KR100919731B1 - 안정제로서 폴리에테르를 함유한 백신전달용 키토산미립자 - Google Patents

안정제로서 폴리에테르를 함유한 백신전달용 키토산미립자

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Abstract

본 발명은 안정제로서 폴리에테르를 함유하고, 보데텔라 브론키셉티카 데모네크로톡신(Bordetella bronchiseptica Dermonecrotoxin, BBD)이 담지된 키토산 미립자, 상기 키토산 미립자를 포함하는 돼지의 위축성 비염 예방용 백신 조성물 및 상기 백신 조성물의 돼지에의 투여방법에 관한 것이다. 본발명은 폴리에테르를 함유하고 BBD가 담지된 키토산미립자를 사용함으로써 전신성(systemic)면역반응과 점막면역반응을 효과적으로 유도할 수 있으므로, 본 발명의 폴리에테르가 함유된 키토산미립자는 비강백신접종을 위한 잠재력 있는 면역보조제임을 알 수 있다.

Description

안정제로서 폴리에테르를 함유한 백신전달용 키토산미립자{Chitosan microsheres for vaccine delivery containing polyether as stabilizer}
현재 미립자들은 정맥주사, 경구, 또는 점막투여를 위한 펩티드, 항원, 올리고뉴클레오티드 및 유전자의 전달체로 각광을 받고 있다[참조문헌: Janes, K.A., Calvo, P., Alonso, M.J., Polysaccharide colloidal particles as delivery systems for macromolecules. Adv. Drug Delivery Rev. 2001; 47, 8397]. 몇가지의 미립자들은 이미 점막백신으로 처리한 후 현저한 체액성면역반응과 점막면역반응을 일으킨다고 보고되었다[참조문헌: Eyles J, Sharp G, Williamson E, Spiers I, Alpar H. Intranasal administration of poly-lactic acid microsphere co-encapsulated Yersinia pestis subunits confers protection from pneumonic plague in the mouse. Vaccine 1998; 16: 698-707].
백신의 점막부위의 투여는 주사투여보다 많은 장점이 있다. 코점막 또는 구강투여는 백신의 투여가 용이하고 여러 가지 부작용을 줄이며 특히 발전도상의 제3국가에서 주사기의 오염에 의한 감염의 위험성도 줄인다. 그러나 단백질 혹은 펩타이드 등의 점막백신의 투여는 거대분자들이 점막 장벽 (mucosal barrier)을 통과하기 어렵고 투여된 항원이 빨리 제거되며 비강 분비물인 효소에 의해 변성이 되는 여러 가지 제한점이 있다. 따라서 성공적인 점막 면역을 위해서는 점막 보조제의 개발이 불가피하다. 즉 점막으로 전달된 항원들은 보통 그 면역원성이 현저히 떨어지기 때문에 항원을 보조제들과 함께 전달하여 면역반응을 강화하는 방법이 필요하다. 마이크로캡슐화하거나 혹은 미립자화하는 방법은 백신전달에서 흔히 사용되는 방법이다. 이런 방법으로 한번의 투여로 장시간동안 감염 혹은 생체에 대하여 효과적인 면역반응을 일으킬 수 있다[참조문헌: Fwu-Long Mi, Shin-Shing Shyu, Chin-Ta Chen and Jen-Yu Schoung Porous chitosan microsphere for controlling the antigen release of Newcastle disease vaccine: preparation of antigen-adsorbed microsphere and in vitro release, biomaterials 1999; 20: 1603-1612].
키토산은 자체의 생체적합성 (biocompatibility), 생분해성 (biodegradability)을 가지며, 독성이 없고 값이 싸며 세포사이의 밀착 결합(tight junction)을 열 수 있는 특성으로 점막 약물 전달 시스템에 있어서 아주 효과적인 생체재료이다[참조문헌: Artursson, P., Lindmark, T., Davis, S.S., Illum, L., Effect of chitosan on permeability of monolayers of intestinal epithelial cells (Caco-2). Pharm. Res. 1994; 11, 1358-1361]. 키토산은 분자량, 탈아세틸화도에 따라 그 성질에 차이가 있는데, 고분자 키토산은 여러 가지 복합체가 점막 병풍 (mucosal barrier)을 지나는 것을 촉진한다고 보고되어 있다[참조문헌: Artursson, P., Lindmark, T., Davis, S.S., Illum, L., Effect of chitosan on permeability of monolayers of intestinal epithelial cells (Caco-2). Pharm. Res. 1994; 11, 1358-1361 ; Illum, L., Farraj, N.F., Davis, S.S., Chitosan as a novel nasal delivery system for peptide drugs. Pharm. Res. 1994; 11, 1186-1189].
흔히, 키토산-항원 백신은 비강투여 후 비강에서 강한 혈청IgG 반응과 IgA 분비를 유도한다[참조문헌: Illum, L., Jabbal-Gill I., Hinchcliffe M., Fisher AN., Davis S.S., Chitosan as a novel nasal delivery system for vaccines. Adv Drug Deliv Rev. 2001, 51(1-3): 81-96]. 키토산은 박테리아, 비루스, 종양에서 넓은 범위의 항원반응을 일으킨다고 알려졌다[참조문헌: Suzuki K, Ogawa Y, Hashimoto K, Suzuki S, Suzuki M. Protecting efect of chitin and chitosan on experimentally induced murine candidasis. Microbiol Immunol 1984; 28: 903-904 ; Saiki I, Murata J, Tokura S, Azuma I. Inhibition by sulfated chitin derivatives of advasion through extracellular matrix and enzymatic degradation metastatic melanoma cells. Cancer Res 1990; 50: 3631-3637 ; Lika I, Vine T, Nishimura K, Azuma I. Simulation of non-specific host resistance against Sendai virus and E. coli infection by chitin in mice. Vaccine 1987; 5: 270-274 ; Kreuter J, Speiser PP. New adjutants on poly(methylmethacrylate) base. Infect Immunol 1976; 13: 204-210 ; Kreuter J, Speiser PP. In vitro studies of poly(methylmethacrylate) adjutants. J Pharm Sci 1976; 65: 1624-1627 ; Kreuter J, Liehl E. Long-term studies of microencapsulated and adsorbed influenza vaccine nanoparticles. J Pharm Sci 1981; 70: 367-371 ; Kreuter J, Liehl E, Berg V. Influence of hydrophobicity on the adjuvant e!ect of particlate polymeric adjutants. Vaccine 1988; 6: 253-256 ; He, P., Davis, S.S., Illum, L., In vitro evaluation of the mucoadhesive properties of chitosan microspheres. Int. J. Pharm. 1998; 166, 7588]. 또한 키토산 미립자는 하나의 수용액에서 혼합되어 만들어지기 때문에 유기용매가 필요없다[참조문헌: Inez M. van der Lubben, Gideon Kersten, Marjan M. Fretz, Coen Beuvery, J. Coos Verhoef, Hans E. Junginger Chitosan microparticles for mucosal vaccination against diphtheria:oral and nasal efficacy studies in mice Vaccine 2003; 21: 1400-1408]. 이러한 원인으로 키토산은 점막 백신을 위한 면역보조제 혹은 백신 전달체로 사용되었다.
위축성 비염(Atrophic rhinitis, AR)은 돼지에서 흔히 일어나는 감염성 질병이다. 위축성 비염은 보통 8~12주 동안 지속되며 성장기 동안에 걸쳐 발병한다. 가장 치명적인 피해로는 이탈 혹은 비강단축에 의한 비강 갑개골의 위축이다[참조문헌: Hasebe H. Occurrence and epizootiological surveys of infectious atrophic rhinitis in swine. Nippon Vet Zootech Col Bull 1971 19:92-102]. 돼지의 호흡기질병은 양돈산업에서 아주 큰 경제적 피해를 야기한다. 따라서, 양돈산업에서 돼지의 호흡기질병, 특히 위축성 비염을 예방하기 위하여 돼지에서 유효한 면역반응을 유도할 수 있는 백신 전달시스템의 개발의 필요성이 존재해 왔다.
시스템과 국부적 면역반응의 잠재력은 점막 시스템이 면역을 위한 하나의 매력적인 장소임을 암시한다. 그러나 점막에 투여된 단백질 혹은 펩타이드는 보통 그 면역성이 떨어진다. 따라서 성공적인 점막 면역을 위해서는 효과적인 보조제가 필요하다. 키토산 미립자는 백신 전달체로서 잠재력이 있지만 물리적 특성에 의해 쉽게 뭉치기 때문에 장기간의 보존에서 문제점이 되어 백신의 방출이 멈추고 방출된 백신의 면역활성도 떨어지는 현상이 나타난다. 이에 본원발명의 목적은 이런 문제점을 극복하여 장기 보존시에도 키토산 미립자가 뭉치지 않고 백신 활성이 그대로 유지될 수 있는 안정한 키토산 미립자를 제공하는데 있다.
본 발명은, 안정제로 폴리에테르를 함유하고 보데텔라 브론키셉티카 데모네크로톡신 (Bordetella bronchiseptica Dermonecrotoxin, BBD)이 담지된 키토산 미립자; 상기 폴리에테르 함유 키토산 미립자를 포함하는 돼지의 위축성 비염 예방용 백신 조성물; 및 상기 백신 조성물을 돼지에 투여하여 위축성 비염을 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 이하의, 폴리에테르를 함유하고 BBD가 담지된 키토산 미립자, 이를 이용한 돼지 위축성 비염 예방용 백신 조성물 및 돼지 위축성 비염 예방 방법을 제공한다.
1. 안정제로서 폴리에테르를 함유하고, 보데렐라 브론키셉티카 데모네크로톡신(BBD)이 담지된 키토산 미립자.
2. 1에 있어서, 입자크기가 0.5 내지 100 ㎛ 인 키토산 미립자.
3. 2에 있어서, 입자크기가 3 내지 8 ㎛ 인 키토산 미립자.
4. 1에 있어서, 키토산의 분자량이 5K 내지1000K의 범위인 키토산 미립자.
5. 1에 있어서, 상기 폴리에테르가 0.5~20 중량％ 함유되고, 키토산이 40 ~ 70 중량％ 함유되며, BBD가 10 ~ 59.5 중량％ 함유되는 것을 특징으로 하는 키토산 미립자.
6. 1에 있어서, 폴리에테르가 폴리에칠렌옥사이드, 폴리에칠렌옥사이드/폴리프로필렌옥사이드 2원공중합체 및 폴리에칠렌 옥사이드/폴리프로필렌옥사이드/폴리에칠렌옥사이드 3원공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 키토산 미립자.
7. 6에 있어서, 상기 폴리에테르가 F127인 키토산 미립자.
8. 1에 있어서, 백신항원의 방출이 조절되는 키토산 미립자.
9. 1에 있어서, 백신항원의 방출 조절이 키토산의 분자량을 조절함으로써 이루어지는 키토산 미립자.
10. 1 내지 9중 어느 하나의 키토산 미립자를 포함하는 돼지 위축성 비염 예방용 백신 조성물.
11. 10의 백신 조성물을 돼지에게 투여함을 특징으로하는 돼지의 위축성 비염의 예방 방법.
12. 10의 백신 조성물을 비강, 질내, 근육내, 피부내, 피하내, 복강내, 정맥내, 안와내, 폐내 및 직장내로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로로 투여함을 특징으로 하는 돼지의 위축성 비염의 예방 방법.
13. 11에 있어서, 백신 조성물을 돼지에게 비강투여함을 특징으로 하는 돼지의 위축성 비염의 예방 방법.
본 발명의 하나의 태양은 안정제로 폴리에테르를 함유하고, 보데텔라 브론키셉티카 데모네크로톡신(Bordetella bronchiseptica Dermonecrotoxin, BBD)이 담지된 폴리에테르 함유 키토산 미립자에 관한 것이다.
돼지 위축성 비염 예방용 백신으로서는 바람직하게는 보데텔라 브론키셉티카 데모네크로톡신 (BBD)이 사용된다. 상기 보데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica, BB)의 독소적인 박테리아 종은 위축성 비염의 발생을 감소시키는데 사용되는 백신으로 알려져 있다[참조문헌: N.R. Shin., J.M. Kim., H.S. Yoo, Korean J. Vet. Res. 2000, 40: 551-561].
본 발명에서 사용하는 키토산은, 본 발명의 키토산 미립자로 제조될 수 있는 것이면 어느 것이든 사용할 수 있으나, 바람직하게는 탈아세틸화도가 50 내지 100%범위의 것이 사용될 수 있다. 키토산 미립자들은 트리폴리포스페이트(Tripolyphosphate, TPP)나 소디움설페이트(Sodium sulfate)의 이온화 결합작용에 의해 준비될 수 있다. 키토산 [폴리(β-(1→4)-2-아미노-2-데옥시-D-글루코스)]은 폴리다당류로서 자연계에 풍부한 키틴으로부터 가공된 것으로 자체의 생체적합성 (biocompatibility), 생분해성 (biodegradability), 독성이 없고 값이 싸며 세포사이의 치밀 이음부(tight junction)를 열 수 있는 특성으로 점막 약물 전달 시스템에 있어서 아주 효과적인 생체재료이다. 또한 백신 전달체로서 키토산은 강한 점막점착성을 갖고 있으며 키토산-항원 백신은 비강투여 후 비강에서 강한 혈청 IgG 반응과 IgA 분비를 유도한다. 이러한 원인으로 키토산은 점막 백신을 위한 면역 보조제 혹은 백신 전달체로서의 사용에 적합하다. 예전의 연구(한국 특허출원 2003-0088872)에서 본 발명자들은 백신이 담지된 키토산 미립자가 면역활성이 있는것을 생체 외 실험을 통해 관찰하였지만 백신이 담지된 키토산 미립자들의 물리적특성때문에 보관하면 쉽게 뭉치는 것을 발견하였다. 백신이 담지된 미립자가 뭉치면 담지된 미립자로부터의 백신 방출이 방해를 받고 면역 자극 능력이 떨어진다. 따라서 효과적인 백신방출과 면역 자극 능력을 위해서는 좀 더 안정된 키토산미립자의 제조가 필요하다.
따라서 본 실험에서는 안정제(stabilizer)인 폴리에테르의 존재하에서 키토산미립자를 제조하였다. 상기 폴리에테르는 바람직하게 폴리에칠렌옥사이드, 폴리에칠렌옥사이드/폴리프로필렌옥사이드 2원공중합체 및 폴리에칠렌 옥사이드/폴리프로필렌옥사이드/폴리에칠렌옥사이드 3원공중합체로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용할 수 있다.
상기 폴리에테르로서 특히 바람직하게는 F127을 사용할 수 있다. F127은 폴리에칠렌옥싸이드/폴리프로필렌옥싸이드/폴리에칠렌옥싸이드 (PEO/PPO/PEO)의 삼블록 공중합체(triblock copolymer)로서 분자량은 12,600, 70%의 친수성 에칠렌옥싸이드 단위(units)와 30%의 소수성 프로필렌옥싸이드 단위를 포함하며 계면활성능력과 안정화(stabilizing) 능력 때문에 제약분야에서 많이 사용되어져 왔으며 또한 우수한 용해성과 약물 방출 능력때문에 약물 전달 시스템으로도 많이 사용되어져 왔다. 본 발명에서는 안정제인 폴리에테르의 존재하에서 제조된 키토산미립자에 백신을 담지하여 비강점막투여를 위한 생체 외와 생체 내 실험을 실시하였다.
폴리에테르와 키토산은 수소 결합에 의해 결합되었고, 1H-NMR에 의해 분석되었다. 상기 폴리에테르 함유 키토산 미립자에 위축성 비염의 백신물질인 상기 BBD를 담지시킬 수 있다. 담지방법으로서는 통상 허용되는 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들면, BBD를 키토산 미립자에 현탁시킨 후 하루정도 교반하면서 인큐베이션시켜 담지시킬 수 있다.
이 때, 폴리에테르가 0.5 ~ 20 중량％ 함유되고, 키토산이 40 ~ 70 중량％ 함유되며, BBD가 10 ~ 59.5 중량％ 함유되도록 하는 것이 바람직하다.
키토산미립자와 폴리에테르 함유 키토산미립자는 제조된 초기에는 구형을 나타낸다. 그러나 2주 정도가 경과하면, 키토산미립자는 많이 뭉쳐져 있지만 폴리에테르 함유 키토산 미립자는 여전히 원래의 모습을 유지하고 있음을 관찰할 수 있ㄴ는데, 이 결과로부터 폴리에테르를 도입한 후에도 미립자형성이 가능하며 폴리에테르가 미립자가 뭉치는 현상을 방지하는 것을 알 수 있다. 이는 폴리에테르의 친수성 그룹인 PEO그룹이 미립자들이 서로 뭉치는것을 방지해주기 때문이다.
또한, 본 발명의 BBD가 담지된 키토산 미립자는 입자크기가 0.5 내지 100㎛인 것이 바람직하며, 특히 1 내지 10㎛인 것이 바람직하고, 더더욱 바람직하게는 3 내지 8 ㎛ 인 것이다. 이미 보고된 바와 같이 점막백신전달을 위한 미립자를 투여할 때 미립자의 크기는 장 또는 호흡기계의 점막접착임파조직 [mucosal associated lymphoid tissues (MALT)]에 효과적으로 작용하는 아주 중요한 요소이다. 미립자의 크기가 10㎛보다 작아야하며 또 너무 작으면 직접 폐로 들어갈 우려가 있기 때문이다[참조문헌: Eldridge, J.H., Hammond, C.J., Meulbrock, J.A., Staas, J.K., Gilley, R.M., Rice, T.R., Controlled vaccine release in the gut-associated lymphoid tissues. I. Orally administered biodegradable microspheres target the peyer's patches. J. Control. Release 1990; 11: 205-214 ; Lydyard, P., Grossi, C., The lymphoid system. Immunology 1998; 5: 31-42]. 즉, 백신이 담지된 미립자들은 크기가 10μm보다 작을 때 점막-관련 림프 조직(mucosal-associated lymphoid tissues,MALTs)에 쉽게 흡수(uptake)된다고 보고가 되어있다.
본 발명의 BBD가 담지된 폴리에테르 함유 키토산 미립자는 바람직하게는 BBD의 방출이 조절될 수 있다. 백신 항원의 지속적인 방출은 면역 시스템에 연속적인 항원투여를 가능하게 한다. 백신 항원의 방출조절은 바람직하게는 키토산의 분자량을 조절함으로써 이루어질 수 있다. 키토산의 분자량이 클수록 백신 BBD와의 분자간 상호작용이 더 강하기 때문에, 백신 항원이 좀 더 천천히 방출된다. 바람직한 키토산의 분자량은 투여목적과 처리되는 항원에 의해 결정되는데 바람직한 분자량의 범위는 5K 내지 1000K이며, 특히 10K 내지 100K의 분자량의 범위가 바람직하다.
본 발명에 의하여 키토산과 백신과의 결합이 이온결합, 수소결합, 소수결합 등 화학결합에도 의존함이 밝혀짐으로써, 이러한 화학결합을 응용하여 백신 방출의 조절도 가능하다.
본 발명의 다른 실시 태양에서 BBD가 담지된 폴리에테르 함유 키토산 미립자를 포함하는 돼지 위축성 비염 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 백신 조성물에는 BBD가 담지된 키토산 미립자 이외에, 백신 항원의 안정화, 방출 조절 등의 목적으로 약제학적으로 허용가능한 어떠한 첨가제도 포함할 수 있다. 이러한 첨가제의 예로서는, 알부민, 글리신, 글리신 이외의 아미노산, 폴리아미노산, 젤라틴, 콘드로이틴 술페이트, 염화나트륨, 만난, 글루코만난, 시트르산나트륨, 만니톨 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 백신 조성물을 동물, 바람직하게는 돼지에 접종하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 동물에 본 발명에 따른 백신의 면역학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 적정량의 본 발명에 따른 백신 조성물을 투여함으로써 돼지에서 위축성 비염에 대한 면역반응을 일으킬 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여방법으로는 숙주 동물의 신체 부위에 효과적인 면역자극이 일어나도록 백신 조성물을 전달시키는 방법 및/또는 임의의 적합한 수단을 사용하는 방법을 포함할 수 있다. 본 발명의 따른 백신 조성물은 경구 또는 비경구 투여와 같은 적당한 경로를 통하여 투여할 수 있다. 비강, 질내, 근육내, 피부내, 피하내, 복강내, 정맥내, 안와내, 폐내 또는 직장내 투여가능하다. 또한, 투여경로에 따라 프로테아제 저해제, 염증 방지제와 같은 추가의 성분을 함께 투여할 수도 있다. 특히 비강 투여는 백신의 투여가 용이하고 여러 가지 부작용을 줄이며 특히 주사기의 오염에 의한 감염의 위험성도 줄일 수 있는 장점이 있다.
실시예
이하에서는, 실시예를 들어 본 발명에 대하여 상세하게 설명하지만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 실험에서는 폴리에테르의 존재하에서 키토산미립자를 제조하였다. 폴리에테르의 존재하에서 제조된 키토산미립자는 tripolyphosphate (TPP)와 이온화 결합작용에 의해 준비되었으며 준비된 미립자에 위축성비염의 백신물질인 Bordetella Bronchiseptica Dermonecrotoxin (BBD)를 담지시켰고 위축성비염에 대한 면역활성을 in vitro와 in vivo에서 관찰하였다.
재료
키토산은 분자량 10K (탈아세틸화도는 80.4%, 자광, 한국)을 사용하였다. 플루로닉F127과 sodium tripolyphosphate (TPP)는 Sigma (St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 돼지 호흡기계 위축성비염백신인 보데텔라 브론키샙티카 네크로톡신 (BBD)는 수의대 전염병학실에서 제공받았다. 다른 시약들도 시약등급에 의하여 사용되었다.
실시예 1: 폴리에테르 함유 키토산 미립자의 제조
(1): 위축성 비염 백신의 제조
보데텔라 브론키셉티카를 본 제조예에서 위축성 비염의 유발시약으로 사용하였다. 이 박테리아 종은 특정배지, G20G로 돼지 비강에서 분리한 것이며, 콜로니 형태, 생화학적, 혈청학적시험 및 자동동정검측기 (automatic bacteria identification system), 바이텍(Vitek, 미국 메릴랜드주, 헤이즐우드 소재)에 의해 검증하였다.
1)분리된 박테리아 종에서 데모네크로시스톡신 (DNT)유전자의 감지
DNT유전자는 문헌[참조: N.R. Shin., J.M. Kim., H.S. Yoo, Korean J. Vet. Res. 2000, 40: 551-561]에 기재된 바에 따라 PCR 증폭에 의하여 감지하였다.
2)보데텔라 브론키셉티카로부터 DNT의 준비
DNT를 상기 문헌[참조: Shin 등 상기]에 기재된 방법에 따라 추출하였다. 박테리아 세포들을 37℃의 TSB 배지 [tryptic soy broth, 디프코 코퍼레이션(Difco Co.]에서 하룻밤 교반하면서 배양하였다. 박테리아를 pH 7.4인 인산염 완충액 (PBS)으로 두 번 세척하였다. 초음파 호모게나이저로 1분동안 쏘니피케이션(sonication)한 후, 4℃의 원심분리기로 20.000rpm에서 1시간 원심분리시켰다. 상청액을 SDS-PAGE에 의해 검측하였다.
(2): 폴리에테르 함유 키토산 미립자의 제조
키토산은 아세트 산(2%)에 용해시켜 최종농도가 0.25 wt-%의 키토산용액을 제조하였고 여기에 폴리에테르 (1.25 wt-%)를 첨가하였다. 1ml의 TPP용액 (15wt-%)을 마그네틱 교반하면서 폴리에테르 함유 키토산용액 25 ml에 초음파분리(sonication) (5W, 15분)을 동반하면서 떨어뜨렸다. 제조된 폴리에테르 함유 키토산미립자는 4℃, 3000rpm에서 15분간 원심분리시켰다. 산물은 멸균된 물로 세 번 씻어주었다.
실시예 2: AR백신(BBD)의 담지
백신의 담지는 예전에 발표된 논문을 참조하였다(H.L. Jiang, I.K. Park, N.R. Shin, S.G. Kang, H.S. Yoo, S.I. Kim, S.B. Suh, T. Akaike, C.S. Cho, In vitro study ofthe immune stimulating activity of an atrophic rhinitis vaccine associated to chitosan microspheres, Europ. J. Pharm. Biop. 58 (2004) 471-476). 0.5ml의 BBD (12mg/ml)를 폴리에테르 함유 키토산미립자 20 mg에 담지시킨 후, 37℃에서 12시간정도 흔들(shaking)었다. 그 다음 현탁용액을 4℃, 2500rpm 원심분리하며 비담지(unloaded) BBD를 제거하였다. 폴리에테르 함유 키토산미립자에 담지된 BBD의 양은 Micro BCA protein assay method 20에 의하여 분석되었다.
비교예 1: 키토산 미립자의 제조
키토산은 분자량 10K, 100K, 300K (한국, 자광), 탈아세틸화도 91%를 사용하였다. 나트륨 트리폴리포스페이트 (TPP)는 시그마(Sigma, 미국 미주리주, 세인트 루이스 소재)에서 제공받았다. 다른 시약들도 시약등급에 의하여 사용하였다.
키토산을 2% (v/v)의 아세트산에 용해시켜 0.25 중량%의 키토산 용액을 제조하였다. 5ml의 TPP용액을 마그네틱 교반하면서 25ml의 상기 제조된 키토산 용액에 떨어뜨렸는데 이때 쏘니피케이션을 동반하였다. 제조된 키토산 미립자들은 4℃, 3000rpm에서 15분간 원심침강시켰다. 상층액을 버리고 5ml의 3차 증류수로 현탁시킨 후, 1ml씩 취하여 1.5ml의 마이크로튜브에 넣어 4℃, 2500rpm으로 원심분리시켜 키토산 미립자를 얻었다.
비교예 2: BBD 백신의 담지
0.5ml의 BBD를 상기 제조된 키토산 미립자 (약 20mg)에 넣어 키토산 미립자가 잘 분포되도록 현탁시킨 후 담지가 잘 되도록 37℃의 인큐베이터에서 24시간 동안 교반하였다. 다음 현탁액을 4℃, 2500rpm 원심분리하며 담지되지 않은 BBD를 제거하였다.
실험예 1: 주사전자현미경 (SEM)에 의한 키토산 미립자의 관찰
실시예 1, 2 및 비교예 1, 2에 의해 얻어진 미립자로 이하와 같은 처리를 행하고 그 결과를 관찰하였다.
상기 시료들은 코팅 챔버(chamber) (CT 1500HF, Oxford Instruments, Oxfordshire, UK)에서 금막코팅 되었다. 코팅된 샘플은 JSM 5410LV field emission SEM (Tokyo, Japan)으로 관찰되었다.
도 1은 키토산 미립자(도 1. a), 백신이 담지된 키토산 미립자(도 1. c), 폴리에테르 함유 키토산 미립자(도 1. d), 그리고 백신이 담지된 폴리에테르 함유 키토산 미립자(도 1. f)들의 형태를 보여준다.
키토산미립자와 폴리에테르 함유 키토산미립자는 제조된 초기에는 구형을 나타내고, 2주후에는 키토산미립자는 많이 뭉쳐져 있지만 (도 1. b) 폴리에테르 함유 키토산 미립자는 여전히 원래의 모습을 유지하는 것을 관찰하였다 (도 1. e). 이 결과로부터 폴리에테르를 도입한 후에도 미립자형성이 가능하며 폴리에테르가 미립자가 뭉치는 현상을 방지하는 것을 알 수 있다. 폴리에테르의 친수성 그룹인 PEO그룹이 미립자들이 서로 뭉치는것을 방지해주기 때문이다.
실험예 2: 동적 광산란(DLS)의 측정
실시예 1, 2 및 비교예 1, 2에 의해 얻어진 미립자로 이하와 같은 처리를 행하고 그 결과를 관찰하였다.
DLS는 DLS-8000 (Otsuka Electronics. Ltd., Osaka, Japan)을 사용하였는데 He-Ne 레이저 빔으로 20℃, 파장 488nm에서 측정하였다. Scattering 각도는 90°를 사용하였다.
미립자들의 평균 크기와 크기 분포는 표 1과 도 2에 각각 나타냈다. 백신이 담지된 폴리에테르 함유 키토산 미립자는 폴리에테르 함유키토산 미립자보다 크기가 더 커졌다. 이것은 백신이 미립자 내부에 들어갈 뿐만 아니라 미립자 표면에도 담지되는 것을 알려준다. 키토산 미립자와 폴리에테르 함유 키토산 미립자는 양전하를 띠고 (7.32 mV, zeta potential) 백신은 음전하 (-18.22 mV)를 띠기 때문에 백신 BBD는 정전기적 작용과 반데르발스힘에 의해 쉽게 미립자 표면에 담지될 수 있다. 그리고 키토산 미립자의 크기는 보관 2주후 훨씬 커졌지만 폴리에테르 함유키토산 미립자의 크기는 변화가 크지 않았다 (표 1). 이것은 폴리에테르가 우수한 안정제 능력을 갖고 있음을 암시한다.
본 발명의 백신이 담지된 폴리에테르 함유 키토산 미립자들의 크기는 5.47±2.35μm로서 MALTs에 쉽게 흡수될 수 있다. 그러므로 상기 입자 크기를 갖는, 본 발명에 따라서 제조된 백신 BBD가 담지된 폴리에테르 함유 키토산 미립자는 호흡기계의 MALT에 대하여 효과적으로 백신 전달을 할 수 있다.
미립자의 입자크기 변화
1일 2주
비교예1:CMs(키토산 미립자) 1.94±0.72 4.97±2.27
실시예1: F127/CMs 2.71±0.75 3.02±0.41
비교예2: BBD 담지된 CMs 4.39±0.68 5.23±1.46
실시예2:BBD담지된 F127/CMs 5.47±2.35 5.19±0.53
실험예 3: In vitro 에서 폴리에테르 함유 키토산 미립자에서의 BBD의방출
실시예 1, 2 및 비교예 1, 2에 의해 얻어진 미립자로 이하와 같은 처리를 행하고 그 결과를 관찰하였다.
폴리에테르 함유 키토산미립자에서의 BBD의 in vitro 방출은 BBD가 담지된 폴리에테르 함유 키토산미립자(20mg)를 1.5ml의 마이크로튜브에 넣고 1ml, pH 7.4인 PBS를 넣고 37℃의 수조(water bath)에서 100rpm으로 흔들었다. 시간에 따라 PBS를 바꾸어주었는데 매번의 용액을 Micro BCA protein assay방법 20으로 측정하여 최종 방출양을 구하였다.
도 3에 나타낸것처럼 백신 BBD가 담지된 키토산미립자와 BBD가 담지된 폴리에테르 함유 키토산미립자에서 지속적인 방출경향을 나타냈고 폴리에테르 함유 키토산미립자에서 키토산미립자보다 더 많은 백신이 방출되었다. 이것은 폴리에테르의 친수성기인 PEO의 특성으로 미립자들끼리 뭉치는것을 방지하기 때문이다. Xu 등은 키토산분자와 뒤엉킨 PEG사슬이 키토산과 BSA의 결합을 성기게 하여 상대적으로 더 많은 BSA가 PEG를 포함하는 나노입자로부터 방출되게 한다고 보고하였다. 본 연구에서 발견한 결과도 친수성이 있는 PEO 사슬이 백신 BBD의 재흡착을 방해하여 BBD가 폴리에테르 함유 키토산미립자로부터의 방출을 촉진하였음을 나타낸다.
실험예 4: TNFα의 분비량의 측정
실시예 1, 2 및 비교예 1, 2에 의해 얻어진 미립자로 이하와 같은 처리를 행하고 그 결과를 관찰하였다.
TNFα는 염증반응에서 흔히 사용되는 지시제이다. 마우스 마크로파아지 세포주인 RAW264.7세포는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)에서 5%의 fetal bovine serum (FBS)로 37℃에서 배양되었다. 60mm의 배양접시에 3x106 세포를 분주한 후, 배지에 백신이 담지된 미립자를 넣어 세포에 처리하였다. 분비된 TNFα는 효소-결합 면역흡착 측정법(enzyme-linked immunosorbent assay,ELIZA) 키트 (Endigen co.)로 분석하였다.
활성화된 마크로파아지는 MHC class II 분자와 co-stimulatory B7 family의 발현이 증대되도록 유도한다. 면역반응발생에서 중요한 단백질은 보통 활성화된 마크로파아지에 의해 분비된다. 본 연구의 주요목적은 비강투여를 위한 폴리에테르 함유 키토산미립자의 면역활성을 동정하는것이다. 백신 BBD를 모델백신으로 우리는 마크로파지 면역세포에서 TNFα의 분비양측정실험을 행하였다.
TNFα의 분비양상은 도 4에 나타냈다. BBD, BBD담지된 키토산미립자, BBD 담지된 폴리에테르 함유 키토산미립자로 처리한 마크로파지 면역세포에서 분비된 TNFα는 시간에 의존하는 양상을 보였으며 BBD-담지된 폴리에테르 함유 키토산미립자에서 가장 많은 TNFα의 분비를 보여주었다 (BBD-담지된 키토산미립자에서 P>0.05, BBD에서 P<0.05). 그리고 LPS의 처리구에서는 48시간이후로 TNFα양의 분비가 거의 없었지만 백신이 담지된 키토산미립자와 폴리에테르 함유 키토산미립자에서는 72시간까지도 TNFα양이 지속적으로 분비되는 것을 관찰하였다. 이것은 백신이 폴리에테르 함유 키토산미립자에서 지속적으로 방출되어 마크로파지를 자극하였기 때문이다. 본 연구의 이 같은 결과는 백신 BBD가 담지된 폴리에테르 함유 키토산미립자는 돼지 호흡기 질병예방을 위한 호흡기백신전달의 효율적인 새로운 입후보자임을 암시한다.
실험예 5: 실험동물 마우스의 면역유발과 샘플링
실시예 2 및 비교예 2에 의해 얻어진 미립자와 이하의 양성 대조군과 음성 대조군으로 실험하였다.
본 실험에서는 5주령 BALB/c (female) mice (Breeding and Research Center, Seoul National University, Korea)를 제정된 실험동물법규에 따라 실험을 진행하였다. 각 실험군(15마리)은 2주간격으로 10주간 30μg의 백신 BBD가 담지된 폴리에테르 함유 키토산미립자, 키토산미립자를 각각 20μl의 PBS에 용해시켜 비강투여로 면역을 유도시켰다. 그리고 대조군으로서 통상적으로 사용되고 있는 백신인 ARPH (positive control)과 아무런 처리를 하지 않은 음성 대조군(negative control)을 사용하였다. 케타민 하이드로클로라이드로 마취를 시킨 마우스를 50μl의 PBS를 인두로 2회 주입하여 비강점액을 채취하였고 채취된 점액샘플은 즉시 -20℃에 동결보관하였다. 혈액샘플은 실온에서 응고시킨 후, 4℃에서 밤새 두었다(overnight). 혈청샘플은 4℃에서 3,000g, 10분간 원심분리하였고 -20℃에 동결보관하였다.
혈청과 비강점액에서의 항원특이적인 항체인 IgG 와 IgA는 ELISA로 측정하였다. 10ng의 BBD상층액을 100μl의 코팅 버퍼 (14.2 mM의 NaCO3, 34.9 mM의 NaHCO3, 3.1 mM의 NaN3, pH 9.6) 로 처리된 마이크로플레이트(microplate)에 4℃에서 밤새 인큐베이션(incubation)시켰다. 다음 플레이트는 PBST (0.05% Triton X-100)으로 두 번 세척하였고 1% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)으로 37℃에서 한시간동안 블로킹(blocking) 시켰다. 일차 항체(Primary antibody)(혈청과 비강점액)는 20배로 희석을 시켜서 37℃에서 한시간 처리를 했고 TBST로 세척 후, 0.1μl의 염소 항-마우스(goat anti-mouse) IgG (H+L)-HRP 또는 항-마우스 IgA (α-chain specific)-HRP로 37℃에서 한시간 처리를 했고 100 μl의 ABST 기질용액으로 처리하여 색을 나타나게 하였다. 20분간 실온에서 인큐베이션한 후, ELISA 리더기 (Molecular Device Corp., Sunnyvale, CA, USA)로 405 nm에서 OD 값을 측정하였다.
통계분석
모든 샘플은 비슷한 조건에서 세 번 반복으로 수집되었고 처리되었다. 샘플농도의 기하평균은 계산되었고 그룹사이의 차이는 t-시험으로 정량되었다. P<0.05는 차이가 큼을 의미한다.
(1) BBD-특이적 IgA 분비
분비 IgA (secretory IgA, sIgA)는 호흡기에서 개체가 병원체에 대하여 방어하는 첫 번째 수단으로서24 MALTs 는 점막표면의 방어에서 중요한 역할을 한다. MALTs는 병원체에 대해 프라이밍(priming) 면역반응을 일으키는 곳으로 인식되고 있다. 따라서 위축성비염을 예방하는 책략으로 비강에 위치한 코-관련 임파조직(nasal-associated lymphoid tissues, NALTs)에서 sIgA의 분비를 효과적으로 유도하는 것이다. 본 실험에서는, BBD가 담지된 폴리에테르 함유 키토산미립자로 면역접종을 한 그룹과 BBD가 담지된 키토산미립자로 면역접종을 한 그룹에서 많은 양의 IgA (비강점액에서)의 분비를 관찰하였고 (P<0.05) BBD가 담지된 폴리에테르 함유 키토산미립자로 면역접종을 한 그룹에서 BBD가 담지된 키토산미립자로 면역접종을 한 그룹보다 더 많은 양의 IgA의 분비를 관찰하였다 (도 5). 그러나 ARPH 백신을 근육투여를 한 그룹에서는 마지막 면역접종까지도 IgA의 분비는 적었다 (P<0.01). BBD가 담지된 폴리에테르 함유 키토산미립자로 처리한 그룹에서는 혈청내에서도 많은 양의 IgA의 분비를 관찰하였다 (도6). 본 실험에서는, BBD가 담지된 폴리에테르 함유 키토산미립자로 처리한 그룹에서 비강점액과 혈청내에서 많은 양의 IgA 분비를 관찰함으로써 비강에 투여한 백신이 담지된 폴리에테르 함유 키토산미립자는 점막에 관여한 면역반응을 효과적으로 유도할 수 있음을 입증하였다.
(2) BBD-특이적 IgG 분비
ARPH로 접종한 그룹은 혈청에서 두 번째 면역접종부터 높은 IgG의 양을 보였다 (도 7). BBD가 담지된 폴리에테르 함유 키토산미립자로 접종한 그룹과 BBD가 담지된 키토산미립자로 접종한 그룹에서도 ARPH그룹보다는 적지만 (P<0.05) 세 번째 면역접종부터 많은 양의 IgG를 관찰하였는데 이러한 결과는 이미 보고된 다른 논문과 비슷한 결과이다28, 29. 또한 BBD가 담지된 폴리에테르 함유 키토산미립자로 처리한 그룹에서 BBD가 담지된 키토산미립자로 처리한 그룹보다 더 많은 양의 IgG가 관찰되었다.
Westerink 등은 플루로닉(Pluronic) 폴리에테르 함유 키토산은 증가된 면역반응을 나타내는데 폴리에테르와 키토산의 시너지적효과이기 때문이라고 설명하고 있다. 도 1에서 알 수 있듯이 키토산미립자와 폴리에테르 함유 키토산미립자는 제조된 초기에는 구형을 나타내고, 2주후에는 키토산미립자는 많이 뭉쳐져 있지만 (도 1. b) 폴리에테르 함유 키토산 미립자는 여전히 원래의 모습을 유지하는 것을 관찰하였다 (도 1. e). 이 결과로부터 폴리에테르를 도입한 후에도 미립자형성이 가능하며 폴리에테르가 미립자가 뭉치는 현상을 방지하는 것을 알 수 있다. 폴리에테르의 친수성 그룹인 PEO그룹이 미립자들이 서로 뭉치는것을 방지해주기 때문이다.
그러므로, 본 연구에서 안정제로서의 폴리에테르분자가 키토산분자와 상호작용하여 높은 면역보조제역활을 한 것으로 사료된다. ARPH는 비강점액에서 현저한 IgA양을 나타내지 못했다. 그러나 BBD가 담지된 폴리에테르 함유 키토산은 비강점액에서 높은 IgA양을 나타냈을뿐만아니라 혈청에서도 높은 IgG양을 나타냈다. 이러한 비강면역접종은 비강에서 특이적 항체반응을 유도하는 효과적인 경로임을 나타냈다. 본 실험의 결과는 BBD가 담지된 폴리에테르 함유 키토산으로 접종시킨 마우스에서 systemic과 점막면역반응을 효과적으로 유도하였고 폴리에테르 함유 키토산미립자는 비강백신접종을 위한 잠재력 있는 면역보조제임을 증명하였다.
키토산 미립자는 백신 전달체로서 잠재력이 있지만 물리적 특성에 의해 쉽게 뭉치기 때문에 장기간의 보존에서 문제점이 되고 백신의 방출을 제어하기 힘든 문제점이 있었으나, 본원발명자들은 이런 문제점을 극복하기 위해 폴리에테르를 안정제로서 함유한 키토산 미립자를 제조하여 비강백신접종을 위한 잠재력 있는 면역보조제를 제공할 수 있게 하였다.
도 1은 키토산 미립자의 초기 사진(a) 및 2주후의 사진(b), 백신 BBD가 담지된 키토산 미립자(c), 폴리에테르 함유 키토산미립자 초기 사진(d) 및 2주후의 사진(e), 백신 BBD가 담지된 폴리에테르 함유 키토산미립자의 SEM 사진(f)이다.
도 2는 키토산 미립자(a), 백신 BBD가 담지된 키토산 미립자(b), F127/키토산미립자(c) 및 백신 BBD가 담지된 F127/키토산미립자(d)의 ELS로 측정한 입자크기 분포이다(25℃에서 산란각 90°).
도 3은 37℃, pH=7.4에서 백신 BBD가 담지된 키토산 미립자와 백신 BBD가 담지된 F127/키토산 미립자로부터 백신 BBD의 in vitro 방출경향(평균±표준편차, n=3)을 나타낸다.
도 4는 BBD, BBD가 담지된 키토산 미립자, BBD가 담지된 F127/키토산 미립자, LPS, F127/키토산 미립자 및 대조군으로 자극된 쥐 마크로파지로부터 TNFα의 분비(n=3)를 나타낸다.
도 5은 근육투여한 ARPH, 비강 투여한 BBD 담지된 F127/키토산 미립자, 비강 투여한 BBD 담지된 키토산 미립자, 아무런 처리를 하지 않은 대조군에서 ELISA(405 nm)로 측정한 비강 점액에서의 항-BBD IgA 수준을 나타낸다(평균±표준편차, n=3).
도 6은 근육투여한 ARPH, 비강 투여한 BBD 담지된 F127/키토산미립자, 비강 투여한 BBD 담지된 키토산미립자, 아무런 처리를 하지 않은 대조군에서 ELISA(405 nm)로 측정한 혈청에서의 항-BBD IgA 수준을 나타낸다(평균±표준편차, n=3).
도 7은 근육투여한 ARPH, 비강 투여한 BBD 담지된 F127/키토산미립자, 비강 투여한 BBD 담지된 키토산미립자, 아무런 처리를 하지 않은 대조군에서 ELISA(405 nm)로 측정한 혈청에서의 항-BBD IgG 수준을 나타낸다(평균±표준편차, n=3).

Claims (13)

  1. 안정제로서 폴리에칠렌옥사이드, 폴리에칠렌옥사이드/폴리프로필렌옥사이드 2원공중합체 또는 폴리에칠렌 옥사이드/폴리프로필렌옥사이드/폴리에칠렌옥사이드 3원공중합체를 함유하고, 보데렐라 브론키셉티카 데모네크로톡신(BBD)이 담지된 키토산 미립자.
  2. 제 1항에 있어서, 입자크기가 0.5 내지 100 ㎛ 인 키토산 미립자.
  3. 제 2항에 있어서, 입자크기가 3 내지 8 ㎛ 인 키토산 미립자.
  4. 제1항에 있어서, 키토산의 분자량이 5K 내지1000K의 범위인 키토산 미립자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 폴리에칠렌옥사이드, 폴리에칠렌옥사이드/폴리프로필렌옥사이드 2원공중합체 또는 폴리에칠렌 옥사이드/폴리프로필렌옥사이드/폴리에칠렌옥사이드 3원공중합체가 0.5~20 중량％ 함유되고, 키토산이 40 ~ 70 중량％ 함유되며, BBD가 10 ~ 59.5 중량％ 함유되는 것을 특징으로 하는 키토산 미립자.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리에칠렌 옥사이드/폴리프로필렌옥사이드/폴리에칠렌옥사이드 3원공중합체가 F127인 키토산 미립자.
  8. 제1항에 있어서, 백신항원의 방출이 조절되는 키토산 미립자.
  9. 제1항에 있어서, 백신항원의 방출 조절이 키토산의 분자량을 조절함으로써 이루어지는 키토산 미립자.
  10. 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 키토산 미립자를 포함하는 돼지 위축성 비염 예방용 백신 조성물.
  11. 제10항의 백신 조성물을 돼지에게 투여함을 특징으로하는 돼지의 위축성 비염의 예방 방법.
  12. 제10항의 백신 조성물을 비강, 질내, 근육내, 피부내, 피하내, 복강내, 정맥내, 안와내, 폐내 및 직장내로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로로 투여함을 특징으로 하는 돼지의 위축성 비염의 예방 방법.
  13. 제11항에 있어서, 백신 조성물을 돼지에게 비강투여함을 특징으로 하는 돼지의 위축성 비염의 예방 방법.
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