KR20160041082A - Promoter for Pollen-Specific Expression in Plants and Use Thereof - Google Patents

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KR20160041082A
KR20160041082A KR1020140134002A KR20140134002A KR20160041082A KR 20160041082 A KR20160041082 A KR 20160041082A KR 1020140134002 A KR1020140134002 A KR 1020140134002A KR 20140134002 A KR20140134002 A KR 20140134002A KR 20160041082 A KR20160041082 A KR 20160041082A
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plants
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김정묵
김민정
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전남대학교산학협력단
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Abstract

Provided are a promoter exhibiting anther-specific expression characteristics in plants, a vector comprising the same, a plant transformed by the vector, and a method for transforming traits of plants using the same. The anther-specific expression promoter of the present invention can be applied in the production of transgenic crops which functionally alters anther-producing substance and existing seeds, pollination and fertilization steps in a high efficiency for increase yield of agriculturally and industrially effective crops. In addition, the anther-specific expression promoter is an anther-specific regulatory region and is capable of regulating expression of the anther-specific gene in the whole steps of the pollination and the fertilization. Thus, the promoter of the present invention can be useful in the development of genetically modified plants into which exotic genes are introduced requiring anther-specific expression.

Description

식물체의 꽃밥 특이적 발현 특성을 갖는 프로모터 및 그의 용도{Promoter for Pollen-Specific Expression in Plants and Use Thereof}[0001] The present invention relates to a promoter having an anther expression-specific expression characteristic of a plant and a use thereof.

본 발명은 식물체의 꽃밥 특이적 발현 특성을 갖는 프로모터 및 그의 용도에 관한 것이다.
The present invention relates to a promoter having an anther expression-specific expression characteristic of a plant and a use thereof.

지난 산업 혁명 이후 무분별한 화석 연료의 사용에 의한 에너지 고갈, 환경오염과 그에 따른 급격한 기후 변화는 친환경적 신 재생에너지의 개발을 촉구하며, 그 중요성이 대두되었다. 이러한 요구에 부응하여 태양광 에너지를 이용하여 생성되는 유기물(주로 식물)과 유기물을 소비해 생성되는 바이오매스 에너지, 즉 바이오에너지의 개발이 주목을 받으며 상용화 기술 개발과 보급이 확대되는 추세이다. 특히, EU는 2010년까지 전체 대체에너지의 70% 이상을 바이오에너지로 공급할 예정임을 발표하였으며, 중국은 농부산물 바이오매스 가스화 이용, 스웨덴, 캐나다, 브라질은 미국과 함께 목질계 에탄올 기술개발 협력 등 전 세계적인 관심 하에 바이오에너지에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. The energy depletion, the environmental pollution and the sudden change of climate caused by the use of fossil fuels after the Industrial Revolution in the last decade have called for the development of environmentally friendly new and renewable energy. In response to these demands, the development of biomass energy (bio-energy), which is produced by consuming organic matter (mainly plants) and organic matter generated by using solar energy, is getting attention, and commercialization technology development and distribution are increasing. In particular, the EU announced that it will supply more than 70% of total alternative energy to bioenergy by 2010. China will use biomass gasification products from farmers, Sweden, Canada and Brazil, Research on bio-energy is actively underway with worldwide interest.

지구상에서 약 1년간 생산되는 바이오매스 양은 현 석유 매장량 전체에 맞먹을 정도로 거대하여 적절히 이용하면 에너지 고갈 문제를 해결할 수 있다. 하지만 최근 중국과 인도와 같은 대국의 경제 급성장에 따른 곡물수요와 수급불안, 여기에 바이오에너지 개발 원료의 지속적인 소비에 따른 애그플레이션(Agflation)의 발생으로 농작물이 아닌 바이오에너지 작물과 같은 현재와 다른 차원의 바이오에너지 원료의 개발 및 보급이 시급하다.The amount of biomass produced on the earth for about a year is large enough to match the total amount of current oil reserves, and if properly used, it can solve the problem of energy exhaustion. However, due to the recent rapid economic growth of major economies such as China and India, grain demand, supply-demand anxiety, and agrification due to the continuous consumption of bio-energy development materials, It is urgent to develop and disseminate bio-energy raw materials.

세계 인구는 향후 12년 안에 10억 명 이상 늘어나, 2030년이면 83억 명에 달할 전망이다. 더욱이 의학기술의 발달로 건강하게 100세 이상을 사는 시대가 머지않은 미래에 열릴 것으로 내다보고 있다. 문명의 활동 및 석유자원 사용에 따른 지구 온난화 등으로 인한 작물의 수율 감소가 점진적으로 진행될 것이다. 따라서 전통적인 재배와 육종법의 개량으로 폭발적으로 팽창하고 있는 인구의 식량을 공급할 수 없기 때문에 재해 저항성 및 바이오매스와 수율이 증진된 작물 개발을 위한 다양한 생명공학적 방법들의 연구와 개발이 시급하다.The world population is expected to grow to over one billion in the next 12 years, reaching 8.3 billion by 2030. Moreover, with the advancement of medical technology, the era of healthy 100 years old and above is expected to take place in the near future. Crop yields will gradually decrease due to the activities of civilization and global warming caused by the use of petroleum resources. Therefore, as traditional cultivation and breeding techniques can not supply the food of explosively expanding populations, it is imperative to research and develop diverse biotechnological methods to develop crops with improved resistance to disasters and biomass and yield.

바이오매스를 생성하는 주요 원료인 식물체는 자신의 생활사 중 필수적으로 꽃밥을 통한 수분, 수정과정이 수반된다. 꽃밥은 꽃 기관 중 수술 내의 꽃가루 방에서 생성되며, 성숙한 꽃밥은 꽃가루 방의 열개로 밖으로 노출되어 암술머리에 안착한다. 이후 암술머리에서 화분관을 형성하고, 신장하여 암술 내의 씨방으로 이동하게 된다. 화분관을 통해 이동한 두 개의 정세포는 각각 씨방내의 난세포와 중심세포와 합체하여 수정과정을 완료하게 된다. 이러한 과정은 다음세대 유지의 기본이 되는 열매 생성에 직접적인 영향을 미친다. Plant, which is the main raw material for producing biomass, is essential in its life history, accompanied by moisture and fertilization process through anther. Anther is formed in the pollen chamber of the flower organ, and the mature anther is exposed to the outside of the pollen chamber and stays in the stigma. Afterwards, a pollen tube is formed in the head of the stigma, and it is moved to the ovary in the stigma. The two spermatocytes transferred through the pollen tube are combined with the oocyte and the central cell in the ovary to complete the modification process. This process has a direct impact on fruit production, which is the basis for the next generation.

한편, 한국특허 공개번호 10-2010-0081806에는 꽃가루 특이적 유전자 프로모터 pPLim3, 이를 포함하는 발현벡터 및 이를 이용한 형질전환체를 제조한 내용이 기재되어 있고, 한국특허 공개번호 10-2005-0041087에는 꽃가루 특이적 유전자 발현 프로모터 염기서열이 기재되어 있으며, 한국특허 공개번호 10-2006-0087960에는 사과 유래 약 특이적 유전자, 그의 프로모터 및 그를 이용한 형질전환 식물체의 제조방법이 기재되어 있으나 본 발명에서와 같이 LBD10 유전자의 프로모터를 이용한 꽃밥 특이적 발현방법에 대해서는 밝혀진바 없다.
Korean Patent Laid-open Publication No. 10-2010-0081806 discloses a pollen-specific gene promoter pPLim3, an expression vector containing the pollen-specific promoter pPLim3, and a transformant using the expression vector. Korean Patent Publication No. 10-2005-0041087 discloses a pollen- Korean Patent Laid-Open No. 10-2006-0087960 discloses a gene specific to an apple-derived drug, a promoter thereof, and a method for producing a transgenic plant using the same. However, as in the present invention, LBD10 An anther expression-specific expression method using a promoter of a gene has not been disclosed.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 식물체의 꽃밥에서 유전자를 특이적으로 발현하도록 조절하는 기능을 갖는 프로모터를 찾기 위해 노력하였다. 그 결과, LBD10 유전자의 프로모터 부위와 EGFP 및 GUS 유전자를 포함하는 Pro LBD10 :EGFP:GUS 벡터를 제조하고, 이 벡터로 형질전환시킨 식물체의 꽃밥에서 EGFP 및 GUS 활성이 나타나고, 꽃밥을 제외한 다른 조직에서는 전혀 활성이 나타나지 않는 것을 실험적으로 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have searched for a promoter having a function to specifically express a gene in anther on an anther. As a result, Pro LBD10 : EGFP: GUS vector containing the promoter region of LBD10 gene and EGFP and GUS gene was produced, and EGFP and GUS activities were observed in the anther of the plant transformed with this vector. In other tissues except the anther The present inventors have completed the present invention by experimentally confirming that no activity occurs at all.

따라서, 본 발명의 목적은 식물체의 꽃밥 특이적 발현 특성의 프로모터를 제공하는 데 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a promoter of anther expression-specific expression characteristics of a plant.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 프로모터 및 외래유전자를 포함하는 벡터를 제공하는 데 있다. It is still another object of the present invention to provide a vector comprising the promoter and the foreign gene of the present invention.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 벡터에 의해 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하는 데 있다. It is another object of the present invention to provide a transgenic plant transformed by the vector of the present invention.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 벡터에 의해 식물의 형질을 전환시키는 방법을 제공하는 데 있다.
It is yet another object of the present invention to provide a method for transforming a plant by the vector of the present invention.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 식물체의 꽃밥 특이적 발현 특성의 프로모터를 제공한다.
According to one aspect of the present invention, there is provided a promoter of an anther-specific expression characteristic of a plant consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

본 발명자들은 식물체의 꽃밥에서 유전자를 특이적으로 발현하도록 조절하는 기능을 갖는 프로모터를 찾기 위해 노력하였다. 그 결과, LBD10 유전자의 프로모터 부위와 EGFP 및 GUS 유전자를 포함하는 Pro LBD10 :EGFP:GUS 벡터를 제조하고, 이 벡터로 형질전환시킨 식물체의 꽃밥에서 EGFP 및 GUS 활성이 나타나고, 꽃밥을 제외한 다른 조직에서는 전혀 활성이 나타나지 않는 것을 실험적으로 규명하였다. The present inventors have searched for a promoter having a function to specifically express a gene in anther on an anther. As a result, Pro LBD10 : EGFP: GUS vector containing the promoter region of LBD10 gene and EGFP and GUS gene was produced, and EGFP and GUS activities were observed in the anther of the plant transformed with this vector. In other tissues except the anther It was experimentally confirmed that no activity was observed at all.

본 명세서에서 “특이적”이라는 용어는 프로모터의 발현 활성이 동일한 식물체내의 적어도 하나 이상의 다른 조직보다 특정한 조직 내에서 더 높다는 것을 의미한다. 프로모터의 발현 활성의 수준은 일반적으로 사용되는 방법을 이용하여 미리 측정된 조직 내에서의 프로모터의 발현수준을 다른 조직내에서의 것과 비교함으로써 평가된다. 일반적으로 프로모터의 발현수준은 프로모터의 조절 하에서 발현된 유전자 생성물, 예를 들어 단백질 및 RNA 등의 생성량에 의해 측정된다.As used herein, the term " specific " means that the expression activity of a promoter is higher in a particular tissue than in at least one other tissue in the same plant body. The level of expression activity of the promoter is assessed by comparing the expression level of the promoter in tissues previously measured using methods commonly used with those in other tissues. Generally, the level of expression of a promoter is measured by the amount of gene product expressed under the control of the promoter, for example, protein and RNA.

본 명세서에서의 용어“프로모터”는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 프로모터 부위는 당업자라면 용이하게 인식할 수 있다. 즉, ATG 모티프를 포함하는 추정의 개시코돈이 확인되어 있고, 이 개시코돈으로부터 업스트림이 추정 프로모터 부위이다. 프로모터는 인접 및 원거리의 업스트림 엘리먼트(element)들로 구성되어 있다. 인접 엘리먼트로서는 통상적으로 RNA 중합효소 II가 적합한 전사 개시 위치에서 RNA의 합성을 개시할 수 있게 하는 TATA 박스를 포함한다. 원 거리 엘리먼트은 인헨서(enhancer)라고도 불리우는 조절 서열을 포함하는데, 이는 TATA 박스의 업스트림 부위에 조직 특이적 또는 시간 특이적 발현에 관여하는 추가 조절 엘리먼트이다. 인헨서는 프로모터의 활성을 촉진할 수 있는 DNA 서열이고, 프로모터의 고유의 엘리먼트이거나, 프로모터의 조직-특이성이나 발현 수준을 향상시키기 위해서 삽입되는 이종기원(heterologous)의 엘리먼트일 수 있다. 프로모터는 본래의 유전자로부터 그 전체가 유래한 것 일 수 있고, 또는 자연계에서 발견된 상이한 프로모터들로부터 유래한 상이한 엘리먼트들로 구성될 수도 있고, 심지어 합성 DNA를 포함할 수도 있다. 당업자라면 각각 상이한 프로모터는 각각 상이한 조직 또는 세포 타입에서, 또는 발달단계의 상이한 단계에서, 또는 상이한 환경조건에 대응하여서 유전자의 발현을 지시할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 유전자를 대부분의 세포타입에서 대부분의 시간동안 발현시키는 프로모터를 “구성성(constitutive) 프로모터”라고 한다. 식물체 세포내에서 유용한 다양한 타입의 새로운 프로모터들이 계속적으로 발견되고 있다; 다수의 프로모터 예들이 Okamuro and Goldberg에 의한 편집물에 개시되어 있다(1989, Biochemistry of Plants 15:1-82). 대부분의 경우에서 조절 서열의 정확한 경계부분이 완벽하게 정해지지 않기 때문에 일정한 변이의 DNA 단편들이 동일한 프로모터 활성을 갖는다고 인식되어 있다.
As used herein, the term " promoter " means a DNA sequence capable of regulating the expression of a coding sequence or functional RNA. The promoter region can be easily recognized by those skilled in the art. That is, the start codon of the estimate including the ATG motif is confirmed, and the upstream is the estimated promoter region from this start codon. A promoter consists of contiguous and remote upstream elements. Adjacent elements typically include a TATA box that allows RNA polymerase II to initiate synthesis of RNA at suitable transcription initiation sites. The distant element contains a regulatory sequence, also called an enhancer, which is an additional regulatory element involved in tissue-specific or time-specific expression in the upstream region of the TATA box. An enhancer is a DNA sequence capable of promoting the activity of a promoter and may be a unique element of the promoter or a heterologous element inserted to enhance the tissue-specificity or expression level of the promoter. The promoter may be entirely derived from the original gene, or may be composed of different elements derived from different promoters found in nature, or may even contain synthetic DNA. It will be understood by those skilled in the art that each different promoter may direct expression of the gene in different tissue or cell types, or at different stages of development, or in response to different environmental conditions. A promoter that expresses a gene for most of the time in most cell types is called a " constitutive promoter ". Various types of new promoters useful in plant cells have been continuously discovered; A number of examples of promoters are disclosed in a compilation by Okamuro and Goldberg (1989, Biochemistry of Plants 15: 1-82). It is recognized that, in most cases, the exact border of the regulatory sequence is not completely defined, so that certain mutated DNA fragments have the same promoter activity.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 서열목록 제1서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된(operatively linked) 외래유전자를 포함하는 벡터를 제공한다.According to another aspect of the present invention there is provided a vector comprising a promoter consisting of the nucleotide sequence described in the first sequence of the sequence listing and an exogenous gene operatively linked to the promoter.

본 명세서에서의 용어“작동가능하게 연결된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합위치의 배열)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.As used herein, the term " operably linked " means a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (e.g., an array of promoter, signal sequence, or transcription factor binding site) and another nucleic acid sequence, The sequence controls the transcription and / or translation of the other nucleic acid sequences.

본 명세서에서의 용어“원하는 외래 유전자”는 특정의 유전자로 한정되지 않고, 원하는 적용 또는 달성하고자하는 표현형에 따라 선택할 수 있다. The term " foreign gene of interest " as used herein is not limited to a specific gene but can be selected according to the desired application or phenotype to be achieved.

본 발명에서의 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.The vectors in the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods are described in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) This document is incorporated herein by reference.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.The vector of the present invention can typically be constructed as a vector for cloning or expression. In addition, the vector of the present invention can be constructed by using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts. For example, when the vector of the present invention is an expression vector and a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of promoting transcription (e.g., pL? Promoter, trp promoter, lac promoter, T7 promoter, tac promoter, etc.) It is common to include a ribosome binding site and a transcription / translation termination sequence for initiation of translation. When E. coli is used as a host cell, the promoter and operator site of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158: 1018-1024 (1984)) and the left promoter of phage l Promoter, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14: 399-445 (1980)).

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.The vectors that can be used in the present invention include plasmids such as pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pGEX series, pET series and pUC19 which are frequently used in the art, phages such as λgt4 · λB ,? -charon,?? z1, and M13), or a virus (e.g., SV40, etc.).

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.On the other hand, when the vector of the present invention is an expression vector and a eukaryotic cell is used as a host, a promoter derived from a genome of a mammalian cell (for example, a metallothionein promoter) or a mammalian virus Virus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter, and tk promoter of HSV) can be used, and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.The vector of the present invention may be a selection marker and may include an antibiotic resistance gene commonly used in the art, for example, ampicillin, gentamycin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, And resistance genes for tetracycline.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 콜리플라우어 모자이크 바이러tm(CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제(nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리 폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀바이러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트(ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the promoter suitable for the present invention may be any of those conventionally used in the art for transgenic introduction of plants, for example, a ubiquitin promoter of corn, a corynebacterium mosaic bar (CaMV) 35S promoter, nopaline synthase (nos) promoter, Piguet mosaic virus 35S promoter, water cranes Vasyl formum virus promoter, combellinella yellowmott virus promoter, ribulose-1,5-bis-phosphate carboxamide (TPI) promoter, adenine phosphoribosyl transferase (APRT) promoter of Arabidopsis, and the tryptophan synthase promoter of ssRUBISCO, a cysteine triphosphate isomerase (TPI) promoter of Arabidopsis thaliana, do.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위는 아그로박테리움 튜머페이션스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것(nos 3' end) (Bevan et al., Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3'- 말단 부분, 또는 CaMV 35S 터미네이터를 포함한다.According to one embodiment of the present invention, the 3'-non-detoxified site causing polyadenylation in accordance with the present invention is derived from the nopaline synthase gene of Agrobacterium tumefaciens (nos 3 'end) ( (Bevan et al., Nucleic Acids Research, 11 (2): 369-385 (1983)), derived from the tryptophan synthase gene of Agrobacterium tumefaciens, the protease inhibitor I or II gene of tomato or potato A 3'-terminal portion, or a CaMV 35S terminator.

선택적으로, 본 발명의 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제(예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자(예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptⅡ),또는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함한다.
Alternatively, the vector of the invention additionally carries a gene encoding a reporter molecule (e.g., luciferase and beta -glucuronidase). In addition, the vector of the present invention can be used as a selection marker for a gene resistant to antibiotics (e.g., neomycin, carbenicillin, kanamycin, spectinomycin, hygromycin) (for example, neomycin phosphotransferase (nptII) Gomycin phosphotransferase (hpt), etc.).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 벡터에 의해 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다.According to another aspect of the present invention there is provided a transgenic plant transformed by said vector.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 벡터로 식물을 형질전환시켜 상기 외래유전자를 식물체에서 발현시키는 단계를 포함하는 식물의 형질을 전환시키는 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for transforming a plant, which comprises transforming a plant with the vector and expressing the foreign gene in a plant.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.Host cells capable of continuously cloning and expressing the vector of the present invention in a stable manner can be used in any host cell known in the art, such as E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli . such as E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus strains, and Salmonella typhimurium, Serratia marcesensus and various Pseudomonas spp. Enterobacteriaceae and strains.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 사람 세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 한편, 본 발명의 벡터는 식물에서 유용성이 크기 때문에, 상기 형질전환체는 세포 뿐만 아니라, 식물 세포 또는 조직으로 부터 유래된 캘러스를 포함한다.When the vector of the present invention is transformed into eukaryotic cells, Saccharomyce cerevisiae, insect cells, human cells (e.g., Chinese hamster ovary, W138, BHK, COS-7, 293 , HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and plant cells. On the other hand, since the vector of the present invention is highly useful in plants, the transformant includes not only cells but also calluses derived from plant cells or tissues.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic.Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.The method of delivering the vector of the present invention into a host cell may be carried out by the CaCl 2 method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973) , Hanahan, D., J. MoI. Biol., 166: 557-580 (1997)), one method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1983)) and electroporation (Dower, WJ et al., Nucleic. Acids Res., 16: 6127-6145 (1988)). In addition, when the host cell is a eukaryotic cell, microinjection (Capecchi, MR, Cell, 22: 479 (1980)), calcium phosphate precipitation (Graham, FL et al., Virology, 52: 456 (Wong, TK et al., Gene, 10: 87 (1980)), DEAE- (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572 (1990)) and dextran treatment (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 ) Or the like into the host cell.

본 발명의 방법에 있어서, 식물세포의 형질전환은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 이는 전기천공(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 입자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)) 및 아그로박테리움-중재 형질전환(미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호)을 포함한다. 이 중에서, 아그로박테리움-중재 형질전환이 가장 바람직하다.In the method of the present invention, transformation of plant cells can be carried out according to conventional methods known in the art, including electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J., 1: 841 (1982) ), Particle bombardment (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572 (1990)) and Agrobacterium-mediated transformation (U.S. Patent Nos. 5,004,863, 5,349,124 and 5,416,011) . Of these, Agrobacterium-mediated transformation is most preferred.

쌍떡잎 식물을 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용하여 형질전환시키고 형질전환된 식물체를 얻는 방법은 공지되어 있고, 이 외에 다른 다양한 식물에 대해서 형질전환 식물체를 얻는 방법이 공지되어 있는 데, 목화(cotton)에 대해서는 미합중국 특허 제 5,004,863 및 5,159135호; 콩에 대해서는 미합중국 특허 제5,569,834 및 5,416011호; 브라시카( Brassica) 에 대해서는 미합중국 특허 제5,463,174호; 땅콩(peanut)에 대해서는 Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep. 15:653-657, McKently et al. (1995) Plant Cell Rep. 14:699-703)에; 파파야(papaya)에 대해서는 Ling, K. et al. (1991) Bio/technology 9:752-758); and pea(Grant et al. (1995) Plant Cell Rep. 15:254-258에 개시되어 있다.Methods for transforming dicotyledonous plants with Agrobacterium tumefaciens and obtaining transformed plants are known, and methods for obtaining transgenic plants for a variety of other plants are known, including cotton U.S. Patent Nos. 5,004,863 and 5,159,135; See U.S. Patent Nos. 5,569,834 and 5,416011 for soybeans; For Brassica, see U.S. Patent No. 5,463,174; For peanut, see Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep. 15: 653-657, McKently et al. (1995) Plant Cell Rep. 14: 699-703); For papaya, see Ling, K. et al. (1991) Bio / technology 9: 752-758); and pea (Grant et al. (1995) Plant Cell Rep. 15: 254-258.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제(예컨데, 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물 세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.Selection of transformed plant cells can be carried out by exposing the transformed culture to a selection agent (e.g., metabolic inhibitor, antibiotic, and herbicide). Plant cells that stably contain a marker gene that is transformed and conferring selectative resistance are grown and divided in the above cultures. Exemplary labels include, but are not limited to, hygromycin phosphotransferase gene, glycophosphate tolerance gene and neomycin phosphotransferase (nptII) system.

식물 원형질 또는 다양한 익스플랜트로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다(미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).Methods for the development or regeneration of plants from plant protoplasts or from various plants are well known in the art. The development or regeneration of plants containing foreign genes introduced by Agrobacterium can be accomplished according to methods known in the art (U.S. Pat. Nos. 5,004,863, 5,349,124 and 5,416,011).

본 발명에 있어서, 바람직한 형질전환 방법은 아그로박테리움 시스템을 이용여 실시되며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)-바이너리 벡터 시스템을 이용하여 실시된다.In the present invention, the preferred transformation method is carried out using an Agrobacterium system, more preferably Agrobacterium tumefaciens-binary vector system.

식물 세포의 형질전환은 Ti 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜머페이션스를 가지고 실시된다(Depicker, A. etal., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983)). 보다 바람직하게는, pBin19, pRD400, pRD320, pGA1611 및 pGA1991과 같은 바이너리 벡터 시스템이 이용된다(An, G. et al., Binary vectors " In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986); An et al., 1988; 및 Lee et al., 1999).Transformation of plant cells is carried out with Agrobacterium tumefaciens containing Ti plasmids (Depicker, A. et al., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983) . More preferably, binary vector systems such as pBin19, pRD400, pRD320, pGA1611 and pGA1991 are used (An, G. et al., Binary vectors "In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, An et al., 1988; and Lee et al., 1999).

본 발명에 적합한 바이너리 벡터는 (i) 식물에서 작동하는 프로모터; (ⅱ) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 구조 유전자; 및 (ⅲ) 폴리아데닐화 시그널 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자 (예:루시퍼라아제 및 글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 바이너리 벡터에 이용되는 프로모터의 예는 CaMV 35S 프로모터, 1 프로모터, 2 프로모터 및 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.Binary vectors suitable for the present invention include (i) a promoter that is operative in plants; (Ii) a structural gene operably linked to the promoter; And (iii) a polyadenylation signal sequence. Alternatively, the vector additionally carries a gene encoding a reporter molecule (e.g., luciferase and glucuronidase). Examples of promoters used in the binary vector include, but are not limited to, CaMV 35S promoter, 1 promoter, 2 promoter and nopaline synthase (nos) promoter.

아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 익스플랜트의 감염은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 감염 과정은 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양물에 익스플랜트를 함침시켜 공동배양하는 과정을 포함한다. 이에 의해 아그로박테리움 튜머페이션스는 식물내로 감염된다.Infection of an explant by Agrobacterium tumefaciens comprises methods known in the art. Most preferably, the infection process comprises co-culturing an explant in a culture of Agrobacterium tumefaciens with an explant. Whereby Agrobacterium tumefaciens is infected into plants.

아그로박테리움 튜머페이션스에 의해 형질전환된 익스플랜트는 재분화 배지에서 재분화되며, 이는 최종적으로 형질전환 식물체를 형성한다.Explants transformed by Agrobacterium tumefaciens are regenerated in regeneration medium, which ultimately forms transgenic plants.

본 발명에 따라 형질전환된 식물은 당업계에 공지된 방법에 의해 형질전환 여부가 확인된다. 예를 들어, 형질전환된 식물의 조직으로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여, PCR을 실시하면 형질전환 식물의 지놈에 삽입된 외래 유전자가 규명될 수 있다. 택일적으로, 노던 또는 서던 블롯팅을 실시하여 형질전환 여부를 확인할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989).)
The transformed plants according to the present invention are confirmed to be transformed by methods known in the art. For example, PCR using DNA samples from tissues of transformed plants can identify foreign genes inserted into the genome of the transgenic plant. Alternatively, Northern or Southern blotting can be performed to confirm the transformation (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(ⅰ) 본 발명은 식물체의 꽃밥 특이적 발현 특성의 프로모터 및 이를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 식물체 및 이를 이용하여 식물의 형질을 전환시키는 방법을 제공한다. (I) The present invention provides a promoter of an anther expression-specific expression characteristic of a plant and a vector containing the same, a plant transformed with the vector, and a method of transforming a plant using the vector.

(ⅱ) 본 발명의 꽃밥 특이적 발현 프로모터는 농·산업적 유용작물의 수율 증진을 위한 고효율의 수분, 수정과정과 기존의 종자 및 꽃밥의 생산 물질을 기능적으로 변형시키는 형질전환 작물 제작에도 활용될 수 있다. (Ii) The anther-specific expression promoter of the present invention can be used for the production of transgenic crops that functionally transform production materials of existing seeds and anther, as well as high-efficiency water, fertilizer and water for increasing the yield of agricultural and industrial useful crops have.

(ⅲ) 본 발명의 꽃밥 특이적 발현 프로모터는 꽃밥 특이적 조절 부위로써 수분, 수정 과정 전 단계에서 꽃밥 특이적 유전자 발현 조절이 가능한 프로모터로서 화분 특이적 발현을 요구하는 외래유전자가 도입된 유전자 변형 식물체 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
(Iii) The anther-specific expression promoter of the present invention is an anther-specific regulatory region, which is capable of regulating an anther gene-specific gene expression at the stage of moisture, before the fertilization process, as a transgenic plant in which a foreign gene requiring a flower- It can be useful for development.

도 1은 Pro LBD10 :EGFP:GUS 제작에 사용된 벡터의 모식도이다.
도 2는 본 발명에 사용된 LBD10 유전자의 프로모터를 포함한 형질전환 식물체의 꽃밥 발달 과정 중 보고자 유전자인 EGFP와 GUS의 발현 양상을 나타낸다. A, 화서; B, 개화; C와 D, 개화 단계의 수술; E, 극성 단일세포 단계의 꽃밥; F, 조기 이중세포 단계의 꽃밥; G, 중-후기 이중세포 단계의 꽃밥; H, 삼중세포 단계의 꽃밥; I, 성숙한 삼중세포 단계의 꽃밥.
Fig. 1 is a schematic diagram of a vector used in the production of Pro LBD10 : EGFP: GUS .
Fig. 2 shows the expression patterns of EGFP and GUS, which are reporter genes, during the development of an anther of a transgenic plant including the promoter of LBD10 gene used in the present invention. A, inflorescence; B, flowering; C and D, surgery at the flowering stage; E, polar single cell stage anthers; F, early double cell stage anthers; G, mid - late double cell stage anthers; H, triple cell stage anthers; I, mature, triple cell stage anther.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실시예 1: Example 1: ProPro LBD10LBD10 :EGFP:GUS : EGFP: GUS 형질전환식물체의 조직 특이적 발현 양상 분석Analysis of tissue-specific expression patterns of transgenic plants

LBD10 유전자의 프로모터 부위가 활성화 되는 조직을 조사하기 위하여, 보고자 유전자인 녹색 형광 단백질을 암호화하는 EGFP 유전자, 이어서 X-Glu 시약의 염색에 파란 발색을 하는 효소 단백질 GUS 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로서 Pro LBD10 :EGFP:GUS를 제작(도 1)하여 애기장대 Columbia-0(Col-0)에 형질전환을 수행하였다. In order to investigate the tissue in which the promoter region of the LBD10 gene was activated, a recombinant plant expression vector containing an EGFP gene encoding a green fluorescent protein as a reporter gene and an enzyme protein GUS gene encoding a blue color in the subsequent staining of an X-Glu reagent Pro LBD10 : EGFP: GUS was constructed (Fig. 1) and transformed into Arabidopsis Columbia-0 (Col-0).

보고자 유전자의 ATG 번역 개시점으로 부터 상위로 약 1808개 염기서열에 해당하는 LBD10 프로모터 부위를 Pfu DNA 중합효소와 두 개의 프라이머, LBD10proF(5'-CAC CGT CTT GAT CAT AAT GTC TTA AAA TCA C-3')와 LBD10proR(5'-CCC CAC TTA AGA CAC AAC ACT ATC-3')를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 이후 GatewayBP recombination reaction을 이용하여 pENTR TM /SD/D-TOPO(Invitrogen) 벡터에 재조합 반응하였다. 그 결과 pENTR TM /SD/D-TOPO LBD10 . 재조합 벡터를 완성하였고, GatewayLR recombination reaction을 이용하여 pKGWFS7 목적 벡터에 재조합 반응하였다. 그 결과 재조합 식물 발현 벡터로서 Pro LBD10 :EGFP:GUS를 제작하였다. 이를 식물에서 발현시키기 위해 아그로박테리움에 형질 전환 시킨 뒤 애기장대에 플로랄 딥 (floral dip) 방법을 이용하여 형질전환을 수행하였다. 형질 전환시킨 식물체는 종자를 받은 뒤 0.5X Murashige Skoog(MS), 10 mg/ml bsata 배지에서 자라는 독립적인 개체를 선별한 뒤 흙에 옮겨 심은 뒤 키워서 각가 종자를 따로 받아 다시 같은 조성의 배지에 심었을 때 살아남는 것과 죽는 표현형이 3:1 비율로 나타나는 개체군을 확인하였고 궁극적으로 24개의 동형접합 형질전환 식물체를 분리하였다. 이들 중 실험에 이용할 형질전환 식물체를 화분에서 6주 동안 생장시켰다. The LBD10 promoter region corresponding to about 1808 base sequences from the beginning of ATG translation of the reporter gene was ligated with Pfu DNA polymerase and two primers, LBD10proF (5'-CAC CGT CTT GAT CAT AAT GTC TTA AAA TCA C-3 ) And LBD10proR (5'-CCC CAC TTA AGA CAC AAC ACT ATC-3 '). Then, recombination reaction was performed with the pENTR TM / SD / D-TOPO (Invitrogen) vector using the GatewayBP recombination reaction. As a result, pENTR TM / SD / D-TOPO LBD10 . The recombinant vector was constructed and recombined into the pKGWFS7 target vector using the GatewayLR recombination reaction. As a result, Pro LBD10 : EGFP: GUS was constructed as a recombinant plant expression vector. To express this in plants, Agrobacterium was transformed into Arabidopsis thaliana using the floral dip method. After the seeds were transplanted, individual individuals growing on a 0.5X Murashige Skoog (MS), 10 mg / ml bsata medium were selected, transferred to the soil, and cultivated. The seeds were separately harvested and planted in the same composition medium The surviving and dead phenotype were identified in 3: 1 ratio and ultimately, 24 homozygous transgenic plants were isolated. Among them, the transgenic plants to be used for the experiment were grown in pots for 6 weeks.

EGFP 보고자 유전자 유래 단백질의 형광 발현을 살펴보기 위하여 발달 중인 꽃밥을 꽃봉오리 내의 발달 중인 수술로부터 주사침을 이용하여 분리하였다. 또한 개화로부터 열개단계의 수술 내에서 성숙한 꽃밥을 분리하였다. 이 후 꽃밥 발달 단계를 확인하고자 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 시약을 이용하여 꽃밥 내의 핵을 염색하였다. 샘플은 Leica DM2500 현미경을 사용하여 1000X 배율로 관찰하였다.To investigate the fluorescence expression of EGFP reporter gene-based proteins, the developing anther was isolated from the developing surgery in the bud using a needle. In addition, mature anther was separated from the flowering in the operation of ten steps. After that, nuclei in anther were stained with DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) reagent to confirm the development stage of anther. Samples were observed at 1000X magnification using a Leica DM2500 microscope.

GUS 보고자 유전자 유래 단백질의 발현을 살펴보기 위하여 형질전환 식물체의 화서를 가위로 절단 후 X-Gluc 시약을 이용하여 37℃에서 16시간동안 반응하였고 에탄올을 이용하여 엽록체를 제거하였다. 샘플은 Leica DM2500 현미경을 사용하여 DIC(differential interference contrast)를 포함한 50-1000X 배율로 관찰하였다.In order to examine the expression of gene-derived proteins from GUS reporter, transgenic plants were cut with scissors and reacted with X-Gluc reagent at 37 ° C for 16 hours, and chloroplasts were removed using ethanol. Samples were observed at 50-1000X magnification with differential interference contrast (DIC) using a Leica DM2500 microscope.

보고자 유전자로부터 생성되는 EGFP와 GUS 단백질 발현 분석을 통해 LBD10 유전자의 프로모터 부위는 꽃밥 발달 과정 중 극성 단일세포 단계부터 성숙한 삼중세포단계까지 전 단계에 거쳐 활성을 나타냄을 알았다. 또한, 꽃밥을 제외한 식물체의 다른 조직에서는 전혀 활성이 나타나지 않았다. 이러한 관찰을 통해 LBD10 유전자의 프로모터는 꽃밥 특이적 발현 프로모터로 유용 프로모터임을 규명하였다(도 2).
Through the analysis of EGFP and GUS protein expression from the reporter gene, it was found that the promoter region of LBD10 gene was active throughout polar development stages from the polar single cell stage to the mature triple cell stage. In addition, no activity was observed in other tissues of plants other than anther. Through these observations, the promoter of the LBD10 gene was confirmed to be a useful promoter as an anther-specific expression promoter (Fig. 2).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, CHONNAM UNIVERSITY <120> Promoter for Pollen-Specific Expression in Plants and Use Thereof <130> PN140476 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1828 <212> DNA <213> LBD10 promoter <400> 1 gtcttgatca taatgtctta aaatcacaaa acttatataa aactataaaa catatattat 60 aatatataat tataatcata agttacaagt atcaatgtat taaaaaaata aatagtatca 120 atactaaata agattttttt tagttttctt aaagatattt atcaaccatt caagttaaat 180 tcaagacata atattcttgt gttattatca actaaatctt gactcttaat attgtatcaa 240 gttttgtaaa tcaataaagt atttagagaa tttaaagtaa atgttcttga ttttatttca 300 tcaagtttaa atcaatgaaa agtagttagg aacgttgatt tatcttcttt actctttcaa 360 ttttatactt ttataatgct attattggag gcaaaaaata gagaggaaga ataagctatt 420 ctctagtatc tatatgaact cttcatgtaa attactaaag aatattagtt acaagaatga 480 aatatctata acccgttcaa gttaaatttt ctatgtttca gttgtcaaac ttctgcatta 540 tcaggttgta ccttcactga atacattata ttgtagaagt ttaaatcaat gaaatattta 600 cagactctaa tattttttat attaaaactc taatacactt ttgttatcat taattaatgt 660 tttactaatt acattgtatc atattgaatc aatgatgtat tagagacagt aaaaatacta 720 ttcgtaacta gtaatgaatt atacttttca aatgatcctt ttatataaat ttcacaaatt 780 ttaaatgcta atttctcatt ctttatttga agagttcttg taaaaaatgc taaagaatgg 840 ggtatattat ttttttagat tctaaatttg aaagttaaaa attcaagacc tagtaaatca 900 gttaaaaata taaaagaaat atctaaaaat aactcacttt ttctccattg taaacaaatt 960 tgattttctt ttcctatgaa atttgaatta gtcttctact aattatgcag cttaaaatat 1020 cattgctaac ttatcaaatg atacttcaaa ttttttatca gtcacaaaaa aaaaaacaat 1080 ttgcataagc ggtttagatt taaatttgac cacacgtgtg taactttgta acacgatgtc 1140 tctatctttc tctctttctt gttgatgtgt tttaaggttt tctaaatctc atttttgtct 1200 ccttaaaatt ttctcagaaa catttccgtc atttgttcct tagttttgta atcaatcttc 1260 acgattcctc aggcactgta cttggcaaat ctctgtcttt ttttctcctt cattttctct 1320 cactctctcc caaaaatcca gtaattctat attattttag gtgatcattc tgatttcaat 1380 ttttttggtt gaatttttct aaatagtaat gttatttcag gtaccatcct ccaaggtcat 1440 aagagaacag gatcggtgtt ctcgaacgag cgggtgcgat ttcttgattc tttaatttta 1500 tttgatcaca tttcttaatt ctctcatata tatagattga ttgatttggt tgaaaattga 1560 tttaatttca taactatgtt ttctttttca taattaaatt ttcatagttc tgtttctttt 1620 ttgttgttga gaaagttgat ctaatgtggt tgattcaaag ggtgatgtaa atgttcttgc 1680 ctggtttttg gtttcttgtg ttgaaagcta aaacgtatat gattttgtgt ttcttgtgct 1740 tcaagatatt tcttacatgt tatttccctt gttctctttg tcttaattcc attcttaaat 1800 ttttgatagt gttgtgtctt aagtgggg 1828 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> LBD10proF <400> 2 caccgtcttg atcataatgt cttaaaatca c 31 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> LBD10proR <400> 3 ccccacttaa gacacaacac tatc 24 <110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, CHONNAM UNIVERSITY <120> Promoter for Pollen-Specific Expression in Plants and Use Thereof <130> PN140476 <160> 3 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 1828 <212> DNA <213> LBD10 promoter <400> 1 gtcttgatca taatgtctta aaatcacaaa acttatataa aactataaaa catatattat 60 aatatataat tataatcata agttacaagt atcaatgtat taaaaaaata aatagtatca 120 atactaaata agattttttt tagttttctt aaagatattt atcaaccatt caagttaaat 180 tcaagacata atattcttgt gttattatca actaaatctt gactcttaat attgtatcaa 240 gttttgtaaa tcaataaagt atttagagaa tttaaagtaa atgttcttga ttttatttca 300 tcaagtttaa atcaatgaaa agtagttagg aacgttgatt tatcttcttt actctttcaa 360 ttttatactt ttataatgct attattggag gcaaaaaata gagaggaaga ataagctatt 420 ctctagtatc tatatgaact cttcatgtaa attactaaag aatattagtt acaagaatga 480 aatatctata acccgttcaa gttaaatttt ctatgtttca gttgtcaaac ttctgcatta 540 tcaggttgta ccttcactga atacattata ttgtagaagt ttaaatcaat gaaatattta 600 cagactctaa tattttttat attaaaactc taatacactt ttgttatcat taattaatgt 660 tttactaatt acattgtatc atattgaatc aatgatgtat tagagacagt aaaaatacta 720 ttcgtaacta gtaatgaatt atacttttca aatgatcctt ttatataaat ttcacaaatt 780 ttaaatgcta atttctcatt ctttatttga agagttcttg taaaaaatgc taaagaatgg 840 ggtatattat ttttttagat tctaaatttg aaagttaaaa attcaagacc tagtaaatca 900 gttaaaaata taaaagaaat atctaaaaaat aactcacttt ttctccattg taaacaaatt 960 tgattttctt ttcctatgaa atttgaatta gtcttctact aattatgcag cttaaaatat 1020 cattgctaac ttatcaaatg atacttcaaa ttttttatca gtcacaaaaa aaaaaacaat 1080 ttgcataagc ggtttagatt taaatttgac cacacgtgtg taactttgta acacgatgtc 1140 tctatctttc tctctttctt gttgatgtgt tttaaggttt tctaaatctc atttttgtct 1200 ccttaaaatt ttctcagaaa catttccgtc atttgttcct tagttttgta atcaatcttc 1260 acgattcctc aggcactgta cttggcaaat ctctgtcttt ttttctcctt cattttctct 1320 cactctctcc caaaaatcca gtaattctat attattttag gtgatcattc tgatttcaat 1380 ttttttggtt gaatttttct aaatagtaat gttatttcag gtaccatcct ccaaggtcat 1440 aagagaacag gatcggtgtt ctcgaacgag cgggtgcgat ttcttgattc tttaatttta 1500 tttgatcaca tttcttaatt ctctcatata tatagattga ttgatttggt tgaaaattga 1560 tttaatttca taactatgtt ttctttttca taattaaatt ttcatagttc tgtttctttt 1620 ttgttgttga gaaagttgat ctaatgtggt tgattcaaag ggtgatgtaa atgttcttgc 1680 ctggtttttg gtttcttgtg ttgaaagcta aaacgtatat gattttgtgt ttcttgtgct 1740 tcaagatatt tcttacatgt tatttccctt gttctctttg tcttaattcc attcttaaat 1800 ttttgatagt gttgtgtctt aagtgggg 1828 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> LBD10proF <400> 2 caccgtcttg atcataatgt cttaaaatca c 31 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> LBD10proR <400> 3 ccccacttaa gacacaacac tatc 24

Claims (5)

서열목록 제1서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 식물체의 꽃밥 특이적 발현 특성의 프로모터.
A promoter of an anther-specific expression characteristic of a plant consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID No. 1.
제 1 항의 식물체의 꽃밥 특이적 발현 특성의 프로모터를 포함하는 벡터.
A vector comprising the promoter of anther-specific expression characteristics of the plant of claim 1.
제 2 항에 있어서, 상기 벡터는 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된(operatively linked) 외래유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
3. The vector of claim 2, wherein the vector comprises an exogenous gene operatively linked to the promoter.
제 2 항 또는 제 3 항의 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체.
A transformed plant transformed with the vector of claim 2 or 3.
제 3 항의 발현벡터로 식물을 형질전환시켜 상기 외래유전자를 식물체에서 발현시키는 단계를 포함하는 식물의 형질을 전환시키는 방법. A method for transforming a plant, comprising transforming a plant with the expression vector of claim 3 and expressing the foreign gene in a plant.
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