KR20160028053A

KR20160028053A - 점막점착성 고분자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160028053A
Application number: KR1020140116308A
Authority: KR
Inventors: 조종수; 최윤재; 강상기; 비제이 싱
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-09-02
Filing date: 2014-09-02
Publication date: 2016-03-11
Also published as: KR101662898B1

Abstract

본 발명은 글루타치온의 아민기와 유드라짓의 카르복실기의 아마이드 결합으로 티올기가 도입된 점막점착성 고분자 및 이를 이용한 경구백신용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 경구백신용 고분자인 유드라짓의 카르복실기와 글루타치온의 아민기간의 아마이드 결합을 통하여 티올기가 도입된 유드라짓 고분자 물질은 기존의 경구백신용 고분자 물질보다 향상된 점막점착성을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 점막점착성 고분자 물질에 항원 단백질을 담지시킨 타블렛을 마우스 동물모델에 경구투여한 경우, 소화장관 내에서 경구투여된 백신의 체류 시간 및 항체 생산 효율이 매우 향상된 것을 확인함에 따라, 본 발명의 점막점착성 고분자 물질은 항원 단백질 또는 약물을 담지한 경구투여용 백신 조성물로 제공될 수 있다.

Description

점막점착성 고분자 및 이의 용도{Mucoadhesive polymer and use thereof}

본 발명은 점막점착성을 향상시킨 고분자 및 이의 용도에 관한 것이다.

경구백신은 주사로 인한 스트레스가 적을 뿐만 아니라, 경구백신을 통해 점막면역반응이 활성화되면, 분비형 항체인 IgA가 소장 내강에서 병원균을 무력화시켜 병원균이 소장 상피세포를 통과하여 체내로 들어오지 못하도록 막아주기 때문에 병원균을 초도에 방어할 수 있다는 장점이 있다. 따라서 이질, 콜레라 등의 세균 및 바이러스성 수인성 전염병을 감염 경로상에서 직접적으로 차단하고 예방하기 위해서는 주사방식의 백신보다 경구백신을 통해 소화장관 내 점막면역반응을 활성화시키는 것이 효과적이다.

그러나 백신체의 주요 구성요소인 단백질 등은 운송과정 중 위산에 의한 낮은 pH, 소장장관의 각종 영양소 분해효소 등에 의해 변성되어 그 고유 기능을 잃기 쉬우며, 안전하게 소화장관까지 전달되더라도 소장점막층에서의 흡수효율이 낮아 체내로 흡수되는데 문제점을 나타냄에 따라, 현재까지는 주사형 백신보다 효율성이 낮아 경구백신의 활용이 매우 제한적이다.

최근 백신의 경구투여 후 위에서 백신을 보호하기 위해 pH가 5.5보다 낮은 환경에서는 물에 녹지 않고 pH가 5.5보다 높을 경우에는 물에 녹는 고분자인 Hydroxypropyl methylcellulose phthalate(HPMCP), 유드라짓 L-100(Eudragit L-100), 유드라짓 S-10D(Eudragit S-10D) 및 cellulose acetate phthalate등이 사용되었으나, 점막점착성이나 M-cell 특이성을 갖지 못해 효율이 낮은 문제가 있다. 또한 Dea-Ayuela등에 의하면 장에 연충 감염이 되었을 경우, Eudragit L-100 미립자에 백신을 담지한 후 경구투여하면 쥐의 Peyer's patch 내의 CD4+T 세포들이 증가하여 Th1/Th2 면역유도가 일어난다고 보고한 바 있으나, 보다 더 특이적이고 효과적인 면역유도가 필요하다.

또 다른 방법으로 리포좀과 같은 전달체를 이용한 경구백신을 이용하여 점막면역을 일으킬 경우, 주사에 의한 면역유도에 비해 수인성 전염병 예방 측면에 장점이 있으나, 전달 효율이 낮아 많은 양의 백신이 필요하기 때문에 전달체가 점막점착성을 부여하는 전략을 고려해야 할 필요가 있다.

따라서, 소화장관으로 약물 또는 백신 전달체의 장내 체류시간을 연장시키고 체내 흡수효율을 증진시키기 위한 효과적인 방법이 필요한 실정이다.

한국등록특허 제10-0885178호

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 글루타치온의 아민기와 유드라짓의 카르복실기의 아마이드 결합으로 티올기가 도입된 점막점착성 고분자를 제공하며, 본 발명에 따른 점막점착성 고분자에 면역증강용 항원 단백질을 담지시킨 경구백신 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 글루타치온의 아민기와 유드라짓의 카르복실기의 아마이드 결합으로 티올기가 도입된 점막점착성 고분자를 제공한다.

본 발명은 글루타치온의 아민기와 유드라짓의 카르복실기의 아마이드 결합으로 티올기가 도입된 점막점착성 고분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 면역증강용(adjuvant) 조성물을 제공한다.

또한 본 발명의 상기 면역증강용(adjuvant) 조성물 및 항원성 물질을 유효성분으로 함유하는 경구백신용 조성물을 제공한다.

본 발명은 점막점착성을 증가시킨 고분자 및 이를 이용한 경구백신용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 경구백신용 고분자인 유드라짓의 카르복실기와 글루타치온의 아민기간의 아마이드 결합을 통하여 티올기가 도입된 유드라짓 고분자 물질은 기존의 경구백신용 고분자 물질보다 향상된 점막점착성을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 점막점착성 고분자 물질에 항원 단백질을 담지시킨 타블렛을 마우스 동물모델에 경구투여한 경우, 소화장관 내에서 경구투여된 백신의 체류 시간 및 항체 생산 효율이 매우 향상된 것을 확인함에 따라, 본 발명의 점막점착성 고분자 물질은 항원 단백질 또는 약물을 담지한 경구투여용 백신 조성물로 제공될 수 있다.

도 1은 글루타치온을 이용하여 유드라짓에 도입된 티올기를 확인한 NMR분석 결과이다.
도 2는 본 발명에 따라 글루타치온을 이용하여 티올기를 도입한 유드라짓으로 제조된 점막점착성 미립자의 SEM 이미지 사진이다.
도 3은 본 발명의 글루타치온을 이용하여 티올기를 도입한 유드라짓(GE)과 기존의 시스테인을 이용하여 티올기를 도입한 유드라짓(TE)을 돼지 소장 점막에서 점착성을 비교한 결과이다.
도 4는 본 발명의 글루타치온을 이용하여 티올기를 도입한 유드라짓(GE)에 돼지 설사병을 유발시키는 M-BmpB 항원에 대한 면역보조제로 유산균(Lactococcus lactis IL1403-IL6-M)을 담지시켜 제조한 타블렛 사진이다.
도 5는 in vivo에서 도 4와 같이 경구용 백신 조성물로 제작된 타블렛을 돼지 설사병이 유발된 동물 모델에 투입하여 동물의 장내 면역 반응 및 점막점착성을 확인하기 위해 수행된 n vivo 분석 모식도이다.
도 6은 도 5의 동물모델의 분변 및 소장에서 생성된 항체량을 확인한 결과이다.

상기 점막점착성 고분자는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다

[화학식 1]

상기 유드라짓은 유드라짓 L-100, 유드라짓 L-100-55 및 유드라짓 S-100으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 유드라짓 L-100일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

또한 본 발명은 글루타치온의 아민기와 유드라짓의 카르복실기의 아마이드 결합으로 티올기가 도입된 점막점착성 고분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 면역증강용(adjuvant) 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 면역증강용(adjuvant) 조성물 및 항원성 물질을 유효성분으로 함유하는 경구백신용 조성물을 제공한다.

상기 경구백신용 조성물의 항원성 물질은 펩티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 유산균, 항원단백질, 상기 항원단백질을 발현하는 유산균, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 재조합 박테리아 및 재조합 바이러스로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 M cell 표적 펩타이드가 결합된 IL-6를 분비할 수 있는 유산균인 락토코거스 락티스(Lactococcus lactis IL1403-IL6-M)일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 점막점착성 고분자는 항원단백질 또는 유산균을 담지시켜 백신용 미립자 또는 타블렛으로 개발하고 경구투여하여 장내로 전달될 경우, 소화장관을 덮고 있는 점막단백질인 뮤신의 시스테인 아미노산의 티올기와 점막점착성 고분의 티올기가 이황화(disulfide bond)결합을 형성하여 소화장관의 점막에 점착성을 증가시킴으로써, 백신 또는 유산균 체류시간을 증가시켜 장내 면역반응을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 점막점착성이 향상된 GE(Glutathionylated Eudragit)의 점막점착성을 기존의 점막점착성 고분자 물질로 알려진 시스테인을 이용하여 티올기를 도입한 유드라짓 고분자인 TE(Thiolated Eudragit)의 점막점착성과 비교한 결과, 도 3과 같이 돼지 소장에서 GE의 점막점착성이 TE보다 향상된 것을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 GE에 유산균을 담지한 타블렛을 마우스에 경구투여한 in vivo 실험에서도, 도 6과 같이 GE 타블렛을 경구 투여한 마우스 실험군의 소장에서 TE 타블렛을 경구 투여한 마우스 실험군보다 항체(IgA) 생산량 및 생산기간이 매우 증가된 것을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 1. 글루타치온(Glutathion)을 이용한 유드라짓 ( Eudragit ) L-100 에 티올기( thiol group )의 도입

소화 장관으로의 전달을 위한 약물 담지체 개발에 널리 이용되는 유드라짓 L-100(Eudragit L-100) 고분자 물질에 점막점착성을 부여하기 위해 글루타치온(glutathion)을 이용하여 티올기를 도입하였다.

반응식 1 같은 방법으로 하기 화학식 1의 GE(Glutathionylated Eudragit)를 합성하였다.

[반응식 1]

[화학식 1]

먼저, 4 g (0.0215 Mol)의 유드라짓 L-100을 100 ml의 DMSO가 담겨있는 3-neck 플라스크(flask)에 넣어 1시간 동안 용해시킨 후, 30분간 질소가스를 통과시켜 플라스크 내의 산소를 제거하였다. 그 다음, 8.8g의 DCC (N,N’-Dicyclohexyl-carbodiimide) 와 4.9g의 NHS (N-Hydroxysuccinimide)를 플라스크 반응용기에 넣고 질소를 충전시켜 교반(string)하며 하룻밤 동안 실온에서 유지하였다.

반응산물을 90 nm 구멍 크기(pore size)의 필터링 페이퍼을 통과시켜 침전물을 여과한 후, 반응액을 다시 3-neck 플라스크에 옮겨 닮고 질소 가스를 30분간 통과시킨 다음, 1.3g의 글루타치온(glutathione)을 반응용기에 첨가하고 계속하여 질소가스를 충전시켜 산화를 방지하고 교반하면서 2일 동안 실온에서 반응시켰다.

그 다음, 반응산물을 또 한번 90 nm 구멍 크기(pore size)의 필터링 페이퍼을 통과시켜 침전물을 여과 후, 반응액을 MWCO: 12-14000의 투석막에 넣고 DMSO를 사용하여 48시간 투석하여 반응에 참가하지 않은 글루타치온(glutathione)을 제거한 후 증류수(DW)로 48시간 투석하여 DMSO를 제거하고 형성된 흰색 침전물을 얻었다.

얻어진 흰색 침전물을 동결건조하여 최종산물로 티올기가 도입된 GE(Glutathionylated Eudragit)을 얻었다.

¹H600hzNMR을 측정한 결과, 도 1과 같이 GE(Glutathionylated Eudragit)에 도입된 티올기(thiol group)가 전체 유드라짓 L-100의 카복실기의 10 mol%로 도입된 것을 확인하였다.

< 실시예 2> GE ( Glutathionylated Eudragit ) 미립자 제조

0.1 M NaOH 10 mL에 20 mg의 GE(Glutathionylated Eudragit)를 넣고 1 분 동안 초음파처리하여 균질한 혼탁액을 제조하였다. 5 mg의 BSA(모델단백질)을 0.1M의 HCL(5ml)에 용해시킨 것을 주사바늘을 이용하여 100 rpm으로 교반하고 있는 Glutathionylated Eudragit/ NaOH 혼탁액에 한 방울씩 첨가하였다.

그 다음, 0.1M의 HCL을 이용하여 반응용기내의 pH를 4.8로 적정하고 20 분 동안 암 조건의 실온에서 인큐베이션하였다. 그 후, 반응 산물을 0.8 μm 구멍 크기(pore size)의 셀룰로스 아세테이트 막(cellulose acetate membrane)으로 여과하여 나노입자(nanoparticle)을 분리한 후, 동결건조하여 최종 점막점착성 나노입자를 얻었다.

그 결과, 도 2의 SEM 이미지 사진과 같은 점막점착성 나노입자를 확인하였다.

< 실시예 3> GE ( Glutathionylated Eudragit ) 미립자의 점막점착성 확인

GE(Glutathionylated Eudragit)의 점막점착성을 확인하기 위해, 이미 검증 된 점막점착성 고분자 물질인 시스테인(cystein)을 이용하여 티올기(thiol)를 도입한 TE(Thiolated Eudragit)와 비교하였다.

먼저, GE와 TE를 모두 FITC로 라벨링을 진행한 후, 상기 실시예 2와 같은 방법으로 GE의 나노입자를 제조하였으며, 동일한 방법으로 TE 나노입자를 제조하였다.

돼지의 소장 한 조각을 유리 슬라이드(glass slide)에 펴서 고정을 시키고 슬라이드를 수직으로 50 ml 팔콘튜브(falcon tube)에 넣은 후, 30 ml의 PBS로 equilibration을 시킨다. 그 다음, FITC가 표지된 GE 및 TE 나노입자를 팔콘튜브에 넣고 37℃, 50 rpm, 암 조건에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 팔콘튜브 내의 용액을 회수하여 485 nm로 흡광도를 측정하여 소장점막에 부착된 나노입자의 양을 추산하였다.

그 결과, 도 3과 같이 GE(Glutathionylated Eudragi) 나노입자가 점막점착성 능력이 있다고 검증된 TE(Thiolated Eudragit)에 비해 그 점막 점착능력이 높게 나타나는 것을 확인하였다.

< 실시예 4> GE ( Glutathionylated Eudragit )을 이용한 타블렛의 점막점착성 효과 확인

GE(Glutathionylated Eudragi)에 유산균을 담지시켜 타블렛을 제작하고 TE(Thiolated Eudragit)와 점막점착성 능력을 비교하였다. GE 고분자물질을 동결건조된 특정 보조항원(adjuvant)을 분비하는 유산균과 함께 1:1 비율로 섞어서 타블렛팅 하였다. 타블렛팅 조건은 경도(hardness)는 69N으로, 타블렛의 크기는 4 mm로 하였으며, 타블렛에 한 개 당 10⁸CFU의 유산균이 내재되게 하였으며, 그 모양과 형태는 도 4와 같다.

이때 담지시켰던 유산균은 기존의 연구를 통하여 경구백신 면역보조제(adjuvant)로 효과적인 M cell 표적 펩타이드가 결합된 IL-6를 분비할 수 있는 유산균(Lactococcus lactis IL1403-IL6-M)을 사용하였다. 백신의 모델 항원은 M-BmpB로써 부라키스피라 하이오디센테리에(Brachyspira hyodysenteriae)라는 돼지 설사병을 유발하는 박테리아의 표면 막 단백질에 M cell 표적 펩타이드를 결합시킨 항원 단백질을 사용하였다. 이와 같이 제작된 타블렛을 도 5와 같은 방법으로 면역실험을 진행하였다.

먼저, 실험 시작 2일 전에 6주령 암컷 SD 마우스의 혈액샘플링을 진행하고 한 주에 2일 연속으로 0, 1 및 2주 마다 하기와 같은 방법으로 경구로 백신을 투여하였으며, 실험그룹과 처리약물을 하기와 같다.

ⅰ) 200㎕ PBS + 200㎕ PBS 실험군; ⅱ) 정제된 M-BmpB 항원단백질 200㎍ + 10⁸개의 야생형 유산균; ⅲ) 정제된 M-BmpB 항원단백질 200㎍ + 10⁸개의 IL-6-M 분비 유산균; ⅳ) 정제된 M-BmpB 항원단백질 200㎍ + 10⁸개의 IL-6-M 분비 유산균을 담지시킨 TE 타블렛; ⅴ) 정제된 M-BmpB 항원단백질 200㎍ + 10⁸개의 IL-6-M 분비 유산균을 담지시킨 GE 타블렛.

상기 약물을 각각의 실험군에 경구 투여한 후 21 및 28일에 분변채집과 소장 샘플링하고 ELISA 방법을 통하여 항원단백질 특이적 항체가를 측정하였다.

그 결과, 도 6과 같이 GE에 유산균을 담지시켰던 백신을 면역보조제로 사용하였을 경우, TE에 유산균을 담지시켰을 때보다 항체(IgA) 생산량 및 생산기간이 증가된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 GE의 점막점착성능이 TE보다 강하여 소장에서 잘 점착되어 효과적으로 면역증강용(adjuvant) 물질을 방출시켜 소장 내 면역을 향상시킨 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

글루타치온의 아민기와 유드라짓의 카르복실기의 아마이드 결합으로 티올기가 도입된 점막점착성 고분자.
청구항 1에 있어서, 상기 점막점착성 고분자는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 점막점착성 고분자.
[화학식 1]
청구항 1에 있어서, 상기 유드라짓은 유드라짓 L-100, 유드라짓 L-100-55 및 유드라짓 S-100으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 점막점착성 고분자.
글루타치온의 아민기와 유드라짓의 카르복실기의 아마이드 결합으로 티올기가 도입된 점막점착성 고분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 면역증강용(adjuvant) 조성물.
청구항 4의 면역증강용(adjuvant) 조성물 및 항원성 물질을 유효성분으로 함유하는 경구백신용 조성물.
청구항 5에 있어서, 상기 항원성 물질은 펩티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 유산균, 항원단백질, 상기 항원단백질을 발현하는 유산균, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 재조합 박테리아 및 재조합 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 경구백신용 조성물.
청구항 5에 있어서, 상기 항원성 물질은 유산균인 락토코거스 락티스(Lactococcus lactis IL1403-IL6-M)인 것을 특징으로 하는 경구백신용 조성물.