KR20160011280A - 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재 - Google Patents

오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재에 관한 것으로, 보다 상세하게는 오르니틴 생산능력이 있는 페디오코커스 펜토사세우스 RBO1-49(Pediococcus pentosaceus RBO1-49) 또는 바이셀라 시바리아 BBO1-48(Weissella cibaria BBO1-48) 균주를 이용하여 발효소재를 제조함으로써, 항비만, 항스트레스에 효과가 있는 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재에 관한 것이다.
본 발명인 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재는 아르기닌, 미강 또는 맥강, 물을 혼합하는 혼합단계; 상기 혼합단계를 통해 수득된 혼합물을 100~130℃, 1.2~1.8 기압에서 10~20분간 살균하는 살균단계; 상기 살균단계를 거친 혼합물을 40~45℃로 냉각하는 냉각단계; 상기 냉각단계를 거친 혼합물에 기능성 유산균 스타터를 0.05~0.1%(w/v) 접종하는 접종단계; 상기 접종단계를 거친 혼합물을 25~35℃에서 70~74시간 발효하는 발효단계; 상기 발효단계를 통해 수득된 발효물을 11,000~13,000rpm으로 10~30분간 원심분리하는 원심분리단계; 상기 원심분리단계를 통해 수득된 발효액을 동결건조를 통해 분말화하는 분말화단계를 포함하며, 상기 접종단계는 페디오코커스 펜토사세우스 RBO1-49(Pediococcus pentosaceus RBO1-49) 또는 바이셀라 시바리아 BBO1-48(Weissella cibaria BBO1-48)를 MRS 배지에서 28~32℃로 45~50시간 동안 배양하여 수득된 기능성 유산균 스타터를 접종한다.

Description

오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재 {The method for manufacturing rice bran or barley bran fermented material containing ornithine and rice bran or barley bran fermented material containing ornithine thereof}
본 발명은 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재에 관한 것으로, 보다 상세하게는 오르니틴 생산능력이 있는 페디오코커스 펜토사세우스 RBO1-49(Pediococcus pentosaceus RBO1-49) 또는 바이셀라 시바리아 BBO1-48(Weissella cibaria BBO1-48) 균주를 이용하여 발효소재를 제조함으로써, 항비만, 항스트레스에 효과가 있는 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재에 관한 것이다.
일반적으로 미강은 벼에서 왕겨를 뽑고 난 다음 현미를 백미로 도정하는 공정에서 분리되는 고운 속겨를 말한다. 이러한 미강은 철분, 칼슘, 마그네슘, 비타민E 등 여러 가지 아미노산을 함유하고 있으며, 뇌세포 기능을 향상시켜 기억력 증진 및 집중력을 향상시키고 콜레스테롤과 중성지방을 감소시켜 각종 성인병 예방에도 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
또한 맥강은 보리의 도정과정에서 나오는 껍질인 보릿겨이다. 이러한 맥강은 섬유가 적고 단백질이 풍부하며, 변비, 항비만, 피부미용 등 다양한 효능을 갖고 있으며 성인병 예방에도 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
쌀과 보리는 세계 4대 곡물에 속하며 우리나라에서 오랫동안 중요한 곡식으로 우리 식생활에 널리 이용되어 왔으나, 쌀과 보리 도정 후 남는 각각 미강 및 맥강은 상기와 같은 뛰어난 영양학적 구성과 효능에도 불구하고 현재 대부분 사료로 사용되고, 이외의 용도로는 이용되지 않고 있다. 따라서 활용도가 낮은 상기 미강 및 맥강으로부터 고부가가치 기능성 식품소재를 생산해 낼 수 있는 기술 개발이 필요하다.
한편 L-오르니틴(L-ornithine)은 단백질을 구성하는 아미노산은 아니지만 식품에 통상 함유되어 있는 아미노산이다. 특히 담수성 쌍각류조개, 재첩 중의 L-오르니틴 함량이 비교적 높다. 재첩 엑기스 100g중에 유리상의 L-오르니틴 함량은 159.9mg이며, 재첩을 저온처리하면 유리상의 L-오르니틴 함량이 상승한다고 알려져 있다.
L-오르니틴은 성장호르몬을 분비시켜 근육의 합성을 증가시키고, 기초대사를 촉진시켜 비만을 예방하는 식품소재로서 미국을 중심으로 많이 이용되고 있다. 최근에는 주름살 개선과 같은 피부미용 효과 등 새로운 기능성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
또한 L-오르니틴은 L-오르니틴과 알파케토글루타릴산이 2:1의 비율로 함유되어 있는 L-오르니틴-알파케토글루타릴산염(OKG)의 형태로 근육증강, 비만예방 및 면역증강 소재로서 폭넓게 이용되고 있고, 유럽에서는 L-오르니틴-L-아스파라긴산염의 형태로 간장장애를 개선하는 의약품으로 이용되고 있다. 일본에서는 L-오르니틴 염산염의 형태로 식품소재로서 사용가능하며, 미국에서는 식이보조제로서 사용가능하나 국내에서는 아직 식약청에 식품첨가물로 등재되어 있지 않아 사용이 곤란한 실정이다.
이에 발효식품 유래의 오르니틴 고생산성 균주를 이용하여 식품을 발효시키면 보통 식품보다 오르니틴 등의 영양기능성, 젖산균으로 인한 풍미, 향미 등이 증진된 발효식품을 제조할 수 있을 것으로 기대되어 이에 대한 연구 필요성이 제기 되었다.
상기와 관련한 선행기술문헌으로는 대한민국 등록특허 제10-1373252호에서는 현미 구아바 잎 발효소재의 제조방법과 그 현미 구아바 잎 발효소재를 이용한 현미 구아바 잎 발효분말차 제조방법을 개시하고 있으나, 미강 또는 맥강을 이용하지 않았으며, 대한민국 공개특허 제10-2014-0046865호에서는 쇠비름 및 미강을 함유하는 발효 조성물 및 그의 제조방법을 개시하고 있으나, 미강을 이용하지만 오르니틴 생산능력이 있는 균주를 이용하지 않기 때문에 오르니틴 함량이 현저히 저하된다는 문제점이 있었다.
따라서, 본 발명은 미강 또는 맥강을 발효시켜 발효소재를 제조하되, 미강 또는 맥강으로부터 오르니틴 생산능력이 있는 유산균을 분리, 동정 및 특성을 연구하고, 이를 통해 오르니틴 고함유 발효소재 제조방법 및 그 제조방법을 통해 제조한 항비만, 항스트레스 효능이 있는 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재를 제공하고자 한다.
대한민국 공개특허 제10-2014-0046865호(2014.04.21) 대한민국 등록특허 제10-1373252호(2014.03.05)
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 발명된 것으로서, 오르니틴 생산능력이 있는 페디오코커스 펜토사세우스 RBO1-49(Pediococcus pentosaceus RBO1-49) 또는 바이셀라 시바리아 BBO1-48(Weissella cibaria BBO1-48) 균주를 이용하여 발효소재를 제조함으로써, 항비만, 항스트레스에 효과가 있는 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 아르기닌, 미강 또는 맥강, 물을 혼합하는 혼합단계; 상기 혼합단계를 통해 수득된 혼합물을 100~130℃, 1.2~1.8 기압에서 10~20분간 살균하는 살균단계; 상기 살균단계를 거친 혼합물을 40~45℃로 냉각하는 냉각단계; 상기 냉각단계를 거친 혼합물에 기능성 유산균 스타터를 0.05~0.1%(w/v) 접종하는 접종단계; 상기 접종단계를 거친 혼합물을 25~35℃에서 70~74시간 발효하는 발효단계; 상기 발효단계를 통해 수득된 발효물을 11,000~13,000rpm으로 10~30분간 원심분리하는 원심분리단계; 상기 원심분리단계를 통해 수득된 발효액을 동결건조를 통해 분말화하는 분말화단계를 포함하며, 상기 접종단계는 페디오코커스 펜토사세우스 RBO1-49(Pediococcus pentosaceus RBO1-49) 또는 바이셀라 시바리아 BBO1-48(Weissella cibaria BBO1-48)를 MRS 배지에서 28~32℃로 45~50시간 동안 배양하여 수득된 기능성 유산균 스타터를 접종한다.
상기와 같이 제시된 본 발명에 의한 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재는 오르니틴 생산능력이 있는 페디오코커스 펜토사세우스 RBO1-49(Pediococcus pentosaceus RBO1-49) 또는 바이셀라 시바리아 BBO1-48(Weissella cibaria BBO1-48) 균주를 이용하여 발효소재를 제조함으로써, 오르니틴 함유량을 현저히 증진시킬 수 있다는 효과가 있다.
이로써 천연 재료를 통해 발효하여 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재를 제조할 수 있고, 고함량의 오르니틴 발효소재를 생산 및 제조할 수 있다는 효과가 있다.
또한 높은 오르니틴 함유량으로 인하여 오르니틴에 기인한 항비만 및 항스트레스 효능도 현저히 높다는 효과가 있다.
이로써 영양학적, 효능적으로 우수한 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재를 제공함으로써 사용자의 건강 증진에 기여할 수 있다는 효과가 있다.
또한 많은 용도로 활용되고 있지 못한 미강 및 맥강을 활용함으로써 미강 및 맥강 관련 산업에 크게 기여할 수 있다는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 제조방법을 나타낸 순서도.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따른 오르니틴을 함유하는 미강 발효소재의 pH 변화를 나타낸 그래프.
도 3은 본 발명의 실시예 2에 따른 오르니틴을 함유하는 맥강 발효소재의 pH 변화를 나타낸 그래프.
도 4는 본 발명의 실시예 1에 따른 오르니틴을 함유하는 미강 발효소재의 산도 변화를 나타낸 그래프.
도 5는 본 발명의 실시예 2에 따른 오르니틴을 함유하는 맥강 발효소재의 산도 변화를 나타낸 그래프.
도 6은 본 발명의 실시예 1에 따른 오르니틴을 함유하는 미강 발효소재의 오르니틴 함량을 나타낸 그래프.
도 7은 본 발명의 실시예 2에 따른 오르니틴을 함유하는 맥강 발효소재의 오르니틴 함량을 나타낸 그래프.
도 8은 본 발명의 실시예 1에 따른 오르니틴을 함유하는 미강 발효소재의 항비만 효능을 나타낸 그래프.
도 9는 본 발명의 실시예 2에 따른 오르니틴을 함유하는 맥강 발효소재의 항비만 효능을 나타낸 그래프.
도 10은 본 발명의 실시예 1에 따른 오르니틴을 함유하는 미강 발효소재의 항스트레스 효능을 나타낸 그래프.
도 11은 본 발명의 실시예 2에 따른 오르니틴을 함유하는 맥강 발효소재의 항스트레스 효능을 나타낸 그래프.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
첨부된 도 1 내지 도 11을 참고하여 본 발명에 의한 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재에 대한 실시예의 구성을 상세히 살피면 아래와 같다.
본 발명에 의한 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 제조방법은 먼저 아르기닌(Arginine, Arg), 미강 또는 맥강, 물을 혼합하는 혼합단계(S10)를 수행한다.
이때 상기 혼합단계는 물 100 중량부에 대하여, 아르기닌 0.5~1.5 중량부 및 미강 또는 맥강 15~25 중량부를 포함하여 혼합한다.
이때 상기 아르기닌은 알칼리 또는 아르기나아제로 분해하면 오르니틴이 생성되는 물질로, 상기 아르기닌이 0.5 중량부 미만이면 제조가 완료된 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 오르니틴 함량이 저하될 수 있고, 1.5 중량부를 초과하면 상기 아르기닌이 일정량만큼 분해된 후 더 이상 분해되지 않는다는 문제점이 있다. 또한 상기 미강 또는 맥강은 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재 제조 시 발효가 진행될 주요 구성물질로, 상기 미강 또는 맥강이 15 중량부 미만이면 발효가 원활히 이루어지지 않고, 25 중량부를 초과하면 일정량만큼 발효된 후 더 이상 발효되지 않는다는 문제점이 있다.
상기 혼합단계를 통해 수득된 혼합물을 100~130℃, 1.2~1.8 기압에서 10~20분간 살균하는 살균단계(S20)를 수행한다.
상기 살균단계를 거친 혼합물을 40~45℃로 냉각하는 냉각단계(S30)를 수행한다.
상기 냉각단계를 거친 혼합물에 기능성 유산균 스타터를 0.05~0.1%(w/v) 접종하는 접종단계(S40)를 수행한다.
이때 상기 접종단계는 오르니틴 생산능력이 있는 페디오코커스 펜토사세우스 RBO1-49(Pediococcus pentosaceus RBO1-49) 또는 바이셀라 시바리아 BBO1-48(Weissella cibaria BBO1-48)을 MRS 배지에서 28~32℃로 45~50시간 동안 배양하여 수득된 기능성 유산균 스타터를 접종한다.
이때 상기 페디오코커스 펜토사세우스 RBO1-49는 미강에서 분리하며, 상기 바이셀라 시바리아 BBO1-48은 맥강에서 분리할 수 있다. 따라서 상기 혼합단계에서 미강 혼합 시 상기 페디오코커스 펜토사세우스 RBO1-49를 접종하고, 상기 혼합단계에서 맥강 혼합 시 상기 바이셀라 시바리아 BBO1-48을 접종하는 것이 바람직하다.
또한 상기 접종단계(S40)에서 기능성 유산균 스타터를 0.05%(w/v) 미만으로 접종하면 오르니틴 생산능력이 저하될 수 있고, 0.1%(w/v)를 초과하면 일정량만큼 오르니틴이 생성된 후 더 이상 생성되지 않는다는 문제점이 있다.
상기 접종단계를 거친 혼합물을 25~35℃에서 70~74시간 발효하는 발효단계(S50)를 수행한다.
상기 발효단계를 통해 수득된 발효물을 11,000~13,000rpm으로 10~30분간 원심분리하는 원심분리단계(S60)를 수행한다.
상기 원심분리단계를 통해 수득된 발효액을 동결건조를 통해 분말화하는 분말화단계(S70)를 수행하며, 상기 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 제조를 완료한다.
이로써 제조가 완료된 상기 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재는 -1~5℃의 온도에서 저장한다.
이하 상기 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재를 제조하기 위하여, 상기 페디오코커스 펜토사세우스 RBO1-49와 바이셀라 시바리아 BBO1-48 균주를 분리 및 동정하고, 이를 이용하여 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재를 제조하는 실험예, 실시예 및 시험예에 대하여 상세히 설명한다.
< 실험예 >
본 발명은 오르니틴 생산능력이 있는 페디오코커스 펜토사세우스 RBO1-49(Pediococcus pentosaceus RBO1-49)와 바이셀라 시바리아 BBO1-48(Weissella cibaria BBO1-48) 균주의 분리 및 동정에 대해 하기에서 보다 상세히 설명하고자 한다.
[재료 및 방법]
(1) 미강 또는 맥강으로부터 오르니틴 생산능력이 있는 페디오코커스( Pediococcus ), 바이셀라 ( Weissella ) 속 후보 균주의 분리
오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 기능성을 증진시키기 위하여 페디오코커스(Pediococcus), 바이셀라(Weissella) 속 균주의 생리활성물질 생산 능력에 대한 연구의 일환으로 오르니틴 생산능력이 있는 젖산균을 미강 또는 맥강으로부터 분리하였다. 미강 또는 맥강을 이용하여 펩톤수로 10-1 ~ 10-8 범위로 희석하였고, 희석액을 0.1mL씩 분주하여 DE MAN, ROGOSA아가 배지(Difco, Detroit, MI, USA)에 배양하였다. 배지에는 0.02% Bromocresol purple(BCP)(Sigma Chemical Co. St. Louis, USA)이 첨가되었고, 콜로니를 얻기 위해 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 콜로니 중에서 환을 형성하지 않으면서 진한 노랑색을 띄는 것을 페디오코커스(Pediococcus), 바이셀라(Weissella) 속 후보군으로 분리하였다. 이어 오르니틴 생성가능성은 TLC를 이용하여 조사하였다. TLC는 silica gel F254과 표준 오르니틴(Merck, Damstadt, Germany), 이동상(Butanol: Acetic acid: Dichoromethanol: water= 5:3:3:3)을 이용하여 실시하였다.
(2)오르니틴 생산능력이 있는 페디오코커스 ( Pediococcus ), 바이셀라( Weissella ) 속 균주의 동정
균주 동정을 위해 후보 균주로부터 genomic DNA를 DNeasy Blood & Tissue kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 분리하였다. DNA의 정제는 제조사의 지침을 따랐다. 16S rDNA의 클로닝을 위해 Primer는 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(Forward)와 5'-ACGGGCGGGTGTGTRC-3'(Reverse)를 이용하여 PCR 증폭을 시행하였다. PCR 증폭은 100ng 주형 DNA, 0.5μM의 프라이머 DNA, 2mM dNTPs, 10X reaction 완충액 및 Taq 중합효소(Doctor protein, Korea) 5U/㎕을 사용하여 95℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초의 어닐링(annealing), 72℃에서 1분 신장으로 하는 35cycle을 Biometra thermocycler(Tampa, Florida, USA)로 증폭시켰다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 확인하였다. 확인된 PCR 산물의 16S rDNA sequencing 통해 RBO1-49, BBO1-48의 염기서열 정보를 얻었다. 얻어진 16S rDNA의 서열정보를 이용하여 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 DNA의 상동성 조사에 활용하였으며, 염기서열과의 상동성을 비교분석하였다.
(3) 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재 제조용 스타터 및 미강 또는 맥강으로부터 분리한 페디오코커스 ( Pediococcus ), 바이셀라 ( Weissella ) 속 균주의 특성
분리된 균주의 당 발효패턴과 생화학적인 특성을 조사하기 위하여 API 50 CHL kit (BioMerieux sa, Marcy-L'Etoile, France)를 제조사의 지침에 따라 사용하였다. (Lee, J.S., K.C. Lee, J.S. Ahn, T.I. Mheen, Y.R. Byun and Y.H. Park. 2002. Pediococcus. koreensis sp. nov., isolated from kimchi. Int'l J. Syst. Evol. Microbial . 52, 1257-1261.). 선발된 균주의 오르니틴 생산능을 측정하기 위하여 1%아르기닌이 첨가된 MRS 배지(Difco, Detroit, MI, USA, pH 6.5)에 균주를 접종하고 30℃에서 30~48시간 배양하였고, 5,000rpm에서 20분간 원심분리한 후 세포와 배양액을 분리하여 각각 오르니틴을 분석하였다.
(4) 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재 제조
오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재 제조는 1%Argnine + 20% 미강 또는 맥강을 고압멸균을 실시하고 페디오코커스 펜토사세우스 RBO1-49(Pediococcus pentosaceus RBO1-49)와 바이셀라 시바리아 BBO1-48(Weissella cibaria BBO1-48)를 0.1%(w/v) 접종하여 30℃에서 72시간 동안 발효하였다. 발효 후 12,000rpm에서 20분간 원심리하여 발효액을 추출하였으며 추출 후 동결건조를 통해 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재를 제조하였다(도 1 참조).
(5)오르니틴의 분석
오르니틴 분석은 800㎕의 용매(methanol: chloroform: water = 12:5:3(v/v))를 200㎕의 발효소재 시료와 혼합하였다. 혼합액을 원심분리(12,000rpm, 4℃, 15분)하여 수용액층인 상등액을 1차 회수하였고, 유기용매층에 클로로포름과 물(1:2(v/v)) 혼합액 600㎕을 혼합한 후 원심분리하여 상등액을 2차 회수하였다. 1, 2차 회수한 상등액을 합하여 동결건조하였고, 초순수로 용해하여 0.45㎛ PVDF 막을 통과시켜 HPLC 분석용 시료로 사용하였다. HPLC(Waters, Milford, MA, USA) 분석을 위해 시료는 6-aminoquioly-N-hydroxysuccinimidyl carbonate (AQC)로 유도체화 하였고, 3.9x150mm AccQ·TagTM(Nova-PakTMC18, Waters) 칼럼으로 유도체들을 분리하였다(Seok, J.H., K.B. Park KB, Y.H. Kim, M.O. Bae, M.K. Lee and S.H. Oh. 2008 Production and characterization of Kimchi with enhanced levels of -aminobutyric acid. Food Sci . Biotechnol . 17, 940-946.). 오르니틴함량은 표준 오르니틴의 HPLC 분석결과를 토대로 작성한 표준곡선을 이용하여 산출하였다.
[결과]
(1) 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재 제조용 스타터를 이용하는 미강 또는 맥강으로부터 오르니틴 생성 페디오코커스 ( Pediococcus ), 바이셀라( Weissella ) 속 후보 균주의 분리
오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재 제조용 스타터를 포함하는 미강 또는 맥강으로부터 오르니틴을 생성하는 젖산균을 분리하기 위해 브로모페놀블루가 첨가된 MRS 배지에서 자란 콜로니 중 환을 형성하지 않고 진한 노랑색을 띄는 것들을 후보 균주로 선발하였다. 후보 균주의 오르니틴 생성가능성은 TLC를 이용하여 조사하였다. TLC를 통하여 오르니틴 생산능력이 우수한 균주를 선발하였다. 선발된 균주들 중 미강 유래 RBO1-49의 형태학적 및 생화학적 특성을 조사한 결과 분리된 균주는 그람양성구균 이었으며, 분리된 젖산 균주는 L-아라비노스, D-자일로스, D-갈락토스 등을 분해하여 산을 생성하고, 이노시톨, 글루코겐, D-락토스 등은 분해하지 못하였다(표 1 참조). 맥강 유래 BBO1-48의 형태학적 및 생화학적 특성을 조사한 결과 분리된 균주는 그람양성간균 이였으며, 분리된 젖산 균주는 D-갈락토스, D-프록토스, D-만노스 등을 분해하여 산을 생성하고, 이토니톨, D-아도니톨, 글리코겐 등은 분해하지 못하였다(표 2 참조).
(표 1) 미강 유래 페디오코커스 펜토사세우스 RBO1-49(Pediococcus pentosaceus RBO1-49)의 형태학적 및 생화학적 특성
Figure pat00001
상기 표 1에서 +는 양성(positive), -는 음성(negative)을 의미한다.
(표 2) 맥강 유래 바이셀라 시바리아 BBO1-48(Weissella cibaria BBO1-48)의 형태학적 및 생화학적 특성
Figure pat00002
상기 표 2에서 +는 양성(positive), -는 음성(negative)을 의미한다.
(2) 16S rDNA 서열분석에 의한 균주의 동정
선발된 균주의 동정을 위해 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. 미강 유래 선발균주 Pediococcus sp. RBO1-49의 16S rDNA 염기서열은 Pediococcus pentosaceus strain VITMS7 (Access No. KC692718.1)의 16S rDNA 염기서열과 98% 상동성을 보였다(표 3 참조). 맥강 유래 선발균주 Weissella sp. BBO1-48의 16S rDNA 염기서열은 Weissella cibaria strain qz140(Access No. AB761300.1)의 16S rDNA 염기서열과 98% 상동성을 보였다(표 4 참조).이들 결과를 종합하고, Sharpe 등의 젖산균 동정방법(Sharpe, M.E., T.F. Fryer, and D.G. Smith. 1996. Identification of lactic acid bacteria. p. 65-79. In B.M. Gibbs and F.A. Skinner (ed.). Identification Methods for Microbiologists: part A. Academic Press, Inc., New York, USA.)을 참고로 이들 균주를 Pediococcus pentosaceus , Weissella cibaria 균주로 동정하고, Pediococcus pentosaceus RBO1-49, Weissella cibaria BBO1-48이라 명명하였다.
(표 3) Pediococcus pentosaceus RBO1-49 염기서열
Figure pat00003

(표 4) Weissella cibaria BBO1-48 염기서열
Figure pat00004

< 실시예 1> 페디오코커스 펜토사세우스 RBO1 -49( Pediococcus pentosaceus RBO1-49) 균주를 접종한 오르니틴을 함유하는 미강 발효소재의 제조
물 100 중량부에 대하여, 아르기닌 1 중량부 및 미강 20 중량부를 혼합하여 혼합물을 수득한다.
상기 혼합물을 121℃, 1.5 기압에서 15분간 살균한다.
상기 살균된 혼합물을 45℃로 냉각한다.
상기 냉각된 혼합물에 페디오코커스 펜토사세우스 RBO1-49(Pediococcus pentosaceus RBO1-49)를 MRS 배지에서 30℃로 48시간 동안 배양하여 수득된 기능성 유산균 스타터를 0.1%(w/v) 접종한다.
상기 기능성 유산균 스타터가 접종된 혼합물을 30℃에서 72시간 발효시켜 발효물을 수득한다.
상기 발효물을 12,000rpm으로 20분간 원심분리하여 발효액을 수득한다.
상기 발효액을 동결건조하여 분말화함으로써, 오르니틴을 함유하는 미강 발효소재의 제조를 완료한다.
< 실시예 2> 바이셀라 시바리아 BBO1 -48( Weissella cibaria BBO1 -48) 균주를 접종한 오르니틴을 함유하는 맥강 발효소재의 제조
물 100 중량부에 대하여, 아르기닌 1 중량부 및 맥강 20 중량부를 혼합하여 혼합물을 수득한다.
상기 혼합물을 121℃, 1.5 기압에서 15분간 살균한다.
상기 살균된 혼합물을 45℃로 냉각한다.
상기 냉각된 혼합물에 바이셀라 시바리아 BBO1-48(Weissella cibaria BBO1-48)을 MRS 배지에서 30℃로 48시간 동안 배양하여 수득된 기능성 유산균 스타터를 0.1%(w/v) 접종한다.
상기 기능성 유산균 스타터가 접종된 혼합물을 30℃에서 72시간 발효시켜 발효물을 수득한다.
상기 발효물을 12,000rpm으로 20분간 원심분리하여 발효액을 수득한다.
상기 발효액을 동결건조하여 분말화함으로써, 오르니틴을 함유하는 맥강 발효소재의 제조를 완료한다.
< 시험예 1> pH 변화
상기에서 제조한 실시예 1 및 실시예 2에 대하여 균주 접종 후 3일간 발효시켰을 때 일자별로 pH 변화를 측정하였다.
상기 실시예 1의 pH 변화는 0일차에 6.5였으며 1일차부터 감소하여 4.88이였으며 3일차에는 4.56까지 낮아졌다(도 2 참조). 또한 상기 실시예 2의 pH 변화는 0일차에 6.04였으며 1일차까지 큰 변화는 없었으며 3일차에는 5.34까지 낮아졌다(도 3 참조).
< 시험예 2> 산도 변화
상기에서 제조한 실시예 1 및 실시예 2에 대하여 균주 접종 후 3일간 발효시켰을 때 일자별로 산도 변화를 측정하였다.
상기 실시예 1의 산도 변화는 1일차에 0.82였으며 3일차에서는 증가하여 1.02로 나타냈다(도 4 참조). 또한 상기 실시예 2의 산도 변화는 1일차에 0.36이였으며 3일차에는 0.42까지 증가하였다(도 5 참조).
< 시험예 3> 오르니틴 함량
상기에서 제조한 실시예 1 및 실시예 2에 대하여 균주 접종 후 3일간 발효시켰을 때 오르니틴 함량을 측정하였다.
실시예 1 및 실시예 2는 시간이 지날수록 오르니틴 함량이 증가하는 것을 알 수 있다(도 6 및 도 7 참조). 이는 천연재료를 통해 발효하여 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재를 제조할 수 있으며, 고함량 오르니틴 발효소재를 제조할 수 있다는 것을 알 수 있다.
< 시험예 4> 항비만 효능
상기에서 제조한 실시예 1 및 실시예 2에 대하여 균주 접종 후 3일간 발효시킨 후 3T3-L-1세포 항비만 효능을 측정하였다.
상기 3T3-L-1세포는 지방세포로써, 도 8을 참조하여 상기 3T3-L-1세포에 어떤 처리도 하지 않은 Control(대조구), 상기 3T3-L-1세포에 미강만 처리한 결과를 나타내는 미강 및 상기 3T3-L-1세포에 상기 실시예 1인 미강 발효소재를 처리한 결과를 나타내는 미강 발효소재를 살펴보면, 측정된 3T3-L-1세포 수치에 있어서 상기 미강은 상기 Control과 큰 차이를 보이지 않는 반면 상기 미강 발효소재는 상기 Control보다 현저히 낮은 수치를 보여주고 있다.
또한 도 9를 참조하여 상기 3T3-L-1세포에 어떤 처리도 하지 않은 Control(대조구), 상기 3T3-L-1세포에 맥강만 처리한 결과를 나타내는 맥강 및 상기 3T3-L-1세포에 상기 실시예 2인 맥강 발효소재를 처리한 결과를 나타내는 맥강 발효소재를 살펴보면, 측정된 3T3-L-1세포 수치에 있어서 상기 실시예 1과 마찬가지로 상기 맥강은 상기 Control과 큰 차이를 보이지 않는 반면 상기 맥강 발효소재는 상기 Control보다 현저히 낮은 수치를 보여주고 있다.
이로써 상기 미강 발효소재(실시예 1) 및 맥강 발효소재(실시예 2)는 지방세포분화와 지방축적을 억제하여 항비만 효능이 있다는 것을 알 수 있다.
< 시험예 5> 항스트레스 효능
상기에서 제조한 실시예 1 및 실시예 2에 대하여 균주 접종 후 3일간 발효시킨 후 세포 항스트레스 효능을 측정하였다.
도 10을 참조하여 상기 세포에 어떤 처리도 하지 않은 Control(대조구), 상기 세포에 미강만 처리한 결과를 나타내는 미강 및 상기 세포에 상기 실시예 1인 미강에 오르니틴 생산능력이 있는 균주를 접종한 발효소재를 처리한 결과를 나타내는 미강+오르니틴을 살펴보면, 측정된 세포 생존능력에 있어서 상기 미강은 상기 Control과 큰 차이를 보이지 않는 반면 상기 미강+오르니틴은 상기 Control보다 현저히 높은 수치를 보여주고 있다.
또한 도 11을 참조하여 상기 세포에 어떤 처리도 하지 않은 Control(대조구), 상기 세포에 맥강만 처리한 결과를 나타내는 맥강 및 상기 세포에 상기 실시예 2인 맥강에 오르니틴 생산능력이 있는 균주를 접종한 발효소재를 처리한 결과를 나타내는 맥강+오르니틴을 살펴보면, 측정된 세포 생존능력에 있어서 상기 실시예 1과 마찬가지로 상기 맥강은 상기 Control과 큰 차이를 보이지 않는 반면 상기 맥강+오르니틴은 상기 Control보다 현저히 높은 수치를 보여주고 있다.
이로써 상기 미강+오르니틴(실시예 1) 및 맥강+오르니틴(실시예 2)을 처리했을 때 세포 생존능력이 높아지므로 스트레스에 저항하는 항스트레스 효능이 있다는 것을 알 수 있다.

Claims (5)

  1. 미강 또는 맥강과, 아르기닌 및 물을 혼합하는 혼합단계(S10);

    상기 혼합단계를 통해 수득된 혼합물을 100~130℃, 1.2~1.8 기압에서 10~20분간 살균하는 살균단계(S20);

    상기 살균단계를 거친 혼합물을 40~45℃로 냉각하는 냉각단계(S30);

    상기 냉각단계를 거친 혼합물에 기능성 유산균 스타터를 0.05~0.1%(w/v) 접종하는 접종단계(S40);

    상기 접종단계를 거친 혼합물을 25~35℃에서 70~74시간 발효하는 발효단계(S50);

    상기 발효단계를 통해 수득된 발효물을 11,000~13,000rpm으로 10~30분간 원심분리하는 원심분리단계(S60);

    상기 원심분리단계를 통해 수득된 발효액을 동결건조를 통해 분말화하는 분말화단계(S70)를 포함하는 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혼합단계는
    물 100 중량부에 대하여, 아르기닌 0.5~1.5 중량부와, 미강 또는 맥강 15~25 중량부를 포함하여 혼합하는 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 접종단계는
    상기 기능성 유산균 스타터가 오르니틴 생산능력이 있는 페디오코커스 펜토사세우스 RBO1-49(Pediococcus pentosaceus RBO1-49) 또는 바이셀라 시바리아 BBO1-48(Weissella cibaria BBO1-48)로 구성되는 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 접종단계는
    상기 페디오코커스 펜토사세우스 RBO1-49(Pediococcus pentosaceus RBO1-49) 또는 바이셀라 시바리아 BBO1-48(Weissella cibaria BBO1-48)을 MRS 배지에서 28~32℃로 45~50시간 동안 배양하여 수득된 기능성 유산균 스타터를 접종하는 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재의 제조방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 오르니틴을 함유하는 미강 또는 맥강 발효소재.
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