KR20160027637A - 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 흑삼 추출물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 흑삼 추출물에 관한 것으로, 수삼에 이산화탄소를 가압하고 85~100℃의 온도에서 150~300분 동안 증숙하는 단계; 상기 증숙된 수삼을 건조하는 단계; 상기 증숙 단계 및 건조 단계를 5회 반복하여 흑삼을 제조하는 단계; 상기 흑삼을 열수 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 저온 진공 건조하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 흑삼 추출물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항산화 기능성 흑삼 추출물은 진세노사이드 Rg3, Rg5 및 Rk1을 4~11 mg/g 함유하며, 총 페놀의 함량과 항산화 활성이 증가한 효능을 보유하고 있다.

Description

항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 흑삼 추출물{METHOD FOR MANUFACTURING BLACK GINSENG EXTRACT HAVING ANTIOXIDANT FUNCTION AND BLACK GINSENG EXTRACT MANUFACTURED BY THE SAME}

본 발명은 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 흑삼 추출물에 관한 것이다.

더욱 상세하게는 수삼에 이산화탄소를 가압하고 85~100℃의 온도에서 150~300분 동안 증숙하는 단계; 상기 증숙된 수삼을 건조하는 단계; 상기 증숙 단계 및 건조 단계를 5회 반복하여 흑삼을 제조하는 단계; 상기 흑삼을 열수 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 저온 진공 건조하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 흑삼 추출물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 항산화 기능성 흑삼 추출물은 진세노사이드 Rg3, Rg5 및 Rk1을 4~11 mg/g 함유하며, 총 페놀의 함량과 항산화 활성이 증가한 효능을 보유하고 있다.

인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)은 두릅나무과에 속하는 다년생 초본으로 인삼의 뿌리는 옛날부터 강장제 또는 만병통치약으로 알려져 있으며, 최근의 연구에 의해서도 다양한 약리 효과가 인정되고 있다.

인삼은 원기를 보하고, 신체허약, 권태, 피로, 식욕부진, 구토, 설사에 쓰이며 폐기능을 도우며 진액을 생성하고 안신(安神)작용 및 신기능을 높여 준다.

인삼의 약리 효과로 대뇌피질 흥분과 억제, 평형, 항피로, 항노화, 면역증강, 심장수축, 성선촉진, 고혈당억제, 단백질합성촉진, 항상성 유지, 항암, 해독작용 등이 보고되어 있다.

인삼은 가공 방법에 따라 다양한 종류로 나뉘는데, 우선 가공하지 않은 상태의 인삼을 수삼 또는 생삼이라 한다. 수분 함량이 높은 수삼은 보존 기간이 짧기 때문에 가공과정을 거쳐 보존성을 높이게 된다.

수삼을 익히지 않고 햇볕, 열풍 또는 기타 방법으로 말린 것을 백삼이라 한다. 백삼은 수삼의 껍질을 벗겨 말리기도 하고, 껍질째 말리기도 한다. 이때 껍질을 벗기지 않고 말린 백삼을 피부백삼이라 한다.

태극삼은 백삼과 홍삼의 중간 제품으로, 수삼을 끓는 물에 찌거나 데쳐서 말린 것을 말한다. 통상적으로 수삼을 섭씨 80~90도 물에서 10~20분 내지 침적한 후 건조시킨다.

홍삼은 수삼을 수증기로 쪄서 건조한 것으로, 수분이 15% 이하가 되도록 건조하였기 때문에 장기보관이 가능하다. 인삼을 증숙하는 과정에서 진세노사이드의 성분이 증가하고 새로운 성분이 생겨 약성이 증대되는 효과가 있다.

또한 홍삼은 가공하지 않은 인삼에 비해 소화흡수가 잘 될 뿐만 아니라 부작용이 사라지며, 맛도 좋아지게 된다.

흑삼은 홍삼을 제조하는 방법과 비슷한데, 수삼을 증숙하고 건조하는 과정을 반복하여 제조한다.

흑삼은 수삼이나 홍삼에 비해 진세노사이드 함량이 더욱 증가한 인삼으로, 기존에 존재하지 않았던 진세노사이드 종류가 흑삼에 다량 존재하는 것이 확인되었다.

이처럼 인삼은 가공 형태에 다양한 제품들이 존재하며, 가공 방법에 따라 인삼의 진세노사이드 조성이 달라진다.

이중 흑삼은 증숙과 건조를 반복함으로써, 진세노사이드의 소화 흡수가 더욱 잘되고, 홍삼에 비해 항산화 활성이 증가하였다고 알려져 있다.

또한 기존에 존재하지 않던 신규한 진세노사이드가 다량 생성되는데, 특히 Rg3, Rg5 및 Rk1 등은 수삼에 존재하지 않지만 흑삼에서는 다량 존재한다.

진세노사이드(Ginsenoside)는 인삼에 들어있는 사포닌을 일컫는 말로, 사포닌은 배당체(glycoside)라 부르는 화합물의 일종이다.

진세노사이드는 스테로이드 골격에 당이 붙어 있는 구조를 갖는데, 당이 붙은 위치에 따라 Protopanxadiol(PPD), Protopanaxatriol(PPT), Oleanane과 Dammarane계로 나누어진다.

증숙 과정을 통해 스테로이드-당 결합이 끊어지면서 남아있는 당의 위치에 따라 새로운 진세노사이드가 생성되고, 다른 효과를 나타내게 된다.

또 수용성인 당이 떨어지면서 상대적으로 지용성을 띄게 되고, 세포막 투과가 용이해져 체내 활성이 증가하게 된다.

흑삼은 증숙과 건조를 반복하여 활성이 증가한 진세노사이드가 다량 함유된 효과가 있지만, 고온의 증숙 과정에서 탄화가 일어나, 발암물질인 벤조피렌이 발생한다는 문제점이 있다.

또한 진세노사이드의 당을 분해하여 다른 종류의 진세노사이드로 변환하기 때문에, 기존에 존재하던 진세노사이드의 함량은 줄어들게 된다.

인삼의 진세노사이드는 30여 종 이상이 존재하며, 종류에 따라 각각 다른 약리 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

인삼제품의 지표가 되는 대표적 진세노사이드는 Rg1, Rb1 및 Rg3 등으로, Rg1은 기억력 개선, 세포노화 억제, 혈액순환 촉진 효능이 있고, Rb1은 면역력 증진, 피로회복, 혈소판 응집 억제에 효과가 있다. Rg3은 혈액 순환을 도와 심근경색이나 뇌졸중 예방, 암세포 전이 억제에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

따라서 흑삼의 제조공정 중 발생하는 벤조피렌의 생성을 억제하고, 진세노사이드의 함량이 증진되면서도, 진세노사이드 종류가 가장 많이 존재하는 인삼 가공 제품을 제조하는 기술이 요구되고 있다.

흑삼은 제조시간과 경비가 많이 소요되므로 대량생산과 가격경쟁의 어려움이 있어, 이를 극복하기 위한 효율적인 제조방법을 찾는 시도가 계속되고 있다.

이에 본 출원인은 적당한 횟수의 증포 과정을 통해서도 진세노사이드의 함량이 증가하고 항산화 기능성이 증진되는 효율적인 흑삼 추출물의 제조방법을 완성하였다.

한편, 흑삼의 항산화 효능과 관련하여 이(비특허문헌 1) 등은 70% EtOH 흑삼 추출물이 DPPH 라디칼 소거활성, nitrite 소거활성, superoxide 소거활성 및 hydrogen peroxide 소거활성이 있음을 언급하고 있다.

또한 김(비특허문헌 2) 등은 흑삼 제조과정 중 증포 횟수에 따른 에탄올 추출물의 항산화 활성에 대해 기재하고 있는데, 증포 횟수가 증가할수록 흑삼 에탄올 추출물의 항산화 활성이 더욱 증가함을 나타내고 있다.

한편, 대한민국 등록특허공보 제10-182181호에는 적은 횟수의 증숙으로 홍삼의 진세노사이드 성분을 다량 함유하고 항산화 효과를 나타내는 흑홍삼의 제조방법에 대하여 기재되어 있다.

그러나 이들 선행문헌은 흑삼의 항산화 효능에 대해서만 나타내고 있을 뿐, 증숙 횟수에 따른 진세노사이드의 종류별 함량에 대해서는 알 수 없는 문제점이 있다. 따라서 진세노사이드의 종류가 다양하게 함유되고 함량이 증진된 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법은 알 수 없는 문제점이 있다.

대한민국 등록특허공보 제10-182181호 (2011.11.03.)

이숙영, 김동희, 우원홍. 흑삼의 항산화 활성. 동의생리병리학회지. 2011. 25(1):115-121. 김효진, 이지연, 유보람, 김혜란, 최재을, 남기열, 문병두, 김미리. 흑삼 제조과정 중 증포횟수에 따른 에탄올 추출물의 항산화 활성. 한국식품영양과학회지. 2011. 40(2):156-162.

본 발명은 위와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조한 흑삼 추출물을 제공하는 데 있다.

또한 본 발명의 목적은 벤조피렌의 발생이 억제되고, 진세노사이드의 함량이 증가하면서도 다종의 진세노사이드를 함유하는 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조한 흑삼 추출물을 제공하는 데 있다.

또한 본 발명의 목적은 증숙 횟수 및 추출방법에 따른 항산화 효과를 측정함으로써 효율적인 제조방법을 도출한 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조한 흑삼 추출물을 제공하는 데 있다.

또한 본 발명의 목적은 진세노사이드 Rg3, Rg5 및 Rk1을 4~11 mg/g 함유하며, 총 페놀의 함량과 항산화 활성이 증가한 효능을 보유하는 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조한 흑삼 추출물을 제공하는 데 있다.

본 발명은 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조한 흑삼 추출물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

또한 본 발명은 벤조피렌의 발생이 억제되고, 진세노사이드의 함량이 증가하면서도 다종의 진세노사이드를 함유하는 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조한 흑삼 추출물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

또한 본 발명은 증숙 횟수 및 추출방법에 따른 항산화 효과를 측정함으로써 효율적인 제조방법을 도출한 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조한 흑삼 추출물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

또한 본 발명은 진세노사이드 Rg3, Rg5 및 Rk1을 4~11 mg/g 함유하며, 총 페놀의 함량과 항산화 활성이 증가한 효능을 보유하는 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조한 흑삼 추출물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명에 따른 항산화 기능성 흑삼 추출물은 벤조피렌의 발생이 억제되고, 진세노사이드의 함량이 증가하면서도 다종의 진세노사이드를 함유하는 효능을 보유하고 있다.

본 발명에 따른 항산화 기능성 흑삼 추출물은 증숙 횟수 및 추출방법에 따른 항산화 효과를 측정함으로써 효율적인 제조방법을 도출한 효능을 보유하고 있다.

본 발명에 따른 항산화 기능성 흑삼 추출물은 진세노사이드 Rg3, Rg5 및 Rk1의 함량이 증가하며, 총 페놀의 함량과 항산화 활성이 증가한 효능을 보유하고 있다.

도 1은 증숙 횟수에 따른 흑삼의 색도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 증숙 횟수에 따른 흑삼 추출물에서 검출된 벤조피렌 함량을 나타낸 표이다.
도 3은 증숙 전과 9증 후 진세노사이드 함량 변화를 나타낸 HPLC 크로마토그램 결과이다.
도 4는 증숙 횟수에 따른 진세노사이드의 함량 변화를 나타낸 표이다.
도 5는 증포 횟수에 따른 흑삼 추출물의 총 페놀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 증포 횟수에 따른 흑삼 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 7은 증포 횟수에 따른 흑삼 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 8은 증포 횟수에 따른 흑삼 추출물의 Fe^{2 +} 킬레이트 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 9는 증포 횟수에 따른 흑삼 추출물의 SOD 유사활성능을 나타낸 그래프이다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실험예와 참고예는 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과한 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

실시예 1. 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조

1) 증숙 단계

인삼을 증숙기에 넣고 이산화탄소를 가압하여 증숙한다.

이때 인삼은 가공하지 않은 상태의 수삼을 이용할 수 있으며, 전처리로 일정기간 건조한 상태의 수삼이나, 백삼이 이용될 수도 있다.

건조는 감압건조, 동결건조, 양건조, 음건조 및 진공건조 등 다양한 건조 방법을 사용할 수 있다.

증숙 온도는 85~100℃에서 수행될 수 있으며, 증숙 시간은 150 내지 300분 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 설계조건에 따라 변경될 수 있다.

2) 건조 단계

증숙한 인삼을 건조한다.

이때 건조는 냉풍건조, 열풍건조, 동결건조, 원적외선 건조, 음건조, 진공건조, 감압건조 등의 방법이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 진공건조 방법을 사용할 수 있다.

건조 온도 및 시간은 설계 조건에 따라 다양하게 설정될 수 있으며, 바람직하게는 30~60℃에서 10~30시간 동안 건조가 수행될 수 있다.

설계 조건에 따라 이산화탄소 가압증숙 흑삼의 잔류 수분을 건조하는 단계가 추가로 수행될 수 있으며, 이산화탄소 가압증숙 흑삼의 잔류 수분 함량이 바람직하게는 흑삼 전체 성분 내의 5~20%가 되도록 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

3) 증숙 및 건조 반복 단계

상기 증숙 단계 및 건조 단계를 반복 수행하여 흑삼을 제조한다.

반복 횟수는 1~8회 수행될 수 있으며, 바람직하게는 5회 반복 수행될 수 있다.

증숙과 건조를 반복함으로써 점차 색이 검어져 흑삼이 제조된다.

4) 추출 단계

위 단계를 통해 제조된 흑삼을 추출한다.

추출 방법에는 용매 추출법, 수증기 증류법, 이산화탄소 초임계 추출법, 마이크로 웨이브 공정 추출법, 퍼콜레이션 추출법 등의 다양한 추출 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 용매 추출법을 이용할 수 있다.

용매 추출시, 추출 용매의 종류에 따라 추출 온도, 추출 시간, 용매의 양 및

잔류 성분 처리 방식 등이 다르게 설계될 수 있다.

추출 용매 또한 다양한 용매가 사용될 수 있는데, 추출 가능한 용매에는 물, 에탄올, 메탄올, 지방유, 글리세린, 마유, 에틸아세테이트, 아세톤, 부탄올 및 이소프로판올 등이 있으며, 바람직하게는 물을 사용할 수 있다.

5) 추출물 건조 단계

용매 추출법을 통해 제조된 흑삼 추출물을 건조한다.

건조 방법에는 냉풍건조, 열풍건조, 동결건조, 원적외선 건조, 음건조, 진공건조, 감압건조 등의 방법이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 저온진공건조 방법이 이용될 수 있다.

저온진공건조는 건조기 내부의 압력을 진공으로 유지하고, 온도를 5~15℃ 정도로 조절하여 건조하는 방법으로, 추출성분의 변성이 없고, 맛과 향도 소실되지 않는다.

흑삼 추출물은 건조하여 고형분 형태로 제공될 수 있고, 분말형태로 제공될 수도 있다.

실험예 1. 색도 분석

1-1. 실험 준비

실시예 1에 따른 흑삼을 제조하여 실험 재료로 사용하되, 증숙 횟수에 따라 각각의 시료를 제조하였다.

본 실험예를 비롯한 실험예 2 및 3에서 사용한 시료는 위와 동일한 과정으로 제조되었음을 미리 밝혀둔다.

1-2. 실험 과정

흑삼의 증숙 횟수별 색도 변화 측정방법은 시료를 미세하게 분쇄한 후, 분광측색계 KONICA MINOLTA (Model No. CM2500D)를 이용하여 측정파장범위(360 nm~740 nm)에서 SCI(정반사포함)값으로 3회 측정 하였고 CIE 규격에 맞추어 측정하였으며, L*값, a*값 및 b*값을 각각 3회 반복 측정하여 평균값으로 나타내었다.

여기에서 L*은 명도, a*는 적색도, b*는 황색도를 표시한다.

1-3. 실험 결과

도 1은 증숙 횟수에 따른 흑삼의 색도 변화를 나타낸 그래프이다.

실험 결과, 증숙 전 수삼의 L*값은 68.94이며 증숙을 반복할수록 감소하여 9증포에서는 40.60으로 감소하는 것을 확인하였다.

a*값은 증숙 전 16.08이며 1증에서 21.71으로 증가하였으나, 증포를 반복할수록 값이 감소하여 9증에서는 3.19로 나타났다.

b*값 역시 마찬가지로 증숙 전 6.85에서 9증 후 2.65로 증포가 반복됨에 따라 값이 감소하였다.

즉 증숙과 건조를 반복하여 수행할수록 흑삼의 명도, 적색도 및 황색도가 감소하여 색이 어두워지는 것을 알 수 있다.

실험예 2. 벤조피렌의 함량 분석

2-1. 실험 과정

벤조피렌 분석은 식품의약품안전처 "건강기능식품 중 벤조피렌 시험법지침"에 근거하여 다음과 같이 수행되었다.

1) 흑삼 추출물 시료 5 g을 증류수 20 ml에 1시간 침지시킨 후 헥산을 10 ml 주입하여 헥산층을 추출하였다.

2) 추출한 헥산층을 감압농축기 (MG-2100, Buchi, Switzerland)를 이용하여 농축하였다.

3) 농축물을 MeOH 100 ml에 녹인 후, GC-MS (6890series, Agilent, USA)에 주입하여 벤조피렌의 함량을 분석하였다.

2-2. 실험 결과

도 2는 증숙 횟수에 따른 흑삼 추출물에서 검출된 벤조피렌 함량을 나타낸 표이다.

실험 결과, 벤조피렌 함량이 1증포에서는 0.049 ㎍/kg, 6증포에서 0.050 ㎍/kg으로 증포 횟수에 따른 유의한 증가는 없었다.

또한 검출된 벤조피렌의 함량 역시 식품공전에서 제시한 기준치인 2 ㎍/kg 이하인 것을 확인하였다.

따라서 본 발명에 따른 흑삼 추출물의 제조방법으로 제조된 흑삼 추출물은 증포횟수에 관계없이 벤조피렌이 기준치 이하 생성되는 것을 알 수 있다.

실험예 3. 진세노사이드 함량 분석

3-1. 실험 과정

진세노사이드의 함량이 증가하고 종류가 다양하게 존재하는 흑삼 추출물을 제조하기 위해서, 증포 횟수에 따른 흑삼의 진세노사이드 함량을 분석하였다.

1) 흑삼 분말시료 0.50 g을 농축용 플라스크에 평량하고 수포화부탄올 50 ml를 주입한 후 80℃ 환류냉각 추출기에서 1시간 추출하였다.

2) 추출된 흑삼 분말 시료를 10분간 방냉 후 추출액을 여과하고 잔사에 다시 동량의 용매를 넣어 2회 더 반복 추출하였다.

3) 총 3회 추출된 흑삼 분말 시료를 분액깔대기에 옮기고 150 ml 증류수를 가하여 진탕하였다.

4) 부탄올 층과 물 층을 분리하여, 부탄올 층을 농축플라스크에 주입하고 45℃ 수조에서 로터리 이바포레이터(rotary evaporator)를 이용하여 진공 농축하였다.

5) 농축 후 플라스크 내 잔류물을 50% 메탄올 20 ml에 용해하여 0.45 um 멤브레인 필터(membrane filter)로 여과하였다.

6) 여과된 흑삼 시료 분말 잔류물의 진세노사이드 함량을 HPLC(Agilent 1260, Agilent Technologies, USA)를 이용하여 측정하였다. HPLC 분석은 아질런트 포로쉘 (Agilent poroshell) 120EC-C18 컬럼(3.0 mm, 50 mm, 2.7 um)을 이용하였다.

이 때 이동상의 유속과 컬럼 온도는 각각 0.8 ml/min, 35℃로 하고, UV 검출기의 검출 파장은 203 nm로 하여 분석하였다.

3-2. 실험 결과

도 3은 증숙 전과 9증 후 진세노사이드 함량 변화를 나타낸 HPLC 크로마토그램 결과이다.

도 4는 증숙 횟수에 따른 진세노사이드의 함량 변화를 나타낸 표이다.

실험 결과, 증숙 전 진세노사이드 Rg3(s), Rk1, Rg5 및 Rh2는 존재하지 않았지만 증숙이 반복됨에 따라 함량이 점점 증가하는 것을 알 수 있다.

특히 Rg3, Rk1 및 Rg5은 기존의 수삼 또는 홍삼에 비해 함량이 매우 높아진 것을 확인하였다.

홍삼(1~2증)에서 Rg3, Rk1 및 Rg5 함량의 합은 0.9~2.5 mg/g이나, 흑삼(3~9증)은 4~10.7 mg/g까지 증가하였다.

반면, Rg1, Re, Rb1, Rb2 및 Rd는 증포를 거듭할수록 함량이 감소하였으며, 특히 Rg1, Re 및 Rb2는 7증 이상에서부터 아예 검출되지 않는 것을 확인하였다.

이는 배경기술에서 서술한 바와 같이 증숙 과정에서 진세노사이드의 당이 분해되어 다른 진세노사이드로 전환되는 것으로, 새로운 진세노사이드의 함량이 증가하는 대신 기존의 진세노사이드의 함량이 감소하게 된다.

진세노사이드는 종류에 따라 다른 활성과 효능을 갖기 때문에 다양한 종류의 진세노사이드를 함유하는 것이 효능 면에서 용이하다고 할 수 있다.

따라서 증숙을 통해 새로운 진세노사이드가 생성되면서도 기존의 진세노사이드가 적당하게 함유되어 있는 흑삼 추출물의 제조 조건이 요구된다.

실험 결과를 토대로 진세노사이드가 다양하게 포함된 흑삼 추출물의 제조방법을 알아보면, 우선 7증 이상은 기존의 진세노사이드인 Rg1, Re 및 Rb2가 존재하지 않으므로, 6증 이하의 증숙 횟수를 설정해야 한다.

아울러, 신규한 진세노사이드인 Rg3, Rk1 및 Rg5의 총 함량이 3~4증에 비해 5~6증에서 60~90% 이상 증가하였으므로 5~6회 증숙하는 것이 다양한 진세노사이드를 함유하면서도 Rg3, Rk1 및 Rg5의 함량이 높은 흑삼을 제조할 수 있게 된다.

실험예 4. 총 페놀 함량 측정

4-1. 실험 준비

실시예 1에 기재된 방법으로 제조된 흑삼 추출물을 실험 재료로 준비하였으며, 이때 증숙 횟수에 따라 각각의 흑삼 추출물을 제조하였다.

4-2. 실험 과정

페놀성 물질이 phosphomolybic acid와 반응하여 청색을 나타내는 현상을 이용한 방법으로 Folin-Denis법에 의해 측정하였다.

1) 흑삼 추출물 100 mg당 1 mL PBS Buffer를 첨가하여 100 mg/mL 농도의 추출물 용액을 제조하여 시료 용액으로 사용하였다.

2) 증류수 2.5 mL에 시료 0.33 mL, Folin- Denis 0.16 mL, NO2CO3 0.3 mL을 넣고 암실에서 30분 발색시킨 후 760 nm에서 흡광도를 측정하였으며 standard는 tannic acid를 사용하였다.

4-3. 실험 결과

도 5는 증포 횟수에 따른 흑삼 추출물의 총 페놀 함량을 나타낸 그래프이다.

실험 결과, 총 페놀 함량이 1증포에서 17.25 mg/g, 6증포에서 39.83 mg/g, 9증포에서는 64.42 mg/g으로 증포 횟수가 증가할수록 총 페놀 함량이 증가하는 것을 확인하였다.

실험예 5. 항산화 활성 측정

5-1. DPPH 라디칼 소거능 측정

흑삼 추출물의 항산화 활성을 알아보고자 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다.

1) 실험 과정

흑삼 추출물 100 mg 당 1 mL 메탄올을 첨가하여 100 mg/mL 농도의 추출물 용액을 제조하여 시료 용액으로 사용하였다.

시료 용액 50 μL에 1.5×10^-4 mM DPPH용액 150 μL을 가한 후 30분 후에 515 nm에서 흡광도를 측정하였으며 라디칼 소거능(%)을 다음의 식으로 계산한 후 각 농도별 라디칼 소거능에 대한 검량선에서 라디칼 소거능이 50%가 되는 농도인 IC₅₀을 구하였다

Free radical scavenging effect ＝ (Abs_DPPH－Abs_sample) / Abs_DPPH ×100

2) 실험 결과

도 6은 증포 횟수에 따른 흑삼 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.

실험 결과, 증포 횟수가 증가할수록 DPPH 라디칼 IC₅₀ 값(DPPH 라디칼을 50% 소거시키는데 필요한 농도)은 감소하여, 흑삼 추출물의 항산화능이 증가한 것을 알 수 있다.

7증포 이상 수행한 흑삼 추출물 사이에서는 DPPH 라디칼 IC₅₀ 값에 큰 차이가 없어 7회 이상의 증포는 항산화능 향상에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 사료된다.

5-2. ABTS 라디칼 소거능 측정

1) 실험 과정

ABTS[2,2'-azinobis(3 ethybenzothiazoline-6-sulfonic acid)] radical cation decolorization의 측정은 Pellegrini 등 의 방법에 의해 측정하였다.

추출물 100 mg 당 1 mL 메탄올을 첨가하여 100 mg/mL 농도의 추출물 용액을 제조하여 시료 용액으로 사용하였다. 시료 용액 50 μL와 ABTS solution 1 mL를 30초 동안 섞은 후 2.5분간 incubation하여 734 nm에서 흡광도를 측정하여 라디칼 소거능(%)을 계산한 후 각 농도별 라디칼 소거능에 대한 검량선에서 라디칼 소거능이 50%가 되는 농도인 IC₅₀을 구하였다.

2) 실험 결과

도 7은 증포 횟수에 따른 흑삼 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.

실험 결과, 증포 횟수가 증가할수록 ABTS 라디칼 IC₅₀ 값(ABTS 라디칼을 50% 소거시키는데 필요한 농도)은 감소하여, 흑삼 추출물의 항산화능이 증가한 것을 알 수 있다.

또한 DPPH 실험 결과와 마찬가지로, 7증포 이상 수행한 흑삼 추출물 사이에서는 IC₅₀ 값에 큰 차이가 없어 7회 이상의 증포는 항산화능 향상에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 사료된다.

5-3. Fe2 + 킬레이트 소거능 측정

1) 실험 과정

금속 킬레이팅제는 산화환원 전위를 감소시켜 금속이온의 산화상태를 안정화시키기 때문에 제2의 항산화제라고 할 만큼 중요하다.

Fe^{2 +}는 여러 금속 이온 중 가장 강력한 산화촉진제로 본 실험에서는 Fe^{2 +}에 대한 흑삼 추출물의 킬레이팅 효과를 측정하였다.

1) 흑삼 추출물 용액 50 ul와 2 mM FeCl2 용액 5 ul 를 혼합한 후, 상온에서 5분간 반응시켰다.

2) 증류수 130 ul를 혼합하고, 이 용액에 5 mM ferrozine 15 ul를 가한 후 다시 10분간 반응시킨 후에 Microplate reader(M2, Molecular Device, Canada)를 이용하여 562 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3) 철 이온에 대한 킬레이트 효과를 %로 계산한 후 각 농도별 킬레이트 소거능에 대한 검량선에서 킬레이트 소거능이 50%가 되는 농도인 IC₅₀을 구하였다.

2) 실험 결과

도 8은 증포 횟수에 따른 흑삼 추출물의 Fe^{2 +} 킬레이트 소거능을 나타낸 그래프이다.

실험 결과, 1증 흑삼 추출물 3.73 mg/ml에서 9증 흑삼 추출물 0.79 mg/ml으로 측정되어, 증포 횟수가 증가할수록 흑삼 추출물의 항산화능이 증가한 것을 알 수 있다.

또한 6증포 이상 수행한 흑삼 추출물의 킬레이트 소거능이 1.15, 1.13, 1.05, 0.79 mg/ml로 IC₅₀ 값에 큰 차이가 없어 6회 이상의 증포는 항산화능 향상에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 사료된다.

5-4. SOD 유사활성 ( Superoxide dismutase like activity ) 측정

1) 실험 과정

흑삼 추출물의 SOD 유사활성은 마크룬드 등의 방법에 따라 과산화수소로 전환시키는 반응을 촉매하는 피로갈롤 (pyrogallol)의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다.

1) 흑삼 추출물 0.2 ㎖에 pH 8.5로 보정한 Tris-HCl 완충용액 (50 mM Tris [hydroxymethyl] amino methane, 10 mM EDTA, pH 8.5) 3 ㎖과 7.2 mM 피로갈롤 0.2 ㎖을 첨가하여 25 ℃에서 10 분간 반응 후, 1 N HCl 1 ㎖을 가하여 반응을 정지시켰다.

2) 반응액 중 산화된 피로갈롤 양은 UV/VIS spectrophotometer를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하고, 흡광도의 차이를 백분율(%)로 계산하였으며, 소거능이 50%가 되는 농도인 IC₅₀을 구하였다.

2) 실험 결과

도 9는 증포 횟수에 따른 흑삼 추출물의 SOD 유사활성능을 나타낸 그래프이다.

실험 결과, 1증 흑삼 추출물 4.32 mg/ml에서 9증 흑삼 추출물 0.89 mg/ml으로 측정되어, 증포 횟수가 증가할수록 흑삼 추출물의 항산화능이 증가한 것을 알 수 있다.

또한 6증포 이상 수행한 흑삼 추출물의 SOD 유사활성이 1.28, 1.08, 0.94, 0.89 mg/ml로 IC₅₀ 값에 큰 차이가 없어 6회 이상의 증포는 항산화능 향상에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 사료된다.

이상의 실험 결과를 통해 벤조피렌이 기준치 이하로 발생하여 안전하게 섭취할 수 있고, 5~6회 증포를 통해 진세노사이드의 종류가 다양하게 존재하며, 효율적인 증포 횟수로 제조시간 및 비용을 절약할 수 있는 항산화 기능성 흑삼 추출물을 제조하는 방법을 도출할 수 있다.

Claims (5)

1. 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법이되,
   수삼에 이산화탄소를 가압하고 85~100℃의 온도에서 150~300분 동안 증숙하는 단계;
   상기 증숙된 수삼을 건조하는 단계;
   상기 증숙 단계 및 건조 단계를 5회 반복하여 흑삼을 제조하는 단계;
   상기 흑삼을 열수 추출하는 단계; 및
   상기 추출물을 저온 진공 건조하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 건조하는 단계는 진공 건조방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 항산화 기능성 흑삼 추출물의 제조방법.
   
3. 청구항 1 또는 2에 기재된 방법으로 제조된 항산화 기능성 흑삼 추출물.
   
4. 청구항 3에 있어서,
   상기 흑삼 추출물은 진세노사이드 Rg3, Rg5 및 Rk1을 4~11 mg/g 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화 기능성 흑삼 추출물.
   
5. 청구항 3에 있어서,
   상기 흑삼 추출물은 총 페놀 함량과 항산화 활성이 증가한 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는 항산화 기능성 흑삼 추출물.
   

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