KR20160052582A

KR20160052582A - 염증 연관 질병 치료에 사용되기 위한 피도티모드

Info

Publication number: KR20160052582A
Application number: KR1020167007206A
Authority: KR
Inventors: 아르날도 카루소; 시모나 피오렌티니
Original assignee: 폴리켐 에스.에이.
Priority date: 2013-09-10
Filing date: 2014-09-08
Publication date: 2016-05-12
Also published as: WO2015036009A1; CA2922739A1; AU2014320474A1; MX2016003195A; PH12016500472A1; HK1223041A1; CL2016000543A1; WO2015036370A1; US20160213651A1; SG11201601203TA; TW201542206A; EA201690574A1; EP3146966A1; MD20160040A2; CN105555267A; IL244435A0; EP3043796A1; PE20160649A1; JP2016529327A

Abstract

본 발명은 알레르기성 질환, 자가면역 질환과 같은 비 정규적인 NF-kB 경로의 이상 과활성이 특징인 염증 관련 질병 및, 알러지성 또는 자가면역성과는 다른 메커니즘을 기초로하는 다른 염증성 질환을 치료하기 위한, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염의 새로운 사용과 관련된다.

Description

염증 연관 질병 치료에 사용되기 위한 피도티모드 { PIDOTIMOD FOR USE IN THE TREATMENT OF INFLAMMATION-ASSOCIATED DISEASES }

호스트 감염(host infection) 동안 미생물 성분(microbial component)에 대한 인식은, 염증성 유전자 발현(inflammatory gene expression)의 유도가 뒤따르는 선천적인 면역 반응을 활성화하는데 있어서 주요한 단계이다. TLRs(toll-like receptors)가 전형적인 예인 패턴 인식 수용체(pattern-recognition receptor)는 박테리아 성분, 바이러스성 성분 및 진균 성분에 대한 호스트 반응에서 주요한 조절 인자(regulator)이다. 이러한 반응에 중심이 되는 것은, 호스트 보호(host protection), 선천 면역 세포와 적응 면역 세포 동원 및 병원체 제거에 관련된 유전자를 상향 조절(up-regulate)하는 능력이다. 비록 TLR-매개 염증 반응(TLR-mediated inflammatory response)이 병원체에 대항한 면역 방어를 제공하는데 중요하지만, 제대로 기능을 하지 않는 반응은, 패혈증, 염증 및 자가 면역으로 나타나는 급성 염증 상태 및 만성 염증 상태 모두에 이르게 할 수 있다. 따라서, TLR 반응의 강도와 지속 기간은 반드시 엄격하게 조절되어야 한다(Lord et al. 2009).

TLR 이외에도, 최근 연구에선, CATERPILLER 또는 NOD 유사 수용체(NOD-like receptor)로 알려져 있는 신규의 면역 유전자 가족의 발견과 특성화에 중점을 두고 있다. 몇몇의 NLR 유전자에서의 돌연변이는 자가 면역 및 염증을 포함하는 인간 질병 상태와 연관이 있어왔다. NLR 유전자 가족의 구성원은, 특정한 병원체-유도 산물(pathogen-derived product) 또는 다양한 병원체-유도 산물에 노출된 후에 세포 활성화를 조절하는데 연관되어 있다. NLR 유전자는 다양한 호스트 방어 프로세서를 조절하는데 연관되어 있다. NLR 유전자에 대한 관련성은 면역 및 염증 장애를 겪는 환자들에 대한 유전 분석에 의해 가장 명백하게 드러났다(Lord et al. 2009).

"NOD-like receptor, pyrin domain containing 12" (NLRP12)라고도 불리는 Monarch-1는 NLR에서 가장 잘 알려진 성분이다. NLRP12는, 인간 세포에서 TLR-유도된 NF-κB 신호 및 TNFR-유도된 신호의 네거티브 조절 인자로서 기능한다. NLRP12는 IRAK (IL-1R-associated kinase)-1 초인산화/활성화를 막으며, NIK(NF-κB-inducing kinase)를 분해시킴으로써 감소된 NF-κB 활성으로 이끈다(Lich et al. 2007).

TLR-활성화된 NF-κB 신호(TLR-activated NF-κB signaling)의 결과는 TNF-α를 포함하는 몇몇의 염증 시토카인의 생성이다. 이와 같은 시토카인의 과잉 생성은 알레르기, 자가 면역 질환 및 다른 급성/만성 염증 질환과 같은 염증성 질병의 징후 및 증상으로 이어진다. 비 정규적인 NF-kB 경로(non canonical NF-kB pathway)의 이상 과활성(aberrant hyperactivation)에 연관된 가장 중요한 질병은 다음과 같다(Imani Fooladi et al. 2013; Delunardo et al. 2013; Meneghini et al. 2013; Lv et al. 2013; Monaco et al. 2004; Zhang et al. 2013; Medeiros, LaFerla. 2013; Qu et al. 2012; Wenhong et al. 2012; Qi et al. 2012; Mori T et al. 2012) 참조):

ㆍ 알레르기성 비염, 알레르기 결막염, 아토피성 알레르기, 아토피피부염, 접촉피부염, 습진, 및/또는 알레르기성 혈관염과 같은 알레르기성 질환.

ㆍ 원형탈모증, 강직척추염(Ankylosing Spondylitis), 자가면역성 심근병(Autoimmune cardiomyopathy), 자가면역성 결합조직병(Autoimmune connective tissue disease), 자가면역성 창자병(Autoimmune enteropathy), 자가면역성 간염( Autoimmune hepatitis), 자가면역성 말초신경병(Autoimmune peripheral neuropathy), 자가면역성 췌장염(Autoimmune pancreatitis), 자가면역성 다선 증후군(Autoimmune polyendocrine syndrome), 자가면역성 혈소판감소자색반(Autoimmune thrombocytopenic purpura), 자가면역성 두드러기(Autoimmune urticaria), 자가면역성 포도막염(Autoimmune uveitis), 복강병(Celiac disease), 만성피로증후군, 낭성섬유증, 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 특발성폐섬유증(Idiopathic pulmonary fibrosis), 특발저혈소판자색반병(Idiopathic thrombocytopenic purpura), IgA 콩팥병(IgA nephropathy), 소아특발관절염(Juvenile idiopathic arthritis)(또는 소아류마티스관절염, 또는 스틸씨 병(Still’s disease)), 가와사키병(Kawasaki's disease), 편평태선(Lichen planus), 홍반성 루푸스(Lupus erythematosus), 류마티스관절염(Rheumatoid arthritis), 류마티스열(Rheumatic fever), 쇼그렌증후군, 척추관절병(Spondyloarthropathy), 측두동맥염(Temporal arteritis)(또는 거세포동맥염(giant cell arteritis)), 궤양대장염(Ulcerative colitis), 두드러기 혈관염(Urticarial vasculitis), 백반증(Vitiligo)과 같은 자가면역 질환.

ㆍ 알츠하이머병, 죽상동맥경화증(Atherosclerosis), 만성간질환(Chronic Liver Diseases), 만성 콩팥병(Chronic Nephropathy), 위염, 사구체신염(Glomerulonephritis), A형, B형 및 C형 간염, 화농성 한선염(Hydradenitis suppurativa), 저감마글로불린혈증(Hypogammaglobulinemia), 간질성방광염(Interstitial cystitis), 경화태선(Lichen sclerosus), 간 지방증(Liver steatosis), 대사증후군(Metabolic Syndrome), 비만, 파킨슨병, 보통천포창(Pemphigus vulgaris), 허혈 후 염증(Post-ischemic inflammation), 건선, 건선 관절염, 레이노현상(Raynaud phenomenon), 하지불편증후군(Restless leg syndrome), 복막후섬유증(Retroperitoneal fibrosis), 저혈소판증(Thrombocytopenia)과 같은, 알러지성 또는 자가면역성이 아닌 염증성 질환.

화학명이 (4R)-3-(5-oxo-L-prolyl)-1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid인 피도티모드(Pidotimod)는 IT1231723에서 처음으로 개시되었다. 이것은, 생체외(in vitro) 및 생체내(in vivo) 면역 조정 작용과 함께 제공되는 합성 펩타이드 유사 분자(synthetic peptide-like molecule)이다(Giagulli et al., 2009). 면역 시스템은 우리 몸과 모든 외부 물질들 간의 항상성 균형(homeostatic balance)을 유지하는데 개입한다.; 따라서 이러한 기능의 이상은, 자기-항원(self-antigens)에 대한 관용 손실(loss of tolerance)뿐만 아니라, 비-자기 구조(non-self structures)에 대한 불완전하거나 이상한 반응을 유발할 수 있다.: 어떠한 경우에서라도 , 면역 시스템 에러는 임상적으로 병의 징후로서 나타난다.

피도티모드는, 실험적 박테리아성 및 바이러스성 감염 모델에서 확인되고 많은 통제 임상 실험에서 확인되었듯이, (비록 직접적인 항균 작용 및 항바이러스 작용은 없지만) 감염성 프로세스에 대한 보호 작용을 발휘한다. 특히, 체외 연구는, NK 세포의 세포독작용(cytotoxic action)뿐만 아니라 포식세포 자극(phagocytes stimulation) 및 상대 포식세포 작용(relative phagocyte action)을 증가시키는 피도티모드 능력을 강조하였다. 게다가, 피도티모드는 특정한 자극에 의해 유도되는 항바이러스 분자(IFN-α)의 방출을 증가시키는 것으로 알려졌다(Taramelli et al. 1994).

구강 경로를 통해 정제(tablet)로 투여되는 피도티모드는, 소아 환자에서 재발하는 호흡기 감염 치료에서 높은 효능을 유도하였을 뿐만 아니라, 동물 모델에서 바이러스 감염에 대한 높은 저항을 유도하는 것으로 증명되어졌다.

본원 발명의 목적은, 알레르기성 질환, 자가면역 질환과 같은, 비 정규적인 NF-kB 경로의 이상 과활성이 특징인 염증 관련 질병 및 알러지성 또는 자가면역성과는 다른 메커니즘을 기초로하는 다른 염증성 질환을 치료하기 위한, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체(stereoisomer) 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도이다.

도 1. MonoMac 6 세포주 내에서 피도티모드 처리에 따른 특정 NLRP12 전사의 상향 조절(Up-modulaton).
도 2. 인간 일차 단핵구(human primary monocytes) 내에서 피도티모드 처리에 따른 특정 NLRP12 전사의 상향 조절.
도 3. MonoMac 6 세포주 내에서 피도티모드(PDT) 처리에 따른 NLRP12 단백질의 상향 조절(Up-modulaton). NT: 처리되지 않음(not treated). MW: 분자량(moecular weight).
도 4. 단핵구에서 피도티모드(PDT) 처리에 따른, 'TLR 작용제로 자극된 세포에 의해 유도되는 MCP-1 합성'의 감소. CTR: 대조(control)
도 5. 피도티모드(PDT)는 TLR 연류에 의해 유도된 NLRP12의 하향 조절에 대항한다. NT: 처리되지 않음(not treated). LPS: 지질다당질(lipopolysaccharide).

방어적 항균 면역 반응을 유지하는데 있어서 활성이 있다는 것 이외에도, 피도티모드는, TLR 활성으로 일어나는 염증의 제어에 연관된, NLRP12 (Monarch 1)의 전사(transcription)와 합성을 증가시킨다는 점이 놀랍게도 발견되었다. 이와 같은 피도티모드에 의해 유발된 이벤트는 TLR 자극시 면역 세포에 의해 방출되는 염증 매개체의 생산 조절로 이어진다. 따라서, 이와 같이 신규로 발혀진 메커니즘을 통해 피도티모드는 또한, NLRP12가 중대한 역할을 하는, 비 정규적인 NF-kB 경로의 이상 과활성이 특징인 염증 관련 질병의 기초가 되는 염증 경로를 완화시킬 수 있다.

이용가능한 약물 치료는, 염증 연쇄반응의 후기 작동체(late effector)에 작용한다. 예컨대 단일클론성 항체처럼 TNFα에 결합하거나, 그것의 농도를 감소시키거나, 또는 코르티코스테로이드처럼 면역 시스템(이것은 장기간 사용 후 많은 부작용의 원인이 된다)을 억제시킴으로써 작용한다.

반면에, 피도티모드는 Monarch-1을 활성화시킴으로써, NF-κB 활성의 연쇄 반응을 차단시키면서 염증 메커니즘의 매우 초기 단계에 작용할 수 있는 유일한 약물이다. 단일클론성 항체와 비교하였을 때, 이것의 효과는 더 일반적이며 하나의 염증성 시토카인에 작용되는 것이 아니다. 코르티코스테로이드와 비교하였을 때, 피도티모드는 매우 안전하고, 장기간의 코르티손(cortisone) 치료의 잘 알려진 독성효과를 유발하지 않는다.

따라서 본원 발명의 목적은, 알레르기성 질환, 자가면역 질환과 같은, 비 정규적인 NF-kB 경로의 이상 과활성이 특징인 염증 관련 질병 및 알러지성 또는 자가면역성과는 다른 메커니즘을 기초로하는 다른 염증성 질환을 치료하기 위한, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체(stereoisomer) 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도이다.

본원 발명에 따라 치료될 수 있는 알레르기성 질환은 알레르기성 비염, 알레르기 결막염, 아토피성 알레르기, 아토피피부염, 접촉피부염, 습진, 및/또는 알레르기성 혈관염으로부터 선택될 수 있다.

본원 발명에 따라 치료될 수 있는 자가면역 질환은 원형탈모증, 강직척추염, 자가면역성 심근병, 자가면역성 결합조직병, 자가면역성 창자병, 자가면역성 간염, 자가면역성 말초신경병, 자가면역성 췌장염, 자가면역성 다선 증후군, 자가면역성 혈소판감소자색반, 자가면역성 두드러기, 자가면역성 포도막염, 복강병, 만성피로증후군, 낭성섬유증, 하시모토 갑상선염, 특발성폐섬유증, 특발저혈소판자색반병, IgA 콩팥병, 소아특발관절염(또는 소아류마티스관절염, 또는 스틸씨 병), 가와사키병, 편평태선, 홍반성 루푸스, 류마티스관절염, 류마티스열, 쇼그렌증후군, 척추관절병, 측두동맥염(또는 거세포동맥염), 궤양대장염, 두드러기 혈관염, 백반증으로부터 선택될 수 있다.

본원 발명에 따라 치료될 수 있는, 알러지성 또는 자가면역성과는 다른 메커니즘에 기초를 둔 염증성 질환은, 알츠하이머병, 죽상동맥경화증, 만성간질환, 만성 콩팥병, 위염, 사구체신염, A형, B형 & C형 간염, 화농성 한선염, 저감마글로불린혈증, 간질성방광염, 경화태선, 간 지방증, 대사증후군, 비만, 파킨슨병, 보통천포창, 허혈 후 염증, 건선, 건선 관절염, 레이노현상, 하지불편증후군, 복막후섬유증, 저혈소판증으로부터 선택될 수 있다.

본원 발명의 치료를 위해, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염은 전신적으로(systemically) 또는 국소적으로(topically) 투여될 수 있다.

전신적으로 투여되는 경우, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염을 적어도 약학적으로 허용가능한 부형제(excipient) 및/또는 보조제(adjuvant)와 함께 함유하는 고체 또는 액체 제제의 형태일 수 있다.; 이와 같은 제제는, 서로 다른 경로에 따라 적절한 일반적인 제형으로, 비경구적인 경로(즉, 근육내 또는 정맥내)로 투여되거나, 장관(enteral) 경로(즉, 입 또는 직장(rectal))로 투여될 수 있다.

이와 같이 전신적으로 투여되는 고체 제제는, 50% 내지 90%, 더 바람직하게는 65% 내지 80%, 가장 바람직하게는 70% 내지 75%의 피도티모드 w/w 농도를 가질 수 있다.

이와 같이 전신적으로 투여되는 액체 제제는, 0.5% 내지 20%, 더 바람직하게는 1% 내지 10%, 가장 바람직하게는 2% 내지 8%의 피도티모드 w/w 농도를 가질 수 있다.

본 발명의 일 실시 예에 따르면, 구강으로 투여되는 경우, 피도티모드의 양, 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염의 양은 일회량 당 10 내지 1000 mg일 수 있고, 더 바람직하게는 일회량 당 50 내지 800 mg일 수 있다.

국소적으로 투여되는 경우, 그것은 피도티모드, 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염을 적어도 약학적으로 허용가능한 부형제(excipient) 및/또는 보조제(adjuvant)와 함께 함유하는 고체, 반고체 또는 액상 제제 형태일 수 있다.; 이와 같은 제제는 서로 다른 경로에 따라 투여에 적합한 일반적인 제형으로, 피부(dermal), 안구(ocular), 귀(auricular), 코(nasal), 볼(buccal), 척추내(intraspinal), 기관내(endotracheal), 질(vaginal), 방광내(intravesical), 직장(rectal) 경로로 투여될 수 있다.

이와 같은 국소적으로 투여되는 반고체 또는 액상 제제는 0.1% 내지 30%, 더 바람직하게는 1% 내지 20%, 가장 바람직하게는 5% 내지 15%의 피도티모드 w/w 농도를 가질 수 있다.

이와 같은 국소적으로 투여되는 고체 제제는 50% 내지 90%, 더 바람직하게는 65% 내지 80%, 가장 바람직하게는 70% 내지 75%의 피도티모드 w/w 농도를 가질 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 고체, 반고체 또는 액상 제제는 종래 기술에 따라 제조될 수 있고, 약학적으로 허용가능한 부형제, 보조제 및/또는 담체를 포함할 수 있으며, 또한 하나 이상의 활성 성분과 조합하여, 상호 보완적으로나 또는 어떤 경우라도 유용한 작용에 따라 포함할 수 있다.

의약 조성물 및 본 발명의 용도는 이하의 실시 예들을 통해 더 설명될 것이다. 그러나 아래의 실시 예들로 본 발명이 한정되는 것은 아니고, 설명의 목적을 위한 것이다.

실시 예 1

본 발명에 따른 피도티모드의 용도를 나타내는 피도티모드 작용은, TLR-유도 활성(TLR-induced activation)과, 인간 단핵 세포(human monocytic cells) 및 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood monocytic cell)에서의 염증을 조절할 수 있다고 실험적인 테스트에 의해 보여졌다.

1. 인간 단핵 세포의 배양. PBMCs(Peripheral blood mononuclear cells)가 말초 혈액에 의해 획득되었다(직접(freshly drawn) 또는 연막(buffy coat)에서). 그리고 (Marini et al., 2008)에 설명된 것처럼 anti-CD14 상자성 비드 (Miltenyi Biotec)를 사용하면서 포지티브 선택(positive selection)에 의해 단핵 세포가 PBMCs로부터 얻어졌다. 정화(purification)시에, 세포들은 짧게(24 내지 72 시간 동안) 완전한 세포배양액(complete culture medium)(RPMI 1640 complemented with 10% of fetal bovine serum certified low endotoxin)에서 배양되었다. 몇몇의 실험들은 아메리칸 타입 배양 컬렉션 제시(American type culture collection suggestion)에 따라 성장된 인간 단핵 세포주(MonoMac 6)에서 수행되었다.

2. 피도티모드로 세포 처리. PBMCs, 정제된 일차 인간 단핵 세포(primary human monocytes) 또는 MonoMac 6이 1 내지 25μg/mL의 농도에서 서로 다른 시간 동안 피도티모드로 처리되었다. 몇몇의 실험에선, 피도티모드 처리 시작으로부터 6 내지 48 시간 이후에, 세포들은 세척되었고, 6-24시간 동안 TLR 1-9 optimal ligand(Human TLR1-9 Agonist kit, Invivogen)의 존재와 부존재 하에서 배양되었다.

3. 피도티모드 작용에 연관된 유전자 발현의 평가. 자극시에, 세포가 수확되었고, RNAeasy mini kit (Qiagen)를 이용하여 총 RNA가 추출되었다. 그리고 RNA는 역전사되고(retro-transcribed) 증폭되었다.

제조자의 프로토콜에 따라 “Human “RT2 Profiler PCR microarray kit”를 이용하여 실시간 PCR이 수행되었다(SABbiosciences, Qiagen). 이 키트는, 염증의 매개체의 발현에 특정한 연관성을 제공하면서, 면역 반응에 연관된 유전자의 발현의 다형 해석(wide analysis)을 가능하게 한다.

4. 면역탁본법(Immunoblot)과 면역침전(immunoprecipitation) 검사. 세포 용해물(Cell lysates)이 단백질 분해효소 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail)(Roche)을 포함하는 용해 버퍼에서 제조되었다. 단백질 용해물은 SDS-PAGE (8%)에 의해 용해되었고, 5%의 BSA를 포함하는 TBS-Tween 20 (0.1%)에서 1시간 동안 미리 차단된(blocked) 니트로셀룰로스막으로 이동되었다. 세포질성 NLRP12(cytoplasmic NLRP12)의 존재를 검출하기 위해, NLRP12에 대한 염소 다클론성 항체(goat polyclonal antibody)으로 첫번째 배양이 있었고, 당나귀-항-염소-HRP 2차 항체(nkey-anti-goat-HRP secondary antibody)의 첨가가 뒤따랐다. 면역 침전 연구를 위해, 12 시간 동안 4°C에서, NLRP12에 대한 토끼 다클론성 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 20μl의 단백질 A/G 코팅된 비드(protein A/G coated bead)(protein A/G plus, Santa Cruz Biotechnology)의 존재하에 단백질을 침전시켰다. 단백질 복합체가 4번 내지 6번 세척되었고, 95 °C 에서 5분 동안 배양되었고, 상술한 것처럼 면역 탁본에 의해 용해되었다.

5. 전사 배열(Transcription array). LPS 또는 다른 PAMP와 같은 잠재적 위험 신호에 의해 유발된 염증을 감소시키는 피도티모드 능력이, 작동체 염증 분자(effector inflammatory molecule)에 대하여 특이적인 mRNA의 레벨을 평가함으로써 강조되었다. 이 범위에서 전체 RNA가 반자동 추출 시스템 NucliSens Easymag (Biomerieux)을 사용하여 추출되었다. 그리고 RNA는, “High capacity cDNA Reverse Transcription Kit”(Applied Biosystem)를 사용하여 cDNA에서 역전사 되었다. 유전자 발현 연구를 수행하기 위해, 치료되거나 치료되지 않은 세포에서 얻어진 cDNA가 Taqman 프라이머-프로브 세트(Taqman primers-probe sets)(Applied Biosystem)를 사용하여 PCR 대상이 되었다. 얻어진 결과는 상대 정량 연구 소프트웨어(Relative Quantification Study software)(Applied Biosystems)를 사용하는 2^-ΔΔCt방법을 사용하여 분석되었다. 각 유전자에 대한 Ct 값은 β-활성(β-actin)에 대한 Ct 값으로 정규화(normalized)되었다.

6. TLR 자극에 의해 유도된 향염증성 분자(proinflammatory molecule)의 정량화(quantification)를 위한 ELISA.

시토카인 합성의 증가는 TLR 자극에 대한 세포성 반응의 신호이다. 피도티모드는, TLR 활성에 의해 트리거된 염증성 신호의 증폭을 감소시키는 NLRP12의 발현을 상향조절함으로써 염증의 정도를 규율한다. PBMC 및/또는 정제된 단핵구는, 1-25 μg/mL 피도티모드로 사전 처리되거나 처리되지 않은 상태에서 각 TLR 리간드의 최적의 농도로 자극되거나 자극되지 않는다. 그리고 새포 배양의 상청액(supernatant)이 자극 시작으로부터 24시간 뒤에 수집되었다. IL-6, IL-8, TNF-α, MCP-1 및 IL-1β의 존재가 ELISA 검사 (Endogen)를 통해 배양 배지에서 정량화되었다.

결과

생체외(In-vitro) 연구는 인간 Monomac 6 세포(human Monomac 6 cell)에 대한 피도티모드의 직접적인 생물학적 활성, 및 호스트에 해로운 지나치게 열성적인 염증 반응을 조절하는 그것의 능력을 보여줬다. 이것은, TLR 자극에 의해 유도된 염증 단계와, 시토카인 및 키모카인(chemokine)의 방출에 있어서 그것이 피도티모드 처리에 의해 어떻게 조절되는지를 생체외 모니터링함으로써 수행되었다. 또한, 피도티모드 활성의 관찰은, 그 화합물로 처리된 후에 이어지는 그것의 전사 및 발현을 증가시키는 피도티모드의 능력을 연구함으로써 NLRP12의 평가를 통해 일어났다.

그리고 패턴 인식 수용체 연관 경로(Pattern Recognition Receptor-related pathway)의 활성에 연관된 유전자의 패널의 발현이 전사 어레이(transcriptional array)를 이용하여 분석되었다. 16 시간 동안의 처리 이후에, 피도티모드(25μg/ml)는 NOD 유사 수용체 NLRP12 발현의 현저한 증가를 유도할 수 있었다. 피도티모드-자극된 세포에서의 유전자 어레이에서, 자극되지 않은 것과 비교하여 관찰된 두 배의 NLRP12 mRNA 증가는 특정한 정량 실시간 PCR 분석(quantitative Real-Time PCR assay)에 의해 확인되었다. 상이한 피도티모드 농도들(25, 5, 및 1 μg/ml)로 처리된 세포들에 대한 상이한 자극 시점(6, 16, 24, 및 48시간의 처리)에서의 분석은, 25 및 5 μg/ml의 분자가 사용되었을 때 24 시간의 자극 이후에 NLRP12 발현에서의 증가 피크를 나타내면서 그러한 결과를 확인하였다(도 1).

건강한 기증자의 말초혈액으로부터 얻어진 일차 단핵구(Primary monocyte)도 이러한 피도티모드 효과에 민감했다. 8명의 상이한 대상자들로부터 정제된 실험된 모든 샘플들에서, NLRP12 mRNA 발현의 증가가 관찰되었다. 처리되지 않은 세포와 비교하여, 25 및 5 μg/ml의 농도에서 피도티모드로 자극된 단핵구가, 자극 시작으로부터 24 및 48시간 이내에 NLRP12 mRNA 피크의 높은 레벨을 보였다(도 2).

NLRP12 단백질 발현은 mRNA 발현의 과정을 따랐다. Monomac6는 36시간 동안 5 μg/ml에서 피도티모드로 처리되었고, NRLP12 발현 레벨은, 특정한 단백질 면역 침강(immunoprecipitation)에 대한 면역블로팅에 의해 평가되었다. 피도티모드의 존재에서 배양된 세포로부터 얻어진 샘플에서, 처리되지 않은 것과 비교하여, 높은 양의 NLRP12 단백질이 관찰되었다(도 3).

NLRP12는, 비 정규적인 NF-kB 활성 및 p52-의존 키모카인(p52-dependent chemokine) 발현을 억제하며(Allen et al., 2012), 미생물 산물과 같은 TLR 작용제(TLR agonist)에 의해 활성화되는 잠재적인 위험한 향 염증성 활성을 약화시키는데 중요한 역할을 하는(Williams et al., 2005) 네거티브 조절 단백질(negative regulatory protein)로서 정의되어 왔다. 따라서 피도티모드의 효과는, 단핵구를 염증 활성화된 표현형(inflammatory activated phenotype)으로 이끄는 자극제들로 처리된(이것들이 TLR를 통해 활성화되기 때문에) 일차 인간 단핵구에서 평가되었다. 피도티모드 처리는 TLR 작용제에 의해 유도된 염증성 매개체에 대항(counteract)했다. 평가된 모든 샘플들(8명의 상이한 기증자로부터 얻어진 8개 샘플들)에서, 도 4에 대표적으로 도시된 것처럼, 특정 MCP-1의 레벨이 지속적으로 감소되었다. 이러한 데이터는 또한, 다른 주요한 향 염증성 분자들이 평가되었을 때(IL-6, IL-8 TNF-α 및 IL-1β), 피도티모드가 전사 레벨(transcriptional level)에서 이러한 매개체의 생산을 컨트롤하는 것으로 확인되었다.

mRNA 레벨에서 획득된 데이터는, ELISA에 의한 세포 상청액에 존재하는 염증성 분자의 정량화에 의해 확인되었다. 이러한 결과 세트는, 정제된 단핵구가 아닌 전체 PBMC(total PBMC)가 사용되었을 때 재현 가능했다.

최종적으로, 대표적인 TLR를 그것의 최적의 작용제(agonist)로 자극하는 상황에서 세포를 피도티모드로 선 처리하는 것이 TLR 자극에 의해 단핵구에서 유도된 NLRP12 하향조절(downregulation)을 컨트롤하는지 평가되어 왔다(Williams et al., 2005). 도 5에서 보여지는 결과는, 메신저(messenger) 레벨(왼쪽 패널)과 단백질 레벨(오른쪽 패널) 둘 다에서 NLRP12 발현의 감소에 피도티모드 존재에서 배양된 세포가 어떻게 대항하는지 강조한다.

이러한 데이터는 피도티모드가 단핵구에서 NLRP12 발현을 하향조절할 수 있다는 것을 보여준다. 그 결과로, 단핵구는 TLR 작용제에 의해 유도된 염증성 매개체의 생산을 하향조절하여 호스트에 유해할 수 있는 과도한 또는 적절하지 않은 염증을 조절함으로써 NLRP12 활성에 반응한다.

실시 예 2

비강으로 삽입 또는 스프레이되는 용액으로서 다음의 w/V 조성을 가지는 것이 제조되었다:

1. 피도티모드 6.7 %

2. 완충제 0.05 %

3. pH 조절제 q.s. to pH 6.5

4. 삽입을 위한 물 q.s. to 100 %

제조: 구성 1 내지 3이 삽입을 위해 물에 용해되고, pH 6.5인 균일한 용액이 얻어질 때까지 혼합되었다.

실시 예 3

경구 투여를 위한 용액으로서 하기의 w/w % 조성을 가지는 것이 제조되었다:

1. 피도티모드 5.10%

2. 염화나트륨 0.07%

3. 감미료 0.06%

4. 킬레이트제 0.05%

5. 트로메타민(Tromethamine 2.50%

6. 보존제(Preservative) 0.15%

7. 감미료 용액(Sweeteners solution) 31.89%

8. 향미료(Flavouring agent) 0.30%

9. 항산화제 0.07%

10. 착색제(Colouring agent) 0.01%

11. 정제수(Purified water) 59.80%

제조

용기(vessel)에서 구성 1 내지 10을 적합한 양의 정제수에 용해한다. 투명한 용액이 얻어질 때까지 섞는다. 나머지 양의 물을 첨가하고, 균일한 용액이 얻어질 때까지 혼합하고 여과한다.

실시 예 4

경구 투여를 위한 정제로서 하기의 w/w % 조성을 가지는 것이 제조되었다:

1. 피도티모드 72.70%

2. 희석제(Diluent) 17.65%

3. 붕괴제(Disintegrant) 4.55%

4. 바인더 4.00%

5. 유동화제(Glidant) 1.10%

제조

용기에서 구성 1 및 2를 섞는다. 다른 용기에서 구성 4를 적합한 양의 물에 용해한다. 투명한 용액이 얻어질 때까지 혼합한다. 얻어진 용액을 균일한 알갱이(homogeneous granulate)가 얻어질 때까지 혼합된 구성 1 및 2에 스프레이한다. 건조 후에, 구성 3 및 5를 얻어진 알갱이에 첨가하고 균일한 혼합물이 얻어질 때까지 섞는다. 혼합물이 정제 기계(tableting machine)로 압착된다.

실시 예5

수분 크림(water cream) 내의 오일(oil)로서, 하기의 w/w % 조성을 가지는 것이 제조되었다:

1. 피도티모드 10.00%

2. 완충제(Buffering agent) 5.40%

3. 킬레이트제(Chelating agent) 0.10%

4. 보습제(Humectant) 5.00%

5. 점도제(Thickener) 0.25%

6. 필름 형성제(Film former) 0.50%

7. 유화제(Emulsifier) 15.50%

8. 완화제(Emollient) 13.00%

9. 항산화제(Antioxidant) 0.50%

10. 보존제(Preservative) 1.00%

11. 정제수(Purified Water) q.s. to 100.00%

제조

메인 용기에서, 구성 1, 2, 3, 4, 5를 물에서 가용화(solubilize) 한다. 크산탄 검(Xanthan Gum)을 첨가하고 균일할 때까지 분산한다. 따로 구성 7을 물에서 가용화하고, 이것을 메인 용기에 저어 가며 첨가한다. 이 상태(phase)를 70 - 75℃에서 가열한다. 다른 용기에서 구성 8, 9, 10, 11, 12을 혼합하고, 저어 가며 70 - 75℃에서 가열한다. 상기 두 상태를 동일한 온도에서 가열하고 약 10분 동안 균질화 한다. 40℃로 식히고 순차적으로 구성 13과 14를 첨가한다. 이때 각 첨가 이후마다 균일화를 한다. 보통으로 저으면서 실온(room temperature)으로 식힌다.

실시 예 6

하기의 w/w % 조성을 가지는 국소 용액이 제조되었다:

1. 피도티모드 10.00%

2. 완충제 5.15%

3. 킬레이트제 0.10%

4. 보습제 5.00%

5. 필름 형성제 1.00%

6. 정제수 q.s. to 100.00%

제조

물에서 구성 1, 2, 3, 4, 6를 가용화 한다. 구성 7을 첨가하고 투명한 용액이 얻어질 때까지 혼합한다.

Claims

비 정규적인 NF-kB 경로의 이상 과활성이 특징인 염증 관련 질병을 치료하기 위한, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항에 있어서,
상기 질병은,
알레르기성 질환, 자가면역 질환 또는 '알러지 및 자가면역과는 다른 메커니즘에 기초하는 염증성 질환'인 것을 특징으로 하는, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.
제2항에 있어서,
상기 알레르기성 질환은,
알레르기성 비염, 알레르기 결막염, 아토피성 알레르기, 아토피 피부염, 접촉 피부염, 습진, 및/또는 알레르기성 혈관염에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.
제2항에 있어서,
상기 자가면역 질환은,
원형탈모증, 강직척추염, 자가면역성 심근병, 자가면역성 결합조직병, 자가면역성 창자병, 자가면역성 간염, 자가면역성 말초신경병, 자가면역성 췌장염, 자가면역성 다선 증후군, 자가면역성 혈소판감소자색반, 자가면역성 두드러기, 자가면역성 포도막염, 복강병, 만성피로증후군, 낭성섬유증, 하시모토 갑상선염, 특발성폐섬유증, 특발저혈소판자색반병, IgA 콩팥병, 소아특발관절염(또는 소아류마티스관절염, 또는 스틸씨 병), 가와사키병, 편평태선, 홍반성 루푸스, 류마티스관절염, 류마티스열, 쇼그렌증후군, 척추관절병, 측두동맥염(또는 거세포동맥염), 궤양대장염, 두드러기 혈관염으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.
제2항에 있어서,
상기 '알러지 및 자가면역과는 다른 메커니즘에 기초하는 염증성 질환'은,
알츠하이머병, 죽상동맥경화증, 만성간질환, 만성 콩팥병, 위염, 사구체신염, A형, B형 및 C형 간염, 화농성 한선염, 저감마글로불린혈증, 간질성방광염, 경화태선, 간 지방증, 대사증후군, 비만, 파킨슨병, 보통천포창, 허혈 후 염증, 건선, 건선 관절염, 레이노현상, 하지불편증후군, 복막후섬유증, 저혈소판증으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
인간에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
전신적으로(systemically) 투여되는 것을 특징으로 하는, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.
제7항에 있어서,
비경구적인(parenteral) 경로(근육내 또는 정맥내)로 투여되거나, 장관(enteral) 경로(입 또는 직장)로 투여되는 것을 특징으로 하는, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.
제7항에 있어서,
고체 제제 또는 액체 제제로 투여되는 것을 특징으로 하는, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.
제9항에 있어서,
상기 고체 제제는,
50% 내지 90%, 더 바람직하게는 65% 내지 80%, 가장 바람직하게는 70% 내지 75%인 피도티모드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염의 w/w 농도를 가지는 것을 특징으로 하는, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.
제9항에 있어서,
상기 액체 제제는,
0.5% 내지 20%, 더 바람직하게는 1% 내지 10%, 가장 바람직하게는 2% 내지 8%인 피도티모드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염의 w/w 농도를 가지는 것을 특징으로 하는, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.
제9항에 있어서,
상기 고체 제제는,
일회량 당 10 내지 1000 mg, 더 바람직하게는 일회량 당 50 내지 800 mg의 피도티모드의 양 또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염의 양을 포함하는 것을 특징으로 하는, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
국소적으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.
제13항에 있어서,
피부(dermal), 안구(ocular), 귀(auricular), 코(nasal), 볼(buccal), 척추내(intraspinal), 기관내(endotracheal), 질(vaginal), 방광내(intravesical) 또는 직장(rectal) 경로로 투여되는 것을 특징으로 하는, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.
제13항에 있어서,
고체 제제, 반고체 제제 또는 액상 제제로 투여되는 것을 특징으로 하는, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.
제15항에 있어서,
상기 고체 제제는,
50% 내지 90%, 더 바람직하게는 65% 내지 80%, 가장 바람직하게는 70% 내지 75%인 피도티모드 또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염의 w/w 농도를 가지는 것을 특징으로 하는, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.
제15항에 있어서,
상기 반고체 제제 또는 상기 액상 제제는,
0.1% 내지 30%, 더 바람직하게는 1% 내지 20%, 가장 바람직하게는 5% 내지 15%인 피도티모드 또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염의 w/w 농도를 가지는 것을 특징으로 하는, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 추가 활성 성분과 조합으로 또는 시간 간격을 두고 투여되는 것을 특징으로 하는, 피도티모드 또는 이것의 입체이성질체 및/또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염.