KR20160028738A - 단방향성 분비 유도성 카테콜이 결합된 키토산 겔을 이용한 내제간엽줄기세포를 연골세포로 분화 촉진시키는 조성물 - Google Patents

단방향성 분비 유도성 카테콜이 결합된 키토산 겔을 이용한 내제간엽줄기세포를 연골세포로 분화 촉진시키는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 카테콜이 결합된 키토산 겔 (catechol-conjugated chitosan gel)을 이용한 내제간엽줄기세포를 연골세포로 분화 촉진시키는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 카테콜이 결합된 키토산 겔에 의한 단방향 분비 유도 효과, 연골 손상부위로의 줄기세포 이동 촉진 효과, 및 연골재생 증진 효과를 확인하였는바, 줄기세포를 이용한 골질환의 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟 치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

단방향성 분비 유도성 카테콜이 결합된 키토산 겔을 이용한 내제간엽줄기세포를 연골세포로 분화 촉진시키는 조성물 {Composition for promoting differentiation of endogenous mesenchymal stem cell to chondrocytes using catechol-conjugated chitosan gel can induce isotropic releasing}
본 발명은 카테콜이 결합된 키토산 겔 (catechol-conjugated chitosan gel)을 이용한 내제간엽줄기세포를 연골세포로 분화 촉진시키는 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 줄기세포 이동 및 분화 촉진물질의 지속적인 단방향성 분비(Anisotropic release)를 유도할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
관절연골의 손상은 원래의 조직으로 재생이 되지 않아 치유가 어렵기 때문에 이 문제를 해결하기 위한 여러 시도가 있어 왔다. 이러한 연골 손상은 관절 연골조직의 외상성 결손이나 점진적인 파괴를 가져오는 골관절염에 의하며 그 빈도가 매우 높으나 원래의 조직인 초자연골로의 재생은 어려우며 연골재생의 분자적 조절기전에 대하여 많이 알려져 있지 않다.
기존 손상관절 치료법으로 약물치료, 자가골 연골 이식술, 골수 천공술 및 인공관절치환술 등이 있으며 이들 중 약물 치료 등의 보존적 치료는 증상 완화를 시켜 제한적인 기능 회복에 한정되고 관절연골의 외상성 결손에 이용하는 자가 골 연골 이식술은 골-연골편 채취로 인한 공여부 손상을 초래하며, 채취양이 제한되는 단점이 있다. 또한, 중등도로 진행된 골관절염에 시행하는 골수 천공술은 원래의 연골조직인 초자연골 대신 섬유연골을 재생시켜 임상 결과가 불량한 단점이 있으며, 현재 진행되고 있는 골관절염에 있어서는 인공관절 치환술을 시행하는 것이 표준적인 치료이나 젊은 환자에 시술하는 경우, 인공관절의 수명이 또한 문제가 된다.
위와 같은 문제점을 해결하기 위해, 최근 자기 복제능력이 있고 여러 조직으로 분화할 수 있으며 많은 양을 공여부의 기능 장애 없이 쉽게 채취 가능한 장점이 있는 줄기세포가 세포 치료에 이상적인 세포원으로 인식되어 이에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 아직까지 연골형성을 위한 인자, 환경 등에 대한 명확한 지식이 부족한 상태이다.
줄기세포를 이용한 세포치료에 있어서, 성체간엽줄기세포는 환자 본인의 몸에서 얻을 수 있으므로, 최근 관심의 대상이 되고 있는 세포획득에 관한 윤리적인 문제에 저촉을 받지 않으며, 자가 복제능력과 배양조건에 따라 골, 연골, 지방, 근육, 건 등 각종의 결체조직으로 분화할 수 있으므로 근골격계 조직의 재생을 위한 아주 유용한 세포원으로 인식되고 있다. 현재까지 진행된 성체 줄기세포에 대한 대부분의 연구들은 골수에서 추출하여 배양된 간엽줄기세포가 이용되고 있으며, 이외에도 골막, 지방조직, 근육 등의 대부분의 근골격계 조직에서도 성체줄기세포가 존재한다고 알려져 있다. 또한, 이러한 조직들 중 골수는 대표적인 줄기세포의 원천이며 연골하골을 천공하면 골수와 연골손상부위와 직접 통하여 결손 부위로 줄기세포가 이동하는 것으로 보고된바 있다.
더욱이, 골관절염과 같은 광범위하고 전반적인 연골손상에 있어서는 세포-이식물에 의한 국소적인 세포치료가 불가능하므로 줄기세포의 자체동원에 의한 연골재생을 통한 치료가 유용하게 이용될 수 있다. 상기 치료에 있어서, 재생 연골의 질을 결정하는 중요한 요소는 동원되어 증식하고 분화하는 줄기세포의 수이므로 많은 세포가 골수로부터 연골결손 부위로 이동하게 하는 기술이 중요하다. 또한, 이동된 줄기세포는 다른 부위로 이동하지 않고 결손부위에 머무르며 그 부위에서 연골로 분화하여야 하므로 세포를 함유하고 분화를 유도할 수 있는 지지체가 필수적인 바, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국 특허공개번호 10-2007-0022976), 아직 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 카테콜이 결합된 키토산 겔에 의한 단방향 분비 유도 효과, 연골손상부위로의 줄기세포 이동 촉진 효과, 및 연골재생 증진 효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 줄기세포 이동 및 분화 촉진물질이 혼합된, 헤파린이 공유결합된 피브린 겔(Heparin-conjugated fibrin gel; HCF) 및 카테콜이 결합된 키토산 겔(catechol-conjugated chitosan gel)을 포함하는, 간엽줄기세포에서 연골세포로의 분화를 촉진시키는 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 골질 환 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 (a) 줄기세포 이동 및 분화 촉진물질이 혼합된, 헤파린이 공유결합된 피브린 겔을 연골손상부위에 접착시키는 단계; 및 (b) 상기 헤파린이 공유결합된 피브린 겔에 카테콜이 결합된 키토산 겔을 접착시키는 단계를 포함하는 간엽줄기세포에서 연골세포로의 분화를 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포 이동 및 분화 촉진물질이 혼합된, 헤파린이 공유결합된 피브린 겔(Heparin-conjugated fibrin gel; HCF) 및 카테콜이 결합된 키토산 겔(catechol-conjugated chitosan gel)을 포함하는, 간엽줄기세포에서 연골세포로의 분화를 촉진시키는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 촉진물질은 PDGF-AA(Platelet Derived Growth Factor AA) 및 TGF-β1(Transforming growth factor beta 1)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것 일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 촉진물질의 단방향 분비(anistotopic release)를 유도하는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 골질환 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 골질환은 골 관절염일 수 있다.
본 발명은 (a) 줄기세포 이동 및 분화 촉진물질이 혼합된, 헤파린이 공유결합된 피브린 겔을 연골손상부위에 접착시키는 단계; 및 (b) 상기 헤파린이 공유결합된 피브린 겔에 카테콜이 결합된 키토산 겔을 접착시키는 단계를 포함하는 간엽줄기세포에서 연골세포로의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (a) 단계에서, 상기 촉진물질은 PDGF-AA 및 TGF-β1로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 방법은 촉진물질의 단방향 분비(anistotopic release)를 유도하는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 조성물을 개체의 연골손상 부위에 접착시키는 단계를 포함하는 골질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 줄기세포 이동 및 분화 촉진물질이 혼합된, 헤파린이 공유결합된 피브린 겔(Heparin-conjugated fibrin gel; HCF) 및 카테콜이 결합된 키토산 겔(catechol-conjugated chitosan gel)을 포함하는, 조성물의 골질환의 치료용도를 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 줄기세포 이동 및 분화 촉진물질이 혼합된, 헤파린이 공유결합된 피브린 겔(Heparin-conjugated fibrin gel; HCF) 및 카테콜이 결합된 키토산 겔(catechol-conjugated chitosan gel)을 포함하며, 카테콜이 결합된 키토산 겔에 의한 단방향 분비 유도 효과, 연골손상부위로의 줄기세포 이동 촉진 효과, 및 연골재생 증진 효과를 확인하였는바, 줄기세포를 이용한 골질환 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 (A) 카테콜이 결합된 키토산 겔(catechol-conjugated chitosan gel) 장벽이 없는 기존 연골재생 모델, 및 (B) 카테콜이 결합된 키토산 겔 장벽을 이용한 연골재생 모델을 나타낸 결과이다.
도 2는 (A) 카테콜이 결합된 키토산 겔의 외관을 육안으로 관찰한 결과, (B) 증류수와 배양액(혈액)에 각각 6시간 동안 반응시킨 경우, 탄성율의 변화를 비교한 결과, (C) 혈액 접촉 전, 카테콜이 결합된 키토산 겔의 구조변화를 전자현미경으로 관찰한 결과, 및 (D) 혈액 접촉 후, 카테콜이 결합된 키토산 겔의 구조변화를 전자현미경으로 관찰한 결과이다.
도 3은 (A) 형광고분자의 단방향 분비를 확인하기 위해 임의로 제작된 시험장치의 모식도, (B) Rho-Dex의 방향성을 형광이미지 측정장치로 확인한 결과, 및 (C)~(H) NIH3T3 세포의 이동성을 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 4는 (A) pGL4 (Promega) 벡터에 루시퍼레이즈 유전자(Fluc)를 삽입시킨 pFU-FGW 벡터의 모식도, (B)~(C) GFP 렌티바이러스 감염 줄기 세포에서의 GFP 및 루시퍼레이즈의 발현을 확인한 결과, 및 (D) CellVue (Sigmal)를 이용하여 세포막을 형광 표지한 후, 최종 이식될 줄기세포의 형광표지 정도를 형광 이미지 측정장치로 확인한 결과이다.
도 5는 골수강 내 이식된 간엽줄기세포가 연골 손상부위로 이동을 촉진시키는 과정을 생체 내에서 모니터링하기 위한 실험의 모식도이다.
도 6은 (A) 이식된 간엽줄기세포의 이동현상을 시간별로 측정한 Bioluminescence 이미지 결과, (B) femur를 적출하여 측정한 형광이미지 결과, 및 (C) femur를 적출하여 측정한 형광이미지를 정량화한 결과이다.
도 7은 (A) 연골손상 부위에서 카테콜이 결합된 키토산 겔 장벽을 처리에 의해 재생된 연골의 형태학적 분석을 수행한 결과, (B) 사프라닌-O 염색법을 이용한 연골의 재생정도를 비교한 histology 분석결과, 및 (C) 재생된 연골의 ICRS macroscopic Score 및 Wakitani histological Score 결과이다.
도 8은 (A) 재생된 연골조직 내 이동되어 잔류하고 있는 사람줄기세포를 검출한 결과, 및 (B) 현미경의 40X 배율내에 존재하는 형광검출세포수를 측정한 결과이다.
본 발명자들은, 카테콜이 결합된 키노산 겔의 구조적 특성을 확인하였으며, 상기 구조에 기인한 고분자의 단방향 분비 효과 및 세포 이동 조절 효과를 확인하였다, 또한, 동물실험을 통하여, 카테콜이 결합된 키토산 겔에 의한 줄기세포의 이동 촉진 효과 및 연골재생 증진 효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 줄기세포 이동 및 분화 촉진물질이 혼합된, 헤파린이 공유결합된 피브린 겔(Heparin-conjugated fibrin gel; HCF) 및 카테콜이 결합된 키토산 겔(catechol-conjugated chitosan gel)을 포함하는, 간엽줄기세포에서 연골세포로의 분화를 촉진시키는 조성물을 제공한다.
광범위하고 전반적인 연골손상에 있어서는 효과적인 치료를 위하여 줄기세포가 이용되고 있으나, 기존의 줄기세포를 이용한 치료는 줄기세포 이동 촉진 또는 분화 유도인자들을 양방향으로 분비(isotropic release)하기 때문에 상기 인자들의 소모속도가 빨라 연골 손상 부위로 이동된 줄기세포가 연골 손상 부위가 아닌 타조직으로 분산될 가능성이 커지게 되는 문제점을 가지고 있었다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 고안된 본 발명은 카테콜이 결합된 키토산 겔을 접착시킴으로써, 줄기세포 이동 및 분화 촉진물질을 단 방향으로 분비(anistotopic release)하도록 하여, 연골 손상부위로 줄기세포 이동을 촉진시키고 궁극적으로는 연골 재생을 증가시킴에 특징이 있다.
본 발명에 따른 조성물의 대상인 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 성체 줄기세포는 바람직하게는 골수, 근육, 지방, 제대혈, 양막, 또는 양수로부터 분리된 중간엽 줄기 세포 또는 간질세포, 상기 세포로부터 유래된 연골세포로 분화될 수 있는 전구세포, 상기 세포로부터 분화된 연골세포, 연골조직으로부터 분리된 초대 연골세포 등이 사용될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 세포의 분리, 증식 및 연골세포로의 분화는 당분야에 공지된 임의의 방법에 따라 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 헤파린이 공유 결합된 피브린 겔(Heparin-conjugated fibrin gel; HCF)은 상온에서 트롬빈 존재하에 피브리노겐의 효소적 중합 반응에 의해 겔(gel)을 형성하는, 피브린과 글리코사미노 글리칸의 일종으로서, 황산기를 다량으로 포함하여 고도로 음전하를 띄는 성질 때문에 특정 부류의 헤파린 결합성 단백질과 결합하는, 헤파린간의 결합에 의해서 제조되며, 상기 헤파린이 공유 결합된 피브린 겔은 줄기세포 이동 및 분화 촉진물질과 결합되어 이들의 초기 과다 방출을 막고 지속적인 방출을 유도하는 역할을 한다.
또한, 본 발명에 따른 줄기세포 이동 및 분화 촉진물질은 IL-8, 란테스(Rantes), MIP-3β(Monocyte inflammatory protein-3β), SDF-1α(Stromal cell-derived factor-1α), BCA-1(B cell attracting chemokine-1), CCL2(케모카인 (C-C 모티프) 리간드2), CCL20(케모카인(C-C 모티프) 리간드2), CXCL16(케모카인 C-X-C 모티프 리간드 16), CXCL12(케모카인 C-X-C 모티프 리간드 12), 내피세포 증식 인자(Endothelial growth factor;EGF), b-FGF (basic Fibroblast Growth Factor), 간세포 생장인자(Hepatocyte growth factor;HGF), TGF-β1(Transforming growth factor beta 1), IGF-1(Insulin-like growth factor 1), PDGF-AB(Platelet Derived Growth Factor AB), PDGF-AA(Platelet Derived Growth FactorAA) 및 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)일 수 있으나, 바람직하게는 PDGF-AA(Platelet Derived Growth FactorAA) 및 TGF-β1(Transforming growth factor beta 1)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 물질일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 있어서, (a) 줄기세포 이동 및 분화 촉진물질이 혼합된, 헤파린이 공유결합된 피브린 겔을 연골손상부위에 접착시키는 단계; 및 (b) 상기 헤파린이 공유결합된 피브린 겔에 카테콜이 결합된 키토산 겔을 접착시키는 단계를 포함하는 간엽줄기세포에서 연골세포로의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서는 카테콜이 결합된 키토산 겔을 제조하여(실시예 1 참조), 높은 탄성율과 구조의 불투과성을 확인하였으며(실시예 2 참조), 고분자의 단방향 분비 효과 및 세포이동 억제 효과를 확인하였다(실시예 3 참조). 또한, 루시퍼레이즈(Luciferase) 및 GFP(Green fluorescence protein)가 동시에 발현될 수 있는 렌티바이러스 감염 줄기세포 제작하여(실시예 4 참조), 동물모델 실험에서 카테콜이 결합된 키토산 겔에 의한 줄기세포의 이동 촉진 효과 및 연골재생 증진 효과를 확인하였는바, 줄기세포를 이용한 골질환 치료용 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다(실시예 5 내지 7 참조).
따라서, 본 발명은 줄기세포 이동 및 분화 촉진물질이 혼합된, 헤파린이 공유결합된 피브린 겔(Heparin-conjugated fibrin gel; HCF) 및 카테콜이 결합된 키토산 겔(catechol-conjugated chitosan gel)을 포함하는, 간엽줄기세포에서 연골세포로의 분화를 촉진시키는 조성물을 포함하는 골질환 치료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 조성물을 연골 손상부위에 접착시킴으로써, 골질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, 본 발명에 따른 치료의 대상인 골 질환은 조골세포의 활성 촉진으로 골량 증가가 필요 또는 요구되는, 상태 또는 질병을 의미하는 것으로 골량 저하 질환을 포함하며, 바람직하게는 골관절염 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 조성물을 개체의 연골 손상부위에 접착시키는 단계를 포함하는 골질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse, 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 카테콜이 결합된 키토산 겔의 제조
카테콜이 결합된 키토산 겔의 제조를 위해 먼저 키토산 (1g)을 0.1N HCl 용액 (100 ml, pH 5.0)에 분해하여 키토산 용액을 제조하였고, 상기 용액을 Hydrocaffeic acid (1.18 g)과 EDC (1.24 g)이 녹아있는 50% 에탄올 (50 ml)에 천천히 섞어 12 시간 동안 반응시켰다. 이 후, pH 4.0 NaCl 용액에서 2일 동안 투석하고 다시 4시간 동안 증류수 안에서 투석한 후, 동결 건조시켜 완성하였다.
실시예 2. 카테콜이 결합된 키토산 겔의 구조적 특성 확인
카테콜이 결합된 키노산 겔의 구조적 특성을 확인하기 위하여, 증류수를 대조군으로 설정하여 카테콜이 결합된 키노산 겔을 증류수와 배양액(혈액)에 각각 6시간 동안 반응시킨 후, 탄성율을 비교하였으며, 배양액 접촉 전후의 구조 변화를 전자현미경를 통하여 확인하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 배양액에 반응시킨 카테콜이 결합된 키노산 겔은 증류수와 반응시킨 겔과 비교하여 약 33배가량 높은 탄성율을 나타냈다. 또한, 전자현미경을 통하여 관찰한 결과, 배양액(혈액)접촉 후, 고분자나 세포의 투과가 불가능한 필름형태의 견고한 구조가 형성됨을 확인하였다.
상기 결과는 본 발명의 카테콜이 결합된 키노산 겔은 생체 내에서 손상된 연골 부위에 부착되어 고분자나 세포의 이동에 영향을 미치는 구조를 형성할 수 있음을 의미한다.
실시예 3. 카테콜이 결합된 키토산 겔 장벽에 의한 단방향 분비능 및 세포이동 조절효과 확인
상기 실시예 1의 카테콜이 결합된 키노산 겔의 구조적 특성에 기인한 고분자의 단방향 분비를 확인하기 위하여, 고분자 Rho-Dex를 이용하여 이미지화시켰다. 보다 구체적으로, 형광고분자인 Rho-Dex 10 mg을 1 ml HCF에 녹이고 피브린 용액과 2:6 (HCF : Fibrin)의 비율로 섞은 후, 이의 겔화 유도를 위해 다시 트롬빈과 1:1의 비율로 섞어 이를 시험튜브안에 넣어 굳히고 반대쪽 면에는 카테콜이 결합된 키노산 겔를 처리하여 장벽을 만든 후, 48시간 동안 HCF로부터 분비되는 Rho-Dex의 방향성을 형광이미지 측정장치로 확인하였다.
또한, 카테콜이 결합된 키노산 겔의 세포이동 조절효과를 확인하기 위하여, 세포배양용기 중간의 카테콜이 결합된 키노산 겔 장벽을 기준으로 한쪽면에만 NIH3T3 세포를 접종하고 6시간 동안 배양하였다. 이 후, 접종한 면과 접종하지 않은 면에서 NIH3T3 세포 존재를 현미경으로 확인함으로써 세포의 이동여부를 확인하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, HCF로부터 분비되는 Rho-Dex는 카테콜이 결합된 키노산 겔 장벽이 존재하지 않는 방향으로만 분비가 유도되었으며, 세포를 접종하지 않은 겔 장벽 반대쪽 면에서는 이동되어 온 세포가 전혀 발견되지 않는 것을 확인하였다.
상기 결과는 카테콜이 결합된 키노산 겔 장벽을 이용함으로써 고분자의 분비능력을 한쪽 방향으로만 유지시켜줄 뿐만 아니라 세포의 이동도 억제할 수 있음을 의미한다.
실시예 4. Luc-GFP 렌티바이러스 감염 줄기 세포의 제조 및 확인
간엽줄기세포가 연골 손상 부위로 이동되는 것을 생체 내에서 모니터링하기 위하여, 루시퍼레이즈(Luciferase) 및 GFP(Green fluorescence protein)가 동시에 발현될 수 있는 렌티바이러스 감염 줄기세포를 제작하였다.
우선, 본 실시예에서의 렌티바이러스 벡터는 pFUGW (Addgene)를 backbone으로 재조합되었으며, pGL4 (Promega) 벡터로부터 반딧불 루시퍼레이즈 (Firefly luciferase) 유전자를 sense primer 5'-GGATCCAT GGAAGATGCCAAAAACAT-3'(서열번호 1) 와 antisense primer 5'-AC CGGTCACGGCGATCTTGCCG-3'(서열번호 2)를 이용하여 PCR 증폭으로 확보하고, 이 증폭된 루시퍼레이즈 유전자는 pFUGW 벡터의 BamHI-AgeI 효소부위에 결합시켜 pFU-FGW 벡터를 완성시켰으며, 대략적인 모식도는 도 4A에 나타내었다. 또한, 상기 pFU-FGW 벡터를 이용하여 생산된 Luc-GFP 렌티바이러스의 기능성을 확인하기 위하여, Luc-GFP 렌티바이러스를 인간 간엽 줄기 세포에 감염시킨 후, 도 4B 및 4C에 나타낸 바와 같이, 줄기세포의 GFP 및 루시퍼레이즈의 발현을 확인하였다. 아울러, Luc-GFP 렌티바이러스 감염 줄기세포를 이용하여 실험동물에 이식 전 회수된 세포에 CellVue (Sigmal)를 이용하여 세포막을 형광 표지한 후, 최종 이식될 줄기세포의 형광표지 정도를 측정하였으며, 도 4D에 나타낸 바와 같이, 동물모델에 사용될 줄기세포는 루시퍼레이즈를 발현하여 Bioluminescence 이미징이 가능할 뿐만 아니라 세포막에 Cy5.5 형광표지까지되어 있으므로 Fluorescence 이미징도 가능한 듀얼 검출시스템의 사용이 가능함을 확인하였다.
실시예 5. 카테콜이 결합된 키토산 겔 장벽에 의한 연골 손상부위로의 이식된 줄기세포 이동 촉진효과 확인
골수강 내 이식된 형광표지 간엽줄기세포가 연골 손상 부위로 이동되는 것을 생체 내에서 모니터링하였다. 면역억제 쥐의 연골에 드릴을 이용하여 1.5 × 1.5 × 1 mm의 손상을 만들고 골수강으로 이어지는 구멍을 만들어 대퇴부 골수강 안쪽에 Luc-GFP 렌티바이러스 감염 및 형광표지된 간엽줄기세포 (10 ㎕)를 마트리겔 (Matrigel 10 ㎕)과 동량으로 섞어 이식한 후에 연골 손상부위를 헤파린이 공유결합된 피브린겔 (Heparin-conjugated fibrin gel)로 막고 최외각에 카테콜이 결합된 키토산 겔 패치(가로 3 x 세로 4 cm)를 증류수를 뿌려 접착시키고 상처를 봉합하였다. 이 후, 이식된 간엽줄기세포의 이동현상을 시간대별(1, 3, 7, 14일)로 측정하였으며, 수술 6주 후, 실험동물로부터 수술부위가 존재하는 각 그룹의 femur를 적출하여 이들의 형광이미지 분석을 수행하고 그 결과를 정량화하였다.
도 6A에 나타낸 바와 같이, 헤파린이 공유결합된 피브린 겔만을 이식한 그룹(G1)에서는 이식된 세포가 시간에 따라 점차 사라지는 반면, 헤파린이 공유결합된 피브린겔로부터 PDGF-AA가 방출되는 그룹(G2-G4)에서는 형광표지된 간엽줄기세포가 시간에 따라 점차적으로 연골 손상부위로 이동되는 결과를 확인하였다. 특히, 카테콜이 결합된 키토산 겔 장벽을 처리한 실험군(G4)에서는 단방향으로 TGF-β1 및 PDGF-AA이 분비되어 연골 손상부위로 이식된 줄기세포의 이동속도가 가장 빨랐을 뿐만 아니라 지속적으로 연골 손상부위에서 세포의 루시퍼레이즈 신호가 검출되는 것을 확인하였다.
또한, 도 6B 및 6C에 나타낸 바와 같이, 카테콜이 결합된 키토산 겔 장벽을 처리한 실험군(G4)의 femur에서 가장 높은 형광이 검출되었으며 이를 처리하지 않은 실험군 (G2, G3) 대비 2.5배 이상 더 강한 형광이 검출되는 것을 확인하였다.
상기 결과는 기존 고가의 형광나노입자를 이용하여 간엽줄기세포를 형광표지하는 방법 이외에도 현재 개발된 bioluminescence와 fluorescence 듀얼 이미징 시스템으로도 연골 손상부위로 골수 내 이식된 간엽줄기세포의 이동촉진을 유발하는 물질을 보다 저렴한 비용으로 스크리닝할 수 있으며, 카테콜이 결합된 키토산 겔 장벽의 처리는 기존 모델 (G3) 대비 연골 손상부위로의 이식된 세포의 이동촉진 능력을 2배 이상 향상시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 6. 연골 손상부위에서 카테콜이 결합된 키토산 겔 장벽에 의한 연골 재생효과 확인
상기 실시예 4에서 연골부위로 이동이 촉진된 간엽줄기세포가 실제로 연골 손상 부위에서 연골 분화를 촉진할 수 있는지 확인하기 위하여, 간엽줄기세포 이식 42일 후에 각 그룹(G1 내지 G4)에 대한 재생된 연골의 형태학적 분석을 수행하였다. 또한, 이들의 파라핀 조직을 사프라닌-O 염색법을 이용하여 염색한 후, 연골의 재생정도를 확인하였으며, 연골의 질적 수준을 ICRS macroscopoc score 및 Wakitani histological score를 통하여 확인하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 형태학적으로 다른 그룹 대비 카테콜이 결합된 키토산 겔 장벽 처리군(G4)이 주변 연골조직과 매우 유사한 초자연골 형태로 재생되어 있음을 확인하였으며, 사프라닌-O 염색을 통해 연골재생 정도가 견고하고 부드럽게 재생되어 있음을 확인하였다. 또한, 카테콜이 결합된 키토산 겔 장벽 처리군(G4)에서 다른 그룹대비 가장 높은 ICRS macroscopic 스코어 결과와 가장 낮은 Wakitani histological 스코어 결과를 나타내어 재생된 연골의 질적 수준이 우수함을 확인하였다.
상기 결과는 카테콜이 결합된 키토산 겔 장벽 처리에 의해 이동이 촉진된 간엽줄기세포들이 손상된 연골의 재생에 있어서 효과적임을 의미한다.
실시예 7. 재생된 연골부위에 이동된 인간 줄기세포 확인
상기 실시예 5에서 재생된 연골부위의 인간 줄기세포를 확인하기 위하여, 1차 항체로 사람 세포 특이적 항체 (Anti-human nuclei antibody)와 2차 항체로 biotinylated anti-mouse antibody를 이용하여 이미지화 시킨 후, 현광현미경으로 관찰하였다. 또한, 각 처리군에서 현미경의 40X 배율 내에 존재하는 형광검출세포수를 측정하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 골수 조직내에서 다량의 사람 골수줄기세포가 잔존하는 것을 확인하였으며, 다른 그룹 대비 카테콜이 결합된 키토산 겔 장벽 처리군(G4)의 지정된 골수 내에 잔존하는 세포 수가 G2 그룹 대비 3.4배, G3 그룹 대비 2.8배 더 유의적으로 많음을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition for promoting differntiation of mesenchymal stem cell to chondrocytes comprising catechol-conjugated chitosan gel <130> PB14-12217 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Firefly luciferase sense primer <400> 1 ggatccatgg aagatgccaa aaacat 26 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Firefly luciferase antisense primer <400> 2 accggtcacg gcgatcttgc cg 22

Claims (8)

  1. 줄기세포 이동 및 분화 촉진물질이 혼합된, 헤파린이 공유결합된 피브린 겔(Heparin-conjugated fibrin gel; HCF) 및 카테콜이 결합된 키토산 겔(catechol-conjugated chitosan gel)을 포함하는, 간엽줄기세포에서 연골세포로의 분화를 촉진시키는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 촉진물질은 PDGF-AA(Platelet Derived Growth Factor AA) 및 TGF-β1(Transforming growth factor beta 1)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 촉진물질의 단방향 분비(anistotopic release)를 유도하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제 1항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 골질환 치료용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 골질환은 골관절염인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 하기의 단계를 포함하는 간엽줄기세포에서 연골세포로의 분화를 촉진시키는 방법:
    (a) 줄기세포 이동 및 분화 촉진물질이 혼합된, 헤파린이 공유결합된 피브린 겔을 연골 손상부위에 접착시키는 단계; 및
    (b) 상기 헤파린이 공유결합된 피브린 겔에 카테콜이 결합된 키토산 겔을 접착시키는 단계.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서, 상기 촉진물질은 PDGF-AA 및 TGF-β1로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 방법은 촉진물질의 단방향 분비(anistotopic release)를 유도하는 것을 특징으로 하는, 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101399696B1 (ko) * 2012-05-07 2014-05-27 동국대학교 산학협력단 연골손상부위로 줄기세포의 이동을 촉진시키는 물질의 스크리닝 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biomacromolecules. 2011. Vol.12, pp.2653-2659.* *
Biomaterial Science. 2013. Vol.1, pp.783-790.* *
Molecular Therapy. 2012. Vol.20, No7, pp.1434-1442. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116942915A (zh) * 2023-08-09 2023-10-27 山东大学齐鲁医院 骨细胞凝胶培养方法及其在骨包虫病骨缺损中的应用
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