KR20160027563A - 시링산 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시링산, 또는 이의 약제학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 지질관련 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 비만이 유도된 개체의 체중 증가량, 혈 중 및 간 조직 내 지질함량을 감소시키고, 지방산 산화 관련 유전자의 발현을 촉진시키며, 지질합성 관련 유전자 및 효소의 발현을 억제시킨다. 또한, 아스파르트산 아미노전이효소(AST) 및 알라닌 아미노전이효소(ALT)의 활성을 억제시키고, 렙틴 함량 및 인슐린 저항성을 감소시키며, 아디포넥틴 함량을 증가시킨다. 또한, 혈청 중 염증인자 및 간 조직 내 염증관련 유전자의 발현을 억제시키고, 항산화 대사 관련 효소 및 지질산화 관련 단백질의 발현을 증가시키는 효과를 나타내므로, 비만 또는 지질관련 대사성 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다. 아울러, 상기 시링산은 식물로부터 유래된 화학물질이기 때문에 인체에 대한 부작용이 화학적 합성물보다 극히 적어 매우 안전하므로, 약제학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

Description

시링산 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for preventing or treatmenting obesity or lipid-related metabolic disease comprising syringic acid, or salt thereof as an active ingredient}

본 발명은 비만 또는 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비만을 유도한 개체의 체중 증가량, 혈 중 및 간 조직 내 지질함량을 감소시키고, 아디포사이토카인(adipocytokines)의 발현 조절, 지질대사 관련 효소 및 유전자 발현 조절, 염증인자 및 염증 관련 유전자 발현 조절하는 시링산, 또는 이의 약제학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염을 포함하는 비만 또는 비만으로 인한 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근 우리나라는 경제성장과 더불어 식생활이 서구화 되면서 섭취하는 열량이 늘어나고, 그에 따라 비만 인구도 증가하는 추세이다. 구체적으로 2013년 보건복지통계연보에 따르면, 만 19세 이상 성인들 중에서 비만인의 비율이 31.4%로 2010년에 조사된 30.9%보다 0.5% 증가하였으며, 소아 비만율도 빠르게 증가하고 있는 추세이다.

이러한 비만은 그 자체로도 체중이 증가하고 몸집이 비대해져 생활에 불편을 주지만 더 큰 문제는 혈 중 지질 농도를 높여, 동맥경화와 심장병을 발생시키고, 인슐린 저항성을 높여 당뇨, 생리불순, 암 등의 합병증을 유발하며, 고지혈증, 고혈압, 관상동맥 및 뇌졸중 등의 만성 성인병 질환의 원인이 되기 때문에 비만의 치료와 예방은 필수적이다(Lee JH, J. Kor. Soc. Obes., 1:21-24, 1992; Lew EA, Ann. Intern. Med., 103:1024-1029, 1985; Kim KI et al., Korean J. Food Sci. Technol., 35:720-725, 2003).

비만을 유발하는 원인은 유전적 영향, 서구화되는 식생활에 의한 환경적인 영향, 스트레스에 의한 심리적인 영향 등에 의해 유발되는 것으로 알려져 있으나 그 정확한 원인이나 기작에 대해서는 명확히 밝혀져 있지 않다.

과거 지방세포는 단순히 인체의 잉여에너지를 중성지방의 형태로 저장하고 외부로부터 충격을 완충해주는 작용을 하는 세포로 인식되어져 왔다. 하지만 최근에 지방세포는 공복, 대사, 인슐린 민감도(insulin sensitivity)를 조절하는 아디포사이토카인(adipocytokine)을 분비하는 내분비기관으로서 인식되고 있다. 구체적으로, 아디포넥틴(adiponectin), 렙틴(leptin), 레지스틴(resistin), 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor alpha; TNF-α), 인터루킨-6(interleukin-6; IL-6) 등의 아디포사이토카인(adipocytokines)이 항상성 유지와 에너지 대사 조절에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Matsuzawa, Y. et al., Ann. Ny. Acad. Sci., 892:146-154, 1999; Saltiel, A.R., Nat. Med., 7:887-888, 2001).

특히, 비만 유전자에서 생성되는 렙틴은 지방세포의 양과 비례하므로 비만자의 혈청 렙틴의 농도가 정상 체중자에 비하여 높게 나타나고, 내장지방보다는 피하지방에서 더 많이 생성되는데, 이러한 렙틴은 지방세포의 내분비 개념으로 비만에 중요한 역할을 하고, 섭식조절 뿐만 아니라 에너지 소비와 생식기능까지 광범위하게 작용하며, 식욕을 억제하고 교감신경계를 통하여 열 생성을 증가시킨다. 또한, 뇌를 순환하면서 시상하부의 수용체에 작용하여 식이를 억제하고, 체내지방이 증가하면 뇌에서 분비되는 물질로서 뇌에 포만감을 관장하는 만복중추(satiety center)를 자극해 식욕을 저해하는 물질 중 하나로 밝혀졌다(Mantzoros, C.S., Ann Intern. Med., 130:671-680, 1999; Roemmich, J.N. and A.D., Am. J. Hum. Biol., 11:209-224, 1999).

이와 같은 비만을 치료하기 위한 목표는 크게 두 가지로 구분할 수 있다. 첫 번째는 과량의 지방을 연소시켜 체중을 감소시키는 것이며, 두 번째는 대사성 불균형(metabolic imbalance)을 개선시키는 것이다. 현재 비만의 치료는 체중감량 뿐만 아니라, 조기에 심혈관 질환을 유발하는 요인을 제거하여 대사 이상을 개선하는 데 그 목표가 있다. 또한 식이섭취 조절 및 에너지 소비 조절을 통해 비만을 억제하는 연구도 활발히 이루어지고 있다. 음식을 섭취하는 행동을 조절하는 기관으로 시상하부와 운동신경, 자율신경 및 말초신경계가 모두 관여하는데 비만의 병인론에 있어서 중추신경계 중 특히 시상하부가 중요한 역할을 하며 뉴로펩타이드 Y, POMC/CART, 멜라노코틴 수용체, 노르에피네프린, 세로토닌 등이 시상하부에서 분비되는 대표적인 인자들이다. 현재 비만치료제 개발 전략은 식사량 감소, 열량흡수의 억제, 발열반응 촉진, 에너지 대사 조절, 신경계를 통한 신호전달조절과 같은 것들이다(박미정,Korean J Pediatr 48(2), 2005).

현재까지 알려진 비만치료제는 작용 기작에 따라 크게 포만감 항진제, 지방흡수 억제제, 항정신성 식욕 억제제로 나뉘며, 가장 대표적인 약물들로는 제니칼(Xenical^TM, 로슈제약회사, 스위스), 리덕틸(Reductil^TM, 애보트사, 미국), 엑소리제(Exolise^TM, 아토파마, 프랑스) 등이 있으나 지방변, 장내가스발생, 복부팽만감, 배변 실금 등을 유발하고, 심장질환, 호흡기 질환, 신경계질환 등의 부작용을 동반하며, 그 효능의 지속성이 낮다는 문제점이 있다.

이에 상기와 같은 인공적으로 합성된 물질의 부작용을 최소화하기 위해 천연물질로부터 체중조절에 효과적인 기능성 물질의 개발이 이루어지고 있다. 이러한 대표적 예로 녹차, 인산, 당귀, 차가버섯, 홍삼, 다래나무, 갈조류 등이 있다. 그러나 이러한 천연물질로부터 추출한 항비만 물질의 경우 효능을 나타내는 물질의 유효농도가 약하고, 농경지 등에서 재배하여야 하므로 많은 비용이 소용되는 등의 문제가 있다.

이에 본 발명자들은 식물 추출물 유래 파이토케미칼(phytochemical) 중 비만 또는 지질관련 대사성 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 개발하기 위하여 노력한 결과, 시링산, 또는 이의 약제학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물이 비만을 유도한 개체의 체중 증가량, 혈 중 및 간 조직 내 지질함량을 감소시키고, 아디포사이토카인(adipocytokine)의 발현 조절, 지질대사 관련 효소 및 유전자 발현 조절, 염증인자 및 염증대사 관련 유전자 발현을 조절함으로써 비만 또는 지질관련 대사성 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 시링산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 시링산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 시링산 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 시링산 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 시링산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 시링산(syringic acid)은 페놀성 화합물 중 하나로, IUPAC명은 4-히드록시-3,5-디메톡시벤조산(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid)으로 하기 화학식 1의 구조를 가진다.

상기 시링산(syringic acid)은 시킴산 경로(shikimic acid pathway)에 의하여 합성되는 페놀 화합물로서, 수수(sorghyum bicolor), 아사이베리(Euterpe oleracea) 등의 식물 종에서 추출, 분리 및 정제되거나, 화학적으로 합성 제조된 상품(예를 들어, Sigma-aldrich사의 syringic acid)일 수 있다. 상기 시링산은 항산화, 미백활성, 항균, 항암 등의 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다(대한민국 등록특허 제10-1283849호; Journal of agricultural science, Khim P.C., 2009, 1(2):15-20.; J. Exp. Biomed. Sci., Lee et al., 2005. 11:337-341.). 그러나 아직까지 시링산의 비만 및/또는 지질관련 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료 효능에 대해서는 알려진 바가 없다.

상기 식물에서 시링산을 추출하는 경우 물 또는 유기 용매를 사용하여 추출할 수 있는데, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 상기 유기용매는 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매이며, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 부탄올, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합용매이며, 추출물의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 상기 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.

또한, 상기 시링산은 상기 추출용매에 의하여 추출하는 방법 외에 통상적인 정제과정을 거쳐서도 수득할 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제방법을 통해 얻어진 분획을 통하여서도 시링산을 수득할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 시링산의 약제학적으로 허용가능한 염은 약제학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성되는 산부가염 또는 염기에 의해 형성되는 금속염이 유용하다. 하나의 예로, 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다. 무기산으로는 염산, 황산, 브롬산, 아황산 또는 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레인산, 푸마산, 글루콘산, 메탄술폰산 등을 사용할 수 있다. 또한, 금속염으로는 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 사용할 수 있다. 그러나 반드시 이로 제한되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 비만은 에너지 불균형으로 의하여 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)을 의미한다.

본 발명에 있어서, 지질관련 대사성 질환은 생체 내 과도한 지질 축적에 의해 발생하는 질환을 의미한다. 구체적인 예로, 당뇨, 고지혈증, 지방간, 간염, 간경화, 동맥경화, 고혈압, 심혈관질환 및 상기 질환들이 동시다발적으로 발생하는 대사증후군 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분인 시링산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염에 의하여 비만이 유도된 개체의 체중 증가량, 체내 지방량, 지방합성관련 유전자 발현 및 지방합성관련 효소의 활성을 감소시키고, 지방산 산화를 촉진시키며, 아디포사이토카인, 염증인자, 항산화 대사 관련 효소 및 지질산화 관련 단백의 발현을 조절하여 비만 또는 지질관련 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 효능을 나타낸다.

하나의 구체적 실시에서, 비만을 유발시킨 실험동물에 시링산을 급여하는 경우, 비만을 유발시킨 실험동물(고지방 대조군)에 비하여 식이섭취량과 식이효율의 변화 없이 체중을 유의적으로 감소시켜 체중 증가량이 약 10% 감소되었고, 내장지방 함량은 13% 감소되었으며, 간 조직 내 중성지방(트리글리세리드) 함량은 44%, 혈청 내의 중성지방(트리글리세리드) 함량은 12% 감소되었다. 또한, 비만을 유발시킨 실험동물에 시링산을 급여한 경우 비만을 유발시킨 실험동물(고지방 대조군)에 비하여 지방산 산화에 관여하는 유전자인 AdipoR2, PPARα, ACSL, CPT1 및 CPT2의 발현이 각각 118%, 88%, 77%, 118% 및 42% 증가되었고, 지방산화 효소인 베타-옥시데이션(β-oxidation)과 카르니틴 아실트렌스퍼레이즈(CPT)의 활성이 각각 106% 및 47% 증가되었다. 반면, 지방합성 관련 유전자인 CIDEA, PPARγ, SREBF 및 FASN의 발현이 각각 72%, 40%, 37% 및 43% 감소되었으며, 지방합성 효소인 포스파티드산 포스파데이즈(PAP)와 지방산 합성효소(FAS)의 활성이 각각 33% 및 61% 감소되었다.

다른 하나의 구체적 실시에서, 비만을 유발시킨 실험동물에 시링산을 급여하는 경우 비만을 유발시킨 실험동물(고지방 대조군)에 비하여 간독성 효소인 아스파르트산 아미노전이효소(asparate aminotransferase, AST) 및 알라닌 아미노전이효소(alanin aminotransferase, ALT)의 활성이 감소되었고, 아디포넥틴의 농도는 17% 증가하였으며, 렙틴의 농도는 34% 감소되었다. 또한, 비만을 유발시킨 실험동물에 시링산을 급여하는 경우 비만을 유발시킨 실험동물(고지방 대조군)에 비하여 인슐린 저항성이 63% 감소되었다.

또 다른 하나의 구체적 실시에서, 비만을 유발시킨 실험동물에 시링산을 급여하는 경우 비만을 유발시킨 실험동물(고지방 대조군)에 비하여 혈청 중 염증인자인 TNF-α, INF-γ 및 MCP-1의 함량이 각각 54%, 57% 및 40% 감소되었으며, 염증관련 유전자인 TLR4, MYD88, NF-κB, TNF-α, IL-6의 발현이 각각 58%, 71%, 65%, 76% 및 69% 억제되었다. 또한, 비만을 유발시킨 실험동물에 시링산을 급여하는 경우 비만을 유발시킨 실험동물(고지방 대조군)에 비하여 항산화 대사 관련 효소인 CAT, GSH-Px 및 GST의 활성이 각각 48%, 40% 및 29% 증가하였고, 지질대사 관련 단백질인 PPARα의 함량이 15% 증가하였다.

본 명세서에서, 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 개체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 본 명세서에서, 용어 "개선" 또는 "치료"는 개체에서 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제 (b) 질환 또는 질병의 경감 및 (c) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다. 본 명세서에서, 용어 "개체"는 본 발명의 상기 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 래트, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 약제학적 조성물은 상기 시링산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 이외에 약제학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 윤활제, 습윤제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 담체를 포함할 수 있다.

상기 약제학적 조성물로 적합한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

상기 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구, 비경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 직장 또는 정맥 내 주입, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 등으로 투여될 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.1-100 ㎎/kg(체중)이다. 또한, 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 mL의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

상기 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 시링산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 약제학적 조성물의 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 10중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 5중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 함량이 0.0001중량% 미만인 경우에는 비만 및/또는 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 치료 효과가 너무 미약하고, 10중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하고 제형상 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 시링산 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 시링산의 구조, 추출법, 효능, 용도 등에 관한 내용은 상술한 바와 같다.

본 발명에 있어서, 상기 시링산의 식품학적으로 허용가능한 염은 식품학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성되는 산부가염 또는 염기에 의해 형성되는 금속염이 유용하다. 하나의 예로, 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다. 무기산으로는 염산, 황산, 브롬산, 아황산 또는 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레인산, 푸마산, 글루콘산, 메탄술폰산 등을 사용할 수 있다. 또한, 금속염으로는 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 사용할 수 있다. 그러나 반드시 이로 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 시링산 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염 이외에 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물은 포도당 및 과당 당의 모노사카라이드, 말토스, 수크로스 및 올리고당 등의 디사카라이드, 덱스트린 및 사이클로덱스트린 등의 폴리사카라이드 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 시링산 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품이 음료일 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 식품은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일쥬스, 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

상기 시링산 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염은 조성물의 총 종량을 기준으로 0.0001 내지 10중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 5중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 함량이 0.0001중량% 미만인 경우에는 비만 및/또는 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 개선 효과가 너무 미약하고, 10중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하고 제형상 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

본 발명의 약제학적 또는 식품 조성물은 상술한 바와 같이 비만이 유도된 개체의 체중 증가량 감소, 혈 중 및 간 조직 내 지질함량 감소, 지질합성 관련 유전자 및 효소 발현 억제, 지방산 산화 관련 유전자 발현 촉진, 아스파르트산 아미노전이효소(AST) 및 알라닌 아미노전이효소(ALT) 활성 억제, 아디포넥틴 함량 증가, 렙틴 함량 감소, 인슐린 저항성 감소, 혈청 중 염증인자 및 염증관련 유전자 발현 억제 및 항산화 대사 관련 효소 및 지질산화 관련 단백질의 발현을 증가시킴으로, 비만 또는 지질관련 대사성 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효능을 나타낸다. 또한, 본 발명의 조성물에 유효성분으로 포함되는 시링산, 또는 이의 약제학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염은 식물로부터 유래된 화학물질로, 인체에 대한 부작용이 화학적 합성물질에 비하여 극히 적어 매우 안전하다.

본 발명의 시링산은 비만이 유도된 개체의 체중 증가량, 혈 중 및 간 조직 내 지질함량을 감소시키고, 지방산 산화 관련 유전자의 발현을 촉진시키며, 지질합성 관련 유전자 및 효소의 발현을 억제시킨다. 또한, 아스파르트산 아미노전이효소(AST) 및 알라닌 아미노전이효소(ALT)의 활성을 억제시키고, 렙틴 함량 및 인슐린 저항성을 감소시키며, 아디포넥틴 함량을 증가시킨다. 또한, 혈청 중 염증인자 및 염증관련 유전자의 발현을 억제시키고, 항산화 대사 관련 효소 및 지질산화 관련 단백질의 발현을 증가시키는 효과를 나타내므로, 비만 또는 지질관련 대사성 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다. 아울러, 상기 시링산은 식물로부터 유래된 화학물질이기 때문에 인체에 대한 부작용이 화학적 합성물보다 극히 적어 매우 안전하므로, 약제학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

도 1은 일반식이, 고지방식이 및 시링산이 포함된 고지방식이를 섭취한 실험동물의 체중 및 체중증가량을 측정한 결과이다.
도 2는 일반식이, 고지방식이 및 시링산이 포함된 고지방식이를 섭취한 실험동물의 내장지방조직의 크기 및 형태학적 변화를 광학현미경을 이용하여 관찰한 결과이다.
도 3은 일반식이, 고지방식이 및 시링산이 포함된 고지방식이를 섭취한 실험동물의 간 조직 내 지방축적정도를 광학현미경을 이용하여 관찰한 결과이다.
도 4는 일반식이, 고지방식이 및 시링산이 포함된 고지방식이를 섭취한 실험동물의 간 조직에서 지질대사 관련 유전자인 AdipoR2, PPARα, ACSL, CPT1, CTP2, CIDEA, PPARγ, SREBF 및 FASN의 발현을 측정한 결과이다.
도 5는 일반식이, 고지방식이 및 시링산이 포함된 고지방식이를 섭취한 실험동물의 간 조직에서 지질대사 관련 효소인 포스파티드산 포스파테이즈(PAP), 지방산합성효소(FAS), 포도당-6-인산탈수소효소(G6PD), 베타-옥시데이션(β-oxidation) 및 카르니틴 아실트렌스퍼레이즈(CPT)의 활성의 활성을 측정한 결과이다.
도 6은 일반식이, 고지방식이 및 시링산이 포함된 고지방식이를 섭취한 실험동물의 혈청을 이용하여 공복시 혈당, 내당능, 아스파르트산 아미노전이효소(asparate aminotransferase, AST)와 알라닌 아미노전이효소(alanine aminotransferase, ALT)의 활성, 인슐린 농도, 렙틴 농도, 아디포넥틴 농도 및 인슐린저항성(HOMA-IR)을 측정한 결과이다.
도 7은 일반식이, 고지방식이 및 시링산이 포함된 고지방식이를 섭취한 실험동물의 혈청 중의 염증 관련 사이토카인인 TNF-α, IFN-γ 및 MCP-1의 함량을 측정한 결과이다.
도 8은 일반식이, 고지방식이 및 시링산이 포함된 고지방식이를 섭취한 실험동물의 간 조직에서 염증관련 유전자인 TLR4, MYD88, NF-κB, TNF-α 및 IL-6의 발현을 측정한 결과이다.
도 9는 일반식이, 고지방식이 및 시링산이 포함된 고지방식이를 섭취한 실험동물의 간 조직에서 항산화 대사 관련 효소인 CYP2E1, SOD, CAT, GSH-Px, GST 활성과 H₂O₂ 및 GSH의 함량을 측정한 결과이다.
도 10은 일반식이, 고지방식이 및 시링산이 포함된 고지방식이를 섭취한 실험동물의 간 조직에서 지질대사 관련 단백질인 AMPK, p-AMPK, ACC, p-ACC 및 PPARα의 발현을 측정한 결과이다.

이하, 제조예 및 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 제조예 및 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

제조예 1 : 시링산(syringic acid) 준비

시링산을 시그마(Sigma-aldrich, USA)로부터 구입하여 준비하였다.

제조예 2 : 실험동물의 사육 및 시료 준비

2-1. 실험동물의 사육

생후 4주령 된 C57BL/6J 계열 수컷 24마리를 잭슨 연구소(Jackson laboratory, USA)에서 구입하여 1주 동안 일반식이로 적응시킨 후, 3그룹(정상군, 고지방 대조군 및 고지방-시링산 급여군)으로 나누어 하기 표 1의 식이조성으로 16주 동안 사육하였다. 구체적으로, 정상군을 제외한 모든 군은 비만 유도를 위하여 총 칼로리의 20% 지방과 1% 콜레스테롤인 고지방식이를 공급하여 비만을 유도하였고, 정상군은 5%가 지방인 일반식이를 공급하였다.

동물의 사육은 항온(22±2℃), 항습(50±5%), 12시간 간격(08:00~20:00)의 광주기로 일정한 조건이 유지되는 사육시설에 설치된 개개의 폴리카보네이트 케이지(polycarbonate cage) 안에서 수행하였다.

(단위: %)
	정상군	고지방 대조군	고지방-시링산 급여군
콜린 비타르트레이트(choline bitartrate)	0.2	0.2	0.2
D,L-메티오닌(D,L-methionine)	0.3	0.3	0.3
AIN76-미네랄 혼합물(mineral mix)	3.5	4.2	4.2
AIN76-비타민 혼합물(vitamin mix)	1	1.2	1.2
카제인(casein)	20	20	20
옥수수기름(corn oil)	5	3	3
돼지기름(lard)	-	17	17
콜레스테롤(cholesterol)	-	1	1
셀룰로오스(cellulose)	5	5	5
수크로스(sucrose)	50	37	37
옥수수전분(corn starch)	15	11.1	11.1
시링산(syringic acid)	-	-	0.05
총 중량(%)	100	100	100
삼차뷰틸하이드로퀴논(tert-butylhydroquinone)	0.001	0.004	0.004

2-2. 실험동물로부터 혈청준비

상기 실시예 2-1에서 사육이 끝난 실험동물들을 12시간 동안 절식시킨 후 복부 하대정맥(inferior vena cava)으로부터 공복혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 30분 동안 실온에 두어 혈구를 가라앉힌 후, 4℃가 유지되는 원심분리기를 이용하여 3,000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하였다.

2-3. 실험동물의 장기조직 채취

상기 실시예 2-2에서 사육이 끝난 실험동물들의 혈액을 채취한 후 즉시 장기조직(간, 신장, 심장, 지방조직)을 적출하여 PBS(phosphate buffered saline)용액으로 수차례 헹군 후 표면의 수분을 제거하였으며, 즉시 액체질소로 급냉시켜 -70℃에 보관하였다.

실시예 1 : 시링산 급여에 따른 체중 및 식이섭취량 변화 측정

사육기간 동안 실험동물들의 활동성, 행동이상 유무 등과 같은 특이사항을 관찰하여 기록하였다. 체중은 1주마다 측정하고, 식이섭취량은 사육기간 중 매일 측정하여 기록하였다. 상기 체중 및 식이섭취량은 실험군당 평균값으로 나타내었고, 유의차 검정은 one-way ANOVA를 이용하여 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과를 도 1 및 표 2에 나타내었다.

	정상군	고지방 대조군	고지방-시링산군
식이섭취량(g/day)	4.09±0.08b	3.57±0.05a	3.56±0.05a
식이섭취효율(%)	3.43±0.08a	4.79±0.16c	4.33±0.07b
평균±표준오차, abc 실험군간 서로 다른 상첨자를 갖는 값은 던컨의 다중검정을 이용하여 p<0.05 수준에서 상호 유의차가 있음을 의미함.

실험결과, 실험기간 동안 모든 실험군에서 체중 증가현상이 관찰되었으며, 평균 체중 증가량은 고지방 대조군이 정상군에 비하여 유의적으로 높았으며, 고지방-시링산군의 평균 체중 증가량은 고지방 대조군에 비하여 10% 감소되어 정상군과 유사한 수준을 나타내었다.

실시예 2 : 시링산 급여에 따른 내장지방 무게 및 형태학적 변화 측정

상기 제조예 2-3에서 적출한 복부, 부고환, 신장주변 및 장간막의 지방 무게를 측정하고, 광학현미경을 이용하여 부고환 지방조직의 크기 및 형태학적 변화를 관찰하였다. 상기 내장지방조직의 무게 및 크기는 실험군당 평균값으로 나타내었고, 유의차 검정은 one-way ANOVA를 이용하여 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과를 도 2 및 표 3에 나타내었다.

(단위: mg/g B.W.)
	정상군	고지방 대조군	고지방-시링산 급여군
부고환 지방	38.50±0.91a	54.92±1.95c	46.14±3.04b
복부 지방	11.22±0.57	13.57±0.55	12.89±1.11
신장주변 지방	2.70±0.36a	4.16±0.45b	2.79±0.30a
장간막 지방	14.21±1.56	12.80±1.07	12.28±0.92
총 내장지방	66.64±2.40a	85.46±1.86b	74.09±4.15a
평균±표준오차, abc 실험군간 서로 다른 상첨자를 갖는 값은 던컨의 다중검정을 이용하여 p<0.05 수준에서 상호 유의차가 있음을 의미함.

실험결과, 고지방 대조군은 부고환 지방과 신장주변 지방이 증가되어 총 내장지방이 정상군에 비하여 유의적으로 증가하였다. 그러나, 고지방-시링산 급여군은 증가된 부고환 지방과 신장주변 지방을 유의적으로 감소시켜 총 내장지방량을 13%, 고지방식이로 증가된 지방구의 크기를 25% 감소시켰다.

실시예 3 : 시링산 급여에 따른 체내 지질 함량 변화 측정

3-1. 혈청 중의 지질함량 측정

상기 제조예 2-2에서 채취한 실험동물의 혈청 중의 트리글리세리드(triglyceride) 함량, 총 콜레스테롤 함량, 유리지방산 함량, HDL-콜레스테롤 함량 및 HTR 수치를 측정하였다.

구체적으로, 혈청 중 트리글리세리드 함량은 McGowan 등(1983)의 효소법을 이용한 발색법 원리에 따라 트리글리세리드 측정용 키트(아산제약, 한국)를 사용하여 측정하였다. 혈청 내 트리글리세리드는 지단백질지방분해효소(lipoprotein lipase, LPL)에 의해 글리세롤과 지방산으로 분해된다. 이 중 글리세롤은 ATP와 글리세롤키나제(glycerol kinase, GK)의 작용으로 L-α-글리세로인산칼슘(glycerophosphate)을 형성하며, 이것은 O₂ 및 글리세로포스포-옥시다아제(glycerophospho-oxidase)와 반응하여 H₂O₂를 발생시켰다. 여기에 퍼옥시다아제(peroxidase)와 4-아미노-안티피린(4-amino-antipyrin)을 처리하여 적색으로 발색시킨 후 550nm에서 흡광도를 측정하여 글리세롤 표준곡선과 비교하여 정량하였다.

혈청 중 총 콜레스테롤 함량은 Allain 등(1974)의 효소법을 응용한 측정용 키트(아산제약, 한국)를 사용하였다. 혈청 콜레스테롤은 에스테르형 콜레스테롤(CE)과 유리 콜레스테롤(FC) 두 형태로 존재하므로, 이들 모두를 정량하기 위하여 에스테르형 콜레스테롤을 콜레스테롤 에스테라아제(cholesterol esterase)에 의해 지방산과 유리 콜레스테롤로 전환시켰다. 유리 콜레스테롤을 콜레스테롤 옥시다아제(cholesterol oxidase)에 의해 △⁴ -콜레스테논(cholestenon)으로 전환시키고, 이 생성물과 기질인 H₂O₂를 퍼옥시다아제(peroxidase), 페놀(phenol) 및 4-아미노-안티피린(4-amino-antipyrine)과 반응시켜 적색으로 발색시킨 후, 500nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정치는 콜레스테롤 표준용액과 비교하여 정량하였다.

유리지방산 함량은 효소법을 이용한 발색법 원리에 따라 유리지방산 측정용 시액(non-esterified fatty acid, NEFA kit, Wako, Osaka, Japan)을 사용하여 측정하였다. 혈청 유리지방산에 아실 코엔자임 A(acyl coenzyme A, CoA) 합성효소를 작용시켜 acyl-CoA, AMP 및 피로인산(pyrophosphoric acid)을 생성시킨 후, 여기에 아실 코엔자임 A 옥시다아제(acyl coenzyme A oxidase)를 첨가하여 2,3-트랜스-엔오일-CoA(2,3-trans-enoyl-CoA) 및 H₂O₂를 생성시켰다. 이를 퍼옥시다아제(peroxidase)와 4-아미노-안티피린(4-amino-antipyrin) 및 N-ethyl-N-(2-hydr oxy-3-sulfo-oropyl)-m-toruidine으로 처리하여 적색으로 발색시킨 후 555nm에서 흡광도는 측정하여 유리지방산 표준곡선과 비교하여 정량하였다.

HDL-콜레스테롤 함량은 혈청 100㎕를 취하여 인텅스텐 나트륨 500μg과 염화마그네슘 1mg을 처리하면 인텅스텐산과 마그네슘 양이온의 작용으로 지단백질 중 apo B를 포함하는 LDL 및 VLDL이 침전된다(Warnick, 1982). 이를 원심분리한 후 상층액을 총 콜레스테롤과 같은 방법으로 발색 반응시켜 500nm에서 흡광도를 측정하고, 콜레스테롤 표준용액과 비교하여 정량하였다.

HTR 수치는 총 콜레스테롤과 HDL-콜레스테롤 측정치를 이용하여 하기 실험식 1을 이용하여 계산하였다.

[실험식 1]

HTR(%) = {HDL-콜레스테롤(mg/dL)/총 콜레스테롤(mg/dL)}×100

상기 혈청 중의 트리글리세리드 함량, 총 콜레스테롤 함량, 유리지방산 함량, HDL-콜레스테롤 함량 및 HTR 수치는 실험군당 평균값으로 나타내었고, 유의차 검정은 one-way ANOVA를 이용하여 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

	정상군	고지방 대조군	고지방-시링산군
트리글리세리드(mg/dL)	55.80±2.66a	67.32±2.66b	59.34±2.66a
총 콜레스테롤(mg/dL)	123.36±6.96a	150.04±5.80b	141.14±4.64b
유리지방산(mmol/L)	1.00±0.01	1.14±0.07	0.99±0.01
HDL-콜레스테롤(mg/dL)	90.10±9.67	95.51±2.71	112.53±7.73
HTR(%)	74.96±2.67b	62.77±2.81a	80.79±5.40b
평균±표준오차, ab 실험군간 서로 다른 상첨자를 갖는 값은 던컨의 다중검정을 이용하여 p<0.05 수준에서 상호 유의차가 있음을 의미함.

실험결과, 고지방 대조군의 혈청 중의 트리글리세리드와 총 콜레스테롤 함량은 정상군에 비하여 각각 약 21% 및 22% 유의적으로 증가하였으며, 시링산의 급여로 상기 증가한 혈청 중의 트리글리세리드와 총 콜레스테롤 함량을 각각 12% 및 6% 감소시켰다.

한편, 시링산 급여에 따른 HDL-콜레스테롤 함량의 감소는 이루어지지 않았으나, 총 콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤 비(HTR)은 정상군과 유사한 수치까지 증가하였다.

3-2. 간 조직 및 분변의 지질함량 측정

상기 제조예 2-3에서 채취한 실험동물의 간 조직으로부터 Folch 등(1957)의 방법을 따라 지질을 추출하였고, 조직 중의 콜레스테롤 및 트리글리세리드 함량은 Omedeo 등(1983)의 방법을 수정·보완하여 측정하였다. 구체적으로, 상기 간 조직 0.1g을 잘게 자른 후 클로로포름메탄올(chloroform:methanol, 2:1) 용액 2mL을 첨가하여 균질화 시킨 후 25℃에서 3시간 동안 지질을 추출하였다. 여기에 1M H₂SO₄ 200㎕을 첨가하여 혼합한 후 실온에서 2,000rpm으로 20분 동안 원심분리 한 다음 지질층 1mL을 옮겨 1% Triton X-100을 함유한 클로로포름(chloroform) 용액 1mL을 첨가하여 혼합한 후, 질소가스로 건조시켰다. 그 후 증류수를 첨가하여 sonication한 후 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 트리글리세리드, 유리 지방산, 콜레스테롤 함량을 측정하였다.

분변의 지질함량 역시 Folch 등(1957)의 방법을 따라 지질을 추출하였고, 분변 중의 콜레스테롤 및 트리글리세리드 함량은 Omedeo 등(1983)의 방법을 수정·보완하여 측정하였다. 구체적으로 상기 제조예 2-1에서 사육한 실험동물의 분변을 말린 후, 말린 분변 0.5g에 클로로포름메탄올(chloroform:methanol, 2:1) 용액 10mL을 첨가하여 균질화 시킨 후 24시간 동안 침출하였다. 그 다음 20℃, 3,000rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 새로운 실험튜브에 7mL을 옮겨 질소가스로 건조시켰다. 건조시킨 시료는 클로로폼메탄올 1mL을 첨가하여 혼합한 후 새로운 실험튜브에 200㎕를 옮겨 다시 건조시켰다. 상기 건조시킨 시료에 에탄올 1mL을 첨가하여 sonication한 후 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 콜레스테롤 및 트리글리세리드 함량을 측정하였다.

상기 간 조직 및 분변 중의 트리글리세리드 함량, 콜레스테롤 함량 및 유리지방산 함량 수치는 실험군당 평균값으로 나타내었고, 유의차 검정은 one-way ANOVA를 이용하여 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.

	정상군	고지방 대조군	고지방-시링산군
간 조직
트리글리세리드(mg/g)	12.40±1.77a	62.00±3.54c	34.54±2.66b
콜레스테롤(mg/g)	0.77±0.39a	6.96±0.39c	3.87±0.39b
유리지방산(mmol/g)	4.58±0.09a	6.51±0.24c	5.92±0.04b
분변
트리글리세리드(mg/g)	37.20±2.66a	62.89±5.31b	56.69±3.54b
콜레스테롤(mg/g)	53.36±4.64a	599.38±12.76b	677.88±17.40c
평균±표준오차, abc 실험군간 서로 다른 상첨자를 갖는 값은 던컨의 다중검정을 이용하여 p<0.05 수준에서 상호 유의차가 있음을 의미함.

실험결과, 고지방 대조군의 간 조직 내 트리글리세리드, 콜레스테롤 및 유리지방산의 함량은 정상군에 비하여 유의적으로 증가하였으며, 시링산의 급여로 고지방 대조군의 간 조직 내 트리글리세리드, 콜레스테롤 및 유리지방산의 함량을 각각 약 44%, 44% 및 9% 감소시켰다.

분변 내 콜레스테롤 함량은 시링산의 급여로 인해 콜레스테롤의 배설이 증가하였다.

3-3. 간 조직의 지방축적 정도 관찰

상기 제조예 2-3에서 채취한 실험동물의 간 조직의 지방축적정도를 알아보기 위해 간조직의 형태학적 관찰은 다음과 같이 실시하였다. 구체적으로 상기 간 조직을 10% 포름알데히드(formaldehyde) 용액에 24시간 고정한 다음, 수세하고 60% 알코올에서부터 상승농도로 탈수하여 파라핀에 포매하고, 이것을 4㎛ 두께로 박절하여 hematoxylin-eosin(H&E) 염색 하였다. Oil Red O 염색은 간 조직을 동결 한 뒤, 이것을 4㎛ 두께로 박절하여 슬라이드 글라스 위에 부착한 후 건조시킨 뒤 Oil Red O 염색약으로 염색 하였다. Masson Trichrome 염색은 고정한 간 조직을 4㎛ 두께로 박절하여 슬라이드 글라스 위에 부착한 후 bouin 용액에 매염시키고 trichrome 염색하였다. 염색한 간 조직세포는 광학현미경으로(200배 배율) 관찰하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

실험결과, 고지방 대조군의 간 조직은 문맥 주위에 지방이 축적되어 있음을 관찰하였고, 고지방-시링산군에서는 고지방 대조군에 비하여 지방축적과 섬유화 정도가 감소되는 것으로 관찰되었다.

실시예 4 : 시링산 급여에 따른 지질대사 관련 유전자 발현 및 효소 활성 변화 측정

4-1. 시링산 급여에 따른 지질대사 관련 유전자 발현 변화 측정

상기 제조예 2-3에서 채취한 실험동물의 간 조직 0.1g 당 1mL의 트리졸(TRIzol, Invitrogen, Grand Island, NY)을 첨가하여 조직 분쇄기(tissue lyzer, QIAGEN, Germany)를 이용하여 균질화 시킨 후 3,250 ×g, 4℃에서 10분 동안 원심 분리하였다. 그 다음 상기 상층액을 취해 클로로포름(chloroform) 200㎕를 첨가하여 3,250 ×g, 4℃에서 20분 동안 원심 분리하였으며, 다시 상층액을 취하여 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가한 후 10분 동안 3,000 ×g, 4℃에서 원심 분리하여 RNA 펠렛(pellet)을 얻었다. 그 다음 상기 RNA 펠렛을 75% 에탄올로 2회 세척하고 건조한 후 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리 증류수에 녹였다. 0.5 ~ 10㎍/㎕ 농도까지 희석하여, 분석 시까지 -70℃에 보관하였다.

cDNA(complementary DNA) 합성은 역전사 합성 키트(QuantiTect Reverse Transcription kit, QIAGEN, Germany)를 사용하여 단일가닥(first-strand) cDNA를 합성하였다. 앞서 분리한 RNA 1㎕를 취하여 2㎕의 gDNA 추출 용액(wipeout buffer)과 혼합한 후 부피를 RNase free 증류수로 14㎕를 맞추었으며, 42℃에서 2분 동안 반응시킨 후 얼음에서 냉각시켰다. 여기에 1㎕의 역전사효소(reverse transcriptase), 4㎕ RT buffer 그리고 1㎕ RT primer mix를 넣어 42℃에서 15분 동안 반응시켜 cDNA를 합성한 후 95℃에서 3분 동안 반응시켜 역전사효소(reverse transcriptase)의 활성을 억제하였다. 최종 얻어진 cDNA는 RNase free 증류수에 희석시켜 -20℃에 보관하였고, RT-qPCT(real-time quantitative PCR) 수행시 주형(template)으로 사용하였다. 수득한 cDNA와 RT-PCR 키트(SYBR green PCR kit, QIAGEN, Germany)를 이용하여 RT-qPCT법으로 표적 유전자의 발현을 조사하였다. 주형 cDNA는 RNase free 증류수에 희석하여 25 ng/㎕를 사용하였고, 유전자 발현 분석을 위해 RT-PCR 키트(SYBR green PCR kit, QIAGEN, Germany)를 사용하였다. 각 유전자의 발현을 분석할 수 있는 프라이머는 ㈜제노텍 (Daejeon, Korea)에서 합성하였다. 반응액의 조성은 SYBR Green 10㎕, 주형 cDNA 2㎕, 프라이머는 각각 200μM 첨가하고, 최종 부피는 20㎕가 되도록 RNase free 증류수를 첨가한 다음 94℃에서 15초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초, 65℃에서 15초를 1 cycle로 하여 40회 반응시켰다. 이때 각 cycle 마다의 형광신호를 모니터링하여 나타나는 Ct(threshold cycle)을 분석하여 각 실험군 간의 mRNA 발현을 CFX96 Real time system(Bio-rad, USA)으로 정량분석하였다. Internal transcription marker로는 GAPDH를 사용하였으며, 증폭에 사용한 유전자 프라이머 염기 서열은 하기 표 6에 나타내었고, 그 결과는 도 4에 나타내었다.

유전자	전사(forward) 및 역전사(reverse) 프라이머 서열(5 3)
AdipoR2	Forward	GGA CTC CAG AGC CAG ATA TAC GG (서열번호 1)
	Reverse	GCC CAT AAA CCC TTC ATC TTC CTG (서열번호 2)
PPAR	Forward	GCT GGA GGG TTC GTG GAG TC (서열번호 3)
	Reverse	CGG TGA GAT ACG CCC AAA TGC (서열번호 4)
ACSL	Forward	CGC ACC CTT CCA ACC AAC AC (서열번호 5)
	Reverse	TCG TCG TAG TAG TAC ACC AAG AGC (서열번호 6)
CPT1	Forward	ATC TGG ATG GCT ATG GTC AAG GTC (서열번호 7)
	Reverse	GTG CTG TCA TGC GTT GGA AGT C (서열번호 8)
CPT2	Forward	GCC TGC TGT TGC GTG ACT G (서열번호 9)
	Reverse	TGG TGG GTA CGA TGC TGT GC (서열번호 10)
CIDEA	Forward	GGC TGA TAG GGC AGT GAT TTA (서열번호 11)
	Reverse	CGA AGG TGA CTC TGG CTA TTC (서열번호 12)
PPAR	Forward	CTG GCC TCC CTG ATG AAT AAA G (서열번호 13)
	Reverse	GGT GGG ACT TTC CTG CTA ATA C (서열번호 14)
SREBF	Forward	AAC CTC ATC CGC CAC CTG (서열번호 15)
	Reverse	TGG TAG ACA ACA GCC GCA TC (서열번호 16)
FASN	Forward	CGC TCC TCG CTT GTC GTC TG (서열번호 17)
	Reverse	AGC CTT CCA TCT CCT GTC ATC ATC (서열번호 18)

실험결과, 고지방 대조군은 정상군에 비하여 지방산 산화에 관여하는 유전자인 AdipoR2, PPARα, ACSL, CPT1 및 CPT2의 발현이 유의적으로 감소하였고, 고지방-시링산군은 상기 유전자 발현을 고지방 대조군에 비하여 각각 118%, 88%, 77%, 118% 및 42% 증가되었다.

반면, 고지방 대조군은 정상군에 비하여 지방합성 관련 유전자인 CIDEA, PPARγ, SREBF 및 FASN의 발현이 유의적으로 증가하였고, 고지방-시링산군은 그 발현을 고지방 대조군에 비하여 각각 72%, 40%, 37% 및 43% 억제되었다.

4-2. 시링산 급여에 따른 지질대사 관련 효소 활성 변화 측정

상기 제조예 2-3에서 채취한 실험동물의 간 조직을 분쇄한 후 포스파티드산 포스파데이즈(phosphatidis acid phosphatase, PAP), 지방산합성효소(fatty acid synthase, FAS), 포도당-6-인산탈수소효소(glucose 6-phophate dehydrogenase, G6PD), 베타-옥시데이션(β-oxidation) 및 카르니틴 아실트렌스퍼라제(carnitine acyltransferase, CPT) 활성도를 측정하였다.

구체적으로, PAP 활성은 Walton과 Possmayer(1984)의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 0.05M Tris-HCl(pH 7.0), 1.25mM Na₂-EDTA, 1.0mM MgCl₂의 첨가와 무첨가 반응액 50㎕에 0.9% NaCl 용액에 용해시켜 1mM 포스파티데이트(phosphatidate) 및 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)을 함유한 기질 50㎕를 가한 다음 0.1mL의 효소를 가하여 37℃에서 15분 동안 반응시켰다. 그 후 1.8M H₂SO₄ 0.1mL를 가하여 반응을 정지시킨 다음 1.25% 아스코르브산(ascorbic acid), 0.32% 몰리브덴산암모늄(ammonium molybdate)를 각각 0.25mL와 0.13% 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate) 용액 0.1mL 가하고, 45℃에서 20분 동안 가온 발색시킨 후 820nm에서 흡광도를 측정하였다.

FAS 활성도는 Carl 등(1975)이 실시한 방법을 수정ㅇ보완하여 측정하였다. 구체적으로, 185.5mM 포타슘포스페이트(potassium phosphate) 완충용액(pH 7.0), 165mM acetyl-CoA, 500nM malonyl-CoA, 500nM NADPH, 1uM β-mercaptoethanol 및 세포질 분획을 섞어 30℃에서 반응시킨 후 흡광도의 변화를 측정하였다. FAS의 활성도는 시토졸 단백질 1 mg당 1분 동안 산화되는 NADPH의 nmol로 나타내었다.

G6PD 활성도는 Pitkanen 등(1997)의 방법을 수정, 보완하여 측정하였다. 2.9mM MgCl₂를 함유한 47.9mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.3)에 240μM NADP⁺, 4mM glucose-6-phosphate 그리고 시토졸 효소원을 순서대로 첨가한 후 25℃, 340nm에서 90초 동안 NADPH의 흡광도 변화를 측정하였다. 효소활성도는 시토졸 단백질 1mg당 1분간 생성된 NADPH의 nmol로 나타내었다

β-Oxidation 활성도는 Lazarow법(1981)에 의해 palmitoyl-CoA을 기질로 하여 NAD⁺가 NADH로 환원되는 정도를 흡광도로 측정하였다. 47mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.2mM NAD⁺, 1.65mM DTT, 1.5% BSA(bovine serum albumin, 1.5g/100mL), 2% Triton X-100, 2g/100mL), 100μM CoA, 1mM FAD, 100mM KCN, 5mM palmitoyl-CoA 반응액에 미토콘드리아 분획을 첨가하여 반응을 개시한 후 37℃, 340nm에서 5분 동안의 흡광도 변화를 측정하였다. β-oxidation 활성도 단위는 미토콘드리아 단백질 1mg 당 1분간 생성된 NADH의 nmol로 나타내었다.

CPT 활성도는 Markwell 등(1973)의 방법에 따라 DTNB(5'5-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid))를 사용하여 palmitoyl-CoA로부터 생성 되는 CoASH를 측정하였다. 97.6mM Tris-HCl(pH8.0), 1.1mM EDTA, 2.50mM l-carnitine, 0.12mM DTNB, 0.075mM palmitoyl-CoA, 0.09% triton X-100 반응액에 미토콘드리아 분획을 첨가하여 반응을 개시한 후 25℃, 412nm에서 2분 동안 흡광도 변화를 측정하였다.

상기 포스파티드산 포스파데이즈(phosphatidis acid phosphatase, PAP), 지방산합성효소(fatty acid synthase, FAS), 포도당-6-인산탈수소효소(glucose 6-phophate dehydrogenase, G6PD), 베타-옥시데이션(β-oxidation) 및 카르니틴 아실트렌스퍼레이즈(carnitine acyltransferase, CPT) 활성도는 실험군당 평균값으로 나타내었고, 유의차 검정은 one-way ANOVA를 이용하여 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

실험결과, 고지방 대조군의 베타-옥시데이션(β-oxidation)과 카르니틴 아실트렌스퍼레이즈(carnitine acyltransferase, CPT)의 활성도는 정상군에 비하여 감소하였으며, 고지방-시링산군은 상기 효소의 활성도를 고지방 대조군에 비하여 각각 106%, 47% 증가시켰다.

반면, 고지방 대조군의 포스파티드산 포스파데이즈(phosphatidis acid phosphatase, PAP), 지방산합성효소(fatty acid synthase, FAS)의 활성도는 정상군에 비하여 증가하였으며, 고지방-시링산군은 상기 효소의 활성도를 고지방 대조군에 비하여 33% 및 61% 감소시켰다.

실시예 5 : 시링산 급여에 따른 생화학적 지표 변화 측정

상기 제조예 2-2에서 준비한 실험동물의 혈청을 이용하여 공복시 혈당, 내당능, 아스파르트산 아미노전이효소(asparate aminotransferase, AST)와 알라닌 아미노전이효소(alanine aminotransferase, ALT)의 활성, 인슐린 농도, 렙틴 농도, 아디포넥틴 농도 및 인슐린저항성(HOMA-IR)을 측정하였다.

구체적으로, 공복시 혈당은 혈당측정기(GlucoDr supersensor, Allmedicus, Korea)를 이용하여 측정하였다.

내당능은 상기 제조예 2-1에서 사육이 종료되기 1주일 전 포도당 용액을 체중(kg)당 1g씩 경구투여한 후 각각 1, 30, 60 및 120분 후 꼬리 정맥(tail vein)으로부터 혈액을 채취한 후 혈당측정기(GlucoDr supersensor, Allmedicus, Korea)를 이용하여 측정하였다.

AST(asparate aminotransferase)와 ALT(alanine aminotransferase)의 활성은 혈액생화학분석기(Fuji Dri-Chem 3500, Fujifilm, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다.

인슐린, 렙틴 및 아디포넥틴의 농도는 각각 마우스 인슐린 ELISA 키트(Morinaga ultra sensitive mouse insulin enzyme linked immunosorbent assay kit, Miobs, Japan), 마우스 렙틴 ELISA 키트(Morinaga mouse/rat leptin enzyme linked immunosorbent assay kit, Miobs, Japan) 및 아디포넥틴 ELISA 키트(Mouse adiponectin duoset, R&D system, USA)를 이용하여 측정하였다.

인슐린저항성(HOMA-IR)은 공복혈당과 공복인슐린 수치를 이용하여 하기 실험식 2로 계산하여 나타내었다.

[실험식 2]

인슐린저항성(HOMA-IR) = {공복혈당(mmol/L) × 공복 인슐린(μIU/mL)} / 22.5

상기 공복시 혈당, 내당능, AST(asparate aminotransferase)와 ALT(alanine aminotransferase)의 활성, 인슐린 농도, 렙틴 농도, 아디포넥틴 농도 및 인슐린저항성수치(HOMA-IR)는 실험군당 평균값으로 나타내었고, 유의차 검정은 one-way ANOVA를 이용하여 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

실험결과, 고지방 대조군의 공복 혈당 및 인슐린 함량은 각각 8주, 12주부터 정상군에 비하여 유의적으로 높아져 인슐린저항성이 유발되었다. 그러나 시링산을 급여한 고지방 대조군(고지방-시링산군)은 16주 후 고지방 대조군에 비하여 인슐린의 농도가 43% 감소되었고, 이로 인해 인슐린저항성 역시 고지방 대조군에 비하여 63% 감소되었으며, 내당능도 21% 감소되었다.

고지방 대조군의 AST와 ALT의 활성은 정상군에 비하여 유의적으로 증가하였고, 아디포넥틴의 농도는 감소하였으며, 렙틴의 농도는 증가하였다. 그러나, 시링산을 급여한 고지방 대조군(고지방-시링산군)은 고지방 대조군에 비하여 ALT의 활성이 40% 감소되었고, 아디포넥틴 농도는 고지방 대조군에 비하여 17% 증가하였으며, 렙틴의 농도는 고지방 대조군에 비하여 34% 감소되어 정상군과 비슷한 수준을 나타내었다.

실시예 6 : 시링산 급여에 따른 혈청 및 간조직의 항염증 활성 측정

6-1. 시링산 급여에 따른 혈청 염증성 사이토카인(cytokine)의 활성 측정

상기 제조예 2-2에서 채취한 실험동물의 혈청 20㎕를 Multiple detection kit(Bio-Rad, USA) 및 Luminex 200 Labmap system(Bio-Rad, USA)을 사용하여 키트에 명시된 방법에 준하여 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), IFN-γ(interferon-γ) 및 MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1)의 함량을 측정하였으며, 정량은 Bio-plex manager software version 5.0(Bio-Rad)을 이용하여 분석하였다. 상기 TNF-α, INF-γ 및 MCP-1 함량은 실험군당 평균값으로 나타내었고, 유의차 검정은 one-way ANOVA를 이용하여 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

실험결과, 혈청 염증지표인 TNF-α, INF-γ 및 MCP-1 함량은 고지방 대조군이 정상군에 비하여 유의적으로 증가되었다. 그러나 시링산을 급여한 고지방 대조군(고지방-시링산군)은 고지방 대조군에 비하여 TNF-α, INF-γ 및 MCP-1의 함량이 각각 54%, 57% 및 40% 감소되었다.

6-2. 시링산 급여에 따른 염증관련 유전자 발현 측정

상기 제조예 2-3에서 채취한 실험동물의 간 조직의 염증관련 유전자 발현은 상기 실시예 4-1과 동일한 방법을 이용하여 측정하였다. 증폭에 사용한 유전자 프라이머 염기서열은 하기 표 7에 나타내었다. 상기 염증관련 유전자의 발현은 실험군당 평균값으로 나타내었고, 유의차 검정은 one-way ANOVA를 이용하여 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

유전자	전사(forward) 및 역전사(reverse) 프라이머 서열(5 3)
TLR4	Forward	TAT TCA GAG CCG TTG GTG TAT C (서열번호 19)
	Reverse	CCA GGT GAG CTG TAG CAT TTA (서열번호 20)
MYD88	Forward	GTA TCC TGC GGT TCA TCA CTA T (서열번호 21)
	Reverse	GAA CTC TTC CAC TCA GCT ATC C (서열번호 22)
NF-B	Forward	GAA GTG AGA GAG TGA GCG AGA GAG (서열번호 23)
	Reverse	CGG GTG GCG AAA CCT CCT C (서열번호 24)
TNF-	Forward	AAA GAC ACC ATG AGC ACA GAA AGC (서열번호 25)
	Reverse	GCC ACA AGC AGG AAT GAG AAG AG (서열번호 26)
IL-6	Forward	GAG GAT ACC ACT CCC AAC AGA CC (서열번호 27)
	Reverse	AAG TGC ATC ATC GTT GTT CAT ACA (서열번호 28)

실험결과, 고지방 대조군은 정상군에 비하여 염증 관련 유전자의 발현이 유의적으로 증가하였다. 그러나 시링산을 급여한 고지방 대조군(고지방-시링산군)은 고지방 대조군에 비하여 염증 관련 유전자인 TLR4, MYD88, NF-κB, TNF-α 및 IL-6 의 발현이 각각 58%, 71%, 65%, 76% 및 69% 억제되었다.

실시예 7 : 시링산 급여에 따른 항산화 활성 측정

7-1. 시링산 급여에 따른 항산화 대사 관련 효소 활성도 변화 측정

상기 제조예 2-3에서 채취한 실험동물의 간 조직을 분쇄한 후 CYP2E1(cytochrome P450 2E1), SOD(superoxide dismutase), CAT(catalase), GSH-Px(glutathione peroxidase), GST(glutathione S-transferase) 활성과 H₂O₂(hydroperoxide) 및 GSH(glutathione) 함량을 측정하였다.

구체적으로, CYP2E1 활성도는 Dicker 등(1990)의 방법에 준하여 측정하였다. 구체적으로 1M의 인산칼륨 완충용액(potassium phosphate, pH 7.4) 45㎕에 효소원 100㎕와 20mM NADPH 22.5㎕, 100mM 아닐린 46㎕와 증류수를 첨가하여 총 용량 450㎕를 맞추어 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 40% TCA 90㎕를 첨가하여 10분 동안 차가운 곳에 두었다. 그 다음 4℃에서 12,000rpm에 10분 동안 원심분리 한 후 상층액 360㎕을 새로운 실험튜브에 옮기고 10% NA₂CO₃ 240㎕, 2% phenol 360㎕ 첨가하여 실온에 45분 방치하고 흡광도 630nm에 측정하였다. 그 다음 4-히드록시아닐린(hydroxyaniline)의 생성량을 측정하고 표준 검량선을 이용하여 CYP2E1 활성도를 산출하였다. 효소의 활성도는 1분간 1 mg의 단백질이 생성한 4-히드록시아닐린의 양을 umol로 나타내었다.

SOD 활성도는 Marklund와 Marklund(1974) 방법을 수정하여, 알칼리 상태에서 피로갈롤(pyrogallol)의 자동산화를 SOD가 억제하는 정도를 측정하였다. 즉 10mM EDTA를 포함한 50mM Tris-HCl 완충액(pH 8.5) 1.5mL에 효소원 0.1mL와 7.2mM 피로갈롤 용액 0.1mL를 순서대로 잘 혼합하여 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1N HCl 50㎕를 첨가하여 반응을 종결시켰고, 420nm에서 흡광도를 측정하여 산출하였다. SOD활성 단위는 효소원을 넣지 않고 10분간 반응시킨 7.2mM 피로갈롤 용액의 자동산화를 50% 억제하는데 필요한 1mg 단백질에 대한 unit로 나타내었다.

CAT 활성도는 Aebi(1988)의 방법을 수정·보완하여 측정하였다. 즉 50mM 인산칼륨 완충용액(potassium phosphate, pH 8.5) 2.89mL과 효소원 10㎕를 혼합하여 25℃에서 5분간 반응시킨 후 0.3M H₂O₂용액 0.1mL을 첨가하여 240nm에서 반응전 흡광도를 측정한 다음, 25℃에서 5분간 더 반응시킨 후 240nm에서 반응후 흡광도를 측정하여 H₂O₂ 흡광도 변화를 구하였다. CAT 활성 단위는 1분간 1mg 단백질에 의해 손실되는 H₂O₂ 양을 나타내었다.

GSH-Px 활성도는 Paglia와 Valentine(1967)의 방법으로 수정·보완하여, H₂O₂를 기질로 이용한 coupled enzyme procedure로 측정하였다. 즉 환원형 글루타티온(glutathione, GSH)은 GSH-Px에 의해 H₂O₂와 반응하여 산화형 글루타티온(GSSG)으로 되고, 이것은 다시 글루타티온 환원효소(glutathione reductase)와 NADPH에 의해 환원된다. 이때 NADPH의 흡광도가 340nm에서 감소되는 정도를 측정하여 GSH-Px의 활성도를 산출하였다. 즉 0.1M Tris-HCl 완충용액(pH 7.2) 2.6mL에 30mM 환원형 GSH 용액 0.1mL, 6mM NADPH용액 0.1mL, 그리고 25μM H₂O₂ 0.1mL을 순서대로 첨가하여 25℃에서 5분간 더 반응시킨 후 340nm에서 반응 후 흡광도를 측정하였다. GSH-Px 활성 단위는 단백질 1mg당 1분 동안 산화되는 NADPH 정도를 나타내었다.

GST 활성도는 Habig 등(1974)의 방법에 따라 1-클로로-2,4-디니트로벤젠(1-chloro-2,4-dinitrobezene)과 환원된 글루타티온(reduced glutathione) 및 효소원의 반응에서 생성되는 티오에테르(thioether)의 흡광도를 340nm에서 측정하였다. GST 활성도는 흡광계수(9.5M^-1cm^-1)를 이용하여 계산하였으며, 단백질 1 mg이 1분간 생성시킨 티오에티르(thioether)의 함량을 nmol로 나타내었다.

H₂O₂ 활성도는 Wolff 등(1994)의 방법에 따라 측정하였다. 생체내의 과산화수소(Hydrogen peroxide, H₂O₂)는 제일철(ferrous, Fe²⁺) 이온을 제이철(ferric, Fe³⁺) 이온으로 산화시키는데, 자일레놀오렌지(xylenol orange)를 이용하여 560nm에서의 H₂O₂ 생성 정도를 흡광도 증가로 측정하였다. 앞에서 분리한 미토콘드리아 분획 각각 50㎕에 FOX 용액｛0.1M xylenol orange, 0.25mM 암모늄황산제일철(ammonium ferrous sulfate), 100mM 솔비톨(sorbitol), 25mM H₂SO₄｝950㎕를 섞어 상온에서 30분 동안 반응시키고 25℃, 500 nm에서 흡광도를 측정하였고 H₂O₂ 표준용액의 함량으로 정량하였다.

GSH 활성도는 Ellman의 방법(1959)을 수정 보완하여 측정하였다. 간 조직 세포질 분획 0.2mL에 증류수 0.3mL와 4% 설포살리실산(sulfosalicylic acid) 0.5mL를 첨가하여 4℃, 2,500rpm에서 10분 동안 원심분리 하였다. 그 다음 상층액 0.3mL을 취하여 설프히드릴기(sulfhydryl)의 발색제인 DTNB(5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid))와 반응시켜 412nm에서 비색정량한 다음, 산화형 글루타티온의 표준검량선에 의해 그 양을 산출하였다.

상기 CYP2E1, SOD, CAT, GSH-Px 및 GST 활성도와 H₂O₂와 GSH 함량은 실험군당 평균값으로 나타내었고, 유의차 검정은 one-way ANOVA를 이용하여 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

실험결과, 고지방 대조군의 CYP2E1의 활성과 H₂O₂ 함량은 증가하였고, CAT, GSH-Px, GST 활성은 감소하였다. 반면, 고지방-시링산군의 CYP2E1의 활성과 H₂O₂ 함량은 고지방 대조군에 비하여 각각 31%, 29% 감소하였으며, CAT, GSH-Px 및 GST 활성은 각각 48%, 40% 및 29% 증가하였다.

7-2. 시링산 급여에 따른 지질대사 관련 단백질 발현 변화 측정

상기 제조예 2-3에서 채취한 실험동물의 간 조직에 용해 용액(lysis solution, 50mM Hepes(pH7.5), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 2mM EGTA, 50mM NaF, 1% Triton, 1mM PMSF, 25μg/mL leupeptin, 2μg/mL aprotinin)을 첨가한 후 분쇄기를 이용하여 균질화 하였다. 상기 균질액은 4℃에서 30분간 혼합한 뒤 8,850 ×g로 1시간 동안 원심분리한 후 상층액을 Bradford(1976)법에 따라 단백질을 정량하였다. 그 다음 단백질 50μg을 10% SDS 폴리아크릴아미드겔(polyacrylamide gel)에서 전기영동한 다음 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose transfer membrane, Whatman, Germany)으로 이동시킨 후 0.1%의 트윈-20(Tween-20)을 포함한 Tris 완충용액(TBST)으로 15분간 3회 세척하고 5% BSA용액으로 1시간 동안 실온에서 블로킹(blocking) 시켰다. 그 다음 AMPK, p-AMPK, ACC, p-ACC(1:1000, Cell Signaling, USA)과 PPARα(1:200, Santa Cruz , USA)의 1차 항체를 5% BSA용액에 희석하여 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 다음날 TBST 완충용액으로 15분간 3회 세척한 후 세척한 니트로셀룰로오스 막은 anti-rabbit IgG(GE Healthcare, USA) 2차 항체를 이용하여 실온에서 2시간 반응시켰고, 다시 TBST 완충용액으로 15분간 3회 세척한 후 ECL 용액(Santacruz Biotechnology, USA)에 니트로셀룰로오스 막을 넣고 5분간 발색한 뒤 LAS 4000(Fujifilm, USA)을 이용하여 스캔하고 이미지 분석하였다. 니트로셀룰로오스 막은 다시 TBST 완충용액으로 15분간 3회 세척한 후 스트리핑(stripping) 완충용액(62.5 mM Tris, 2% SDS, pH 6.7)에 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 700㎕를 첨가하여 60℃에서 30분간 반응시킨 다음 β-actin(1:200, Sigma, St. Louis, MO, USA)을 다른 항체와 동일한 방법으로 측정하였다. 단백질 발현량은 β-actin으로 보정한 후 산출하였다.

상기 지질대사 관련 단백질 발현은 실험군당 평균값으로 나타내었고, 유의차 검정은 one-way ANOVA를 이용하여 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

실험결과, 고지방-시링산군은 고지방 대조군에 비하여 p-AMPK의 발현이 약 20% 증가되었고, p-ACC의 발현을 약 68% 증가시켜 지질합성을 억제하였다. 또한 지방산 산화 관련 인자인 PPARα의 발현이 고지방 대조군에 비하여 약 15% 증가하였다.

<110> Chosun University Industry-Academic Cooperation Foundation Chosun Natural Pharmaceutical Material Development Research Center <120> Compositions for preventing or treatmenting obesity or lipid-related metabolic disease comprising syringic acid, or salt thereof as an active ingredient <130> PA-14-0150 <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AdipoR2 Forward primer <400> 1 ggactccaga gccagatata cgg 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AdipoR2 Reverse primer <400> 2 gcccataaac ccttcatctt cctg 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR alpha Forward primer <400> 3 gctggagggt tcgtggagtc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR alpha Reverse primer <400> 4 cggtgagata cgcccaaatg c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACSL Forward primer <400> 5 cgcacccttc caaccaacac 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACSL Reverse primer <400> 6 tcgtcgtagt agtacaccaa gagc 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPT1 Forward primer <400> 7 atctggatgg ctatggtcaa ggtc 24 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPT1 Reverse primer <400> 8 gtgctgtcat gcgttggaag tc 22 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPT2 Forward primer <400> 9 gcctgctgtt gcgtgactg 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPT2 Reverse primer <400> 10 tggtgggtac gatgctgtgc 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CIDEA Forward primer <400> 11 ggctgatagg gcagtgattt a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CIDEA Reverse primer <400> 12 ggctgatagg gcagtgattt a 21 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma Forward primer <400> 13 ctggcctccc tgatgaataa ag 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma Reverse primer <400> 14 ggtgggactt tcctgctaat ac 22 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBF Forward primer <400> 15 aacctcatcc gccacctg 18 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBF Reverse primer <400> 16 tggtagacaa cagccgcatc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FASN Forward primer <400> 17 cgctcctcgc ttgtcgtctg 20 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FASN Reverse primer <400> 18 agccttccat ctcctgtcat catc 24 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR4 Forward primer <400> 19 tattcagagc cgttggtgta tc 22 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR4 Reverse primer <400> 20 ccaggtgagc tgtagcattt a 21 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYD88 Forward primer <400> 21 gtatcctgcg gttcatcact at 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYD88 Reverse primer <400> 22 gaactcttcc actcagctat cc 22 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NF-kappaB Forward primer <400> 23 gaagtgagag agtgagcgag agag 24 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NF-kappaB Reverse primer <400> 24 cgggtggcga aacctcctc 19 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha Forward primer <400> 25 aaagacacca tgagcacaga aagc 24 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha Reverse primer <400> 26 gccacaagca ggaatgagaa gag 23 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 Forward primer <400> 27 gaggatacca ctcccaacag acc 23 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 Reverse primer <400> 28 aagtgcatca tcgttgttca taca 24

Claims (4)

1. 시링산(syringic acid) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 지질관련 대사성 질환은 당뇨, 고지혈증, 지방간, 간염, 간경화, 동맥경화, 고혈압, 심혈관질환 및 상기 질환들이 동시다발적으로 발생하는 대사증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 비만 또는 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
3. 시링산(syringic acid) 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 지질관련 대사성 질환은 당뇨, 고지혈증, 지방간, 간염, 간경화, 동맥경화, 고혈압, 심혈관질환 및 상기 질환들이 동시다발적으로 발생하는 대사증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 비만 또는 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.

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