KR20160048028A - IL-1β 억제제 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본원에는 사람 IL-1β 활성 조절과 연관된 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 치료 조성물이 기재된다. 특정 양태에서, 본 발명은 사람 IL-1β에 결합하고 이의 기능을 약화시킬 수 있는 헤테로이량체 단백질 어셈블리를 조작하는 것에 기초한다. 헤테로이량체 단백질 어셈블리는 사람 IL1-R1 및 사람 IL-1RAcP의 세포외 부분, 또는 이들의 기능적 단편을 포함한다. IL1-R1 부분 및 IL-1RAcP 부분 각각은 사람 Ig 감마-1의 Fc 부분의 다른 돌연변이체에 융합된다. 헤테로이량체 단백질의 2개의 다른 Fc 돌연변이체는 2개의 Fc 돌연변이체 사이에서 임의의 호모머 (homomeric) 어셈블리에 비해 헤테로이량체 형성에 유리하도록 조작된다. 또한, 포유동물 세포에서 폴리펩타이드를 과생성하기 위한 DNA 발현 벡터 및 발현 시스템이 제공된다.

Description

IL-1β 억제제 조성물 및 이의 용도 {IL-1β INHIBITOR COMPOSITION AND USE THEREOF}
일반적으로, 본 발명은 염증 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염, 크론 질환 등), 당뇨병, 심혈관 질환 및 통풍과 연관된 질병에서의 생물학적 약제학의 용도뿐 아니라 생물학적 약제학 기술분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 IL-Ιβ 사이토킨을 억제할 수 있는, 헤테로이량체 IL-lRl/IL-lRAcP-유래 조성물에 관한 것이다.
사이토킨인 인터루킨-1 (IL-1) 패밀리는 사람 및 마우스에서 11개의 별개의 유전자에 의해 암호화되는 11개 단백질 (IL-1F1 내지 IL-1F11)을 포함한다. IL-l-타입 사이토킨은 선천성 면역 반응의 주요 조절자이며, 인터루킨-1 수용체 길항제 (IL-1RA)에 의한 시작 멤버 IL-1 또는 IL-1β의 억제는, 다수의 사람 자가염증 질환에서 IL-1의 주요 역할을 입증한다. IL-1 또는 IL-Ιβ는 다수의 다른 세포 타입에서 수백 개의 유전자의 메신저 RNA 발현을 빠르게 증가시킨다. IL-1 및 IL-Ιβ의 강력한 전염증 (proinflammatory) 활성은 3개의 주요 수준에서 제한된다 : (i) 합성 및 분비, (ii) 막 수용체, 및 (iii) 세포내 신호 전달. 상기 경로 (pathway)는 IL-1 반응을 중폭하거나 끝내는 양성- 및 음성-피드백 메키니즘을 포함하는, IL-1 또는 IL-Ιβ의 세포 외 및 세포내 신호 전달 (signaling)로 요약된다. 수용체의 리간드 결합에 반응하여, 조합적 인산화 및 유비퀴틴화 이벤트의 복합 연속 (complex sequence)은 핵 인자 kappa-B 신호 전달 및 JNK 및 p38 미토겐- 활성화 단백질 키나제 경로의 활성화 결과를 낳고, 이는 전사 및 후 전사 (posttranscription) 매카니즘에 의한 표준 (canonical) IL-1 표적 유전자 (IL-6, IL-8, MCP-1, COX-2, IB, IL-1, IL-Ιβ, MKP-1와 같은 유전자)의 발현을 협동적으로 유도한다. 흥미롭게도, 대부분의 세포내 구성요소는 IL-1에 대한 세포 내 반응에 참가하고, 또한 다른 사이토킨 (IL-18 및 IL-33), TLRs (Toll-like-receptors), 및 많은 세포독성 스트레스 형태에 대한 반응을 매개한다 (Weber A, et al, Sci Signal, 2010 Jan 19;3(105) 참고, 상기 문헌의 개시는 전체가 본원에 참조로 삽입된다).
IL-1 및 IL-Ιβ는 독립적으로 타입 1 IL-1 수용체 (IL-1R1)에 결합하고, 편재하여 (ubiquitously) 발현한다. 제3의 특이적 리간드인, IL-1 수용체 길항제 (IL-IRA)는 IL-1RI에 유사한 특이성 및 친화도로 결합하나, 수용체를 활성화하지 않고, 하류 신호 전달을 유발하지 않는다. IL-1 수용체 보조 단백질 (IL-lRAcP, IL-1 receptor accessory protein)은 IL-1/IL-1RI 복합체의 신호 전달에 필요한 공동-수용체로 작용하며, 상기 공동-수용체는 또한 다른 IL-1 패밀리 멤버, 구체적으로 IL-18 및 IL-33에 의한 IL-1R1 활성화에 필요하다. 타입 II IL-1 수용체 (IL-1R2)는 IL-1 및 IL-Ιβ에 결합하지만 신호 전달-권한이 있는 세포질 부분 (signaling-competent cytosolic part)이 부족하여, 유인용 수용체 (decoy receptor)로 작용한다. IL-IRA, 원형질 막-결합된 IL-1R2 (plasma membrane-anchored IL-1R2), 및 세포외 IL-1 수용체 체인 (sIL-lRI, sIL-lRII, 및 sIL-lRAcP로 칭함, 여기서 "s"는 수용성을 의미함) 각각의 자연적으로 발생하는 "창고 (shed)" 도메인은 증가된 전사 및 조절된 분비의 조합에 의해 조절되는 IL-1 신호 전달의 유도성 음성 조절자를 제공하며, 세포 외 공간에서 이의 풍부는 IL-1 효과를 제한하거나 종료시킬 수 있다.
IL-1 신호 전달의 최초 단계는 IL-lRacP 모집을 가능하게 하는 IL-1RI의 제1 세포외 도메인에서의 리간드-유도된 형태 변화이다. 보존된 세포질 부분을 통해 Toll- 및 IL-lR-유사 (TIR) 도메인으로 불리며, 삼량체 복합체는 빠르게 두개의 세포 내 신호 전달 도메인인 MYD88 (myeloid differentiation primary response gene 88) 및 IRAK (interleukin-1 receptor-activated protein kinase) 4로 어셈블리된다. MYD88 또는 IRAK4이 부족한 마우스는 IL-1 신호 전달에서 심각한 결함을 나타낸다. 유사하게, IRAK4 유전자에 돌연변이가 있는 사람은 IL-1RI 및 Toll-유사 수용체 (TLR) 신호 전달에 결함을 갖는다. IL-1, IL-1RI, IL-RAcP, MYD88, 및 IRAK4는 안정한 IL-1-유도된 제1 신호 전달 모듈을 형성한다. 이는 IRAK4의 (자동)인산화에 의해 병렬화되며, 그 이후 IRAKI 및 IRAK2을 인산화하고, 그 후 TRAF (tumor necrosis factor-associated factor) 6의 모집 및 올리고머화가 이어진다. IRAKI 및 2는 어댑터 및 단백질 키나제 양쪽으로 기능하고 하류에 신호를 전달한다. IRAKI, IRAK2, 및 TRAF6의 복합체는 최초 수용체 복합체로부터 분리되고, 상기 단백질들이 부족한 세포는 전사 인자 NF-kappa-B (nuclear factor kappa-B) 및 AP-1 (activator protein 1)의 손상된 활성을 갖는다.
IL-1의 과생산은 많은 염증 질환의 원인이다. 예를 들어, IL-1은 당뇨병, 심혈관 질환, 통풍 및 관절염의 특정 유형 (예를 들어, 류마티스 관절염 (RA))의 병리학과 연결되어 있다..
릴로나셉트 (Rilonacept)는 IL-1 길항제로, 사람 ILl-RAcP의 세포외 도메인의 IL-1 결합 부위, 사람 IL-1RI의 세포외 도메인의 IL-1 결합 부위, 및 다량체화 구성요소 (multimerizing component)를 포함하는 IL-1-특이적 융합 단백질을 포함한다. 상기 IL-l-특이적 융합 단백질은 미국 특허 번호 6,472,179, 2003년 7월 31일에 공개된, 미국 특허 공개 번호 2003/0143697, 미국 특허 번호 7,361,350, 및 2005년 9월 8일에 공개된 미국 특허 공개 번호 2005/0197293에 개시되어 있다 (상기 문헌들은 전체가 본원의 참조로 삽입된다). 릴로나셉트는 ARCALYST라는 상표명으로 미국 FDA (Food and Drug Administration)에 의해 성인 및 12세 이상의 어린이에서의 FCAS (Familial Cold Auto-inflammatory Syndrome) 및 MWS (Muckle- Wells Syndrome)을 포함하는, 크리오피린-연관된 주기적 증후군 (Cryopyrin-Associated Periodic Syndrome: CAPS)의 치료에 대해 승인받았다. 현재 릴로나셉트의 추가적인 임상 시험이 진행 중이다 (즉, 예를 들어 통풍).
발명의 요약
본 요약은 하기 상세한 설명에서 추가적으로 개시하는 간략화한 형태 내에서 컨셉 선택을 도입하기 위해 제공된다. 본 요약은 청구항 주제의 주요 특징 또는 본질적인 특징을 확인하기 위한 의도가 아니며, 청구항 주제의 범위 결정에 도움으로 사용되기 위한 의도가 아니다.
구체적인 양태로서, 본 발명은 사람 IL-Ιβ (GenBank: AAH08678.1)에 결합할 수 있는 헤테로이량체 단백질 조성물을 제공한다. 상기 단백질 조성물은 사람 IL1-R1 (GenBank: AAM88423.1)의 18 내지 333 아미노산을 함유하는 제1 아미노산 서열, 및 사람 면역글로불린 감마-1 Fc (GenBank: J00228.1)의 Fc 부분의 제1 돌연변이체를 함유하는 제2 아미노산 서열을 포함하는, 제1 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 단백질 조성물은 또한 사람 ILl-RAcP (GenBank: BAA25421.1)의 21 내지 358 아미노산을 함유하는 또 다른 제1 아미노산 서열, 및 사람 면역글로불린 감마-1 Fc의 Fc 부분의 제2 돌연변이체를 함유하는 또 다른 제2 아미노산 서열을 포함하는, 제2 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 단백질 조성물에서, 제1 및 제2 돌연변이체는 임의의 호모이량체 어셈블리 전반에서 제1 및 제2 돌연변이체 간에서 헤테로이량체 어셈블리 선호적으로 선택된다. 상기 단백질 조성물은 ELISA 검정에서 약 50 ng/ml의 EC50을 갖는 사람 IL-Ιβ 결합 활성을 나타낼 수 있을 수 있다. 상기 단백질 조성물의 제1 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 함유할 수 있으며, 제2 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 함유할 수 있다.
구체적인 양태로서, 본 발명은 치료학적 조성물을 제공한다. 치료학적 조성물은 사람 IL-Ιβ에 결합할 수 있는 헤테로이량체 단백질 조성물을 포함한다. 상기 단백질 조성물은 사람 IL1-R1의 18 내지 333 아미노산을 함유하는 제1 아미노산 서열, 및 사람 면역글로불린 감마-1 Fc의 Fc 부분의 제1 돌연변이체를 함유하는 제2 아미노산 서열을 포함하는, 제1 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 단백질 조성물은 또한 사람 ILl-RAcP의 21 내지 358 아미노산을 함유하는 또 다른 제1 아미노산 서열, 및 사람 면역글로불린 감마-1 Fc의 Fc 부분의 제2 돌연변이체를 함유하는 또 다른 제2 아미노산 서열을 포함하는, 제2 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 단백질 조성물에서, 제1 및 제2 돌연변이체는 임의의 호모이량체 어셈블리 전반에서 제1 및 제2 돌연변이체 간에서 헤테로이량체 어셈블리 선호적으로 선택된다. 상기 치료학적 조성물은 헤테로이량체 단백질 조성물의 반감기가 사람 Fc ELISA로 검정되었을 때, 5 mg/kg 투여량으로 피하 투여 후 마우스의 체순환 내에서 적어도 약 88시간일 수 있다. 상기 치료학적 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 함유하는 제1 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 함유하는 제2 폴리펩타이드로 구성되는 헤테로이량체 단백질을 포함할 수 있다.
구체적인 양태로서, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다. 상기 핵산의 코돈 사용 빈도 (codon usage)는 포유동물 세포 내에서 상기 폴리펩타이드를 고발현시키기 위하여 적합화될 수 있다. 상기 핵산은 서열번호 5의 서열을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 발현 벡터를 포함할 수 있다.
구체적인 양태로서, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다. 상기 핵산의 코돈 사용 빈도는 포유동물 세포 내에서 상기 폴리펩타이드를 고발현시키기 위하여 적합화될 수 있다. 상기 핵산은 서열번호 6의 서열을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 발현 벡터를 포함할 수 있다.
구체적인 양태로서, 본 발명은 서열번호 7의 분리된 핵산을 제공한다.
구체적인 양태로서, 본 발명은 이종 발현 시스템을 제공한다. 상기 발현 시스템은 서열번호 3의 아미노산 서열을 함유하는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 함유하는 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 또 다른 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 상기 발현 시스템의 발현 벡터는 포유동물 세포 내에 포함될 수 있다. 상기 포유동물 세포는 CHO 세포일 수 있다. 상기 발현 시스템은 서열번호 1의 아미노산 서열을 함유하는 제1 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 함유하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 헤테로이량체 단백질을 발현시킬 수 있다. 상기 헤테로이량체 단백질의 발현 수준은 적어도 세포 배양물 리터 당 300 mg일 수 있다.
구체적인 양태로서, 본 발명은 사람 IL-Iβ의 활성 조절과 연관된 질병의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한 물질의 용도를 제공한다. 상기 물질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 함유하는 제1 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 함유하는 제2 폴리펩타이드로 구성된 헤테로이량체 단백질을 포함한다. 상기 사람 IL-Iβ의 활성 조절과 연관된 질병은 관절염, 통풍, 류마티스 관절염, 크리오피린-연관된 주기적 증후군 (CAPS), 공피증, 당뇨병, 죽상동맥경화증, 건성 안 질환, 눈 알러지, 또는 포도막염일 수 있다.
구체적인 양태로서, 본 발명은 사람 IL-Iβ의 활성 조절과 연관된 질병 또는 상태의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 사람 IL-Iβ의 활성 조절과 연관된 질병의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 치료학적으로 유효한 양의 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 상기 약제학적 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 함유하는 제1 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 함유하는 제2 폴리펩타이드로 구성된 헤테로이량체 단백질을 포함한다. 상기 사람 IL-Iβ의 활성 조절과 연관된 질병은 관절염, 통풍, 류마티스 관절염, 크리오피린-연관된 주기적 증후군 (CAPS), 공피증, 당뇨병, 죽상동맥경화증, 건성 안 질환, 눈 알러지, 또는 포도막염일 수 있다.
구체적인 양태로서, 본 발명은 사람 IL-Ιβ에 결합할 수 있는 헤테로이량체 단백질 조성물을 제공한다. 상기 단백질 조성물은 사람 IL-Ιβ로 섬유모세포 치료에 반응하여, 사람 폐 섬유모세포에서 사람 IL-6 생성을 억제할 수 있다. 상기 억제는 IC50 값이 약 2.3 pM으로 특징지울 수 있다.
[도면의 간단한 설명]
하기 도면 및 설명은 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다:
도 1은 유연성 링커를 통해 IgG-Fc 도메인 (Fc-II)에 융합된 IL1-R1의 세포외 부분과 또 하나의 유연성 링커를 통해 또 하나의 IgG-Fc 도메인 (Fc-V)에 융합된 IL1-RAcP의 세포외 부분을 포함하는 본 발명의 교시의 헤테로이량체 단백질 어셈블리를 예시적으로 나타낸다.
도 2는 본 발명의 폴리펩타이드의 클로닝에 사용된 PKN012 플라스미드의 맵 및 주석이 달린 서열을 도식적으로 나타낸다.
도 3은 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하는 안정한 세포주를 제조하는 방법에서 수득된 대표적인 트랜스펙션 성장 곡선을 나타낸다.
도 4는 음이온 교환 크로마토그래피 정제 단계 후 서열번호 1의 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 폴리펩타이드를 포함하는 헤테로이량체를 함유하는 샘플의 크기-배제 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸다.
도 5는 음이온 교환 크로마토그래피 정제 단계 후 서열번호 1의 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 폴리펩타이드를 포함하는 헤테로이량체를 함유하는 샘플의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.
도 6은 상업적으로 이용가능한 사람 IL-1β를 사용하는 ELISA 검정에서 서열번호 1의 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 폴리펩타이드를 포함하는 헤테로이량체를 함유하는 정제된 샘플의 전형적인 결합 곡선을 나타낸다.
도 7은 IL-6 생성 검정 실험의 IL-1 항체 매개 억제에서 수득된 교정 곡선을 나타낸다.
도 8은 MRC5 세포를 50 pg/ml의 최종 농도로 IL-1β와 24시간 동안 인큐베이션하거나 (IL-1 단독) 처리하지 않고 그대로 놔둔 (세포 대조군) 배양 배지로부터의 IL-1β-매개 IL-6 생성 및 IL-6 회수의 결과를 나타내는 것으로, 세포에 노출되지 않은 배양 배지는 IL-6 회수를 평가하기 위해 20 pg/ml의 최종 농도에서 IL-6로 스파이크 (spiked)되었다.
도 9는 MRC5 세포를 50 pg/ml의 최종 농도로 IL-1β와 24시간 동안 인큐베이션하거나 (IL-1 단독) 처리하지 않고 그대로 놔둔 (세포 대조군) 배양 배지로부터의 IL-1β-매개 IL-6 생성 및 IL-6 회수의 측정 결과를 나타낸다. 세포에 노출되지 않은 배양 배지는 IL-6 회수를 평가하기 위해 20 pg/ml의 최종 농도에서 IL-6로 스파이크되었다.
도 10은 본 교시의 IL1R-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체를 이용해 수행된 IL-6 생성 검정의 억제에서 수득된 교정 곡선을 나타낸다.
도 11은 MRC5 세포를 50 pg/ml의 최종 농도로 IL-1β와 24시간 동안 인큐베이션하거나 (IL-1 단독) 처리하지 않고 그대로 놔둔 (세포 대조군) 배양 배지로부터의 IL1R-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체를 이용한 IL-1β-매개 IL-6 생성 및 IL-6 회수의 억제 측정 결과를 나타내는 것으로, 세포에 노출되지 않은 배양 배지는 IL-6 회수를 평가하기 위해 30 pg/ml의 최종 농도에서 IL-6로 스파이크되었고 (RPH-10 + 30 pg/ml IL6); 이 실험에 사용된 2개의 세포 배양 플레이트간의 일관성을 확보하기 위하여, 양쪽 플레이트 모두로부터 IL-6 생성에 대한 IL-1의 효과를 비교하였고 (플레이트 1 및 2의 경우, 각각 IL-1 단독 및 IL1 단독 플레이트 2); IL-6 생성에 대한 IL1R-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체의 가장 높은 농도 (20 μg/ml)의 효과를 또한 검사하였고 (RPH-10 단독); 204.8 ng/ml의 최종 농도에 상응하는 IL1R-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체 희석액을 또한 2개 플레이트간의 데이터 동일성을 증명하기 위하여 포함시켰다 (RPH1O 플레이트 2).
도 12는 MRC5 세포를 IL-1β 또는 다양한 농도의 LIR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체와 사전-혼합된 IL-1β와 인큐베이션시킨 LIR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체 실험에 대한 적정 곡선 측정의 결과를 나타내는 것으로; IL-6 생성을 퀀타킨 (Quantakine) ELISA로 측정하였고 데이터를 4-매개변수 적합 알고리즘 (4-parameter fit algorithm)을 이용하여 분석하였으며, 결과의 평행상태에서 계수 C는 0.3 ng/ml의 IC50 값에 수적으로 동일하거나 약 2.4 pM이다.
[발명을 실시하기 위한 구체내용]
본원에 기술된 교시는, 부분적으로, 사람 IL-Ιβ에 결합하여 그의 기능을 약화시킬 수 있는 헤테로이량체 단백질 어셈블리의 조작 (engineering)을 기반으로 한다. 본 교시의 헤테로이량체 단백질 어셈블리는 IL1-R1 (GenBank: AAM88423.1)의 세포외 부분 및 IL-1RAcP (GenBank: BAA25421.1)의 세포외 부분, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. IL1-R1 부분과 IL-1RAcP 부분 각각은 사람 Ig 감마-1 (GenBank: J00228.1)의 Fc 부분의 별개의 돌연변이체에 융합된다. 헤테로이량체 단백질 어셈블리에서 2개의 별개의 Fc 돌연변이체는 임의의 호모머 (homomeric) 어셈블리에 비해 2개의 Fc 돌연변이체 사이에 헤테로이량체 이량체 형성에 유리하도록 조작된다. 본 교시의 헤테로이량체 단백질 어셈블리의 재조합 생성을 가능케 하기 위하여, 이종 단백질 발현 시스템에서 헤테로이량체 단백질 어셈블리를 과다생성하는 DNA 발현 벡터를 제작하였고, 높은 발현 수준으로 헤테로이량체 단백질 어셈블리를 안정적으로 발현하는 포유동물 세포를 제조하였다. 본 교시의 헤테로이량체 단백질 어셈블리의 생리학적으로 적절하고 실질적으로 순수한 제조물을 수득하는 것을 가능케 하는 단백질 정제 절차가 고안되었다. 따라서 정제된 단백질 분자는 사람 IL-1β (GenBank: AAH08678.1)를 이용한 시험관 내 효소-연계 면역흡착 검정 (ELISA)에서 높은 정도의 특이적 활성을 증명한다. 예상외로, 단백질 분자는 피하 동물 투여 시 허용가능한 약동학적 프로파일을 나타내면서 임의의 체중 손실 또는 유해한 임상 사례를 초래하지 않는다.
이 명세서에 사용된 용어는 이 발명의 맥락 내에서, 그리고 각각의 용어가 사용된 특정 문맥 내에서, 일반적으로 당업계에서 이들의 통상의 의미를 갖는다. 발명의 조성물 및 방법과 이를 어떻게 제조하고 사용할 것인지를 기술함에 있어 실시자에게 추가적인 안내를 제공하기 위해, 특정 용어가 하기 또는 명세서의 다른 부분에서 논의된다. 임의 사용 용어의 범주 또는 의미는 그 용어가 사용된 특정 문맥으로부터 자명할 것이다. "약" 및 "대략"은 일반적으로 측정의 성질 또는 정확도를 감안하여 측정된 양에 대한 허용가능한 정도의 오류를 의미할 것이다. 전형적으로, 오류의 예시적인 정도는 주어진 값 또는 값의 범위의 20 퍼센트 (%) 이내, 바람직하게는 10% 이내, 더욱 바람직하게는 5% 이내이다. 대안적으로, 및 구체적으로 생물학적 시스템에서, 용어 "약" 및 "대략"은 주어진 값의 10배 이내, 바람직하게는 5배 이내, 더욱 바람직하게는 2배 이내인 값을 의미할 수 있다. 본원에 주어진 수량은 달리 언급되지 않는 한 대략적이며, 이는 용어 "약" 또는 "대략"이 명백히 언급되지 않는 경우 추정될 수 있음을 의미한다.
본 발명의 방법은 야생형 서열 대 하나 이상의 돌연변이체 (서열 변형체)를 포함하는 서로에 대해 서열을 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 비교는 전형적으로, 예컨대 당업계에 잘 알려진 서열 정렬 프로그램 및/또는 알고리즘 (예컨대, 두서너 가지 예를 들면, BLAST, FASTA 및 MEGALIGN)을 이용하는 고분자 서열의 정렬을 포함한다. 통상의 기술자는, 이러한 정렬에서, 돌연변이가 잔기 삽입 또는 결실을 포함하는 경우, 서열 정렬이 삽입되거나 결실된 잔기를 함유하지 않는 고분자 서열 내에 "갭" (전형적으로 - 또는 "A"로 표시됨)을 도입할 것임을 용이하게 인식할 수 있다.
본 발명의 방법은 통계학적 계산, 예컨대 IC50 또는 EC50 값 등의 측정을 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 다양한 상업적으로 이용가능한 소프트웨어, 예컨대 PRISM (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA) 또는 유사한 것을 이용하여 이러한 계산이 수행될 수 있음을 용이하게 인식할 수 있다.
모든 그의 문법적 형태 및 철자 변형체에 있어서, "동종"은, 동일한 종의 유기체에서 슈퍼패밀리 유래 단백질뿐만 아니라 상이한 종의 유기체로부터의 동종 단백질을 포함하는, "공통의 진화 기원"을 보유하는 2개 단백질 사이의 관계를 지칭한다. 이러한 단백질 (및 이의 암호화 핵산)은 퍼센트 동일성의 측면에서든 혹은 특정 잔기 또는 모티프 및 보존된 위치에 의해서든, 이들의 서열 유사성에 의해 반영되는 바와 같은, 서열 상동성을 갖는다. 그러나 통상의 용법 및 본 출원에서, 용어 "동종"은, "매우"와 같은 부사와 함께 수식될 때, 서열 유사성을 지칭할 수 있고 또는 공통의 진화 기원과 관련이 있거나 그렇지 않을 수 있다.
모든 그의 문법적 형태에 있어서, 용어 "서열 유사성"은 공통의 진화 기원을 공유하거나 그렇지 않을 수 있는 핵산 또는 아미노산 서열들 사이의 동일성 또는 일치의 정도를 지칭한다.
용어 "단백질"과 "폴리펩타이드"는 상호호환적으로 사용된다. 본원에 기술된 폴리펩타이드는 하나 이상의 인접하는 아미노산 쇄로 구성될 수 있고, 그로써 이량체를 형성하거나 다른 올리고머를 형성한다. 일반적으로, 포유동물에서 사용하기 위한 본 교시의 폴리펩타이드는 CHO 또는 HEK293 세포주와 같이, 적절한 번역-후 수식을 가능케 하는 포유동물 세포에서 발현되지만, 다른 포유동물 발현 세포주가 마찬가지로 유용할 것으로 예상된다. 따라서 본 교시의 폴리펩타이드는 그의 생물학적 기능에 실적적으로 영향을 미치지 않으면서 번역-후 수식될 수 있는 것으로 예상된다.
특정 양태에서, 본 교시의 헤테로이량체 단백질 어셈블리의 기능적 변형체는 사람 IL1-R1 또는 IL-1RAcP의 적어도 생물학적 활성 부분 또는 이의 기능적 단편과, 하나 이상의 융합 도메인을 갖는 융합 단백질을 포함한다. 이러한 융합 도메인의 잘 알려진 예시에는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타치온 S 트랜스퍼라제 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 (예컨대, Fc), 말토스 결합 단백질 (MBP), 또는 사람 혈청 알부민이 포함된다. 융합 도메인은 바람직한 특성을 부여하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, IL1-R1 또는 IL-IPVAcP 폴리펩타이드 부분은 생체 내에서 IL1-R1 또는 IL-1RAcP 폴리펩타이드를 안정화시키는 도메인 ("안정화제" 도메인)에, 선택적으로 적절한 펩타이드 링커를 통해 융합될 수 있다. 용어 "안정화하는"은, 이것이 감소된 파괴, 감소된 소거, 또는 다른 약동학적 효과 때문인지와 무관하게, 전신 순환에서 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키는 임의의 것을 의미한다. 면역글로불린의 Fc 부분과의 융합은 특정 단백질에 바람직한 약동학적 특성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 사람 혈청 알부민에의 융합은 바람직한 특성을 부여할 수 있다. 선택될 수 있는 다른 유형의 융합 도메인에는 다량체화 (예컨대, 이량체화, 사량체화) 도메인 및, 예컨대 생체 내 표적 작용 부위에서의 축적을 촉진하는, 추가적인 생물학적 기능을 부여하는 기능적 도메인이 포함된다.
특정 양태에서, 본 교시의 헤테로이량체 단백질 어셈블리는 IgG-Fc 도메인에 융합된, IL1-R1의 세포외 부분, 또는 이의 기능적 단편과, 또 하나의 IgG-Fc 도메인에 융합된, 세포외 부분 IL-1RAcP, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. IgG-Fc 도메인 및 또 하나의 IgG-Fc 도메인은 임의의 호모이량체 단백질 어셈블리에 비해 헤테로이량체 단백질 어셈블리에 유리하도록 선택된다. IL1-R1의 세포외 부분은 유연성 링커를 통해 IgG-Fc 도메인에 융합될 수 있고, IL-1RAcP, 또는 이의 기능적 단편은 동일한 아미노산 서열의 유연성 링커 또는 또 하나의 유연성 링커를 통해 또 하나의 IgG-Fc 도메인에 융합될 수 있다.
도 1에 예시적으로 나타낸, 예시적 실시형태에서, 유연성 링커를 통해 IgG-Fc 도메인 (Fc-II)에 융합된 IL1-R1의 세포외 부분은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 유연성 링커를 통해 또 하나의 IgG-Fc 도메인 (Fc-V)에 융합된 IL-1RAcP는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
hILl-Rl-hlgGl-Fc 폴리펩타이드 (서열번호 1)
Figure pct00001
hIL-lRAcP-hlgGl-Fc 폴리펩타이드 (서열번호 2)
Figure pct00002
특정 양태에서, 본 교시는 유연성 링커를 통해 IgG-Fc 도메인 (Fc-II)에 융합된 사람 IL1-R1의 선두의 333개 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 해독틀을 갖는 재조합 DNA 분자, 및 유연성 링커를 통해 또 하나의 IgG-Fc 도메인 (Fc-V)에 융합된 사람 IL-1RAcP의 선두 358개 아미노산을 포함하는 또 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 해독틀을 갖는 또 하나의 재조합 DNA 분자를 제공한다.
예시적 실시형태에서, 유연성 링커를 통해 IgG-Fc 도메인 (Fc-II)에 융합된 사람 IL1-R1의 선두의 333개 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 이에 대응하는 DNA 분자는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 유연성 링커를 통해 또 하나의 IgG-Fc 도메인 (Fc-V)에 융합된 사람 IL-1RAcP의 선두 358개 아미노산을 포함하는 또 하나의 폴리펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이에 대응하는 DNA 분자는 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
hILl-Rl-hlgGl-Fc 폴리펩타이드 (서열번호 3)
Figure pct00003
hILl-Rl-hlgGl-Fc DNA (서열번호 4)
Figure pct00004
hIL-lRAcP-hlgGl-Fc 폴리펩타이드 (서열번호 5)
Figure pct00005
hIL-lRAcP-hlgGl-Fc DNA (서열번호 6)
Figure pct00006
특정 양태에서, 본 발명은 유연성 링커를 통해 IgG-Fc 도메인 (Fc-II)에 융합된 사람 IL1-R1의 선두의 333개 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드, 및 유연성 링커를 통해 또 하나의 IgG-Fc 도메인 (Fc-V)에 융합된 사람 IL-1RAcP의 선두 358개 아미노산을 포함하는 또 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 해독틀을 갖는 또 하나의 재조합 DNA 분자의 고 발현을 위한 재조합 포유동물 발현 플라스미드를 제공한다. 이 플라스미드는 상기 폴리펩타이드 및 상기 또 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 2개의 유전자의 전사를 유도하기 위해 2개의 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 포함하는데, 이들 각각은 전사 종결 서열 및 폴리아데닐화 서열을 수반한다. 플라스미드는 또한, 세균에서의 플라스미드 증식 및 선별을 지지하기 위한, 복제 기원 및 암피실린 내성을 부여하는 유전자를 함유한다. 플라스미드는 안정한 CHOK1 및 NSO 세포주를 확립하는데 폭넓게 사용되는 선택 마커인, 글루타민 신세타제에 대한 유전자를 추가로 함유한다. 본 발명의 플라스미드를 도 2에 예시적으로 나타내었다.
예시적 실시형태에서, 본 교시의 포유동물 발현 플라스미드는 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
IL-lRAcP- hlgGl-Fc-V expression 플라스미드 (서열번호 7)
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
특정 양태에서, 본 교시는 유연성 링커를 통해 IgG-Fc 도메인 (Fc-II)에 융합된 사람 IL1-R1의 아미노산 잔기 18 내지 333을 포함하는 폴리펩타이드, 및 유연성 링커를 통해 또 하나의 IgG-Fc 도메인 (Fc-V)에 융합된 사람 IL-1RAcP의 아미노산 잔기 21 내지 358을 포함하는 또 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 헤테로이량체 단백질 어셈블리의 생성을 위한 포유동물 발현 시스템을 제공한다.
예시적 실시형태에서, 본 발명의 포유동물 발현 시스템은 서열번호 7의 뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO-K1)를 포함한다.
특정 양태에서, 본 교시는 IL-Ιβ 조절과 관련된 다음의 질환에 의해 영향을 받은 포유동물의 치료 방법을 제공한다: 관절염, 통풍, 류마티스 관절염, 크리오피린-관련 주기적 증후군 (Cryopyrin-Associated Periodic Syndromes, CAPS), 공피증, 당뇨병, 죽상동맥경화증, 건성 안 질환, 눈 알러지, 또는 포도막염.
실시예
하기의 실시예는 앞서 기술한 양태 및 본 발명의 다른 양태를 설명하는 것이다. 이들 실시예는 한정적인 것이 아니며, 본 발명의 실시형태를 통해 청구된 화합물, 조성물, article, 장치 및/또는 방법의 제조 및 평가 방법에 관한 통상적인 기술을 제공한다. 하기의 실시예는 단순히 발명의 예시적인 것이며, 발명자들의 발명에 관한 사상(scope)을 제한하는 것은 아니다. 하기의 실시예는 숫자(예를 들면, 양, 온도 등)에 대한 정확성은 확신할 수 있으나, 오차 및 편차는 고려되어야 한다.
실시예 1 : 본 발명의 폴리펩타이드의 발현을 위한 플라스미드의 작제
IL-1R1의 잔기 1 내지 333 또는 IL-1RAcP의 잔기 1 내지 358의 아미노산 잔기를 암호화하는 서열을 포함하는 최적화된 유전자 서열은 화학적으로 합성하였다. 제조된 단편은 HindIII 및 BspEI 제한 부위(site)를 통해, Fc-V 또는 Fc-II를 암호화하는 서열을 포함하는 수용자(recipient) 중간체(intermediate) 벡터로 인프레임(in-frame)하게 클로닝되었다. 수득한 양성 클론은 DNA 시퀀싱을 통해 검증하였다. 제조된 작제물은 각각 PKN001＇-IL-1R-FcV 및 PKN001＇-RAcP-FcII로 칭하였다.
다음으로, HindIII 및 EcoRI 제한 부위를 통해, IL-1R1-FcV를 암호화하는 유전자를 두번째 중간체 벡터인 PKN002에 클로닝하였다. 양성 클론은 이중 절단으로 스크리닝하였으며, 정확한 플라스미드의 삽입 서열은 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 제조된 작제물은 PKN002-IL-1R-FcV로 칭하였다.
최종적으로, PKN001＇-RAcP-FcII로부터의 RAcP-FcII를 위한 발현 카세트는 NotI 및 Sa1I 제한 부위(site)를 통해 PKN002-IL-1R-FcV 플라스미드로 통합되었으며, RAcP-FcII 및 IL-1R-FcV를 위한 발현 요소를 포함하는 신규 재조합 작제물을 수득하였다. 제조된 클론은 NotI 및 Sa1I 이중 절단 및 DNA 겔 전기영동을 통해 스크리닝하였으며, 정확한 클론은 대략 8kb DNA 단편을 이동하는 하나의 밴드와 4kb DNA 단편을 이동하는 또 다른 밴드를 나타내었다. 최종적인 플라스미드는 PKN012-IL1R-FcV-RAcP-FcII로 칭하였다.
재조합 플라스미드 PKN012-IL1R-FcV-RAcP-FcII는 RAcP-FcII 및 IL-1R-FcV 둘다를 위한 발현 카세트를 조합한다. 플라스미드는 CMV 프로모터 조절하에서 RAcP-FcII 및 IL-1R-FcV 단백질을 1 대 1 비율로 공동-발현하기 위해 사용될 수 있다. 상기 두 융합 단백질의 대부분은 분비 후에 IL-1R-FcV/RAcP-FcII 헤테로이량체를 형성할 수 있다. 또한, 플라스미드는 SV 프로모터를 통해 글루타민 신세타제(GS) 단백질을 발현할 수 있으며, 선별 마커로 사용되어 IL-1R-FcV/RAcP-FcII 헤테로이량체 생산을 위한 안정적인 세포주를 제조할 수 있다. PKN012-IL1R-FcV-RAcP-FcII의 플라스미드 맵을 도 2에 나타내었다.
실시예 2 : 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하기 위한 안정적인 세포주의 제조
서열번호 1의 hIL1-R1-hIgG1-Fc 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 hIL-1RAcP-hIgG1-Fc 폴리펩타이드를 공동-발현하는 CHO-K1 세포의 안정적인 클론은 기본적인 세포생물학 프로토콜을 통해 제조하였다. 상기 실시예 1에 나타낸 발현 플라스미드 PKN012-IL1R-FcV-RAcP-FcII를 사용하여 상기 폴리펩타이드의 고발현을 위한 안정적인 세포주를 제조하였다. 다수의 클론에서 상기 폴리펩타이드의 발현 레수준s는 그 이었다. 하나의 클론 세포주는 진탕 플라스크 (shake flask) 배치 배양에서 약 300 mg/L 또는 그 이상의 발현 레벨을 나타내었다.
재료
차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO-K1)는 ATCC (CCL- 61™)로부터 동결된 스톡을 입수하였다. 상기 세포를 CD CHO 배지안에서 순응시켰다. 배지와 시약은 시판 공급원으로부터 입수하였다. 모든 적용에 있어서, 상기 세포를 고농도로 수차례 계대하였다. 상기 결과물인 세포를 서브클로닝하였다. 20시간 미만의 배증 시간으로 결과물인 클론 중 하나와 우수한 형태가 모세포주로서 선별되었다.
방법
4 계대의 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO-K1)를 6 mM의 L-글루타민을 포함하는 CD-CHO 화학적 규명 배지 (Invitrogen)에서 배양하였다. 상기 세포를 세포 농도 4×l06 세포/ml에 이르게 한 후, 1:3으로 나눠서 유지시켰다. 세포를 원심분리에 의해 스핀다운하고 1ml의 CD-CHO 화학적 규명 배지 (Invitrogen)에 재현탁하였다.
다음과 같은 전기천공법 프로토콜을 이용하였다:
- 100 ul의 멸균된 TE 버퍼 중의 플라스미드 DNA 40 ug을 전기천공법을 위해 사용하었다; 트렌스펙션 당일의 세포 생존능력은 적어도 95%였다;
- 세포를 800 rpm에서 5 분간 원심분리하였다. 상기 상청액을 제거하고 상기 세포를 10ml의 CD CHO 배지에 현탁하고 다시 원심분리하였다;
- 상기 상청액을 제거하고 상기 세포를 소용량의 CD CHO 배지에서 현탁하여 1.43×l07 세포/ml가 되도록 하였다;
- 0.7 ml의 세포(107 세포)를 상기 DNA에 첨가하고 버블이 생기지 않도록 피펫팅으로 부드럽게 혼합하였다;
- 세포를 300 볼트, 각 큐벳에 900 uF의 단일 펄스를 가함으로써 즉시 전기천공하였다;
- 상기 세포 현탁액을 96웰 플레이트 10 장에 50 ul/웰씩 분주하였다; 다음날, 33.3 uM의 MSX를 포함하는 150 ul의 CD CHO를 각 웰에 첨가하였다.
트랜스펙션의 수는 잠재적인 ILlR-FcV-RAcP-FcII 발현 세포주의 발생 과정에 있어서의 CHO-K1 세포에서 수행하였다; 대표적인 트랜스팩션 성장 곡선을 도 3에 나타내고, 상기 데이터를 표 1에 나타내었다. 단백질 발현량은 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 단백질 과발현이 높은 세포주는 약 180 kDa의 분자량을 나타내는 강한 밴드를 나타내었다. 예비 분석에 근거하여, 4개의 클론이 상세분석을 위해 선별되어, 발현량은 SDS-PAGE와 ELISA에 의해 상세히 조사하였다. 잘 발현하는 클론은 125 ml의 셰이크 플라스크에 접종하였다, 상기 세포를 확장하고 동결하였다.
상기 선별된 가장 높은 생산 세포주를 선별하고 CD-CHO에서 해동하였다. 상기 세포주의 성장 곡선을 조사하고, 샘픔을 매일 세포수, 세포 생존능력 및 ILlR-FcV-RAcP-FcII 생산성을 위해 회수하였다. 이러한 연구에 근거하여, 선별된 최고의 생산성의 세포주는 CD-CHO 배지에서 상업적 생산을 서포트하는데 필요한 양의 ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체를 발현하고 있었다. 정제 후의 헤테로이량체의 수율은 적어도 약 300 mg/L (임의의 생산 최적화 없이)이었다.
대표적인 클론 세포주 성장 곡선
배양 기간
(일수) 		세포 밀도
(10 6 세포/ml) 		피딩
0 0.5
1 1.09
2 1.93
3 2.97 +10% 피드 B
5 4.13
6 4.55 +10% 피드 B
7 4.6
8 5.46 +10% 피드 B
9 4.86
10 2.4
11 1
실시예 3 : 본 발명의 폴리펩타이드의 정제
서열번호 1의 hILl-Rl-hlgGl-Fc 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 hIL-lRAcP-hlgGl-Fc 폴리펩타이드를 앞서 설명한 실시예 2와 같이 기본적으로 CHO-K1에서 공동-발현 시켰다. 잘 확립된 프로토콜을 이용하여 세포를 회수하고 용해하였다. 세포 용해물 정화 후, 발현된 hlLl-Rl-hlgGl-Fc/hIL-lRAcP-hlgGl-Fc 폴리펩타이드를 포함하는 약 0.4 mg/ml의 단백질 농도의 상기 상청액을 단백질 A 친화성 컬럼 (affinity column)에 적용시켰다. 상기 친화성 정제 단계를 표 2에서 서술한 절차에 따라 수행하였다. 약 3.5 - 3.7의 pH의 hILl-Rl-hlgGl-Fc/ hIL-lRAcP-hlgGl-Fc를 포함하는 상기 단백질 A 용출액을, 잠재적으로 존재하는 오염성 재료를 불활성화시키기 위해 45-60 분간 인큐베이션하였다.
실온에서 pH 3.6로 약 45 분간 재료 인큐베이션 후, pH를 2 M의 Tris-HCl pH 9.5 (희석된 Pro A 용출물의 약 3.5% v/v)를 이용하여 약 7.9 내지 8.1로 조정하였다. 상기 낮은 pH 처리된 단백질 A 용출물을 1 M의 Tris-HCl, pH 9.0을 이용하여 약 pH 8.0으로 pH를 조정하였다. 상기 전도도는 필요에 따라 탈이온수 (dH20)를 이용하여 약 5.5 mS/cm로 조정하였다.
DNA, HCP, 내독소 및 짐재적인 바이러스성 오염의 함량을 줄이기 위해, 상기 pH 가 조정된 단백질 A 컬럼 용출물을 Q Sepharose 레진을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피 (AIEX)로 보다 정제하고, 상기 AIEX 단계를 표 3에 서술한 단계적 용출 절차에 따라 수행하였다. 풀링된 용출 피크 부분을 약 20 mg/ml의 농도로 정밀여과하여 농축하고, 그 다음, 20% 슈크로스 스톡 용액을 첨가하여 최종 슈크로스 농도가 약 1% (w/v)℃가 되도록 하였고, -80℃에서 동결하였다.
이와 같은 정제된 단백질 샘플을 사이즈 배제 HPLC (SEC-HPLC)와 SDS-PAGE (환원 및 비환원)에 의해 분석하였다. 분석 결과를 도 4 및 도 5에 각각 나타내었다. 도 5에서, 라인 1, 3은 비환원조건하의 hILl-Rl-hlgGl-Fc/ hIL-lRAcP-hlgGl-Fc SDS-PAGE를 나타낸다. 반면, 라인 4, 6은 환원 조건 하를 나타낸다. 라인 2, 5는 분자량 마커를 나타낸다. hILl-Rl-hlgGl-Fc/ hIL-lRAcP-hlgGl-Fc 헤테로이량체는 약 90 kDa의 정확한 분자량의 2개의 디설파이드가 연결된 단량체로 이루어진 약 180 kDa의 정확한 분자량을 갖는다.
전기 SEC-HPLC 작용 절차는 표 4에서 서술한다. 로딩하는 샘플은 이동상으로 희석하여 약 5 mg/ml의 단백질 농도가 되도록 하였다. hILl-Rl-hlgGl-Fc/ hIL-lRAcP-hlgGl-Fc 헤테로이량체의 생물학적으로 적절한 형태는 정체 시간 RT=14.979 분에 주 피크에 의해 나타났다.
단백질 A 친화성 크로마토그래피의 작동 절차
단계 버퍼 용적 유동
　 　 CV cm/h
사용전 세정 dH2O 3 150
평형화 10 mM NaPh, pH 6.0 5 150
샘플 로드 세포 수거 - 150
세척 1 10 mM NaPh, pH 6.0 3 150
세척 2 25 mM NaPh, 0.5 M NaCl, 5% 이소프로판올 pH 7.0 5 150
재평형화 10 mM NaPh, pH 6.0 3 150
용출 20 mM Na-시트레이트, pH 3.4 4 150
재평형화 10 mM PB, pH 6.0 3 150
CIP 0.1 M NaOH (접촉 시간 15분), 역류, 5 사이클마다 CIP 3 100
NaCl로 세정 1M NaCl 3 150
사용후 세정 dH2O 3 150
저장 20% (v/v) 에탄올, 20 mM NaPh, pH 7.0 3 150
AIEXdml 작동 절차
단계 버퍼 용적 유동
　 CV cm/h
사용전 세정 dH2O 3 150
재충전 10 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, pH 8 3 150
평형화 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8 3 150
샘플 로드 Prepared Q Load - 150
세척 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8 3 150
용출 10 mM Tris-HCl, 0.35 M NaCl, pH 8.0 3 150
CIP 1 M NaOH (접촉 시간 1시간), 역류 3 40
재생 10 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, pH 8.0 3 150
사용후 세정 dH2O 3 150
저장 20% (v/v) 에탄올 3 150
SEC-HPLC의 작동 절차
이동상:　　　　　 20 mM 포스페이트, 300 mM NaCl, pH 7.4
유속: 0.5 mL/분
컬럼: G2000 SWxl, 7.8mmx300mm, TOSOH Bioscience
가드 컬럼: TSK Guard SWxl, 6.0mmx40mm, TOSOH Bioscience
컬럼 온도: 25℃
샘플러 온도: 실온
주입 용적: 10 μl
검출기 파장:　　　　　　 280 nm
러닝 시간: 30분
이 실시예에서 설명한 바와같이 본질적으로 발현되고 정제된 이와 같은 정제된 샘플의 활성을 상업적으로 이용가능한 사람 IL-β (PrimGene, Shanghai, China; Cat#: 101-OlB)를 이용하여 스탠다드 ELISA로 시험하였다. 검정에서 얻은 전형적인 결합 곡선을 도 6에 나타내었다. 곡선 분석에 근거하여, 상기 계산된 EC50 값은 약 50 ng/ml이다.
실시예 4 : 사람 세포에서 IL1R-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체를 갖는 IL-1β 유도된 IL-6 생성 억제의 특성분석
본 실시예는 사람 IL-1β표적의 ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체의 강한 기능적 (억제적)특성을 나타낸다. 기능적 비교로서 IL-6에 대해 이전에 특정지어진 마우스 단일클론 항체를 사용하였다. 사람 폐 섬유모세포 MRC5는 IL-1β 처리에 반응하여 IL-6를 생산한다. MRC5 세포의 IL-1β유도된 IL-6 생성의 정량을 검정 기능적생산량으로서 사용하였다. ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체 및 ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체 조절에 의한 IL-6 생성의 억제는 ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체 물질의 억제적 특성의 정량 측정을 제공한다.
ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체 (서열번호 l 및 서열번호 2)의 폴리펩타이드는 앞서 실시예에서 설명하는 바와 같이 본질적으로 공발현하고 정제하였다. 샘플에 사용된 다량의 순수한 ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체의 단백질 농도는 100 mM NaCl, 25 mM NaH2P04/Na2HP04, 25 mM 아르기닌 하이드로클로라이드, 1% 슈크로스, pH=6.3에서 0.9 mg/ml이다.
다음과 같은 재료가 검정에 이용되었다:
세포: MRC5 세포, 사람 폐 섬유모세포, ATCC Cat # CCL-171, Lot # 59474707. 배지: DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium), 높은 글루코스 (4.5 g/L), Mediatech, Cat # 10-017-CM, Lot # 10017204, L-글루타민 및 lx penn/strep 및 10% 우태 혈청으로 보충됨, Omega Scientific, Cat # FB-05, Lot # 105104 시약: IL-Ιβ, 사람 재조합, 이 콜라이-유도됨, Alal l7-Ser269, Accession # NP 000567, R&D systems, Cat # 201-LB, Lot # ADM1411062; 사람 IL-Ιβ에 대한 모노클로날 항체, clone #8516, R&D systems, Cat # MAB201, Lot # AWE1011081; 사람 IL-6 Quantakine 면역검정, R&D systems, Cat # D6050, Lot # 300070.
다음과 같은 절차가 검정에 이용되었다:
세포 유지:
1. 제조사의 추천에 따라 T75 플라스크에서 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 MRC5 세포를 증식시킨다. 계대수를 기록한다;
2. 세포를 트립신화하고, 10%> FBS를 포함하는 (10% 이상의 FBS) DMEM에 재현탁한다;
3. Guava ViaCount 시약을 이용하여 세포 생존능력을 시험한다. 표준 생존력은 >85%이어야 한다. 그렇지 않으면, 이 세포 배치는 사용하지 않는다;
4. 48웰 플레이트의 웰 당 2 x 103 세포/웰 또는 ml 당 5 x 103의 원하는 농도로 배양하기 위해 세포 희석액을 준비한다;
5. 37℃, 5%> C02에서 16-24시간 동안 세포를 붙이고, 그 다음 배지를 제거하였다;
6. 0.4 ml/웰의 48웰 플레이트에, 10% FBS가 추가된 새로운 DMEM 배지로 교환하고, 5에서 10 분간 배양하고 같은 볼륨으로 다시 배지를 교환한다;
7. 웰에 IL- 1 β를 첨가한다. 테스트 물질을 IL- 1 β 및 적절한 대조군과 를 예비-혼합한다;
8. 24시간 동안 처리한 후에 세포를 배양하고, 그 다음, 상기 상청액 회수한다;
9. 300 x g에서 10분간 상기 상청액을 원심분리하고, 깨끗한 상청액을 회수하고, 직접 또는 적절하다면 1/3 희석하여 ELISA에 사용하였다.
ELISA 프로토콜:
검정의 원리: 본 검정은 양적인 샌드위치 효소 면역기술을 사용한다. 마이크로 플레이트에는 IL-6에 특이적인 단일 클론 항체가 사전에 코팅되어 있다. 표준시료와 샘플들은 마이크로 플레이트의 웰에 주입되고, 존재하는 IL-6는 고정된 항체에 결합한다. 결합하지 않은 다른 물질을 씻어낸 후에, IL-6에 특이적인 효소가 결합 된 폴리클로날 항체가 웰에 더해진다. 결합하지 않은 어떠한 항체-효소 시약을 제거한 후에, 기질 용액이 웰에 주입되고 결합 된 IL-6에 비례하여 색깔이 변화한다. 색깔의 변화가 멈춰지고, 그 후에 색의 강도가 측정된다.
검정 절차:
1. 모든 시약과 사용되는 표준시료는 제조자의 매뉴얼에 따라 준비되었다. (http://www.rndsystems.com product_results.aspx?k=D6050)
2. 플레이트 틀에서 과도한 마이크로 플레이트 스트립은 제거하고, 이것을 건조시키는 팩을 포함하는 호일 파우치로 옮기고 다시 봉합한다.
3. 각 웰에 대해 100 μL의 검정 희석 RD1W를 주입한다.
4. 각 웰당 100 μL의 표준시료, 샘플, 또는 대조군을 주입한다. 제공된 접착용 스트립으로 둘러싼다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 표준시료와 샘플들의 검정을 기록하기 위해 플레이트의 배치가 제공되었다.
5. 각 웰의 용액을 흡수하고 씻는 과정을 4번의 씻는 과정 동안 세번을 수행한다. 용액을 뿌리는 용도의 통과 여러 가지의 용기 또는 자동세척기를 이용하여 세척용 버퍼 (400 μL)로 각 웰을 채워 세척을 수행한다. 각 단계에서 액체를 완전히 제거하는 것은 좋은 실험 결과를 위해 필수적이다. 마지막 세척후에, 흡입 또는 붓는 과정을 통해 잔여 세척 버퍼를 완전히 제거한다. 플레이트를 뒤집어 종이 수건에 대해 블롯팅한다.
6. 각 웰에 대하여 200 μL의 IL-6를 주입한다. 접착용 스트립으로 둘러싼다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
7. 절차 5에서의 흡입/세척 과정을 반복한다.
8. 각 웰에 대해 200 μL의 기질 용액을 주입한다. 실온에서 20분간 인큐베이션한다. 빛으로부터 보호한다.
9. 각 웰에 대해 정지 용액 50 μL을 첨가한다. 웰의 색깔은 파란색에서 노란색으로 변화해야 한다. 웰에서의 색깔이 초록색이거나, 색깔의 변화가 일정하지 않으면, 완전하게 섞이게 하기 위해 부드럽게 플레이트를 두드린다.
10. 450 nm에 맞춰진 마이크로 플레이트를 이용하여, 30분 이내에 각 웰의 광학 농도를 측정한다. 만약 파장 교정이 가능하다면, 540 nm 또는 570 nm의 파장으로 설정한다. 만약, 파장 교정이 불가능하다면, 450 nm에서의 판독으로부터 540 nm 또는 570 nm의 판독을 감한다. 이러한 차감은 플레이트의 광학적 불완전성을 교정할 것이다. 교정이 없이 450 nm에서 직접적으로 만들어진 판독 값은 더 높고 낮은 정확성을 보일 것이다.
다음은 입수된 실험 데이터이다:
항-IL-1 β 항체의 조절을 통한 IL-6의 생성의 억제:
1. MRC5 세포들 (계대 5)은 48개의 웰 플레이트(Costar, Cat # 3548)에 웰당 2 x 103 세포의 농도, 웰당 0.4 ml, 그리고 24시간 동안 인큐베이션된다;
2. 검정하는 날에는, 웰의 존재하는 배지는 흡입되고 10% FBS가 첨가된 0.4 ml의 DMEM으로 교환되고, 10-15 분간 인큐베이션하고 동일한 신선한 배지로 동일한 양으로 교환된다;
3. 실험과정에서 IL-Ιβ는 50 pg/ml의 최종 농도로 사용된다;
4. 항-인간 IL-Ιβ 항체들은 0.192, 0.96, 4.8, 24, 120 그리고 600 ng/ml의 최종 농도로 사용되었다;
5. IL-Ιβ과 항-인간 IL-Ιβ 항체 모두는 lO배로 농축된 용액으로 준비되었다;
6. 세포들에 대해 실험을 위한 물질을 첨가하기 이전에, 10배 농축된 IL-Ιβ 55 μL은 대응되는 10배로 농축된 항-인간 IL-Ιβ 항체 용액 (또는 적절한 대조군) 55 μL과 섞여지고 실온에서 30분간 인큐베이션된다;
7. 인큐베이션후에, 100 μL의 각 혼합물은 0.4 mL의 성장 배지를 포함한 웰에 첨가된다;
8. 세포들은 실험용 물질의 존재하에서 24시간 동안 인큐베이션되고 상층액은 수집되어 300 x g의 속도로 10 분간 원심분리되고 IL-6 ELISA 검정을 위해 사용된다;
9. 항-IL-Ιβ 항체의 존재하에서의 IL-6의 회수를 위한 실험을 위해, 후자는 최종 농도 600 ng/ml로 사용되었고 IL-6 표준시료는 최종 농도 20 pg/mL로 섞여졌다.
IL-1 항체에 의한 IL-6 생산 검정에서 얻어진 교정 곡선은 도 7에 나타나 있다. 실험에서 배양 배지의 IL-Ιβ에 의한 IL-6 생성과 IL-6 회수의 측정의 결과는 도 8 및 도 9에 나타나 있다. 얻어진 IL-6 생성을 위한 수치 값과 그들의 표준편차는 표 5에 나타나있다.
IL-6 생성 값 요약
샘플 ID 평균, pg/ml 표준편차 pg/ml
세포 대조군 1.8 0.001
IL-1 단독, 50 pm/ml 149.2 1.2
Anti-IL-1 Ab + 30 pg/ml IL-6 22.8 0.2
IL-1 + 0.192 ng/ml 항 IL-1 Abs 152.5 2.5
IL-1 + 0.96 ng/ml 항 IL-1 Abs 122.1 2.3
IL-1 + 4.8 ng/ml 항 IL-1 Abs 33.4 0.4
IL-1 + 24 ng/ml 항 IL-1 Abs 3.37 0.09
IL-1 + 120 ng/ml 항 IL-1 Abs 2.44 0.02
IL-1 + 600 ng/ml 항 IL-1 Abs 2.16 0.03
앞서 말한 실험은 다음 사항을 나타낸다: (1) 대조군 항-IL-Ιβ 항체는 아주 강력한 IL-Ιβ 신호 경로의 저해제로 약 2.1 ng/mL 또는 약 14 pM의 IC50를 갖는다; (2) 세포 밀도는 웰당 2 x 103 세포가 되도록 검정하기 전 24시간 전에 플레이팅하는 것이 적절하다; (3) IL-6의 회수는 20 pg/ml의 최종농도가 되도록 배양 배지에 첨가되고 이는 약 114%이다.
ILlR - FcV - RAcP - FcII 헤테로이량체의 준비에 의한 IL-6 생성 억제:
1. MRC5 세포들 (계대 6)은 48개의 웰 플레이트(Costar, Cat # 3548)에 웰당 2 x 103 세포의 농도, 웰당 0.4 ml, 그리고 24시간 동안 인큐베이션된다;
2. 이 실험을 위해서 플레이팅은 이중으로 복제되어 수행되었다. 복제된 플레이트 각각은 ELISA plate에서 측정되어서 처리당 4개의 실험 요소를 결과로 얻었다
3. 검정하는 날에는, 웰의 존재하는 배지는 흡입되고 10% FBS가 첨가된 0.4 ml의 DMEM으로 교환되고, 10-15 분간 인큐베이션하고 동일한 신선한 배지로 동일한 양으로 다시 교환된다;
4. IL-Ιβ는 실험 동안 최종 농도 50 pg/ml로 사용되었다;
5. ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체는 최종 농도 0.0536, 0.134, 0.335, 0.839, 2.097, 5.24,13.1, 32.8, 81.9, 204.8, 512, 1280, 3200 그리고 20000 ng/ml로 사용되었다;
6. IL-Ιβ 그리고 ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체는 lO배의 농축된 용액으로 준비되었다;
7. 세포들에 대해 실험을 위한 물질을 첨가하기 이전, 10배 농축된 IL-Ιβ/IL-1F2 120 μL은 대응되는 10배로 농축된 ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체 용액 (또는 적절한 대조군) 120 μL과 섞여지고 실온에서 30분간 인큐베이션된다;
8. 인큐베이션후에, 100 μL의 각 혼합물은 0.4 mL의 성장 배지를 포함한 웰에 첨가된다;
9. 세포들은 실험용 물질의 존재하에서 24시간 동안 인큐베이션되고 상층액은 수집되어 300 x g의 속도로 10 분간 원심분리되고 IL-6 ELISA 검정을 위해 사용된다.
ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체에 의한 IL-6 생산의 저해 검정에서 얻어진 교정 곡선은 도 10에 나타나 있다. 실험에서 배양 배지의 ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체에 의한 IL-6 생성과 IL-6 회수의 측정의 결과는 도 11 그리고 도 12에 나타나 있다. 얻어진 IL-6 생성을 위한 수치 값과 그들의 표준편차는 표 6에 나타나 있다.
IL-6 생성 값 요약
샘플 ID 평균, pg/ml 표준편차 pg/ml 보정 범위
세포 대조군 13.97 0.23
IL-1 단독, 50 pm/ml 플레이트 1 548.9 7.29 R
IL-1 단독, 50 pm/ml 플레이트 2 563.1 1.87 R
IL-1 + 0.054 ng/ml 헤테로이량체 322.9 15.69 R
IL-1 + 0.134 ng/ml 헤테로이량체 256.2 12.51
IL-1 + 0.335 ng/ml 헤테로이량체 180.2 8.69
IL-1 + 0.834 ng/ml 헤테로이량체 108.6 3.86
IL-1 + 2.09 ng/ml 헤테로이량체 46.7 1.39
IL-1 + 5.24 ng/ml 헤테로이량체 21.9 1.26
IL-1 + 13.11 ng/ml 헤테로이량체 12.9 0.24
IL-1 + 32.8 ng/ml 헤테로이량체 13.9 0.29
IL-1 + 81.92 ng/ml 헤테로이량체 13.4 1.04
IL-1 + 204.8 ng/ml 헤테로이량체 Pl.1 13.4 0.64
IL-1 + 512 ng/ml 헤테로이량체 12.9 0.65
IL-1 + 1280 ng/ml 헤테로이량체 13.9 0.16
IL-1 + 3200 ng/ml 헤테로이량체 16.1 3.03
IL-1 + 8000 ng/ml 헤테로이량체 16.9 1.09
IL-1 + 20000 ng/ml 헤테로이량체 22.5 0.55
헤테로이량체 단독 20000 ng/ml 20.9 1.04
IL-1 + 204.8 ng/ml 헤테로이량체 Pl. 2 13.9 0.68
헤테로이량체 + 30 pg/ml IL-6 스파이크 27.4 1.2
R - 값이 검정 보정 범위 밖에 있다는 있다는 것을 나타낸다.
각 실험 요소는 이중으로 복제되어 플레이팅 되었고, IL-6 생성은 복제된 각각에 대해 측정되어 농도 요소당 4개의 실험 결과를 얻을 수 있었다. 얻어진 데이터는 실험 절차와 검정의 높은 재현성을 입증한다. 앞서 말한 실험은 이 실험에서 사용한 ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체에 대한 IC50의 값은 약 0.3 mg/ml 또는 약 2.4 pM이었다.
실시예 5 : 마우스에 피하 투여 후의 ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체의 약동학 (PK).
ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체 폴리펩타이드 (서열번호 l 및 서열번호 2)는 동시에 발현되었고 앞선 실험에서 기술한 바와 같이 기본적으로 정제되었다. 동물에게 투여하기 위해 폴리펩타이드는 다음과 같은 버퍼에서 형성되었다: 1% w/v 수크로즈, lOOmM 염화나트륨, 20 mM L-아르기닌 하이드로클로라이드, 25 mM 중탄산나트륨, pH 6.3. 폴리펩타이드의 투여를 위한 스톡 농도는 0.5 mg/mL였다.
14개의 암컷 Balb/c nu/nu 마우스 체중에 따라 임의로 추출되어 실험의 날 0에 2개의 동물로 7개의 그룹이 지어졌다. 폴리펩타이드의 1회 처리 (5 mg/kg)는 실험의 날 0에 실험의 날 0에 혈청 준비를 위해 심장의 구멍이 나서 피를 흘리는 그룹 1의 마우스를 제외한 모든 그룹에 피하(등)를 통해 투여되었다. 혈액 샘플은 남은 그룹의 다양한 시간에서 혈장 준비를 위한 실험을 통해 외부의 부비강을 통해 채취되었다.
체중은 투여날 (0 일)에 모든 동물에 대해 기록되었고, 그리고 나서 각 그룹의 마지막 날을 포함하여 일주에 3회 측정되었다.
마우스 그룹들은 혈장 준비를 위해 특정 시간에 도태되었다. 0 시간과 처리 후 36시간 이내의 채취된 샘플의 도태된 그룹에 대한 체중 변화는 측정되지 않았다. 체중이 얻어진 것과 다른 심각한 의학적 징후를 보이지 않는 모든 다른 마우스들은 연구 기간 동안 보고되었다.
연구에서 생전 기간 다음에, 혈장 샘플들은 ELISA에 의해서 Hu-Fc 단백질이 분석되었다. ELISA에 의한 마우스 혈장 샘플에서 Hu_Fc의 수량화는 순환하는 폴리펩타이드의 양을 위한 판독 결과로서 사용되었다. 검정연구에서 사용된 모든 마우스 샘플에 대해 수행되었다.
1시간의 투여 후에 동물의 혈장에서 폴리펩타이드가 측정되었다. 그리고 나서, Prism 5.0c (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA)를 사용한 One Phase Decay 모델 공식 (One Phase Decay Model equation)은 Hu-Fc ELISA에 의해 감지된 폴리펩타이드의 약동학을 결정하기 위해서 사용되었다. Hu-Fc의 순환하는 수준의 최고점 (Cmax)은 1.65 μg/mL로 결정되었고, 순환하는 수준의 최고점에의 시간 (Tmax)은 처리 후 36시간이었다. 반감기 (Tl/2)는 88.15 시간이었고 속도 상수 (K)는 0.0079 hr-1 였다. 처리되지 않은 그룹 1의 혈장에서 Hu-Fc의 수준은 무시할 정도였다. 연구의 결과는 표 7에 요약되어 있다.
투여 후 각각의 시간에서 평균 사람-Fc 단백질 농도 ± SEM (μg/mL)
그룹 처리 체혈 스케쥴 (투여후 시간) 평균 사람-Fc 단백질 농도 [μg/mL] SEM
1 비처리 0시간 0.00 -*
2 서열번호 1 및 2의 폴리펩타이드 (5 mg/kg, 단지 1회,s.c.) 30분 0.02 0.01
3 1시간^ 0.12 0.00
4 2시간^ 0.24 0.09
5 4시간^ 0.76 0.03
6 8시간^ 1.11 0.10
7 10시간^ 1.53 0.08
2 24시간# 1.47 0.14
3 36시간# 1.65 0.11
4 96시간# 1.27 0.01
5 7일# 0.43 0.01
6 14일# 0.13 0.07
7 21일# 0.06 0.04
*그룹에서 샘플 중 하나에서 Hu-Fc 수준처럼 계산되기 어려운 SEM(Standard error of the mean)은 ELISA의 검출가능한 한계 이하였다.
인간의 Fc 단백질 농도는 세개의 샘플의 평균 흡수도에 기초한 Prism Software에 의해 결정되었다.
∧외부의 부비강을 통한 출혈
#말단의 심장의 구멍을 통한 출혈
실시예 6 : C57BL6 마우스에서 28일의 반복된 투여후에 ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체의 유독성의 평가.
다음은 반복된 투여의 유독성 평가 연구 결과 요약이다. 본 연구에서 일주일에 두번 10, 30 그리고 100 mg/kg의 피하 투여 마우스에 대한 ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체 폴리펩타이드 (서열번호 l 및 서열번호 2)의 처리 실험은 잘 수용되었다. 연구의 종료 이전에 예정되지 않은 죽음은 존재하지 않았다. 실험에서 사용한 처리는 사망률 또는 유독성의 임상적 징후와 연관되어 있지 않았다. 일관된 성(gender)이 있거나 체중의 영향에 연관된 처리가 존재하지는 않는다. 처리에 대한 가능한 결과로 여겨지나 부정적인 것으로 여겨지지 않는 증가된 식품 소비의 발견이 있었다.
비록 임상적 생화학에 연관된 파라미터에 있어서 기능적 변화의 증거가 존재하지만, 비록 일부의 경우 완전한 것은 아니지만 대개의 경우에서 이러한 파라미터의 가역성의 증거가 존재하기 때문에 독물학상 중요한 것으로 여겨지지 않는다. 독역학 (toxicokinetic) 평가가 부존재하는 상황에서 이러한 일부의 차이의 명백한 비가역성의 평가는 불가능하다. 그러나, 조직병리학적 변화와 연관된 차이가 존재하거나 부정적인 것으로 여겨지는 것은 존재하지 않는다. 관찰된 차이점들은 전형적으로 가역적인 형태이고 가역적 기간은 이것을 증명하는데 충분하지 않다.
따라서 ILlR-FcV-RAcP-FcII 헤테로이량체 마우스에 대한 처리의 28일의 연구에서 관찰되지 않은 부정적 영향의 수준 (No-Observed Adverse Effect Level (NOAEL))은 100 mg/kg으로 여겨지는 것으로 결론지어졌다.
여기에 언급된 모든 출판물들과 특허권들은 마치 개개의 출판 또는 특허권이 특이적이고 개별적으로 참조에 의해 포함되어 있는 것처럼 전체로서 참조에 의해 포함되어 있다.
중요한 연구의 구체적 실시형태들이 논의되는 동안에, 위의 발명의 상세한 설명은 실시예가 되고 이것에 제한되는 것은 아니다. 많은 변이들이 이 발명의 상세한 설명과 아래의 청구항의 검토에 있어 능숙한 자에 대해서는 분명해질 것이다. 발명의 완전한 범위는 청구항과 이와 동등한 완전한 범위, 그리고 그러한 변이와 함께한 발명의 상세한 설명을 참조하여 결정되어야 한다.

Claims (40)

  1. 사람 IL-Ιβ에 결합할 수 있는 헤테로이량체 단백질 조성물로서, 상기 단백질 조성물은
    사람 IL1-R1의 아미노산 18 내지 333을 포함하는 제1 아미노산 서열 및 사람 면역글로불린 감마-1 Fc의 Fc 부분의 제1 돌연변이체를 포함하는 제2 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
    사람 ILl-RAcP의 아미노산 21 내지 358을 포함하는 또 다른 제1 아미노산 서열 및 사람 면역글로불린 감마-1 Fc의 Fc 부분의 제2 돌연변이체를 포함하는 또 다른 제2 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하고,
    상기 제1 및 제2 돌연변이체는 상기 제1 돌연변이체와 제2 돌연변이체 사이에서 임의의 호모이량체 어셈블리보다 헤테로이량체 어셈블리에 유리하도록 선택되는, 단백질 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 조성물이 ELISA 검정에서 약 50 ng/ml의 ED50으로 사람 IL-1β 결합 활성을 나타내는, 단백질 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는, 단백질 조성물.
  4. 사람 IL-Ιβ에 결합할 수 있는 헤테로이량체 단백질 조성물을 포함하는 치료 조성물로서, 상기 헤테로이량체 단백질 조성물은
    사람 IL1-R1의 아미노산 18 내지 333을 포함하는 제1 아미노산 서열 및 사람 면역글로불린 감마-1 Fc의 Fc 부분의 제1 돌연변이체를 포함하는 제2 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
    사람 ILl-RAcP의 아미노산 21 내지 358을 포함하는 또 다른 제1 아미노산 서열 및 사람 면역글로불린 감마-1 Fc의 Fc 부분의 제2 돌연변이체를 포함하는 또 다른 제2 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하고,
    상기 제1 및 제2 돌연변이체는 상기 제1 돌연변이체와 제2 돌연변이체 사이에서 임의의 호모이량체 어셈블리보다 헤테로이량체 어셈블리에 유리하도록 선택되는, 치료 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 마우스에서 5 mg/kg의 용량으로 피하 투여한 후 전신 순환 중의 상기 헤테로이량체 단백질 조성물의 반감기가, 사람 Fc ELISA로 검정시, 적어도 약 88시간인, 치료 조성물.
  6. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 헤테로이량체 단백질 조성물을 포함하는 치료 조성물.
  7. 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산.
  8. 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 코돈 사용이 포유동물 세포에서 상기 폴리펩타이드의 고발현에 최적화된 것인, 핵산.
  10. 제7항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열번호 5의 서열을 포함하는, 핵산.
  11. 제8항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열번호 6의 서열을 포함하는, 핵산.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 핵산이 발현 벡터를 포함하는, 핵산.
  13. 서열번호 7의 분리된 핵산.
  14. 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 또 다른 핵산을 포함하는 (harboring) 이종 발현 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 상기 발현 벡터가 포유동물 세포에 포함되는, 발현 시스템.
  16. 제15항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 CHO 세포인, 발현 시스템.
  17. 제15항에 있어서, 상기 발현 시스템이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 헤테로이량체 단백질을 발현할 수 있고, 상기 헤테로이량체 단백질의 발현 수준이 세포 배양물 리터 당 적어도 300 mg인, 발현 시스템.
  18. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 헤테로이량체 단백질을 포함하는 물질의 사람 IL-Ιβ 활성 조절과 연관된 질환의 치료 또는 예방용 의약 제조를 위한 용도.
  19. 제18항에 있어서, 상기 질환이 관절염인, 용도.
  20. 제18항에 있어서, 상기 질환이 통풍인, 용도.
  21. 제18항에 있어서, 상기 질환이 류마티스 관절염인, 용도.
  22. 제18항에 있어서, 상기 질환이 크리오피린-연관된 주기적 증후군 (CAPS)인, 용도.
  23. 제18항에 있어서, 상기 질환이 공피증인, 용도.
  24. 제18항에 있어서, 상기 질환이 당뇨병인, 용도.
  25. 제18항에 있어서, 상기 질환이 죽상동맥경화증인, 용도.
  26. 제18항에 있어서, 상기 질환이 건성 안 질환인, 용도.
  27. 제18항에 있어서, 상기 질환이 눈 알러지인, 용도.
  28. 제18항에 있어서, 상기 질환이 포도막염인, 용도.
  29. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 헤테로이량체 단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 사람 IL-Ιβ 활성 조절과 연관된 질환의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 사람 IL-Ιβ 활성 조절과 연관된 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 질환이 관절염인, 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 질환이 통풍인, 방법.
  32. 제29항에 있어서, 상기 질환이 류마티스 관절염인, 방법.
  33. 제29항에 있어서, 상기 질환이 크리오피린-연관된 주기적 증후군 (CAPS)인, 방법.
  34. 제29항에 있어서, 상기 질환이 공피증인, 방법.
  35. 제29항에 있어서, 상기 질환이 당뇨병인, 방법.
  36. 제29항에 있어서, 상기 질환이 죽상동맥경화증인, 방법.
  37. 제29항에 있어서, 상기 질환이 건성 안 질환인, 방법.
  38. 제29항에 있어서, 상기 질환이 눈 알러지인, 방법.
  39. 제29항에 있어서, 상기 질환이 포도막염인, 방법.
  40. 사람 IL-Ιβ에 결합할 수 있는 헤테로이량체 단백질 조성물로서, 상기 단백질 조성물은 사람 IL-Ιβ로의 섬유모세포 치료에 반응하여 사람 폐 섬유모세포에서 사람 IL-6 생성을 억제할 수 있으며, 상기 억제가 약 2.3 pM의 IC50 값을 갖는, 조성물.
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