KR20160027582A

KR20160027582A - 자살벡터를 이용하여 다제내성 균주의 변이주를 제작하는 방법

Info

Publication number: KR20160027582A
Application number: KR1020140115545A
Authority: KR
Inventors: 오만환; 한규동
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2014-09-01
Filing date: 2014-09-01
Publication date: 2016-03-10
Also published as: KR101685759B1

Abstract

본 발명은 다제내성 균주에서 복제되지 않고, 다제내성 균주의 변이주 제작에 사용될 수 있는 자살벡터, 상기 자살벡터를 포함하는 다제내성 균주의 변이주 제작용 키트, 상기 자살벡터를 이용하여 다제내성 균주의 표적유전자가 결실된 변이주를 제작하는 방법 및 상기 방법으로 제작되어 다제내성 균주의 표적유전자가 결실된 변이주에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 다제내성 균주의 변이주 제작용 자살벡터 또는 다제내성 균주의 변이주 제작용 키트를 이용하면, 다양한 다제내성 균주의 연구에 사용할 수 있는 제한된 항생제 저항성 유전자만을 이용하여도, 다제내성 균주의 게놈 DNA에서 하나 또는 다수의 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 결실된 변이주를 제작할 수 있으므로, 다양한 다제내성 균주의 유전체, 생리활성 등의 다양한 분야의 연구에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

자살벡터를 이용하여 다제내성 균주의 변이주를 제작하는 방법{Process for preparing murtant strain of multidrug-resistant strain using suicide vector}

본 발명은 자살벡터를 이용하여 다제내성 균주의 변이주를 제작하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 다제내성 균주에서 복제되지 않고, 다제내성 균주의 변이주 제작에 사용될 수 있는 자살벡터, 상기 자살벡터를 포함하는 다제내성 균주의 변이주 제작용 키트, 상기 자살벡터를 이용하여 다제내성 균주의 표적유전자가 결실된 변이주를 제작하는 방법 및 상기 방법으로 제작되어 다제내성 균주의 표적유전자가 결실된 변이주에 관한 것이다.

항생제는 축산이나 수산업에 있어서 질병에 대하여 예방의 차원 또는 성장촉진을 위해서 사용되거나 치료를 목적으로 빈번히 사용되어 왔다. 그러나, 항생제의 과다사용으로 인하여 항생제에 내성을 가진 항생제 내성균의 발생이 증가하고 있을 뿐만 아니라, 상기 항생제 내성균은 축수산 식품을 통하여 사람에게 전파될 수 있다는 위험성으로 인하여, 이들의 내성을 유발하는 작용기작을 규명하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

한편, 상기 항생체에 의하여 내성이 유발된 균주 이외에도 자연계에는 천연적으로 다양한 항생제에 대하여 내성을 나타내는 내성균이 존재한다. 예를 들어, 다제내성 그람음성 균주에 속하는 것으로 알려진 아시네토박터 속(Acinetobacter sp.) 균주는 흔히 토양이나 물 등의 자연환경에 널리 존재하며 특히 병원환경에 오랫동안 서식하다가 면역력이 약한 환자에게서 결막염, 피부염, 폐렴, 뇌수막염, 패혈증, 심내막염, 복강 내 감염, 수술부위 감염, 요로감염 등의 합병증을 일으키는 전형적인 병원감염균으로 알려져 있다. 현재까지 연구된 아시네토박터 속 균주로 동정된 균주는 27종이 알려져 있고, 혼성화방법에 의하여 구별되는 종류로는 약 11종이 알려져 있다. 이 중에서도 아시네토박터 캘코아세티쿠스(A. calcoaceticus, genospecies 1형), 아시네토박터 바우마니(A. baumannii, genospecies 2형), 아시네토박터 피티(A. pittii, genospecies 3형) 및 아시네토박터 노소코미알리스(A. nosocomialis, genospecies 13 TU)는 유전적으로 밀접하게 연관되어 있어서 표현형에 기초하여 분류하는 일반적인 방법으로는 상기 균주를 구별하는 것 조차 어려운 실정이어서, 때로는 이들 균주를 모아 ACB 복합균주(A. calcoaceticus-A. baumannii complex, ACB complex)라고 지칭하기도 한다.

이처럼 구별이 어려운 다제내성 균주를 보다 간편하기 구별하는 방법을 개발하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 예를 들어, 한국특허공개 제2014-19219호에는 다제내성 균주의 일종인 아시네토박터 속 균주의 유전적 차이를 나타내는 영역을 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 상기 영역을 검출할 수 있는 프로브를 사용하여, 아시네토박터 속 균주를 동정하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 상기 다제내성 균주는 병원에서 이차적으로 감염될 수 있다고 알려져 있기 때문에, 이러한 감염에 의해 발생되는 다양한 증상을 신속하게 치료하는 방법을 개발하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 예를 들어, WO 2010/064261호에는 카르바페넘과 아즈트레오남의 복합제제를 사용하여 다제내성 균주의 일종인 아시네토박터 바우마니 감염증을 치료하는 방법이 개시되어 있고, 한국특허등록 제820960호에는 항균활성을 나타내는 스트렙토마이세스 시나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis) 균주를 이용하여 다제내성 균주의 일종인 아시네토박터 바우마니 감염증을 치료하는 방법이 개시되어 있다.

그럼에도 불구하고, 아직까지는 상기 항생제에 의해 내성이 유발되거나, 또는 천연적으로 다양한 항생제에 대하여 내성을 나타내는 다제내성 균주는 이들에 대한 연구가 충분히 진행되지 않고 있어서, 상기 다제내성 균주의 감염에 의하여 질병이 유발될 경우에는, 이에 대한 치료성공율이 낮다는 문제점이 해결되지 않고 있다. 이같은 문제점을 해결하기 위하여는, 상기 다제내성 균주에서 발현되는 각 유전자의 특성 및 기능을 규명하는 연구가 선행되어야 하지만, 항생제에 대하여 저항성을 나타낸다는 특성 때문에, 상기 다제내성 균주의 유전학적 및 생리학적 연구가 활발히 진행되지 못하고 있는 실정이다. 따라서, 다제내성 균주의 변이주를 용이하게 제작하여, 상기 내성균주의 유전체를 보다 구체적으로 연구할 수 있는 방법론의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 다제내성 균주의 연구에 사용할 수 있는 제한된 항생제 저항성 유전자를 이용하여, 다제내성 변이주를 용이하게 제작하는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 다제내성 균주에서 복제되지 않는 자살벡터를 이용할 경우, 다제내성 균주의 연구에 사용할 수 있는 제한된 항생제 저항성 유전자만을 이용하여도 목적하는 다제내성 균주의 변이주를 용이하게 제작할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 다제내성 균주의 변이주 제작용 자살벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 자살벡터를 포함하는 다제내성 균주의 변이주 제작용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 자살벡터를 이용하여 다제내성 균주의 변이주를 제작하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조되어, 다제내성 균주의 표적 유전자가 결실된 변이주를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 다양한 항생제에 대하여 저항성을 나타내는 다제내성 균주의 연구에 사용할 수 있는 제한된 항생제 저항성 유전자를 이용하여, 다제내성 균주의 변이주를 효과적으로 제작하는 방법을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 자살벡터에 주목하게 되었다.

통상적으로, 자살벡터는 특정 숙주안에서 복제되지 않는 플라스미드 또는 파아지를 의미하는데, 본 발명자들은 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함된 표적 유전자의 전체 또는 그의 일부를 결실 또는 치환 등의 방법으로 변이시키기 위한 수단으로서 사용하기 위하여, 다제내성 균주에서 복제되지 않는 자살벡터를 제작하였다. 본 발명자들이 제작한 자살벡터는 통상의 다른 벡터와 마찬가지로 외래 유전자가 삽입될 수 있는 다클론부위를 포함하는데, 상기 다클론부위는 복잡한 제한효소를 사용하지 않고서도 상기 자살벡터에 DNA 삽입단편을 용이하게 도입할 수 있도록 평활말단이 도입될 수 있는 다양한 제한효소 절단부위를 포함하도록 구성하였다. 이러한 다클론부위로 인하여, 통상적인 PCR 방법으로 제작되어 평활말단을 갖는 DNA 삽입단편은 특별한 제한효소를 처리하지 않고서도 상기 자살벡터에 용이하게 도입될 수 있다.

한편, 본 발명자들은 상기 제작된 자살벡터에 DNA 삽입단편을 도입하여 재조합벡터를 제작하고, 이를 상기 특정 숙주에 도입하면, 단일교차 재조합(single cross-over recombination)을 통해 상기 DNA 삽입단편을 상기 숙주의 게놈에 도입시켜서 형질전환체를 제작할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 다제내성 균주의 변이주 제작용 자살벡터를 제공한다.

본 발명자들은 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함된 표적 유전자의 전체 또는 그의 일부(이하, '표적 폴리뉴클레오티드'라 함)를 결실 또는 치환 등의 방법으로 변이시키기 위한 수단으로서 사용하기 위하여, 다제내성 균주에서 복제되지 않는 자살벡터를 제작하였는데, 상기 자살벡터는 R6K ori, mob RP4 유전자, cat 유전자, sacB 유전자 및 다클론부위를 순차적으로 포함하도록 구성하였다. 상기 자살벡터에 포함된 다클론부위는 복잡한 제한효소를 사용하지 않고서도 상기 자살벡터에 DNA 삽입단편을 용이하게 도입할 수 있도록 평활말단이 도입될 수 있는 다양한 제한효소 절단부위를 포함하도록 구성하였는데, 이로 인하여 통상적인 PCR 방법으로 제작되어 평활말단을 갖는 DNA 삽입단편은 특별한 제한효소를 처리하지 않고서도 상기 자살벡터에 용이하게 도입될 수 있다. 또한, sacB 유전자는 수크로스를 분해하는 효소로 알려진 수크라제를 발현시키는데, 상기 발현된 수크라제는 과다한 수크로스를 포함하는 환경에서는 수크로스를 분해하여 다제내성 균주에게 독성을 나타내는 산물을 생성함으로써, 숙주세포의 게놈DNA에서 단일교차 재조합을 유발시킬 수 있다.

이러한 구성요소를 포함하는 자살벡터에 DNA 삽입단편이 도입된 재조합 벡터를 다제내성 균주에 도입하면, 상기 DNA 삽입단편에 포함된 5'-영역 단편 또는 3'-영역 단편으로 인하여, 1차 단일교차 재조합이 유발되어, 상기 재조합벡터 전체가 다제내성 균주의 게놈 DNA에 삽입된 형질전환체를 제작할 수 있다. 상기 형질전환체의 제작성공여부는 상기 DNA 삽입단편에 포함된 마커영역 단편의 발현여부에 의해 확인될 수 있다. 이어, 상기 제작된 형질전환체를 과량의 수크로스가 포함된 배지에 접종하고 배양하면, 자살벡터에 포함된 sacB 유전자로부터 발현된 수크라제에 의해 수크로스를 분해시키고, 이로부터 생성되는 독성산물로 인하여 상기 재조합벡터가 삽입된 게놈 DNA 내에서 2차 단일교차 재조합이 유발될 수 있다. 상기 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 앞서 삽입된 재조합벡터가 게놈 DNA가 제거되어 야생형 다제내성 균주로 복귀하거나, 또는 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 제거된 다제내성 균주의 변이주가 제조될 수 있다. 상기 변이주의 제조여부는 최종적으로 생산된 균주의 기능 또는 게놈 DNA 크기를 비교하여 확인할 수 있다.

따라서, 상기 제작된 다제내성 균주에서 복제되지 않는 자살벡터에 DNA 삽입단편이 도입된 재조합벡터를 상기 다제내성 균주에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 이를 수크로스가 포함된 배지에서 배양할 경우, 다제내성 균주의 게놈에서 단일교차 재조합이 유발되어 다제내성 균주의 게놈 DNA의 일부가 결실 또는 치환된 변이주를 제작할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 자살벡터는 다제내성 균주의 변이주를 제작하는데 사용할 수 있고, 상기 변이주의 제작시에 동일한 마커영역 단편을 반복적으로 사용하여 연속적으로 다양한 변이주를 제조할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명에서 사용하는 다제내성 균주는 다양한 항생제에 대하여 저항성을 갖고 있어 변이주의 제작시에 사용될 수 있는 항생제 저항성 마커유전자가 제한되는데, 종래의 변이주 제조방법을 사용할 경우에는 사용된 항생제 저항성 마커유전자가 변이주의 게놈 DNA에 잔류하게 되어, 추가적인 변이주를 제작하기 위하여는 또 다른 항생제 저항성 마커유전자를 사용하여야 하므로, 다제내성 균주의 변이주 제작이 제한될 수 밖에 없다.

이러한 종래의 변이주 제조방법과는 달리, 본 발명에서 제공하는 자살벡터를 사용하면 중간과정에서 항생제 저항성 마커유전자를 사용하기는 하지만, 최종적으로 제조된 변이주의 게놈 DNA에는 항생제 저항성 마커유전자가 남아있지 않으므로, 동일한 항생제 저항성 마커유전자를 사용하여 2차 변이주를 제조할 수 있다. 또한, 동일한 마커영역 단편을 사용한 동일한 방식으로, 상기 2차 변이주를 이용한 3차 변이주의 제조, 상기 3차 변이주를 이용한 4차 변이주의 제조 등의 연속적인 변이주를 제조할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 자살벡터는 특정 균주에 대한 특이성을 나타내지 않으므로, 다제내성 균주 뿐만 아니라 다제내성을 나타내지 않는 균주를 대상으로 할 경우에도 변이주를 제작하는데 사용될 수 있다. 그러나, 다제내성을 나타내지 않는 균주를 대상으로 할 경우에는 종래의 벡터를 이용할 경우에 보다 효과적으로 변이주를 제작할 수 있는 반면, 다제내성 균주를 대상으로 할 경우에는 본 발명에서 제공하는 자살벡터를 사용할 경우에 보다 효과적으로 변이주를 제작할 수 있다는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 자살벡터는 다제내성을 나타내는 균주이기만 하다면 이의 변이주 제작을 위하여 제한없이 사용되어 본 발명의 자살벡터가 제공하는 장점을 누릴 수 있다.

본 발명의 용어 "다제내성 균주"란, 다양한 항생제에 대하여 저항성을 나타내는 균주를 의미하는데, 인위적인 항생제 처리로 인하여 후천적으로 항생제에 대하여 내성을 나타내는 균주 뿐만 아니라 천연적으로 다양한 항생제에 대하여 내성을 나타내는 균주를 모두 포함한다,

본 발명에 있어서, 상기 다제내성 균주는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 다제내성을 나타내는 그람음성 균주가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 다제내성을 나타내는 그람음성 간균이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 다제내성을 나타내는 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii, A. baumannii) 균주가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 상기 다제내성 균주의 예시로써, 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii, A. baumannii) 균주를 사용하였다.

본 발명의 용어 "아시네토박터 바우마니 균주(Acinetobacter baumannii, A. baumannii) 균주"란, MRAB(multidrug-resistant Acinetobacter baumannii)라고도 지칭되는 병원균의 일종으로서, 카바페넘계, 아미노글리코사이드계 및 플로로퀴놀론계열의 항생제에 대하여 저항성을 나타내는 감염성 병원균을 의미한다. 상기 균주는 면역저하자, 만성 폐질환자, 당뇨병 환자등에 쉽게 감염된다고 알려져 있다.

본 발명의 용어 "자살벡터(suicide vector)"란, 숙주 균주의 게놈 DNA에 DNA 삽입단편을 전달하기 위한 전달매체가 되는 도입벡터의 일종으로서, 특정 숙주 균주안에서 복제되지 않고, 이에 포함된 삽입단편이 발현되지도 않는 플라스미드 또는 파아지를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 자살벡터는 다제내성 균주의 변이주 제작용 자살벡터인 것으로 해석될 수 있는데, 상기 자살벡터는 다제내성 균주내에서 복제되지 않는 특성을 나타낸다. 이를 위한 구성요소로서 R6K ori, mob RP4 유전자, cat 유전자, sacB 유전자 및 다클론부위가 순차적으로 포함하는 형태가 될 수 있는데, 상기 다클론부위는 다양한 평활말단을 생성하는 제한효소에 의하여 절단될 수 있는 부위를 포함할 수 있다. 상기 평활말단을 생성하는 제한효소는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 PstI, FspI, NotI, BglII 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 자살벡터에 포함된 R6K ori, mob RP4 유전자, cat 유전자, sacB 유전자, 다클론부위 등은 야생형 서열 뿐만 아니라, 동일한 기능을 나타내는 한, 이들과 상동성을 나타내는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있는데, 예를 들어, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.

예를 들어, 본 발명에서 제공하는 자살벡터는 도 1b에 도시된 개열지도를 가지는 자살벡터, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 자살벡터가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "DNA 삽입단편"이란, 변이를 유발시키고자 하는 목적 균주에 도입하여 목적 균주의 유전형질을 변이시킬 수 있는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 DNA 삽입단편은 상기 자살벡터의 다클론부위에 도입되는 DNA 삽입단편은 숙주인 다제내성 균주의 게놈 DNA 내에 도입되어 단일교차 재조합이 유발될 수 있도록 구성된 폴리뉴클레오티드와 자살벡터의 도입여부를 확인할 수 있는 마커를 포함하도록 구성될 수 있다.

구체적으로, 상기 DNA 삽입단편은 다제내성 균주의 게놈 DNA에 위치한 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드의 상류에 인접한 염기서열(이하, '5'-영역 단편'이라 함), 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드의 하류에 인접한 염기서열(이하, '3'-영역 단편'이라 함) 및 다제내성 균주가 저항성을 나타내지 않은 항생제에 대한 저항성을 가지는 항생제 마커 단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열(이하, '마커영역 단편'이라 함)을 순차적으로 포함하도록 구성될 수 있는데, 상기 5'-영역 단편과 3'-영역 단편은 다제내성 균주의 게놈 DNA 내에서 단일교차 재조합을 유발시킬 수 있고, 상기 마커영역 단편은 자살벡터의 도입여부를 확인할 수 있는 마커로서 작용할 수 있다.

본 발명의 용어 "표적 폴리뉴클레오티드의 상류에 인접한 염기서열"이란, 다제내성 균주의 게놈 DNA에서 표적 폴리뉴클레오티드의 5'에 연결된 염기서열 또는 이와 동일한 염기서열을 가지는 DNA 단편을 의미하고, 본 발명의 용어 "표적 폴리뉴클레오티드의 하류에 인접한 염기서열"이란, 다제내성 균주의 게놈 DNA에서 표적 폴리뉴클레오티드의 3'에 연결된 염기서열 또는 이와 동일한 염기서열을 가지는 DNA 단편을 의미한다.

본 발명의 용어 "항생제 마커 단백질"이란, 항생제에 대하여 저항성을 부여하여, 형질전환시 마커로서 사용될 수 있는 단백질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 항생제 마커 단백질을 코딩하는 유전자는 DNA 삽입단편의 마커영역 단편으로 사용되고, 상기 자살벡터에 DNA 삽입단편이 도입되어 제작된 재조합벡터가 다제내성 균주에 도입되어, 이의 게놈 DNA에 삽입되면, 상기 게놈 DNA로부터 제거되기 전까지는 독립적으로 발현된다. 상기 항생제 마커 단백질을 코딩하는 유전자는 다제내성 균주에 내재적으로 포함되지 않는 한, 종래에 사용되었던 모든 항생제 마커 단백질을 코딩하는 유전자를 사용할 수 있는데, 다제내성 균주에 따라 상기 항생제 마커 단백질은 적절한 것을 사용할 수 있다.

예를 들어, 본 발명에서는 다제내성 균주로서 아시네토박터 바우마니 균주를 사용하였는데, 상기 아시네토박터 바우마니 균주에 사용할 수 있는 항생제 마커 단백질은 카나마이신 저항성 유전자인 nptI, 테트라사이클린 저항성 유전자인 tetM, tetC, tetR 등을 단독으로 또는 조합한 것이 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 다제내성 균주의 일종인 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에 위치한 표적 유전자의 상류에 인접한 염기서열(5'-영역 단편), 상기 표적 유전자의 하류에 인접한 염기서열(3'-영역 단편) 및 아시네토박터 바우마니 균주가 저항성을 나타내지 않은 카나마이신에 대한 저항성을 나타내는 단백질을 코딩하는 nptI 유전자의 염기서열(마커영역 단편)을 순차적으로 포함하도록 설계된 DNA 삽입단편을 합성하여 사용하였다.

본 발명의 용어 "표적 유전자"란, "내재 유전자"라고도 하고, 상기 목적하는 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함되어 상기 목적 유전자를 사용하여 변이를 유발시키는 대상이 되는 유전자를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 표적 유전자는 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함되어 결실 또는 치환의 대상이 되는 유전자인 것으로 해석될 수 있는데, 상기 표적 유전자는 다제내성 균주에 따라 적절한 것이 될 수 있다.

예를 들어, 본 발명에서는 다제내성 균주로서 아시네토박터 바우마니 균주를 사용하였는데, 상기 아시네토박터 바우마니 균주의 표적 유전자로는 게놈 DNA에 포함된 basD, bauA, rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD, rhbC3 등을 단독으로 또는 조합한 것이 될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 자살벡터는 이의 다클론 부위에 삽입될 수 있는 상기 DNA 삽입단편을 서로 다른 목적에 부합되도록 설계하여, 다양한 형태의 다제내성 균주의 변이주를 제작하는데 사용될 수 있다.

첫 번째 사용예로서, 본 발명에서 제공하는 자살벡터는 상기 DNA 삽입단편과 함께, 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함된 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 결실된 변이주의 제작에 사용될 수 있다.

이하에서는, 5'-영역 단편(A), 표적 유전자(X), 3'-영역 단편(B)을 포함하는 다제내성 균주의 게놈 DNA(이하, '-A-X-B-'로 표시함)와 5'-영역 단편(A), 3'-영역 단편(B), 마커영역 단편(nptI), sacB 유전자(sacB) 등을 포함하는 자살벡터유래 재조합벡터(이하, '-A-B-nptI-sacB-'로 표시함)를 사용하여, 본 발명에서 제공하는 다제내성 균주의 변이주의 제조방법을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

상기 재조합벡터(-A-B-nptI-sacB-)를 다제내성 균주에 도입하면, 1차 단일교차 재조합을 통해 게놈 DNA(-A-X-B-)에 도입되어, 형질전환체(-A-B-nptI-sacB--A-X-B- 또는 -A-X-B-nptI-sacB--A-B-)를 제작할 수 있다. 이어, 상기 형질전환체를 과량의 수크로스가 포함된 배지에 접종하고 배양하면, 상기 형질전환체에 포함된 sacB 유전자로부터 발현된 수크라제에 의해 수크로스를 분해시키고, 이로부터 생성되는 독성산물로 인하여 상기 재조합벡터가 삽입된 게놈 DNA 내에서 2차 단일교차 재조합이 유발될 수 있다.

상기 형질전환체(-A-B-nptI-sacB--A-X-B-)의 5'-영역 단편(A)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 야생형 게놈 DNA(-A-X-B-)와 DNA 단편(-B-nptI-sacB--A)이 생성되고; 상기 형질전환체(-A-B-nptI-sacB--A-X-B-)의 3'-영역 단편(B)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 표적 유전자가 결실된 게놈 DNA(-A-B-)와 DNA 단편(-nptI-sacB--A-X-B)이 생성되며; 상기 형질전환체(-A-X-B-nptI-sacB--A-B-)의 5'-영역 단편(A)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 표적 유전자가 결실된 게놈 DNA(-A-B-)와 DNA 단편(-X-B-nptI-sacB--A)이 생성되고; 상기 형질전환체(-A-X-B-nptI-sacB--A-B-)의 3'-영역 단편(B)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 야생형 게놈 DNA(-A-X-B-)와 DNA 단편(-nptI-sacB--A-B)이 생성된다.

상기 생성된 DNA 단편은 세포내에서 다양한 뉴클레아제에 의해 분해되어 제거되므로, 결과적으로는 야생형 DNA를 갖는 야생형 균주 또는 표적 유전자가 결실된 게놈 DNA를 갖는 변이주를 수득할 수 있다. 상기 야생형 균주에 비하여 변이주는 표적 유전자가 결실되어 게놈 DNA의 크기가 감소하므로, 상기 표적 유전자의 기능발현 여부 또는 전기영동을 이용한 게놈 DNA의 크기분석 등의 방법을 통해 변이주를 간단하게 구별할 수 있다.

아울러, 상술한 바와 같이 동일한 마커영역 단편을 반복적으로 사용하여 다양한 변이주를 제조할 수 있다는 장점을 응용하여, 본 발명에서 제공하는 자살벡터는 다제내성 균주에 포함된 다중의 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 결실된 변이주를 제조하는데 사용될 수 있는데, 이때 다중의 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드는 순차적으로 하나씩 결실되어 최종적으로는 모든 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 결실된 변이주를 제조할 수 있다.

예를 들아, 유전자 M, N, O, P 및 Q 가 순차적으로 포함된 게놈 DNA(-M-N-O-P-Q-)를 포함하는 다제내성 균주 균주에, 유전자 N을 결실시키기 위한 재조합벡터(-M-O-nptI-sacB-)를 가하고 수크로스배지에서 배양하여 유전자 N이 결실된 게놈 DNA(-M-O-P-Q-)를 포함하는 1차 변이주를 제작하고; 상기 1차 변이주에 유전자 O를 결실시키기 위한 재조합벡터(-M-P-nptI-sacB-)를 가하고 수크로스배지에서 배양하여 유전자 O가 결실된 게놈 DNA(-M-P-Q-)를 포함하는 2차 변이주를 제작하며; 상기 2차 변이주에 유전자 P를 결실시키기 위한 재조합벡터(-M-Q-nptI-sacB-)를 가하고 수크로스배지에서 배양하여 유전자 P가 결실된 게놈 DNA(-M-Q-)를 포함하는 3차 변이주를 제작할 수 있다. 이때, 동일한 항생제 저항성 마커유전자(nptI)를 반복적으로 사용할 수 있다.

두 번째 사용예로서, 본 발명에서 제공하는 자살벡터는 상기 DNA 삽입단편과 함께, 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함된 표적 유전자 전체가 아닌 일부가 결실된 변이주의 제작에 사용될 수 있다.

이하에서는, 하나의 유전자 내에 포함된 5'-영역 단편(a), 표적 폴리뉴클레오티드(x), 3'-영역 단편(b)을 포함하는 표적 유전자를 포함하는 다제내성 균주의 게놈 DNA(이하, '-axb-'로 표시함)와 5'-영역 단편(a), 3'-영역 단편(b), 마커영역 단편(nptI), sacB 유전자(sacB) 등을 포함하는 자살벡터유래 재조합벡터(이하, '-ab-nptI-sacB-'로 표시함)를 사용하여, 다제내성 균주의 표적 폴리뉴클레오티드가 결실된 변이주의 제조방법을 구체적으로 설명한다.

상기 재조합벡터(-ab-nptI-sacB-)를 다제내성 균주에 도입하면, 1차 단일교차 재조합을 통해 게놈 DNA(-axb-)에 도입되어, 형질전환체(-ab-nptI-sacB--axb- 또는 -axb-nptI-sacB--ab-)를 제작할 수 있다. 이어, 상기 형질전환체를 과량의 수크로스가 포함된 배지에 접종하고 배양하면, 상기 형질전환체에 포함된 sacB 유전자로부터 발현된 수크라제에 의해 수크로스를 분해시키고, 이로부터 생성되는 독성산물로 인하여 상기 재조합벡터가 삽입된 게놈 DNA 내에서 2차 단일교차 재조합이 유발될 수 있다.

상기 형질전환체(-ab-nptI-sacB--axb-)의 5'-영역 단편(a)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 야생형 게놈 DNA(-axb-)와 DNA 단편(b-nptI-sacB--a)이 생성되고; 상기 형질전환체(-ab-nptI-sacB--axb-)의 3'-영역 단편(b)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 표적 폴리뉴클레오티드가 결실된 게놈 DNA(-ab-)와 DNA 단편(-nptI-sacB--axb)이 생성되며; 상기 형질전환체(-axb-nptI-sacB--ab-)의 5'-영역 단편(a)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 표적 폴리뉴클레오티드가 결실된 게놈 DNA(-ab-)와 DNA 단편(xb-nptI-sacB--a)이 생성되고; 상기 형질전환체(-axb-nptI-sacB--ab-)의 3'-영역 단편(b)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 야생형 게놈 DNA(-axb-)와 DNA 단편(-nptI-sacB--ab)이 생성된다.

상기 생성된 DNA 단편은 세포내에서 다양한 뉴클레아제에 의해 분해되어 제거되므로, 결과적으로는 야생형 DNA를 갖는 야생형 균주 또는 표적 유전자가 결실된 게놈 DNA를 갖는 변이주를 수득할 수 있다. 상기 야생형 균주에 비하여 변이주는 표적 폴리뉴클레오티드가 제거되어 표적 유전자의 기능이 억제되거나 또는 게놈 DNA의 크기가 감소하므로, 상기 표적 유전자 기능발현 여부 또는 전기영동을 통한 게놈 DNA의 크기분석 등의 방법을 통해 변이주를 간단하게 구별할 수 있다.

세 번째 사용예로서, 본 발명에서 제공하는 자살벡터는 상기 DNA 삽입단편과 함께, 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함된 표적 유전자가 치환된 변이주의 제작에 사용될 수 있다.

이하에서는, 5'-영역 단편(A), 표적 유전자(X), 3'-영역 단편(B)을 포함하는 다제내성 균주의 게놈 DNA(이하, '-A-X-B-'로 표시함)와 5'-영역 단편(A), 치환 유전자(E), 3'-영역 단편(B), 마커영역 단편(nptI), sacB 유전자(sacB) 등을 포함하는 자살벡터유래 재조합벡터(이하, '-A-E-B-nptI-sacB-'로 표시함)를 사용하여, 다제내성 균주의 표적 유전자가 치환된 변이주의 제조방법을 구체적으로 설명한다.

상기 재조합벡터(-A-E-B-nptI-sacB-)를 다제내성 균주에 도입하면, 1차 단일교차 재조합을 통해 게놈 DNA(-A-X-B-)에 도입되어, 형질전환체(-A-E-B-nptI-sacB--A-X-B- 또는 -A-X-B-nptI-sacB--A-E-B-)를 제작할 수 있다. 이어, 상기 형질전환체를 과량의 수크로스가 포함된 배지에 접종하고 배양하면, 상기 형질전환체에 포함된 sacB 유전자로부터 발현된 수크라제에 의해 수크로스를 분해시키고, 이로부터 생성되는 독성산물로 인하여 상기 재조합벡터가 삽입된 게놈 DNA 내에서 2차 단일교차 재조합이 유발될 수 있다.

상기 형질전환체(-A-E-B-nptI-sacB--A-X-B-)의 5'-영역 단편(A)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 야생형 게놈 DNA(-A-X-B-)와 DNA 단편(-E-B-nptI-sacB--A)이 생성되고; 상기 형질전환체(-A-E-B-nptI-sacB--A-X-B-)의 3'-영역 단편(B)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 표적 유전자가 치환된 게놈 DNA(-A-E-B-)와 DNA 단편(-nptI-sacB--A-X-B)이 생성되며; 상기 형질전환체(-A-X-B-nptI-sacB--A-E-B-)의 5'-영역 단편(A)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 표적 유전자가 치환된 게놈 DNA(-A-E-B-)와 DNA 단편(-X-B-nptI-sacB--A)이 생성되고; 상기 형질전환체(-A-X-B-nptI-sacB--A-E-B-)의 3'-영역 단편(B)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 야생형 게놈 DNA(-A-X-B-)와 DNA 단편(-nptI-sacB--A-E-B)이 생성된다.

상기 생성된 DNA 단편은 세포내에서 다양한 뉴클레아제에 의해 분해되어 제거되므로, 결과적으로는 야생형 DNA를 갖는 야생형 균주 또는 표적 유전자가 치환된 게놈 DNA를 갖는 변이주를 수득할 수 있다. 상기 야생형 균주에 비하여 변이주는 표적 유전자가 치환되므로, 상기 표적 유전자 또는 치환 유전자의 기능발현 여부 등의 방법을 통해 변이주를 간단하게 구별할 수 있다.

네 번째 사용예로서, 본 발명에서 제공하는 자살벡터는 상기 DNA 삽입단편과 함께, 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함된 표적 유전자의 일부 폴리뉴클레오티드(표적 폴리뉴클레오티드)가 치환된 변이주의 제작에 사용될 수 있다.

이하에서는, 하나의 유전자 내에 포함된 5'-영역 단편(a), 표적 폴리뉴클레오티드(x), 3'-영역 단편(b)을 포함하는 표적 유전자를 포함하는 다제내성 균주의 게놈 DNA(이하, '-axb-'로 표시함)와 5'-영역 단편(a), 치환 폴리뉴클레오티드(e), 3'-영역 단편(b), 마커영역 단편(nptI), sacB 유전자(sacB) 등을 포함하는 자살벡터유래 재조합벡터(이하, '-aeb-nptI-sacB-'로 표시함)를 사용하여, 다제내성 균주의 표적 폴리뉴클레오티드가 치환된 변이주의 제조방법을 이하에서 구체적으로 설명한다.

상기 재조합벡터(-aeb-nptI-sacB-)를 다제내성 균주에 도입하면, 1차 단일교차 재조합을 통해 게놈 DNA(-axb-)에 도입되어, 형질전환체(-aeb-nptI-sacB--axb- 또는 -axb-nptI-sacB--aeb-)를 제작할 수 있다. 이어, 상기 형질전환체를 과량의 수크로스가 포함된 배지에 접종하고 배양하면, 상기 형질전환체에 포함된 sacB 유전자로부터 발현된 수크라제에 의해 수크로스를 분해시키고, 이로부터 생성되는 독성산물로 인하여 상기 재조합벡터가 삽입된 게놈 DNA 내에서 2차 단일교차 재조합이 유발될 수 있다.

상기 형질전환체(-aeb-nptI-sacB--axb-)의 5'-영역 단편(a)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 야생형 게놈 DNA(-axb-)와 DNA 단편(eb-nptI-sacB--a)이 생성되고; 상기 형질전환체(-aeb-nptI-sacB--axb-)의 3'-영역 단편(b)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 표적 폴리뉴클레오티드가 치환된 게놈 DNA(-aeb-)와 DNA 단편(-nptI-sacB--axb)이 생성되며; 상기 형질전환체(-axb-B-nptI-sacB--aeb-)의 5'-영역 단편(a)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 표적 폴리뉴클레오티드가 치환된 게놈 DNA(-aeb-)와 DNA 단편(xb-nptI-sacB--a)이 생성되고; 상기 형질전환체(-axb-nptI-sacB--aeb-)의 3'-영역 단편(b)에서 2차 단일교차 재조합이 유발되면, 야생형 게놈 DNA(-axb-)와 DNA 단편(-nptI-sacB--aeb)이 생성된다.

상기 생성된 DNA 단편은 세포내에서 다양한 뉴클레아제에 의해 분해되어 제거되므로, 결과적으로는 야생형 DNA를 갖는 야생형 균주 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 치환된 게놈 DNA를 갖는 변이주를 수득할 수 있다. 상기 야생형 균주에 비하여 변이주는 표적 유전자의 일부가 치환되었으므로, 상기 표적 유전자의 기능발현 여부 등의 방법을 통해 변이주를 간단하게 구별할 수 있다.

다섯 번째 사용예로서, 본 발명에서 제공하는 자살벡터는 상기 DNA 삽입단편과 함께, 다제내성 균주에 포함된 서로 다른 두 개의 표적 유전자가 동시에 결실된 변이주의 제작에 사용될 수 있다.

이하에서는, 5'-영역 단편(A), 제1 표적 유전자(X), 중간 단편(B), 제2 표적 유전자(Y) 및 3'-영역 단편(C)을 포함하는 다제내성 균주의 게놈 DNA(이하, '-A-X-B-Y-C-'로 표시함); 5'-영역 단편(A), 중간 단편(B), 제1 마커영역 단편(nptI), sacB 유전자(sacB) 등을 포함하는 자살벡터유래 제1 재조합벡터(이하, '-A-B-nptI-sacB-'로 표시함); 및 중간 단편(B), 3'-영역 단편(C), 제2 마커영역 단편(tetR), sacB 유전자(sacB) 등을 포함하는 자살벡터유래 제2 재조합벡터(이하, '-B-C-tetR-sacB-'로 표시함)를 사용하여, 다제내성 균주의 서로 다른 두 개의 표적 유전자가 동시에 결실된 변이주의 제조방법을 구체적으로 설명한다.

일례로서, 상기 제1 재조합벡터(-A-B-nptI-sacB-)와 제2 재조합벡터(-B-C-tetR-sacB-)를 다제내성 균주에 도입하면, 1차 단일교차 재조합을 통해 제1 재조합벡터가 게놈 DNA(-A-X-B-Y-C-)의 5'-영역 단편(A)에 도입되어, 1차 형질전환체(-A-B-nptI-sacB--A-X-B-Y-C-)를 제작할 수 있고, 2차 단일교차 재조합을 통해 제2 재조합벡터가 상기 1차 형질전환체의 첫 번째 중간 단편(B)에 도입되어, 2차 형질전환체(-A-B-C-tetR-sacB--B-nptI-sacB--A-X-B-Y-C-)를 제작할 수 있다. 이어, 상기 2차 형질전환체를 과량의 수크로스가 포함된 배지에 접종하고 배양하여, 상기 2차 형질전환체의 3'-영역 단편(C)에서 3차 단일교차 재조합이 유발되면, 제1 표적 유전자(X)와 제2 표적 유전자(Y)가 결실된 게놈 DNA(-A-B-C-)와 DNA 단편(-tetR-sacB--B-nptI-sacB--A-X-B-Y-C)이 생성되는데, 상기 생성된 DNA 단편은 세포내에서 다양한 뉴클레아제에 의해 분해되어 제거되므로, 결과적으로는 제1 표적 유전자(X)와 제2 표적 유전자(Y)가 결실된 게놈 DNA를 갖는 변이주를 제조할 수 있다.

다른 일례로서, 상기 제1 재조합벡터(-A-B-nptI-sacB-)와 제2 재조합벡터(-B-C-tetR-sacB-)를 다제내성 균주에 도입하면, 1차 단일교차 재조합을 통해 제2 재조합벡터가 게놈 DNA(-A-X-B-Y-C-)의 3'-영역 단편(C)에 도입되어, 1차 형질전환체(-A-X-B-Y-C-tetR-sacB--B-C-)를 제작할 수 있고, 2차 단일교차 재조합을 통해 제1 재조합벡터가 상기 1차 형질전환체의 두 번째 중간 단편(B)에 도입되어, 2차 형질전환체(-A-X-B-Y-C-tetR-sacB--B-nptI-sacB--A-B-C-)를 제작할 수 있다. 이어, 상기 2차 형질전환체를 과량의 수크로스가 포함된 배지에 접종하고 배양하여, 상기 2차 형질전환체의 5'-영역 단편(A)에서 3차 단일교차 재조합이 유발되면, 제1 표적 유전자(X)와 제2 표적 유전자(Y)가 결실된 게놈 DNA(-A-B-C-)와 DNA 단편(-X-B-Y-C-tetR-sacB--B-nptI-sacB--A)이 생성되는데, 상기 생성된 DNA 단편은 세포내에서 다양한 뉴클레아제에 의해 분해되어 제거되므로, 결과적으로는 제1 표적 유전자(X)와 제2 표적 유전자(Y)가 결실된 게놈 DNA를 갖는 변이주를 제조할 수 있다.

또 다른 일례로서, 상기 제1 재조합벡터(-A-B-nptI-sacB-)와 제2 재조합벡터(-B-C-tetR-sacB-)를 다제내성 균주에 도입하면, 1차 단일교차 재조합을 통해 상기 제1 재조합벡터의 중간 단편(B) 부위에 제2 재조합벡터가 도입되어, 제3 재조합벡터(-A-B-C-tetR-sacB--B-nptI-sacB-)를 제작할 수 있고, 2차 단일교차 재조합을 통해 제3 재조합벡터가 게놈 DNA(-A-X-B-Y-C-)의 5'-영역 단편(A)에 도입되어, 2차 형질전환체(-A-B-C-tetR-sacB--B-nptI-sacB--A-X-B-Y-C-)를 제작할 수 있다. 이어, 상기 2차 형질전환체를 과량의 수크로스가 포함된 배지에 접종하고 배양하여, 상기 2차 형질전환체의 3'-영역 단편(C)에서 3차 단일교차 재조합이 유발되면, 제1 표적 유전자(X)와 제2 표적 유전자(Y)가 결실된 게놈 DNA(-A-B-C-)와 DNA 단편(-tetR-sacB--B-nptI-sacB--A-X-B-Y-C)이 생성되는데, 상기 생성된 DNA 단편은 세포내에서 다양한 뉴클레아제에 의해 분해되어 제거되므로, 결과적으로는 제1 표적 유전자(X)와 제2 표적 유전자(Y)가 결실된 게놈 DNA를 갖는 변이주를 제조할 수 있다.

상기 각 방법에 의하여 제조된 변이주는 야생형 균주에 비하여 두 개의 표적 유전자가 결실되므로, 상기 각 표적 유전자의 기능발현 여부 또는 전기영동을 통한 게놈 DNA의 크기분석 등의 방법을 통해 변이주를 간단하게 구별할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 다제내성 균주의 일종인 아세토박터 바우마니 균주(A. baumannii)에서 복제되지 않는 자살벡터인 pHKD01 벡터를 제작하고(도 1a 및 1b), 상기 제작된 pHKD01 벡터를 이용하여 다양한 표적 유전자(basD, bauA, rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD 또는 rhbC3)를 결실시킬 수 있는 다양한 상동재조합 벡터(pHKD02 내지 pHK13)를 제작하였다(도 3의 A).

본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 다제내성 균주의 변이주 제작용 자살벡터를 포함하는 다제내성 균주의 변이주 제작용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 다제내성 균주의 게놈 DNA에 DNA 삽입단편을 도입하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 자살벡터 뿐만 아니라, 다제내성 균주의 변이주 제작에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 일례로서, 상기 DNA 삽입단편이 다제내성 균주에 도입되었는지의 여부를 확인하기 위하여, 상기 DNA 삽입단편의 마커영역 단편으로 사용될 수 있는, 다제내성 균주가 저항성을 나타내지 않은 항생제에 대한 저항성을 가지는 항생제 마커 단백질을 코딩하는 유전자가 포함될 수 있다. 그 외에도, 상기 항생제 마커 단백질을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머, DNA 삽입단편을 평활말단으로 절단하기 위한 제한효소(PstI, FspI, NotI, BglII 등), 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 단독으로 또는 필요에 따라 조합하여 포함할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 자살벡터를 이용하여, 다제내성 균주의 변이주를 제작하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 다제내성 균주의 변이주의 제작방법은, (a) R6K ori, mob RP4 유전자, cat 유전자, sacB 유전자 및 다클론부위를 순차적으로 포함하는 자살벡터의 다클론부위에 DNA 삽입단편이 도입된 재조합벡터를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 재조합벡터를 다제내성 균주에 도입하여, 형질전환체를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환체를 수크로스를 포함하는 배지에서 배양하여 표적 유전자가 결실된 변이주를 선발하는 단계를 포함한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 자살벡터를 사용할 경우, 동일한 마커영역 단편을 반복적으로 사용하여 연속적으로 다양한 변이주를 제조할 수 있으므로, 상기 변이주의 제작방법은 표적 유전자를 달리하여 전체 과정을 반복수행함으로써, 다제내성 균주에 포함된 다양한 유전자 중에서 하나 이상의 유전자가 순차적으로 결실된 연속적인 변이주를 제조할 수 있다.

즉, 다제내성 균주로부터 하나의 표적유전자가 결실된 변이주의 게놈 DNA에 존재하는 다른 표적유전자를 추가로 결실시키기 위하여, 상기 (a) 내지 (c) 단계를 반복수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는 방법에 비하여, 상기 (a) 내지 (c) 단계를 반복수행하는 단계를 포함하는 방법을 비교하면, 사용되는 다제내성 균주가 하나의 표적유전자가 결실된 다제내성 균주의 변이주라는 점과 사용되는 DNA 삽입단편이 다른 표적유전자를 결실시키기 위하여 제작된 점이라는 부분에서만 차이가 있다.

즉, 상기 다른 표적 유전자는 목적하는 야생형 또는 변이된 다제내성 균주의 게놈 DNA에서 추가로 결실시키고자 하는 대상이 되므로, 상기 DNA 삽입단편은 다른 표적유전자의 염기서열을 분석하여, 상기 다른 표적유전자에 부합되도록 5'-영역 단편과 3'-영역 단편을 설계하고, 이들과 함께 마커영역 단편을 포함하도록 합성된 형태의 DNA 단편이 될 수 있다. 또한, 상기 DNA 삽입단편에 포함된 마커영역 단편은 이전에 사용된 마커영역 단편과 동일한 것이 될 수도 있고, 다른 것이 될 수도 있다.

예를 들어, 본 발명에서는 다제내성 균주로서 아시네토박터 바우마니 균주를 사용하였으며, 상기 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에 포함된 basD, bauA, rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD, rhbC3 등의 유전자 중에서, basD 유전자를 대상으로 상기 다제내성 균주의 변이주의 제작방법을 적용하여, basD 유전자가 결실된 1차 변이주를 제작하고; 상기 1차 변이주의 게놈 DNA에 포함된 bauA, rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD, rhbC3 등의 유전자 중에서, bauA 유전자를 대상으로 상기 다제내성 균주의 변이주의 제작방법을 적용하여, basD 및 bauA 유전자가 결실된 2차 변이주를 제작하며; 상기 2차 변이주의 게놈 DNA에 포함된 rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD, rhbC3 등의 유전자 중에서, rimL 유전자를 대상으로 상기 다제내성 균주의 변이주의 제작방법을 적용하여, basD, bauA 및 rimL 유전자가 결실된 3차 변이주를 제작하고; 상기 3차 변이주의 게놈 DNA에 포함된 piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD, rhbC3 등의 유전자 중에서, piuB 유전자를 대상으로 상기 다제내성 균주의 변이주의 제작방법을 적용하여, basD, bauA, rimL 및 piuB 유전자가 결실된 4차 변이주를 제작하는 방식으로, 아시네토박터 바우마니 변이주를 연속적으로 제조할 수 있다.

이하에서는, 본 발명에서 제공하는 다제내성 균주의 변이주의 제작방법을 각 단계별로 나누어 보다 구체적으로 설명한다.

첫 째, 본 발명에서 제공하는 다제내성 균주의 변이주의 제작방법에 있어서, (a) 단계는 다제내성 균주에서 복제되지 않는 자살벡터에 상기 DNA 삽입단편이 도입된 재조합벡터를 수득하는 단계이다.

상기 (a) 단계는 다제내성 균주의 게놈 DNA에 존재하는 표적 유전자를 변이시킬 수 있는 재조합벡터를 제작하는 단계로서, 상기 자살벡터는 상술한 바와 같이, 다제내성 균주에서 복제되지 않도록 R6K ori, mob RP4 유전자, cat 유전자, sacB 유전자 및 다클론부위를 순차적으로 포함하고, 상기 DNA 삽입단편은 상술한 바와 같이, 5'-영역 단편, 3'-영역 단편 및 마커영역 단편을 순차적으로 포함한다. 이때, 상기 5'-영역 단편과 3'-영역 단편은 각각 상기 표적 유전자의 상류 및 하류에 인접한 염기서열이므로, 상기 5'-영역 단편과 3'-영역 단편은 표적 유전자의 염기서열에 의하여 결정되고, 상기 마커영역 단편은 다제내성 균주가 저항성을 나타내지 않은 항생제에 대한 저항성을 가지는 항생제 마커 단백질을 코딩하는 유전자가 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 다제내성 균주로서 아세토박터 바우마니 균주를 사용하고, 이에 적합하도록 5'-영역 단편(A), 3'-영역 단편(B) 및 마커영역 단편(nptI)을 포함하는 DNA 삽입단편(-A-B-nptI-)을 자살벡터(-R6K-mobRP4-cat-sacB-MCS-)의 다클론부위(multi-cloning site, MCS)에 도입하여 재조합벡터(-R6K-mobRP4-cat-sacB-A-B-nptI-)를 제작하였다.

둘 째, 본 발명에서 제공하는 다제내성 균주의 변이주의 제작방법에 있어서, (b) 단계는 상기 수득한 재조합벡터를 다제내성 균주에 도입하여, 형질전환체를 수득하는 단계이다.

상기 (b) 단계는 재조합벡터가 도입된 형질전환체를 수득하는 단계로서, 상기 표적 유전자를 게놈 DNA에 포함하는 다제내성 균주에 상기 수득한 재조합벡터를 도입하면, 표적 유전자의 상류부위(5'-영역 단편) 또는 하류부위(3'-영역 단편)에서 단일교차 재조합이 유발되어 상기 재조합벡터가 다제내성 균주의 게놈 DNA에 포함된 표적 유전자의 상류 또는 하류에 도입되어, 결과적으로는 재조합벡터를 포함하는 형질전환체를 수득할 수 있다. 아울러, 상기 수득한 형질전환체는 재조합벡터에 포함된 마커영역 단편에서 발현되는 단백질에 의하여 저항성을 나타내는 항생제를 포함하는 배지에서 배양함으로써, 선별할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 다제내성 균주로서 아세토박터 바우마니 균주를 사용하고, 이에 적합하도록, 표적 유전자(X), 이의 상류부위(5'-영역 단편, A) 및 하류부위(3'-영역 단편, B)를 포함하는 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA(-A-X-B-)에 재조합벡터(-R6K-mobRP4-cat-sacB-A-B-nptI-)가 도입되면, 상기 표적 유전자의 상류부위에서 단일교차 재조합이 수행되어 변이된 게놈 DNA(-A-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-X-B-) 또는 상기 표적 유전자의 하류부위에서 단일교차 재조합이 수행되어 변이된 게놈 DNA(-A-X-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-B-)를 포함하는 형질전환체를 수득할 수 있다.

상기 수득한 형질전환체는 게놈 DNA에 마커영역 단편(nptI)이 도입되었으므로, 상기 nptI에 의하여 발현되는 단백질에 의하여 카나마이신 저항성을 나타내지만, 상기 재조합벡터가 게놈 DNA에 도입되지 않은 아시네토박터 바우마니 균주는 자살벡터의 특성상 상기 재조합벡터가 아시네토박터 바우마니 균주에서 복제되지 않으므로, 상기 아시네토박터 바우마니 균주가 증식함에 따라 희석되어 말소되기 때문에 결과적으로는 nptI로부터 발현되는 단백질이 존재하지 않게 되어, 카나마이신 저항성을 나타내지 않는다. 따라서, 상기 재조합벡터가 도입된 아시네토박터 바우마니 균주를 카나마이신이 포함된 배지에서 배양하면, 형질전환체를 선별하여 수득할 수 있다.

셋 째, 본 발명에서 제공하는 다제내성 균주의 변이주의 제작방법에 있어서, (c) 단계는 상기 형질전환체를 수크로스를 포함하는 배지에서 배양하여 표적 유전자가 결실된 변이주를 선발하는 단계이다.

상기 (c) 단계는 상기 수득한 형질전환체의 게놈 DNA에서 단일교차 재조합에 의하여 표적 유전자를 결실시켜서 변이주를 제작하는 단계로서, 이는 자살벡터에 포함된 sacB 유전자에서 발현된 수크라제와 수크로스를 포함하는 배지를 사용함으로써 수행될 수 있다. 즉, 상기 수득한 형질전환체를 과량의 수크로스를 포함하는 배지에 접종하여 배양하면, 형질전환체의 게놈 DNA에 삽입된 sacB에서 발현된 수크라제에 의하여 상기 수크로스가 분해되고, 이에 따라 수크로스의 분해산물로서 독성산물이 발생되는데, 상기 독성산물은 형질전환를 손상시켜서, 게놈 DNA 내에서 단일교차 재조합이 발생할 수 있는 환경이 조성된다. 게놈 DNA에 도입된 재조합벡터로 인하여, 형질전환체의 게놈 DNA에는 표적 유전자에 인접한 5'-영역 단편과 3'-영역 단편이 중복으로 포함되므로, 상기 단일교차 재조합이 발생할 수 있는 환경이 조성되면, 상기 5'-영역 단편 또는 3'-영역 단편에서 단일교차 재조합이 발생할 수 있다. 상기 5'-영역 단편 또는 3'-영역 단편에서 단일교차 재조합이 발생하면, 앞서 게놈 DNA에 도입된 재조합벡터가 그대로 결실되어 야생형 다제내성 균주의 게놈 DNA로 회복되거나 또는 다제내성 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자가 결실된 변이주를 제작할 수 있다. 상기 제작된 다제내성 균주의 변이주는 게놈 DNA에서 표적 유전자가 결실되었으므로, 상기 표적 유전자의 기능발현여부를 검사하거나 또는 게놈 DNA의 크기를 비교하여, 비교적 용이하게 야생형 균주와 구별하여 선별할 수 있다.

따라서, 상기 표적 유전자가 결실된 변이주의 선발은 (c1) 수크로스를 포함하는 배지에서 배양된 형질전환체를 다제내성 균주가 저항성을 나타내지 않은 항생제가 포함된 배지에서 배양하고, 생존하지 않는 균주를 선발하는 단계; 및, (c2) 상기 선발된 균주로부터 게놈 DNA를 수득하고 그의 크기를 야생형 다제내성 균주의 게놈 DNA의 크기와 비교하여, 상기 게놈 DNA의 크기가 감소된 균주를 선별하는 단계에 의하여 수행하거나; 또는 (c1') 수크로스를 포함하는 배지에서 배양된 형질전환체를 다제내성 균주가 저항성을 나타내지 않은 항생제가 포함된 배지에서 배양하고, 생존하지 않는 균주를 선발하는 단계; 및, (c2') 상기 선발된 균주에서 나타나는 표적 유전자의 활성을 측정하여, 야생형 다제내성 균주에서 측정된 표적 유전자의 활성보다 상대적으로 낮은 수준을 나타내는 균주를 선별하는 단계에 의하여 수행될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 다제내성 균주로서 아세토박터 바우마니 균주를 사용하고, 이에 적합하도록, 상기 형질전환체에 포함된 게놈 DNA(-A-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-X-B- 또는 -A-X-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-B-)에는 각각 두 개의 5'-영역 단편(A)과 3'-영역 단편(B)이 존재하므로 이들에서 두 번째 단일교차 재조합이 유발될 수 있다.

먼저, 첫 번째 게놈 DNA(-A-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-X-B-)의 5'-영역 단편(A)에서 두 번째 단일교차 재조합이 유발되면, 게놈 DNA(-A-X-B-)와 DNA 단편(-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A)이 생성되는데, 상기 DNA 단편은 세포내 뉴클레아제 등에 의하여 분해되므로, 게놈 DNA 만이 잔류하게 되고, 결과적으로는 야생형의 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA(-A-X-B-)로 회복된다. 또한, 상기 첫 번째 게놈 DNA(-A-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-X-B-)의 3'-영역 단편(B)에서 두 번째 단일교차 재조합이 유발되면, 게놈 DNA(-A-B-)와 DNA 단편(-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-X-B)이 생성되는데, 동일한 이유로 게놈 DNA 만이 잔류하게 되고, 결과적으로는 표적 유전자(X)가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 게놈 DNA(-A-B-)가 새로이 형성된다.

다음으로, 두 번째 게놈 DNA(-A-X-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-B-)의 5'-영역 단편(A)에서 두 번째 단일교차 재조합이 유발되면, 게놈 DNA(-A-B-)와 DNA 단편(-X-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A)이 생성되는데, 동일한 이유로 게놈 DNA 만이 잔류하게 되고, 결과적으로는 표적 유전자(X)가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 게놈 DNA(-A-B-)가 새로이 형성된다. 또한, 상기 두 번째 게놈 DNA(-A-X-B-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-B-)의 3'-영역 단편(B)에서 두 번째 단일교차 재조합이 유발되면, 게놈 DNA(-A-X-B-)와 DNA 단편(-nptI--R6K-mobRP4-cat-sacB-A-B)이 생성되는데, 동일한 이유로 게놈 DNA 만이 잔류하게 되고, 결과적으로는 야생형의 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA(-A-X-B-)로 회복된다.

상기 두 번째 단일교차 재조합은 확률적으로 유발되므로, 경우에 따라서는 단일교차 재조합이 발생할 수 있는 환경이 조성된다 하여도 두 번째 단일교차 재조합이 유발되지 않을 수도 있다. 상기 두 번째 단일교차 재조합이 수행된 균주인지의 여부는 상기 수크로스 배지에서 배양된 균주를 상기 재조합벡터에 포함된 마커영역 단편에서 발현되는 단백질에 의하여 저항성을 나타내는 항생제를 포함하는 배지에서 배양함으로써, 선별할 수 있다. 즉, 상기 두 번째 단일교차 재조합이 수행된 균주는 어떠한 경우에도, 게놈 DNA에 상기 마커영역 단편이 잔류하지 않으므로, 상기 항생제를 포함하는 배지에서는 생존할 수 없는 반면, 상기 두 번째 단일교차 재조합이 수행되지 않은 균주는 동일한 배지에서 생존할 수 있으므로, 이러한 차이를 이용하여 두 번째 단일교차 재조합이 수행된 균주를 선별할 수 있다.

따라서, 상기 형질전환체를 수크로스 배지에서 배양하면, 단일교차 재조합이 추가로 발생하여 야생형 다제내성 균주 또는 다제내성 균주의 변이주가 제작될 수 있는데, 상기 제작된 다제내성 균주의 변이주는 게놈 DNA에서 표적 유전자가 결실되었으므로, 상기 표적 유전자의 기능발현여부를 검사하거나 또는 게놈 DNA의 크기를 비교하여, 비교적 용이하게 야생형 균주와 구별하여 선별할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 다제내성 균주의 일종인 아세토박터 바우마니 균주에서 복제되지 않는 자살벡터인 pHKD01 벡터를 제작하고(도 1), 상기 제작된 pHKD01 벡터를 이용하여 다양한 표적 유전자(basD, bauA, rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD 또는 rhbC3)를 결실시킬 수 있는 다양한 상동재조합 벡터(pHKD02 내지 pHK13)을 제작하였으며(도 3의 A), 상기 제작된 상동재조합 벡터를 이용하여 A. baumannii 균주에서 상기 표적 유전자가 결실된 다양한 변이균주(HDK01 내지 HDK12)를 제작하였고(도 3의 B 및 도 4의 B), 상기 제작된 변이균주의 전사체를 대상으로 실시간 PCR 방법을 수행하여 표적 유전자의 발현수준을 정량분석한 결과, 상기 변이균주에서는 표적 유전자가 발현되지 않음을 확인하였다(도 3의 C 및 도 5).

본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제작되어, 다제내성 균주의 표적 유전자가 게놈 DNA에서 결실된 형태의 변이주를 제공한다.

본 발명의 용어 "다제내성 균주의 변이주"란, 다제내성 균주에서 표적 유전자가 결실된 형태로 변이된 다제내성 균주를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 다제내성 균주의 변이주는 야생형 다제내성 균주에서 표적 유전자만이 제거되었을 뿐, 외부에서 도입된 어떠한 유전자도 게놈 DNA에 남아있지 않은 유전형을 나타내므로, 상술한 변이주의 제조방법을 수행할 때, 재조합벡터가 도입되는 다제내성 균주로서 사용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 제공하는 방법을 사용하여 첫 번째 표적 유전자를 결실시킨 변이주를 제작하고, 상기 변이주를 대상으로 본 발명에서 제공하는 방법을 다시 사용하여 두 번째 표적 유전자를 결실시킨 변이주를 제작할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 다제내성 균주로서 아세토박터 바우마니 균주를 사용하여, 상기 균주에 존재하는 basD가 결실된 변이주(HKD02)에 본 발명의 자살벡터를 이용하여 제작된 다른 재조합벡터를 추가로 도입함으로써, 상기 basD 유전자 뿐만 아니라, cirA 유전자가 추가로 결실된 변이주를 제작하였다(도 6).

본 발명에서 제공하는 다제내성 균주의 변이주 제작용 자살벡터 또는 다제내성 균주의 변이주 제작용 키트를 이용하면, 다양한 다제내성 균주의 연구에 사용할 수 있는 제한된 항생제 저항성 유전자만을 이용하여도, 다제내성 균주의 게놈 DNA에서 하나 또는 다수의 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 결실된 변이주를 제작할 수 있으므로, 다양한 다제내성 균주의 유전체, 생리활성 등의 다양한 분야의 연구에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1a는 본 발명에서 제공하는 자살벡터인 pHKD01 벡터의 제조방법을 나타내는 개략도이다.
도 1b는 pHKD01 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 2는 pHKD01 벡터를 이용하여 아시네토박터 바우마니 균주에서 표적 유전자를 결실시키는 방법의 흐름을 나타내는 개략도이다.
도 3의 A는 표적 유전자인 basD 또는 bauA를 대상으로, 증폭된 3가지 폴리뉴클레오티드(5'-영역 단편, 3'-영역 단편 및 nptI 유전자)의 전기영동 결과 및 overlap extension PCR을 수행하여 수득한 평활말단 DNA 단편의 전기영동 사진이다.
도 3의 B는 표적 유전자(basD 또는 bauA)가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD01 또는 HKD02)의 게놈 DNA를 전기영동한 사진이다.
도 3의 C는 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD01 또는 HKD02)에서 표적 유전자(basD 또는 bauA)의 발현여부를 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4의 A는 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 다양한 표적 유전자(rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD 또는 rhbC3)의 상대적인 위치를 나타내는 개략도이다.
도 4의 B는 표적 유전자(rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD 또는 rhbC3)가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03 내지 HKD12)의 게놈 DNA를 전기영동한 사진이다.
도 5는 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03 내지 HKD12)에서 표적 유전자(rimL, piuB, cirA, menG, fhuF, rhbC1, rhbC2, araJ, iucD 또는 rhbC3)의 발현여부를 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 두 가지 표적 유전자(bauA 및 cirA)가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD13)의 게놈 DNA를 전기영동한 사진이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 아시네토박터 바우마니 균주에서 복제되지 않는 자살벡터( pHKD01 벡터)의 제작

다제내성 균주의 하나인 아세토박터 바우마니 균주를 이용하여 본 발명에서 제공하는 다제내성 균주의 변이주를 제작하고자 하였다.

어닐링 올리고뉴클레오티드 클로닝(annealed oligonucleotide cloning) 방법을 응용하여, 제한효소 사이트를 고려하지 않아도 되는 평활말단 클로닝이 가능한 벡터(pHKD01 벡터)를 다음과 같이 제작하였다.

먼저, 첫 번째 평활말단을 위한 제한효소 절단 부위 염기서열을 갖는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 이때, 상기 올리고뉴클레오티드는 평활말단으로 절단하는 제한효소인 FspI의 절단 부위염기서열인 TGCGCA를 포함한다. 또한, 상보적인 올리고뉴클레오티드는 서로 어닐링될 때, DNA 단편의 5' 말단과 3' 말단이 PstI 제한효소에 의해 잘려진 DNA에 직접적으로 연결될 수 있도록 제작되었다.

다음으로, 상기 제작된 각 올리고뉴클레오티드 2㎍을 50㎕의 반응완충액(10mM Tris, 50mM NaCl, 1mM EDTA, pH 7.5)에 가하고, 95℃ 5분 및 25℃ 60분동안 반응시켜서 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 수득하고, 이를 제한효소 PstI으로 절단된 pDS132 벡터에 도입하여 다제내성 아시네토박터 바우마니 균주에서 복제되지 않는 자살벡터 pHKD01(서열번호 1)을 제작하였다(도 1).

도 1은 본 발명에서 제공하는 자살벡터인 pHKD01 벡터의 제조방법 및 제조된 pHKD01 벡터의 개열지도를 나타내는 개략도이다.

한편, 상기 제작된 pHKD01 벡터는 아시네토박터 바우마니 균주에서 표적 유전자를 결실시키는데 사용될 수 있다(도 2). 도 2는 pHKD01 벡터를 이용하여 아시네토박터 바우마니 균주에서 표적 유전자를 결실시키는 방법의 흐름을 나타내는 개략도이다.

도 2에서 보듯이, 결실된 표적 유전자를 포함하는 평활말단 DNA 단편(표적 유전자의 5'-말단 부분(Gene A 영역), 표적 유전자의 3'-말단 부분(Gene B 영역) 및 카나마이신 저항성 유전자(nptI 영역)를 포함)을 PCR 방법으로 증폭하여 수득하고, 상기 수득한 평활말단 DNA 단편을 제한효소 FspI으로 절단된 pHKD01 벡터에 도입하여 상동재조합 벡터(sacB-Gene A-Gene B-nptI)를 수득한 다음, 상기 수득한 상동재조합 벡터를 아시네토박터 바우마니 균주에 도입하여 형질전환체를 제작할 수 있는데, 상기 제작한 형질전환체는 카나마이신이 포함된 배지를 사용하여 선별한다. 표적 유전자의 5'-말단 부분(Gene A 영역)에서 1차 단일교차 재조합(first single cross-over recombination)이 발생하면, 상기 형질전환체에 도입된 발현벡터(sacB-Gene A-Gene B-nptI)이 상기 아시네토박터 바우마니 균주의 염색체에 포함된 정상적인 표적 유전자(Gene A-Gene X-Gene B)와 교차되며, 상기 발현벡터가 아시네토박터 바우마니 균주의 염색체에 존재하는 표적 유전자의 내부에 도입된 형태(Gene A-Gene B-nptI-sacB-Gene A-Gene X-Gene B)를 형성한다. 이어, 상기 형질전환체를 수크로스가 포함된 배지에서 배양하면, 상기 염색체에 도입된 sacB 유전자에서 발현된 수크라제에 의해 수크로스가 분해되면서, 독성부산물을 형성하고, 이로 인하여 상기 상동재조합벡터가 도입된 염색체내의 표적 유전자의 3'-말단 부분(Gene B 영역)에서 2차 단일 교차 상동재조합이 발생하면, 염색체로부터 유래된 표적 유전자 부분(Gene X 영역)과 발현벡터에서 유래된 부분(sacB 영역 및 nptI 영역)이 상기 염색체로부터 제거되어 최종적으로는 정상적인 표적 유전자(Gene X 영역)가 결실된 형태의 염색체(Gene A-Gene B)를 포함하는 아시네토박터 바우마니 변이주를 제조할 수 있다. 상기 아시네토박터 바우마니 변이주는 카나마이신이 포함된 배지를 사용하여 선별할 수 있다. 상기 아시네토박터 바우마니 변이주에는 카나마이신에 대한 저항성을 나타내는 nptI가 포함되어 있지 않으므로, 상기 nptI을 이용하여 아시네토박터 바우마니 변이주로부터 또 다른 표적 유전자를 결실시킬 수 있다.

실시예 2: 아시네토박터 바우마니 균주에서 복제되지 않는 자살벡터를 이용하여, 표적 유전자가 결실된 변이 균주의 제작

상기 실시예 1에서 제작한 자살벡터 pHKD01 벡터를 이용하면, 아시네토박터 바우마니 균주에서 다양한 유전자를 결실시킬 수 있을 것으로 예상되었으므로, 이를 실험적으로 확인하였다.

실시예 2-1: basD 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 제작

먼저, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, basD 유전자의 5'-말단을 증폭시키기 위한 S1/S2 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 basD 유전자의 5'-영역 단편의 폴리뉴클레오티드를 수득하였다.

S1 primer(BASD01F):

5'-GAAGCAATTGAGCGGTTCAGG-3'(서열번호 2)

S2 primer(BASD01R):

5'-AAATGATGAAAGTTCAAAATACGAATTGTTAATCATTTCCAATTTTGCTGT-3'(서열번호 3)

다음으로, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, basD 유전자의 3'-말단을 증폭시키기 위한 S3/S4 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 basD 유전자의 3'-영역 단편의 폴리뉴클레오티드를 수득하였다.

S3 primer(BASD02F):

5'-TTCGTATTTTGAACTTTCATCATTTTGG-3'(서열번호 4)

S4 primer(BASD02R):

5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACTGTGCAAACAGGTTAAACGCAG-3'(서열번호 5)

아울러, pUC4K를 주형으로 하고, nptI 유전자를 증폭시키기 위한 U1/U2 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 nptI 유전자의 폴리뉴클레오티드를 수득하였다.

U1: 5'-GTCTGCCTCGTGAAGAAGGTG-3'(서열번호 6)

U2: 5'-GATCCGTCGACCTGCAGG-3'(서열번호 7)

상기 수득한 3가지 폴리뉴클레오티드(5'-영역 단편, 3'-영역 단편 및 nptI 유전자)를 전기영동하여 그의 크기를 측정하였다(도 3의 A). 도 3의 A는 PCR 방법으로 증폭된 표적 유전자의 5'-말단. 3'-말단 및 nptI 유전자의 폴리뉴클레오티드 및 이들 각 폴리뉴클레오티드를 주형으로 하여 overlap extension PCR을 수행하여 수득한 평활말단 DNA 단편를 나타내는 전기영동사진이다.

상기 수득한 3가지 폴리뉴클레오티드(5'-영역 단편, 3'-영역 단편 및 nptI 유전자)를 주형으로 하고, 상기 S1/U2 프라이머를 사용한 overlap extension PCR을 수행하여, 상기 각 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 결합된 평활말단 DNA 단편을 수득하였다(도 3의 A).

한편, 상기 실시예 1에서 제작한 pHKD01 벡터를 제한효소 FspI으로 절단하고, 상기 절단부위에 상기 수득한 평활말단 DNA 단편을 도입하여, 재조합벡터(pHKD02)를 수득하였다.

상기 수득한 재조합벡터(pHKD02: pHKD01 with ΔbasD::nptI; Cmr,Kmr)를 아시네토박터 바우마니 균주(ATCC 19606)에 도입하고, 상기 도입된 균주를 카나마이신(30㎍/㎖)이 포함된 LB 평판배지에서 배양하여, 형질전환체를 선별하였다. 상기 선별된 형질전환체를 10%(w/v) 수크로스가 포함된 평판배지에서 배양하여 각각의 콜로니를 수득하고, 상기 수득한 각각의 콜로니를 LB 평판배지와 카나마이신(30㎍/㎖)이 포함된 LB 평판배지에서 배양하여, LB 평판배지에서는 성장하지만, 카나마이신이 포함된 LB 평판배지에서는 성장하지 않는 콜로니를 선별하여, 최종적으로 basD 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD01: ATCC 19606 with ΔbasD)를 제작하였다(도 3의 B). 도 3의 B는 표적 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 게놈 DNA를 전기영동한 사진이다. 도 3의 B에서 보듯이, 아시네토박터 바우마니 변이주는 야생형 아시네토박터 바우마니 균주에 비하여 게놈 DNA의 크기가 감소되었음을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에서 제공하는 아시네토박터 바우마니 변이주는 표적 유전자가 결실된 것임을 알 수 있었다.

실시예 2-2: bauA 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 제작

S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 BAUA01F/BAUA01R/BAUA02F/BAUA02R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD03(pHKD01 with ΔbauA::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, bauA 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD02: ATCC 19606 with ΔbauA)를 제작하였다. 이때, 증폭된 3가지 폴리뉴클레오티드(5'-영역 단편, 3'-영역 단편 및 nptI 유전자)의 전기영동 결과 및 overlap extension PCR을 수행하여 수득한 평활말단 DNA 단편의 전기영동 결과는 도 3의 A에 나타내었고, 아시네토박터 바우마니 변이주로부터 유래된 게놈 DNA의 전기영동 결과는 도 3의 B에 나타내었다.

BAUA01F:

5'-GTCGATTTGGAGAAAACGTAAGC-3'(서열번호 8)

BAUA01R:

5'-CATAAATTTTCACTATTTTGCTATGATAAAAAAACCCGCAATCGC-3'(서열번호 9)

BAUA02F:

5'-CATAGCAAAATAGTGAAAATTTATGCTC-3'(서열번호 10)

BAUA02R:

5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACATCATAGCGGCAGCTGTCAC-3'(서열번호 11)

도 3의 B에서 보듯이, 아시네토박터 바우마니 변이주는 야생형 아시네토박터 바우마니 균주에 비하여 게놈 DNA의 크기가 감소되었음을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에서 제공하는 아시네토박터 바우마니 변이주는 표적 유전자가 결실된 것임을 알 수 있었다.

실시예 2-3: rimL 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 제작

S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 RIML01F/RIML01R/RIML02F/RIML02R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD04(pHKD01 with ΔrimL::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, rimL 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03: ATCC 19606 with ΔbauA)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 rimL 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.

RIML01F:

5'-ACTTTGCTTCTATCTGGATGCG-3'(서열번호 12)

RIML01R:

5'-CTTGCAGGTCTACCCATACCAGAAACGGTCCTTGCTATGACATAACC-3'(서열번호 13)

RIML02F:

5'-TTTCTGGTATGGGTAGACCTGC-3'(서열번호 14)

RIML02R:

5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACGGGATAAATTGATCAAGATCGG-3'(서열번호 15)

도 4의 B에서 보듯이, 아시네토박터 바우마니 변이주는 야생형 아시네토박터 바우마니 균주에 비하여 게놈 DNA의 크기가 감소되었음을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에서 제공하는 아시네토박터 바우마니 변이주는 표적 유전자가 결실된 것임을 알 수 있었다.

실시예 2-4: piuB 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 제작

S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 PIUB01F/PIUB01R/PIUB02F/PIUB02R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD05(pHKD01 with ΔpiuB::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, piuB 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD04: ATCC 19606 with ΔpiuB)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 piuB 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD04)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.

PIUB01F:

5'-GGCTTAAATCTGGGATTGACTGG-3'(서열번호 16)

PIUB01R:

5'-CCCAAAATAATGATGCAAAGCTCATTTAAGCCACTCCCCATTTAGCTA-3'(서열번호 17)

PIUB02F:

5'-ATGAGCTTTGCATCATTATTTTGG-3'(서열번호 18)

PIUB02R:

5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACGCACATGTCTTCTACTACAGCCG-3'(서열번호 19)

실시예 2-5: cirA 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 제작

S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 CIRA01F/CIRA01R/CIRA02F/CIRA02R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD06(pHKD01 with ΔcirA::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, cirA 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD05: ATCC 19606 with ΔcirA)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 cirA 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD05)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.

CIRA01F:

5'-AGTTAGCGAAAATAGGTCGCGTACC-3'(서열번호 20)

CIRA01R:

5'-ACAGGCATCTCTTTCGTTAGTTGCATTCTCCCTAGCCCAAATGTTACTCAAC-3'(서열번호 21)

CIRA02F:

5'-TGCAACTAACGAAAGAGATGCCTG-3'(서열번호 22)

CIRA02R:

5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACAACAGTCCAGTAAAGGCCATCACC-3'(서열번호 23)

실시예 2-6: menG 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 제작

S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 MENG01F/MENG01R/MENG02F/MENG02R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD07(pHKD01 with ΔmenG::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, menG 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD06: ATCC 19606 with ΔmenG)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 menG 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD06)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.

MENG01F:

5'-TGGTCTGTACTTGCTCATGCGT-3'(서열번호 24)

MENG01R:

5'-CGAACATTAATGAGAATGATTTTTACTTTAAATTTTCCGATTTCTTTTAAACGTAAG-3'(서열번호 25)

MENG02F:

5'-TAAAAATCATTCTCATTAATGTTCGTATT-3'(서열번호 26)

MENG02R:

5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACGAGTAATCAGGTCCGTAGTCAGTATCC-3'(서열번호 27)

실시예 2-7: fhuF 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 제작

S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 FHUF01F/FHUF01R/FHUF02F/FHUF02R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD08(pHKD01 with ΔfhuF::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, fhuF 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD07: ATCC 19606 with ΔfhuF)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 fhuF 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD07)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.

FHUF01F:

5'-CCGATAGGAATTAAAGCTCTTGG-3'(서열번호 28)

FHUF01R:

5'-CTTTAGAAGTATCAATTTGATTCATCGTCAGATATCACTAACAATTTAAGGC-3'(서열번호 29)

FHUF02F:

5'-ATGAATCAAATTGATACTTCTAAAGCACT-3'(서열번호 30)

FHUF02R:

5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACAGCAACTTTACGACCTGCCG-3'(서열번호 31)

실시예 2-8: rhbC1 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 제작

S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 RHBC101F/RHBC101R/RHBC102F/RHBC102R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD09(pHKD01 with ΔrhbC1::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, rhbC1 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD08: ATCC 19606 with ΔrhbC1)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 rhbC1 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD08)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.

RHBC101F:

5'-GCCCAACAATCTCTACGCAC-3'(서열번호 32)

RHBC101R:

5'-AAGACATATTCATCGTCAGATATCAAGATAAATCTCACTTCACCTGCAAT-3'(서열번호 33)

RHBC102F:

5'-TGATATCTGACGATGAATATGTCTTTTAA-3'(서열번호 34)

RHBC102R:

5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACGACTCAATCCGAACCGTACG-3'(서열번호 35)

실시예 2-9: rhbC2 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 제작

S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 RHBC201F/RHBC201R/RHBC202F/RHBC202R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD10(pHKD01 with ΔrhbC2::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, rhbC2 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD09: ATCC 19606 with ΔrhbC2)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 rhbC2 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD09)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.

RHBC201F:

5'-CCATGATCATGCTAACCTTAGCAG-3'(서열번호 36)

RHBC201R:

5'-GCTGAAGTGCATTCATAGATAAATCTTTTATTAATCCTATTTCTTTAATTGGTCG-3'(서열번호 37)

RHBC202F:

5'-GATTTATCTATGAATGCACTTCAGCC-3'(서열번호 38)

RHBC202R:

5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCCAAGAGCTTTAATTCCTATCGG-3'(서열번호 39)

실시예 2-10: araJ 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 제작

S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 ARAJ01F/ARAJ01R/ARAJ02F/ARAJ02R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD11(pHKD01 with ΔaraJ::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, araJ 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD10: ATCC 19606 with ΔaraJ)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 araJ 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD10)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.

ARAJ01F:

5'-GGGTACAACTCCACATTTACCAG-3'(서열번호 40)

ARAJ01R:

5'-TGTAATTGTCCCATTTTTATTAATCATCCTCTGTTTAGCTTATTCAATATGC-3'(서열번호 41)

ARAJ02F:

5'-GATTAATAAAAATGGGACAATTACATCC-3'(서열번호 42)

ARAJ02R:

5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACGCAACCAGTCTGTAATAATTGGC-3'(서열번호 43)

실시예 2-11: iucD 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 제작

S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 IUCD01F/IUCD01R/IUCD02F/IUCD02R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD12(pHKD01 with ΔiucD::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, iucD 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD11: ATCC 19606 with ΔiucD)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 iucD 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD11)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.

IUCD01F:

5'-GATATTGGTTTACGTGGATGGC-3'(서열번호 44)

IUCD01R:

5'-TCCATACACATATCCTCTGTTTAGCTCAAGCATAACTCACATCCTTCTGT-3'(서열번호 45)

IUCD02F:

5'-GCTAAACAGAGGATATGTGTATGGAAC-3'(서열번호 46)

IUCD02R:

5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACTCATTAGCGCAAAACCAGTCC-3'(서열번호 47)

실시예 2-12: rhbC3 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주의 제작

S1/S2/S3/S4 프라이머로서 각각 RHBC301F/RHBC301R/RHBC302F/RHBC302R을 사용하고, 상동재조합 벡터로서 pHKD13(pHKD01 with ΔrhbC3::nptI; Cmr,Kmr)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, rhbC3 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD12: ATCC 19606 with ΔrhbC3)를 제작하였다(도 4). 이때, 아시네토박터 바우마니 균주의 게놈 DNA에서 표적 유전자인 rhbC3 유전자의 상대적인 위치는 도 4의 A에 나타내었고, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD12)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과는 도 4의 B에 나타내었다.

RHBC301F:

5'-ATTGTTTTTTGTTCGGTGTTCG-3'(서열번호 48)

RHBC301R:

5'-GTCCAATTCCAATAAAATCAAGCATCTGACTACATCCTATTCAGAATCTTAAGC-3'(서열번호 49)

RHBC302F:

5'-ATGCTTGATTTTATTGGAATTGGA-3'(서열번호 50)

RHBC302R:

5'-GCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACTGCTGCAATAACACAATCAGCC-3'(서열번호 51)

실시예 3: 실시간 PCR 분석

상기 실시예 2에서 제조된 각각의 아시네토박터 바우마니 변이주에서 표적 유전자가 발현되는 지의 여부를 확인하기 위하여, 실시간 PCR 분석을 수행하였다.

실시예 3-1: 아시네토박터 바우마니 변이주( HKD01 )의 실시간 PCR 분석

0.15mM의 철 포획물질(2,2-dipyridyl)을 포함하는 LB 배지에 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)와 basD 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD01)를 접종하고, OD600에서 흡광도가 0.7이 될때까지 배양하였으며, 배양이 종료된 후, 배양된 각 균체로부터 전사체를 수득하였다. 상기 전사체로부터 합성된 cDNA를 주형으로 하고, S5/S6 프라이머를 사용한 실시간 PCR을 수행하여 표적 유전자의 발현수준을 정량분석하였다(도 3의 C). 이때, 발현수준의 정량분석은 표적 유전자의 발현수준을 측정하고, 상기 측정된 값을 내부대조군인 16S rRNA의 발현수준으로 정상화(normalization)하여 산출한 것을 사용하여 수행하였다.

S5 primer(BASD03F):

5'-GACTGACCCAAACACCTCAA-3'(서열번호 52)

S6 primer(BASD03R):

5'-GGAAATGCTTCTTGGGCATAATC-3'(서열번호 53)

도 3의 C에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 basD 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 53배(log₁₀1.72) 증가)된 반면, basD 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD01)에서는 표적 유전자인 basD 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD01)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 basD 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.

실시예 3-2: 아시네토박터 바우마니 변이주( HKD02 )의 실시간 PCR 분석

아시네토박터 바우마니 변이주로서 bauA 유전자가 결실된 HKD02를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 BAUA03F/BAUA03R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD02)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 3의 C).

BAUA03F:

5'-CACGTGGTGTTAACGTCTCTAC-3'(서열번호 54)

BAUA03R:

5'-CACGAATCATTGCGCCTTTATC-3'(서열번호 55)

상기 도 3의 C에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 bauA 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 91배(log₁₀1.95) 증가)된 반면, bauA 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD02)에서는 표적 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD02)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 bauA 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.

실시예 3-3: 아시네토박터 바우마니 변이주( HKD03 )의 실시간 PCR 분석

아시네토박터 바우마니 변이주로서 rimL 유전자가 결실된 HKD03를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 RIML03F/RIML03R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서의 표적 유전자인 rimL 유전자의 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).

RIML03F:

5'-GCTACTCATTACGTCAGGTTCAG-3'(서열번호 56)

RIML03R:

5'-CCACTGAGGAATAACGTGTGG-3'(서열번호 57)

도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 rimL 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 198배(log₁₀2.30) 증가)된 반면, rimL 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 표적 유전자인 rimL 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 rimL 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.

실시예 3-4: 아시네토박터 바우마니 변이주( HKD04 )의 실시간 PCR 분석

아시네토박터 바우마니 변이주로서 piuB 유전자가 결실된 HKD04를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 PIUB03F/PIUB03R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD04)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).

PIUB03F:

5'-AAAGATGGCGAGTCACAGTAG-3'(서열번호 58)

PIUB03R:

5'-CCCAATAGCTCTCCGGTATTAG-3'(서열번호 59)

도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 piuB 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 8배(log₁₀0.89) 증가)된 반면, piuB 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD04)에서는 표적 유전자인 piuB 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 piuB 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.

실시예 3-5: 아시네토박터 바우마니 변이주( HKD05 )의 실시간 PCR 분석

아시네토박터 바우마니 변이주로서 cirA 유전자가 결실된 HKD05를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 CIRA03F/CIRA03R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD05)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).

CIRA03F:

5'-GTAGTAACTGCGACTCGTACAC-3'(서열번호 60)

CIRA03R:

5'-GCCGTAGCTTGCTGGATAA-3'(서열번호 61)

도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 cirA 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 26배(log₁₀1.41) 증가)된 반면, cirA 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD05)에서는 표적 유전자인 cirA 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 cirA 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.

실시예 3-6: 아시네토박터 바우마니 변이주( HKD06 )의 실시간 PCR 분석

아시네토박터 바우마니 변이주로서 menG 유전자가 결실된 HKD06를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 MENG03F/MENG03R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD06)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).

MENG03F:

5'-CGTTGTGGTCTTAGGTGCTATT-3'(서열번호 62)

MENG03R:

5'-CCCTTCATTGCGAGTGGTTA-3'(서열번호 63)

도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 menG 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 3배(log₁₀0.46) 증가)된 반면, menG 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD06)에서는 표적 유전자인 menG 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 menG 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.

실시예 3-7: 아시네토박터 바우마니 변이주( HKD07 )의 실시간 PCR 분석

아시네토박터 바우마니 변이주로서 fhuF 유전자가 결실된 HKD07를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 FHUF03F/FHUF03R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD07)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).

FHUF03F:

5'-GTGCGTTTATGGAATGGATGG-3'(서열번호 64)

FHUF03R:

5'-AGGGACAATTACGGCATAAGG-3'(서열번호 65)

도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 fhuF 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 10배(log₁₀1.00) 증가)된 반면, fhuF 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD07)에서는 표적 유전자인 fhuF 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 fhuF 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.

실시예 3-8: 아시네토박터 바우마니 변이주( HKD08 )의 실시간 PCR 분석

아시네토박터 바우마니 변이주로서 rhbC1 유전자가 결실된 HKD08를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 RHBC103F/RHBC103R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD08)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).

RHBC103F:

5'-CAAAGCTTGGCACATAGATTCC-3'(서열번호 66)

RHBC103R:

5'-CTTGCTGACTGAGACCTTCTT-3'(서열번호 67)

도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 rhbC1 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 104배(log₁₀2.01) 증가)된 반면, rhbC1 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD08)에서는 표적 유전자인 rhbC1 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 rhbC1 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.

실시예 3-9: 아시네토박터 바우마니 변이주( HKD09 )의 실시간 PCR 분석

아시네토박터 바우마니 변이주로서 rhbC2 유전자가 결실된 HKD09를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 RHBC203F/RHBC203R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD09)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).

RHBC203F:

5'-GGCAAAGTCAGGATCGCTATT-3'(서열번호 68)

RHBC203R:

5'-ACGTGAGCTTGATGTGTTAGTT-3'(서열번호 69)

도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 rhbC2 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 18배(log₁₀1.25) 증가)된 반면, rhbC2 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD09)에서는 표적 유전자인 rhbC2 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 rhbC2 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.

실시예 3-10: 아시네토박터 바우마니 변이주( HKD10 )의 실시간 PCR 분석

아시네토박터 바우마니 변이주로서 araJ 유전자가 결실된 HKD10를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 ARAJ03F/ARAJ03R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD10)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).

ARAJ03F:

5'-CATGGCTTAGGAATGGGACTT-3'(서열번호 70)

ARAJ03R:

5'-GGCCGCTTGAGTAACTAGATG-3'(서열번호 71)

도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 araJ 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 27배(log₁₀1.41) 증가)된 반면, araJ 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD10)에서는 표적 유전자인 araJ 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 araJ 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.

실시예 3-11: 아시네토박터 바우마니 변이주( HKD11 )의 실시간 PCR 분석

아시네토박터 바우마니 변이주로서 iucD 유전자가 결실된 HKD11를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 IUCD03F/IUCD03R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD11)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).

IUCD03F:

5'-TGATGTGGAGGTAGTGTGTAATG-3'(서열번호 72)

IUCD03R:

5'-GCTTTCTGGTAAATGTGGAGTTG-3'(서열번호 73)

도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 iucD 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 30배(log₁₀1.45) 증가)된 반면, iucD 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD11)에서는 표적 유전자인 iucD 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 iucD 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.

실시예 3-12: 아시네토박터 바우마니 변이주( HKD12 )의 실시간 PCR 분석

아시네토박터 바우마니 변이주로서 rhbC3 유전자가 결실된 HKD12를 사용하고, S5/S6 프라이머로서 각각 RHBC303F/RHBC303R을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD12)에서의 표적 유전자 결실여부를 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5).

RHBC303F:

5'-GAGCAGCCAATTTCAGATCAAG-3'(서열번호 74)

RHBC303R:

5'-GAGCTTGCCAAGGATGTAGT-3'(서열번호 75)

도 5에서 보듯이, 철이 결핍된 조건하에서 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(WT)에서는 표적 유전자인 rhbC3 유전자가 높은 수준으로 발현(발현양이 102배(log₁₀2.00) 증가)된 반면, rhbC3 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD12)에서는 표적 유전자인 rhbC3 유전자가 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD03)에서는 철결핍시에 철의 획득에 필수적인 표적 유전자인 rhbC3 유전자가 결실되었음을 알 수 있었다.

실시예 4: 아시네토박터 바우마니에서 복제되지 않는 자살벡터를 이용하여, 2종의 표적 유전자가 결실된 변이 균주의 제작

실시예 2-2에서 제작한 bauA 유전자가 결실된 아시네토박터 바우마니 균주(HKD02)에 실시예 2-5에서 사용된 상동재조합 벡터 pHKD06를 도입하고, 실시예 2-1의 방법으로 배양하여, 상기 아시네토박터 바우마니 균주(HKD02)에서 cirA 유전자가 추가로 결실된 아시네토박터 바우마니 균주(HKD13)를 제작하였다. 상기 제작된 아시네토박터 바우마니 균주(HKD13)는 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(ATCC 19606)에서 bauA 유전자와 cirA 유전자가 동시에 결실된 변이균주이며, 이를 확인하기 위하여, 상기 아시네토박터 바우마니 변이주(HKD13)의 게놈 DNA를 전기영동하였다(도 6).

도 6은 야생형 아시네토박터 바우마니 균주(ATCC 19606)에서 bauA 유전자와 cirA 유전자가 동시에 결실된 변이균주인 아시네토박터 바우마니 균주(HKD13)의 게놈 DNA를 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

상기 도 6에서 보듯이, 상기 제작된 변이균주인 아시네토박터 바우마니 균주(HKD13)는 bauA 유전자와 cirA 유전자가 동시에 결실된 변이균주임을 알 수 있었다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Process for preparing murtant strain of multidrug-resistant strain using suicide vector <130> KPA140838-KR <160> 75 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pHKD01 <400> 1 ccatgtcagc cgttaagtgt tcctgtgtca ctcaaaattg ctttgagagg ctctaagggc 60 ttctcagtgc gttacatccc tggcttgttg tccacaaccg ttaaacctta aaagctttaa 120 aagccttata tattcttttt tttcttataa aacttaaaac cttagaggct atttaagttg 180 ctgatttata ttaattttat tgttcaaaca tgagagctta gtacgtgaaa catgagagct 240 tagtacgtta gccatgagag cttagtacgt tagccatgag ggtttagttc gttaaacatg 300 agagcttagt acgttaaaca tgagagctta gtacgtgaaa catgagagct tagtacgtac 360 tatcaacagg ttgaactgct gatcttcaga tcctctacgc cggacgcatc gtggccggat 420 ccagccgacc aggctttcca cgcccgcgtg ccgctccatg tcgttcgcgc ggttctcgga 480 aacgcgctgc cgcgtttcgt gattgtcacg ctcaagcccg tagtcccgtt cgagcgtcgc 540 gcagaggtca gcgagggcgc ggtaggcccg atacggctca tggatggtgt ttcgggtcgg 600 gtgaatcttg ttgatggcga tatggatgtg caggttgtcg gtgtcgtgat gcacggcact 660 gacgcgctga tgctcggcga agccaagccc agcgcagatg cggtcctcaa tcgcgcgcaa 720 cgtctccgcg tcgggcttct ctcccgcgcg gaagctaacc agcaggtgat aggtcttgtc 780 ggcctcggaa cgggtgttgc cgtgctgggt cgccatcacc tcggccatga cagcgggcag 840 ggtgtttgcc tcgcagttcg tgacgcgcac gtgacccagg cgctcggtct tgccttgctc 900 gtcggtgatg tacttcacca gctccgcgaa gtcgctcttc ttgatggagc gcatggggac 960 gtgcttggca atcacgcgca ccccccggcc gttttagcgg ctaaaaaagt catggctctg 1020 ccctcgggcg gaccacgccc atcatgacct tgccaagctc gtcctgcttc tcttcgatct 1080 tcgccagcag ggcgaggatc gtggcatcac cgaaccgcgc cgtgcgcggg tcgtcggtga 1140 gccagagttt cagcaggccg cccaggcggc ccaggtcgcc attgatgcgg gccagctcgc 1200 ggacgtgctc atagtccacg acgcccgtga ttttgtagcc ctggccgacg gccagcaggt 1260 aggccgacag gctcatgccg gccgccgccg ccttttcctc aatcgctctt cgttcgtctg 1320 gaaggcagta caccttgata ggtgggctgc ccttcctggt tggcttggtt tcatcagcca 1380 tccgcttgcc ctcatctgtt acgccggcgg tagccggcca gcctcgcaga gcaggattcc 1440 cgttgagcac cgccaggtgc gaataaggga cagtgaagaa ggaacacccg ctcgcgggtg 1500 ggcctacttc acctatcctg cccggctgac gccgttggat acaccaagga aagtctacac 1560 gaaccctttg gcaaaatcct gtatatcgtg cgaaaaagga tggatatacc gaaaaaatcg 1620 ctataatgac cccgaagcag ggttatgcag cggaaaagcg ctgcttccct gctgttttgt 1680 ggaatatcta ccgactggaa acaggcaaat gcaggaaatt actgaactga ggggacaggc 1740 gagagacgat gccaaagagc tacaccgacg agctggccga gtgggttgaa tcccgcgcgg 1800 ccaagaagcg ccggcgtgat gaggctgcgg ttgcgttcct ggcggtgagg gcggatgtcg 1860 aggcggcgtt agcgtccggc tatgcgctcg tcaccatttg ggagcacatg cgggaaacgg 1920 ggaaggtcaa gttctcctac gagacgttcc gctcgcacgc caggcggcac atcaaggcca 1980 agcccgccga tgtgcccgca ccgcaggcca aggctgcgga acccgcgccg gcacccaaga 2040 cgccggagcc acggcggccg aagcaggggg gcaaggctga aaagccggcc cccgctgcgg 2100 ccccgaccgg cttcaccttc aacccaacac cggacaaaaa ggatcctcta cgccggacgc 2160 atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaagt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc 2220 accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt 2280 atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca tctccttgct gcctcgcgcg 2340 tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg 2400 tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg 2460 gtgtcggggc gcagccatga cccgggaatt acgccccgcc ctgccactca tcgcagtact 2520 gttgtaattc attaagcatt ctgccgacat ggaagccatc acaaacggca tgatgaacct 2580 gaatcgccag cggcatcagc accttgtcgc cttgcgtata atatttgccc atggtgaaaa 2640 cgggggcgaa gaagttgtcc atattggcca cgtttaaatc aaaactggtg aaactcaccc 2700 agggattggc tgagacgaaa aacatattct caataaaccc tttagggaaa taggccaggt 2760 tttcaccgta acacgccaca tcttgcgaat atatgtgtag aaactgccgg aaatcgtcgt 2820 ggtattcact ccagagcgat gaaaacgttt cagtttgctc atggaaaacg gtgtaacaag 2880 ggtgaacact atcccatatc accagctcac cgtctttcat tgccatacgg aattccggat 2940 gagcattcat caggcgggca agaatgtgaa taaaggccgg ataaaacttg tgcttatttt 3000 tctttacggt ctttaaaaag gccgtaatat ccagctgaac ggtctggtta taggtacatt 3060 gagcaactga ctgaaatgcc tcaaaatgtt ctttacgatg ccattgggat atatcaacgg 3120 tggtatatcc agtgattttt ttctccattt tagcttcctt agctcctgcc ctatgggatt 3180 cacctttatg ttgataagaa ataaaagaaa atgccaatag gatatcggca ttttcttttg 3240 cgtttttatt tgttaactgt taattgtcct tgttcaagga tgctgtcttt gacaacagat 3300 gttttcttgc ctttgatgtt cagcaggaag cttggcgcaa acgttgattg tttgtctgcg 3360 tagaatcctc tgtttgtcat atagcttgta atcacgacat tgtttccttt cgcttgaggt 3420 acagcgaagt gtgagtaagt aaaggttaca tcgttaggat caagatccat ttttaacaca 3480 aggccagttt tgttcagcgg cttgtatggg ccagttaaag aattagaaac ataaccaagc 3540 atgtaaatat cgttagacgt aatgccgtca atcgtcattt ttgatccgcg ggagtcagtg 3600 aacaggtacc atttgccgtt cattttaaag acgttcgcgc gttcaatttc atctgttact 3660 gtgttagatg caatcagcgg tttcatcact tttttcagtg tgtaatcatc gtttagctca 3720 atcataccga gagcgccgtt tgctaactca gccgtgcgtt ttttatcgct ttgcagaagt 3780 ttttgacttt cttgacggaa gaatgatgtg cttttgccat agtatgcttt gttaaataaa 3840 gattcttcgc cttggtagcc atcttcagtt ccagtgtttg cttcaaatac taagtatttg 3900 tggcctttat cttctacgta gtgaggatct ctcagcgtat ggttgtcgcc tgagctgtag 3960 ttgccttcat cgatgaactg ctgtacattt tgatacgttt ttccgtcacc gtcaaagatt 4020 gatttataat cctctacacc gttgatgttc aaagagctgt ctgatgctga tacgttaact 4080 tgtgcagttg tcagtgtttg tttgccgtaa tgtttaccgg agaaatcagt gtagaataaa 4140 cggatttttc cgtcagatgt aaatgtggct gaacctgacc attcttgtgt ttggtctttt 4200 aggatagaat catttgcatc gaatttgtcg ctgtctttaa agacgcggcc agcgtttttc 4260 cagctgtcaa tagaagtttc gccgactttt tgatagaaca tgtaaatcga tgtgtcatcc 4320 gcatttttag gatctccggc taatgcaaag acgatgtggt agccgtgata gtttgcgaca 4380 gtgccgtcag cgttttgtaa tggccagctg tcccaaacgt ccaggccttt tgcagaagag 4440 atatttttaa ttgtggacga atcgaattca ggaacttgat atttttcatt tttttgctgt 4500 tcagggattt gcagcatatc atggcgtgta atatgggaaa tgccgtatgt ttccttatat 4560 ggcttttggt tcgtttcttt cgcaaacgct tgagttgcgc ctcctgccag cagtgcggta 4620 gtaaaggtta atactgttgc ttgttttgca aactttttga tgttcatcgt tcatgtctcc 4680 ttttttatgt actgtgttag cggtctgctt cttccagccc tcctgtttga agatggcaag 4740 ttagttacgc acaataaaaa aagacctaaa atatgtaagg ggtgacgcca aagtatacac 4800 tttgcccttt 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<223> primer <400> 29 ctttagaagt atcaatttga ttcatcgtca gatatcacta acaatttaag gc 52 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 atgaatcaaa ttgatacttc taaagcact 29 <210> 31 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gcaacacctt cttcacgagg cagacagcaa ctttacgacc tgccg 45 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gcccaacaat ctctacgcac 20 <210> 33 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 aagacatatt catcgtcaga tatcaagata aatctcactt cacctgcaat 50 <210> 34 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 tgatatctga cgatgaatat gtcttttaa 29 <210> 35 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gcaacacctt cttcacgagg cagacgactc aatccgaacc gtacg 45 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ccatgatcat gctaacctta gcag 24 <210> 37 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gctgaagtgc attcatagat aaatctttta ttaatcctat ttctttaatt ggtcg 55 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 gatttatcta tgaatgcact tcagcc 26 <210> 39 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gcaacacctt cttcacgagg cagacccaag agctttaatt cctatcgg 48 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 gggtacaact ccacatttac cag 23 <210> 41 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 tgtaattgtc ccatttttat taatcatcct ctgtttagct tattcaatat gc 52 <210> 42 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gattaataaa aatgggacaa ttacatcc 28 <210> 43 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gcaacacctt cttcacgagg cagacgcaac cagtctgtaa taattggc 48 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gatattggtt tacgtggatg gc 22 <210> 45 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 tccatacaca tatcctctgt ttagctcaag cataactcac atccttctgt 50 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 gctaaacaga ggatatgtgt atggaac 27 <210> 47 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 gcaacacctt cttcacgagg cagactcatt agcgcaaaac cagtcc 46 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 attgtttttt gttcggtgtt cg 22 <210> 49 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 gtccaattcc aataaaatca agcatctgac tacatcctat tcagaatctt aagc 54 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 atgcttgatt ttattggaat tgga 24 <210> 51 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 gcaacacctt cttcacgagg cagactgctg caataacaca atcagcc 47 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 gactgaccca aacacctcaa 20 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 ggaaatgctt cttgggcata atc 23 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 cacgtggtgt taacgtctct ac 22 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 cacgaatcat tgcgccttta tc 22 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 gctactcatt acgtcaggtt cag 23 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 ccactgagga ataacgtgtg g 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 aaagatggcg agtcacagta g 21 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 cccaatagct ctccggtatt ag 22 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 gtagtaactg cgactcgtac ac 22 <210> 61 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 gccgtagctt gctggataa 19 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 cgttgtggtc ttaggtgcta tt 22 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 cccttcattg cgagtggtta 20 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 gtgcgtttat ggaatggatg g 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 agggacaatt acggcataag g 21 <210> 66 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 caaagcttgg cacatagatt cc 22 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 cttgctgact gagaccttct t 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 ggcaaagtca ggatcgctat t 21 <210> 69 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 acgtgagctt gatgtgttag tt 22 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 catggcttag gaatgggact t 21 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 ggccgcttga gtaactagat g 21 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 tgatgtggag gtagtgtgta atg 23 <210> 73 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 gctttctggt aaatgtggag ttg 23 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 gagcagccaa tttcagatca ag 22 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 gagcttgcca aggatgtagt 20

Claims

(a) R6K ori, mob RP4 유전자, cat 유전자, sacB 유전자 및 다클론부위를 포함하는 자살벡터의 다클론부위에 DNA 삽입단편이 도입된 재조합벡터를 수득하는 단계;
(b) 상기 수득한 재조합벡터를 다제내성 균주에 도입하여, 형질전환체를 수득하는 단계; 및
(c) 상기 형질전환체를 수크로스를 포함하는 배지에서 배양하여 표적 유전자가 결실된 변이주를 선발하는 단계를 포함하는, 다제내성 균주의 변이주 제작방법.
제1항에 있어서,
(a) 단계의 자살벡터는 다제내성 균주에서 복제되지 않는 특성을 나타내는 것인 방법.
제1항에 있어서,
(a) 단계의 자살벡터는 도 1b에 도시된 개열지도를 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서,
(a) 단계의 자살벡터는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
(a) 단계의 DNA 삽입단편은 다제내성 균주의 게놈 DNA에 위치한 표적 유전자의 상류에 인접한 염기서열, 상기 표적 유전자의 하류에 인접한 염기서열 및 다제내성 균주가 저항성을 나타내지 않은 항생제에 대한 저항성을 나타내는 단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열을 순차적으로 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
(b) 단계의 다제내성 균주는 아시네토박터 바우마니 균주(Acinetobacter baumannii)인 것인 방법.
제1항에 있어서,
(b) 단계의 형질전환체의 수득은 재조합벡터가 도입된 다제내성 균주를 다제내성 균주가 저항성을 나타내지 않은 항생제가 포함된 배지에서 배양하고, 생존하는 균주를 선별하여 수행하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
(c) 단계의 표적 유전자가 결실된 변이주의 선발은 (c1) 수크로스를 포함하는 배지에서 배양된 형질전환체를 다제내성 균주가 내성을 나타내지 않은 항생제가 포함된 배지에서 배양하고, 생존하지 않는 균주를 선발하는 단계; 및, (c2) 상기 선발된 균주로부터 게놈 DNA를 수득하고 그의 크기를 야생형 다제내성 균주의 게놈 DNA의 크기와 비교하여, 상기 게놈 DNA의 크기가 감소된 균주를 선별하는 단계에 의하여 수행하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
(c) 단계의 표적 유전자가 결실된 변이주의 선발은 (c1') 수크로스를 포함하는 배지에서 배양된 형질전환체를 다제내성 균주가 내성을 나타내지 않은 항생제가 포함된 배지에서 배양하고, 생존하지 않는 균주를 선발하는 단계; 및, (c2') 상기 선발된 균주에서 나타나는 표적 유전자의 활성을 측정하여, 야생형 다제내성 균주에서 측정된 표적 유전자의 활성보다 상대적으로 낮은 수준을 나타내는 균주를 선별하는 단계에 의하여 수행하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
다제내성 균주에 존재하는 다른 표적 유전자를 추가로 결실시키기 위하여, (a) 내지 (c) 단계를 반복수행하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되어 다제내성 균주의 표적 유전자가 결실된 변이주.