KR20160056785A - 시코닌을 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물 - Google Patents
시코닌을 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 시코닌(Shikonin)을 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 지치 유래 시코닌을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균 조성물은 항생제에 내성을 가진 황색포도상구균에 대한 항균효과가 우수하므로, 인체에 독성이 없고 부작용이 적은 항균제로 사용할 수 있으며, 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 이용하여 의약제품, 의약품, 화장품, 식품 및 동물 사료에 적용하여 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 시코닌(Shikonin)을 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항생제에 내성을 갖는 황색포도상구균에 대해 높은 항균활성을 가지는 지치(Lithospermum erythrorhizon) 유래의 시코닌(shikonin)을 유효성분으로 함유하는 항균 조성물에 관한 것이다.
자연계에 널리 분포되어 있는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus; S. aureus)은 세계적으로 널리 알려진 식중독균 중의 하나로, 황금색 색소를 생성하고 용혈성을 가지며 응고효소(coagulase)를 생성하는 종으로, 화농성질환이나 창상감염 등의 피부감염, 골관절염, 폐렴, 패혈증 등을 일으키는 병원성 높은 대표적인 유해세균으로 알려져 있다 (Kim SK et al., The Journal of the Korean Society for Microbiology, 28:251, 1993).
황색포도상구균은 일반적으로 환경에 대한 저항성이 강하여 건강한 성인의 비강, 피부, 구강 등에서도 존재하고 동물의 상처부위를 통한 전염이나 식품의 생산과정, 제조 공정 등의 여러 단계를 거치면서 식품 유통망을 타고 짧은 시간에 전국적으로 전파될 수 있으며, 전파된 황색포도상구균은 사람에게 전이되어 또 다른 매개체가 될 수 있다. 따라서 황색포도상구균과 같은 유해세균을 억제하기 위하여 사람과 동물의 질병 치료와 예방에 항생제를 사용하고 있으나, 황색포도상구균에 의한 식중독 발생률은 노로 바이러스와 살모넬라, 병원성 대장균과 함께 꾸준히 높은 수치를 나타내고 있으며 매년 발생이 증가되고 있다 (Lee JH et al., Korean Journal for Food Science of Animal Resources,30:410, 2010).
더욱이 항생제 오남용 등의 원인으로, 최근 미국이나 네덜란드 등의 국가에서는 식품과 관련한 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant S. aureus; MRSA)의 오염이 보고되고 있으며 1996년에는 반코마이신(vancomycin)에 대하여 저하된 감수성을 나타내는 황색포도상구균이 일본에서 발견된 이후, 여러 나라에서 반코마이신 내성 황색포도상구균(vancomycin-resistant S. aureus; VRSA)가 나타나기 시작하면서 슈퍼박테리아로 불리기 시작하였다 (Kang TY et al., Journal of Life Science, 2:190, 2010).
MRSA와 VRSA 같은 슈퍼박테리아는 출현 이후 지역사회에 빠르게 증가되고 광범위하게 노출되어있어 그 심각성이 점차 높아지고 있으며, 일반 황색포도상구균과 달리 세팔로스포린(cephalosporin), 엠피실린(ampicillin), 나프실린(nafcillin) 등과 같은 베타-락탐(β-lactam) 계열 항생제를 비롯하여 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 및 마크로라이드(macrolides) 계열의 항생제에 대해서도 내성을 지니고 있는 균주로 발전되어 감염증 치료에 큰 어려움을 겪고 있는 실정이다.
오늘날, 우리나라는 인구 고령화와 웰빙 (Well-being)이라는 건강 지향적 트렌드가 자리하면서, 채식위주의 음식문화와 맞물려 가공하지 않는 신선식품으로의 이용이 증가되고 있으나 유통 및 저장과정에서 황색포도상구균 등의 유해 미생물 증식에 의해 발생하기 쉬운 오염을 억제하거나 식품으로 전파되는 유해 미생물의 내성 연구는 아직 미흡한 실정이며, 그 중 공중보건학 측면에서 황색포도상구균의 내성수준은 매우 심각한 문제로 보고되고 있다 (Kim KM et al., Korean Journal of Nosocomial Infection Control, 11:79, 2006).
또한, 현재 축산에 사용되는 많은 항생제의 경우 내성률이 심각한 수준에 있으며 일부의 항생제의 경우 100% 근접해 있다. 현재 축산에서 항생제는 주로 사료 첨가제로 또는 육계의 경우 7일에서 10일 사이에 정기적으로 클리닝(Cleaning) 목적으로 사용된다. 보고에 의하면 전국 도축장에 온 소, 돼지, 닭에게서 분리한 살모넬라, 장내구균 따위의 식중독균의 항생제 내성률을 조사한 결과 닭 분변에서 나온 대장균은 퀴놀론계 항생제에 57%를 웃도는 내성률을 보였다. 이와 같이 현재 축산에 사용되고 항생제는 대부분 세균들이 내성을 지니고 있어 축산에 효과적으로 사용할 수 있는 새로운 항생제 개발이 시급하다.
최근에는 유통 및 저장 중 오염 및 품질저하를 방지하기 위하여 가열 처리나 레토르 등의 물리적 방법과 식품보존제 등의 화학합성물질을 첨가하는 방법 등이 널리 이용되고 있으나, 영양성분 파괴, 품질저하 및 독소잔류 등의 건강에 대한 안전성 문제가 제기되고 있다. 따라서 황색포도상구균과 같은 유해세균에 대한 새로운 항균물질의 개발이 시급히 요구되고 있으며, 전통적으로 감염질환의 치료에 사용되어 온 약용식물을 바탕으로 알칼로이드(alkaloid), 플라보노이드(flavonoid), 테르페노이드(terpenoid), 페놀성 화합물(phenolic compound), 퀴논(quinone), 휘발유(volatile oil) 등의 2차 대사산물 또는 그 유도체들이 후보물질로 활발히 진행되고 있다 (Kim NY et al., Journal of Life Science, 20:589, 2010).
한편, 지치(Lithospermum erythrorhizon)는 뿌리의 외피 부위에 적색 색소를 함유하고 있는 지치과(Boraginaceae) 식물에 속하는 여러 해살이 풀이며, 주로 남부지역의 야산에서 발견된다. 지치에 포함된 색소로 인해 주로 염료로 이용되고 있으며, 뿌리는 항암, 각종 감염성 질환 및 바이러스성 간염에 효과가 있다고 알려져 있다.
또한, 시코닌(shikonin; 5,8-Dihydroxy-2-(1-Hydroxy-4-Methyl-3-Penteny 1-14-Naphthoquinone)은 지치를 포함하는 지치과 식물의 뿌리에서 분리되는 적색의 나프토키논 골격을 가진 자적갈색의 침상결정으로, 지용성이 높고 벤젠, 클로로포름 등의 유기용매에 잘 녹지만 물에는 거의 녹지 않는 특징을 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 항생제 내성을 가지는 황색포도상구균에 대한 항균활성을 가지고, 기존 항생제의 부작용을 최소화한 항균 조성물을 제공하기 위해 예의 노력한 결과, 지치 유래의 시코닌(Shikonin)이 메티실린 내성 황색포도상구균에 대해 높은 항균활성을 가지는 것을 확인하였으며, 시코닌에 의한 항균활성은 황색포도상구균의 막 침투성(permeabilization) 및 황색포도상구균 유래의 펩티도글리칸(peptidoglycan)과의 결합에 의한 효과와 밀접한 관계가 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 시코닌을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 해결하려는 과제는, 상기 항균조성물을 포함하는 의료제품, 약품, 화장품, 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.
상술한 본 발명의 첫번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 시코닌을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균 조성물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 시코닌은 지치(Lithospermum erythrorhizon) 뿌리 유래일 수 있으며, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 항생제 내성 황색포도상구균은 메티실린 내성 본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 항생제 내성 황색포도상구균은 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant staphylococcus aureus)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 시코닌은 헥산(hexane), 디클로로메탄(dichloromethane), 클로로포름(chloroform), 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 및 물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출된 지치 추출물로 부터 분획된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 시코닌은 지치 추출물의 메탄올 분획물에서 분리된 것 일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 항균 조성물에 포함된 시코닌의 농도는 0.4 ~ 125 ㎍/㎖일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 항균 조성물은 막 결합 물질(membrane-binding agents) 또는 ATPase 저해제(inhibitor)를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 막 결합 물질은 황색포도상구균의 막 투과성을 증가시키는 물질인 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), TRIS(tris(hydroxymethyl)aminomethane) 또는 Triton X-100 (TX)일 수 있으며, 상기 ATPase 저해제(inhibitor)는 아지드 나트륨(sodium azide; NA) 또는 N,N '-디시클로헥실카르보디이미드(N,N '-dicyclohexylcarbodiimide; DCCD)일 수 있다.
본 발명의 두번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 상기 항균 조성물을 포함하는 의료제품, 약품, 기능성 식품, 동물성 사료를 포함한다.
본 발명의 지치 유래 시코닌을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균 조성물은 항생제에 내성을 가진 황색포도상구균에 대한 항균효과가 우수하므로, 인체에 독성이 없고 부작용이 적은 항균제로 사용할 수 있으며, 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 이용하여 의약제품, 의약품, 화장품, 식품 및 동물성 사료에 적용하여 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA)인 ATCC33591 균주에 대한 시코닌의 최소억제농도의 타임-킬(Time-kill) 곡선을 나타낸 데이터이다.
도 2는 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA)인 ATCC25923 균주에 대한 시코닌의 최소억제농도의 타임-킬(Time-kill) 곡선을 나타낸 데이터이다.
도 3은 ATPase 저해제인 DCCD 및 아지드 나트륨(sodium azide)과 시코닌을 동시에 처리하였을 때, 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 데이터이다.
도 4는 ATPase 저해제인 아지드 나트륨(a)+시코닌, DCCD(b)+시코닌을 동시에 처리하였을 때, 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 데이터이다.
도 5는 막 침투성 물질인 트리톤 X-100(triton X-100), 트리스(Tris) 및 EDTA과 시코닌의 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 데이터이다.
도 6은 막 침투성 물질인 트리스(a)+시코닌, 트리톤(b)+시코닌을 동시에 처리하였을 때, 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 데이터이다.
도 7는 메티실린 내성 황색포도상구균의 세포벽에 존재하는 펩티도글리칸(a)+시코닌, 리포폴리사카라이드(b)+시코닌을 동시에 처리하였을 때, 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 데이터이다.
도 8은 시코닌을 10시간 동안 처리하였을 때, 메티실린 내성 황색포도상구균의 TEM 이미지를 나타낸 데이터로, (A) 시코닌 미처리 메티실린 내성 황색포도상구균, (B) 7.8㎍/㎖의 시코닌을 처리한 메티실린 내성 황색포도상구균 및 (C) 15.6㎍/㎖의 시코닌을 처리한 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 TEM 이미지이다.
도 2는 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA)인 ATCC25923 균주에 대한 시코닌의 최소억제농도의 타임-킬(Time-kill) 곡선을 나타낸 데이터이다.
도 3은 ATPase 저해제인 DCCD 및 아지드 나트륨(sodium azide)과 시코닌을 동시에 처리하였을 때, 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 데이터이다.
도 4는 ATPase 저해제인 아지드 나트륨(a)+시코닌, DCCD(b)+시코닌을 동시에 처리하였을 때, 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 데이터이다.
도 5는 막 침투성 물질인 트리톤 X-100(triton X-100), 트리스(Tris) 및 EDTA과 시코닌의 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 데이터이다.
도 6은 막 침투성 물질인 트리스(a)+시코닌, 트리톤(b)+시코닌을 동시에 처리하였을 때, 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 데이터이다.
도 7는 메티실린 내성 황색포도상구균의 세포벽에 존재하는 펩티도글리칸(a)+시코닌, 리포폴리사카라이드(b)+시코닌을 동시에 처리하였을 때, 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 데이터이다.
도 8은 시코닌을 10시간 동안 처리하였을 때, 메티실린 내성 황색포도상구균의 TEM 이미지를 나타낸 데이터로, (A) 시코닌 미처리 메티실린 내성 황색포도상구균, (B) 7.8㎍/㎖의 시코닌을 처리한 메티실린 내성 황색포도상구균 및 (C) 15.6㎍/㎖의 시코닌을 처리한 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 TEM 이미지이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 현재 사용되고 있는 항생제는 대부분의 세균들이 내성을 지니고 있어, 의약, 식품뿐만 아니라, 축산분야에 효과적으로 사용할 수 있는 새로운 항생제의 개발이 시급하다.
본 발명은 지치 유래 시코닌을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 인체에 독성이 없고 부작용이 적으며 항생제에 내성을 가진 황색포도상구균에 대한 항균효과 우수한 항균활성을 가진 조성물을 제공하는 효과가 있다.
따라서, 본 발명은 시코닌(shikonin)을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균 조성물을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 항생제 내성 황색포도상구균은 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant staphylococcus aureus)일 수 있다.
본 발명의 항균 조성물은 반코마이신(vancomycin), 세팔로스포린(cephalosporin), 엠피실린(ampicillin), 나프실린(nafcillin) 등과 같은 베타-락탐(β-lactam) 계열 항생제를 비롯하여 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 및 마크로라이드(macrolides)에 내성을 가지는 황색포도상구균에 대한 항균활성을 가질 수 있으며, 특히 메티실린(Methicillin)에 내성이 있는 황색포도상구균에 대한 항균활성을 가지고 있다.
상기 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant staphylococcus aureus; MRSA)은 페니실린(메티실린, 디콜록사실린, 납실린, 옥사실린 외)과 세팔로스포린을 포함한 β-락탐계 항생물질 등 거의 모든 항생제에 강한 내성을 지닌 세균으로 대부분 병원 내 감염으로 발생한다. 또한, MRSA는 사람에게 감염되어 여러 가지 난치병을 일으키는 세균으로 다제내성 황색포도상구균 또는 '옥사실린 내성 황색포도상구균'(ORSA)이라고도 한다.
본 발명에서, 상기 시코닌은 지치(Lithospermum erythrorhizon) 유래일 수 있으며, 바람직하게는 지치 뿌리 추출물에서 분리된 것일 수 있다.
본 발명에서는 시코닌을 지치 추출물에서 분리하였지만, 상업적으로 판매되는, 예를 들어 시그마알드리치(sigma-aldrich, 미국) 등을 통해 구입하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 시코닌은 메탄올(methanol), 헥산(hexane), 디클로로메탄(dichloromethane), 클로로포름(chloroform), 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 및 물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출된 지치 추출물에서 추출 및 분획된 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 시코닌은 지치 추출물의 메탄올 분획물에서 분리된 것 일 수 있다.
본 발명의 일양태에서는 지치 뿌리 추출물로부터 시코닌 화합물을 분리 정제 하였으며, 구체적인 추출방법은 다음과 같다; (a) 건조된 지치의 뿌리를 분쇄하는 단계; (b) 상기 분쇄된 지치 가루를 메탄올(methanol), 헥산(hexane), 디클로로메탄(dichloromethane), 클로로포름(chloroform), 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 및 물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하는 단계; (c) 상기 추출된 지치 추출물을 메탄올(methanol), 헥산(hexane), 디클로로메탄(dichloromethane), 클로로포름(chloroform), 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 및 물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 분획추출하여 시코닌이 포함된 분획을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 수득한 분획물을 정제하여 시코닌을 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예에서는, 지치 추출물에서 최종적으로 메탄올 분획을 수득하였으며, 컬럼크로마토그래피 및 박층 크로마토그래피를 사용하여 최종적으로 71 ㎎의 빨간색 결정을 가진 화합물 1을 수득하였다. 상기 분리된 화합물 1을 동정한 결과, 하기 화학식 1의 구조를 가지고 있는 시코닌으로 확인되었다.
[화학식 1]
본 발명에 있어서, 상기 항균 조성물에 포함된 시코닌의 농도는 0.4 ~ 125 ㎍/㎖일 수 있으며, 바람직하게는 1.9 ~ 100 ㎍/㎖, 더 바람직하게는 3.9 ~ 31.2 ㎍/㎖일 수 있다.
상기 항균조성물에 포함된 시코닌의 농도가 0.4 ㎍/㎖ 미만일 경우 항균활성 효과가 미흡하여 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균 효과가 떨어질 수 있으며, 또한, 125 ㎍/㎖ 보다 더 높은 양의 시코닌이 포함될 수 있지만, 상기 범위로도 충분한 항균 효과를 보일 수 있다.
본 발명에서는 지치 유래 시코닌의 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant staphylococcus aureus; MRSA, 이하 'MRSA'로 표기함)에 대한 항균활성 여부를 확인하기 위해, MRSA 및 메티실린 민감성 황색포도상구균(methicillin-susceptible staphylococcus aureus; MSSA, 이하 'MSSA'로 표기함)를 사용하였으며, 일부 균주는 환자로부터 분리하여 총 8개의 균주를 준비하였으며, 표 2에서 확인한 바와 같이, 총 8개의 황색포도상구균에 대한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 이용하여 항생제 내성 여부를 확인한 결과, 1개(ATCC 25923) 이외의 균주에서는 전부 메티실린 내성이 있는 황색포도상구균임을 확인하였다.
이후 지치 유래 시코닌의 MRSA에 대한 항균효과를 알아보기 위해 균주를 억제하는 최소 억제 농도(Minimum inhibitiry concentration, MIC)를 측정하였으며, 표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 수득한 지치 유래 시코닌의 최소억제농도는 7.8 ~ 31.2 ㎍/㎖으로 확인되었으며, 메티실린 감수성 황색포도상구균뿐만 아니라, 7종의 메티실린 내성 황색포도상구균 모두에 높은 항균활성을 보이는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 타임-킬(Time-kill) 분석을 통해 시코닌의 항균활성을 측정하였으며, 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 15.6 ㎍/㎖의 시코닌을 첨가한 경우, 배양 12시간 만에 황색포도상구균이 거의 사멸한 것을 확인하였으며, 7.8 ㎍/㎖ 및 3.6 ㎍/㎖에서는 황색포도상구균의 성장에 변화가 없거나 증가한 것을 확인하였다.
즉, 본 발명에서 분리한 지치 유래 시코닌 화합물은 메티실린 내성 황색포도상구균에 대해 우수한 항균활성을 가지는 것을 확인하였으며, 시코닌은 시코닌에서 유래된 다른 다양한 유도체보다 높은 항균활성을 가지는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 항균 조성물은 막 결합 물질(membrane-binding agents) 또는 ATPase 저해제(inhibitor)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 막 결합 물질은 황색포도상구균의 막 투과성을 증가시키는 물질로, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), TRIS(tris(hydroxymethyl)aminomethane) 또는 Triton X-100 (TX)일 수 있으며, 상기 ATPase 저해제(inhibitor)는 아지드 나트륨(sodium azide; NA) 또는 N,N '-디시클로헥실카르보디이미드(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide; DCCD)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 시코닌의 항균활성이 막 투과성(membrane permeability)과 관련이 있는지 확인하기 위해, 막 결합 물질(membrane-binding agents) 또는 ATPase 저해제(inhibitor)를 처리했을 때 항균활성을 측정하였으며, 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 막 결합 물질 또는 ATPase 저해제를 시코닌과 혼합하여 사용한 경우, 시코닌 단독처리(황색포도상구균에 대한 항균활성이 미미한 농도) 하였을 때 보다, MRSA 균주에 대한 항균활성이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 막 침투 유도를 위한 막 결합물질과 시코닌을 혼합사용한 경우, MRSA 균주에 대한 시코닌의 항균활성은 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 막 결합 단백질로 알려진 EDTA, TRIS 및 TX는 시코닌과 함께 첨가되었을 때, 시코닌의 항균활성을 현저하게 강화시켰으며, 이는 시코닌의 항균활성이 막 투과성에 의존되는 것을 의미한다. 이 가설을 확인하기 위해, 황색포도상구균 세포벽 유래의 펩티도글리칸을 사용하였으며, 시코닌이 황색포도상구균에 존재하는 펩티도글리칸(peptidoglycan; PGN)에 직접적으로 결합하는지 확인하기 위해 시코닌에 다양한 농도의 펩티도글리칸을 첨가하였을 때, MRSA에 대한 항균활성을 측정하였다.
도 7a에 나타난 바와 같이, 시코닌을 처리한 MRSA에 펩티도글리칸을 첨가하게되면, 오히려 MRSA의 성장억제효과가 감소하는 것을 확인하였으며, 1.9 ~ 125 ㎍/㎖ 농도의 펩티도글리칸과 7.8 ㎍/㎖ 농도의 시코닌의 혼합에 따라 시코닌의 MRSA에 대한 항균활성이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다. 반면, 도 7b에 나타난 바와 같이, 시코닌을 처리한 MRSA에 리포폴리사카라이드를 처리하여도, MRSA 성장억제효과가 감소하지 않았다. 따라서 시코닌은 세포막에 위치한 펩티도글리칸에 직접적으로 결합하여 항균효과를 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서, 시코닌 처리에 의한 메티실린 내성 황색포도상구균의 세포막은 TEM(transmission electron microscope)를 이용하여 관찰한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 시코닌을 처리하지 않은 MRSA 균주는 별개의 격막이 관찰(도 8A)되는 반면, 7.8 ㎍/㎖ 농도의 시코닌을 처리한 경우(도 8B), MRSA 균주의 세포막이 손상된 것을 확인하였다. 또한, 15.6 ㎍/㎖ 농도의 시코닌을 처리한 경우(도 8C)에는 MRSA 균주의 세포막이 파괴되어 세포질이 분리된 것을 확인하였다.
상기의 결과는 이는 시코닌이 펩티도글리칸에 직접적으로 결합하는 것을 의미하기도 하지만, 막 결합 물질, ATPase 저해제를 인간 또는 동물에게 직접적인 해가되지 않는 농도 범위에서 시코닌과 동시에 혼합하여 사용하면, 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 높은 항균활성을 가진 항균 조성물로 사용 가능하다는 것을 의미하기도 한다.
본 발명의 두번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 상기 항균 조성물은 식품, 화장품, 의약품에 항생제 내성 황색포도상 구균에 대한 보존제(항균물질)로 사용될 수 있으며, 기존 항생제 대신 동물 사료에 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 시코닌을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 시코닌을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시코닌을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 50 ㎎/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 시코닌의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 시코닌을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물은 쥐, 생쥐, 가축 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 시코닌을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물은 화장료 조성물에 활용될 수 있으며, 상기 화장료 조성물은 화장수류, 에센스류, 크림류, 팩류, 패치류, 피부접착용 겔류, 파운데이션류, 메이크업베이스류 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있고, 통상적인 화장료 제조법에 적용시킬 수 있다. 구체적으로 액상, 크림상, 페이스트상 및 고체상 등 다양한 성상으로 적용이 가능하며, 이들 각 제형에 적합하고 당업계에 주지된 각종의 통상적인 보조제와 담체를 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
지치 추출물의 제조 및 화합물 분리
본 발명에서 사용한 지치(L. erythrorhizon) 뿌리는 국립원예특작과학원(한국) 인삼특작부로부터 얻어 지치추출물을 제조하였다.
먼저, 건조 및 분쇄된 지치 1 ㎏에 80% 메탄올(methanol; MeOH) 수용액 2 ℓ을 처리한 다음, 실온에서 24시간 동안 3회 추출한 후 여과지로 여과하였으며, 얻어진 추출물을 감압 농축하여 메탄올 추출물 350 ｇ을 수득하였다. 수득한 메탄올 추출물에 물(H2O) 500 ㎖을 처리하여 용해시킨 다음, 순수한 n-헥산(hexane) 500 ㎖을 3회 처리하여 분배추출을 수행하고, 감압농축하여 헥산분획(LEH, 31 ｇ)을 수득하였다.
상기 헥산분획은 n-헥산-에틸아세테이트(n-hexane-EtOAc; 10:1 → 5:1 → 3:1 → 1:1, 800 ㎖) 구배(gradient)를 이용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography; 5 ×20 ㎠)를 수행하였으며 총 10개의 분획을 수득하였다 (LEH1 내지 LEH10). 컬럼 크로마토그래피를 위한 실리카 겔 60(Silica gel 60; 230-400 mesh) 및 LiChroprep RP-18(40-63 ㎛)은 미국의 머크(Merck)로부터 구매하여 사용하였다.
그 중 LEH5 분획(3.5 ｇ)을 클로로포름-메탄올(CHCl3-MeOH; 10:1, 53 ℓ)를 이용하여 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(4 ×15 ㎠)를 수행하였으며, 총 8개의 소분획(LEH5-1 내지 LEH5-8)을 수득하였다. 그 후, LEH5-2 소분획(210 ㎎)을 메탄올-물(MeOH-H2O; 1:1.5, 1.5 ℓ)를 이용한 컬럼 크로마토그래피(RP-18; 4 ×6 ㎠)로 분리한 다음, 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC; RP-18 F254s, Rf: 0.50, MeOH-H2O; 1.5:1)를 이용하여 71 ㎎의 빨간색 결정을 가진 화합물 1을 수득하였다.
상기 분리된 화합물 1은 Varian Unity Inova AS 400 FT-NMR(일본)을 사용하여 NMR 스펙트럼(nuclear magnetic resonance spectra)을 분석하였으며, 또한, 질량분석계(JEOL JMS-700 mass spectrometer; 일본)을 사용하여 EIMS(electron ionization mass spectrum)을 분석하였다.
상기 화합물 1은 최대 292nm에서 UV 흡광도를 가지는 것을 확인하였으며, EIMS을 분석한 결과, 분자량은 288 [M]+ 로 확인되었다. 또한, NMR 데이터를 분석한 결과, 화합물 1은 지치에서 주요화합물로 보고되어 있는 하기 화학식 1의 구조를 가지고 있는 시코닌으로 확인되었다.
[화학식 1]
메티실린 내성 황색포도상구균 선별 및 특성 확인
2-1 : 메티실린 내성 황색포도상 구균 선별 및 배양 조건
실시예 1에서 분리한 지치 유래 시코닌의 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant staphylococcus aureus; MRSA, 이하 'MRSA'로 표기함)에 대한 항균활성 여부를 확인하기 위해, 7개의 MRSA 및 1개의 메티실린 민감성 황색포도상구균(methicillin-susceptible staphylococcus aureus; MSSA, 이하 'MSSA'로 표기함)을 준비하였다 (표 1).
ATCC 33591(MRSA 표준균주) 및 ATCC 25923(MSSA 표준균주)은 각각 MRSA 및 MSSA로 두 균주 모두 ATCC(American Type Culture Collection, 미국)으로 부터 구입하였으며, 임상적 메티실린 내성 황색포도상구균은 원광대학교 의과대학병원의 6명의 환자로부터 분리하여 사용하였다 (KWMrI strains).
모든 균주는 10% DMSO(dimethyl sulfoxide)에서 -80℃에 보관하였으며, 실험에 사용하기 위해 뮬러-힌트 배지(Mueller-Hinton broth; MH broth)에 현탁시킨 후 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 뮬러-힌트 아가(MH agar) 및 뮬러-힌트 배지(MH broth)는 미국의 디프코사(Difco Laboratories)에서 구입하여 사용하였다. 모든 균주는 MH agar에서 유지시켰으며, 항균활성 측정(antibacterial assays)은 MH broth에서 수행하였다. 균주의 성장은 600nm에서 OD(optical density) 값으로 혼탁도(turbidity)를 측정하였다.
2-2 : 메티실린 내성 유전자 확인
MRSA의 메티실린에 대한 내성은 유전체 중 mecA(Mobile genetic element A)라 불리는 내성유전자를 획득함으로써 나타난다. 또한, 메티실린의 내성을 증가시키는 보조 유전자인 femA(factor essential for methicillin resistance A)은 mecA와 협조하여 β-락탐계 항균제에 대한 내성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서는 실시예 2-1의 황색포도상구균에 대해 항생제 내성 여부를 확인하기 위하여 MecA 및 femA(β-lactamase)의 포함여부를 확인하였다.
MecA 및 femA 유전자 검출을 위해서 MH agar에서 배양하고 증식한 한개의 집락을 취하여, 300 ㎕의 세포용해버퍼(cell lysis buffer)에 혼합하였으며, 20분간 100℃로 가열한 다음, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 뒤, 상층액을 수득하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA 2 ㎕를 MRSA Primer Mix Kit (Genotek Co., 한국)를 이용하여 PCR을 시행하였다. PCR 수행을 위한 프라이머는 하기 표 1과 같으며, PCR 반응조건은 94℃에서 60초, 55℃에서 60초, 72℃에서 60초로 하여 30사이클(cycle)을 수행하였다. 증폭산물을 2% 아가로오스 겔(agarose gel)에 넣고, 0.5% Tris-borate buffer에서 25분간 전기영동하여 판독하였다.
| gene | Primer | Sequence (5'-3') | 서열번호 |
| mecA | Forward primer | ATGAGATTAGGCATCGTTTC | 서열번호 1 |
| Reverse primer | TGGATGACAGTACCTGAGCC | 서열번호 2 | |
| femA | Forward primer | CATGATGGCGAGATTACAGG | 서열번호 3 |
| Reverse primer | CGCTAAAGGTACTAACACACGG | 서열번호 4 |
상기에서 확인한 황색포도상구균의 항생제 내성 여부는 하기 표 2에 나타내었다.
| S. aureus strains | mecA gene | β-lactamase activity |
|
| MSSA | ATCC 25923 | - | - |
| MRSA | ATCC 33591 | + | + |
| Clinical isolate | KWMrI 1039 | + | - |
| KWMrI 1040 | + | + | |
| KWMrI 1041 | + | + | |
| KWMrI 1046 | + | + | |
| KWMrI 1047 | + | + | |
| KWMrI 1048 | + | - | |
상기 표 2에서 확인한 바와 같이, 총 8개의 황색포도상구균에 대한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 이용하여 항생제 내성 여부를 확인한 결과, 1개(ATCC 25923) 이외의 균주에서는 전부 메티실린 내성이 있는 황색포도상구균임을 확인할 수 있었다.
지치 유래 시코닌의 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 최소억제농도 측정
실시예 1에서 분리한 지치 유래 시코닌의 황색포도상구균에 대한 항균효과를 알아보기 위해 균주를 억제하는 최소 억제 농도(Minimum inhibitiry concentration, MIC)에 대한 실험을 진행하였다.
최소억제농도 (Minimum inhibitory concentrations, MICs)의 측정은 CLSI 가이드 라인(Clinical and Laboratory Standards Institute guidelines, 2006)에 기술된 액체배지미량희석법(broth microdilution method)에 따라 수행하였으며, 황색포도상구균에 대한 시코닌의 최소억제농도 값은 마이크로플레이트(microplate) 및 마이크로튜브(micro tube)를 이용하여 측정하였다.
실험 전, 시코닌은 DMSO(diluted using MHbroth; v/v)를 이용하여 연속 2배 희석으로 96-웰 플레이트(96 well plates)와 마이크로튜브(micro tube)에 준비하였다. 황색포도상구균 접종물들은 0.5 McFarland standard (approximately 1.58 colony-forming units (CFU)/㎖)로 조정하였으며, 최종적으로 접종물들은 약 1.56 CFU/spot로 희석되었다. 최소억제농도 값은 37℃에서 24 및 48시간 동안 배양하여 황색포도상구균의 성장이 억제되는 가장 낮은 농도로서 정의하였다.
24 및 48시간 동안 배양한 후, 20㎕(1㎎/㎖)의 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 현탁액에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 배양한 후, 육안으로 최소억제농도를 관찰하였다.
기존 항생제와의 비교를 위하여 음성대조군으로 엠피실린(Ampicillin) 및 옥사실린(oxacillin)을 사용하였으며, 황색포도상구균에 대한 최소억제농도는 상기 와 같은 방법으로 수행하였다.
| S. aureus strains | MIC (㎍/㎖) | ||||
| shikonin | ampicillin | Oxacillin | |||
| 24h | 48h | 24h | 24h | ||
| MSSA | ATCC 25923 | 7.8 | 15.6 | 0.9 | 1.9 |
| MRSA | ATCC 33591 | 15.6 | 15.6 | 125 | > 250 |
| Clinical isolate | KWMrI 1039 | 7.8 | 15.6 | 31.2 | > 250 |
| KWMrI 1040 | 15.6 | 15.6 | 31.2 | > 250 | |
| KWMrI 1041 | 15.6 | 31.2 | 62.5 | > 250 | |
| KWMrI 1046 | 31.2 | 31.2 | 250 | > 250 | |
| KWMrI 1047 | 7.8 | 15.6 | 125 | > 250 | |
| KWMrI 1048 | 31.2 | 31.2 | 62.5 | > 250 | |
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 수득한 지치 유래 시코닌의 최소억제농도는 7.8 ~ 31.2 ㎍/㎖으로 확인되었으며, 메티실린 감수성 황색포도상구균뿐만 아니라, 7종의 메티실린 내성 황색포도상구균 모두에 높은 항균활성을 보이는 것을 확인하였다.
음성대조군으로 사용한 엠피실린 및 옥사실린은 메티실린 감수성 황색포도상구균에 대해서는 최소억제농도가 각각 0.9 ㎍/㎖ 및 1.9㎍/㎖로 매우 높은 항균활성을 보인 반면, 7종의 메티실린 내성 황색포도상구균에 대해서 엠피실린의 최소억제농도는 31.2 ~ 250 ㎍/㎖으로 시코닌 보다 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성이 낮은 것을 확인하였으며, 옥사실린의 최소억제농도는 250 ㎍/㎖ 이상으로 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성이 거의 없는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명에서 사용한 균주들이 메티실린뿐만 아니라 β-lactam 계열 항생제인 옥사실린(oxacillin)에서도 내성을 보유한 것이며, 옥사실린보다 시코닌의 MRSA에 대한 항균활성이 더 우수하다는 것을 의미한다.
타임-킬(Time-kill) 분석을 통한 항균활성 평가
실험균주에 대한 타임-킬(Time-kill) 분석은 기존의 방법(V. Dubee et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 55(2):910, 2011)을 변형하여 사용하였으며, 타임-킬 곡선은 96-웰 플레이트에서의 박테리아 성장정도를 시간대 별(0, 12, 24,36, 48 시간)로 측정하여 시코닌의 항균활성을 확인하였다.
먼저, 상기 실험균주는 메티실린 내성 황색포도상구균인 ATCC 33591과 메티실린 감수성 황색포도상구균인 ATCC 25923을 사용하였으며, MH broth에 16 CFU/㎖이 되도록 희석하여 96-웰 플레이트에 분주한 다음, 37℃에서 24시간 배양하였다.
시코닌의 농도는 최소억제농도인 15.6 ㎍/㎖와 이를 기준으로 2배(7.8 ㎍/㎖) 및 4배(3.6 ㎍/㎖) 희석하여 사용하였으며, 상기에서 96-웰 플레이트에서 배양한 황색포도상구균에 첨가하여 배양하였으며, 시코닌을 첨가하지 않은 경우를 대조군으로 하였다. 배양 0, 4, 8, 12 및 48시간에 100㎕ 씩 취하여(Aliquot), MH broth에서 10배로 희석한 다음, 황색포도상구균의 생존율을 측정하였다.
균주의 생존율을 측정하기 위해, 살아있는 두 종류의 황색포도상구균의 수는 항생제가 첨가되지 않은 MH agar 플레이트를 사용하여 24시간 배양 후 측정하였다. 플레이트 상의 콜로니 수는 30 ~ 300 개가 관찰되었으며, 콜로니 수의 민감성 제한의 하한선은 100 CFU/㎖으로 하였으며, 타임-킬 측정법 각각의 실험은 최소한 3번 반복실험 하였으며, 데이터는 평균 ±표준 편차 데이터로 표현하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, MRSA ATCC 33591 균주에 15.6 ㎍/㎖의 시코닌을 첨가한 경우, 배양 12시간 만에 황색포도상구균이 거의 사멸한 것을 확인하였으며, 7.8 ㎍/㎖ 및 3.6 ㎍/㎖에서는 황색포도상구균의 성장에 변화가 없거나 증가한 것을 확인하였다. 또한, 도 2에 나타난 바와 같이, MRSA ATCC 25923 균주에 7.8 ㎍/㎖의 시코닌을 첨가한 경우, 배양 12시간 만에 황색포도상구균이 반 이상 사멸한 것을 확인하였으며, 3.9 ㎍/㎖ 및 1.9 ㎍/㎖에서는 황색포도상구균의 성장에 변화가 없거나 증가한 것을 확인하였다.
시코닌과 막 결합 물질(membrane-binding agents) 또는 ATPase 저해제(inhibitor)의 혼합효과 측정
시코닌의 항균활성이 막 투과성(membrane permeability)과 관련이 있는지 확인하기 위해, 막 결합 물질(membrane-binding agents) 또는 ATPase 저해제(inhibitor)를 처리했을 때 항균활성을 측정하였다.
막 결합 물질(membrane-binding agents)로 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid; Sigma-Aldrich; 미국), TRIS(tris(hydroxymethyl)aminomethane; Sigma-Aldrich; 미국) 및 Triton X-100 (TX; Fluka; 스위스)을 사용하였으며, ATPase 저해제(inhibitor)는 아지드 나트륨(sodium azide, NA; Sigma-Aldrich; 미국) 및 N,N '-디시클로헥실카르보디이미드(,N'-dicyclohexylcarbodiimide, DCCD; Sigma-Aldrich; 미국)을 사용하였다.대사 저해제로 박테리아 환경에서 전기 양성자 구배를 방해하여 ATP 수준을 감소시킬 수 있는 DCCD 및 NA를 ATPase 저해하기 위해 사용하였다. 막 결합물질 및 ATPase 저해제의 농도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 600nm에서 측정하였으며, 막 결합물질 및 ATPase 저해제의 선택적 농도는 황색포도상구균에 대해 어떠한 저해효과도 보이지 않는 농도로 사용하였다.
MRSA(ATCC 33591) 균주의 성장이 억제되지 않는 농도인 7.8 ㎍/㎖을 최대 농도로 하여, 실시예 4와 동일한 방법으로 배양한 MRSA 균주에 시코닌이 0, 1.9, 3.9 및 7.8 ㎍/㎖가 되도록 첨가하였으며, 각각의 시코닌 농도별로 막 결합 물질(0.001% EDTA, 0.0006% TRIS 및 0.005% TX) 또는 ATPase 저해제(0.001% NA, 0.001% DCCD)를 혼합하여 MRSA(ATCC 33591) 균주에 첨가하였다. 37℃에서 24시간 배양한 다음 마이크로플레이트 리더를 사용하여 600nm에서 흡광도를 측정하였다.
막 침투 유도에 의한 시코닌의 항균활성을 측정한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 시코닌(최대 7.8 ㎍/㎖)의 단독사용시에는 MRSA 균주에 대한 항균활성이 다소 높지 않게 관찰되지 않았으며, 막 침투 유도를 위한 막 결합물질과 시코닌을 혼합사용한 경우, MRSA 균주에 대한 시코닌의 항균활성은 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 시코닌 3.9 ㎍/㎖를 처리한 경우 음성대조군과 비교하여 크게 항균활성을 띄지 않았으나, 시코닌과 막 결합물질인 Tris/triton과 함께 처리한 경우 높은 항균활성을 띄었다.
ATPase 저해제에 의한 시코닌의 항균활성을 측정한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 시코닌(최대 7.8 ㎍/㎖)의 단독 사용시에는 MRSA 균주에 대한 항균활성이 관찰되지 않았으며, ATPase 저해제와 시코닌을 혼합사용한 경우, MRSA 균주에 대한 시코닌의 항균활성은 증가하였으나 시코닌 농도 의존적인 MRSA 성장억제효과는 확인하지 못하였다.
또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 시코닌 3.9 ㎍/㎖를 처리한 경우 음성대조군과 비교하여 크게 항균활성을 띄지 않았으나, 시코닌과 ATPase 저해제와 함께 처리한 경우 높은 항균활성을 띄었다.
즉, 막 결합물질인 EDTA, TRIS 및 TX는 시코닌의 MRSA에 대한 항균활성(성장 저해활성)을 증가시키는 것을 확인하였으며, ATPase 저해제인 NA 및 DCCD는 한계적 MRSA의 성장 저해활성을 확인하였다.
펩티도글리칸으로의 시코닌 결합능 확인
막 결합 단백질로 알려진 EDTA, TRIS 및 TX는 시코닌과 함께 첨가되었을 때, 시코닌의 항균활성을 현저하게 강화시켰으며, 이는 시코닌의 항균활성이 막 투과성에 의존되는 것을 의미한다. 이 가설을 확인하기 위해, 황색포도상구균 세포벽 유래의 펩티도글리칸을 사용하였으며, 대조군으로는 리포폴리사카라이드를 사용하였다. 시코닌이 황색포도상구균에 존재하는 펩티도글리칸(peptidoglycan; PGN)에 직접적으로 결합하는지 확인하기 위해, 공지된 방법(W. H. Zhao et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45(6):1737, 2001)으로 펩티도글리칸을 시코닌에 첨가하였다.
시코닌과의 혼합에 따른 효과를 확인하기 위해 펩티도글리칸(Sigma-Aldrich; 미국)은 1.9 ~ 125 ㎍/㎖ 농도가 되도록 연속적으로 2배씩 희석하여 7.8 ㎍/㎖ 농도로 고정한 시코닌과 혼합한 다음, 실시예 5의 방법과 동일하게 MRSA 균주(ATCC 33591)에 첨가한 후, 37℃에서 24시간 배양한 다음 마이크로플레이트 리더를 사용하여 600nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 시코닌의 펩티도글리칸으로의 직접적인 결합은 MRSA 혼합물에 첨가된 펩티도글리칸의 농도가 높아짐에 따라 관찰되었다. 시코닌을 처리한 MRSA에 펩티도글리칸을 첨가하게되면, 첨가된 펩티도글리칸 농도 의존적으로 시코닌의 항균활성이 감소하여 MRSA의 성장이 점자 증가하는 것을 확인하였다. 반면, 펩티도글리칸 단독으로 첨가하였을 때는 MRSA의 성장 저해 효과가 관찰되지 않았다. 이는 시코닌이 펩티도글리칸에 직접적으로 결합하는 것을 의미하며, 도 5에 나타난 바와 같이, 시코닌의 항균활성은 황색포도상구균의 펩티도글리칸에 직접적인 결합에 기인하고 있음을 보여준다.
반면, 도 6에 나타난 바와 같이, 리포폴리사카라이드를 처리한 실험군에서 유의한 결과가 나타나지 않았다.
시코닌 처리에 의한 황색포도상구균 세포막 변화 관찰
시코닌 처리에 의한 메티실린 내성 황색포도상구균의 세포막은 TEM(transmission electron microscope)를 이용하여 관찰하였다.
먼저, MRSA의 대수증식기배양(exponential-phase culture)는 MH broth 배지에서 하룻밤 동안 배양시킨 후 희석하여 준비한 다음, 중간-로그기(mid-logarithmic phase)에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. MH broth에서 성장한 대수기 MRSA(MHB-grown exponential-phase MRSA)에 7.8 ㎍/㎖ 및 15.6 ㎍/㎖ 농도의 시코닌을 첨가하여 10시간 동안 배양시킨 다음, 2㎖의 배양액을 10,000×ｇ에서 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 남아있는 세포 펠렛(pellets)은 Karnovsky fixative (2.5% glutaraldehyde 및 2% paraformaldehyde)를 사용하여 세포를 고정시켰으며, 투과전자현미경(Energy-Filtering Transmission Electron Microscope; LIBRA 120; Carl Zeiss, 독일)을 이용하여 관찰하였다. 투과된 전자 시그널은 전자현미경에 부착된 4 k ×4 k slow-scan charge-coupled device camera (Ultrascan 4000 SP; Gatan, 캐나다)를 이용하여 기록하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 시코닌을 처리하지 않은 MRSA 균주는 별개의 격막이 관찰(도 8A)되는 반면, 7.8 ㎍/㎖ 농도의 시코닌을 처리한 경우(도 8B), MRSA 균주의 세포막이 손상된 것을 확인하였다. 또한, 15.6 ㎍/㎖ 농도의 시코닌을 처리한 경우(도 8C)에는 MRSA 균주의 세포막이 파괴되어 세포질이 분리된 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 지치 유래 시코닌을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균 조성물은 항생제에 내성을 가진 황색포도상구균에 대한 항균효과가 우수하므로, 인체에 독성이 없고 부작용이 적은 항균제로 사용할 수 있다. 또한, 항생제 내성 황색포도상구균의 막투과성을 조절하는 물질 또는 항생제 내성 황색포도상구균 유래의 펩티도글리칸을 혼합하여 사용할 경우, 시코닌의 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성이 증가하므로, 이를 활용하여 의약제품, 약품, 화장품, 건강기능 식품에 적용하여 유용하게 활용할 수 있다.
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA
<120> Antibacterial Composition for Antibiotics Resistant
Staphylococcus aureus inhibition Comprising Shikonin
<130> 1042141
<150> KR 10-2014-0157303
<151> 2014-11-12
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MecA forward primer
<400> 1
atgagattag gcatcgtttc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MecA reverse primer
<400> 2
tggatgacag tacctgagcc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> femA forward primer
<400> 3
catgatggcg agattacagg 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> femA reverse primer
<400> 4
cgctaaaggt actaacacac gg 22
Claims (10)
- 시코닌(shikonin)을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 항생제 내성 황색포도상구균은 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant staphylococcus aureus)인 것을 특징으로 하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 시코닌은 지치(Lithospermum erythrorhizon) 뿌리 유래이며, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물.
[화학식 1]
- 제1항에 있어서, 상기 항균 조성물은 막 결합 물질(membrane-binding agents) 또는 ATPase 저해제(inhibitor)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 막 결합 물질은 황색포도상구균의 막 투과성을 증가시키는 물질인 TRIS(tris(hydroxymethyl)aminomethane) 또는 Triton X-100 (TX)이며,
ATPase 저해제는 아지드 나트륨(sodium azide; NA) 또는 N,N '-디시클로헥실카르보디이미드(N,N '-dicyclohexylcarbodiimide; DCCD)인 것을 특징으로 하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 시코닌은 항생제 내성 황색포도상구균 세포막의 펩티도글리칸(peptidoglycan)과 직접적 결합을 통해 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 포함하는 의약품.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 포함하는 화장품.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 포함하는 건강기능식품.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 포함하는 동물 사료.
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