KR20160044348A - 불포화 지방산을 생산하는 재조합 대장균, 및 이를 이용한 불포화 지방산의 제조방법 - Google Patents

불포화 지방산을 생산하는 재조합 대장균, 및 이를 이용한 불포화 지방산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 불포화 지방산 중 시스-박센산(cis-vaccenic acid)을 생산하는 재조합 대장균, 및 이를 이용한 불포화 지방산의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 불포화 지방산을 생산하는 재조합 대장균은, 지방산 합성 신장단계의 세 종류의 유전자 fabB, fabF, fabA를 cold shock 단백질의 유전정보를 보유한 cspA를 프로모터 (promoter)로 이용하여 저온에서의 유전자의 발현 효율을 높이는 특징으로 하는 플라스미드 (pCOLD1)에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조하여, 숙주 균주인 대장균 (E. coli BL21(DE3))에 상기 재조합 플라스미드가 들어가 형질전환을 일으킴으로써, 저온에서의 배양 시에 세 개의 유전자의 발현 효율을 증대시키는 효과가 있다. 또한, 상기 재조합 대장균을 이용하여 낮은 온도에서 배양하여 지방산을 제조한 경우, 불포화 지방산 중 박센산(vaccenic acid)의 비율과 양이 크게 늘어나, 불포화 지방산을 효과적으로 생산할 수 있다.

Description

불포화 지방산을 생산하는 재조합 대장균, 및 이를 이용한 불포화 지방산의 제조방법{Recombinant E.coli producing unsaturated fatty acid, and method for producing unsaturated fatty acid using the same}
본 발명은 불포화 지방산 중 cis-박센산(cis-vaccenic acid)을 생산하는 재조합 대장균, 및 이를 이용한 불포화 지방산의 제조방법에 관한 것이다.
현재 세계 시장의 고성장은 에너지의 사용 증가를 바탕으로 이루어지고 있다. 석유 에너지의 고갈로 인한 유가 상승의 고공행진이 이루어지면서, 이를 대체할 에너지의 개발이 시급한 실정이다. 이를 위해 태양력이나 풍력 같은 자연 에너지 개발에 관심이 모아지고 있지만, 에너지 밀도가 낮고 간헐적으로 밖에 사용할 수 없다는 등의 단점이 있어 보급에 많은 제약이 따르고 있다. 또한, 연료의 대부분을 수입에 의존하고 있는 국내 에너지 시장의 유가는 2011년에 전년대비 36% 상승으로 분석되었으며(한국석유공사 보도자료 참고), 신흥국의 지속적인 수요증대에 따라 고유가 수준을 유지할 전망이라고 분석하였다. 특히, 국제 유가는 서민 생활물가에 바로 영향을 주기 때문에 석유 의존도가 낮은 새로운 대체에너지 생산이 필수적이다.
대체에너지로서 가장 각광받는 것이 바이오연료(biofuel)인데, 이는 살아있는 바이오매스(biomass)로부터 유기체뿐만 아니라 대사활동에 의한 부산물을 포함하는 생산물을 이용한 신재생에너지의 종류이다. 바이오연료의 대표적인 예로는 현재 수송연료로 사용이 되고 있는 바이오에탄올(bioethanol), 바이오디젤(biodiesel), 메탄올(methanol), 바이오가스(biogas) 및 고형연료 등이 있으며, 이들 모두 전력생산이나 수송연료로서의 가능성이 있다.
바이오디젤은 하기와 같은 구조로 표시되는 화학적으로 긴 지방산 고리를 가진 단일 알킬에스터(alkyl ester) 혼합물이다. 바이오디젤은 경유와 매우 비슷한 물리적 특성 때문에, 현재 사용되는 내연기관의 교체없이 사용할 수 있는 장점이 있다. 또한 기존시설을 통해 운반, 판매가 가능하여 운송연료의 대표적인 대체에너지로 꼽히고 있다. 바이오디젤의 품질은 원료에 따라 결정이 되는데, 포화지방산이 많이 함유된 경우에는 상대적인 산화안정성은 우수하지만 겨울철에 저온유동성이 나쁜 단점이 있다. 반면 불포화지방산이 많은 경우에는 저온유동성이 좋지만 이중결합의 수가 많을 경우 산화안정성이 떨어지는 단점이 있다. 따라서, 가장 안정적인 원료는 올레인산(oleic acid, octadecenoic acid, C18 : 1Δ9)의 함량이 60％가 넘는 바이오디젤로 알려져 있다.
Figure pat00001
식물성 바이오디젤의 지방산 조성비율 및 식물유지로부터 제조한 바이오디젤의 물리적 특성에 대해 각각 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
바이오디젤 조성
원료 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3
팜유 42.6 0.3 4.4 40.5 10.1 0.2
대두유 13.9 0.3 2.1 23.2 56.2 4.3
유채씨유 3.5 0 0.9 64.1 22.3 8.2
동점도
(40, mm2/s) 		세탄가 저위발열량 구름점
(℃)		 저온필터
막힘점(℃)		 인화점
(℃)		 산화안정도 (h), 110℃
팜유 5.7 62 33.5 13 12 164 4.0
대두유 4.0 45 33.5 1 -4 178 2.1
유채씨유 4.4 54.4 - -3.3 -13 - 7.6
한편, 대장균(Escherichia coli)은 포유류들과는 다른 지방산 합성 타입(Type 2)을 이용하기 때문에 이를 통한 연구가 많이 진행되어 왔다. 지방산 합성 타입 2시스템은 개시단계와 아실기의 신장단계에서 기본적인 효소들을 가지고 있으며, 이러한 효소의 지방산 합성 단계는 도 1에 나타내었다. 대장균에 필요한 지방산은 이러한 반복적인 합성으로 생산되며, 주로 생산되는 포화지방산으로는 탄소수 16개인 팔미트 산(palmitic acid, hexadecanoic acid)과 불포화지방산으로는 탄소수 18개에 이중결합이 하나 존재하는 시스-박센산(cis-vaccenic acid, cis-11-octadecanoic acid, C18:1△11)과 팔미톨레익산 (palmitoleic acid, 9-cis-hexadecenoic acid)이 있다.
대장균에 존재하는 fab(fatty acid biosynthesis) 유전자들은 지방산 합성 단계에 관여하는 효소 생산 유전자들이다. 지방산 생합성 경로는 크게 개시단계 (initiation step), 신장단계 (elongation step), 종결단계 (termination step), 베타-옥시데이션 단계 (β-oxidation step)로 구성된다. 지방산 합성에서 신장단계에 관여하는 유전자는 fabA, fabB, fabF가 있다. β-Hydroxydecanoyl ACP dehydrase/isomerase의 유전정보를 가지고 있는 fabA와 KASI(β-ketoacyl-ACP (acyl-carrier-protein) synthaseI)의 유전정보를 가지고 있는 fabB는 불포화지방산 합성에 필수적 유전자이다. fabB와 함께 KASII (β-ketoacyl-ACP synthaseII)의 유전정보를 가지고 있는 fabF는 지방산 신장단계에 위치하며 지방산-ACP에 말로닐-ACP를 결합시켜 지방산의 탄소수를 2개씩 늘려 지방산의 길이를 신장시키는 역할을 한다. 이 세 가지 효소는 대장균의 세포막의 주요 성분인 팔미트산, 팔미톨레익산, 시스-박센산 (cis-vaccenic acid, C18:1△9)을 생합성하는데 직접적인 경로에 관여하며 특히, 불포화지방산인 시스-박센산 생성에 핵심적인 역할을 하는 효소인 KASII의 경우 낮은 온도에서 발현이 잘 된다는 특징이 있다. 대장균의 지방산 생합성 관여 효소 및 유전자 정보는 표 3에 나타내었다.
대장균에 목적 유전자를 플라스미드를 이용하여 형질전환 (transformation) 및 발현 (expression)시켜 목적 단백질 (protein)을 생산하거나 단백질이 효소역할을 하여 대사산물을 생산하는 연구는 많이 진행되어 왔다. 재조합 플라스미드에 의해 형질전환 된 재조합 대장균의 경우 저온에서 배양을 하면 생육이 일시적으로 정지하고 대부분의 재조합 대장균의 경우 재조합 플라스미드의 단백질 발현이 감소한다. 플라스미드 pCOLD1에 코딩(coding)되어 있는 cold shock 단백질은 특이적으로 발현이 유도되어서 pCOLD1에 재조합 된 목적 유전자의 발현을 낮은 온도에서도 잘 되게 할 수 있다. 상기 cold shock 단백질의 유전정보를 보유한 유전자는 cspA이다. 상기 플라스미드 (pCOLD1, Takara)는 상기 유전자 cspA의 프로모터 (promoter)을 이용한 단백질 발현 벡터이다. 이 프로모터를 이용하면 목적단백질 발현이 균체 단백질의 최대 60%이고 종래 발현계에서 발현되지 않는 단백질을 발현할 수 있고 다양한 대장균에서 사용이 가능하다는 특징이 있다.
유전자 발현 단백질 돌연변이 경우 나타나는 표현형(phenotype) 변화
aas Acyl-ACP synthetase lysophosphatidyl
ethanolamine 축적
accA Acetyl-CoA carboxylase carboxyltransferase α subunit
accB Acetyl-CoA carboxylase BCCP subunit
accC Acetyl-CoA carboxylase biotin carboxylase subunit
accD Acetyl-CoA carboxylase carboxyltransferase β subunit
acpP ACP ACP structural gene
acpS ACP synthetase apo-ACP 축적
cfa Cyclopropane fatty acid synthase cells lack cyclopropane fatty acids
fabA β-Hydroxydecanoyl ACP
dehydrase/isomerase		 불포화지방산 자가영양 (unsaturated fatty acid auxotroph)
fabAup - 포화지방산(saturated fatty acid) 과생산
fabB β-Ketoacyl-ACP synthase Ⅰ 불포화지방산 자가영양(unsaturated fatty acid auxotroph)
fabD Malonyl-CoA:ACP transacylase 온도에 따라 포화지방산, 불포화지방산의 자가영양(auxotroph) 필요
fabE Acetyl-CoA carboxylase -
fabF β-Ketoacyl-ACP synthase Ⅱ 온도에 따라 조절
fabG β-Ketoacyl-ACP synthase -
fabH β-Ketoacyl-ACP synthase Ⅲ -
fabI Enoyl-ACP reductase -
fabZ 3-hydroxyacyl-ACP dehydratase -
fadD Long-chain acyl-CoA synthetase -
fadR Transcriptional regulator of fabA -
fatA trans불포화지방산의 이용
lpxA UDP-Glc-NAc acyltransferase 지질 A(lipid A) 축적
orf-17 Putative dehydrase -
plsB sn-Glycerol-3-phosphate acyltransferase glycerol-3-phosphate 자가영양
plsC 1-Acylglycerol phosphaste acyltransferase -
plsX Unknown PlsB- 표현형에 필요
tesA Thioesterase Ⅰ 효소활성 결핍
tesB Thioesterase Ⅱ 효소활성 결핍
상기와 같이, 화석연료의 대체 에너지로서 바이오디젤로 변환이 가능한 지방산에 대한 관심이 점점 증대되고 있으며, 이로 인해 지방산을 생합성하는 대장균에 대한 관심도 증대되고 있다. 현재의 바이오디젤은 식물성 유지를 이용하여 만들어지고 있다. 불포화지방산 함유량이 많은 바이오디젤의 경우, 낮은 온도에서도 잘 얼지 않는다는 장점이 있다. 예로 유채씨유를 이용한 바이오디젤의 경우, 64％가 넘는 올레익산 함유를 가지고 있어 다른 바이오디젤보다 더 낮은 온도에서 언다. 하지만, 식물성 유지의 경우 식량과 관계하여 곡물가 상승과 농경지 부족, 토지가격 상승 등의 문제가 있어 미생물을 이용한 에너지 생성이 주목받고 있다. 미생물의 경우 세포막을 구성하는 지방 형태로 지방산을 생합성 하고 있으며, 이에 따라 유전자 조작이 가능한 대장균에 대한 관심도 증대하여, 이에 관한 연구가 진행되고 있다.
따라서, 신재생에너지 개발의 일환으로 바이오디젤로 전환하였을 때 물리적 특성이 유리한 불포화 지방산의 조성을 높일 수 있는 균주의 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
이러한 요구에 따라, 본 발명자들은 불포화 지방산의 생산성을 향상시킨 신규한 균주를 개발하고자 하였다.
앞서 본 발명자들은 불포화 지방산 중 박센산(cis-vaccenic acid)을 생산하는 신규한 재조합 대장균을 개발한 바 있다.
본 발명의 배경이 되는 기술로, 본 발명자들은 대한민국 등록특허 제10-1402108호(2014년05월26일)에서 불포화 지방산 중 박센산(cis-vaccenic acid)을 생산하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 지방산의 제조방법에 대해 개시한 바가 있고, 대한민국 등록특허 제10-1275090호(2013년06월10일)에서 지방산을 생산하는 재조합 대장균, 및 이를 이용한 지방산의 제조방법에 대해 개시한 바 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
대한민국 등록특허 제10-1402108호(2014년05월26일) 대한민국 등록특허 제10-1275090호(2013년06월10일)
본 발명자들은 불포화 지방산의 조성을 높일 수 있는 균주를 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과, cold shock 단백질의 유전정보를 보유한 cspA 프로모터 (promoter)를 이용하여 지방산 합성 신장단계에서 탄소 사슬의 신장과 지방산 생성 마지막 단계에 작용하는 효소 (KASI, KASII)의 정보를 가진 두 개의 유전자 fabB, fabF와 KASI와 함께 불포화지방산 생성 단계에 관여하는 효소 (β-Hydroxydecanoyl ACP dehydrase/isomerase)의 정보를 가진 유전자 fabA를 포함하는 재조합 플라스미드를 제조하고 이에 의해 형질전환된 재조합 대장균을 제조하였다. 상기 재조합 대장균을 저온에서 배양하고 이로부터 지방산을 추출하여 불포화지방산 중 시스-박센산(cis-vaccenic acid)의 비율이 크게 늘어남을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 재조합 플라스미드 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 불포화 지방산 중 cis-박센산(cis-vaccenic acid)을 생산하는 재조합 대장균을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 불포화 지방산의 제조방법을 제공하는 데 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 5' 에서 3' 방향으로 작동가능하게 연결된(operatively linked), (i) 원핵세포에서 작동가능한 프로모터(promoter); 및 (ii) E.coli K-12 MG1655의 베타-케토 아실-아실 운반 단백질 합성효소II (KASII, β-keto acyl-acyl carrier protein synthaseII)를 코딩하는 뉴클레오티드 (fabF, 서열번호 1); E.coli K-12 MG1655의 베타-케토 아실-아실 운반 단백질 합성효소I (KASI, β-keto acyl-acyl carrier protein synthaseI)를 코딩하는 뉴클레오티드 (fabB, 서열번호 2); 및 E.coli K-12 MG1655의 베타-하이드록시 데카노일 사이오에스터 디하이드레이즈/아이소머레이즈(β-hydroxy decanoyl thioester dehydrase/isomerase)를 코딩하는 뉴클레오티드 (fabA, 서열번호 3); 를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 재조합 플라스미드는 pCOLD1::fabF, fabB, fabA이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는, 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미하며, 구체적으로는 프로모터 서열, 터미네이터 서열, 마커 유전자, 기타 적합한 서열을 비롯하여 적합한 조절 서열을 포함하도록 제작할 수 있다. 이러한 벡터는 플라스미드, 파지, 코스미드 등일 수 있다(Molecular Cloning: Laboratory Manual: 2판, Sambrook 등 Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)). 이러한 벡터의 제조, 돌연변이 유발, 서열 분석, 세포 내로의 DNA의 도입 및 유전자발현과 단백질 분석법은 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 등 편집, John Wiley ＆ Sons (1992))에 상세히 기재되어 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이며, 본 명세서에서 '플라스미드' 및 '벡터'는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 벡터는 원핵세포에서의 발현에 적합한 벡터이며, 목적 단백질을 발현하는 플라스미드 벡터이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된"은, 발현 조절 서열이 목적단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사 및 해독을 조절하도록 연결된 것을 말하며, 발현 조절 서열(프로모터 포함)의 조절 하에 뉴클레오티드 서열이 발현되어 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 목적단백질의 폴리펩타이드가 생성되도록 정확한 해독 프레임을 유지시키는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터"는, 전사를 이끌기에 충분한 최소한의 서열을 의미한다.
본 발명에서 원핵세포에서 목적단백질을 발현하기 위해 사용할 수 있는 프로모터에는 예컨대, cspA, T7, tac, trc, lac, lpp, phoA, recA, araBAD, proU, cst-1, tetA, cadA, nar, lpp-lac, starvation promoters, T7-lac operator, T3-lac operator, T5-lac operator, T4 gene 32, nprM-lac operator 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는 cspA, T7, tac, lac, T7-lac operator, T3-lac operator, T5-lac operator, T4 gene 32, 보다 바람직하게는 cspA, T7, tac, T7-lac operator가 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 프로모터는 cspA 프로모터이다.
상기 cspA 프로모터는 저온에서 유전자의 발현 효율을 높이는 cold shock 단백질의 유전정보를 보유하며, pCOLD1 내에 존재한다.
따라서, 상기 cspA 프로모터(서열번호 4)를 이용하여 저온에서 보다 안정적으로 목적단백질의 발현을 유도할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 벡터에 의해 형질전환된 재조합 대장균을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 재조합 대장균은 불포화 지방산을 생산한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 불포화 지방산은 시스-박센산(cis-vaccenic acid)이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 재조합 대장균은 E. coli BL21(DE3)::pCOLD1::fabF, fabB, fabA(기탁번호 : KCTC18324P)이다.
본 발명에 따른 지방산을 생산하는 재조합 대장균은, cold shock 단백질의 유전정보를 보유한 cspA를 프로모터(promoter)를 이용하여 저온에서의 유전자의 발현 효율을 높이는 특징으로 하는 플라스미드(pCOLD1)에 대장균 K-12 MG1655의 베타-케토 아실-아실 운반 단백질 합성효소II (KASII, β-keto acyl-acyl carrier protein synthaseII)의 유전정보를 보유한 뉴클레오티드 (fabF, 서열번호 1); 대장균 K-12 MG1655의 베타-케토 아실-아실 운반 단백질 합성효소I (KASI, β-keto acyl-acyl carrier protein synthaseI)의 유전정보를 보유한 뉴클레오티드 (fabB, 서열번호 2); 및 대장균 K-12 MG1655의 베타-하이드록시 데카노일 사이오에스터 디하이드레이즈/아이소머레이즈 (β-hydroxy decanoyl thioester dehydrase/isomerase)의 유전정보를 보유한 뉴클레오티드(fabA, 서열번호 3)로 이루어진 재조합 플라스미드에 의해 형질전환된 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 유전자를 언급하면서 사용되는 표현 "유전정보를 보유한" 및 "유전정보를 가진"은, 목적유전자를 코딩하는 것을 의미하며, 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.
본 발명에 사용된 유전자 정보는 대장균(E. coli K-12 MG1655)의 유전 정보를 바탕으로 하여, 지방산 신장단계에서 탄소 사슬의 신장과 지방산 생성 마지막 단계에 작용하는 효소(KASI, KASII)의 정보를 가진 두 개의 유전자 fabB, fabF와 KASI와 함께 불포화지방산 생성 단계에 관여하는 효소 (β-Hydroxydecanoyl ACP dehydrase/isomerase)의 유전정보를 가진 유전자 fabA을 이용한다.
구체적으로는, 대장균 (E.coli K-12 MG1655)에서 목적 유전자(fabB, fabF, fabA)을 이용하여 제조한 재조합 플라스미드 pEcoli-Nterm 6xHN::fabF, fabB, fabA (대한민국 등록특허 제10-1402108호에 개시)를 주형(template)으로 이용하여 중합효소연쇄반응 (PCR, polymerase chain reaction)을 수행하고 목적 유전자를 확보한다.
특히, 확보한 유전자 뉴클레오티드 (fabB, fabF, fabA)와 단백질 발현을 위한 플라스미드(pCOLD1)를 제한효소 반응과 라이게이션 (ligation) 반응을 수행하여 재조합 플라스미드를 제조한다[pCOLD1::fabF, fabB, fabA].
단백질 발현을 위한 플라스미드의 복제분기점의 경우, pCOLD1는 ColE1을 포함하며 암피실린 내성 유전자를 가지고, 저온에서의 유전자의 발현 효율을 높이는 cold shock 단백질의 유전정보를 보유한 cspA 프로모터 (promoter)를 보유하며, 유전자 발현 조절을 목적으로 하는 lac operator를 보유한다.
상기 제조된 재조합 플라스미드를 이용하여 열충격 형질전환방법을 통해 재조합 대장균을 제조한다[E. coli XL-1 blue::pCOLD1::fabF, fabB, fabA]. 상기 제조된 재조합 대장균은 항생제가 포함된 고체 LB 배지에서 원형 콜로니 형태로 자라는 것을 확인하였으며, 이 콜로니를 암피실린이 포함된 액체 LB 배지에서 배양하고 플라스미드를 추출한 후 제한효소로 처리한 플라스미드의 유전자 (fabB, fabF, fabA)와 E. coli K-12 MG1655의 유전자 염기서열과 오류가 없음을 확인하였다.
상기 제조된 재조합 대장균 (E. coli BL21(DE3)::pCOLD1::fabF, fabB, fabA)을 2014년 09월 17일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행(KCTC)에 기탁하였으며, KCTC18324P의 수탁번호를 부여받았다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 불포화 지방산의 제조 방법을 제공한다:
(a) 상기 재조합 대장균을 1차 배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 1차 배양한 재조합 대장균을 10℃ 내지 20℃의 저온에서 2차 배양하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 얻은 배양액을 원심분리하여 균체와 배지를 분리하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 분리된 균체에 황산과 메탄올의 혼합용액을 첨가하고, 질소를 충전한 다음, 에스테르화 반응을 수행하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 반응액에 헥산과 증류수를 첨가하여 층을 분리하는 단계.
바람직하게는, 상기 (b) 단계의 2차 배양은 15℃ 내지 18℃의 저온이고, 가장 바람직하게는 17℃이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 (e) 단계에서 분리된 층의 불포화 지방산 조성을 분석하는 단계를 추가적으로 포함한다.
상기 분석은 지방산의 조성을 분석할 수 있는 한, 당업계에 공지된 어떠한 방법도 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 불포화 지방산은 시스-박센산(cis-vaccenic acid)이다.
예컨대, 상기 제조된 재조합 대장균(E.coli BL21(DE3)::pCOLADuetTM-1::accA, accB, accC, accD + pEcoliNterm 6xHN:: fabF, fabB, fabA + pCDF-1b::`tesA)을 37℃에서 1차 배양하여 중간 지수기까지 자라게 하여 IPTG로 유도시킨 후에 낮은 온도인 17℃에 옮겨 2차로 배양하고, 원심분리하여 균체와 배지를 분리한 후, 분리된 균체에 황산과 메탄올의 혼합용액을 첨가하고 질소를 충전한 다음, 에스테르화 반응을 수행하고, 반응액에 헥산과 증류수를 첨가하여 층을 분리하여 헥산층을 가스크로마토그래피를 수행하여 불포화 지방산의 조성을 확인한다.
본 발명의 방법에 따르면, 불포화 지방산인 박센산(vaccenic acid)의 비율과 양이 월등하게 증가하였다.
본 발명의 방법은 상술한 재조합 대장균을 이용하여 불포화 지방산을 제조하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 대장균은 불포화 지방산을 효과적으로 생산함으로써, 바이오 연료로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 지방산을 생산하는 재조합 대장균은, 지방산 합성 신장단계의 세 종류의 유전자 fabB, fabF, fabA를 cold shock 단백질의 유전정보를 보유한 cspA를 프로모터 (promoter)로 이용하여 저온에서의 유전자의 발현 효율을 높이는 특징으로 하는 플라스미드 (pCOLD1)에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조하여, 숙주 균주인 대장균 (E. coli BL21(DE3))에 상기 재조합 플라스미드가 들어가 형질전환을 일으킴으로써, 저온에서의 배양 시에 세 개의 유전자의 발현 효율을 증대시키는 효과가 있다. 또한, 상기 재조합 대장균을 이용하여 지방산을 제조한 경우, 불포화지방산의 비율이 재조합 대장균 (E. coli BL21(DE3)::pEcoli-Nterm 6xHN::fabF, fabB, fabA)과 유전적 조작을 하지 않은 대장균 (E. coli BL21(DE3))의 불포화지방산의 비율과 비교해 크게 증가하여, 불포화 지방산을 효과적으로 생산할 수 있다.
도 1은 지방산 합성 경로 및 불포화 지방산 합성 경로를 나타낸 도이다.
도 2는 저온에서 대장균 내 단백질 발현 효율을 높이기 위해 사용한 플라스미드 (pCOLD1)의 정보를 나타낸 도이다.
도 3은 재조합 플라스미드(pCOLD1::fabF, fabB, fabA)와 fabF+fabB+fabA의 크기를 확인한 것을 나타낸 도이다.
도 4는 대장균 내 단백질 발현을 위한 플라스미드 pCOLD1과 fabB, fabF, fabA의 유전자 정보를 포함한 뉴클레오티드를 결합시킨 재조합 플라스미드의 구조 및 크기 변화를 나타낸 도이다.
도 5는 fabB, fabF, fabA의 유전정보에 대한 주형으로 이용하기 위한 플라스미드 pEcoli-Nterm 6xHN와 유전자 fabF, fabB, fabA의 유전자 정보를 포함한 뉴클레오티드를 결합시킨 재조합 플라스미드의 구조 및 크기 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 대장균 내 단백질 발현을 위한 플라스미드 pCOLD1에 결합시킨 fabF, fabB, fabA 유전자의 염기서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 목적 유전자의 정보를 보유한 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 플라스미드의 제조
1. PCR 을 이용한 유전자 증폭
본 발명에 사용된 유전자 정보는 대장균(E.coli K-12 MG1655)의 유전 정보를 바탕으로 하여, 지방산 합성 신장단계에서 탄소 사슬의 신장과 지방산 생성 마지막 단계에 작용하는 효소 (KASI, KASII)의 정보를 가진 두 개의 유전자 fabB(서열번호 1), fabF(서열번호 2)와 KASI와 함께 불포화지방산 생성 단계에 관여하는 효소 (β-Hydroxydecanoyl ACP dehydrase/isomerase)의 정보를 가진 유전자 fabA(서열번호 3)의 염기서열을 사용하였다. 염기서열 정보는 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, www.genome.jp/kegg/)에서 참고하였으며, 제작한 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하여 목적 유전자를 확보하였다. 목적 유전자의 증폭반응을 위한 프라이머 제작 및 제한효소는 표 4에 나타내었다.
목적 유전자 발현 효소 플라스미드 프라이머 제한효소
fabB KASI
(β-keto acyl-acyl carrier protein synthaseI)		 pEcoli-Nterm 6xHN 5'-GGA AGA TCT GAA GGA GAT ATA CCA TGA AAC GTG CAG TGA TTA CTG GCC-3' BglII,
NotI
5'-ATA AGA ATG CGG CCG CTT AAT CTT TCA GCT TGC GCA TTA CCA-3'
fabF KASII
(β-keto acyl-acyl carrier protein synthaseII)		 pEcoli-Nterm 6xHN 5'-AAA ACT GCA GGT GTG TCT AAG CGT CGT GTA GTT GTG A-3' PstI,
SalI
5'-ACG CGT CGA CTT AGA TCT TTT TAA AGA TCA AAG AAC C-3'
fabA β-Hydroxydecanoyl ACP dehydrase/isomerase pEcoli-Nterm 6xHN 5'-CCT TAA TTA AGG AAG GAG GGA TGG TAG ATA AAC GCG AAT CC-3' PacI,
XbaI
5'-GCT CTA GAG CTC AGA AGG CAG ACG TAT CCT G-3'
fabF, fabB, fabA pCOLD1 5'-AAA ACT GCA GGT AGT GTC TAA GCG TCG TGT AGT TGT GA-3' PstI, XbaI
5'-GCT CTA GAT CAG AAG GCA GAC GTA TCC TGG AAC AGA C-3'
중합효소연쇄반응을 위한 주형 유전자로 사용한 재조합 플라스미드 (pEcoli-Nterm 6xHN::fabF, fabB, fabA)에 해당하는 유전자 fabF, fabB, fabA에 대해서 대장균의 주형 유전자는 하기와 같은 방법으로 획득하였다. 먼저, E. coli K12 MG1655를 배양한 후, 대장균 배양액을 원심분리하고 상등액을 취하였다. 상등액에 5㎖의 리소자임 용액을 첨가하여 혼합한 후, 투명한 점성이 나타날 때까지 섞어주었다. 점성이 나타나면 2㎖의 10% SDS (sodium dodecyl sulfate) 용액을 첨가하고 30분 동안 반응하였다. 혼합물을 0.7㎖씩 마이크로튜브에 분주하고, PCI용액 (페놀, 클로로포름, 이소아밀 알콜)을 넣어 층 분리가 일어나지 않을 때까지 섞어주었다. 이 후 원심분리하고 상등액을 모아 같은 방법으로 PCI 용액을 처리하고 원심분리 하였다. 모아진 상등액 부피의 1/10 만큼 pH 6으로 적정한 3M 아세테이트와 두 배의 에탄올을 첨가하여 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA를 주형으로 하여, 각각의 유전자들 (fabB, fabF, fabA)의 프라이머와 함께 중합효소연쇄반응에 이용하여 유전자를 증폭하였다. 중합효소연쇄반응의 조건은 통상적인 조건으로 변성온도 (denaturing temperature) 94℃, 결합온도 (annealing temperature) 65℃, 신장온도 (extension temperature) 72℃에서 진행되었으며, 총 30회 반응을 수행하였다. 반응에 사용한 중합효소 (polymerase)는 NEB (New England Biolabs Inc.) 사의 제품을 사용하였다. 증폭된 유전자 물질은 정제과정을 거치고, 0.7% 아가로오스 겔 (agarose gel)에서 확인하였다.
2. 목적 유전자의 정보를 보유한 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 플라스미드의 제조
확보한 유전자 뉴클레오티드와 단백질 발현 벡터를 말단부위를 제외한 다른 부위를 절단하지 않는 공통된 제한효소를 사용하여 절단하고, 전기영동으로 확인하였다. 확인된 아가로오스 겔의 밴드(band)를 절단하여 50℃에서 녹인 후, 정제 과정을 거쳐 라이게이션(ligation)을 4℃에서 수행하여 선형의 pCOLD1에 fabF, fabB, fabA을 순서대로 결합시킨 원형 플라스미드 (pCOLD1::fabF, fabB, fabA)를 제조하였다. 재조합 플라스미드 (pCOLD1::fabF, fabB, fabA)와 fabF+fabB+fabA의 크기를 확인한 것을 도 3에 나타내었다. 플라스미드 pCOLD1과 fabB, fabF, fabA의 유전자 정보를 포함한 뉴클레오티드를 결합시킨 재조합 플라스미드의 구조 및 크기 변화는 도 4에 나타내었다. 그리고 fabB, fabF, fabA의 유전정보에 대한 주형으로 이용된 플라스미드 pEcoli-Nterm 6xHN와 유전자 fabF, fabB, fabA의 유전자 정보를 포함한 뉴클레오티드를 결합시킨 재조합 플라스미드의 구조 및 크기 변화는 도 5에 나타내었다.
실시예 2 : 재조합 플라스미드에 의해 형질전환 된 재조합 대장균의 제조
1. 재조합 플라스미드의 합성오류 확인
목적 유전자의 운반을 목적으로 하는 플라스미드 (pCOLD1::fabF, fabB, fabA)을 숙주세포에 넣기 전, 재조합 플라스미드의 합성오류 확인 및 벡터의 안정성과 숙주 균주로의 형질전환 시 효율 향상을 위해 대장균 E. coli XL1-Blue (E. coli XL1-B)를 이용하여 컴피턴트 세포 (competent cell)를 제조하여 일차 형질전환을 시도하였다(E. coli XL-1 blue:: pCOLD1::fabF, fabB, fabA).
컴피턴트 세포는 하기와 같은 과정으로 제조하였다. 37℃에서 배양한 E. coli XL1-Blue를 계대 배양하여, 생장 곡선의 지수기에 접어들었을 때 회수하여, 0℃에서 30분 동안 보관하였다. 배양액을 5,000 rpm에서 원심분리한 후 상등액을 제거하고, 세포벽을 플라스미드 이동이 용이하게 처리하기 위하여 MgCl2 용액을 넣어 30분 동안 0℃에서 보관하였다. 상기 용액을 다시 원심분리 하여 상등액을 제거하고 CaCl2 용액을 넣어 60분간 0℃에서 이차 처리하였다. 여기에 외부 유전자를 포함한 재조합 플라스미드(pCOLD1::fabF, fabB, fabA)를 넣어 0℃에서 30분 동안 반응시키고, 42℃의 온수조에서 30초 동안 열처리하고, 5분 동안 0℃의 얼음에 순차적으로 넣는 열충격 형질전환방법 (heat-shock method)을 실시하였다. 상기 열충격 형질전환방법을 실시한 샘플은 37℃에서 1시간 동안 배양하여 형질전환 과정을 거친 세포들의 정상 생장을 도왔다. 이 세포를 플라스미드가 내성을 가지고 있는 항생제 (암피실린)가 포함된 고체 LB 배지 (LB 아가 플레이트, 트립톤 10 g/L, NaCl 5 g/L, 효모 추출액 5 g/L, 아가 15 g/L)에 일정량 도말 (spreading)하였다.
상기 형질전환과정을 거친 샘플은 항생제가 포함된 고체 LB 배지에서 작은 원형 콜로니 (colony) 형태로 자라는 것을 확인하였다. 이 콜로니를 항생제가 포함된 5㎖의 액체 LB 배지에서 배양하고 일반적인 플라스미드 추출 키트를 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 상기 추출한 플라스미드는 중합효소연쇄반응 과정 후에 라이게이션을 위해 처리한 제한효소를 이용하여 플라스미드와 목적 유전자의 정보를 보유한 뉴클레오티드를 절단하여 E. coli K-12 MG1655의 유전자와의 크기를 비교하였다. 또한 상기와 같은 플라스미드의 유전자 염기서열 분석결과와 KEGG에 공개된 유전정보가 일치하는지 확인하여, 형질전환 과정의 돌연변이나 중합효소연쇄반응 도중에 일어나는 합성오류가 없음을 확인하였다. 이는 도 6에 나타내었다.
재조합 플라스미드 pCOLD1::fabF, fabB, fabA의 fabB 유전자의 염기서열과 E. coli K-12 MG1655의 fabB 유전자의 염기서열 분석결과에서 뉴클레오티드 한 곳의 서열이 E. coli K-12 MG1655와 상이하였지만, 아미노산으로 번역이 된 경우의 아미노산 서열과 효소의 기능을 하는 단백질로 입체구조를 가지는 경우에는 일치함을 확인하였다.
2. 재조합 대장균의 제조 ( E. coli BL21(DE3) ::pCOLD1:: fabF , fabB, fabA )
상기 1에서 합성오류를 점검한 재조합 플라스미드 (pCOLD1::fabF, fabB, fabA)를 넣기 위해서, 상기 1의 컴피턴트 세포 제조방법과 동일한 방법으로 숙주 대장균 (E. coli BL21(DE3))와 재조합 플라스미드를 처리하고 열충격 형질전환방법을 다시 시도하여 재조합 균주를 제조하였다(E. coli BL21(DE3)::pCOLD1::fabF, fabB, fabA).
따라서, 상기 제조한 재조합 대장균 (E. coli BL21(DE3)::pCOLD1::fabF, fabB, fabA)을 2014년 09월 17일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행(KCTC)에 기탁하였으며, KCTC18324P의 수탁번호를 부여받았다.
상기 제조된 재조합 대장균, 목적 유전자 및 재조합 플라스미드는 표 5에 나타내었다.
재조합 대장균 목적 유전자 재조합 플라스미드
E. coli BL21(DE3)::pCOLD1::fabF, fabB, fabA fabF, fabB, fabA pCOLD1::fabF, fabB, fabA
실시예 3 : 재조합 대장균을 이용하여 지방산의 생성
상기 실시예 2에서 제조된 재조합 대장균 (E. coli BL21(DE3)::pCOLD1::fabF, fabB, fabA)을 항생제인 암피실린이 포함된 200㎖의 액체 LB 배지에 넣고 총 27시간 동안 배양하였다. 먼저 37℃의 진탕배양기에서 200rpm의 속도로 회전시키면서 배양하였다. 배양액의 OD (optical density)가 0.6~0.8에 이르렀을 때 유전자 발현을 목적으로 1.0mM IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가한 후 낮은 온도에서 KASⅡ의 발현이 효율적임을 고려하여 17℃의 낮은 온도로 옮겨 배양하였으며, 원심분리하여 균체와 배지를 분리하고, 동결건조하여 균체의 수분을 제거하였다. 분석을 위한 샘플을 제조하기 위해서, 균체가 포함된 시험관에 황산과 메탄올 (5:100의 부피비)의 혼합용액을 첨가하고, 질소로 충진하였다. 시험관을 밀봉하여 90℃에서 30분 동안 에스테르화 반응을 하고 상온에서 냉각시켰다. 그 다음, 헥산과 증류수를 첨가하여 교반기 위에서 섞어주고 원심분리를 통해 층을 분리하여 FAMEs(fatty acid methyl esters)이 용해된 상층의 헥산층을 분석하였다. 분석에 이용한 장비는 가스크로마토그래피 (gas chromatography, Agilent 6890N)이며, 이용한 컬럼은 Agilent 19091N-133 capillary column이다.
표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 재조합 대장균의 불포화 지방산 조성을 분석한 결과, 본 발명의 재조합 균주는 야생형 균주(E. coli BL21(DE3))뿐만 아니라 불포화 지방산을 생산하는 양성 대조군[대한민국 등록특허 제10-1402108호에 개시된 재조합 플라스미드(pEcoli-Nterm 6xHN::fabF, fabB, fabA)를 이용하여 형질전환시킨 E. coli BL21(DE3):: pEcoli-Nterm 6xHN::fabF, fabB, fabA] 과 비교하여 불포화 지방산 조성에서 차이가 생겼으며, 특히, 시스-박센산(cis-vaccenic acid)의 비율과 양이 탁월하게 향상된 것을 확인하였다.
Figure pat00002
한국생명공학연구원 KCTC18324P 20140917
<110> INHA-INDUSTRY PARTNERSHIP INSTITUTE <120> Recombinant E.coli producing unsaturated fatty acid, and method <130> INHA1.146P <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1242 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 gtgtctaagc gtcgtgtagt tgtgaccgga ctgggcatgt tgtctcctgt cggcaatacc 60 gtagagtcta cctggaaagc tctgcttgcc ggtcagagtg gcatcagcct aatcgaccat 120 ttcgatacta gcgcctatgc aacgaaattt gctggcttag taaaggattt taactgtgag 180 gacattatct cgcgcaaaga acagcgcaag atggatgcct tcattcaata tggaattgtc 240 gctggcgttc aggccatgca ggattctggc cttgaaataa cggaagagaa cgcaacccgc 300 attggtgccg caattggctc cgggattggc ggcctcggac tgatcgaaga aaaccacaca 360 tctctgatga acggtggtcc acgtaagatc agcccattct tcgttccgtc aacgattgtg 420 aacatggtgg caggtcatct gactatcatg tatggcctgc gtggcccgag catctctatc 480 gcgactgcct gtacttccgg cgtgcacaac attggccatg ctgcgcgtat tatcgcgtat 540 ggcgatgctg acgtgatggt tgcaggtggc gcagagaaag ccagtacgcc gctgggcgtt 600 ggtggttttg gcgcggcacg tgcattatct acccgcaatg ataacccgca agcggcgagc 660 cgcccgtggg ataaagagcg tgatggtttc gtactgggcg atggtgccgg tatgctggta 720 cttgaagagt acgaacacgc gaaaaaacgc ggtgcgaaaa tttacgctga actcgtcggc 780 tttggtatga gcagcgatgc ttatcatatg acgtcaccgc cagaaaatgg cgcaggcgca 840 gctctggcga tggcaaatgc tctgcgtgat gcaggcattg aagcgagtca gattggctac 900 gttaacgcgc acggtacttc tacgccggct ggcgataaag ctgaagcgca ggcggtgaaa 960 accatcttcg gtgaagctgc aagccgtgtg ttggtaagct ccacgaaatc tatgaccggt 1020 cacctgttag gtgcggcggg tgcagtagaa tctatctact ccatcctggc gctgcgcgat 1080 caggctgttc cgccaaccat caacctggat aacccggatg aaggttgcga tctggatttc 1140 gtaccgcacg aagcgcgtca ggttagcgga atggaataca ctctgtgtaa ctccttcggc 1200 ttcggtggca ctaatggttc tttgatcttt aaaaagatct aa 1242 <210> 2 <211> 1217 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 aaacgtgcag tgattactgg cctgggcatt gtttccagca tcggtaataa ccagcaggaa 60 gtcctggcat ctctgcgtga aggacgttca gggatcactt tctctcagga gctgaaggat 120 tccggcatgc gtagccacgt ctggggcaac gtaaaactgg ataccactgg cctcattgac 180 cgcaaagttg tgcgctttat gagcgacgca tccatttatg cattcctttc 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aagagctgga cgagcaggct gcgggtctga acatcgtgac cgaaacgacc gatcgcgaac 1140 tgaccaccgt tatgtctaac agcttcggct tcggcggcac caacgccacg ctggtaatgc 1200 gcaagctgaa agattaa 1217 <210> 3 <211> 518 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 atggtagata aacgcgaatc ctatacaaaa gaagaccttc ttgcctctgg tcgcggtgac 60 tgtttggcgc taaaggcccg caattgccag caccgaacat gctgatgatg gaccgtgtgg 120 tcaaaatgac cgaaacgggt ggtaacttcg acaaagggta tgttgaagca gaactggata 180 tcaatccgga tctgtggttc ttcggatgcc actttattgg cgatccggtt atgccgggat 240 gcctgggcct ggacgcaatg tggcagctgg tagggttcta cctcggctgg ctgggcggcg 300 aaggtaaagg ccgcgcgctg ggcgttggcg aagtgaaatt cactggtcag gtactgccga 360 cagcgaaaaa agtgacctac cgtattcact ttaaacgcat tgttaaccgt cgtctgatta 420 tgggcctggc ggatggcgaa gtgctggttg atggtcgtct gatctatacc gccagcgacc 480 tgaaagtcgg tctgttccag gatacgtctg ccttctga 518 <210> 4 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cspA promoter <400> 4 ccgattaatc ataaatatga aaaataattg ttgcatcacc cgccaatgcg tggcttaatg 60 cacatca 67 <210> 5 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for fabB gene <400> 5 ggaagatctg aaggagatat accatgaaac gtgcagtgat tactggcc 48 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for fabB gene <400> 6 ataagaatgc ggccgcttaa tctttcagct tgcgcattac ca 42 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for fabF gene <400> 7 aaaactgcag gtgtgtctaa gcgtcgtgta gttgtga 37 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for fabF gene <400> 8 acgcgtcgac ttagatcttt ttaaagatca aagaacc 37 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for fabA gene <400> 9 ccttaattaa ggaaggaggg atggtagata aacgcgaatc c 41 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for fabA gene <400> 10 gctctagagc tcagaaggca gacgtatcct g 31 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for fabF, fabB and fabA gene <400> 11 aaaactgcag gtagtgtcta agcgtcgtgt agttgtga 38 <210> 12 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for fabF, fabB and fabA gene <400> 12 gctctagatc agaaggcaga cgtatcctgg aacagac 37

Claims (10)

  1. 5' 에서 3' 방향으로 작동가능하게 연결된(operatively linked),
    (i) 원핵세포에서 작동가능한 프로모터(promoter); 및
    (ii) E.coli K-12 MG1655의 베타-케토 아실-아실 운반 단백질 합성효소II (KASII, β-keto acyl-acyl carrier protein synthaseII)를 코딩하는 뉴클레오티드 (fabF, 서열번호 1); E.coli K-12 MG1655의 베타-케토 아실-아실 운반 단백질 합성효소I (KASI, β-keto acyl-acyl carrier protein synthaseI)를 코딩하는 뉴클레오티드 (fabB, 서열번호 2); 및 E.coli K-12 MG1655의 베타-하이드록시 데카노일 사이오에스터 디하이드레이즈/아이소머레이즈 (β-hydroxy decanoyl thioester dehydrase/isomerase)를 코딩하는 뉴클레오티드 (fabA, 서열번호 3);
    를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 cspA 프로모터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 플라스미드는 pCOLD1::fabF, fabB, fabA인 것을 특징으로 하는 벡터.
  4. 제 3항의 벡터에 의해 형질전환된 재조합 대장균.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 재조합 대장균은 불포화 지방산을 생산하는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 불포화 지방산은 시스-박센산(cis-vaccenic acid)인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 재조합 대장균은 E. coli BL21(DE3)::pCOLD1::fabF, fabB, fabA인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균(기탁번호 : KCTC18324P).
  8. 다음 단계를 포함하는 불포화 지방산의 제조 방법:
    (a) 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 재조합 대장균을 1차 배양하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 1차 배양한 재조합 대장균을 10℃ 내지 20℃의 저온에서 2차 배양하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 얻은 배양액을 원심분리하여 균체와 배지를 분리하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 분리된 균체에 황산과 메탄올의 혼합용액을 첨가하고, 질소를 충전한 다음, 에스테르화 반응을 수행하는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계의 반응액에 헥산과 증류수를 첨가하여 층을 분리하는 단계.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 (e) 단계에서 분리된 층의 불포화 지방산 조성을 분석하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 불포화 지방산은 시스-박센산(cis-vaccenic acid)인 것을 특징으로 하는, 불포화 지방산의 제조방법.
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