KR20160038190A - 마이크로rna-192에 대한 길항제를 포함하는 간 섬유화 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마이크로RNA-192(miR-192)에 대한 길항제(antagonist)를 포함하는, 간 섬유화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 간 섬유화의 치료방법에 관한 것이다.

Description

마이크로RNA-192에 대한 길항제를 포함하는 간 섬유화 억제용 조성물{Composition comprising antago-miR-192 for inhibiting liver fibrosis}

본 발명은 마이크로RNA-192(miR-192)에 대한 길항제(antagonist)를 포함하는, 간 섬유화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 간 섬유화의 치료방법에 관한 것이다.

섬유화(fibrosis)란 인체 내에서 조직이 여러 가지 스트레스 (감염, 화학적 자극, 방사선 등)에 의한 손상을 받은 후 창상치유(wound healing) 과정 중에 정상적인 통제가 불가능한 상태로, 특히 만성 질환에 공통적으로 거치게 되는 경로로서 그 기전이 매우 복잡하여 현재까지도 완전히 규명되고 있지 않다.

특히 간 섬유화의 경우 자가 면역, B형 간염 바이러스, C형 간염바이러스, 기생충, 약물, 알코올, 고지방 식이 같은 비-알콜성 인자, 대사성 질환 등 다양한 원인에 의해서 간에 손상이나 스트레스를 받게 되어 발병이 된다고 알려져 있으며, 만성간염이 지속되면 간 섬유화로 진행될 수 있다.

간이 알코올, 바이러스 등의 여러 유해환경인자에 의해 자극을 받으면 쿠퍼세포(Kupffer cell)로부터 분비된 TGF-b(transforming growth factor b)를 포함한 여러 사이토카인에 의하여 간성상 세포가 활성화된다. 분비된 TGF-b는 콜라겐 합성을 촉진시켜 세포외 기질에 축적시키고, 지속적으로 축적된 콜라겐에 의하여 간 섬유화를 일으킬 뿐만 아니라, 간성상세포 자신 뿐만 아니라 주변의 간세포에도 영향을 주어 EMT(epithelial to mesenchymal transition)을 일으키는 것으로 알려져 있다. 계속되는 간 섬유화증(hepatic fibrosis)의 과정을 거쳐 결국은 간경변증이 유발되므로 간 섬유화증의 과정을 이해하고 연구하는 것은 간경변을 유발할 수 있는 모든 질환을 해결하는 데 가장 기본적인 단계라고 할 수 있다.

일반적으로 간 섬유화증은 간경변과는 달리 가역적이고, 얇은 원섬유(thin fibril)로 구성되며, 결절(nodule) 형성이 없는 것으로 알려져 있고, 간 손상의 원인이 소실되면 정상회복이 가능할 수 있으나, 이러한 간 섬유화증 과정이 반복적으로 지속되면 ECM(extra cellular matrix) 간의 크로스링킹(crosslinking)이 증가하여 결절(nodule)이 있는 비가역적인 간경변으로 진행된다.

간 섬유화가 더욱더 진행되어 간경변증(cirrhosis)가 일어나는데, 그 발병기전은 어떤 원인에 의해 간세포 괴사가 일어나면 간세포 재생과 섬유조직 증식이 있다. 이러한 과정이 오랫동안 반복하여 지속될 때 간경변증이 생긴다. 지속적 또는 반복적인 미만성 간실질 손상, 섬유조직 증식과 간세포 재생에 의해 재생된 간 결절이나 결절로 형성된 간경변은 병리학적으로 괴사(necrosis), 염증(inflammation) 및 섬유화(fibrosis)가 수반되는 만성질환이며 궁극적으로 간암으로의 진행 및 사망에 이르게 된다. 특히 초기에 자각증상이 없어 상당히 진행되어서야 발견되기 때문에 효과적인 진단 및 치료에 관한 연구가 필요하다.

한편, 마이크로RNA(miRNA)는 약 20 내지 25개의 뉴클레오티드(nt)로 구성되는 비-코딩 RNA로, 특정 mRNA의 3’UTR에 결합하여 전사 후 과정에서 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. miRNA는 핵 내에서 RNA 폴리머라제(polymerase) II에 의해 전사되어 헤어핀구조를 갖는 primary miRNA로 만들어진 후 이중가닥RNA를 특이적으로 인식하는 리보뉴클레아제인(ribonulease)인 Drosha에 의해 헤어핀부위가 잘려 대략 70nt정도의 precursor miRNA(pre-miRA)가 만들어진다. 이러한 pre-miRNA는 3’에 1~4nt의 오버행(overhang)을 가진 stem-loop 구조를 형성하고 있으며, Exportin-5(Exp5)/RanGTP에 의해 세포질로 이동한다. 이렇게 이동한 pre-miRNA는 stem-loop 구조를 인지하는 단백질인 다이서(Dicer)에 의해 잘려져 이중가닥 miRNA로 만들어지며, 이중 가이드 miRNA는 RISC(RNA-induced silencing complex)와 결합하여 특정 mRNA의 3’UTR을 표적화하여 mRNA를 절단하거나 번역(translation)을 억제함으로써 유전자 발현을 조절하게 된다.

최근 연구에 의하면 이러한 miRNA는 조직 특이적인 프로파일을 가질 뿐만 아니라 질병 특이적인 프로파일을 갖는다고 알려져 있다. 많은 miRNA가 암의 발달과 전이뿐만 아니라 다양한 질병과 연관되어 있다고 알려져 있으며 이러한 질병들의 치료제나 표지자로써의 활용을 위한 연구가 지속되고 있다. 그 예로 한국공개특허 제10-2010-0061798호는 심장 조직에서의 섬유증을 조절하기 위한 miRNA로 miR-29에 대해 개시하고 있으나, miRNA의 활성을 억제함으로써 간 섬유화를 억제하는 것에 대해서는 개시하고 있지 않다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은간 섬유화를 치료하기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, miR-192가 C형 간염 바이러스 감염 시 진행되는 간 섬유화 과정에 관여하는 miRNA임을 규명하였으며, 상기 antago-miR-192를 처리하여 miR-192를 억제함으로써 간 섬유화 진행에 관여하는 원인 인자인 TGF-b1의 발현을 억제하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은마이크로RNA-192(miR-192)에 대한 길항제(antagonist)를 포함하는, 간 섬유화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 마이크로RNA-192(miR-192)에 대한 길항제를 간 섬유화가 진행되는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 섬유화의 치료방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 구현예는 마이크로RNA-192(miR-192)에 대한 길항제(antagonist)를 포함하는, 간 섬유화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, “마이크로RNA(micro RNA)”란, 표적 mRNA의 번역을 저하 또는 억제를 통해서, 서열-특이적 방법으로 세포의 유전자발현을 억제하는 내인성의 작은 비-코딩 RNA를 의미한다.

본 발명의 “마이크로RNA-192(miR-192)”는 “마이크로RNA-192”와 “miR-192”는 혼용될 수 있으며, 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 핵산 분자로 존재할 수 있다. miR-192와 관련하여, miR-192의 발현을 통해 대장암을 조절하는 기작에 대해 보고된 바 있으며, miR-192가 폐암 세포의 사멸(apoptosis)를 유도하고 세포 증식을 억제하는데 관련이 있음에 대해 보고된 바 있으나, 간 섬유화의 진행을 촉진하는데 관여하는 것에 대해서는 보고된 바 없다.

miR-192의 성숙(mature) 마이크로RNA 분자는 단일 가닥으로 존재할 수 있으며, 전구체 마이크로RNA 분자는 이중가닥 부분을 형성할 수 있는 자가-상보적인(예를 들어 스템- 또는 루프-구조) 구조를 포함할 수 있고 RNA,DNA, PNA(peptide nucleic acids) 또는 LNA(locked nucleic acid) 같은 형태일 수 있다. 구체적으로 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 포함할 수 있다.

본 발명 일 실시예에서는 miR-192를 세포 내 도입하였을 때 Huh-7.5 및 Huh-7 세포 모두에서 간섬유화에 영향을 주는 원인 인자로 알려진 TGF-b1(Transforming growth factor-b1)의 발현이 증가한 것을 확인하였으며(도 3B 및 도3E), miR-192의 길항제인 antago-miR-192를 세포 내로 도입하였을 때, miR-192 뿐 아니라 TGF-b1의 발현이 모두 감소된 것을 확인하였다(도 4A 및 도 4B). 또한, TGF-b1의 음의 조절자(negative regulator)인 ZEB1 역시 miR-192를 세포 내로 도입하였을 때 감소하는 것을 확인하였고(도 3C, F), miR-192의 길항제인 antago-miR-192를 도입하였을 때 증가하는 것을 확인하였다(도 4D). 상기와 같은 결과로부터 miR-192를 억제함으로써 간 섬유화 진행에 있어서 주요 원인 인자인 TGF-b1의 발현을 TGF-b1의 음의조절자인 ZEB1의 증가를 통하여 감소시켜 간 섬유화 진행을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명에서 용어, “길항제(antagonist)”는 표적 물질의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로 감소시킬 수 있는 분자를 의미하며, 이에 제한되지는 않으나 핵산 분자, 단백질 분자, 합성물 등의 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 “마이크로RNA-192(miR-192)에 대한 길항제”는 miR-192에 대한 안티센스 서열을 포함하는 핵산 분자일 수 있다. 상기 핵산 분자는 이에 제한되지는 않으나 DNA, RNA 또는 DNA-RNA 하이브리드 형태일 수 있으며, 구체적으로 상기 miR-192에 대한 안티센스 서열은 서열번호 2로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 길항제는 TGF-b1의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 간 섬유화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 miR-192에 대한 길항제 뿐 아니라 miR-192의 감소 효과를 증가시킬 수 있는 여타의 물질, 예를 들어 화합물, 천연물, 신규 단백질 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "간 섬유화"는 손상된 간 조직이 정상적인 간세포로 복구되지 않고 콜라겐과 같은 섬유 조직으로 변형된 상태를 말한다. 주로 간손상으로 인한 간세포 괴사 이후에 나타나며, 영역 1(zone 1)의 문맥-문맥 섬유상 가교(portal-portal fibrous bridges)를 일으키는 경계면 간염이 생긴 이후에 나타나는 것으로 알려져 있다. 구체적인 관련 질환으로 간경변 또는 간경화 등이 있다.

본 발명에서, “간경변”또는 “간경화”는 간염 등으로 인한 간세포의 지속적인 파괴와 반복적인 미만성 간손상과 이에 따른 섬유화 현상(liver fibrogenesis) 및 재생결절(nodule)이 나타나는 간 질환을 말한다. 주로 간이 굳어지고 간의 모양이 일그러지며, 간소엽의 구조가 대부분 파괴되어 문맥역과 중심정맥의 입체적 위치관계가 파괴되는 병증으로, 약 20 내지 40%가 간암으로 진행되는 것으로 알려져 있다. 간 섬유화가 진행되어 간경변 또는 간경화에까지 이르는 경우 정상간으로 복원되기 어려운 특징이 있는바, 간 섬유화의 진행 과정을 표적으로 하는 본 발명의 약학적 조성물을 이용하여 치료할 수 있다.

본 발명의 용어, "예방"은 본 발명에 따른 간 섬유화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 투여로 간 섬유화를 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "치료"는 본 발명에 따른 간 섬유화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 투여로 간 섬유화를 호전시키거나 간 섬유화가 진행되는 세포를 정상 세포로 전환하는 등 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

아울러, 본 발명의 간 섬유화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 칼슘 카보네이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제의 예로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 있으며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로즈 또는 락토스, 젤라틴 등을 혼합하여 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 마이크로RNA-192(miR-192)에 대한 길항제를 간 섬유화가 진행되는 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 섬유화의 치료방법을 제공한다. 구체적인 관련 질환으로 간경변 또는 간경화 등이 있다. 상기 길항제는 miR-192에 대한 안티센스 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 miR-192에 대한 안티센스 서열은 서열번호 2로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 성별, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 암을 가진 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 치료용 조성물을 개체에게 투여함으로써, 암을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 치료방법은 인간을 제외한 동물을 치료하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 인간의 경우 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있음을 고려할 때, 인간의 치료에 있어서도 충분히 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 1 내지 10 mg/kg으로, 바람직하게는 1 내지 5 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 치료용 조성물은 단독으로, 또는 공지의 간 섬유화에 대한 치료제를 병용 투여하거나 외과적 수술요법 등의 보조 치료 방법들과 병행하여 사용하여 치료 효과를 증대시킬 수 있다.

본 발명에서는 miR-192에 대한 길항제인 antago-miR-192를 이용하여 miR-192를 억제함으로써 TGF-b1의 발현을 감소시켜 간 섬유화 진행을 억제할 수 있음을 확인하여, 간 섬유화 과정을 표적하여 치료하고 손상된 간세포의 정상세포로의 전환을 유도하는데 활용될 수 있다.

도 1은 HCV 감염에 의한 miR-192, TGF-b1 및 miR-122의 발현 패턴 변화를 나타낸 것이다. 도 1A는 HCV 감염 후 HCV 양성 가닥 게놈의 시간에 따른 카피수 변화를 나타내었으며, 도 1B는 HCV 감염 후 시간에 따른 pri-miR-192의 발현 변화를 나타낸 것이다. 도 1C는 HCV 감염 후 시간에 따른 miR-192의 발현 변화를 나타내었으며, 도 1D는 HCV 감염 후 시간에 따른 TGF-b1의 발현 변화를 나타낸 것이다. 도 1E는 HCV 감염 후 24시간 및 48시간째의 TGF-b1 단백질의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 1F 및 도 1G는 각각 HCV 감염 후 시간에 따른 pri-miR-122및 miR-122의 시간에 따른 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 인간 간암 세포주에서의 TGF-b1에 의한 miR-192의 발현 변화를 나타낸 것이다. 도 2A는 TGF-b1 단백질 처리 후 TGF-b1 mRNA의 수준을 확인한 결과이다. 도 2B는 TGF-b1의 처리 농도에 따른 mature miR-192의 발현 수준을 나타낸 것이다. 도 2C는 TGF-b1의 처리 농도에 따른 ZEB1 mRNA의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 3은 인간 간암 세포주에서의 miR-192 도입에 의한 TGF-b1 및 ZEB1의 발현 수준 변화를 나타낸 것이다. 도 3A 및 도 3D는 각각 Huh-7.5 및 Huh-7 세포에 miR-192가 정상적으로 트랜스펙션 되어 발현되는 것을 확인한 것이다. 도 3B 및 도 3E는 각각 Huh-7.5 및 Huh-7 세포에서 miR-192가 트랜스펙션 되었을 때 TGF-b1의 발현 변화를 나타낸 것이다. 도 3C 및 도 3F는 각각 Huh-7.5 및 Huh-7 세포에서 miR-192가 트랜스펙션 되었을 때 ZEB1의 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 인간 간암 세포주에 antago-miR-192를 트랜스펙션 하였을 때 TGF-b1의 발현 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다. 도 4A는 antago-miR-192에 의해서 miR-192의 발현이 감소한 것을 확인한 결과이다. 도 4B는 antago-miR-192에 의해 TGF-b1 mRNA 발현이 감소된 것을 나타낸 것이다. 도 4C는 ELISA를 통하여 TGF-b1의 단백질 발현 역시 antago-miR-192에 의해 감소한 것을 확인한 결과이다.
도 4D는 antago-miR-192에 의해 ZEB1의 발현이 증가한 것을 나타낸 것이다. 도 4E는 실시예 5에서 사용한 antago-miR-192의 서열 및 구조를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시에 1. 실험방법

1-1. 세포 배양

인간 간암 세포주인 Huh-7 세포, Huh-7.5세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 스트렙토마이신/페니실린(streptomycin/penicillin)이 첨가된 배지인 DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)을 이용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였고, 2-3일마다 계대배양하였다. 계대배양시 배지를 버리고 1x PBS(8g NaCl, 0.2g KH₂PO₄, 1.14g Na₂HPO₄, 0.2g KH₄PO₄/L) 5ml로 세포를 씻어준 후 1x 트립신(Trypsin) 1ml을 처리하여 CO₂ 인큐베이터에 1분간 두었다. 배지 9ml로 트립신을 불활성화시킨 후 1500rpm으로 2분 30초간 원심 분리하여 세포를 침전시킨 후 상층액을 제거하고 배지 10ml로 재현탁(resuspension)하였다. 매 계대배양시 새로운 100mm 디쉬(dish)에 1/3을 분주하여 배양하였다.

1-2. 마이크로 RNA ( miRNA ) 및 항-마이크로 RNA ( anti - miRNA ) 도입( transfection )

Huh-7 세포, Huh-7.5 세포를 6-웰에 4X10⁵ 개씩 분주한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. miRNA 혹은 anti-miRNA 50 pmole과 serum free media(SFM) 100ul를 1.5ml 튜브에 넣고 섞었다. 리포펙타민(Lipofectamin)2000 5ul와 SFM 100ul를 새로운 1.5ml 튜브에 넣고 섞은 후 5분 동안 상온에서 보관하였다. 리포좀(liposome)형태로 복합체를 이룰 수 있도록 각 튜브의 mixture를 혼합한 후 20분 동안 상온에서 보관하였다. 10초간 원심 분리 후 각각 세포 위에 뿌려 트랜스펙션(transfetion)하였다. 5% CO₂인큐베이터에서 배양한 후 새로운 배지로 갈아주고 밤새 배양하였다.

1-3. TGF - b1 단백질의 처리

Huh-7 세포, Huh-7.5 세포를 12-웰에 2X10⁵ 개씩 분주한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. TGF-b1 단백질을 처리하기 전 16시간 이상 serum starvation을 주었고, 각각 1ng/ml, 5ng/ml, 10g/ml 및 25ng/ml의 농도로 처리하기 위해 0.1% BSA가 섞인 PBS로 희석하여 완전배지(complete media)와 섞어 처리하였다. 이후 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였고, 72시간 후에 수득하였다.

1-4. Total RNA 분리

miRNA, anti-miRNA 또는 TGF-b1이 처리된 세포를 1x PBS 1ml로 2번 씻어낸 후 트리졸(trizol)을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 트리졸 500ul~1ml을 처리 한 후 5분간 상온에서 둔 후 1.5ml 튜브에 옮겼다. 이후 클로로포름(chloroform) 100ul~200ul를 첨가한 후 볼텍스(vortex)하고, 4℃, 13,000rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 상층액을 새로운 1.5ml 튜브에 옮기고 에탄올 침전시킨 후DEPC(Diethylpyrocarbonate) dH₂O 에 녹였다. 그 후 DNaseI을 처리하여 남아 있을지도 모르는 genomic DNA를 제거한 후 역전사(reverse transcription)하였다.

1-5. Real - time PCR

역전사를 통해 합성된 cDNA를 real-time PCR하였다. cDNA 2㎕, 10x PCR buffer, dNTP 10mM, 정방향 및 역방향 프라이머 각각 10pmole, taq polymerase 2.5unit, 10x cybergreen 1㎕씩 넣고 dH₂O로 70㎕를 만들어 20㎕씩 분주하여 real time PCR을 수행하였다. real time PCR 조건은 enzyme activation 95℃, 10분 / denaturation 95℃, 30초 / anneal 58℃, 30초 / extend 72℃, 30초 / 40사이클로 하였다. 유전자에 대한 internal control로는 18s 유전자를 이용하였다.

miR-192는 mature miR-192 probe(ABI, TM000491)를 이용하여 합성한 cDNA 2㎕, 20x Taqman small RNA assay 3.5㎕, 2x Taqman Universal PCR Master Mix II(ABI) 35㎕를 넣고 dH₂O로 총 70㎕를 만들어 섞고 20㎕씩 분주하여 Real time PCR(enzyme activation-95℃, 10분 / denaturation-95℃, 15초 / anneal:extend-60℃, 60초/ 40cycle)을 수행하였다.

miR-122는 mature miR-122 probe(ABI, PN4427975)를 이용하여 상기 miR-192와 동일한 방법으로 cDNA 합성 및 real-time PCR을 수행하였다.

또한 각 유전자에 대한 real-time PCR을 수행하기 위한 프라이머는 하기 표 1에 정리하였다.

유전자	서열번호		서열
TGF-b1	4	Forward	5-CAAGGACCTCGGCTGGAAGTGGA-3
	5	Reverse	5-CCAGGACCTTGCTGTACTGCGTGT-3
ZEB1	6	Forward	5-ACTCTGATTCTACACCGC-3
	7	Reverse	5-TGTCACATTGATAGGGCTT-3
18s	8	Forward	5-CCATCCAATCGGTAGTAG G -3
	9	Reverse	5-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3

1-6. JFH -1 RNA 의 제작

HCV 게놈(genome)을 포함하고 있는 DNA construct를 XbaI을 이용하여 선형화(linearization) 하였다. 상기 선형화 한 DNA 10ug, 2X 전사 버퍼(transcription buffer), 2uM NTPs, RNase 저해제(Inhibitor) 100U 및 T7 polymerase 50U을 혼합하여 37℃에서 3시간 인큐베이션 하였다. 이후 T7 polymerase 50U을 추가하고 37℃에서 3시간 인큐베이션 하고, DNase 처리 후 37℃에서 30분간 인큐베이션 하였다. 이후 80% Acidic phenol을 처리하고 4℃, 13000rpm, 10분간 원심분리 하였다. 이후 아이소프로판올(Isoprophanol)을 2배 volume으로 섞은 후 -80℃ 저장하여 RNA를 합성하였다.

1-7. HCV RNA transfection 및 stable cell 제작

상기 1-6에서 합성한 HCV RNA 10ug을 lipofectamine2000을 이용하여 100mm dish에 분주한 세포에 트랜스펙션 하고, 2~3일에 한 번씩 계대 배양하였으며 이를 4주 동안 진행하였다. 이후 배양된 세포와 배지를 걷어 RNA 추출 및 정제 후 real time PCR을 이용하여 HCV 양성 가닥 게놈을 검출하여 타이터(titer)를 정하고, 이렇게 얻은 상층액을 이용하였다.

상기 real time PCR에 사용한 프라이머는 하기와 같다.

JFH-1 5’ 프라이머: CGACCAGTACCACCATCCTT (서열번호 10)

JFH-1 3’ 프라이머: AGCACCTTACCCAGGCCTAT (서열번호 11)

1-8. 인간 간암 세포로의 HCV 감염

인간 간암 세포인 Huh-7.5 세포를 감염 하루 전에 분주하였다. 하루 후 상기 1-7에서 타이터를 정한 HCV가 포함된 상층액을 이용하여, 10 MOI(multiplicity of infection)로 맞추어 DMEM 배지와 함께 처리하고, 6시간 후에 새로운 DMEM 배지로 교체하였다. 이후 시간에 따라 세포를 수득하여 RNA를 분석하였다.

1-9. TGF - b1 ELISA

TGF-b1 ELISA kit(R&D system, DB100B)을 이용하여 세포에 HCV 감염시킨 후 배지로 분비된 TGF-b1을 측정하였다.

구체적으로, 상기 배지 100ul에 염화나트륨(NaCl)을 섞은 뒤 5분 동안 인큐베이션 한 후 1.2N NaOH/0.5 M HEPES 를 넣어 샘플을 준비하였다.

Standard로 이용한 TGF-b1 단백질을 정량 별로 준비하고, microplate strips에 Assay Diluent RD1-21 50ul를 웰에 각각 넣은 후 standard와 샘플을 50ul씩 넣고 섞은 후 2시간 인큐베이션 하였다. 이후 wash buffer 400ul를 각각의 웰에 넣고 4번 반복하여 세척하고, TGF-β1 Conjugate 100ul를 각각의 웰에 넣고 섞은 후 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 다시 wash buffer 400ul를 각각의 웰에 넣고 4번 반복하여 세척하고, Substrate Solution 100ul를 넣고 섞은 후 빛이 들어오지 않게 호일을 덮은 뒤 30분 동안 인큐베이션 하였다. Stop solution 100ul를 넣고, microplate reader기(Eopch, Biotek)로 450nm 파장으로 측정하였다.

실시예 2. C형 간염 바이러스( Hepatitis C virus , HCV ) 감염에 의한 miR -192 및 TGF - b1 의 발현 증가 확인

HCV 감염 후 마이크로RNA와 TGF-b1의 발현 변화를 분석하기 위해 Huh-7.5 세포에서 만들어진 JFH-1 바이러스 파티클(HCV genotype 2a)을 Huh-7.5 세포에 감염시켜 시간별로 마이크로RNA와 TGF-b1 발현의 변화를 qRT-PCR을 이용하여 측정하였다

도 1에 나타난 바와 같이, HCV 양성가닥 게놈(positive strand genome)은 12시간까지 1 x 10⁶ copies/1ug 이하로 감소하다가 24시간째부터 2 x 10⁶ copies/1ug 이상으로 시간에 따라 증가하였다(도 1A). 이로부터 시간이 길어질수록 HCV의 복제가 증가하였음을 알 수 있었다.

pri-miR-192는 HCV 양성가닥 게놈이 증가한 시간인 24시간 내지 48시간을 기준으로 약 1.5배 증가하였고(도 1B), mature miR-192는 HCV 게놈이 감소했던 6시간째까지 70%이상 감소하다가 24시간 경과이후에 증가하여 72시간째에 1.7배 이상 증가함을 확인하였다(도 1C). 이로부터 HCV 복제와 mature miR-192의 발현 패턴이 연관 있음을 알 수 있었다.

TGF-b1 mRNA는 mature miR-192의 발현 변화와 유사하게 24시간 이후 미미하게 증가하다가 72시간째에 2배 증가하였다(도 1D). 또한 TGF-b1의ELISA를 이용하여 TGF-b1 단백질의 양을 측정했을 때 24시간 및 48시간째에서 20 내지 30% 증가한 것을 확인하였다(도 1E). pri-miR-122는 pri-miR-192와 유사한 패턴을 나타내었으나(도 1F), miR-122는 48시간째에 1.5배 증가하였다가 이후에 오히려 감소한 것을 알 수 있었다(도 1G).

실시예 3. TGF - b1 단백질 처리에 의한 miR -192의 발현 증가 확인

인간 간암 세포주인 Huh-7.5 세포에서의 miR-192와 TGF-b1의 직접적인 상호관계를 확인하기 위해 TGF-b1 단백질 처리에 따른 miR-192의 발현 양상을 qRT-PCR을 이용하여 확인하였다.

TGF-b1은 auto-positive feedback 작용을 하는 것으로 잘 알려져 있기 때문에 TGF-b1 단백질 처리 후 TGF-b1 mRNA의 수준을 확인함으로써 TGF-b1 단백질이 제대로 작용하였는지 확인하였다. 그 결과 TGF-b1 단백질에 대한 농도 의존적으로 TGF-b1 mRNA의수준이 증가하는 것을 알 수 있었다(도 2A).

이 때 mature miR-192의 발현은 TGF-b1의 처리 농도가 5ng/ml까지는 증가하다가 10ng/ml부터 감소하였다(도 2B).

TGF-b1의 신호전달은 양의 피드백(positive feedback)과 음의 피드백(negative feedback) 작용으로 TGF-b1이 일정한 수준으로 유지되도록 하는데, TGF-b1 단백질이 고농도로 존재할 때 miR-192이 감소하는 것은TGF-b1 에 의한 음의 피드백 작용으로 여겨진다. 특히 TGF-b1의 음의 조절자(negative regulator)인 ZEB1 역시 TGF-b1 단백질이 저농도 일 때는 감소하였다가 고농도일 때 증가하는 패턴을 나타내었으며(도 2C), 이러한 ZEB1의 패턴 변화로부터도 상기와 같은 miR-192에 대한 TGF-b1 에 의한 음의 피드백 작용을 유추할 수 있었다.

실시예 4. miR -192에 의한 TGF - b1의발현 증가 확인

miR-192가 간섬유화에 영향을 주는 TGF-b1에 직접적으로 영향을 주는지 확인하기 위해 miR-192 duplex RNA를 트랜스펙션하여 TGF-b1의 수준 변화를 real-time PCR을 이용하여 관찰하였다. 우선, 인간 간암 세포주인 Huh-7.5 및 Huh-7 세포에 duplex miR-192 RNA를 도입하였을 때 mature miR-192가 증가한 것으로 보아 duplex miR-192가 정상적으로 트랜스펙션되었음을 확인하였다(도 3A 및 도 3D).

miR-192를 세포 내 도입하였을 때 Huh-7.5 및 Huh-7 세포 모두에서 TGF-b1의 mRNA 발현이 약 1.5배 증가하는 것을 확인하였다(도 3B 및 도3E). 또한 TGF-b1의 음의 조절자인 ZEB1 역시 miR-192의 도입에 의해 Huh-7.5 및 Huh-7 세포 모두에서감소하였다(도 3C 및 도 3F).

상기와 같은 결과로부터 miR-192는 TGF-b1의 음의 조절자인 ZEB1을 억제함으로써 TGF-b1을 증가시킴을 알 수 있었다.

실시예 5. antago - miR -192에 의한 TGF - b1 억제 효과 확인

상기 실시예 1 내지 4를 통해 miR-192에 의해 TGF-b1이 증가하고, TGF-b1에 의해 miR-192가 증가함을 확인하였으며, 이로부터 miR-192와 TGF-b1 사이에 양의 피드백이 존재하는 것을 알 수 있었다.

따라서, miR-192를 억제함으로써 간 섬유화 과정에서의 주요 원인 인자인 TGF-b1의 발현이 억제되는지 확인하기 위하여, Huh-7.5 세포에 antago-miR-192를 트랜스펙션하여 TGF-b1의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 4A에 나타난 바와 같이 antago-miR-192에 의해서 miR-192의 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, 도 4B에 나타난 바와 같이 antago-miR-192에 의해 TGF-b1 mRNA 발현이 감소된 것을 확인하였다.

또한, ELISA를 통하여 antago-miR-192에 의해서 TGF-b1의 단백질 발현 역시 감소한 것을 확인하였으며(도 4C), 상기 실시예 4에서 miR-192의 도입에 의해 감소한 ZEB1의 경우 antago-miR-192의 처리에 의해 반대로 증가함을 확인하였다(도 4D).

상기와 같은 결과로부터 miR-192가 인간 간암 세포주에서의 간 섬유화 진행에 있어서 주요 원인 인자인 TGF-b1의 발현을 증가시키는 것을 확인하였으며, miR-192에 대한 길항제인 antago-miR-192를 이용하여 miR-192를 억제함으로써 TGF-b1의 발현을 감소시켜 간 섬유화 진행을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Composition comprising antago-miR-192 for inhibiting liver fibrosis <130> KPA140890KR <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-192 <400> 1 cugaccuaug aauugacagc c 21 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antago-miR-192 <400> 2 ggcugucaau ucauagguca 20 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-122 <400> 3 uggaguguga caaugguguu ug 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-b1 forward primer <400> 4 caaggacctc ggctggaagt gga 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-b1 reverse primer <400> 5 ccaggacctt gctgtactgc gtgt 24 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZEB1 forward primer <400> 6 actctgattc tacaccgc 18 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZEB1 reverse primer <400> 7 tgtcacattg atagggctt 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S forward primer <400> 8 ccatccaatc ggtagtagg 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S reverse primer <400> 9 gtaacccgtt gaaccccatt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JFH-1 5' primer <400> 10 cgaccagtac caccatcctt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JFH-1 3' primer <400> 11 agcaccttac ccaggcctat 20

Claims (6)

1. 마이크로RNA-192(miR-192)에 대한 길항제(antagonist)를 포함하는, 간 섬유화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 길항제는 miR-192에 대한 안티센스 서열을 포함하는 것인, 간 섬유화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 안티센스 서열은 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 것인, 간 섬유화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 길항제는 TGF-b1(Transforming growth factor-b1)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 간 섬유화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
5. 마이크로RNA-192(miR-192)에 대한 길항제를 간 섬유화가 진행되는 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 섬유화의 치료방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 길항제는 miR-192에 대한 안티센스 서열을 포함하는 것인, 간 섬유화의 치료방법.

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