KR101790296B1 - 네트롭신을 유효성분으로 포함하는 그람음성 세균에 대한 폴리믹신의 항균 활성을 증가시키는 조성물 - Google Patents

네트롭신을 유효성분으로 포함하는 그람음성 세균에 대한 폴리믹신의 항균 활성을 증가시키는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 네트롭신을 유효성분으로 포함하는 그람음성 세균에 대한 폴리믹신의 항균활성을 증가시키는 조성물을 제공한다. 본 발명은 그람음성 세균을 사멸 또는 증식을 억제하기 위하여 처리하는 폴리믹신 투여량을 4배 이상 낮춤으로써 투여된 개체에서 폴리믹신의 과투여량으로 인하여 발생하는 부작용을 현저히 낮출 수 있는 장점을 가지며, 본 발명의 주요성분 중 하나인 네트롭신의 투여량을 8배 이상 낮출 수 있는 효과를 동시에 발휘한다. 또한, 본 발명은 그람음성 세균으로 인하여 발생되는 질병 및 질환을 치료 또는 예방을 하기 위하여 사용되는 식품, 의약품, 사료 등과 같은 제품에 첨가제로서 사용될 수 있다.

Description

네트롭신을 유효성분으로 포함하는 그람음성 세균에 대한 폴리믹신의 항균 활성을 증가시키는 조성물{Composition for Improving Antibacterial Activity of Polymyxin against Gram-Negative Bacteria Comprising Netropsin as Effective Component}
본 발명은 네트롭신을 유효성분으로 포함하는 그람음성 세균에 대한 폴리믹신의 항균활성을 증가시키는 조성물에 관한 것이다.
폴리믹신(polymyxin)은 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa)가 생산하는 그람음성간균 및 녹농균에 유효한 펩티드계 항생물질로, 긴 소수성 꼬리를 가진 사이클릭 펩타이드의 구조를 가진 항생제이다(Dixon RA et al, J. Antimicrob ., Chemother.18(5):557-563(1986)). 또한, 폴리믹신 A, B, C, D 및 E(Colistin) 등의 성분이 있으나, B1(C56H98N16O13, 분자량 1203.49)과 B2(C55H96N16O13, 분자량 1189.47)를 주성분으로 하는 폴리믹신 B와 폴리믹신 E가 주로 내복 및 외과용로 사용되고 있다. 주사시 신장장애와 간독성를 일으키기 쉬우며, 세균세포 외막의 인지질과 결합하여 포스포리파아제를 활성화하여 세포막을 파괴하는 특징을 가진다. 폴리믹신은 패니바실러스 폴리믹사와 같은 그람양성 균에서 비 리보좀 펩타이드 합성효소 시스템에 의하여 생성되며, 많은 그람 음성 세포막 밖에 존재하는 리포폴리사카라이드 분자와의 특이성으로 인하여 그람 음성 박테리아에 대해서 선택적인 독성을 나타낼 수 있다. 그람 음성 박테리아 감염시 처방될 수 있는 제제이다. 폴리믹신 M은 마타신(mattacin)으로 알려져 있다.
하기 화학식 1은 폴리믹신 B의 화학식 구조(R가 H이면 폴리믹신 B1이고, R이 CH3이면 폴리믹신 B2임)이며, 화학식 2는 폴리믹신 E(콜리스틴 : colistin)에 대한 화학 구조이다.
Figure 112015029573062-pat00001
Figure 112015029573062-pat00002
네트롭신(netropsin)은 430.47 분자량과 C18H26N10O3 분자식(화학식 3)을 가지는 항종양성 올리고펩티드계 항생물질이며, 스트렙토마이세스 네트롭시스(Streptomyces netropsis)로부터 분리 및 동정된 후 네트롭신으로 명명되었다. 네트롭신은 콘코시딘(congocidine)과 동시에 사용된다.
생화학적으로 중요한 점은 네트롭신이 B형 2중나선 DNA의 dAdT가 풍부한 부위에 단단하게 결합하는 특성을 가지나 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 RNA와는 결합하지 않는다.
Figure 112015029573062-pat00003
한편, 항생제인 폴리믹신(Polymyxin)은 그람음성균을 저해하는 강력한 항생제로서 최후의 항생제로 불리고 있다. 강력한 효능으로 인하여 최근 대두되고 있는 항생제 다제내성 세균에 적용할 수 있을 것으로 기대되나 폴리믹신이 가지고 있는 신장독성 및 신경 독성으로 인하여 임상에서 폭넓은 사용이 어려웠다. 또한, 폴리믹신은 인간을 포함하는 포유동물을 대상으로 항생제를 투여함으로써 많은 열, 발진 및 통증 등의 많은 부작용을 동반하며 특히 심각한 신경독성과 간독성을 유발한다고 보고 되었다(Pedersen M.F. et al., Invest. Urol. 9 : p.234-237(1971)).
현재, 폴리믹신과 관련하여 그람음성 박테리아의 제거 및/또는 결장에서 그람음성 박테리아 감염의 치료를 위하여 항-그람음성 리포펩티드 항박테리아제(예컨대, 폴리믹신-유형 항박테리아제) 또는 그람음성 박테리아에 대해 효과적인 다른 펩티드 항박테리아제와 아미노글리코시드, 마크롤라이드 또는 퀴놀론 항박테리아제의 조성물이나 폴리믹신 및 유도체에 대한 정보는 한국특허공개 제10-2011-7024134호, 한국특허공개 제10-2009-0045932호 및 일본특허공개 제2011-503316호에 개시되어 있다.
그러나, 폴리믹신의 과사용으로 인하여 발생될 수 있는 부작용을 억제하고 그람음성 세균에 대한 폴리믹신의 항균활성을 증가시킬 수 있는 성분(물질) 또는 방법에 대하여 전혀 개시하고 있지 않다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 본 발명자들은 폴리믹신의 효능을 극대화시키는 한편 항생제로 인한 부작용을 최소화시킬 수 있는 물질을 개발하고자 노력하였다, 그 결과, 토양에서 분리한 방선균 대사산물인 네트롭신이 그람음성 세균에 폴리믹신과 병행처리하는 경우 그람음성 세균을 사멸 또는 증식을 억제시키기 위한 폴리믹신의 투여량을 4배 이상 낮출 수 있다는 사실을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 네트롭신(netropsin)을 유효성분으로 포함하는 그람음성 세균(gram-negative bacteria)에 대한 폴리믹신의 항균 활성을 증가시키는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 폴리믹신(polymyxin) 및 네트롭신(netropsin)을 유효성분으로 포함하는 그람음성 세균(gram-negative bacteria) 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 사료첨가제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 그람음성 세균이 존재하는 개체에 폴리믹신(polymyxin)과 네트롭신(netropsin)을 동시에 또는 상호 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는, 그람음성 세균(gram-negative bacteria)에 대한 폴리믹신의 항균 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 그람음성 세균이 존재하는 개체에 폴리믹신(polymyxin)과 네트롭신(netropsin)을 동시에 또는 상호 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는, 그람음성 세균(gram-negative bacteria)을 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 네트롭신을 유효성분으로 포함하는 그람음성 세균에 대한 폴리믹신의 항균활성을 증가시키는 조성물을 제공한다.
본 발명은 그람음성 세균을 사멸 또는 증식을 억제시키기 위하여 처리하는 폴리믹신 투여량을 4배 이상 낮춤으로써 투여된 개체(인간을 포함하는 동물)에서 폴리믹신의 과투여량으로 인하여 발생하는 부작용을 현저히 낮출 수 있는 장점을 가지며, 본 발명의 주요성분 중 하나인 네트롭신의 투여량을 8배 이상 낮출 수 있는 효과를 동시에 발휘한다.
또한, 본 발명은 그람음성 세균으로 인하여 발생되는 질병 및 질환을 치료 또는 예방을 하기 위하여 사용되는 식품, 의약품, 사료 등과 같은 제품에 첨가제로서 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서의 실시예에 대한 과정을 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명에서 (a) 1800개 균주 상에서 선발한 AN130070(Streptomyces netropsis) 균주 배양액과 폴리믹신(polymyxin)을 대장균(E. coli)에 병행처리하였을 때 폴리믹신의 항균 활성과 (b) 폴리믹신과 네트롭신(netropsin)을 대장균에 병행처리하였을 때 항균 활성을 탁도환원분석법을 이용하여 나타낸 결과이다.
도 3은 상기 도 2의 탁도환원분석법을 측정한 OD 값(대장균의 생존율)을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 AN130070(Streptomyces netropsis) 균주 배양액에서의 네트롭신에 대한 구조 및 항균 활성 테스트 결과이다. (a)는 AN130070 배양액 내에서 분리한 네트롭신의 HPLC/MS(high performance liquid chromatography/Mass Spectrometry) 분석 결과이다. (b)는 AN130070 배양액 내에서 분리한 네트롭신, 디스타마이신 및 레시트롭신에 대한 화학구조식을 나타낸 것이다. (c)는 대장균에 대한 폴리믹신 및 AN130070 배양액 내에서 분리한 네트롭신의 항균활성 결과이다.
도 5는 본 발명의 다제내성 세균 및 동물모델에서의 폴리믹신 및 네트롭신의 항균 활성에 대한 결과이다. (a) 다제내성을 가지는 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)에 폴리믹신 및 네트롭신을 처리한 후 항균 활성에 대한 결과를 탁도환원분석법을 활용하여 나타낸 결과이다. (b)는 꿀벌부채명나방 유충(Galleria mellonella)에 아시네토박터 바우마니 세균을 주입한 후 폴리믹신 및 네트롭신을 투여하였을 때 유충의 생존률을 나타낸 그래프이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 네트롭신(netropsin)을 유효성분으로 포함하는 그람음성 세균(gram-negative bacteria)에 대한 폴리믹신의 항균 활성을 증가시키는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 폴리믹신(polymyxin) 및 네트롭신(netropsin)을 유효성분으로 포함하는 그람음성 세균(gram-negative bacteria) 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 폴리믹신의 효능을 극대화시키는 한편 항생제로 인한 부작용을 최소화시킬 수 있는 물질을 개발하고자 노력하였으며, 그 결과, 토양에서 분리한 방선균 대사산물인 네트롭신이 그람음성 세균에 폴리믹신과 병행처리하는 경우 그람음성 세균을 사멸 또는 증식을 억제시키기 위하여 투여되는 폴리믹신의 양을 4배 이상 낮출 수 있다는 사실을 확인하였다.
이와 같은, 본 발명의 효과는 폴리믹신의 항균 활성을 증가시킬 수 있는 신규한 물질인 네트롭신을 추가시킴으로써 상호 시너지 작용에 의하여 발휘되는 효과이다. 따라서, 2개 이상의 공지된 항생제를 단순 혼합하는 경우에 1개의 항생제를 투여하는 것보다 2개 항생제를 투여하는 경우 항균 활성이 2배가 증가되지 않거나 항균 활성을 나타내기 위한 투여량이 감소되지 않음은 당업계에 있어서 자명한 사실이다.
또한, 본 발명은 그람음성 세균에 대한 폴리믹신의 항균 활성을 현저히 증가시킴과 동시에, 이와 같은 폴리믹신의 항균 효과를 발휘시키는 네트롭신의 항균 활성을 증가시킬 수 있는 효과를 발휘한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 그람음성 세균에 대하여 단독으로 폴리믹신을 투여하는 경우보다 그람음성 세균에 대한 폴리믹신의 항균 활성을 4배 증가시킬 뿐만 아니라 폴리믹신의 항균 활성을 증가시키는 물질인 네트롭신의 항균 활성도 동시에 8배까지 증가시킬 수 있는 효과를 발휘한다.
본 발명의 명세서에서 표현‘그람음성 세균 방제’는 그람음성 세균에 대한 항균의 의미와 혼용되어 사용될 수 있으며, 표현‘그람음성 세균(gram-negative bacteria)에 대한 폴리믹신의 항균 활성을 증가시키는’은 그람음성 세균을 사멸 또는 생장(성장)을 억제할 수 있는 폴리믹신의 투여량을 감소시키는 것과 동일한 의미로 사용될 수 있다.
본 발명에서 유효성분으로 사용하는 폴리믹신은 폴리믹신 A, 폴리믹신 B, 폴리믹신 C, 폴리믹신 D 및 폴리믹신 E를 포함하나, 바람직하게는 폴리믹신 B, 폴리믹신 E, 또는 폴리믹신 B와 폴리믹신 E를 모두 포함한다.
본 발명은 자연계에 존재하는 그람음성 세균이라면 제한 없이 모든 그람음성 세균에 대하여 항균 활성을 가지나, 바람직하게는 본 발명은 병원성(pathogenic) 그람음성 세균에 대하여 특이적인 항균 활성을 가진다.
또한, 본 발명에서 그람음성 세균은 에스케리키아 속(Escherichia sp.) 세균 및 아시네토박터 속(Acinetobacter sp.) 세균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 그람음성 세균을 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명에서의 에스케리키아 속 세균은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 에스케리키아 알버티(Escherichia albertii), 에스케리키아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리키아 페르구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리키아 헤르마니(Escherichia hermannii) 및 에스케리키아 불네리스(Escherichia vulneris)로 이루어진 군으로 선택된 하나 이상의 에스케리키아 속 세균을 포함하며, 보다 더 바람직하게는 에스케리키아 속 세균은 에스케리키아 콜리를 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명에서의 아시네토박터 속(Acinetobacter sp.) 세균은 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 아시네토박터 주니(Acinetobacter junii), 아시네토박터 보이시에리(Acinetobacter boissieri), 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus), 아시네토박터 해모리티쿠스(Acinetobacter haemolyticus), 아시네토박터 노소코미알리스(Acinetobacter nosocomialis), 아시네토박터 쉰들레리(Acinetobacter schindleri) 및 아시네토박터 유르신기(Acinetobacter ursingii)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아시네토박터 속 세균이며, 보다 더 바람직하게는 아시네토박터 바우마니이다.
본 발명은 상기 아시네토박터 속 세균에 대하여 방제활성을 나타내는 경우 다제내성(multi-drug resistance) 아시네토박터 속 세균에 대하여 특이적인 항균 활성을 가진다. 용어‘다제내성’은 2개 이상의 항생제에 내성을 가지는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 아시네토박터 속 세균에 대하여 항균 활성을 가지는 경우 아시네토박터 속 세균은 다제내성을 가지는 아시네토박터 속 세균을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 사료첨가제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 사료첨가제용 조성물로 제조되는 경우, 육상 또는 수상 동물에 대하여 사료에 혼합하여 공급할 수 있다. 본 발명에서의 사료에는 분말사료, 고형사료, 모이스트 펠릿사료, 드라이 펠릿사료, EP(Extruder Pellet) 사료, 날먹이 등이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 조성물에서의 유효성분을 포함함에 따라, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 그람음성 세균이 존재하는 개체에 폴리믹신(polymyxin)과 네트롭신(netropsin)을 동시에 또는 상호 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는, 그람음성 세균(gram-negative bacteria)에 대한 폴리믹신의 항균 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 그람음성 세균이 존재하는 개체에 폴리믹신(polymyxin)과 네트롭신(netropsin)을 동시에 또는 상호 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는, 그람음성 세균(gram-negative bacteria)을 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 그람음성 세균이 존재하는 개체에 폴리믹신을 투여하는 경우 네트롭신을 동시에 또는 상호 순차적으로 투여함으로써 그람음성 세균에 대한 폴리믹신의 항균 활성을 현저히 증가시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 그람음성 세균에 대하여 단독으로 폴리믹신을 투여하는 것보다 폴리믹신의 항균 활성을 4배 증가시킬 뿐만 아니라 폴리믹신의 항균 활성을 증가시키는 물질인 네트롭신의 항균 활성도 동시에 8배까지 증가시키는 효과를 발휘한다.
본 발명의 명세서에서 용어‘투여’는 상기 개체에 직접 또는 간접으로 투여되는 것을 포함한다. 본 발명에서 폴리믹신과 네트롭신을 개체에 투여하는 경우 직접적으로 도구(예컨대, 주사기)를 이용하여 투여하거나 타 물질과 결합 또는 운반체(carrier)에 포함되어 투여하는 것을 포함한다.
본 발명에서 폴리믹신과 네트롭신을 개체에 투여하는 경우 동시 또는 상호 순차적으로 투여하는 단계를 포함하나, 바람직하게는 폴리믹신과 네트롭신을 동시 또는 폴리믹신 투여 후 네트롭신을 순차적으로 투여하는 단계를 포함하고, 보다 바람직하게는 폴리믹신과 네트롭신을 동시에 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 명세서에서 용어‘존재하는’은 그람음성 세균이 생균 상태로 증식할 수 있는 상태를 의미한다.
본 발명의 명세서에서 용어‘개체’는 그람음성 세균이 존재할 있는 생명체를 의미하며, 생명체는 식물 또는 동물(인간을 제외함)을 한다.
본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함함에 따라, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 토양 유래 방선균 분리 및 배양
방선균(Actinomycete)은 자연계에 널리 분포하고 있으며 특히 토양에서 그 분포밀도와 다양성이 다양하게 분포하는 것으로 보고되었다. 강력한 항생제인 폴리믹신(Polymyxin)과 병행처리하여 폴리믹신의 독성을 낮추면서 항생제 효율을 높이기 위해 방선균 대사산물을 분석하였다.
다양한 조건의 환경시료에서 방선균을 분리하기 위하여 환경시료의 각 희석액 0.1 ㎖씩을 HV(humic acid vitamin) 아가 배지(Humic acid 1.0g (0.2N NaOH 10ml에 녹임), Na2HPO4 0.5g, KCl 1.71g, MgSO4·7H2O 0.05g, FeSO4·7H2O 0.01g, CaCO3 0.02g, Agar 15-20g, D.W 1L, Vitamin (각 0.5mg의 thimine-HCl, 리보플라빈, 니아신, 피리독신-HCl, 이노시톨, Ca-pantothenate, &-아미노벤조산, 및 0.25mg의 바이오틴), Cycloheximide 50ppm, Nalidixic acid 10ppm, pH 7.2)에 도말하였고, 28℃에서 7-14일간 배양한 후 방선균을 순수 분리하였다. 분리된 방선균을 Bennett's 아가 배지 상에 다시 이식하여 28℃에서 7일간 배양한 후 상이한 방선균주를 선별하였다. 선별된 방선균을 트립틱 소이 브로스(Tryptic Soy Broth, 30 g/ℓ)와 글루코스(glucose, 20 g/ℓ)를 조성으로 하는 배지에 넣고 3일간 30℃ 150 ㎖에서 진탕 배양시킨 후에, 큰 용량(1.5 ℓ)의 용기로 2차 배양시켰다.
방선균을 2차로 배양해서 얻은 배양액을 초고속원심분리기를 통해서 거름종이에 방선균주를 걸러낸 이후로 4.5 ㎛ 크기의 막 여과기를 통해 배양액만을 순수하게 분리하였다.
실시예 2 : 방선균 대사산물을 이용한 항생제 활성 증진의 검정
실시예 1에서 얻어진 1800개 균주에 대한 방선균 대사산물을 항생제와 병행처리하여 항생제 활성을 검정하였다. 항생제 폴리믹신(Polymyxin B, Polymyxin E(Colistin), Sigma Aldrich사) 250 ng/㎖, 25 ng/㎖ 및 2.5 ng/㎖과 대조군으로 항생제가 포함되지 않은 0 ng/㎖을 이용하여 다양한 항생제 농도에서의 대장균(Escherichia coli MG1655)을 O.D600 = 0.3%와 0.5%의 농도로 병행 접종하여 대사산물의 효과를 검정하였다. 대장균(항생제 포함):배양액의 부피 비율을 2:1로 유지하고 빠른 스크리닝 검정을 위하여 대장균이 생장시 테트라졸리움(tetrazolium)을 매개로 하는 발색반응을 이용하여 항생제 활성 증진효과를 검정하였다(MTT(tetrazolium-based colorimetric) 검정 방법 참조).
96 웰 플레이트를 이용하여 항생제 병행처리 시 항생제 조합에 대한 대장균에 대한 최소억제농도(Minimum Inhibitory Concentration)를 확인하였다. 96 웰 플레이트 가로축에는 폴리믹신의 최소억제 농도를 1/2씩 희석하고 세로축에는 네트롭신 혹은 배양액을 순차적으로 1/2씩 희석한 배지에 대장균과 Acinetobacter baumannii 균주를 O.D 600 = 0.3%와 0.5%로 각각 접종하였다. 이후 위에서 언급한 것처럼 테트라졸리움 발색 시약을 이용하여 최소억제농도를 확인하였다. 아울러 각각의 96 웰에 UV로 측정하여 탁도를 측정하였다.
1800개의 방선균 배양액 중에서 폴리믹신과 병행처리 시에 활성을 갖는 균주 배양액을 선발하였다. 저농도에서 항균활성을 보이는 배양액을 선발한 후에 그 중에서 활성이 가장 좋은 AN130070 균주를 선택하였다. 폴리믹신 항생제(B와 E)와 배양액을 각각 병행처리한 결과 최소억제 농도 기준(1000 ng/㎖)으로 병행 처리시 4배의 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 2의 (a)).
실시예 3 : 16S rDNA 시퀀싱과 방선균 동정
방선균 배양액의 특징을 더 알아보기 위하여 방선균을 16S rDNA 시퀀싱 방법을 이용하여 동정하였다. 세균의 리보좀(ribosomal) RNA 염기서열을 분석한 후, NCBI 사이트에서 BLAST를 시행하여 16S rDNA 서열과 가장 일치하는 균(reference)을 통해 선발된 방선균을 동정하였다.
16S rDNA 시퀀싱을 통해 AN130070 균주는 Streptomyces netropsis로 판명되었고, 이 균주가 생산한다고 알려진 네트롭신을 이용하여 탁도환원분석법을 시행하였다(도 2의 (b)). 상기 탁도환원분석법으로 측정한 OD 값을 그래프로 나타내 결과, 네트롭신의 MIC90(그람 음성 세균의 생장을 90% 저해하는데 필요한 농도)은 100㎍/ml이고, 폴리믹신의 MIC90은 500 ng/ml이었으며, 네트롭신과 폴리믹신을 병행 처리했을 때 네트롭신의 MIC90은 12.5 ㎍/ml이고, 폴리믹신의 MIC90은 125 ng/ml이므로, 폴리믹신과 네트롭신의 농도를 각각 4배 및 8배까지 경감시킬 수 있었다(도 3).
실시예 4 : 방선균 대사산물 분석을 통한 항생제 병행처리 효과를 지니는 화합물의 분리
위에서 선발된 방선균 대사산물을 고속액체 크로마토그래피(HPLC)/질량분석법(GC)을 이용하여 배양액 내에 포함된 화합물을 분리하였다. C18 컬럼(column)을 이용하여 분획 시료를 3차에 걸쳐 나누어 분획을 확보하였으며, 초기 농도(3000 ppm)에 입각하여 활성 증진 검정을 폴리믹신 농도 250 ng/㎖, 25 ng/㎖, 2.5 ng/㎖과 0 ng/㎖에서 각각의 분획 시료에 대해 동일하게 시행하였다. 마지막으로 얻은 분획시료를 질량분석법과 핵자기 공명법(NMR)을 이용하여 화합물의 정확한 구조를 규명하였다.
배양액을 HPLC/MS 법으로 분석한 결과, 네트롭신으로 추정되는 자외선 파장 대에서 네트롭신과 그 유도체에 해당하는 피크(peak)를 확인할 수 있었으며(도 4의 (a)), 네트롭신과 디스타마이신, 렉시트롭신이 그 유도체로 판명되었다(도 4의 (b)). 배양액에서 분리한 네트롭신 역시 폴리믹신과 병행 처리하는 경우 탁도환원분석법에 의한 대장균 최소억제농도를 각각 8배 및 4배 줄이는 것을 확인할 수 있었다(도 4의 (c)).
실시예 5 : 꿀벌부채명나방 유충( Galleria mellonella )를 이용한 동물모델 검정 실험
최종적으로 분리된 화합물을 동물면역 모델로 쓰이는 꿀벌부채명나방 유충을 이용하여 항생효능을 보이는 선발된 화합물과 폴리믹신 항생제를 병행처리했을 때의 효과를 최종 검정하였다. 3-4령이 된 꿀벌부채명나방 유충에 유효한 Acinetobacter baumannii 균주를 107 cfu/5 ㎕의 농도를 해밀턴 주사기를 이용하여 유충의 복부 왼쪽 면에 주입하였다. 병행 처리 효과를 확인하기 위하여 폴리믹신과 네트롭신(netropsin)으로 확인된 항생제를 각각 최소억제 농도 이하인 값인 폴리믹신(500 ng/㎖, MIC=1000 ng/㎖)과 네트롭신(100 ng/㎖, MIC=200 ng/㎖)과 두 농도를 혼합한 농도로 유충의 복부 오른쪽 면에 주입하였다. 주입한 후에 37℃ 배양기에 넣고 12시간 간격으로 유충의 생존비율을 측정하였다.
도 2에서 (a)의 방법과 같이 Acinetobacter baumannii에서도 동일한 탁도환원분석법을 시행하였다. Acinetobacter baumannii에서의 최소억제 농도를 폴리믹신에서 4배, 네트롭신에서 8배까지 줄일 수 있었다(도 5의 (a)).
동물모델인 꿀벌부채명나방을 이용한 실험에서는 병행처리 시 대조군(control, 병처리군의 40% 생존률)과 비교했을 때, 병행처리군(P500+N100) 유충의 생존률을 85%로 45% 증진시켰으며, 각각의 폴리믹신(P500)과 네트롭신(N100)과 비교시 유충의 생존률을 각각 15%와 10%로 향상시키는 효과를 나타내었다(도 5의 (b)).

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 폴리믹신(polymyxin) 및 네트롭신(netropsin)을 유효성분으로 포함하며, 폴리믹신과 네트롭신의 최소억제농도(MIC90)를 감소시키고 개체의 생존율을 증가시키는 것을 특징으로 하는 그람음성 세균(gram-negative bacteria) 방제용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리믹신은 폴리믹신 B 및 폴리믹신 E로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 그람음성 세균은 병원성 그람음성 세균인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 그람음성 세균은 에스케리키아 속(Escherichia sp.) 세균 및 아시네토박터 속(Acinetobacter sp.) 세균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 그람음성 세균인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 세균은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 에스케리키아 알버티(Escherichia albertii), 에스케리키아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리키아 페르구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리키아 헤르마니(Escherichia hermannii) 및 에스케리키아 불네리스(Escherichia vulneris)로 이루어진 군으로 선택된 하나 이상의 에스케리키아 속 세균인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 아시네토박터 속(Acinetobacter sp.) 세균은 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 아시네토박터 주니(Acinetobacter junii), 아시네토박터 보이시에리(Acinetobacter boissieri), 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus), 아시네토박터 해모리티쿠스(Acinetobacter haemolyticus), 아시네토박터 노소코미알리스(Acinetobacter nosocomialis), 아시네토박터 쉰들레리(Acinetobacter schindleri) 및 아시네토박터 유르신기(Acinetobacter ursingii)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아시네토박터 속 세균인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 아시네토박터 속 세균은 다제내성(multi-drug resistance) 아시네토박터 속 세균인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제2항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 사료첨가제용 조성물.
  10. 그람음성 세균이 존재하는 인간을 제외한 개체에 네트롭신(netropsin)을 폴리믹신(polymyxin)과 동시에 또는 상호 순차적으로 투여하여 폴리믹신과 네트롭신의 최소억제농도(MIC90)를 감소시키고 개체의 생존율을 증가시키는 것을 특징으로 하는 그람음성 세균(gram-negative bacteria)에 대한 폴리믹신의 항균 활성을 증가시키는 방법.
  11. 그람음성 세균이 존재하는 인간을 제외한 개체에 네트롭신(netropsin)을 폴리믹신(polymyxin)과 동시에 또는 상호 순차적으로 투여하여 폴리믹신과 네트롭신의 최소억제농도(MIC90)를 감소시키고 개체의 생존율을 증가시키는 것을 특징으로 하는 그람음성 세균(gram-negative bacteria)을 방제하는 방법.
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