KR20160043465A

KR20160043465A - 천연 염미 증진제 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20160043465A
Application number: KR1020140137892A
Authority: KR
Inventors: 조형용; 이화진; 은 방; 윤효선; 이석훈
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2014-10-13
Filing date: 2014-10-13
Publication date: 2016-04-21
Also published as: KR101712492B1

Abstract

본 발명은 어패류 분쇄물에 어패류 분쇄물의 총 중량에 대하여 1 내지 3 중량%의 복합효소를 첨가한 후 40 내지 60℃ 및 65 내지 80MPa의 조건으로 12 내지 20시간 동안 고압효소처리한 다음, 효소 불활성화, 냉각숙성, 유지제거, 정제 및 건조단계를 통해 어패류로부터 염미증진물질을 추출한 후 건조하여 쓴맛이 감소되고 식품 조리시 소금을 첨가하였을 때와 비슷하거나 더 높은 기호도를 갖는 천연 염미 증진제 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

천연 염미 증진제 및 그 제조방법{Natural salty taste enhancer and method for preparing the same}

본 발명은 천연 염미 증진제 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고압효소처리 기술을 이용하여 어패류로부터 염미증진물질을 추출한 후 건조하여 쓴맛이 감소되고 식품 조리시 소금을 첨가하였을 때와 비슷하거나 더 높은 기호도를 갖는 천연 염미 증진제 및 그 제조방법에 관한 것이다.

급격한 산업화와 도시화의 과정을 거치면서 소득수준의 향상, 핵가족화, 단독세대의 증가 등의 영향으로 외식과 패스트푸드, 피자 등의 서구식 음식 및 인스턴트식품 등의 식품소비가 증가하였다. 특히 한국인의 경우 탕, 찌개, 김치, 장류, 젓갈류 등 나트륨 함량이 높은 식품도 함께 섭취하고 있어 하루 나트륨 섭취량은 세계보건기구(WHO) 권장량(3,450mg)의 2배가 넘는 6,000mg 내지 8,000mg으로 고농도의 나트륨을 섭취하는 것으로 알려져 있으며, 나트륨의 과다 섭취는 고혈압, 심장병, 뇌심혈관 질환, 신장질환, 위암 등 만성질환의 주요 원인으로 작용하고 있다.

최근, 만성질환을 예방하고 건강증진을 위해 나트륨 섭취의 감량에 대해 관심을 갖게 되었으며, 그 결과 저나트륨 소금 또는 염미 증진제의 개발 연구가 진행되고 있다. 한 예로, 미네랄 성분을 강화한 천연소금, 함초, 다시마, 구기자, 양파, 표고버섯, 무, 마늘 등과 같은 천연추출액을 이용한 소금대체용 천연 조미료, 나트륨 대신 염화칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘 등을 첨가한 저나트륨 소금, 또는 아스파르트산염(aspartate), 글루탐산 나트륨(monosodium glutamate, MSG) 등의 화학조미료가 있다. 그러나 저나트륨 소금은 짠맛이 덜하여 기존보다 많이 사용하게 되므로 결과적으로 많은 나트륨을 섭취하며, 칼륨, 칼슘 등이 첨가된 소금을 신장병 환자가 섭취할 경우 호흡곤란, 흉통, 심장마비 등을 유발하는 문제점이 있다. 또한, 인위적으로 합성하여 제조된 화학조미료는 많이 섭취할 경우 신경조직에 흡수되어 세포막을 파괴해 두통, 구토, 메스꺼움, 혀 마비와 같은 증상을 나타내며, 최근 암 유발 물질로 대두되면서 화학조미료에 대한 안정성 및 유해성의 문제점이 있다.

한편, 초고압 기술(High pressure technology, HPT)은 열을 사용하지 않고 100 내지 900 MPa의 높은 압력을 가하여 부패 미생물 및 병원성 미생물의 비공유 결합(이온결합, 수소결합)과 소수성 결합에 영향을 주어 세포막을 붕괴시켜 미생물을 사멸시키거나 단백질의 변성을 일으켜 영양소의 파괴를 최소화하는 기술이다. 이러한 초고압 처리는 열처리 가공에 비해 현저히 적은 열에너지를 소비하며, 상온 또는 저온에서 실행이 가능하며, 식품천연의 맛과 향미, 색, 신선도, 및 영양성분을 유지할 수 있고, 모든 방향에서 압력이 균일하게 작용하므로 처리정도의 차이가 존재하지 않으며, 미생물사멸 외에도 단백질의 변성 또는 변형, 효소활성화 또는 불활성화, 효소기질 특이성 변화, 탄수화물과 지방의 특성 변화 등을 유도할 수 있고, 공유결합과 수소결합에 영향을 주지 않으며, 플라스틱 필름과 같은 파우치형태의 백(bag)에 포장된 상태에서도 이용할 수 있어 실험을 용이하게 할 수 있다는 것 등의 장점이 있다.

이에 본 발명자들은 천연물로부터 유래하여 장기적으로 복용하여도 부작용이 없고, 통상의 소금 또는 염미 증진제를 포함하는 소금에 비하여 짠맛이 증진된 염미 증진제를 개발하고자 노력하였으며, 그 결과 고압효소 처리기술을 이용하여 어패류로부터 염미증진물질을 추출하였고, 상기 염미증진물질은 쓴맛이 감소되고 식품 조리시 소금을 첨가하였을 때와 비슷하거나 더 높은 기호도를 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 고압효소 처리기술을 이용한 천연 염미 증진제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 방법에 의하여 제조된 천연 염미 증진제를 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 어패류의 이물질을 제거하고, 분쇄하는 전처리 단계(S100); 상기 전처리 단계(S100)에서 얻은 어패류 분쇄물에 어패류 분쇄물의 총 중량에 대하여 1 내지 3중량%의 복합효소를 첨가한 후 40 내지 60℃ 및 65 내지 80 MPa의 조건으로 12 내지 20시간 동안 고압효소처리하여 가수분해하는 가공 단계(S200); 상기 가공 단계(S200)에서 가수분해된 어패류 분쇄물의 효소를 불활성화 시키는 효소 불활성화 단계(S300); 상기 효소 불활성화 단계(S300)에서 효소의 활성이 중지된 어패류 가수분해물을 냉각숙성하는 냉각숙성 단계(S400); 상기 냉각숙성 단계(S400)에서 냉각숙성된 어패류 가수분해물의 유지를 제거하는 유지제거 단계(S500); 상기 유지제거 단계(S500)에서 유지가 제거된 어패류 가수분해물로부터 염미증진물질을 분리 및 정제하는 정제 단계(S600); 및 상기 정제 단계(S600)에서 수득한 염미증진물질을 건조하여 분말화하는 제형화 단계(S700);를 포함하는 천연 염미 증진제의 제조방법에 관한 것이다.

이하에서는 본 발명의 천연 염미 증진제의 제조방법을 도 1을 참조하여 각 단계에 따라 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

(1) 어패류의 이물질을 제거하고, 분쇄하는 전처리 단계이다(S100).

본 발명에 있어서, 상기 어패류는 우리나라에서 생산되는 어패류 중 염장품의 원료로 사용되는 것이라면 어느 것이나 사용 가능하며, 예를 들어 쥐치, 멸치, 갈치, 명태, 노가리, 고등어, 참조기, 오징어, 굴, 삼치 및 참조기 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 멸치이다.

본 발명에 있어서, 상기 어패류의 이물질을 제거하는 방법은 어패류의 표면을 물로 깨끗이 세척하여 염분 및 이물질을 제거하는 것이라면 이에 한정되지는 않으며, 하나의 예로서, 내장을 제거하지 않은 어패류를 10 내지 15℃에서 1시간 동안 침지 및 수세하여 불순물 및 염분을 제거할 수 있다.

다음으로, 상기 이물질이 제거된 어패류를 분쇄한다. 상기 분쇄는 통상의 방법, 예를 들어 분쇄기에 의한 분쇄 등의 방법으로 이루어질 수 있다. 이러한 분쇄에 있어서, 어패류는 잘게 분쇄 할수록 이후의 단계에서 이루어지는 고압효소처리 시 어패류에서 효소의 작용이 용이하게 이루어져 증미성분인 다양한 아미노산 또는 펩타이드를 생성하므로, 분쇄된 어패류는 평균 200 ㎛ 이하, 바람직하게는 150 내지 200 ㎛의 입자크기를 갖는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 분쇄된 어패류는 14,000 내지 18,000rpm에서 3 내지 5분 동안 분쇄하여 이루어진 것이다.

이때, 어패류는 어패류의 총 중량에 대하여 1 내지 3배, 바람직하게는 2배의 물을 첨가하여 분쇄가 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 물의 양을 어패류의 총 중량의 미만으로 첨가하는 경우 어패류를 분쇄하는 시간이 오래 소요되며, 물의 양을 어패류의 총 중량에 대하여 3배 초과하여 첨가하는 경우 그 이하의 물의 양을 첨가하여 분쇄하는 경우에 비하여 어패류를 분쇄하는 시간 또는 어패류 입자 크기의 감소가 미비하여 비경제적이다.

하나의 구체적 실시에서, 3월 초 제주도 해역에서 어획되어 -20℃에서 동결 보관된 멸치를 상온에서 해동한 후 10 내지 15℃의 물에 1시간 동안 침지 및 수세하여 염분 및 불순물을 제거하였다. 그 다음 상기 멸치 중량의 2배의 물을 첨가한 후 가정용 믹서기를 이용하여 2분 동안 2회 분쇄한 다음 호모게나이저를 이용하여 16,000 rpm으로 5분 동안 2차 분쇄하여 멸치 분쇄물을 제조하였다. 그 결과, 가정용 믹서기를 이용하여 1차 분쇄한 멸치 분쇄물의 입자 크기는 약 1,000 ㎛ 이하였고, 호모게나이저로 2차 분쇄한 멸치 분쇄물의 크기는 약 180 ㎛이였으며, 16,000rpm 이상 및 5분 이상의 조건에서 분쇄하였을 경우 입자의 크기는 유의적으로 차이가 없는 것으로 확인되었다.

(2) 상기 전처리 단계(S100)에서 분쇄한 어패류 분쇄물에 복합효소를 첨가한 후 특정 온도, 압력 및 시간 동안 고압효소처리하여 어패류 분쇄물을 가수분해하는 가공 단계(S200)이다.

단백질 가수분해효소는 다양한 아미노산 또는 펩티드 혼합물을 만드는 효소로, 동식물의 단백질을 가수분해하는데 사용되고 있다. 특히, 어패류의 단백질 가수분해물을 생산하고자 할 때 식물 또는 미생물 기원의 단백질 분해 효소(판크레아틴(pancreatin), 트립신(trypsin), 펩신(pepsin), 파파인(papain), 브로멜린(bromelain), 세균 및 곰팡이 유리 단백질 가수분해효소 등)가 사용되고 있으며, 효소의 종류는 당업계의 통상의 기술자가 효율과 경제성을 함께 고려하여 선정하여 수행되고 있다.

한 예로, 어패류의 단백질 가수분해물을 생산하기 위해 효소(알칼라아제(alcalase), 플라보르자임(flavourzyme), 코로라아제(corolase) 등)가 사용되어져 왔다. 상기 효소는 빠른 시일에 어패류의 단백질을 분해시키나 강한 쓴맛(고미, bitterness)을 발생시키는 문제가 있으므로, 이를 해결하기 위해 활성탄을 이용하거나 알코올을 이용한 선택추출, 여러 다른 매트릭스(matrix)를 활용한 크로마토그래피적 제거방법 등을 사용하여 왔다. 그러나, 상기 쓴맛을 제거하는 방법들은 가수분해물에서의 유용 아미노산을 함께 제거하거나 낮은 회수율, 특정 장비의 필요성, 고비용이 소요되는 등의 다양한 문제점을 내포하고 있다.

따라서, 본 발명에서는 엔도형(endopeptidase 또는 proteinase)과 엑소형(exopeptidase)이 혼합되어 있는 복합효소를 사용하여 쓴맛을 감소시키면서 높은 질소 회수율을 가지는 염미 증진제를 생산하고자 하였다.

구체적으로, 본 발명에서 사용되는 복합효소는 엔도형의 프로테아제(protease), 및 엔도형 및 엑소형의 아미노펩티다아제(aminopeptidase)가 혼합된 복합효소이며, 바람직하게는 프로테아제(protease)와 아미노펩티다아제(aminopeptidase)가 0.8 내지 1.2 : 4.8 내지 5.2의 중량비, 바람직하게는 1 : 5의 중량비로 혼합된 복합효소이다.

상기 프로테아제(protease)는 알칼라아제(alcalase™), 뉴트라아제(neutrase™), 프로타멕스(protamex™) 또는 브로멜린(bromeline™) 등 중에서 선택된 어느 하나 이상, 바람직하게는 알칼라아제(alcalase™)이다. 상기 아미노펩티다아제(aminopeptidase)는 플라보르자임(flavourzyme™), 펩티다아제 R(peptidase R™), N-글리코시다아제(N-glycosidase™) 등 중에서 선택된 어느 하나 이상, 바람직하게는 플라보르자임(flavourzyme™)이다.

하나의 구체적 실시에서, 멸치를 세척 및 분쇄하여 분말화시킨 멸치 분쇄물에 알칼라아제, 프로타멕스, 플라보르자임, 알칼라아제와 플라보르자임을 5 : 1, 4 : 2, 3 : 3, 2 : 4 또는 1 : 5의 중량비로 혼합한 복합효소 및 멸치 내재 조효소를 각각 처리하고 50℃에서 3시간 동안 반응시켜 단백질 가수분해활성, 트립토판 함량 및 짠맛증진물질이 존재할 것으로 예상되는 Peak Ⅱ 분획의 함량을 측정하였다. 그 결과, 단백질 가수분해활성은 알칼라아제에서 가장 높게 나타났고, 알칼라아제와 플라보르자임을 1 : 5의 중량비로 혼합한 복합효소는 알칼라아제와 유사한 가수분해 활성을 나타냈다. 또한, 상기 알칼라아제와 플라보르자임을 1 : 5의 중량비로 혼합한 복합효소는 멸치 내재 조효소 및 프로타멕스에 비하여 쓴맛 펩타이드인 트립토판의 함량을 감소시키고, Peak Ⅱ 분획의 함량이 가장 높은 것으로 확인되었다(실시예 1-2 및 1-3 참조).

따라서, 본 발명의 복합효소는 어패류의 단백질을 용이하게 가수분해시켜 쓴맛 펩타이드의 생성을 감소시키면서 짠맛증진물질의 함량이 최대로 포함된 염미 증진제를 형성하는데 매우 효과적임을 알 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 복합효소는 어패류 분쇄물에 어패류 분쇄물의 총 중량에 대하여 1 내지 3 중량%, 바람직하게는 1.5 내지 2.5 중량%, 보다 더 바람직하게는 2 중량%의 함량으로 첨가하는 것을 특징으로 한다. 상기 복합효소의 함량이 1 중량% 미만인 경우 어류 단백질의 가수분해가 용이하게 이루어지지 않거나 맛의 주요성분을 나타내는 아미노산, 특히 글루타민, 아스파라긴 등을 유리시키는 효율이 떨어지며, 복합효소의 함량이 3 중량%를 초과하는 경우 그 이하의 함량을 첨가하여 가수분해된 어류의 아미노산의 함량의 증가가 미비하거나 쓴맛 펩타이드의 함량이 증가하여 염미 증진제의 풍미가 저하되는 문제가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 고압효소처리는 고압 및 특정온도에서 일정한 시간동안 효소에 의해 기질을 가수분해하는 것을 말한다.

구체적으로, 상기 고압효소처리를 위한 특정 온도는 40 내지 60℃, 바람직하게는 45 내지 55℃, 보다 바람직하게는 50℃이며, 고압은 65 내지 80 MPa, 바람직하게는 70 내지 80 MPa, 보다 바람직하기는 75 MPa이며, 일정시간은 10 내지 20시간, 바람직하게는 12 내지 18시간, 보다 바람직하게는 16시간 이다. 또한, 효소는 상술한 복합효소이며, 기질은 상술한 어패류 분쇄물이다. 상기한 조건 이외의 조건에서는 어패류의 단백질이 가수분해되는 시간이 오래 소요되거나 단백질 가수분해도, 질소 회수율, 수율 및 짠맛증진물질이 존재할 것으로 예상되는 분획의 함량이 저하되는 문제가 있다.

하나의 구체적 실시에서, 멸치 분쇄물에 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 멸치 분쇄물의 총 중량에 대하여 1 또는 2 중량%를 처리한 후 50, 75 또는 100 MPa의 압력, 40, 50 또는 60℃의 온도에서 12, 24 또는 48시간 동안 고압효소처리 하였다. 그 다음 상기 고압효소처리된 멸치 분쇄물의 효소 불활성화, 냉각숙성 및 여과하여 얻은 멸치 가수분해물의 가수분해도(degree of hydrolysis, DH, %), 질소 회수율(nitrogen recovery, NR, %), 수율, 분자량 및 고압효소 조건별 S/N비(신호 대 잡음비)를 측정하였다. 그 결과, 멸치 가수분해물의 가수분해도(DH, %)는 복합효소의 첨가량이 많거나 반응시간이 길수록 증가하였고, 질소 회수율(NR, %)은 복합효소의 첨가량이 많을수록 증가하였으며, 수율은 효소의 반응시간이 길수록 감소하는 반면, 복합효소의 첨가량이 많을수록 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 짠맛증진물질이 존재할 것으로 예상되는 Peak Ⅱ 분획의 함량은 효소의 첨가량이 많을수록 증가하는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

따라서, 본 발명의 고압효소처리의 최적 조건은 어패류 분쇄물에 어패류 분쇄물의 총 중량에 대하여 2 중량%의 복합효소를 처리한 후 75 MPa 및 50℃에서 12시간 내지 16시간 동안 처리하는 것이며, 상기 조건으로 가수분해된 어패류 분쇄물은 종래 고압효소 조건(50MPa 및 50℃에서 48시간 처리, Okazaki et al ., 2003)에서 가수분해된 어패류 분쇄물에 비하여 4배의 시간 단축과 약 2.5배의 유리아미노산을 생산할 수 있을 것이다.

(3) 상기 가공 단계(S200)에서 제조된 어패류 가수분해물의 효소를 불활성화 시키는 효소 불활성화 단계(S300)이다.

본 발명에 있어서, 상기 효소 불활성화는 가수분해된 어패류 분쇄물에 존재하는 효소의 활성을 중지시키는 방법이라면 이에 한정되지는 않으나, 열처리, 효소 불활성 조건의 고압처리 등이 있다. 하나의 구체적 예로서, 70 내지 90℃의 온도, 바람직하게는 80℃의 온도에서 10 내지 30분, 바람직하게는 20분 동안 열처리하여 효소의 활성을 중지시킬 수 있다.

(4) 상기 효소의 불활성화 단계(S300)에서 효소의 활성이 중지된 어패류 가수분해물을 저온에서 냉각숙성하는 냉각숙성 단계(S400)이다.

본 발명에 있어서, 상기 냉각숙성은 0 내지 5℃의 저온에서 6 내지 12시간, 바람직하게는 6 내지 10시간 동안 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 냉각숙성이 5℃를 초과한 온도 또는 6시간 미만으로 이루어지는 경우 최종 제조되는 염미 증진제에 부유 지방이 발생하여 이미 또는 이취가 발생하고, 0℃ 미만의 온도 또는 12시간을 초과하여 이루어지는 경우 그 이상의 온도 또는 그 이하의 시간에서 숙성시켜 제조된 염미 증진제에 비하여 이미 또는 이취의 감소가 미비하여 비경제적이다.

(5) 상기 냉각숙성 단계(S400)에서 숙성된 어패류 가수분해물의 유지(fats and fatty oils)를 제거하는 유지제거 단계(S500)이다.

종래 산, 알칼리, 효소 또는 고압 등의 방법으로 가수분해된 어패류를 간장, 된장, 숙성치즈 등의 원료로 사용하는 경우 제품에 따라 다르지만, 단백질 가수분해물은 일반적으로 살균, 원심분리, 증발 농축 및 건조하거나 단계적으로 원심분리, 가압엽상 여과기(plate and frame filter press) 또는 마이크로 필터 시스템(micro filtration system)을 이용하여 여과하는 공정을 거치게 된다. 그러나 상기 여과공정을 거쳐 제조된 최종 제품은 어패류 고유의 기름 및 지방성분 등에 의한 이미 및 이취가 발생하며, 반복적인 여과공정을 통해 어패류에 포함되어 있는 유용물질, 예를 들어 짠맛증진물질, 감칠맛을 나타내는 아미노산 등이 손실되어 최종 제조되는 제품의 품질이 떨어지는 문제가 있다.

따라서, 본 발명에서는 가수분해된 어패류 분쇄물의 유지를 제거하여 최종 제조되는 염미 증진제의 이미 및 이취를 감소시키면서, 여과공정을 생략하여 어패류에 포함되어 있는 유용성분의 손실을 최소화시키고자 하였다.

본 발명에 있어서, 어패류의 유지는 가수분해된 어패류 분쇄물을 냉각숙성한 후 고화되어 떠 있는 유지를 모직물, 합성 스펀지, 탈지솜, 기름종이, 헝겊 또는 체 등을 이용하거나 원심분리 등을 이용하여 제거할 수 있다. 하나의 구체적 예로, 냉각숙성된 어패류 가수분해물을 원심분리기(tubular centrifuge)를 이용하여 15,000 내지 20,000 rpm의 속도로 원심분리하여 어패류의 유지를 제거할 수 있다.

본 발명의 유지제거는 최종 제조되는 염미 증진제의 이미 및 이취를 개선시키는 효과를 나타낸다.

하나의 구체적 실시에서, 고압효소처리된 멸치 분쇄물을 90~100℃에서 10분 동안 불활성화 처리를 하고, 0℃ 냉각기(chiller)에서 냉각하여 추가적인 효소의 반응을 정지시켰다. 그 다음 12시간 동안 4℃에서 숙성하여 시료 내 유지의 고형화를 유도하고, 고형화된 유지는 원심분리를 통하여 제거한 후 냉동 저장한 멸치 가수분해물과 유지를 제거하지 않은 멸치 가수분해물의 지방함량을 측정하였다. 그 결과, 유지를 제거하지 않은 멸치 가수분해물은 저장기간 동안 유지가 부유하는 것으로 확인되었으며, 유지를 제거한 멸치 가수분해물의 지방함량은 약 0.1% 이하로 확인되었으며, 이는 최종 제조된 염미 증진제의 이미 및 이취발생을 억제하는 것으로 확인되었다(실시예 1-5 참조).

(6) 상기 유지제거 단계(S500)에서 유지가 제거된 어패류 가수분해물로부터 염미증진물질을 분리 및 정제하는 정제 단계(S600)이다.

본 발명에 있어서, 염미증진물질의 분리 및 정제는 당업계에 통상적으로 알려진 정제방법을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 일정한 분자량 컷-오프 값을 가지는 한외여과, 나노여과, 냉동여과법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 크로마토그래피)에 의한 분리, 전기투석 시스템 등이 있으며, 바람직하게는 한외여과 시스템 및 나노여과 시스템을 이용하여 염미증진물질을 분리 및 정제할 수 있다.

하나의 구체적 실시에서, 5 내지 10 kDa 분자량 컷-오프값을 가지는 한외여과 시스템 및 250 Da 분자량 컷-오프값을 가지는 나노여과 시스템을 이용하여 단계적으로 분리 및 정제함으로써 염미증진물질을 수득할 수 있다(실시예 7 및 8 참조).

본 발명의 정제 단계(S600)에서 분리 및 정제된 염미증진물질은 건물 100 중량부에 대하여 0.8 내지 1.3 중량부의 나트륨이 함유되어 있다. 또한, 상기 염미증진물질은 아미노산 중 쓴맛을 내는 트립토판(tryptophan)이 아미노산의 총 중량에 대하여 0.2 내지 0.6 중량% 함유되고, 감칠맛을 내는 글루타민산(glutamic acid)이 아미노산의 총 중량에 대하여 15 내지 20 중량% 함유되어 있다.

하나의 구체적 실시에서, 멸치 분쇄물에 멸치 분쇄물 중량에 대하여 2 중량%의 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 첨가하여 파우치에 넣고 밀봉한 후 75 MPa 및 50℃에서 16시간 동안 고압처리한 다음 80℃에서 20분 동안 효소를 불활성화 하였다. 그 후 4℃에서 12시간 동안 냉각숙성한 다음 연속식 원심분리기를 이용하여 원심분리하여 고화되어 떠있는 유지를 제거하여 멸치 가수분해물(APH)을 제조하고, 상기 멸치 가수분해물을 10 kDa 및 5 kDa 분자량 컷-오프값을 가지는 한외여과막 및 250 Da 분자량 컷-오프값을 가지는 나노여과막에 단계적으로 여과하여 멸치 가수분해물의 분획물(APHU-1, APHU-2, APHN-1 및 APHN-2)을 제조하였다. 그 다음 상기 멸치 가수분해물(APH)과 멸치 가수분해물의 분획물(APHU-1: MW<10 kDa; APHU-2: 5 kDa≤MW<10 kDa; APHN-1: 250 Da≤MW<5 kDa 및 APHN-2: MW<250 Da)의 멸치에 함유된 단백질 대비 수율, 짠맛증진물질이 존재할 것으로 예상되는 Peak Ⅱ의 분자량, pH, 수용성 고형분 함량, 나트륨 함량, 질소 함량 및 유리/구성 아미노산 함량을 측정하였다. 그 결과, 멸치에 함유된 단백질 대비 수율은 원심분리하여 얻은 멸치 가수분해물(APH)이 가장 높았고, 한외여과 및/또는 나노여과를 통해 정제된 분획물 중 APHN-1의 단백질 수율이 높았으며, 짠맛증진물질이 존재할 것으로 예상되는 Peak Ⅱ의 분자량 역시 한외여과 및/또는 나노여과를 통해 정제된 분획물 중 APHN-1에서 가장 높게 나타낸 반면, 나트륨 함량은 건물 100g 당 1.1g으로 가장 적게 함유되어 있었다. 멸치 가수분해물(APH) 및 한외여과 및/또는 나노여과를 통해 정제된 분획물들의 pH는 분획물 중 APHN-2 분획물을 제외하고 모두 6.2 내지 7.1 범위로 확인되었고, 쓴맛을 내는 트립토판의 함량은 APHN-1 분획물에서 가장 낮게 나타낸 반면, 감칠맛을 내는 글루타민산의 함량은 가장 높게 나타내는 것을 확인하였다(실시예 7 참조).

본 발명에 있어서, 어패류 가수분해물(APH)로부터 분리 및 정제된 염미증진물질은 어패류 가수분해물을 한외여과막에 여과시킨 후 다시 나노여과막에 여과하여 나노여과재에 퇴적된 물질을 정제한 것이므로 APHN-1 분획물이라고도 표현한다.

본 발명에 있어서, 상기 염미증진물질은 상기 정제 단계(S600) 이후 필요에 따라 탈색 및 탈취 공정을 추가하여 수득할 수 있다. 상기 탈색 및 탈취 공정의 추가 여부는 환자나 어린이 등 어패류의 향과 색에 민감한 사람에게 염미증진물질을 제공하거나 조미료 또는 대체 소금으로 사용하는 경우 요리, 식품 등의 관능성을 향상시키기 위한 경우 등에 따라 선택하여 사용될 수 있다.

상기 탈색 및 탈취공정은 당업계에 통상적으로 알려진 탈색 및 탈취방법을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 반복여과 또는 활성탄 처리 등이 있으며, 바람직하게는 1 내지 3 중량%의 활성탄을 처리하여 수득할 수 있다.

하나의 구체적 실시에서, 멸치 분쇄물을 고압효소처리한 후 한외여과막을 이용하여 분획한 분획물에 2%의 활성탄을 처리하는 경우 노란빛, 이취 및 이미의 강도가 전체적으로 감소된 염미증진물질을 수득할 수 있다(실시예 9 참조).

(7) 상기 정제 단계(S600)에서 수득한 염미증진물질을 건조하여 분말화하는 제형화 단계(S700)이다.

본 발명에 있어서, 상기 건조는 염미증진물질의 수분을 제거하는 방식이라면 제한되지 않으며, 예를 들어, 열풍건조, 동결건조, 분무건조, 유동층 건조, 유동층 분무건조 및 진공건조 등을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 유동층 분무건조를 이용하여 이루어질 수 있다.

하나의 구체적 예로, 본 발명의 염미증진물질은 150℃ 내지 200℃, 바람직하게는 160℃ 내지 190℃, 보다 바람직하게는 180℃의 입구온도 및 15×10 kPa 내지 25×10 kPa, 바람직하게는 16×10 kPa 내지 20×10 kPa, 보다 바람직하게는 18×10 kPa의 분사압력으로 유동층 건조하여 제형화된 것일 수 있다. 상기 이외의 입구온도 및 분사압력 조건에서 건조하는 경우 염미 증진제의 회수율이 떨어지는 문제가 있다.

하나의 구체적 실시에서, 멸치 분쇄물을 고압효소처리하여 제조한 멸치 가수분해물을 한외여과막(MWCO 10kDa)에 여과하여 투과된 투과액을 유동층 분무건조기를 이용하여 분출속도 0.5 m³/분, 주입속도 500mL/시간, 180 및 200℃의 입구온도 및 180 및 240 kPa의 분사압력으로 건조된 염미증진물질의 회수율, 수분함량 및 입자 사이즈를 확인하였다. 그 결과, 180℃의 입구온도 및 180 kPa의 분사압력으로 건조된 염미증진물질은 200℃의 입구온도 또는 240 kPa의 분사압력으로 분무건조한 염미증진물질에 비하여 회수율이 가장 높았다. 또한, 상기 염미증진물질은 동결 건조된 염미증진물질(대조군)에 비하여 밝은 색상을 나타내었으며, 수분함량이 약 2배 증가하였다(실시예 10 참조).

본 발명에 있어서, 상기 건조된 염미증진물질은 평균 20 내지 30 ㎛²의 입자크기를 나타낸다. 상기 입자크기가 20 ㎛² 미만인 경우 그 이상의 입자크기를 가지는 염미증진물질과 짠맛, 감칠맛 등의 조미의 강도가 비슷하며, 30 ㎛²를 초과하는 경우 그 이하의 입자크기를 가지는 염미증진물질에 비하여 조미의 강도가 감소할 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 염미 증진제는 짠맛증진물질인 디펩타이드의 함량이 상기 유지제거 단계(S500)에서 유지가 제거된 어패류 가수분해물(APH)에 비하여 적어도 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 보다 바람직하게는 10배 이상, 보다 더 바람직하게는 20배 증가되었으며, 45mM의 염 용액에 비하여 염미가 적어도 0.1% 이상, 바람직하게는 1% 이상, 보다 바람직하게는 5% 이상, 보다 더 바람직하게는 10% 이상, 보다 더 바람직하게는 13% 향상된 효과를 나타낸다.

하나의 구체적 실시에서, 멸치 분쇄물에 멸치 분쇄물의 총 중량에 대하여 2 중량%의 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 처리 한 후 75 MPa 및 50℃에서 16시간 동안 고압처리한 다음 80℃에서 20분 동안 효소를 불활성화 하였다. 그 후 4℃에서 12시간 동안 냉각숙성한 다음 연속식 원심분리기를 이용하여 원심분리하여 고화되어 떠있는 지방을 제거하여 멸치 가수분해물(APH)을 제조하였다. 그 다음 상기 멸치 가수분해물(APH)을 10 kDa 분자량 컷-오프값을 가지는 한외여과막에 투과시킨 분획물(10 kDa permeate), 및 상기 한외여과막에 투과시킨 분획물을 5 kDa 분자량 컷-오프값을 가지는 한외여과막에 투과시킨 후 250 Da 분자량 컷-오프값을 가지는 나노여과막에 여과하여 투과되지 못한 분획물(APHN-1)을 수득하고, 상기 한외여과막에 투과시킨 분획물(10 kDa permeate)과 나노여과막을 통해 수득한 APHN-1 분획물의 짠맛증진에 관한 관능평가를 실시하였다. 그 결과, 구체적으로 한외여과막에 투과시킨 분획물(10 kDa permeate)은 소금농도 45mM의 표준시료에 비하여 10 내지 35% 염미가 증가하였고, APHN-1 분획물은 소금농도 45mM의 표준시료에 비하여 0.4 내지 13% 염미가 증가하였으며, 10 kDa permate 분획물 및 APHN-1 분획물의 첨가량이 높아질수록 짠맛의 강도는 증가하는 효과를 나타내었다(실시예 11-3 참조).

또한, 상기 멸치 가수분해물(APH)과 멸치 가수분해물의 분획물(APHU-1: MW<10 kDa; APHU-2: 5 kDa≤MW<10 kDa; APHN-1: 250 Da≤MW<5 kDa 및 APHN-2: MW<250 Da)에 포함되어 있는 L-아르기닌 및 아르기닌 디펩타이드의 함량을 측정한 결과, 멸치 가수분해물(APH), APHU-1 분획물, APHU-2 분획물 및 APHN-1 분획물에서는 표준품 9가지 중 STD-1(RY, Arg-Tyr)을 제외한 8가지의 디펩타이드가 검출되었으며, 나노 여과하여 수득한 APHN-1 분획물에서 가장 많은 디펩타이드가 검출되었다(실시예 11-2 참조).

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 어패류 분쇄물에 고압효소처리한 후 정제 및 건조하여 제조된 천연 염미 증진제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 천연 염미 증진제는 상술한 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 천연 염미 증진제는 건물 100 중량부에 대하여 0.8 내지 1.3 중량부의 나트륨이 함유되어 있다. 또한, 상기 천연 염미 증진제는 아미노산 중 쓴맛을 내는 트립토판(tryptophan)이 아미노산의 총 중량에 대하여 0.2 내지 0.6 중량% 함유되고, 감칠맛을 내는 글루타민산(glutamic acid)이 아미노산의 총 중량에 대하여 15 내지 20 중량% 함유되어 있다.

본 발명에 있어서, 상기 천연 염미 증진제는 짠맛증진물질인 디펩타이드의 함량이 상기 유지제거 단계(S500)에서 유지가 제거된 어패류 가수분해물(APH)에 비하여 적어도 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 보다 바람직하게는 10배 이상, 보다 더 바람직하게는 20배 증가되었으며, 45mM의 염 용액에 비하여 염미가 적어도 0.1% 이상, 바람직하게는 1% 이상, 보다 바람직하게는 5% 이상, 보다 더 바람직하게는 10% 이상, 보다 더 바람직하게는 13% 향상된 효과를 나타낸다.

본 발명에 있어서, 상기 천연 염미 증진제는 어패류로부터 분리되어 장기적으로 복용하여도 부작용이 없으므로, 가공식품 및 식품조리에 대체 소금으로 사용하거나 천연 향신료로 사용할 수 있다.

본 발명의 제조방법은 어패류를 단시간에 효율적으로 가수분해시켜 짠맛증진물질 및 조미성분의 펩타이드의 함량을 증가시키고 쓴맛 펩타이드의 함량을 감소시키므로, 짠맛을 증진시킴과 동시에 정미성분과 상호작용하여 맛의 상승효과를 나타내는 천연 염미 증진제를 제공할 수 있다. 상기 방법에 따라 제조된 천연 염미 증진제는 가공식품 및 식품조리에 대체 소금으로 사용하거나 천연 향신료로 사용될 수 있다. 아울러, 상기 제조방법은 어패류로부터 염미증진물질을 대규모로 생산할 수 있는 대량생산 시스템으로 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 천연 염미 증진제를 제조하는 공정의 모식도이다.
도 2는 효소의 종류 및 반응시간에 따라 가수분해된 멸치 분쇄물의 트립토판 함량을 측정한 결과이다.
도 3은 효소의 종류에 따른 가수분해된 멸치 분쇄물의 분자량의 변화를 측정한 결과이다.
도 4는 L₉(3⁴)의 직교배열표인 MINITAB을 이용하여 설정한 압력, 온도, 시간 및 효소 농도의 파라미터에 따라 고압효소 처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물의 유리아미노산의 함량을 측정한 결과이다.
도 5는 L₉(3⁴)의 직교배열표인 MINITAB을 이용하여 설정한 압력, 온도, 시간 및 효소 농도의 파라미터에 따라 고압효소 처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물의 압력, 온도, 시간 및 효소별 가수분해도에 대한 신호 대 잡음비(S/N비)를 측정한 결과이다.
도 6은 L₉(3⁴)의 직교배열표인 MINITAB을 이용하여 설정한 압력, 온도, 시간 및 효소 농도의 파라미터에 따라 고압효소 처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물의 압력, 온도, 시간 및 효소별 질소 회수율에 대한 신호 대 잡음비(S/N비)를 측정한 결과이다.
도 7은 L₉(3⁴)의 직교배열표인 MINITAB을 이용하여 설정한 압력, 온도, 시간 및 효소 농도의 파라미터에 따라 고압효소 처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물의 압력, 온도, 시간 및 효소별 수율에 대한 신호 대 잡음비(S/N비)를 측정한 결과이다.
도 8은 L₉(3⁴)의 직교배열표인 MINITAB을 이용하여 확립한 압력, 온도, 시간 및 효소 농도의 파라미터에 따라 고압효소 처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물의 분자량의 변화를 측정한 결과이다.
도 9는 L₉(3⁴)의 직교배열표인 MINITAB을 이용하여 설정한 압력, 온도, 시간 및 효소 농도의 파라미터에 따라 고압효소 처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물의 압력, 온도, 시간 및 효소별 짠맛증진물질에 대한 신호 대 잡음비(S/N비)를 측정한 결과이다.
도 10은 상압 및 고압에서 효소 종류에 따른 멸치의 단백질 분해 활성을 비교 측정한 결과이다.
도 11은 상압 및 고압에서 효소 종류에 따라 가수분해된 멸치 분쇄물의 가수분해도를 비교 측정한 결과이다.
도 12는 수율, 질소 회수율, 가수분해도 및 Peak Ⅱ 분획에 적합한 최적의 고압효소처리 조건에 따라 가수분해된 멸치 분쇄물의 가수분해도를 측정한 결과이다.
도 13은 수율, 질소 회수율, 가수분해도 및 Peak Ⅱ 분획에 적합한 최적의 고압효소처리 조건에 따라 가수분해된 멸치 분쇄물의 질소 회수율을 측정한 결과이다.
도 14는 멸치 분쇄물에 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 멸치 분쇄물 중량의 2% 함량으로 첨가하고, 75MPa의 압력, 50℃의 온도에서 16시간 동안 고압 처리하여 가수분해한 다음 원심분리하여 얻은 멸치 가수분해물의 구성/유리 아미노산 함량을 측정한 결과이다.
도 15는 멸치 분쇄물에 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 멸치 분쇄물 중량의 2% 함량으로 첨가하고, 75MPa의 압력, 50℃의 온도에서 16시간 동안 고압 처리하여 가수분해한 다음 원심분리하여 얻은 멸치 가수분해물을 5 내지 10 kDa의 한외여과 및 250 Da의 나노여과 시스템을 이용하여 분획한 분획물의 분자량을 측정한 결과이다.
도 16은 멸치 분쇄물에 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 멸치 분쇄물 중량의 2% 함량으로 첨가하고, 75MPa의 압력, 50℃의 온도에서 16시간 동안 고압 처리하여 가수분해한 다음 원심분하여 얻은 멸치 가수분해물을 5 내지 10 kDa의 한외여과 및 250 Da의 나노여과 시스템을 이용하여 분획한 분획물의 색을 육안으로 관찰한 결과이다.
도 17은 멸치 분쇄물에 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 멸치 분쇄물 중량의 2% 함량으로 첨가하고, 75MPa의 압력, 50℃의 온도에서 16시간 동안 고압 처리하여 가수분해한 다음 원심분리하여 얻은 멸치 가수분해물에 처리한 활성탄의 농도에 따른 탈색 효과를 육안으로 관찰한 결과이다.
도 18은 멸치 분쇄물에 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 멸치 분쇄물 중량의 2% 함량으로 첨가하고, 75MPa의 압력, 50℃의 온도에서 16시간 동안 고압 처리하여 가수분해한 다음 원심분리하여 얻은 2.5%, 5% 및 10.0%의 멸치 가수분해물에 2%의 활성탄 처리로 인한 탈색 효과를 육안으로 관찰한 결과이다.
도 19는 멸치 분쇄물에 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 멸치 분쇄물 중량의 2% 함량으로 첨가하고, 75MPa의 압력, 50℃의 온도에서 16시간 동안 고압 처리하여 가수분해한 다음 원심분리하여 얻은 2.5%의 멸치 가수분해물에 2%의 활성탄을 처리한 후 반응 온도에 따른 탈색 효과를 육안으로 관찰한 결과이다.
도 20은 멸치 분쇄물에 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 멸치 분쇄물 중량의 2% 함량으로 첨가하고, 75MPa의 압력, 50℃의 온도에서 16시간 동안 고압 처리하여 가수분해한 다음 원심분리하여 얻은 멸치 가수분해물(APH), 감압농축한 멸치 가수분해물(Evaporation APH), 상기 멸치 가수분해물을 10 kDa 및 5kDa의 한외여과막으로 여과한 분획물(MW < 5kDa) 및 상기 한외여과막으로 여과한 분획물을 250 Da의 나노여과막으로 여과한 분획물(APHN-1)에 2% 활성탄 처리로 인한 탈색 효과를 육안으로 관찰한 결과이다.
도 21은 멸치 분쇄물에 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 멸치 분쇄물 중량의 2% 함량으로 첨가하고, 75MPa의 압력, 50℃의 온도에서 16시간 동안 고압 처리하여 가수분해한 다음 원심분리하여 얻은 멸치 가수분해물(APH), 감압농축한 멸치 가수분해물(Evaporation APH), 상기 멸치 가수분해물을 10 kDa 및 5kDa의 한외여과막으로 여과한 분획물(MW < 5kDa) 및 상기 한외여과막으로 여과한 분획물을 250 Da의 나노여과막으로 여과한 분획물(APHN-1)에 2% 활성탄 처리로 인한 휘발성 성분의 함량을 측정한 결과이다.
도 22는 멸치 분쇄물에 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 멸치 분쇄물 중량의 2% 함량으로 첨가하고, 75MPa의 압력, 50℃의 온도에서 16시간 동안 고압 처리하여 가수분해한 다음 원심분리하여 얻은 멸치 가수분해물(APH), 감압농축한 멸치 가수분해물(Evaporation APH), 상기 멸치 가수분해물을 10 kDa 및 5kDa의 한외여과막으로 여과한 분획물(MW < 5kDa) 및 상기 한외여과막으로 여과한 분획물을 250 Da의 나노여과막으로 여과한 분획물(APHN-1)에 2% 활성탄 처리로 인해 제거된 휘발성 물질의 화학식을 나타낸 것이다.
도 23은 멸치 분쇄물에 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 멸치 분쇄물 중량의 2% 함량으로 첨가하고, 75MPa의 압력, 50℃의 온도에서 16시간 동안 고압 처리하여 가수분해한 다음 원심분리하여 얻은 멸치 가수분해물(APH)을 한외여과막 및 나노여과막으로 여과하여 분획한 APHN-1 분획물에 2% 활성탄 처리에 따른 염미 증진율을 측정한 결과이다.
도 24는 멸치 분쇄물에 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 멸치 분쇄물 중량의 2% 함량으로 첨가하고, 75MPa의 압력, 50℃의 온도에서 16시간 동안 고압 처리하여 가수분해한 다음 원심분리하여 얻은 멸치 가수분해물(APH)을 5 내지 10 kDa의 한외여과 시스템을 이용하여 정제하여 5 kDa 이하의 분자량을 가지는 분획물의 향미 관능평가를 나타낸 그래프이다.
도 25는 멸치 분쇄물에 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 멸치 분쇄물 중량의 2% 함량으로 첨가하고, 75MPa의 압력, 50℃의 온도에서 16시간 동안 고압 처리하여 가수분해한 다음 원심분리하여 얻은 멸치 가수분해물(APH)을 10 kDa의 한외여과 시스템을 이용하여 여과한 분획물(10 kDa permate)을 분무건조 조건에 따라 건조하여 얻은 분획물(10 kDa permate) 및 동결건조하여 얻은 분획물(10 kDa permate)의 입자크기를 현미경으로 비교 관찰한 결과이다.
도 26은 멸치 분쇄물에 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 멸치 분쇄물 중량의 2% 함량으로 첨가하고, 75MPa의 압력, 50℃의 온도에서 16시간 동안 고압 처리하여 가수분해한 다음 원심분리하여 얻은 멸치 가수분해물(APH)을 10 kDa의 한외여과 시스템을 이용하여 여과한 분획물(10 kDa permate)을 분무건조 조건에 따라 건조하여 얻은 분획물(10 kDa permate) 및 동결건조하여 얻은 분획물(10 kDa permate)의 색을 육안으로 비교 관찰한 결과이다.
도 27은 45mM의 농도를 가지는 표준용액을 기준으로 멸치 분쇄물에 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 멸치 분쇄물 중량의 2% 함량으로 첨가하고, 75MPa의 압력, 50℃의 온도에서 16시간 동안 고압 처리하여 가수분해한 다음 원심분리하여 얻은 멸치 가수분해물(APH)을 10 kDa의 한외여과 시스템을 이용하여 여과한 분획물(10 kDa permate) 및 250 Da의 나노여과 시스템을 이용하여 여과한 APHN-1 분획물의 짠맛을 측정한 결과이다.

이하, 제조예 및 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 제조예 및 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

제조예 1 : 효소 및 멸치 내재 조효소액 준비

1-1. 효소 및 복합효소 준비

국내에서 구하기 쉬운 효소들 중 1차로 단백질 분해효소(protease)와 아미노펩티다아제(amino-peptidase)를 선정하고, 이들을 구입하여 준비하였다. 구체적으로, 단백질 분해효소는 노보자임(novozymes, Denmark)에서 알칼라아제(alcalase)와 프로타멕스(Protamex)를, 아미노 펩티다아제는 대명상사(daemyungcorp, Korea)에서 플라보르자임(flavourzyme)을 구매하여 준비하였다. 또한, 상기 효소 중 알칼라아제와 플라보르자임을 5 : 1, 4 : 2, 3 : 3, 2 : 4 또는 1 : 5의 중량비로 혼합하여 복합효소를 제조하였다. 국내에서 구하기 쉬운 효소에 대한 정보를 하기 표 1에 나타내었고, 이 중에서 1차 선정된 3가지 효소들의 특성은 하기 표 2에 나타내었다.

효소명	상품명	기원	type	작용기전
Protease (Subtilisin)	Alcalase 2.4L	Bacillus licheniformis	endo (serineendoprotease)	serine기에 작용. Gelatin Extraction
Protease (neutral)	Neutrase 0.8L	Bacillus amyloliquefaciens	endo (metalloendoprotease)	gluten weakening. 반죽의 특성을 우수하게 향상
Trypsin	PTN 6.OS	porcine pancreas		arginine과 lysine 잔사의 carboxyl side에 peptide 결합을 깬다.
Amino- peptidase	Flavourzyme 500MG	Aspergillus oryzae	exo (aminopeptidase), endo
Amino- peptidase	Flavourzyme 1000L	Aspergillus oryzae	exo, endo mix	치즈, 효모, 생선, 고기 등의 펩타이드 제조가 용이. 풍미향상
Protease (Subtilisin)	Protamex	Bacillus	endo (serineendoprotease)	다른 endoprotease와 달리 낮은 가수분해도에서도 쓴맛을 내는 단백질 분해물을 생성하지 않음
protease	Bromeline 1200 GDU	pineapple
protease	Collupullin MG	carica papaya
Multi-enzyme complex	Viscozyme L	Aspergillus aculeatus		cell wall 파괴

상품명	분자량 (kDa)	최적 pH	온도(℃)	금속이온요구	활성아미노산	주요 활성저해제
Alcalsae 2.4L	18~35	6.5~8.5	55~70	Ca² ⁺	serin	phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and diisopropylfluorophosphate
Flavourzyme 500 MG	30~45	5.5~7.5	45~65	-	N-terminal	N-bromophenacyl bromide, Iodine, potassium permanganate
Protamex 1.5 MG	18~35	5.5~7.5	35~60	Ca² ⁺	serin	phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), EDTA

1-2. 멸치 내재 조효소 준비

3월 초에 제주도 해역에서 어획되어 -20℃에서 동결 보관된 멸치를 동해수산(기장)에서 구입하였다. 상기 멸치는 해동한 후 내장과 살로 분리하여 전체 멸치(whole anchow; WA), 내장(viscera anchow; VA) 및 근육(muscle anchow) 부분으로 나누어 준비하였다. 그 다음 상기 전체 멸치(WA), 내장(VA) 및 근육(MA)을 20mM의 인산완충 용액(phosphate buffer, pH 7.0)과 1 : 2의 중량비로 혼합한 후 호모게나이저(homogenizer, IKA, Germany)를 이용하여 16,000 rpm으로 5분 동안 균질하였다. 그 다음 4℃가 유지되는 원심분리기에서 17,500×g의 속도로 20분 동안 원심분리하여 상등액을 분리하고, 분리된 상등액은 여과지(Whatman paper No. 4)로 여과하여 조효소로 사용하였다.

실시예 1 : 멸치로부터 염미증진물질의 추출을 위한 예비실험

1-1. 전처리 공정 : 원료 분쇄 조건 설정

3월 초에 제주도 해역에서 어획되어 -20℃에서 동결 보관된 멸치를 동해수산(기장)에서 구입하였다. 상기 구입한 멸치를 상온에서 해동한 후 10 내지 15℃의 물에 1시간 동안 침지 및 수세하여 염분 및 불순물을 제거하였다. 그 다음 상기 멸치에 멸치 중량의 2배의 물을 첨가하고, 가정용 믹서기를 이용하여 2분 동안 2회 분쇄한 후 호모게나이저를 이용하여 16,000 rpm으로 5분 동안 2차 분쇄하여 멸치 분쇄물을 제조하였다.

그 결과, 도면에는 나타내지 않았으나 가정용 믹서기를 이용하여 1차 분쇄한 멸치 분쇄물의 입자 크기는 약 1,000 ㎛ 이하였고, 호모게나이저로 2차 분쇄한 멸치 분쇄물의 크기는 약 180 ㎛이였다. 예비실험 과정에서 분쇄속도가 입자 크기의 감소에 영향을 주며, 16,000 rpm 및 5분 이상에서 분쇄하였을 경우 입자의 크기는 유의적으로 차이가 없는 것으로 확인되었다.

1-2. 가공 공정 : 최적의 효소 선택(1)

가수분해 활성이 가장 좋은 효소를 선택하기 위하여 상기 제조예 1-1에서 준비한 단일 효소 및 혼합비에 따라 제조한 복합효소, 및 상기 제조예 1-2에서 제조한 멸치 내재 조효소의 단백질 가수분해활성을 측정하였다. 먼저, 카제인(casein, sigma C-7078, USA) 분말을 0.03M 인산완충 용액(phosphate buffer, pH 7.5)에 녹여 20 mg/ml의 농도로 제조하였다. 그 다음 상기 카제인 5ml에 제조예 1-1에서 준비한 단일 효소, 혼합비에 따라 제조한 복합효소 및 상기 제조예 1-3에서 제조한 멸치 내재 조효소액을 각각 1ml씩 첨가한 후 50℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그 다음 0.44M TCA 용액을 5ml 첨가하여 혼합한 후 실온에서 30분 동안 정치시켜 효소반응을 중단시켰다. 효소반응이 중단된 시료는 12,000×g의 속도로 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 0.2㎛ 실링지 필터(syringe filter)로 여과하였다. 그 다음 상기 여과액 1ml에 0.55M 탄산나트륨(Na₂CO₃) 용액 2.5ml 및 1N 폴린-시오칼토 시약(folin-ciocalteu reagent, sigma, USA) 0.5ml을 첨가한 후 37℃에서 30분 동안 발색시켰다. 그 다음 상기 발색된 시료를 상온에서 10분 동안 정치시킨 후 660nm에서 흡광도를 측정하였다. 가수분해활성은 측정된 수치로부터 효소액 1ml이 1분간 1㎍에 해당하는 티로신을 생산하는 것을 1 unit로 하였다. 표준품으로는 L-티로신(sigma, USA)을 사용하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

효소		단백질 가수분해활성(U/g)
알칼라아제		15,100.00
프로타멕스		13,402.63
플라보르자임		8,400.00
복합효소 (알칼라아제 : 플라보르자임)	5 : 1	17,800.00
	4 : 2	19,050.00
	3 : 3	17,375.00
	2 : 4	16,100.00
	1 : 5	15,425.00
멸치 내재 조효소	WA(전체)	44.74
	MA(근육)	34.21
	VA(내장)	163.16

실험결과, 알칼라아제의 가수분해활성이 가장 높게 나타났으며, 알칼라아제와 플라보르자임을 1 : 5의 중량비로 혼합한 복합효소가 알칼라아제와 유사한 가수분해활성을 나타냈다.

1-3. 가공 공정 : 최적의 효소 선택(2)

멸치 분말 100g에 상기 제조예 1-1에서 준비한 단일 효소 및 혼합비에 따라 제조한 복합효소, 및 상기 제조예 1-2에서 제조한 멸치 내재 조효소를 각각 2ml씩 첨가한 후 50℃의 온도에서 3시간 동안 반응시켰다. 이때, 반응 30분마다 멸치 분말을 채취하고, 채취한 멸치 분말은 100℃에서 10분 동안 가열하여 효소를 실활(dead-end)시킨 후 0℃가 유지되는 냉각기(chiller)에서 냉각한 다음, 17,500×g의 속도로 20분 동안 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 상기 분리된 상등액은 여과지(Whatman paper No.4)로 여과하여 가수해된 멸치 분말의 쓴맛(bitterness) 정도를 HPLC 및 GPC 크로마토그램을 이용하여 측정하였다.

상기 쓴맛의 정도는 쓴맛을 내는 아미노산으로 알려진 트립토판(tryptophan)의 함량을 측정함으로써 이루어졌다. 상기 HPLC(Hewlett agilent, 1100-series, USA) 분석을 위해 시료를 추가 처리하였다. 구체적으로, 상기 여과지에 여과한 각 시료를 10,000 rpm의 속도에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 분리하였다. 그 다음 상기 상등액 1ml에 12% 과염소산(HClO₄) 0.5ml을 넣고 혼합한 후 다시 10,000 rpm의 속도에서 30분 동안 원심분리 하였다. 그 다음 상등액을 분리하여 0.22㎛ 실링지 필터(syringe filter)에 통과시킨 후 HPLC에 주입하였다. 시료 분석에 사용된 컬럼은 C18 Hypersil ODS(4.0×250mm)을 사용하였고, 이동상은 메탄올(methanol)과 아세트산나트륨(sodium acetate) 8.5 mM을 1 mL/분의 유속으로 흐르게 하였으며, 시료는 2 ㎕ 씩 주입하였다. 시료의 분석은 280 nm에서의 흡광도를 측정하여 이루어졌고, 표준품은 DL-트립토판(Sigma, USA)을 사용하였다. 그 결과를 도 2 및 3에 나타내었다.

실험결과, 알칼라아제와 플라보르자임은 멸치 내재 조효소 및 프로타멕스에 비하여 트립토판 생성 함량을 감소시키고, 짠맛증진물질이 포함되어 있는 것으로 예상되는 Peak Ⅱ 분획의 비율이 높아 알칼라아제와 플라보르자임을 혼합 효소의 원료로 선정한 것이 바람직하다는 사실을 확인하였다.

따라서, 상기 실시예 1-2의 결과와 본 실험 결과를 종합하여 가수분해활성이 우수하면서도 쓴맛을 최소화하고 짠맛 증진물질이 많이 포함되어 있는 Peak Ⅱ 분획을 많이 생성할 수 있는 알칼라아제와 플라보르자임이 1 : 5의 중량비로 혼합된 복합효소를 사용하기로 결정하였다.

효소의 작용을 최대화하기 위해서는 pH의 조절이 요구되지만, 본 실험은 액화물의 산업적 생산을 고려하여 공정을 단순화하고자 하는 목적으로 pH 조절은 생략하기로 하였다.

1-4. 가공 공정 : 고압처리 조건 설정

상기 실시예 1-1의 조건으로 분쇄한 멸치 분쇄물 100ml에 상기 제조예 1-1에서 준비한 단일 효소 및 혼합비에 따라 제조한 복합효소를 처리한 후 상기 표 2에 기재된 각 효소의 최적의 온도 및 50 내지 200 MPa의 압력에서 50시간 동안 고압처리 하였다.

그 결과, 효소의 작용은 48시간 까지 진행되는 것으로 나타났으며, 상업적 효소들의 경우 보고되고 있는 최적의 온도보다 압력 하에서는 약 5℃ 정도 상승된 온도에서 최적의 활성을 나타내는 것으로 보고되고 있어, 40~60℃의 온도에서 액화를 진행하기로 결정하였다.

또한, 압력을 100 MPa 이상으로 설정하는 경우 온도 조절에 문제가 발생하므로, 최적화 압력의 범위는 50~100 MPa로 설정하기로 결정하였다.

1-5. 후처리 공정 : 효소 불활성화 및 후처리 조건 설정

고압/효소 처리를 마친 멸치 분쇄물을 90~100℃에서 10분 동안 불활성화 처리를 하고, 0℃ 냉각기(chiller)에서 냉각하여 추가적인 효소의 반응을 정지시켰다. 그 다음 12시간 동안 4℃에서 숙성하여 시료 내 유지의 고형화를 유도하고, 고형화한 지방은 원심분리 및 여과 과정을 통하여 제거한 후 냉동 저장하였다.

그 결과, 냉각숙성이 이루어진 가수분해된 멸치 분쇄물의 지방 함량은 약 0.1% 이하로 확인되었으며, 이는 최종 제조된 액화물의 이미 및 이취발생 억제의 중요한 인자로 작용하는 것으로 나타났다. 즉, 충분한 냉각과정이 이루어지지 않으면 저장 시료에서 부유 지방이 발생하는 것으로 확인되었으므로, 충분한 시간의 숙성은 반드시 요구되어진다.

따라서, 상기 예비실험을 통하여 멸치로부터 염미증진물질을 추출하기 위한 변수로서, 온도(40~60℃), 압력(50~100 MPa), 시간(12~48 시간) 및 효소 사용 농도(0~2%)를 설정하였다.

실시예 2 : 염미증진물질의 추출을 위한 고압효소가수분해 처리 조건 확립

2-1. 재료 준비

3월 초에 제주도 해역에서 어획되어 -20℃에서 동결 보관된 멸치를 동해수산(기장)에서 구입하였다. 상기 구입한 멸치를 상온에서 해동한 후 10 내지 15℃의 물에 1시간 동안 침지 및 수세하여 염분 및 불순물을 제거하였다. 그 다음 상기 멸치에 멸치 중량의 2배의 물을 첨가하고, 가정용 믹서기를 이용하여 2분 동안 2회 분쇄한 후 호모게나이저를 이용하여 16,000 rpm으로 5분 동안 2차 분쇄하여 멸치 분쇄물을 준비하였다.

멸치 분쇄물의 액화에 사용되는 효소는 알칼라아제(alcalase, novozymes, Demark)와 플라보르자임(flavourzyme, 대명상사, Korea)을 1 : 5의 중량비로 혼합하여 준비하였다.

2-2. 고압 처리 조건 확립

우선 실험 횟수를 최대한 줄일 수 있는 L₉(3⁴)의 직교배열표인 MINITAB을 이용하여 하기 표 4와 같이 완성하였고, 모든 실험은 상기 실시예 1의 예비실험에서 설정된 절차에 따라 진행되었다. 이때 9가지 조건의 실험을 3회 반복과 검증 실험을 3회 반복하는 실험을 총 30회 실시하였다.

	파라미터(parameters)
	압력(MPa)	온도(℃)	시간(hrs)	효소농도(%)
1	50	40	12	0
2	50	50	24	1
3	50	60	48	2
4	75	40	24	2
5	75	50	48	0
6	75	60	12	1
7	100	40	48	1
8	100	50	12	2
9	100	60	24	0

2-3. 고압/효소 처리 조건에 따라 가수분해된 멸치 분쇄물의 일반성분 및 이화학적 특성 분석

상기 실시예 2-2의 조건으로 고압/효소 처리된 멸치 분쇄물을 AOAC 일반성분 분석법에 의해 수분, 조지방, 조단백질 및 회분 함량을 분석하였다. 멸치 분쇄물의 pH, 염도 및 수용성 고형분의 함량은 pH계(pH meter, Orion 4-star Plus, Thermo Sci., USA), 염도계(Salt meter, Master-S28M, Atago, Japan) 및 당도계(Master Refractometer, Master-M, 2M and 3M, Atago, Japan)를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 표 5 및 표 6에 나타내었다.

1) 수분

상기 실시예 2-2의 조건으로 고압/효소 처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물 약 3~5g을 진공오븐에 넣어 98~100℃에서 3~5시간 동안 건조시킨 후 데시케이터(desiccator)에서 약 30분간 식히고 무게를 측정하였다. 그 다음 다시 칭량접시를 1~2시간 건조하여 일정한 중량이 될 때까지 반복 건조하여 하기 실험식 1을 이용하여 수분 함량을 측정하였다(AOAC법 926.08과 925.09, 1990).

[실험식 1]

수분(%) = [(W₁-W₂)/(W₁-W₀)] × 100

W₁ : 칭량접시와 멸치 분쇄물 무게

W₂ : 건조 후 칭량접시와 멸치 분쇄물의 무게

W₀ : 칭량접시의 항량

2) 조지방

조지방 함량은 soxhlet(Raypa, SX-6MP)법을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2-2의 조건으로 고압/효소 처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물 10~20g을 믹서기에 넣고, 메탄올 100ml을 2번에 나누어 넣어 혼합시킨 다음 펀넬(funnel)에 넣어 강하게 흔들었다. 그 다음 클로로포름 역시 동량 및 같은 방법으로 펀넬에 넣고 강하게 흔든 후 증류수 90ml을 넣고 강하게 흔들었다. 그 다음 펀넬을 방치하여 층분리가 되면, 항량(constant weight)이 된 수기(칭량병)에 깔대기를 꽂고 무수황산 나트륨을 이용하여 클로로포름 층을 농축하였다. 그 후 다시 펀넬에 클로로포름 90ml을 넣고 흔든 다음, 층분리하여 상기와 같은 방법으로 클로로포름층을 받아 농축시킨다. 그 후 농축시킨 층을 건조시킨 다음 수기를 105℃ 이상으로 가열하여 하기 실험식 2를 이용하여 조지방 함량을 구하였다.

[실험식 2]

지방(%) = [(W₁-W₀)/S] × 100

W₁ : 지방수기의 항량(g),

W₀ : 지방 추출 후 지방수기의 항량(g)

S : 시료의 무게(g)

3) 조단백

조단백 함량은 마이크로-킬달법(micro-Kjeldahl 법)을 이용하여 분석하였다. 상기 실시예 2-2의 조건으로 고압/효소 처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물 약 0.5g을 취하여 단백질 분해관(250ml 분해관, Buchi)에 넣고, 분해 촉진제(Kjeltabs tablets containing Potassium Sulphate and a catalyst, Foss. Denmark) 3.5g을 첨가한 후, 황산(95%, Kanto, 0172-00438, Japan) 20~25 mL을 가하여 플라스크를 흔들어 주면서 혼합하였다. 단백질 분해장치(Raypa-R. Espinar, S.L, Spain)에 시료와 시약을 넣은 단백질 분해관을 넣고 분해장치 뚜껑을 덮은 후 최종 시료가 투명하게 분해 될 때까지 약 1~2시간 동안 410℃ 에서 분해하였다. 분해가 완료된 후 플라스크를 실온으로 꺼내 15분 동안 방냉시킨 다음 증류장치(Raypa-R. Espinar, S.L, Spain)에서 60 mL 3% 붕산(boric acid)에 5분간 증류하여 포집하였다. 그 후 자동적정기(Crison Instruments, S.A., Titromatic, Spain)에 의해 0.1N 염산용액(Samchun, H0241, Korea)으로 적정하고, 하기 실험식 3을 이용하여 계산하였다.

[실험식 3]

조단백질(%N) = {[(V₁ - V₂) × f × 0.0014]/S} × 100

V₁: 0.1N 염산용액 소비량(ml)

V₂: blank 시험시 0.1N 염산용액 소비량(ml)

f = 0.1N 염산용액 역가 수

S = 멸치 분쇄물의 무게

4) 조회분

상기 실시예 2-2의 조건으로 고압/효소 처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물을 550±10℃에 점화하여 휘발성 유기 물질을 빼냈다. 잔류물의 중량을 측정한 후 회분 함량을 계산하였다(AOAC법 923.03, 1990).

5) 실험결과

	수분(%)	조지방(%)	조단백(%)	조회분(%)
1	95.78±0.06	0.10±0.01	3.98±0.01	0.14±0.20
2	94.46±0.10	0.07±0.00	4.36±0.02	0.28±0.39
3	93.42±0.20	0.09±0.00	5.18±0.00	0.43±0.60
4	93.48±0.13	0.03±0.00	4.90±0.00	0.41±0.57
5	94.96±0.01	0.04±0.00	4.2±10.01	0.16±0.22
6	94.62±0.06	0.01±0.00	4.41±0.01	0.27±0.38
7	94.48±0.07	0.01±0.00	4.45±0.01	0.28±0.38
8	93.45±0.14	0.00±0.00	5.08±0.02	0.40±0.56
9	95.21±0.02	0.01±0.00	4.18±0.00	0.14±0.20

	pH	염도(%)	수용성 고형분(Brix, %)
1	6.17±0.02	0.08±0.00	5.80±0.00
2	6.51±0.01	0.37±0.01	6.40±0.00
3	6.35±0.00	0.74±0.01	8.00±0.00
4	6.45±0.01	0.73±0.01	7.60±0.00
5	6.55±0.01	0.08±0.01	6.00±0.00
6	6.40±0.00	0.33±0.00	5.33±0.12
7	6.44±0.00	0.45±0.00	6.80±0.00
8	6.36±0.00	0.66±0.00	6.40±0.00
9	6.50±0.00	0.06±0.00	4.47±0.12

실험결과, 조지방 함량은 0.1% 이하였고, 염도는 역시 0.1% 이하였다. pH는 6.1~6.6 범위로 일정하였다. 다만, 조단백질 함량 및 수용성 고형분의 함량만이 실험 조건에 따라 유의적인 변화를 나타내었다.

2-4. 고압/효소 처리 조건에 따라 가수분해된 멸치 분쇄물의 유리아미노산 함량 측정

유리 아미노산의 분석은 HPCL 시스템(Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA)을 사용하여 수행하였다. 시료는 C18 컬럼(4.6 × 150 mm, 5 ; Youngjinbiochrom, Korea)으로 분리되었고, 분리된 시료는 두 개의 검출기(fluorescence detector, UV detector)에서 분석되었다. 상기 실시예 2-2의 조건으로 고압/효소 처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물은 증류수로 적정농도로 희석되었고, 실링지 필터(DISMIC-13CP 0.45 micron syringe filter, Advantec Co., Saijo, Japan)로 분석 전 여과하였다. 이동상은 20 mM 인산나트륨 용액(sodium phosphate buffer, pH 7.8)과 45%(v/v) 아세토니트릴과 45% (v/v) 메탄올 용액을 혼합한 용액을 사용하였다. 시료는 오르토-프탈알데하이드(o-phthalaldehyde, OPA)와 반응한 경우 형광검출기(450 nm emission, 305 nm excitation)로, 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트(9-fluorenylmethyl chloroformate, FMOC)와 반응시킨 경우 UV 검출기(338 nm)로 분석하였다. 그 결과를 도 4 및 표 7에 나타내었다.

(mg/L)
분류	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Glutamate	1,853.94	2,336.31	3,177.16	3,926.92	24,16.45	2,661.21	3,247.31	3,158.00	1,770.11
Asparagine	2,007.80	2,397.26	2,880.68	3,329.25	2,640.57	2,575.29	3,183.72	2,904.26	2,056.83
Serine	0.00	205.90	0.00	0.00	159.01	297.71	80.10	69.12	190.78
Glutamine	1,291.27	1,442.93	1,958.10	2,136.44	1,515.97	1,730.82	1,849.28	1,937.89	1,252.86
Histidine	3,345.68	2,576.31	648.34	4,509.64	2,110.83	2,779.53	3,485.74	3,853.03	1,426.46
Glycin	943.75	1,038.05	1,689.60	1,845.14	724.80	1,249.80	1,195.03	1,633.53	593.66
Threonine	703.89	1,071.28	1,167.74	1,408.02	1,158.61	1,011.74	1,382.54	1,209.29	804.72
Arginine	1,222.47	1,455.38	1,981.70	2,167.88	1,512.86	1,767.33	1,911.45	1,960.42	1,277.10
Alanine	2,088.37	2,124.21	2,775.38	2,903.18	2,270.69	2,641.43	2,569.81	2,720.68	2,200.49
GABA	2,163.44	2,179.34	2,874.90	3,147.71	2,446.71	2,534.83	2,914.38	2,838.40	1,999.13
Tyrosine	608.49	517.29	744.70	708.85	597.91	668.89	600.25	665.12	562.55
Valine	432.63	456.93	541.54	516.04	545.67	494.51	535.39	505.85	470.08
Methionine	1,541.99	1,829.54	2,495.44	2,637.13	1,836.54	2,183.58	2,222.65	2,442.98	1,586.83
Tryptophan	1,112.12	1,220.92	1,505.25	1,515.77	1,138.04	1,263.97	1,297.92	1,463.45	1,086.36
Phenyl- alanine	4,222.73	4,758.35	6,510.15	6,574.62	4,692.94	5,271.15	5,328.27	6046.98	4193.87
Isoleucine	1,350.66	1,534.65	1,996.89	2,021.14	1,487.70	1,740.71	1,697.32	1,936.70	1,370.07
Leucine	1,511.85	2,012.07	2,426.38	2,505.83	1,865.24	2,068.11	2,164.58	2,412.00	1,588.37
Lysine	2,818.21	3,315.97	3,907.03	3,966.16	3,150.27	3,401.41	3,412.07	3,825.85	2,828.99
Proline	2,244.41	2,431.90	3,664.01	3,849.42	2,597.35	3,035.24	3,180.91	3,417.81	2,495.62
Total	32,174.40	35,308.14	43,432.76	50,561.26	35,324.25	39,794.81	43,254.86	45,605.36	30,033.37

실험결과, 멸치 분쇄물에 복합효소를 2% 처리한 후 75 MPa의 압력, 40℃의 온도에서 24시간 동안 고압처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물의 아미노산 함량이 가장 높은 것으로 확인되었다.

2-5. 고압/효소 처리 조건에 따라 가수분해된 멸치 분쇄물의 가수분해도(degree of hydrolysis, DH) 측정

상기 실시예 2-2의 조건으로 고압/효소 처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물의 가수분해도는 멸치의 아미노산의 함량(51.16 mg/mL)을 기준으로 고압/효소 처리 후 상등액에 포함되어 있는 유리 아미노산의 총 함량을 기준으로 분석하였다. 멸치에 함유되어 있는 아미노산의 함량은 물에 동량으로 희석한 분쇄 멸치를 산으로 가수분해하여 분석하였고, 유리 아미노산의 함량은 전처리 없이 실링지 필터로 여과(2 ㎛)하여 분석하였다. 가수분해도는 하기 실험식 5를 이용하여 계산하였다. 상기 가수분해도를 분석하기 위한 아미노태 질소는 포르몰(formol) 적정법과 TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, Sigma, USA)법을 사용하여 정량하였다. 상기 TNBS법에서는 표준물질을 L-루신(JUNSEI, Japan)으로 하였고, 시료 0.25 mL에 0.2몰의 완충용액(phosphate buffer, pH 8.2) 2 mL, 0.05% TNBS 2 mL을 넣고 50℃ 암소에서 60분 동안 반응시켰다. 반응을 중지시키기 위해 0.1N HCl 4 mL을 넣고 30분간 반응한 후 UV/Vis 스펙트로포토미터(spectrophotometer, Beckmen, DU530, USA)로 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. 포르몰(Formol) 적정법에서는 시료를 증류수로 40배 희석하고 pH를 7.0으로 조절하였다. 이 후 시료에 포말린(formalin) 10 mL 을 넣고 NaOH를 이용하여 pH 8.5로 적정하여 첨가된 NaOH 양으로부터 하기 실험식 4를 사용하여 포르몰 질소(formol nitrogen)의 함량을 산출하였다. 또한, 압력, 온도, 시간 및 효소별 S/N비(신호 대 잡음비)도 구하였다. 그 결과를 도 5 및 표 8에 나타내었다.

[실험식 4]

아미노태 질소(mg) = NaOH(ml) × NaOH의 노르말 농도 × 14

[실험식 5]

가수분해도(DH, %) = (아미노태 질소/총 질소) × 100

2-6. 고압/효소 처리 조건에 따라 가수분해된 멸치 분쇄물의 질소 회수율(nitrogen recovery, NR) 측정

상기 실시예 2-2의 조건으로 고압/효소 처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물의 질소 회수율은 총 질소의 함량, 수용성 단백질에 함유되어 있는 질소의 함량, 유리 아미노산의 형태로 존재하는 질소의 함량을 계산하여 측정하였다. 수용성 단백질의 함량과 포르몰 질소(formol nitrogen)의 함량을 분석하여 총 질소의 함량을 백분율로 산출하고, 측정되지 않은 질소의 함량은 unknown으로 나타내었다. 수용성 단백질은 로리법(lowry method)으로 정량하였으며, 이때 사용한 표준시료는 BSA(Bovine Serum Albumin, Sigma, USA)를 사용하였고, 시료 1 mL에 로리 시약(Sigma, TP0300-1KT Kit, USA) 1 mL을 넣고 20분 동안 반응시킨다. 이 후 폴린용액(Folin-ciocalteu's phenol reagent, Sigma, TP0300-1KT Kit, USA) 0.5 mL을 넣고 30분 간 반응시킨 후, UV/Vis 스펙트로포토미터(Spectrophotometer, Beckmen, DU530, USA)으로 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 상기 unknown은 휘발성 비단백태 질소와 침전된 질소를 포함한다. 또한, 압력, 온도, 시간 및 효소별 S/N비(신호 대 잡음비)도 구하였다. 그 결과를 도 6 및 표 8에 나타내었다.

2-7. 고압/효소 처리 조건에 따라 가수분해된 멸치 분쇄물의 수율 측정

상기 실시예 2-2의 조건으로 고압/효소처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물을 17,000 rpm으로 원심분리하여 상등액을 수득한 후 하기 실험식 6을 이용하여 멸치 분쇄물을 수율을 백분율로 나타내었다. 그 결과를 도 7 및 표 8에 나타내었다.

[실험식 6]

수율(%) = {가수분해된 멸치분쇄물의 원심분리 후 무게(g)/가수분해된 멸치분쇄물의 원심분리 전 무게(g)} × 100

	총 질소 (mg/mL)	포르몰 질소 (mg/mL)	수용성 단백질 질소(mg/mL)	DH(%)	S/N1	NR(%)	S/N2	수율(%)	S/N3
1	30.88	4.32±0.04	5.12±0.03	13.99	22.91	62.86	35.97	86.30	38.72
2	34.24	6.25±0.14	2.61±0.36	18.25	25.23	68.98	36.77	74.15	37.40
3	35.52	6.51±0.03	3.27±0.12	18.33	25.26	84.85	38.57	67.76	36.62
4	28.16	7.15±0.28	3.44±0.09	25.4	28.10	98.78	39.89	70.91	37.01
5	20.48	5.69±0.14	3.89±0.34	27.8	28.88	69.01	36.78	50.34	34.03
6	31.52	5.77±0.15	3.64±0.14	18.29	25.24	77.74	37.81	71.94	37.14
7	24.64	6.16±0.06	2.77±0.01	24.99	27.96	84.50	38.54	47.99	33.62
8	25.44	7.07±0.45	2.66±0.01	27.81	28.88	89.09	39.00	98.62	39.88
9	29.92	5.17±0.06	3.69±0.07	17.3	24.76	58.67	35.37	75.58	37.57

실험결과, 도 5에서 보는 바와 같이 가수분해도는 압력, 온도, 시간 및 효소의 양과 같이 모든 인자에 대하여 영향을 받는 것으로 나타났다. 압력과 온도는 최적치가 존재하는 것으로 드러났고 효소 첨가량과 반응시간은 많거나 길수록 좋다는 것을 보여주었다. S/N비를 바탕으로 가수분해도가 가장 좋은 최적의 조건은 압력 75MPa, 온도 50℃, 반응시간 48시간 및 복합효소의 첨가량은 2%이었다.

도 6에서 보는 바와 같이 질소 회수율은 시간과 온도 및 압력의 영향은 그리 크지 않으나 압력의 경우에 최적 조건이 있는 것으로 판단되었고 효소의 첨가량은 많을수록 좋은 것으로 드러났다. S/N비를 바탕으로 질소분포도가 가장 좋은 최적은 조건은 압력 75MPa, 온도 40℃, 반응시간 48시간 및 복합효소의 첨가량은 2%이었다.

도 7에서 보는 바와 같이 수율은 압력과 온도의 영향은 미미하고, 시간은 길수록 효과가 줄어드는 것으로 나타났으며 효소의 첨가량은 많을수록 수율이 좋은 것으로 분석되었다. S/N비를 바탕으로 수율이 가장 좋은 최적의 조건은 압력 50MPa, 온도 50℃, 반응시간 12시간 및 복합효소의 첨가량은 2%이었다.

2-8. 고압/효소 처리 조건에 따라 가수분해된 멸치 분쇄물의 분자량 분포도 측정

상기 실시예 2-2의 조건으로 고압/효소 처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물의 짠맛증진물질 생산 최적화 가능성을 알아보기 위하여 겔 투과 크로마토그래피(Gel permeation chromatography, GPC, GE healthcare, AKTAP prime plus)를 이용하여 GPC 크로마토그램 분석을 실시하였다. 유리 컬럼(GE healthcare, XK16/70)에 고정상으로써 Sephadex G-10(Sigma, G10120)을 충진하여 분자량별로 분리하였다. 이동상은 1% 포름산(formic acid)을 사용하였고, 0.5 mL/분의 유속으로 시료를 주입하였으며, 214 nm에서 검출하였다. 또한 검출된 분획 중 짠맛증진물질이 존재할 것으로 예상되는 Peak Ⅱ 분획의 백분율과 S/N비(신호 대 잡음비)도 구하였다. 그 결과를 도 8, 도 9 및 표 9에 나타내었다.

	Peak Ⅱ (%)	S/N비
1	43.40	32.75
2	49.18	33.84
3	53.70	34.60
4	90.17	39.10
5	42.66	32.60
6	51.89	34.30
7	54.72	34.76
8	97.77	39.80
9	39.61	31.966

실험결과, 짠맛증진물질 생산 가능성은 효소가 가장 커다란 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 구체적으로, 짠맛증진물질이 존재할 것으로 예상되는 Peak Ⅱ 분획의 함량은 압력 증가에 따라 증가하다가 75 MPa 이상에서는 일정하게 유지되며, 50℃까지는 일정하게 유지되다가 그 이상의 온도에서는 감소하는 경향을 보였다. 또한, 12시간 이상 반응시킬 경우 Peak Ⅱ의 함량이 감소하였다.

실시예 3 : 파일럿 플랜트( pilot plant ) 수준에서 효소 안정성 검증

3-1. 멸치 및 효소 준비

멸치는 3월 초 제주도 해역에서 어획되어 -20℃에서 동결 보관된 멸치를 동해수산(기장)에서 구입하여 준비하였다. 그 다음 구입한 멸치를 상온에서 해동한 후 10 내지 15℃의 물에 1시간 동안 침지하여 염분 및 불순물을 제거하였다. 그 후 멸치 중량의 2배의 물을 첨가하여 가정용 믹서기를 이용하여 2분 동안 2회 분쇄한 다음 호모게나이저를 이용하여 16,000rpm에서 5분 동안 분쇄하여 멸치 분쇄물을 준비하였다.

효소는 상기 제조예 1-1에서 멸치의 가수분해를 위하여 선정된 시판 상용 효소인 알칼라아제(alcalase), 플라보르자임(flavoruzyme), 뉴트라아제(neutrase) 및 프로타멕스(protamex)를 노보자임사(Novonodisk Bioindustrials, Inc., Denmark)에서 구입하여 준비하였다. 또한, 상기 효소 중 알칼라아제와 플라보르자임을 1 : 5의 중량비로 혼합하여 복합효소(A:F=1:5)를 제조하여 준비하였다. 각 효소들의 최적 조건 및 유래는 하기 표 10과 같다.

효소명	최적 조건		물질 유래
효소명	온도(℃)	pH	물질 유래
Alcalase 2.4 L	55-70	6.5-8.5	Bacillus licheniformis
Flavourzyme 500 MG	50	7.0	Aspergillus oryzae
Neutrase 0.8 L	45-55	6.0	Bacillus amyloliiensquefaciens
Protamex 1.5 MG	40	6.0-7.0	Bacillus sp .

3-2. 상압 또는 고압조건에서의 효소별 효소활성 측정

상기 실시예 3-1에서 준비한 멸치 분쇄물에 알칼라아제(alcalase), 플라보르자임(flavourzyme), 뉴트라아제(neutrase), 프로타멕스(protamex), 및 알칼라아제(alcalase)와 플라보르자임(flavourzyme)을 1:5의 중량비로 혼합한 복합효소를 2% 첨가한 다음 상압(0.1 MPa, 50℃) 또는 고압(100MPa, 50℃) 조건에서 0, 1, 2, 6, 12 및 24시간 동안 반응시켜 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 효소의 단백질 가수분해 활성을 측정하였다. 대조군으로는 효소를 넣지 않고 고압 처리한 멸치를 사용하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

실험결과, 고압 및 상압 모두에서 5가지 효소들의 안정성이 유지되는 것을 확인하였다.

3-3. 상압 또는 고압조건에서의 효소별 가수분해도 측정

상기 실시예 3-1에서 준비한 멸치 분쇄물에 알칼라아제(alcalase), 플라보르자임(flavourzyme), 뉴트라아제(neutrase), 프로타멕스(protamex), 및 알칼라아제(alcalase)와 플라보르자임(flavourzyme)을 1:5의 중량비로 혼합한 복합효소(A:F=1:5)를 2% 첨가한 다음 상압(0.1 MPa, 50℃) 또는 고압(100MPa, 50℃) 조건에서 0, 1, 2, 6, 12 및 24시간 동안 반응시켜 실시예 2-5와 동일한 방법으로 가수분해된 멸치의 가수분해도를 분석하였다. 대조군으로는 효소를 넣지 않고 고압 처리한 멸치를 사용하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.

실험결과, 5가지 효소는 각각 상압에 비하여 고압에서 높은 가수분해도를 보였고, 대조군과 각 효소를 넣은 가수분해물의 가수분해도를 비교했을 때, 대조군보다 효소를 넣은 가수분해물의 가수분해도가 높은 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 보아 상압조건(0.1 MPa, 50℃)보다는 고압조건(100 MPa, 50℃)에서 가수분해가 촉진됨을 알 수 있었다.

3-4. 고압조건에서 효소처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물의 쓴맛 정도 측정

상기 실시예 3-1에서 준비한 멸치 분쇄물에 알칼라아제(alcalase), 플라보르자임(flavourzyme), 뉴트라아제(neutrase), 프로타멕스(protamex), 및 알칼라아제(alcalase)와 플라보르자임(flavourzyme)을 1:5의 중량비로 혼합한 복합효소(A:F=1:5)를 각각 2% 첨가한 다음 고압(100MPa, 50℃)조건에서 0, 1, 2, 6, 12 및 24시간 동안 반응시켜 실시예 1-3과 동일한 방법으로 가수분해된 멸치 분쇄물의 트립토판 함량을 측정하였다. 대조군으로는 효소를 넣지 않고 고압 처리한 멸치를 사용하였다. 그 결과를 표 11에 나타내었다.

	트립토판(mM)
Time	대조군	알칼라아제	플라보르자임	뉴트라아제	프로타멕스	A:F=1:5
0	1.11	1.15	1.62	1.15	1.52	1.61
1	6.12	4.59	7.60	7.27	7.56	4.61
2	8.96	8.41	8.61	9.83	13.10	8.73
6	15.10	14.92	12.71	16.71	18.45	12.81
12	17.12	16.06	13.69	19.66	19.60	15.19
24	16.98	17.03	12.61	20.59	21.92	16.90

실험결과, 플라보르자임(flavourzyme)을 첨가한 가수분해물이 대조군보다 트립토판(tryptophan)을 적게 생성되는 것으로 나타났으며, 그 다음으로는 복합효소(A:F=1:5), 알칼라아제(alcalase), 뉴트라아제(neutrase), 프로타멕스(protamax) 순으로 나타내었다. 이러한 결과 및 효소의 가격을 고려하여 복합효소(A:F=1:5)가 가장 적합한 것으로 결정되었다.

실시예 4 : 파일럿 플랜트 규모에서 염미증진물질을 추출하기 위한 최적의 고압효소가수분해 처리 조건 검증 실험

상기 실시예 2의 S/N비를 바탕으로 압력, 온도, 시간 및 효소에 따라 결정한 최적의 고압효소가수분해 처리 조건으로 고압/효소처리하여 가수분해된 멸치 분쇄물을 제조하고, 가수분해도, 질소 회수율 및 분자량을 각각 상기 실시예 2-5, 2-6 및 2-8과 동일한 방법으로 측정하였다. 각 측정치별 최적 조건은 하기 표 12에 나타내었다. 그 결과를 도 12 및 13과 표 13에 나타내었다.

측정치	압력(MPa)	온도(℃)	시간(hrs)	효소(%)
수율(%)	50	50	12	2
질소회수율(NR, %)	75	40	48	2
가수분해도(DH, %)	75	50	48	2
Peak (%)	75	50	12	2

	GPC fraction(%)
	Peak Ⅰ	Peak Ⅱ	Peak Ⅲ
1(수율, %)	7.65	50.17	42.18
2(NR, %)	4.79	48.92	46.29
3(DH, %)	5.42	48.99	45.59
4(Peak , %)	5.67	47.57	46.76
Peak Ⅰ: 1,300 Da 이상, Peak Ⅱ: 250-1,300 Da, Peak Ⅲ: 250 Da 이하

실험결과, 측정치별 고압효소가수분해 최적화 조건에 따른 가수분해된 멸치 분쇄물의 가수분해도는 질소 회수율의 최적 조건(75 MPa, 40℃, 48 시간, 효소 농도 2%)에서 가장 높게 나타냈으며, 측정치별 고압효소가수분해 최적화 조건에 따른 질소 회수율은 가수분해도의 최적 조건(75 MPa, 50℃, 48 시간, 효소 농도 2%)에서 가장 높게 나타났다.

측정치별 고압효소가수분해 최적화 조건에 따라 가수분해된 멸치 분쇄물의 분자량은 고압효소분해 조건별 유의적인 차이를 확인할 수 없었다.

파일럿 플랜트(pilot plant) 규모에서 멸치로부터 염미증진물질을 추출하기 위해서는 효소의 양을 줄여야 한다는 사실과 고압처리 시간의 반응 시간을 작업 시간과 일치시키는 것이 매우 중요하다는 사실을 확인할 수 있었다.

따라서 짠맛증진물질의 생산을 위한 최적조건인 75 MPa, 50℃, 복합효소 2% 및 12 시간의 처리 조건에서 시간을 16 시간으로 조정하여 파일럿 플랜트 규모의 생산에 적용하기로 결정하였다.

실시예 5 : 고압효소가수분해의 최적 조건에 따른 멸치 가수분해물 ( APH ) 제조

3월 초에 제주도 해역에서 어획되어 -20℃에서 동결 보관된 동해수산(기장)의 멸치를 구입하였다. 상기 구입한 멸치를 상온에서 해동한 후 10 내지 15℃의 물에 1시간 동안 침지 및 수세하여 염분 및 불순물을 제거하였다. 그 다음 상기 멸치에 멸치의 중량의 2배의 물을 첨가하고, 가정용 믹서기를 이용하여 2분 동안 2회 분쇄한 후 호모게나이저를 이용하여 16,000 rpm으로 5분 동안 2차 분쇄하여 멸치 분쇄물을 제조하였다. 그 다음 상기 분쇄한 멸치 분말에 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 멸치 분쇄물 중량의 2% 함량으로 첨가하여 2kg 단위로 파우치에 넣고 밀봉하였다. 그 후 고압시스템((주)이노쉘코리아, korea)을 이용하여 75MPa의 압력 및 50℃의 온도에서 16시간 동안 고압 처리한 다음 80℃에서 20분 동안 열처리하여 효소를 불활성화 하였다. 그 후 4℃에서 12시간 동안 냉각숙성한 다음 연속식 원심분리기(tubular centrifuge, A-V10675G, TOmoe engineering, Japan)를 이용하여 17,000rpm에서 원심분리하여 고화되어 떠있는 유지를 제거하여 멸치 가수분해물을 제조하였다.

실시예 6 : 멸치 가수분해물의 구성/유리 아미노산 함량 및 단백질 추출 효율 측정

6-1. 멸치 가수분해물의 구성/유리 아미노산 함량 측정

상기 실시예 5에서 제조한 멸치 가수분해물(APH)의 구성/유리 아미노산 함량을 상기 실시예 2-4와 동일한 방법으로 측정하였다. 이동상은 하기 표 14에 제시된 대로 구성 아미노산의 경우 10 mM Na₂HPO₄, 10mM Na₂B₄O₇ 10H₂O(pH8.2) 용액을 사용하고, 유리 아미노산의 경우 20 mM 인산나트륨 용액(sodium phosphate buffer, pH 7.8)과 5%(v/v) 아세토나이트릴 및 45% (v/v) 메탄올 용액을 혼합한 용액을 사용하였다. 시료는 오르토-프탈알데하이드(o-phthalaldehyde, OPA)와 반응 한 경우 형광검출기(450 nm emission, 305 nm excitation)로, 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트(9-fluorenylmethyl chloroformate, FMOC)와 반응시킨 경우 UV 검출기(338 nm)로 분석하였다. 그 결과를 도 14 및 표 15에 나타내었다.

	조건
	구성 아미노산	유리 아미노산
HPLC 기기	Ultimate 3000(Thermo Dionex, USA)
FL Detector	Emission 450 nm, Excitation 340 nm(OPA)
	Emission 305 nm, Excitation 266 nm(FMOC)
UV Detector	338 nm
표준품	1 nmol/μL Amino acids 17종 std (0.1 N-HCL 용해) 및 추가 6종	1 nmol/μL Amino acids 17종 std (0.1 N-HCL 용해)
Column	Inno C18 column(4.6 mm x 150 mm, 5 μm/Youngjinbiochrom, Korea)
Mobile Phase A	Na₂HPO₄ 10 mM, Na₂B₄O₇ 10H₂0 10 mM, pH 8.2	20 mM Sodium phosphate monobasic, pH 7.8
Mobile Phase B	3D.W. / Acetonitrile / Methanol(10 : 45 : 45 v/v%)
Injection Volume	1μ L	0.5 μL
Column Temperature	40℃
Sample Temperature	20℃

No.	Ret.Time min	Peak Name	Height LU	Area LU*min	Rel.Area %	함량(mg/kg)
1	2.79	Aspartic acid	0.059	0.014	0.23	860.897
2	4.33	Glutamic acid	0.068	0.007	0.12	542.059
3	7.65	Serine	0.104	0.012	0.21	525.731
4	8.89	Histidine	0.417	0.045	0.77	5,166.471
5	9.50	Glycine	5.514	0.621	10.71	18,294.064
6	9.68	Threonine	0.760	0.082	1.41	4,598.326
7	10.84	Arginine	2.795	0.312	5.38	20,143.196
8	11.57	Alanine	10.958	1.247	21.51	44,303.244
9	11.89	Taurine	1.522	0.186	3.21	7,551.130
10	13.38	Tyrosine	0.434	0.048	0.82	3,912.426
11	16.13	Novaline	5.698	0.687	11.85	22,076.667
12	16.49	Methionine	1.466	0.178	3.07	9,231.835
13	18.31	Phenylalanine	1.944	0.245	4.23	14,594.773
14	18.55	Isoleucine	4.286	0.554	9.57	24,941.859
15	19.54	Leucine	5.860	0.726	12.52	32,930.612
16	20.06	Lysine	1.076	0.138	2.37	36,236.801
17	21.40	Hydroproline	0.198	0.050	0.86	1,462.020
18	26.21	proline	3.449	0.646	11.15	20,034.288
Total:			46.609	5.796	100.00	267,406.400

실험결과, 유리 아미노산인 아스파라긴(asparagine)과 글루타민(glutamine)이 구성 아미노산인 아스파르트산(aspartic acid)과 글루타민산(glutamine acid)으로 전환된 것으로 확인되었고, 쓴맛을 나타내는 아미노산인 트립토판(tryptophane)은 검출되지 않았다.

6-2. 멸치 가수분해물(APH)의 단백질 추출 효율

상기 실시예 5에서 제조한 멸치 가수분해물과 상기 멸치 가수분해물을 원심분리한 시료를 각각 취해 질소함량을 측정하여 단백질 추출 효율을 하기 실험식 7을 이용하여 구하였다. 대조군으로는 생멸치를 사용하였다. 그 결과를 표 16에 나타내었다.

[실험식 7]

단백질 추출 효율(CIP, %) = (원심분리 후 질소 함량(상등액 1ml 당)/원심분리 전 질소 함량(APH 1ml 당)) × 100

	멸치:물(1:2)
생멸치의 단백질 함량(g/kg)	51.90
단백질 추출 효율(%)	63.50

실험결과, 생멸치에 함유된 단백질 함량은 51.90 g/kg이였고, 멸치 가수분해물의 총 단백질 함량은 1,307.68 g이었으며, 이 중 830.43 g의 단백질이 수용성 단백질로 존재하였으므로, 단백질 추출 효율은 63.50%이다. 이 값으로부터 본 발명을 통해 개발된 공정이 매우 효율적임을 확인할 수 있었다.

실시예 7 : 염미증진물질의 대량생산을 위한 분리 및 정제 조건 확립

7-1. 한외여과 시스템 및 나노여과 시스템을 이용한 멸치 가수분해물의 분획물 제조

상기 실시예 5에서 제조한 멸치 가수분해물(APH)을 한외여과 시스템(5 kDa, proflux M60 tangential frow filtration system, Millipore, USA 및 10 kDa, Lab U/F system) 및 나노여과 시스템(250 Da, Prolab system, USA)을 이용하여 멸치 가수분해물의 분획물을 제조하였다.

구체적으로, 상기 실시예 5에서 제조한 멸치 가수분해물을 한외여과막(MWCO 10 kDa)에 통과시켜 분리된 10 kDa 이상 크기의 분획물(이하, APHU-1이라 함)을 얻었다. 그 다음 상기 한외여과막에 투과된 투과액(MW<10 kDa)을 물에 1 : 10 비율로 용해시킨 후 한외여과막(MWCO 5 kDa)에 통과시켜 분리된 5 kDa 이상 10 kDa 미만 크기의 분획물(이하, APHU-2이라 함)을 얻었다. 그 다음 상기 한외여과막에 투과된 투과액(MW<5 kDa)을 나노여과막(MWCO 250 Da)에 통과시켜 분리된 250 Da 이상 5 kDa 미만의 분획물(이하, APHN-1이라 함)과 나노여과막에 투과된 투과액(MW<250 Da, 이하, APHN-2라 함)을 분획하였다. 상기 각 분획물은 -70℃에서 24시간 동안 동결시킨 후, 건조하여 -20℃에서 보관하였다.

7-2. 한외여과 및 나노여과를 통해 얻은 분획물의 수율 및 단백질 함량 측정

상기 실시예 5에서 제조한 멸치 가수분해물(APH), 상기 실시예 7-1에서 제조한 APHU-1 분획물, APHU-2 분획물, APHN-1 분획물 및 APHN-2 분획물의 무게를 측정하고, 가수분해하지 않은 생멸치를 기준으로 추출 수율을 측정하였다. 상기 분획물의 단백질 함량은 마이크로-킬달법(micro-Kjeldahl법)을 이용하여 측정하였으며, 구체적으로 상기 실시예 2-3의 조단백질 함량 분석방법을 사용하였다. 그 결과를 표 17에 나타내었다.

	대조군		분획물
	생멸치	멸치 가수분해물(APH)	한외여과		나노여과
	생멸치	멸치 가수분해물(APH)	APHU-1	APHU-2	APHN-1	APHN-2
무게	8.39 Wet wt(kg) 2.10 Dry wt(kg)	1,110.20 Dry wt(g)	130.20 Dry wt(g)	94.40 Dry wt(g)	309.99 Dry wt(g)	59.51 Dry wt(g)
수율(%)	100	52.86	6.20	4.64	14.76	2.83
단백질 함량(g)	1,493.42	830.43	95.57	71.37	244.27	ND
단백질 수율(%)	100	55.61	6.40	4.78	16.36	ND

실험결과, 생멸치 8.39kg(건조무게 2.1kg)를 고압/효소처리하여 가수분해한 후 원심분리를 통해 1.1kg의 멸치 가수분해물(APH)을 얻을 수 있었으며, 한외여과 시스템과 나노여과 시스템을 이용하여 594.1 g의 분획물(APHU-1, APHU-2, APHN-1 및 APHN-2)들을 얻을 수 있었다. 한편, 상기 멸치 가수분해물 및 분획물들의 가수분해된 단백질의 수율 역시 멸치 가수분해물 및 분획물들의 수율과 유사한 회수율을 보였다.

7-3. 한외여과 및 나노여과를 통해 얻은 분획물의 분자량 측정

상기 실시예 5에서 제조한 멸치 가수분해물(APH), 상기 실시예 7-1에서 제조한 APHU-1 분획물, APHU-2 분획물, APHN-1 분획물 및 APHN-2 분획물에서 짠맛증진물질의 존재 가능성을 알아보기 위하여 겔 투과 크로마토그래피(Gel permeation chromatography, GPC)를 실시하였다. 먼저, GPC 컬럼(YMC pack diol-60, 300 mm 20mm, I.D. S-5㎛, 6nm)을 1% 아세트산(acetic acid)로 평형화시켰다. 그 후 APHU-1 분획물, APHU-2 분획물, APHN-1 분획물 및 APHN-2 분획물을 18mg/ml의 농도로 희석한 다음 희석한 분획물 1ml을 각각 컬럼에 충진하고 유출속도 5ml/분으로 용리시켜 214nm에서 측정하여 멸치 가수분해물 및 각 분획물별 분자량 분포 및 면적을 분석하였다. 표준물질로는 비타민 B₁₂(MW 1,355.37 Da), 비타민 B₁(MW 337.27 Da) 및 L-글루타민산(MW 147.13 Da)을 사용하였다. 각 분획물 별 분자량 면적은 분자량 분포도의 가로축과 세로축 값(min mAu)을 곱하여 계산하였다. 그 결과를 도 15, 표 18 및 표 19에 나타내었다.

각 분획물별 GPC Peak 분포도
GPC peak	APH(%)	APHU-1(%)	APHU-2(%)	APHN-1(%)	APHN-2(%)
Ⅰ	5.8	24.6	5.7	6.0	0.0
Ⅱ	47.8	38.0	51.3	48.4	35.3
Ⅲ	46.4	37.4	43.0	45.4	64.7
분포	100	100	100	100	100
peak Ⅰ: 1,300 Da이상, peak Ⅱ: 250 Da~1,300 Da, peak Ⅲ: 250 Da이하

각 분획물별 GPC Peak 면적
GPC peak	APH(%)	APHU-1(%)	APHU-2(%)	APHN-1(%)	APHN-2(%)
Ⅰ	1,766.8	9,683.0	1,686.3	2,535.7	4.0
Ⅱ	14,516.2	14,961.2	15,144.0	20,306.1	4,370.2
Ⅲ	14,092.7	14,735.7	12,692.3	19,093.2	8,020.9
총 면적	30,375.6	39,379.9	29,522.6	41,935.0	12,395.05
peak Ⅰ: 1,300 Da이상, peak Ⅱ: 250 Da~1,300 Da, peak Ⅲ: 250 Da이하

실험결과, 도 15에서 보는 바와 같이 주요 Peak 3개가 확인되었으며, 멸치 가수분해물(APH)의 분자량을 기초로 하여 분획된 가수분해물의 분획물들은 1,500 Da 이하의 분자량을 가지며 서로 유사한 분자량 분포 및 패턴을 보였다.

각 분획물별 Peak 면적을 비교해 보면, APHU-1 분획물에서는 다른 분획물에 비하여 Peak Ⅰ 분획이 월등히 높게 나타났다. 막의 한계 분자량이 낮아질수록 peak Ⅰ 분획은 점차 줄어들어 APHN-2 분획물에서는 거의 사라진 것을 확인할 수 있었고, 반면에 Peak Ⅱ와 Ⅲ의 비율이 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 총 면적값을 비교해 보면 APHN-1 분획물 Peak의 면적이 가장 컸으며, APHN-2 분획물의 경우에는 Peak Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ 분획의 함량이 급격하게 줄어들어 APHN-1 분획물 면적의 30% 밖에 되지 않았다.

7-4. 한외여과 및 나노여과를 통해 얻은 분획물의 이화학적 특성 분석

상기 실시예 5에서 제조한 멸치 가수분해물(APH) 및 상기 실시예 7-1에서 제조한 APHU-1 분획물, APHU-2 분획물, APHN-1 분획물 및 APHN-2 분획물을 물에 2.5%의 농도로 용해한 후 pH 미터(pH meter, Orion 4-star Plus, Thermo Sci., USA), 염도계(Salt meter, Master-S28M, Atago, Japan) 및 당도계(Master Refractometer, Master-M, 2M and 3M, Atago, Japan)를 이용하여 용해도, pH, 수용성 고형분 함량 및 염도를 측정하였다. 또한, 상기 실시예 5의 멸치 가수분해물(APH) 및 상기 실시예 7-1에서 제조한 APHU-1 분획물, APHU-2 분획물, APHN-1 분획물 및 APHN-2 분획물을 증류수를 이용하여 1000배 희석한 후 0.2㎛ 실링지 필터(DISMIC-25JP, Advantec, Tokyo, Japan)에 여과한 용액 1ml을 검액으로 사용하였다. 상기 검액은 이온 크로마토그래피(ion chromatography, IC, Dionex ICS-900, Termo scientific, Japan) 장치를 이용하여 유출속도 1ml/분, 압력 1,200-1,400 psi 및 전류 60mA 조건하에서 분석을 실시하였다. 그 결과를 표 20에 나타내었다.

	용해도(%)	pH	수용성 고형분(Brix)	염도(%)	g/100 g of powder
	용해도(%)	pH	수용성 고형분(Brix)	염도(%)	나트륨	질소, NK	단백질, NK*6.25
APH	100	7.1	2.9	0.32	4.5	11.97	74.80
APHU-1	100	6.4	2.8	0.07	4.4	11.74	73.40
APHU-2	100	6.6	2.4	0.18	4.7	12.10	75.60
APHN-1	100	6.2	2.5	0.00	1.1	12.61	78.80
APHN-2	100	5.9	2.2	1.13	15.6	ND	ND

실험결과, pH는 APHN-2 분획물이 5.9로 가장 낮게 나타났으며, 나머지 시료는 6.2에서 7.1 범위로 시판 간장 및 멸치 가수분해물과 유사하였다. 용해도는 2.5%로 용해한 용액에 따른 것으로 용해성이 모든 시료가 매우 우수하게 확인되었다. 염도는 APHN-2 분획물이 다른 시료들보다 월등히 높게 나타났으며, 5 kDa 한외여과막을 투과한 투과액을 나노여과한 APHN-1 분획물은 완벽하게 탈염 효과가 있는 것으로 나타났다. 따라서 나노 여과 시스템은 펩타이드의 분획뿐만 아니라 탈염에도 큰 효과가 있다.

한편, 멸치 가수분해물(APH), APHU-1 분획물, APHU-2 분획물 및 APHN-1 분획물 100g 당 단백질 함량은 73~79% 정도로 매우 높게 나타내었다.

7-5. 한외여과 및 나노여과를 통해 얻은 분획물의 색 측정

상기 실시예 5에서 제조한 멸치 가수분해물(APH) 및 상기 실시예 7-1에서 제조한 APHU-1 분획물, APHU-2 분획물, APHN-1 분획물 및 APHN-2 분획물을 물에 용해시켜 2.5% 농도로 제조하였다. 그 다음 분광광계도(UV-140-02, Shimadzu Co., Japan)를 이용하여 각각 660nm 및 430nm에서 가수분해물 및 각 분획물의 탁도 및 갈변도를 측정하였다. 또한, 색차계(Colory meter, CM-3500d, Minolta, Japan)를 이용하여 가수분해물 및 각 분획물의 명도(L, lightness), 적색도(a, Redness) 및 황색도(b, Yellowness)를 측정하였다. 이때 표준 백색판은 L=89.74, a=1.24, b=-7.26을 기준으로 하였다. 그 결과를 도 16 및 표 21에 나타내었다.

	탁도(OD₆₆₀ nm)	갈변도(OD₄₃₀ nm)	색도
	탁도(OD₆₆₀ nm)	갈변도(OD₄₃₀ nm)	명도(L)	적색도(a)	황색도(b)
APH	0.025	0.537	54.77	-0.52	32.72
APHU-1	0.087	1.162	41.39	7.75	43.27
APHU-2	0.018	0.396	56.33	-1.83	25.71
APHN-1	0.029	0.665	56.17	0.34	37.88
APHN-2	0.001	0.017	67.12	-0.08	-3.83

실험결과, 탁도는 APHN-2 분획물의 값이 가장 낮았으며, 나머지 분획물들은 서로 유의적인 차이가 없었다. 갈변도의 경우에는 APHU-1 분획물의 값이 가장 낮은 APHN-2 분획물의 값보다 68 배 높은 값을 보였으며, 다른 분획물들 보다 어두운 빛을 띠었다. 색도의 명도 값은 APHN-2 분획물이 다른 분획물들에 비해 다소 높았으며, 적색도와 황색도 값은 APHU-1 분획물이 가장 높게 나타났다.

7-6. 한외여과 및 나노여과를 통해 얻은 분획물의 유리/구성 아미노산 분석

상기 실시예 5에서 제조한 멸치 가수분해물(APH) 및 상기 실시예 7-1에서 제조한 APHU-1 분획물, APHU-2 분획물, APHN-1 분획물 및 APHN-2 분획물의 유리/구성 아미노산 함량을 상기 실시예 6-1과 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과를 표 22에 나타내었다.

(단위 : mg/kg)
	APH	APHU-1	APHU-2	APHN-1	APHN-2
Asp	2,910	29,874	22,802	39,890	3,921
Glu	54,765	39,170	39,505	83,311	3,406
Asn	806	626	538.7	205	495
Ser	1,007	16,675	10,604	311	29,002
Gln	1,437	14,973	14,777	7,412	9,868
His	20,003	17,403	18,179	20,973	7,837
Gly	17,640	11,751	11,847	709	34,819
Thr	28,727	22,460	23,407	10,055	21,729
Arg	1,432	33,963	17,701	36,624	11,489
Ala	44,043	33,353	35,620	6,495	64,358
Tarurine	8,024	6,642	7,809	1,010	15,317
Gaba	4,497	-	-	-	-
Tyr	7,392	17,193	51,743	5,771	8,208
Val	53,794	28,536	29,778	26,188	18,870
Met	22,311	19,384	19,503	8,625	24,513
Trp	3,659	3,246	3,582	2,015	3,454
Phe	25,187	25,183	28,782	12,141	28,747
Ile	32,177	28,703	27,883	35,103	14,280
Leu	51,929	50,500	49,886	54,282	32,402
Lys	16,246	48,333	50,688	100,376	12,209
Hydroproline	697	493	410	680	156
Pro	7,503	7,326	8,094	2,598	10,248
Total	388,187	455,785	473,136	454,772	335,329

실험결과, 쓴맛을 내는 트립토판(tryptophane)의 함량은 APHN-1 분획물에서 가장 낮게 나타났던 반면, 감칠맛을 내는 글루타민산(glutamic acid)의 함량은 APHN-1 분획물에서 가장 높게 나타났다. 한편, 단맛을 내는 글리신(glycine), 프롤린(proline), 알라닌(alanine) 및 세린(serine)은 APHN-2 분획물에 가장 많이 함유되어 있었다.

실시예 8 : 염미증진물질의 대량생산을 위한 탈염 공정 여부

8-1. 나노여과 막을 이용한 탈염

상기 실시예 5에서 제조한 멸치 가수분해물(APH)을 한외여과 시스템(MWCO 10 kDa 및 5 kDa)을 차례로 통과시킨 다음 그 투과액(5kDa permeate)을 나노여과 시스템(MWCO 250 Da)을 이용해 탈염 공정을 수행하였다. 그 다음 나노여과 시스템으로 탈염 공정을 실시한 시료(250 Da retentate; APHN-1), 나노여과 시스템에 투과된 시료(APHN-2) 및 탈염 공정을 실시하지 않은 시료(APH, APHU-1 및 APHU-2)를 각각 동결건조한 후 이온 크로마토그래피(IC)를 이용하여 나트륨 함량을 측정하였다. 또한, 상기 동결 건조된 시료를 물에 2.5% 농도로 용해시킨 후 염 측정기기(YK-31SA, Lutron, Taiwan)을 이용하여 염의 함량을 측정하고, 이를 백분율로 환산하여 염도를 계산하였다. 그 결과를 표 23에 나타내었다.

	APH	APHU-1	APHU-2	APHN-1	APHN-2
나트륨(g/100 g)	4.5	4.4	4.7	1.1	15.6
염 함량(g/100 g)	11.4	11.2	11.9	2.8	39.6
염도(%)	12.8	2.8	7.2	0.0	45.2

실험결과, 나노여과 시스템을 통과하기 전 시료(APH, APHU-1 및 APHU-2)들의 염 함량은 100g 당 11.2~11.9 g으로 유의적인 차이가 없었다. 하지만 나노여과 시스템으로 분리한 APHN-1의 염 함량은 100g 당 2.8 g으로 염 함량이 1/5로 감소하였으며, APHN-2 시료는 100g 당 39.6 g으로 나노여과 시스템을 통과하기 전 시료들보다는 4 배, APHN-1 시료보다는 14 배 높아진 것을 확인하였다. 이는 분자량이 작은 염들이 나노 여과막(250 Da)을 통과하면서 여과막을 통과하지 못한 분획물인 APHN-1 시료에서 탈염이 이루어졌다고 볼 수 있다.

8-2. 전기투석을 이용한 탈염

상기 실시예 5에서 제조한 멸치 가수분해물(APH)이 한외여과 시스템(MWCO 5kDa)에 통과하고, 나노여과 시스템(MWCO 250 Da)을 통과하지 못한 APHN-1 액상 시료를 전기투석 장비(Micro-acilyzer S3, Astom, Japan, 표준탈염성능; 500 ml/hr)에 카트리지(AC-220, Astom, Japan)를 장착하여 전압 12V, 전류 21A, 조작 시간 40분 및 상호전류 0.22A/h의 조건에서 탈염을 실시하였다. 그 다음 이온 크로마토그래피 및 마이크로-킬달법(micro-Kjeldahl법)을 이용하여 전기투석 처리 전과 후의 시료의 나트륨 및 총 질소 함량을 측정하였다. 그 결과를 표 24에 나타내었다.

	전기투석 전	전기투석 후
전기전도도(mS/cm)	11.2	5.9
나트륨(g/100 g)	1.10	0.85
총 질소(g/100 g)	13.0	6.70

실험결과, 전기투석 전의 APHN-1 분획물의 전기전도도는 11.2 mS/cm이었지만, 전기투석 후에 시료의 전기전도도는 1/2인 5.9 mS/cm로 떨어졌다. 반면에 결과에는 기재하지 않았지만 0.5% NaCl의 전기전도도는 4.8 mS/cm에서 11.9 mS/cm로 약 2 배 증가하였다. 나트륨 함량은 전기투석 전 1.1 g/100 g이 전기투석 후에는 0.85 g/100 g으로 감소하였으며, 질소 함량은 전기투석 후 0.5% NaCl 시료에서도 질소가 검출되었다. 이 결과를 통해 탈염이 진행되면서 염 이외의 물질(질소 포함)들이 함께 제거 및 이동하였다는 것을 알 수 있었다.

결론적으로 나노여과 시스템 및 전기투석 장비를 이용하여 탈염공정을 실시한 멸치 가수분해물은 탈염공정을 실시하지 않은 멸치 가수분해물에 비하여 각각 76.67% 및 22.73% 염을 제거하였다. 그러나, 파일럿 플랜트 스케일 시스템에서 대량으로 제품을 생산하는 경우 전기투석은 가격대비 효율이 높지 않을 뿐만 아니라 질소 손실을 야기시킬 수 있으므로, 탈염공정이 꼭 필요하다면 나노여과 시스템을 활용하기로 하였다.

실시예 9 : 염미증진물질의 대량생산을 위한 탈색 및 탈취 공정 여부

9-1. 활성탄 농도에 따른 멸치 가수분해물(APH)의 탈색률 측정

상기 실시예 5에서 제조한 멸치 가수분해물(APH)을 모델 용액(monosodium L-glutamate monohydrate 1.9g/L, maltodextrin 6.375g/L 및 yeast extract 2.1g/L)에 첨가하여 2.5% 농도로 용해시킨 후 0.5, 1.0, 2.0 및 3.0%의 정제 활성탄(No. 2524, SHIN KI CHEMICAL, Korea)을 첨가하여 상온에서 5분 동안 반응시킨 후 420nm 흡광도에서 OD값을 측정하여 탈색률을 계산하였다. 상기 탈색률은 하기 실험식 8을 이용하여 백분율로 나타내었다. 대조군으로는 활성탄을 처리하지 않은 멸치 가수분해물을 사용하였다. 그 결과를 도 17 및 표 25에 나타내었다.

[실험식 8]

탈색률(%) = {(무처리 시료의 흡광도 - 처리시료의 흡광도)/(무처리 시료의 흡광도)} × 100

		활성탄 농도(%)
	대조군	0.5	1.0	2.0	3.0
OD	0.570	0.084	0.038	0.005	0.001
탈색률(%)	-	85.3	93.3	99.1	99.8

실험결과, 활성탄의 농도가 2%이상이었을 경우 탈색률이 99% 이상으로 나타나, 이 결과를 토대로 활성탄의 농도는 2%, 반응시간은 5분으로 반응조건을 결정하였다.

9-2. 멸치 가수분해물(APH)의 농도에 따른 탈색률 측정

상기 실시예 5에서 제조한 멸치 가수분해물(APH)을 모델 용액(monosodium L-glutamate monohydrate 1.9g/L, maltodextrin 6.375g/L 및 yeast extract 2.1g/L)에 첨가하여 2.5%, 5.0% 및 10.0% 농도로 각각 용해시킨 후 2%의 정제 활성탄(No. 2524, SHIN KI CHEMICAL, Korea)을 첨가하여 상온에서 5분 동안 반응시킨 후 420nm 흡광도에서 OD값을 측정하여 탈색률을 계산하였다. 상기 탈색률은 상기 실험식 7을 이용하여 백분율로 나타내었다. 대조군으로는 활성탄을 처리하지 않은 2.5%, 5.0% 및 10.0%의 멸치 가수분해물을 사용하였다. 그 결과를 도 18 및 표 26에 나타내었다.

	멸치 가수분해물의 농도(%)
	2.5		5.0		10.0
	Un- treatment	Treatment	Un- treatment	Treatment	Un- treatment	Treatment
OD	0.570	0.005	1.124	0.057	2.312	0.393
탈색률(%)	99.1		94.9		83.0

실험결과, 멸치 가수분해물(APH)의 농도가 2.5%인 경우에 탈색률이 99.1%로 가장 높았으며, 5.0%인 경우에는 94.9%로 다소 낮아졌지만 여전히 90% 이상의 탈색률을 나타내었다. 하지만 멸치 가수분해물(APH)의 농도가 10%인 경우에는 탈색률이 83.0%로 낮아졌고, 도 18을 보면 2.5%와 5.0% 때와 비교했을 때 육안으로도 노란빛을 띠는 것을 확인하였다.

9-3. 활성탄의 반응 온도에 따른 탈색률 측정

상기 실시예 5에서 제조한 멸치 가수분해물(APH)을 모델 용액(monosodium L-glutamate monohydrate 1.9g/L, maltodextrin 6.375g/L 및 yeast extract 2.1g/L)에 첨가하여 2.5% 농도로 각각 용해시킨 후 2%의 정제 활성탄(No. 2524, SHIN KI CHEMICAL, Korea)을 첨가하여 상온, 40℃ 또는 60℃에서 5분 동안 반응시킨 후 420nm 흡광도에서 OD값을 측정하여 탈색률을 계산하였다. 상기 탈색률은 상기 실험식 7을 이용하여 백분율로 나타내었다. 대조군으로는 활성탄을 처리하지 않은 멸치 가수분해물을 사용하였다. 그 결과를 도 19 및 표 27에 나타내었다.

	상온		40℃		60℃
	Un- treatment	Treatment	Un- treatment	Treatment	Un- treatment	Treatment
OD	0.570	0.005	0.570	0.005	0.570	0.005
탈색률(%)	99.1		99.1		99.1

실험결과, 상온, 40℃ 및 60℃에서 활성탄을 반응시킨 경우 탈색률이 모두 99.1%로 나타나 활성탄을 처리할 때 열처리를 가하지 않아도 높은 탈색효과가 있다는 사실을 확인하였다.

9-4. 활성탄 처리에 따른 멸치 가수분해물(APH), 감압농축한 멸치 가수분해물, 및 한외여과 및 나노여과를 통해 얻은 분획물의 탈색률 측정

상기 실시예 5에서 제조한 멸치 가수분해물(APH), 감압농축한 멸치 가수분해물(Evaporation APH), 상기 실시예 7-1에서 한외여과하여 얻은 분획물(MW < 5kD) 및 나노여과하여 얻은 APHN-1을 모델 용액(monosodium L-glutamate monohydrate 1.9g/L, maltodextrin 6.375g/L 및 yeast extract 2.1g/L)에 첨가하여 2.5% 농도로 각각 용해시킨 후 2%의 정제 활성탄(No. 2524, SHIN KI CHEMICAL, Korea)을 첨가하여 상온에서 5분 동안 반응시킨 후 420nm 흡광도에서 OD값을 측정하여 탈색률을 계산하였다. 상기 탈색률은 상기 실험식 7을 이용하여 백분율로 나타내었다. 대조군으로는 활성탄을 처리하지 않은 멸치 가수분해물(APH), 감압농축한 멸치 가수분해물(Evaporation APH), 한외여과하여 얻은 분획물(MW<5 kD) 및 나노여과하여 얻은 APHN-1(250 Da≤MW<5 kDa)을 사용하였다. 그 결과를 도 20 및 표 28에 나타내었다.

	APH		Evaporated APH		MW<5 kDa		APHN-1
	Un- treatment	Treatment	Un- treatment	Treatment	Un- treatment	Treatment	Un- treatment	Treatment
OD	0.562	0.025	0.589	0.007	0.411	0.013	0.715	0.016
탈색률(%)	95.6		98.8		96.8		97.8

실험결과, 모든 시료들의 탈색률은 95% 이상으로 높은 탈색률을 나타내었다. 구체적으로, 감압농축한 멸치 가수분해물(Evaporated APH)의 탈색률이 98.8%로 가장 높았으며, 다음으로 나노여과하여 얻은 APHN-1 분획물(97.8%), 한외여과하여 얻은 분자량이 5 kDa 미만인 분획물(96.8%) 및 멸치 가수분해물(95.6%) 순으로 확인되었다.

9-5. 활성탄 처리에 따른 멸치 가수분해물(APH), 감압농축한 멸치 가수분해물, 및 한외여과 및 나노여과를 통해 얻은 분획물의 휘발성 향기성분 측정

상기 실시예 5에서 제조한 멸치 가수분해물(APH), 감압농축한 멸치 가수분해물(Evaporation APH), 상기 실시예 7-1에서 한외여과하여 얻은 분획물(MW<5kD) 및 나노여과하여 얻은 APHN-1 분획물(250 Da≤MW<5 kDa) 5ml에 에틸 아세테이트(ethyl acetate, E.A)와 NaCl 1g을 각각 넣고 5분 동안 가열하여 추출하였다. 그 다음 상기 각 시료 추출액에 피리딘(pyridine, Junsei) 50 ㎕과 트리메틸-실레인(trimethyl-silane, Sigma-aldrich, USA) 50 ㎕를 넣고 75℃에서 75분 동안 반응시켰다. 그 후 가스 크로마토그래프 질량분석계(gas chromatograph-mass spectrometer, GC-MS, Shimadzu GC-2010 plus with GCCMS-2010 SE)를 이용하여 각 시료별 탈취 여부를 확인하였다. GC-MS 분석조건으로 컬럼은 Rtx-5MS(30m, 0.25 film thicknessl, 0.25mm i.d.; Restek, USA)을 사용하였고, 50℃에서 15분간 유지한 후 9℃/분의 속도로 280℃까지 승온한 다음 10분 동안 유지하였다. 인젝터(injector) 온도는 275℃, 운반기체는 헬륨(helium), 유속 1 ml/분으로 하였다. 각 성분의 질량분석은 분자량 50~500까지 TIC 모드로 각 시료별 휘발성 성분 함량을 확인하였다. 머무름 시간(Rt)에 따라 검출되는 휘발성 성분 목록은 하기 표 29에 나타내었다. 대조군으로는 활성탄을 처리하지 않은 멸치 가수분해물(APH), 감압농축한 멸치 가수분해물(Evaporation APH), 한외여과하여 얻은 분획물(MW<5 kD) 및 나노여과하여 얻은 APHN-1 분획물(250 Da≤MW<5 kDa)을 사용하였다. 그 결과를 도 21, 도 22, 표 30 및 표 31에 나타내었다.

Rt (min)	화합물명	Rt (min)	화합물명
12.810	N,N-Diethylformamide	27.250	Mandelic acid
14.320	Dihydropyrazole	27.380	Phenylacetamide
14.650	Alkylthiols (unknown 1)	28.040	Acetophenone der.
16.520	Alkanone oxime (unknown 2)	29.005	Unknown 4
17.750	Furan-2-yl-methanol	30.250	Unknown 5
17.931	N,N-Diethylacetamide	33.145	Cyclic dipeptide 1
18.840	N-2-Ethyl-butylamine	34.255	3-Isobutyl hexa hydropyrrolo [1,2-a]pyrazine-1,4-dione (Isomer 1)
20.350	Alkanediol (unknown 3)	34.450	3-Isobuty lhexa hydropyrrolo [1,2-a]pyrazine-1,4-dione (Isomer 2)
20.900	Hexanoic acid	34.655	Proline cyclic anhydride
22.095	Alkylamine 1 (Pentyl, ?)	34.715	Hexadecanoic acid
22.295	Alkylamine 2 (Hexyl, ?)	36.385	Unknown 7
23.250	Sarcosine	37.950	Cyclic dipeptide 2
24.820	Phenylacetic acid	38.865	Cyclic dipeptide 3
25.251	Octanoic acid	39.110	Cyclic dipeptide 4
26.100	Indanedione

구 분	각 시료별 휘발성 성분 목록
component-1	N-2-Ethyl-butylamine
component-2	Alkylamine 1 (Pentyl, ?)
component-3	Alkylamine 2 (Hexyl, ?)
component-4	Phenylacetic acid
component-5	Phenylacetamide
component-6	3-Isobutylhexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione (Isomer 1)
component-7	3-Isobutylhexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione (Isomer 2)
component-8	Proline cyclic anhydride
component-9	Cyclic dipeptide 2
component-10	Cyclic dipeptide 3
component-11	Cyclic dipeptide 4

TR : Trace level
구 분	APH 활성탄 처리 전		APH 활성탄 처리 후		Evaporated APH 활성탄 처리 전		Evaporated APH 활성탄 처리 후
구 분	R.T	Area	R.T	Area	R.T	Area	R.T	Area
Component-1	18.815	185679	18.827	189027	18.832	183236	18.820	229186
Component-2	22.095	TR	22.091	TR	22.081	151840	22.109	TR
Component-3	22.295	TR	22.342	TR	22.332	489434	22.341	312120
Component-4	24.841	TR	24.820	TR	24.817	128696	24.817	TR
Component-5	27.380	88934	27.380	TR	27.382	182737	27.382	TR
Component-6	34.267	153530	34.267	TR	34.272	191029	34.272	TR
Component-7	34.459	304588	34.459	TR	34.461	495932	34.461	TR
Component-8	34.638	125034	34.638	TR	34.640	71671	34.640	TR
Component-9	37.949	45215	37.949	TR	37.950	74656	37.950	TR
Component-10	38.546	232975	38.546	TR	38.860	92981	38.860	TR
Component-11	39.111	141877	39.111	TR	39.108	188337	39.108	TR

구 분	MW < 5 kD 활성탄 처리 전		MW < 5 kD 활성탄 처리 후		APHN-1 활성탄 처리 전		APHN-1 활성탄 처리 후
구 분	R.T	Area	R.T	Area	R.T	Area	R.T	Area
Component-1	18.840	194309	18.832	193190	18.826	199260	18.767	176422
Component-2	22.051	250122	22.051	TR	22.143	456162	22.165	282625
Component-3	22.300	171609	22.300	TR	22.285	176540	22.285	TR
Component-4	24.817	69261	24.814	TR	24.820	TR	24.820	TR
Component-5	27.383	86305	27.383	TR	27.380	TR	27.380	TR
Component-6	34.269	137250	34.452	23166	34.264	47911	34.264	TR
Component-7	34.458	412044	34.641	26529	34.450	TR	34.450	TR
Component-8	34.636	96044	34.636	TR	34.638	33948	34.638	TR
Component-9	37.951	85574	37.951	TR	37.951	44122	37.951	TR
Component-10	38.856	114935	38.856	TR	38.865	TR	38.865	TR
Component-11	39.110	108039	39.110	TR	39.105	46561	39.105	TR

실험결과, 활성탄 처리에 의하여 휘발성 성분의 일부(amide, carboxylic acid, maltol, furan-2-yl-methanol) 등은 활성탄 처리에 의하여 효과적으로 제거되는 것을 확인할 수 있었으며, 휘발성이 미확인된 환식 디펩티드(cyclic dipeptide) 역시 활성탄 처리에 의하여 대부분 제거되는 것을 알 수 있었다. 구체적으로, 각 시료로부터 대량 30종 내외의 물질을 확인할 수 있었으며, 활성탄 처리한 경우 휘발성이 예상되는 성분으로서 제거된 물질은 페닐아세트산(phenylacetic acid) 및 페닐아세타미드(phenylacetamide) 등이며, 기타 소량의 알킬아민(alkylamine)류의 농도 변화도 관찰되었다. 한편, 휘발성 여부가 불명한 물질 중, 머무름 시간(Rt)이 30~40분에 해당되는 물질은 활성탄을 처리하지 않은 시료에 다량 존재하였으나, 활성탄을 처리한 시료에서 대부분 제거되었다.

9-6. 활성탄 처리에 따른 멸치 가수분해물(APH), 감압농축한 멸치 가수분해물, 및 한외여과 및 나노여과를 통해 얻은 분획물의 총 단백질 함량 측정

상기 실시예 5의 멸치 가수분해물(APH)을 감압농축한 시료(Evaporation APH, E-APH), 멸치 가수분해물(APH)을 감압농축한 후 여과한 시료(E.F-APH) 및 멸치 가수분해물(APH)을 감압농축 및 여과한 후 2%의 활성탄을 처리한 시료(E.F.A-APH)의 총 단백질 함량을 마이크로 킬달법(micro-Kjeldahl법)으로 측정하였다. 대조군으로는 저염 멸치 가수분해물(APH)을 사용하였다. 그 결과를 표 32에 나타내었다.

	대조군(APH)	E-APH	E.F-APH	E.F.A-APH
단백질(g/100 g)	74.80	72.80	74.80	63.20

실험결과, 감압농축한 멸치 가수분해물(E-APH) 및 감압농축한 후 여과한 멸치 가수분해물(E.F-APH)은 대조군(APH)과 비교하여 단백질 손실이 거의 없는 것으로 나타났으며, 활성탄 처리한 가수분해물(E.F.A-APH)은 소량의 단백질 손실이 있는 것으로 나타났다.

9-7. 활성탄 처리에 따른 APHN-1 분획물의 염미증진율 측정

상기 실시예 7-1에서 분획한 APHN-1 분획물을 45mM의 염 농도를 가지는 모델 용액(monosodium L-glutamate monohydrate 1.9g/L, maltodextrin 6.375g/L 및 yeast extract 2.1g/L)에 첨가하여 0.1, 0.3, 0.5 및 1%의 농도로 제조한 후 활성탄 처리에 따른 짠맛의 강도를 측정하고, 하기 실험식 9를 이용하여 염미 증진율을 백분율로 계산하였다. 표준시료는 상기 모델용액을 사용하였다. 그 결과를 도 23에 나타내었다.

[실험식 9]

염미증진률(%) = {(짠맛을 느낀 분획물의 농도 - 실제 분획물의 농도)/(실제 분획물의 농도)} × 100

실험결과, 활성탄 처리 후 APHN-1 분획물은 활성탄 처리 전 APHN-1 분획물에 비하여 짠맛의 강도가 감소되었으나, 농도에 비례하게 짠맛의 강도가 느껴지는 것을 확인하였다. 구체적으로, 활성탄 처리 전 APHN-1 분획물을 1% 첨가하였을 경우 49.63 mM, 0.5%인 경우 48.40 mM, 0.3%인 경우 48.81 mM 그리고 0.1%인 경우 45.19 mM의 강도로 느꼈다. 이 값을 염미 증진률로 환산하면 1%는 10.29%, 0.5%는 경우 7.56%, 0.3%는 8.47%, 그리고 0.1%는 0.42%이다. 활성탄 처리 후 APHN-2 분획물을 1% 첨가하였을 경우 48.60 mM, 0.5%인 경우 46.79 mM, 0.3%인 경우 45.48 mM 그리고 0.1%인 경우 44.94 mM의 강도로 느꼈다. 이 값을 염미 증진률로 환산하면 1%는 8.00%, 0.5%는 경우 3.98%, 0.3%는 1.07%, 그리고 0.1%는 0.13%이다.

9-7. 멸치 가수분해물을 한외여과한 분획물의 활성탄 처리에 따른 향미 관능평가

상기 실시예 7-1에서 한외여과하여 얻은 5 kDa 이하의 분획물(MW5 kDa)을 모델 용액(monosodium L-glutamate monohydrate 1.9g/L, maltodextrin 6.375g/L 및 yeast extract 2.1g/L)에 첨가하여 1% 및 2%로 제조하였다. 그 다음 상기 1% 및 2% 분획물에 각각 2% 활성탄을 처리한 후 5분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 분획물은 원심분리기를 이용하여 상층액을 회수한 후 0.45 ㎛ 멤브레인 필터를 이용하여 감압여과하였다. 기준시료는 0.1% NaCl 용액을 사용하였고, 표준시료는 상기 모델용액을 사용하였다. 향미 관능평가에 사용된 분획물에는 난수번호(3자릿 수)를 부여한 뒤 패널들에게 제공하였다(표 33).

평가항목은 색, 냄새, 맛, 기호도 면에서 평가하도록 하였다. 구체적으로 색에서는 노란빛의 강도와 샘플의 투명도를, 냄새에서는 전체적인 강도와 바닷물 냄새, 마른 멸치 냄새, 해조류 냄새를, 맛에서는 전체적인 강도와 생선비린 맛, 쓴맛, 짠맛, 마른멸치 맛을, 기호도에서는 외관과 냄새, 맛에 대하여 평가하도록 하였다. 평가는 5점 천도로 진행하였다. 각 점수는 중복이 가능하도록 하였으며, 색, 냄새 및 맛에 대해서는 5점이 매우 강함, 1점이 매우 약함으로 평가하도록 하였고, 기호도에 대해서는 5점이 매우 좋음, 1점이 매우 싫음으로 평가하도록 하였다. 그 결과를 도 24에 나타내었다.

	1%		2%
	활성탄 처리 전	활성탄 처리 후	활성탄 처리 전	활성탄 처리 후
난수 번호	# 186	# 216	# 543	# 416

먼저, 색, 냄새 및 맛에 대한 강도평가 결과 투명도는 1% 분획물 활성탄 처리 후 시료(# 216) > 2% 분획물 활성탄 처리 후 시료(# 416) > 1% 분획물 활성탄 처리 전 시료(# 186) > 2% 분획물 활성탄 처리 전 시료(# 543) 순서로 나왔으며, 노란빛의 강도는 2% 분획물 활성탄 처리 전 시료(# 543)가 다른 시료들에 비해 현저하게 높았고, 그 다음으로 1% 분획물 활성탄 처리 전 시료(# 186), 나머지 활성탄 처리 후의 시료(# 216 및 # 416) 비슷한 강도로 나타났다. 쓴맛은 2% 분획물 활성탄 처리 전 시료(# 543)가 가장 높았으며, 나머지 3개의 시료(# 186, # 216 및 # 416)들은 비슷한 값을 보이므로, 활성탄을 이용하였을 경우 패널들이 느끼는 쓴맛의 강도가 현저히 감소한 것을 알 수 있었다. 짠맛의 경우에는 오히려 2% 분획물 활성탄 후 시료(# 416)가 2% 분획물 활성탄 처리 전 시료(# 543)보다 강하게 느꼈고, 다음으로는 1% 분획물 활성탄 전 시료(# 186) > 1% 분획물 활성탄 후 시료(# 216) 순서로 짜게 느끼는 것을 확인 할 수 있었다.

전체적인 기호도(overall acceptance)는 2% 분획물 활성탄 처리 후 시료(# 416)가 가장 높았으며, 나머지 3 개의 시료들은 비슷한 값을 나타냈다. 구체적으로, 외형은 1% 분획물 활성탄 처리 전 시료(# 186)가 가장 높았으며, 그 다음은 2% 분획물 활성탄 처리 후 시료(# 416) > 1% 분획물 활성탄 처리 후 시료(# 216) > 2% 분획물 활성탄 처리 전 시료(# 543)순으로 나타났다. 색상은 1% 분획물 활성탄 처리 전 시료(# 186)가 가장 높았고, 1% 분획물 활성탄 처리 후 시료(# 216)와 2% 분획물 활성탄 처리 후 시료(# 416)가 비슷한 값을 나타내었으며, 2% 분획물 활성탄 처리 전 시료(# 543)가 가장 낮은 값을 나타내었다. 향은 1% 분획물 활성탄 처리 후 시료(# 216) > 2% 분획물 활성탄 처리 후 시료(# 416) > 1% 분획물 활성탄 처리 전 시료(# 186) > 2% 분획물 활성탄 처리 전 시료(# 543) 순서로 나타났고, 맛은 4 개 시료 모두 비슷하게 나타났다.

결론적으로, 분획물에 활성탄을 처리 할 경우 활성탄의 농도가 증가할수록 노란빛, 향, 및 맛에 대한 강도들이 활성탄 처리 전 보다 감소하는 것을 확인 할 수 있었고, 활성탄을 이용한 탈색 및 탈취가 매우 효과적이라는 사실을 알 수 있었다. 그러나 전체적인 외관(overall appearance)과 색은 활성탄 처리를 하지 않은 1% 분획물(# 186)이 가장 높았다.

따라서 천연 조미료를 개발할 때 본 발명에서 개발한 소재의 농도만 잘 조절한다면 탈색 및 탈취 공정 없이도 제품을 생산할 수 있으리라 판단된다.

실시예 10 : 염미증진물질의 제형화를 위한 건조조건 확립

상기 실시예 5에서 제조한 멸치 가수분해물(APH)을 한외여과막(MWCO 10kDa)에 여과하여 투과된 투과액(10 kDa permeate) 375ml을 유동층 분무건조기(SD-1000, EYELA, Japan)를 이용하여 하기 표 34의 조건으로 분무건조 하였다. 그 다음 상기 분무건조한 시료의 수분함량 및 입자 사이즈를 확인하였다. 또한, 상기 분무건조 하기 전 시료에 존재하는 고형물(18.38g/375ml) 대비 건조한 분획물의 무게를 백분율로 계산하여 수율을 나타내었으며, 육안으로 건조된 시료의 색상을 확인하였다. 대조군으로는 상기 투과액(10 kDa permeate)을 파우치에 담아 70℃에서 24시간 동안 동결시킨 후 동결건조기(Freeze dryer, PYTF20R, 일신바이오베이스, Korea)를 이용하여 동결건조시킨 투과액(10 kDa permeate)을 사용하였다. 그 결과를 도 25, 도 26 및 표 35에 나타내었다.

	Sample 1	Sample 2	Sample 3	Sample 4
유입온도(℃)	180	180	200	200
분사압력(kPa)	180	240	240	180
분출속도(m³/min)	0.50	0.50	0.50	0.50
주입속도(mL/h)	500	500	500	500

	분무건조				동결건조
	Sample 1	Sample 2	Sample 3	Sample 4	Sample 5 (대조군)
회수량(g/375 mL)	6.15	4.10	4.72	5.09	16.96
회수율 (%)	34.01	22.31	25.61	27.70	92.30
수분함량 (%)	9.11±1.05	9.33±1.22	9.66±2.52	9.44±1.30	4.86±0.23
입자 사이즈(㎛²)	28.06±14.39	26.39±12.58	28.35±17.61	23.52±13.72	27.90±14.30

실험결과, 분무조건에 따라 건조된 투과액(sample 1~4)의 수율은 각각 34.01%, 22.31%, 25.61% 및 27.70%였으며, 그 중 sample 1의 조건으로 분무건조한 투과액의 수율이 가장 높게 나타냈으며, 동결건조한 투과액의 수율은 92.30%로 분무건조한 투과액에 비하여 월등히 높은 값을 나타내었다. 반면, 수분함량은 분무건조한 투과액이 동결건조한 투과액에 비하여 약 2배 정도 높은 값을 나타내었다.

한편, 분무건조 및 동결건조한 투과액의 입자 사이즈는 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났으며, 분무건조한 투과액의 색상은 동결건조한 투과액에 비하여 밝은 것을 확인되었다.

실시예 11 : 최적화된 공정을 이용하여 제조된 멸치 가수분해물 ( APH ) 및 분획물의 염미증진제로서의 가능성 탐색 및 규명

11-1. 최적화된 공정을 이용하여 멸치 가수분해물 및 이의 분획물 제조

3월 초에 제주도 해역에서 어획되어 -20℃에서 동결 보관된 동해수산(기장)의 멸치를 구입하였다. 상기 구입한 멸치를 상온에서 해동한 후 10 내지 15℃의 물에 1시간 동안 침지 및 수세하여 염분 및 불순물을 제거하였다. 그 다음 상기 멸치에 멸치의 중량의 2배의 물을 첨가하고, 가정용 믹서기를 이용하여 2분 동안 2회 분쇄한 후 호모게나이저를 이용하여 16,000 rpm으로 5분 동안 2차 분쇄하여 멸치 분쇄물을 제조하였다. 그 다음 상기 분쇄한 멸치 분말에 복합효소(알칼라아제 : 플라보르자임 = 1 : 5)를 멸치 분쇄물 중량의 2% 첨가하여 2kg 단위로 파우치에 넣어 밀봉하였다. 그 후 고압시스템((주)이노쉘코리아, korea)을 이용하여 75MPa의 압력 및 50℃의 온도에서 16시간 동안 고압 처리한 다음 80℃에서 20분 동안 열처리하여 효소를 불활성화 하였다. 그 다음 4℃에서 24시간 동안 냉각숙성한 후 연속식 원심분리기(tubular centrifuge, A-V10675G, TOmoe engineering, Japan)를 이용하여 17,000rpm에서 원심분리하여 고화되어 떠있는 지방을 제거하여 멸치 가수분해물(APH)을 수득하였다. 그 다음 상기 멸치 가수분해물(APH)을 한외여과막(MWCO 10 kDa 및 5 kDa) 및 나노여과막(MWCO 250 Da)에 단계적으로 여과하여 APHU-1 분획물, APHU-2 분획물, APHN-1 분획물 및 APHN-2 분획물을 수득한 후 유입 온도 180, 분사압력 180 kPa, 분출속도 0.5 m³/분 및 주입속도 500 ml/시간으로 분무건조하였다.

11-2. 멸치 가수분해물 및 이의 분획물의 L-아르기닌(L-arginine) 및 아르기닐 디펩타이드(arginyl dipeptides) 함량 측정

상기 실시예 11-1에서 제조한 멸치 가수분해물(APH), APHU-1 분획물, APHU-2 분획물, APHN-1 분획물 및 APHN-2 분획물을 증류수(SIMENS LAbostar 7 TWF-UV)에 500 ppm의 농도로 용해시킨 후, 5㎕를 액체 크로마토그래프-질량 분석기(Liquid chromatograph-mass spectrometer)에 적용하여 하기 표 36의 조건으로 L-아르기닌(L-arginine) 및 아르기닐 디펩타이드(arginyl dipeptides) 함량을 측정하였다. 상기 아르기닌(L-arginine) 및 아르기닐 디펩타이드(arginyl dipeptides)의 함량은 하기 표 37의 디펩타이드 표준품을 1, 2, 4, 5, 6, 8 및 10ppm의 농도로 희석한 용액을 이용하여 정량 및 정성분석을 수행하였다. 각 표준품에 대한 머무름 시간(Rt)와 면적(area)은 하기 표 38에 나타냈으며, 표준 검량선(R²)은 하기 표 39에 나타내었다. 그 결과를 표 40에 나타내었다.

	분석조건
Column	Agilent Eclipse XDB-C8(5 μm 4.6150 mm)
Column temperature	25℃
Mobile phase	증류수(0.1% F.A):ACN(0.1% F.A)(95:5) 15 min Isocratic
Detector	UV/Visible(210 nm)
Flow rate	0.2 mL/min
Injection volume	5 μL
Needle voltage	3500 volts
Capillary voltage	80 volts
Drying gas temp	350℃
Drying gas pressure(nitrogen)	30 psi
Nebulizer gas pressure(nitrogen)	40 psi
Scan range	90~600

구 분	디펩타이드	분자량	제조사
STD-1	H-Arg-Tyr-OH acetate salt	337.38	BACHEM
STD-2	H-Glu(His-OH)-OH	284.27
STD-3	H-Arg-Glu-OH	303.32
STD-4	H-Glu(Gln-OH)-OH	275.26
STD-5	H-Glu(Gly-OH)-OH	204.18
STD-6	H-Arg-Ala-OH acetate	245.28
STD-7	H-Arg-Asp-OH	289.29
STD-8	H-Arg-Gly-NH2Sulfate	328.35
STD-9	H-Glu(Glu-OH)-OH	276.25

디펩타이드	머무름 시간(Retention time,Rt)	면적
H-Arg-Tyr-OH acetate salt	8.631	7,024,000
H-Glu(His-OH)-OH	6.605	185,824
H-Arg-Glu-OH	6.441	2,987,000
H-Glu(Gln-OH)-OH	7.092	1,257,000
H-Glu(Gly-OH)-OH	7.127	254,204
H-Arg-Ala-OH acetate	6.413	2,645,000
H-Arg-Asp-OH	6.372	2,483,000
H-Arg-Gly-NH2Sulfate	6.140	1,496,000
H-Glu(Glu-OH)-OH	7.817	1,406,000

디펩타이드	linear regression	표준 검량선(R²)
H-Arg-Try-OH acetate salt(RY)	y=14755x	0.9864
H-Glu(His-OH)-OH(EH)	y=3467.2x	0.9689
H-Arg-Glu-OH(RE)	y=60022x	0.9795
H-Glu(Gln-OH)-OH(EQ)	y=26721x	0.9781
H-Glu(Gly-OH)-OH(EG)	y=5609.8x	0.933
H-Arg-Ala-OH acetate(RA)	y=53458x	0.9784
H-Arg-Asp-OH(RD)	y=50766x	0.9837
H-Arg-Gly-NH2Sulfate(RG)	y=24432x	0.8255
H-Glu(Glu-OH)-OH(EE)	y=29484x	0.9635

Compound	Concentration (mol/L)
Compound	APH	APHU-1	APHU-2	APHN-1	APHN-2
STD-1(RY)	0	0	0	0	0
STD-2(EH)	0.80	1.10	0.79	9.90	0
STD-3(RE/ER)	0.75	0.69	1.40	4.01	0
STD-4(EQ)	4.64	4.59	6.14	12.42	0
STD-5(EG)	0.26	3.24	2.30	6.54	0
STD-6(RA/AR)	0.06	0	0.61	1.28	0
STD-7(RD)	0.43	0.23	0.35	1.51	0
STD-8(RG/GR)	2.98	1.62	3.54	6.41	0
STD-9(EE)	1.70	2.46	2.08	5.42	0

실험결과, 멸치 가수분해물(APH), APHU-1 분획물, APHU-2 분획물 및 APHN-1 분획물에서는 표준품 9가지 중 STD-1(RY, Arg-Tyr)을 제외한 8가지의 디펩타이드가 검출되었으며, 나노여과하여 수득한 APHN-1 분획물에서 가장 많은 디펩타이드가 검출되었다.

11-3. 한외여과 및 나노여과를 통해 얻어진 분획물들의 관능평가

상기 실시예 11-1에서 제조한 멸치 가수분해물(APH)을 10 kDa 분자량 컷-오프값을 가지는 한외여과막에 투과시킨 분획물(10 kDa permeate), 및 상기 한외여과막에 투과시킨 분획물을 5 kDa 분자량 컷-오프값을 가지는 한외여과막에 투과시킨 후 250 Da 분자량 컷-오프값을 가지는 나노여과막에 여과하여 투과되지 못한 분획물(APHN-1)을 수득하였다.

그 다음 상기 한외여과막에 투과시킨 분획물(10 kDa permeate)과 나노여과막을 통해 수득한 APHN-1 분획물의 이미와 이취의 영향을 보완할 수 있도록 모델 용액(monosodium L-glutamate monohydrate 1.9g/L, maltodextrin 6.375g/L 및 yeast extract 2.1g/L)에 염(NaCl)을 첨가하여 45 mM의 농도로 제조한 표준시료에 상기 한외여과막에 투과시킨 분획물(10 kDa permeate)과 나노여과막을 통해 수득한 APHN-1 분획물을 첨가하여 0.1, 0.3, 0.5 및 1.0%의 농도로 제조한 후 짠맛의 강도를 측정하고, 상기 실험식 9를 이용하여 염미 증진율을 백분율로 계산하였다. 강도평가를 위한 표준시료 및 각 시료는 하기 표 41 및 표 42의 함량에 따라 제조된 것을 사용하였다. 그 결과를 도 27에 나타내었다.

(g/L)
Ingredients	표준시료	SE solution
Ingredients	표준시료	10 kDa permate	APHN-1
monosodium L-glutamate monohydrate	1.900	1.900	1.900
Maltodextrin	6.375	6.375	6.375
Yeast extract	2.100	2.100	2.100
NaCl	2.630	-	-
Salt Enhancer(SE, 가수분해물)	-	18.300	91.600

(ml)
	각 분획물별 용액
	0.1%		0.3%		0.5%		1.0%
	표준시료	SE Soln.	표준시료	SE Soln.	표준시료	SE Soln.	표준시료	SE Soln.
10 kDa permate	935.76	64.24	87.29	192.71	678.82	321.18	357.64	642.36
APHN-1	988.76	11.24	966.29	33.71	943.82	56.18	887.64	112.36

실험결과, 짠맛증진 효과를 나타낸다고 알려진 디펩타이드의 함량이 가장 많이 검출된 APHN-1 분획물 보다 10 kDa permate 분획물에서 염미증진효과가 더 높게 나타났다.

구체적으로, 소금농도 45 mM의 표준시료에서 0.1% 10 kDa permate 분획물은 53.13 mM, 0.3% 10 kDa permate 분획물은 55.21 mM, 0.5% 10 kDa permate 분획물은 51.23 mM, 1% 10 kDa permate 분획물은 59.83 mM로 평가되었으며, 이를 염미 증진률로 환산하면, 0.1%는 18.07%, 0.3%는 22.69%, 0.5%는 13.84%, 1%는 32.96%로 나타났다.

또한, 0.1% APHN-1 분획물은 45.19 mM, 0.3% APHN-1 분획물은 48.81 mM, 0.5% APHN-1 분획물은 48.40 mM, 1% APHN-1 분획물은 49.63 mM로 평가되었으며, 이를 염미 증진률로 환산하면, 0.1%는 0.42%, 0.3%는 8.47%, 0.5%는 7.56%, 1%는 10.29%로 나타났다.

상기 결과로부터 10 kDa permate 분획물 및 APHN-1 분획물은 짠맛을 증진시키는 효과가 있는 것으로 판단되며, 향후 염미증진물질로서의 가능성이 있는 것으로 보인다. 특히, 나노여과시스템으로 분획한 APHN-1 분획물을 1% 첨가하였을 경우 염미 증진률이 10.29%인 것을 감안하여 2%의 APHN-1 분획물을 사용하는 경우 나트륨을 약 20% 저감할 수 있을 것으로 예상된다.

실시예 12 : 최적화된 공정의 경제성 분석

상기 실시예 11-1에서 제조한 멸치 가수분해물(APH)과 한외여과 및 나노여과 시스템으로 여과하여 수득한 APHN-1 분획물의 생산효율 및 생산에 소요되는 평균비용을 계산하여 경제성을 분석하였다. 그 결과를 표 43 및 표 44에 나타내었다.

Materials	생멸치	APH	APHN-1
무게	8.39 wet weight(kg)	1.11 FD weight(kg)	0.91 FD weight(kg)
총 질소 함량(g)	239.6	132.87	104.83
수율(%)(wet basis)	100	13.23	10.85
질소회수율(%)(dry basis)	100	55.61	43.75

Category	Cost(원) per unit	Cost(원)
Enzyme	66,333/kg	13,267
Anchovy(10 kg) Transportation Washing & Soaking Electricity Water Labor Mincing & Packaging Electricity Pre-packaging Water Labor	1500/kg 20/kg 185/kWh 125/L 1300/h 185/kWh 35/kg 125/L 1300/h	15,000 200 481 2,500 2,600 204 1,050 3,750 7,800
Hydrolysis at 50 under high pressure Electricity Water	185/kWh 125/L	66,600 1,875
Termination of hydrolysis Electricity Water Labor	185/kWh 125/L 1300/h	7,400 3,750 1,300
Cooling & Aging Electricity	185/kWh	111
Centrifugation Electricity Labor	185/kWh 1300/h	342 1,300
Membrane separation(UF) Water Electricity	125/L 185/kWh	1,850 139
Spray Drying Electricity	185/kWh	34,188
Packaging	70/kg	63
Waste-treatment credit	41/kg	328
Total		166,098

실험결과, 천연 염미 증진제 kg당 단가는 약 166,098원으로 평가되었다. 생멸치 10kg을 기준으로 100% 소재에 대한 단가로서 대량생산(1일 멸치 300kg 처리- 고압시스템 용량고려), 연속생산(월 생산량에 따른 단가 조정), 분말화 공정에서 부형제를 활용한 다양한 짠맛 증진, 가격에 큰 영향을 미치는 효소 사용 억제, 수율을 증가시키기 위한 물의 사용 억제, 에너지 관리 효율 증대 등을 고려하여 실제 공정에 적용한다면, 생멸치 kg당 2,000~5,000원 정도의 제품의 생산이 가능하여 충분한 경쟁력이 있다고 판단되었다.

Claims

어패류의 이물질을 제거하고, 분쇄하는 전처리 단계(S100); 상기 전처리 단계(S100)에서 얻은 어패류 분쇄물에 어패류 분쇄물의 총 중량에 대하여 1 내지 3중량%의 복합효소를 첨가한 후 40 내지 60℃ 및 65 내지 80 MPa의 조건으로 12 내지 20시간 동안 고압효소처리하여 가수분해하는 가공 단계(S200); 상기 가공 단계(S200)에서 가수분해된 어패류 분쇄물의 효소를 불활성화 시키는 효소 불활성화 단계(S300); 상기 효소 불활성화 단계(S300)에서 효소의 활성이 중지된 어패류 가수분해물을 냉각숙성하는 냉각숙성 단계(S400); 상기 냉각숙성(S400)단계에서 냉각숙성된 어패류 가수분해물의 유지를 제거하는 유지제거 단계(S500); 상기 유지 제거 단계(S500)에서 유지가 제거된 어패류 가수분해물로부터 염미증진물질을 분리 및 정제하는 정제 단계(S600); 및 상기 정제 단계(S600)에서 수득한 염미증진물질을 건조하여 분말화하는 제형화 단계(S700);를 포함하는 천연 염미 증진제의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 천연 염미 증진제는 평균 20㎛² 내지 30㎛²의 입자크기를 나타내며, 건물 100 중량부에 대하여 0.8 내지 1.3 중량부의 나트륨이 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 천연 염미 증진제의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 천연 염미 증진제는 아미노산 중 쓴맛을 내는 트립토판(tryptophan)이 아미노산의 총 중량에 대하여 0.2 내지 0.6 중량% 함유되고, 감칠맛을 내는 글루타민산(glutamic acid)이 아미노산의 총 중량에 대하여 15 내지 20 중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 천연 염미 증진제의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 천연 염미 증진제는 디펩타이드의 함량이 상기 유지제거 단계(S500)에서 유지가 제거된 어패류 가수분해물에 비하여 2 내지 20배 증가되었으며, 45mM의 염 용액에 비하여 염미가 0.1 내지 13% 향상되는 것을 특징으로 하는 천연 염미 증진제의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 가공 단계(S200)에서 복합효소는 프로테아제(protease) 및 아미노펩티다아제(aminopeptidase)가 0.8 내지 1.2 : 4.8 내지 5.2의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 천연 염미 증진제의 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 프로테아제(protease)는 엔도형(endo type)이고, 아미노펩티다아제(anminopeptidase)는 엔도형(endo type) 및 엑소형(exo type)인 것을 특징으로 하는 천연 염미 증진제의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 정제 단계(S600)에서 염미증진물질의 분리 및 정제는 5 내지 10 kDa 분자량 컷-오프값을 가지는 한외여과 시스템 및 250 Da 분자량 컷-오프값을 가지는 나노여과 시스템을 이용하여 단계적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 천연 임미 증진제의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 정제 단계(S600) 이후 탈색 및 탈취 공정이 추가로 이루어지는 것을 특징으로 하는 천연 염미 증진제의 제조방법.
어패류 분쇄물에 고압효소처리한 후 정제 및 건조하여 건물 100 중량부에 대하여 0.8 내지 1.3 중량부의 나트륨이 함유되어 있는 천연 염미 증진제.
제9항에 있어서, 상기 고압효소처리는 40 내지 60℃ 및 65 내지 80 MPa의 조건으로 12 내지 20시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 천연 염미 증진제.
제9항에 있어서, 상기 천연 염미 증진제는 아미노산 중 쓴맛을 내는 트립토판(tryptophan)이 아미노산의 총 중량에 대하여 0.2 내지 0.6 중량% 함유되고, 감칠맛을 내는 글루타민산(glutamic acid)이 아미노산의 총 중량에 대하여 15 내지 20 중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 천연 염미 증진제.
제9항에 있어서, 상기 천연 염미 증진제는 디펩타이드의 함량이 상기 유지제거 단계(S500)에서 유지가 제거된 어패류 가수분해물에 비하여 2 내지 20배 증가되었으며, 45mM의 염 용액에 비하여 염미가 0.1 내지 13% 향상되는 것을 특징으로 천연 염미 증진제.
제9항에 있어서, 상기 복합효소는 프로테아제(protease) 및 아미노펩티다아제(aminopeptidase)가 0.8 내지 1.2 : 4.8 내지 5.2의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 천연 염미 증진제.