KR20160006022A

KR20160006022A - (4aS,5S,6R,8aS)-5-((R)-3-((((E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)아크릴로일)옥실)메틸)-5-하이드록시펜틸)-5,6,8a-트리메틸-3,4,4a,5,6,7,8,8a-옥타하이드로나프탈렌-1-카복실릭엑시드 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160006022A
Application number: KR1020140085320A
Authority: KR
Inventors: 김은기; 이향복; 이신애; 신재민; 이지영; 도경록
Original assignee: 인하대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-08
Filing date: 2014-07-08
Publication date: 2016-01-18
Also published as: KR101648739B1

Abstract

본 발명은 피부 미백용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 우수한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내는 (4aS,5S,6R,8aS)-5-((R)-3-((((E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)아크릴로일)옥실)메틸)-5-하이드록시펜틸)-5,6,8a-트리메틸-3,4,4a,5,6,7,8,8a-옥타하이드로나프탈렌-1-카복실릭엑시드 화합물은 세포 독성이 거의 없으므로, 피부 미백용 화장료 조성물, 건강식품 조성물 및 약학 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

(4aS,5S,6R,8aS)-5-((R)-3-((((E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)아크릴로일)옥실)메틸)-5-하이드록시펜틸)-5,6,8a-트리메틸-3,4,4a,5,6,7,8,8a-옥타하이드로나프탈렌-1-카복실릭엑시드 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물 및 이의 용도{Composition for skin whitening comprising (4aS,5S,6R,8aS)-5-((R)-3-((((E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyl)oxy)methyl)-5-hydroxypentyl)-5,6,8a-trimethyl-3,4,4a,5,6,7,8,8a-octahydronaphthalene-1-carboxylic acid as effective component and uses thereof}

본 발명은 피부 미백용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (4aS,5S,6R,8aS)-5-((R)-3-((((E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)아크릴로일)옥실)메틸)-5-하이드록시펜틸)-5,6,8a-트리메틸-3,4,4a,5,6,7,8,8a-옥타하이드로나프탈렌-1-카복실릭엑시드 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물, 건강식품 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색은 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드, 빌리루빈(bilirubin) 등의 인체 내외의 색소 함유 유무와 같은 여러 요인에 의해 결정된다. 그 중에서도 멜라노사이트에서 형성되는 멜라닌이라는 색소가 피부색 형성에 가장 중요한 요소로 받아들여지고 있다. 멜라닌은 티로신이 티로시나아제에 의해 3,4-디하이드록시페닐알라닌, 도파퀴논, 류코도파크롬, 도파크롬, 5,6-디하이드록시인돌 및 인돌-5,6-퀴논을 거쳐 최종적으로 멜라닌으로 변환되는 산화 과정의 최종 생성물이다. 즉, 티로신 및 티로시나아제는 멜라닌 생성에 있어서 매우 중요한 단백질로 작용한다.

멜라닌 생합성은 매우 복잡한 과정으로 아직까지 멜라닌 합성을 유도하는 정확한 메커니즘이 무엇인지에 대해서는 자세히 밝혀지지 않고 있다. 멜라닌은 유해한 자외선에 대한 자연적 방어 역할을 제공하지만 멜라닌이 과잉 생산되는 경우 기미, 주근깨 등의 과다 색소침착을 유발한다. 또한, 과도한 자외선 노출로 인한 멜라닌의 과잉 생성은 심하게는 피부암을 유발하기도 한다. 따라서, 멜라닌 생합성 저해 물질 개발의 필요성이 증가하고 있으며, 미백에 관련된 연구도 활발하게 이루어지고 있다.

피부의 색소 침착을 억제하여 미백 효과를 나타내는 물질로 알부틴, 데옥시알부틴, 옥타데센다이온산, 공액 리놀레산, 니아신아미드, 하이드로퀴논, 코지산, 글루타치온, 아젤라인산 등의 유효성분들이 알려져 있다. 상기와 같은 물질들은 티로시나아제 저해 활성을 갖는 것으로 알려져 있고, 실제로 미백 제품들에 사용되어 왔다. 그러나 상기 유효 성분들은 불충분한 미백 효과, 피부에 대한 안전성 문제, 제형 제작의 난이성 및 안정성 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다. 따라서, 본 발명자들은 미백 효과가 우수하며, 피부 안전성이 높은 화합물을 화장료 조성물로 제공하고자 한다.

한편, 한국등록특허 제1050484호에는 '락톤계 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2001-0107962호에는 '아스코르브산 화합물을 함유한 피부 미백 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명과 같이 (4aS,5S,6R,8aS)-5-((R)-3-((((E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)아크릴로일)옥실)메틸)-5-하이드록시펜틸)-5,6,8a-트리메틸-3,4,4a,5,6,7,8,8a-옥타하이드로나프탈렌-1-카복실릭엑시드 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 멜라닌 세포(melan-a murine melanocyte)에 (4aS,5S,6R,8aS)-5-((R)-3-((((E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)아크릴로일)옥실)메틸)-5-하이드록시펜틸)-5,6,8a-트리메틸-3,4,4a,5,6,7,8,8a-옥타하이드로나프탈렌-1-카복실릭엑시드 화합물을 처리했을 때, 우수한 멜라닌 생성 억제 효과가 나타나며, 5 μM 이상의 농도에서도 세포 독성이 나타나지 않는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (4aS,5S,6R,8aS)-5-((R)-3-((((E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)아크릴로일)옥실)메틸)-5-하이드록시펜틸)-5,6,8a-트리메틸-3,4,4a,5,6,7,8,8a-옥타하이드로나프탈렌-1-카복실릭엑시드 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물, 건강식품 조성물 및 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, (4aS,5S,6R,8aS)-5-((R)-3-((((E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)아크릴로일)옥실)메틸)-5-하이드록시펜틸)-5,6,8a-트리메틸-3,4,4a,5,6,7,8,8a-옥타하이드로나프탈렌-1-카복실릭엑시드 화합물은 멜라닌 생성 억제 효과가 우수하고 세포 독성이 거의 없으므로, 피부 미백용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 선정한 22종의 후보군(천연물)의 HMG-CoA 환원효소 저해능을 비교한 그래프이다.
C: 무처리구, P: 양성 대조군(프라바스타틴)
도 2는 무처리구(Control) 대비 멜라닌 생성률(% Melanin)과 세포 생존율(% Viability)을 비교한 그래프이다.
Control: 무처리구, PTU: 양성 대조군
도 3은 #21 화합물의 HMG-CoA 환원효소의 활성 저해능을 나타낸 그래프이다.
Control: 무처리구, Pravastatin: 양성 대조군(프라바스타틴)
도 4는 #21 화합물의 무처리구(Control) 대비 멜라닌 생성률(% Melanin)과 세포 생존율(% Viability)을 비교한 그래프이다.
Control: 무처리구, PTU: 양성 대조군

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 (4aS,5S,6R,8aS)-5-((R)-3-((((E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)아크릴로일)옥실)메틸)-5-하이드록시펜틸)-5,6,8a-트리메틸-3,4,4a,5,6,7,8,8a-옥타하이드로나프탈렌-1-카복실릭엑시드((4aS,5S,6R,8aS)-5-((R)-3-((((E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyl)oxy)methyl)-5-hydroxypentyl)-5,6,8a-trimethyl-3,4,4a,5,6,7,8,8a-octahydronaphthalene-1-carboxylic acid)인 것이 바람직하다.

미백 성분을 실제 피부에 적용시, 우수한 미백 효과를 발휘하기 위해서는 저농도에서 고활성의 피부 미백 효과를 나타내고, 피부를 투과하여 흡수되는 능력이 우수하고, 미백 효과를 나타내기에 충분한 시간 동안 머무를 수 있도록 휘발성이 낮고, 조성물이나 피부 상에서 활성 성분이 안정하게 유지되고, 의약이나 화장품으로의 제형화가 용이하며, 또한 피부에 안전한 것이 바람직하다. 그러나 공지의 미백 성분 중 상기 특성을 모두 만족시키는 미백 성분은 흔치 않다. 예를 들어, 몇몇 미백 성분들은 시험관 내 실험에서는 저농도에서도 미백 활성이 우수하나, 피부를 투과하여 흡수되는 능력이 떨어져 실제 피부에 적용하기 어렵다. 또 다른 미백 성분들은 친수성이 낮아 화장품이나 의약품으로 제형화가 어렵다. 또한 몇몇 미백 성분들은 열, 광 또는 산소에 노출되었을 때 미백 성분이 분해되거나 다른 화합물로 변형되어 피부에 적용하기 전에 이미 미백 효과가 사라지는 경우도 있다. 그러나 본 발명의 상기 화학식 1의 화합물은 우수한 멜라닌 생성 억제 효과가 나타나며, 5 μM 이상의 농도에서도 세포 독성이 나타나지 않아서 피부에 매우 안전한 것으로 나타났다.

본 발명에 있어서, '미백'이라 함은 피부의 과다 색소 침착을 억제, 저해 또는 완화시키는 것을 말한다. 피부의 과다 색소 침착은 주근깨, 기미, 자외선 노출 후 과다 색소 침착, 염증 후 과다 색소 침착, 노인흑색점, 갈색 반점 또는 검버섯 등을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부 미백용 화장료 조성물은 상기 화학식 1의 화합물을 상기 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~90 중량부의 양으로 함유할 수 있으나, 바람직한 미백 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, '유효량'이라 함은 피부의 과다 색소 침착을 억제, 저해 또는 완화시킬 수 있는 화합물의 양을 의미한다. 본 발명의 피부 미백용 조성물에 포함되는 상기 화합물의 유효량은 피부 미백용 조성물이 제품화되는 형태, 상기 화합물이 피부에 적용되는 방법 및 피부에 머무르는 시간 등에 따라 달라질 것이다. 예컨대, 상기 피부 미백용 조성물이 피부의 과다 색소 침착에 따른 피부과적 치료를 위한 의약품으로 제품화되는 경우에는 일상적으로 피부에 적용하게 되는 화장품으로 제품화되는 경우에 비해 높은 농도로 상기 화학식 1의 화합물을 포함할 수 있을 것이다. 화장품으로 제품화되는 경우에 있어서도 유효성분이 단기간 내에 피부에 머무르게 되는 메이크업 제거제, 세정제 등과 같은 워쉬-오프(wash-off) 타입의 화장품의 경우에는 비교적 높은 농도의 상기 화합물을 포함할 수 있을 것이다. 반면 유효성분이 장기간 동안 피부에 머무르게 되는 화장수, 유액, 크림, 에센스 등의 리브-온(leave-on) 타입의 화장품의 경우에는 워쉬-오프 타입의 화장품에 비해 낮은 농도의 상기 화합물을 포함해도 무방할 것이다.

본 발명의 일 구현에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부 미백용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 화합물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 피부 미백 활성 성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 피부 미백 활성 성분으로는 코지산 및 이의 유도체, 알부틴, 아스코르브산 및 이의 유도체, 하이드로퀴논 및 이의 유도체, 레조르시놀, 사이클로알카논, 메틸렌디옥시페닐 알칸올, 2,7-디니트로인다졸 또는 덩굴귤 추출물, 쌀 추출물, 감초 추출물과 같은 식물 추출물 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습체, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.

상기와 같이 피부 미백용 화장료 조성물을 의약품 또는 화장품으로 제형화할 경우, 활성 성분에 대한 담체로 작용하는 피부에 적용가능한 공지의 부형제를 포함할 수 있다. 의약품으로의 제형화시에는 [Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA]에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있으며, 화장품으로 제형화시에는 [International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed., The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995]에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있을 것이다. 상기 문헌들은 본 명세서의 일부로서 포함된다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 건강식품 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 상기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에 의한 피부 미백용 약학 조성물은, 유효성분인 상기 화학식 1의 화합물을 그대로 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다. 산 부가염 이외에도, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 트리에틸아민, 3차-부틸아민과 같은 염기 부가염도 사용될 수 있다.

본 발명에 의한 약학 조성물의 제형에 있어서, 유효성분의 함유량은 제형에 따라 광범위하게 변할 수 있으며, 통상적인 방법에 따른다.

본 발명에 의한 약학 조성물은, 유효성분에 악영향을 미치지 않는 한, 필요에 따라 의약에 사용되는 각종 보조제, 예컨대 담체나 기타 첨가제, 예컨대 안정제, 완화제, 유화제 등을 첨가하여 제제화될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 또는 경구 등으로 투여할 수 있다. 비경구 투여 루트로는 경피 투여가 바람직하며, 그 중에서도 국소도포가 가장 바람직하다. 예를 들어, 반창고 형태로 제조하여 붙일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제형으로는, 연고, 크림, 주사제, 산제, 과립제, 정제 등을 비롯하여 약학적 제제에 적합한 어떠한 제형으로도 할 수 있다.

본 발명에 의한 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 0.001 내지 1000 ㎎/Kg·day일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명에 의한 조성물은 단독으로 투여되거나 다른 약제와 동등하게 또는 다른 약제를 보조하기 위해 함께 투여될 수 있다. 또한, 각 제형의 조성물에 있어서, 상기한 필수 성분인 조성물 이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 재료 및 방법

1 세포 및 시약

HMG-CoA 환원효소(HMG-CoA Reductase) 활성저해 시험에 사용되는 키트, 멜라닌 정량 실험에 사용되는 DMSO, 세포 생존도 측정 실험에 첨가하는 MTT 시약은 Sigma Aldrich(USA)사의 제품을 사용하였다.

사용한 세포는 murine melanocyte cell(Melan-a)로서, 배양에 쓰인 배지로 RPMI-1640(GIBCO) 배지에 100 unit/ml의 페니실린 스트렙토마이신을 0.1%, FBS(fetal bovine serum) 10%가 첨가되어 사용되었고, 37℃, 10% CO₂ 조건의 항온기를 이용하였다.

2. 실험 시료

실험 시료는 DMSO에 용해시켜 사용하였다.

3. 단백질 구조 기반의 가상 신약탐색을 통한 피부미백 천연물질의 발굴

우선 HMG-CoA 환원효소의 주요 결합 부위(Hot spot region)를 문헌조사를 통해 확인하고, 현재까지 Protein Data Bank에 발표된 총 22종의 HMG-CoA 환원효소 엑스레이 크리스탈 구조들을 중첩하여 구조의 상동성(homology)을 확인하였다. 리간드들과 상호작용하는 단백질 주요결합 부위의 아미노산 잔기들은 문헌상 제시된 돌연변이 실험 결과를 바탕으로 분석하였고, 친수성 상호작용하는 3개의 핵심 아미노산과 소수성 상호작용을 하는 1개의 핵심 아미노산을 선별하였다(표 1). 이 주요 결합 부위 내 핵심 아미노산들과의 상호작용을 근거로 하여 2종의 활성골격(Pharmacophore query)을 생성하였다. 이 활성골격들은 공통적으로 2개의 수소결합 주개, 1개의 수소결합 받개, 1개의 소수성 자리 요소로 구성되어 있으며, 이들의 차이점은 추가적인 1개의 소수성 자리 요소가 존재하는지 유무이다.

리간드들과 상호작용하는 단백질 주요결합 부위의 핵심 아미노산

	핵심 아미노산
친수성 상호작용	리신(Lys)735, 아스파라트산(Asp)690, 글루탐산(Glu)559
소수성 상호작용	류신(Leu)562

가상 신약탐색을 위한 라이브러리는 Accelrys 사의 Discovery Studio/CatDB 의 형태로 구성하였다. 화합물의 3차원 구조의 다중 입체구조(multiple conformation)를 찾아내어 화학적으로 가능한 모든 형태 이성질체(conformer)를 포함할 수 있도록 파라미터(parameter)를 조절하였다. 현재 약 790만 종의 천연물/합성화합물 라이브러리를 구축하였으며, Discovery Studio의 'Search 3D Database' 프로토콜과 앞서 생성한 두 종의 활성골격을 이용하여 가상탐색용 순수 천연물 라이브러리에 포함되어 있는 모든 천연물에 대하여 탐색을 실시하였다.

각각의 화합물이 가지는 여러 가지 형태 이성질체들을 활성 골격에 맵핑(mapping)을 시키면서, 설정한 상호작용 요소들과 천연 화합물 분자의 원자 또는 하부구조가 적합하게 위치하는지를 평가하였다. 이러한 적합도(fitness)를 측정하는 가상 탐색을 통해서 총 730개의 천연 화합물을 가상 선도물질로 선정하였고, 이 중 분자간의 구조적 다양성과 물에서의 용해도 계산 값, 구매가능 여부를 기준으로 최종 22종의 천연 화합물을 선별하였다. 이들은 모두 순도 80% 이상의 추출 천연화합물로서 Analyticon Discovery로부터 구입하였으며, HMG-CoA 환원효소의 활성 억제와 피부 미백 효과를 검증하기 위해 생물학적 실험에 사용되었다.

4. 시험관 내 HMG - CoA 환원효소 활성저해시험( HMG - CoA Reductase Assay )

본 실험은 Sigma 사의 HMG-CoA 환원효소 정량 키트를 사용하였다. 실험은 키트에 첨부된 지시 사항에 따라 수행하였다. 먼저, 정량 버퍼를 모든 웰(96 웰)에 넣었다. 그리고 대조군으로 사용될 억제제 또는 시료를 웰에 넣었다. 그리고 NADPH, HMG-CoA를 모든 웰에 넣었다. 시료가 잘 혼합될 수 있도록 교반해 주었다. 그 후에 마이크로플레이트 리더로 37℃, 370 nm에서 10분간 20초 마다 흡광도를 측정하였다. 10분 후에 측정된 흡광도를 이용하여 대조군 대비 효소의 활성 저해능을 구하고, 공시험하여 보정하였다.

효소저해능(%) = (1-처리구 효소활성/무처리구 효소활성) × 100

5. 세포 내의 멜라닌 생성 저해시험( Melanogenesis inhibition assay )

본 실험방법은 Melan-a(murine melanocyte) 세포를 10%의 FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 배지로 6 웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵ 개로 접종한 후 10% CO₂, 37℃ 하에서 세포가 웰 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 시료가 적당 농도로 희석된 배지로 교체한 후 10% CO₂, 37℃ 하에서 일정 시간 배양하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS(phosphated buffer saline)로 세척하고, 이것을 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 5,000~10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 펠렛을 얻었다. 이 세포 펠렛은 10% DMSO가 함유된 1M 수산화나트륨 용액 100 ㎕를 넣어 80℃ 항온조에서 세포 내 멜라닌을 얻었다. 이 액을 가지고 마이크로플레이트 리더로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군 대비 멜라닌 양을 구하고, 공시험하여 보정하였다.

멜라닌 생성도(%) = 처리구 흡광도/무처리구 흡광도 × 100

6. 세포의 생존도 실험( MTT Assay )

일정농도의 시료를 넣어 세포를 배양한 다음, 웰에서 배지의 10%를 제거 후, 제거한 양만큼의 MTT 용액(0.5% 3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5 diphenyl-2H- tetrazolium bromide)을 넣고, 2시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 다음 DMSO(dimethylsulfoxide) 용액 200 ㎕씩을 첨가하고 10분간 흔들어 준 다음 ELISA 리더로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 생존율(%) = (처리구 흡광도/무처리구 흡광도) × 100

실시예 1: 멜라닌 생성 억제 화합물 선발

HMG-CoA 환원효소는 콜레스테롤을 생합성하는 중요 경로인 메발론산 경로(Mevalonate pathway)의 율속 효소(rate-limiting enzyme)이다. 기존 고지혈증 약물인 Statin 계열의 예시와 같이, HMG-CoA 환원효소에 결합하여 효소의 활성을 저해하였을 때, 체내의 콜레스테롤 저하를 유발하는 것에 대한 연구는 지속되어왔다. 기존의 연구를 기반으로, HMG-CoA 환원효소의 활성저해가 콜레스테롤의 합성을 감소시켜 최종적으로 멜라닌 생성을 억제하는 미백제로 사용될 수 있다는 가설을 세웠다.

HMG-CoA 환원효소의 활성을 억제하여 미백 효과를 나타내는 천연물을 선별하기 위한 인실리코 신약개발(In silico drug discovery) 방법을 이용하여 탐색하였다. 결과적으로, 최종 22종의 천연 화합물을 선별하였다(도 1).

탐색하여 선정한 22종의 저해제 후보군(천연물)이 HMG-CoA 환원효소와 HMG-CoA 사이의 결합을 저해하여 활성을 저해하는지를 확인하고 저해능이 높은 우수 저해제를 선별하기 위하여 HMG-CoA 환원효소 정량 키트를 이용하여 그 효능을 측정하여 비교하였다. 22종의 후보군은 전반적으로 HMG-CoA 환원효소 활성 저해능을 가진다는 것으로 판단되었으며 그 중 6종의 후보군(#2, #5, #8, #9, #21, #22)의 HMG-CoA 환원효소 저해능이 우수한 결과를 보여주었다(도 1). 분석 결과를 바탕으로, 6종의 후보군이 HMG-CoA 환원효소 활성 저해능이 우수한 저해제라는 결론을 내릴 수 있었다.

멜라노사이트에서 HMG-CoA 환원효소의 활성을 억제하여 멜라닌 생성을 감소시키고, 세포에 독성이 없는 시료를 선발하기 위해 실험을 수행한 결과는 도 2와 같다. HMG-CoA 환원효소 저해제로 판단되는 6종의 후보군을 대상으로 실험하였다. 후보군은 5 μM의 농도로 실험하였으며, #22는 해당 농도에서 높은 독성을 나타내어 본 실험결과에서 제외되었다. 분석 결과, HMG-CoA 환원효소의 저해제로써 5 μM에서 멜라닌 억제효능을 보인 천연물은 #8, #9, #21 3종으로 나타났다. 3종의 천연물 중, #8은 이미 공지된 미백 효능을 갖는 화합물이므로, #9, #21 두가지의 천연물들이 신규한 미백 효능을 갖는 천연물로 판단된다.

결론적으로, 새로운 미백 타깃으로서 HMG-CoA 환원효소를 저해하여 미백 효능을 나타내는 신규 천연물로 #9((3R)-5-[[(2R,3S,4R,5R,6S)-6-[2-(3,4-디하이드록시페닐)-5,7-디하이드록시-4-옥소-크로멘-8-일]-3,4,5-트리하이드록시-테트라하이드로피란-2-일]메톡시]-3-하이드록시-3-메틸-5-옥소-펜타노익엑시드), #21((4aS,5S,6R,8aS)-5-((R)-3-((((E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)아크릴로일)옥실)메틸)-5-하이드록시펜틸)-5,6,8a-트리메틸-3,4,4a,5,6,7,8,8a-옥타하이드로나프탈렌-1-카복실릭엑시드)이 선발되었다.

실시예 2: 시험관 내 HMG - CoA 환원효소 활성저해시험

본 실험은 #21((4aS,5S,6R,8aS)-5-((R)-3-((((E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)아크릴로일)옥실)메틸)-5-하이드록시펜틸)-5,6,8a-트리메틸-3,4,4a,5,6,7,8,8a-옥타하이드로나프탈렌-1-카복실릭엑시드)의 HMG-CoA 환원효소의 활성 저해능을 확인하기 위하여 실행하였다. 양성대조군으로는 프라바스타틴(Pravastatin)을 사용하였다(도 3).

각각 50, 100 μM 의 #21((4aS,5S,6R,8aS)-5-((R)-3-((((E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)아크릴로일)옥실)메틸)-5-하이드록시펜틸)-5,6,8a-트리메틸-3,4,4a,5,6,7,8,8a-옥타하이드로나프탈렌-1-카복실릭엑시드) 처리 시에 약 57.9%, 64.6%의 HMG-CoA 환원효소 저해능을 나타내었다.

실시예 3: 세포 내의 멜라닌 생성저해시험

본 실험은 #21((4aS,5S,6R,8aS)-5-((R)-3-((((E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)아크릴로일)옥실)메틸)-5-하이드록시펜틸)-5,6,8a-트리메틸-3,4,4a,5,6,7,8,8a-옥타하이드로나프탈렌-1-카복실릭엑시드)를 처리 시 세포의 멜라닌 생성이 저해되는 정도를 측정하기 위하여 실시하였다. Melan-a(mouse melanocyte) 세포 라인을 사용하였으며 양성 대조군으로는 PTU를 처리하였다.

1, 5, 10 μM의 #21((4aS,5S,6R,8aS)-5-((R)-3-((((E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)아크릴로일)옥실)메틸)-5-하이드록시펜틸)-5,6,8a-트리메틸-3,4,4a,5,6,7,8,8a-옥타하이드로나프탈렌-1-카복실릭엑시드)를 처리하였을 때, 각각 11.6, 40.9, 72.6%의 멜라닌 생성이 감소하였다. 세포 생존도는 각각 92.3, 97.9, 61.8%로 유지되었다(도 4).

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 건강식품 조성물.
[화학식 1]
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 약학 조성물.
[화학식 1]