 μg/mL 처리군, PC1 5 μg/mL 처리군과 PC16 1 μg/mL 처리군, PC16 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 34.5%, 58.6%, 67.0%, 37.1% 유의적으로 감소하였다(p<0.05).

분화 중기의 경우, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 56.1% 감소하였으나 유의성은 나타나지 않았고, PC16 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 71.4% 유의적으로 증가하였다(p<0.05). PC1 1 μg/mL 처리군, PC1 5 μg/mL 처리군과 PC16 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 56.8%, 45.3%, 46.2% 증가하거나 감소하였으나 유의성은 나타나지 않았다(p<0.05).

분화 후기의 경우, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 66.1% 증가하였으나 유의성은 나타나지 않았고, PC16 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 78.4% 유의적으로 감소하였다(p<0.05). PC1 1 μg/mL 처리군, PC1 5 μg/mL 처리군과 PC16 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 68.1%, 14.1%, 17.0% 감소하거나 증가하였으나 유의성은 나타나지 않았다(p<0.05).

상기 결과를 토대로, 초임계 잣송이 추출물이 지방 세포의 분화 초기 adipogenic transcription factor의 발현을 감소시켜 지방 생성을 억제할 수 있을 것으로 판단된다.

(4) FAS 의 발현 측정

초임계 잣송이 추출물이 지방세포분화에서 지방 합성 관련 유전자인 fatty acid synthase (FAS)의 발현에 미치는 영향을 RNA 수준에서 확인하기 위하여 real time PCR을 실시하였다. 상기 결과는 도 7에 나타내었다.

FAS의 발현 정도는 분화 초기의 경우, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 87.3% 유의적으로 증가하였고, PC1 5 μg/mL 처리군, PC16 1 μg/mL 처리군과, PC16 5 μg/mL 처리군이 지방 분화 유도군에 비해 각각 56.2%, 43.5%, 68.3% 유의적으로 감소하였다(p<0.05). PC1 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 34.8% 감소하였으나 유의성은 나타나지 않았다(p<0.05).

분화 중기의 경우, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 24.2% 감소하였으나 유의성은 나타나지 않았고, PC1 1 μg/mL 처리군과 PC16 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 62.8%, 41.1% 유의적으로 감소하였다(p<0.05). PC1 5 μg/mL 처리군과 PC16 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 35.5%, 27.1% 감소하였으나 유의성은 나타나지 않았다(p<0.05).

분화 후기의 경우, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 65.5% 유의적으로 증가하였고, PC16 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 59.4% 유의적으로 감소하였다(p<0.05). PC1 1 μg/mL 처리군, PC1 5 μg/mL 처리군과 PC16 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 29.4%, 9.1%, 16.6% 감소하거나 증가하였으나 유의성은 나타나지 않았다(p<0.05).

상기 결과를 토대로, 초임계 잣송이 추출물이 FAS의 발현을 감소시켜 지방 생성을 억제할 수 있을 것으로 판단된다.

(5) LPL 의 발현 측정

초임계 잣송이 추출물이 지방세포분화에서 지방분해 관련 유전자인 lipoprotein lipase (LPL)발현에 미치는 영향을 RNA 수준에서 확인하기 위하여 real time PCR을 실시하였다. 상기 결과는 도 8에 나타내었다.

LPL 발현 정도는 분화 초기의 경우, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군에서 40.6% 유의적으로 증가하였고, PC1 5 μg/mL 처리군이 지방 분화 유도군에 비해 27.1% 유의적으로 증가하였다(p<0.05). PC1 1 μg/mL 처리군, PC16 1 μg/mL 처리군과 PC16 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 2.4%, 19.9%, 17.6% 증가하였으나 유의성은 나타나지 않았다(p<0.05).

분화 중기의 경우, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 51.2% 유의적으로 감소하였다(p<0.05). PC1 1 μg/mL 처리군, PC1 5 μg/mL 처리군과 PC16 1 μg/mL 처리군, PC16 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군이 비해 각각 40.6%, 20.5%, 33.3%, 3.8% 감소하였으나 유의성은 나타나지 않았다(p<0.05)

분화 후기의 경우, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 81.0% 유의적으로 증가하였고, PC16 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 20.3% 증가하였으나 유의성은 나타나지 않았다(p<0.05). PC1 1 μg/mL 처리군, PC1 5 μg/mL 처리군과 PC16 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 34.6%, 58.8%, 51.8% 유의적으로 증가하였다.

상기 결과를 토대로, 초임계 잣송이 추출물이 LPL 유전자의 발현을 증가시켜 지방 생성 및 축적을 억제 할 수 있을 것으로 판단된다.

4. 초임계 잣송이 추출물이 지방 분해에 미치는 영향

(1) Oil Red O staining

초임계 잣송이 추출물이 지방 세포를 분해하는 과정에서, 지방의 축적 정도에 미치는 영향을 측정하기 위해, 지방 세포가 분화한 후 초임계 잣송이 추출물 처리하고, 분화 후기(11일째)에 Oil red O staining을 수행하였다. 상기 결과는 도 9 및 도 10에 나타내었다.

전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 570.2% 유의적으로 증가하였고, PC1 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 2.8% 감소하였으나 유의성은 나타나지 않았다(p<0.05). PC1 5 μg/mL 처리군, PC16 1 μg/mL 그리고 PC16 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 10.7%, 6.6%, 5.6% 유의적으로 감소하였다(p<0.05).

상기 결과를 토대로, 초임계 잣송이 추출물이 지방 세포를 분해할 수 있을 것으로 확인되었다.

(2) glycerol release assay

초임계 잣송이 추출물이 지방 세포의 분해 과정에서, 글리세롤 방출량에 미치는 영향을 측정하기 위해 분화되어 있는 지방세포에 잣송이 추출물을 처리한 후 분화 후기(11일째)에 배양액 내 유리 글리세롤의 함량을 측정하였다. 상기 결과는 도 11에 나타내었다.

전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 68.0% 유의적으로 증가하였고, PC1 1 μg/mL 처리군, PC1 5 μg/mL 처리군, PC16 1 μg/mL 그리고 PC16 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 35.0%, 8.2%, 19.3%, 28.0% 유의적으로 증가하였다(p<0.05).

상기 결과를 토대로, 초임계 잣송이 추출물이 글리세롤의 방출량을 증가시켜 지방 세포를 분해할 수 있을 것으로 확인되었다.

(3) LPL 발현 측정

초임계 잣송이 추출물이 지방 세포의 분해 과정에서 지방 분해와 관련된 유전자인 lipoprotein lipase (LPL)의 발현에 미치는 영향을 RNA 수준에서 확인하기 위하여 real time PCR을 실시하였다. 상기 결과는 도 12에 나타내었다.

LPL 발현 정도는 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 32.6% 증가하였으나 유의성은 나타나지 않았다(p<0.05). PC1 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 38.7% 유의적으로 증가하였고, PC1 1 μg/mL 처리군, PC16 1 μg/mL 처리군과 PC16 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 18.9%, 4.4%, 24.3% 감소하거나 증가하였으나 유의성은 나타나지 않았다(p<0.05).

상기 결과를 토대로, 초임계 잣송이 추출물이 LPL 유전자의 발현을 증가시켜 지방 분해를 더욱 촉진시킬 수 있을 것으로 판단된다.

(4) HSL 발현 측정

초임계 잣송이 추출물이 지방 세포의 분해 과정에서 지방 분해와 관련된 유전자인 hormone-sensitive lipase (HSL)의 발현에 미치는 영향을 RNA 수준에서 확인하기 위하여 real time PCR을 실시하였다. 상기 결과는 도 13에 나타내었다.

HSL 발현 정도는 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 90.5% 유의적으로 감소하였고, PC1 1 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 69.8% 증가하였으나 유의성은 나타나지 않았다(p<0.05). PC1 5 μg/mL 처리군, PC16 1 μg/mL 처리군과 PC16 5 μg/mL 처리군은 지방 분화 유도군에 비해 각각 94.1%, 93.0%, 88.3% 유의적으로 증가하였다(p<0.05).

따라서, 초임계 잣송이 추출물이 HSL 유전자의 발현을 증가시켜 지방 분해를 더욱 촉진 시킬 수 있을 것으로 판단된다.

이상, 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

Claims (10)

1. 초임계 잣송이 추출물을 포함하는 체지방 감소용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 peroxisome proliferation activated receptors-γ (PPAR- γ), CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) 및 fatty acid synthase (FAS)로부터 선택되는 적어도 하나의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 체지방 감소용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 lipoprotein lipase (LPL), hormone-sensitive lipase (HSL) 및 adiponectin으로부터 선택되는 적어도 하나의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 체지방 감소용 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 초임계 이산화탄소를 사용하여 추출되는 것을 특징으로 하는 체지방 감소용 조성물.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 추출물은 150 ~ 400 bar의 압력 조건 하에서 추출되는 것을 특징으로 하는 체지방 감소용 조성물.
   
6. 제4항에 있어서,
   상기 추출물은 31 ~ 70 ℃의 온도 조건 하에서 추출되는 것을 특징으로 하는 체지방 감소용 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 추출물의 농도는 10 μg/mL 미만인 체지방 감소용 조성물.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 추출물의 농도는 1 μg/mL를 초과하는 것을 특징으로 하는 체지방 감소용 조성물.
   
9. 초임계 잣송이 추출물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 경구 투여용 제제.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 경구 투여용 제제의 제형은 캡슐, 정제, 알약, 드라제, 분말 및 과립으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 경구 투여용 제제.

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