KR20160005122A

KR20160005122A - 개별 세포 배양 미세환경의 어레이, 이러한 어레이의 제조 방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160005122A
Application number: KR1020157034940A
Authority: KR
Inventors: 마티아스 루톨프; 아드리안 랑가
Original assignee: 에꼴 뽈리떼끄닉 뻬데랄 드 로잔느 (으뻬에프엘)
Priority date: 2013-05-08
Filing date: 2014-05-08
Publication date: 2016-01-13
Also published as: US20180113114A1; SG10201709159YA; RU2015152344A; US10725022B2; BR112015027826A2; SG11201509214WA; MX368780B; EP2801613A1; JP2016517694A; IL242344B; EP2994527A1; US20160116453A1; AU2014264548B2; CA2911380A1; CN105358675A; AU2014264548A1; MX2015015406A; RU2718491C2; JP6648005B2; WO2014180970A1

Abstract

본 발명은 배양하기 어려운 세포 유형의 표현형 및 운명을 제어하는 하이드로겔 제제를 확인하는 조합적 방법에 관한 것이다.

Description

개별 세포 배양 미세환경의 어레이, 이러한 어레이의 제조 방법 및 이의 용도{ARRAYS OF DISCRETE CELL CULTURE MICROENVIRONMENTS, METHODS OF MAKING SUCH ARRAYS AND USES THEREOF}

본 발명은 상이한 특성, 즉, 세포 표현형 및 운명, 즉, 증식/자기 재생, 콜로니 형성, 분화 및/또는 이동에 영향을 주는 상이한 기계적 및/또는 생화학적 특성(즉, 세포 점착, 신호전달, 분해성)을 보유하는 세포 배양 미세환경의 개별 용적의 어레이; 이러한 어레이의 제조 방법; 이러한 어레이의 제조를 위한 부품 키트; 및 특히 줄기 세포와 같은 배양이 어려운 세포 유형의, 세포 성장 거동에 대한 하이드로겔 제제의 영향을 테스트하는 조합적 방법에 관한 것이다.

특히 암 또는 줄기 세포 연구 분야에서, 복잡한 세포 거동을 설명하는 모델로서 이차원 세포 배양 시스템뿐만 아니라 천연 유래 삼차원 세포 배양 시스템이 다년간 알려져 있다.

이차원 세포 배양 시스템은 생체내 발견된 것들과 매우 닮은 유전자 발현 패턴 및 세포 표현형을 허용하지 않는다는 단점을 갖는다. 추가로, 이들은 생체내 세포 배양 미세환경의 특정한 주요 생리학적 특징, 특히 공간적 제약, 단백질가수분해 리모델링, 강성도 매개된 기계적에너지변환 및 리간드의 적절한 표시 방식을 충실하게 재현할 것으로 예상될 수 없다.

천연 유래 3D 세포 배양 시스템은 불량하게 정의된 조성물을 갖고 배치 간 편차를 보여주고, 이는 이들의 특성을 체계적인 방식으로 변경하는 것과 이들의 주요 매트릭스 파라미터를 독립적으로 제어하는 것을 불가능하게 만든다.

따라서, 본 발명의 목적은 선행 기술의 단점을 극복하는 것이고, 특히 목적하는 세포 거동을 제어하는 세포 배양 미세환경의 빠른 확인을 가능하게 하는 도구 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 제1 측면은 캡슐화된 세포의 거동에 영향을 주는 상이한 특성을 보유하는 세포 배양 미세환경(바람직하게는 각각)의 개별 용적의 어레이에 관한 것이다.

본원에서 이해되는 바와 같이, 용어 "세포 배양 미세환경 내에 캡슐화되는" 또는 유사한 표현은 세포가 또는 세포들이 매트릭스에 의해 완전히 둘러싸이고 이로써 천연 발생 세포 성장 조건을 모방하도록 매트릭스에 삽입되는 것을 의미한다.

본원에서 이해되는 바와 같이, 용어 "미세환경" 또는 "미세환경의 용적"은 각각 고처리용량 테스트 기기, 특히 멀티 웰 플레이트에 적합한 용적을 의미한다. 멀티 웰 플레이트에서 분석되는 전형적인 용적은 약 100 nl 내지 약 500 ㎕, 바람직하게는 약 200 nl 내지 약 20 ㎕ 범위이다.

용어 "개별 용적"은 어레이 내에서 공간적으로 분리된 스팟 또는 영역에 관한 것이다. 분리된 스팟 또는 영역은 서로 접촉하고 있을 수 있거나, 예를 들면, 플라스틱 장벽에 의해 서로 분리되어 있을 수 있다. 이들 각각의 개별 용적 내에서 또는 위에서, 목적하는 세포 유형의 세포는 서로 분리되어 있는 방식으로 위치할 수 있다. 이들은 실험 시작부터 서로 접촉하지 않고 시간 경과에 따라 그대로 유지되고, 이로써 이웃한 용적으로부터 독립적으로, 오직 이들의 세포 배양 미세환경의 영향하에서만 성장한다.

특히, 개별 용적을 갖고 세포 증식/자기 재생, 콜로니 형성, 분화 및/또는 이동에 영향을 주는 상이한 특성을 보유하는 삼차원 하이드로겔의 어레이가 사용될 수 있다. 하이드로겔 전구체 분자를 가교결합시켜 수득된, 사용된 하이드로겔은 바람직하게는 세포 적합성(cell-compatible) 가교결합 반응에 의해 가교결합되는 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)계 중합체, 가장 바람직하게는 멀티암(multiarm) PEG계 중합체이다.

본원에서 이해되는 바와 같이, "세포 적합성 반응(들)에 의해 가교결합가능함"(또는 유사한 용어)은 (i) a) 효소적 촉매 반응, 바람직하게는 활성화된 트랜스글루타미나제 인자 XIIIa에 의존하는 효소적 촉매 반응; 및 b) 비효소적 촉매 및/또는 비촉매 반응, 바람직하게는 마이클 첨가 반응(Michael addition reaction)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공유 결합 형성; 및/또는 ii) 비공유 결합 형성(예를 들면, 특히 온도 변화 또는 버퍼의 이온 강도 변화에 의해 유도된, 소수성 상호작용, H 결합, 반데르발스 또는 정전기적 상호작용을 기반으로 함) 둘 다를 기반으로 한 반응을 포함한다.

바람직한 양태에서, PEG계 전구체 분자는 문헌 [Ehrbar et al., 2007]에 설명된 가교결합 메커니즘에 의해 생리학적 조건하에 트롬빈 활성화된 인자 XIIIa를 사용하거나, 문헌 [Lutolf et al., 2003]에 설명된 바와 같은 가교결합 메커니즘에 의해 온화한 화학적 반응을 통해 가교결합될 수 있도록 선택된다.

하이드로겔 전구체 분자의 가교결합은 어레이의 개별 용적에서 연구되는 세포 유형의 존재하에, 세포가 하이드로겔 매트릭스에 의해 캡슐화되는 방식, 즉 별개의 세포 배양 미세환경에 존재하는 방식으로 수행된다.

세포 배양 미세환경으로부터의 다양한 기계적 및 생화학적 인자는 3D에서 증식/자기 재생, 분화, 이동 및/또는 콜로니 형성에 관하여 세포의 거동에 영향을 준다. 본 발명에 따른 어레이에서, 이들 인자는 용적마다 상이할 수 있고, 따라서 세포 유형에 대한 개별적인 인자 또는 인자들의 조합의 영향이 다수, 바람직하게는 수백 또는 수천개의 고유한 세포 배양 미세환경에서 동시에 연구되는 것을 가능하게 한다. 따라서, 세포 배양 미세환경에서 세포 운명에 대한 개별적인 인자의 역할이 체계적으로 분석될 수 있고, 특히 줄기 세포와 같은 배양이 어려운 세포 유형의 거동을 제어하는 하이드로겔 세포 배양 미세환경이 빠르게 확인될 수 있다.

본 발명에 따른 삼차원 하이드로겔 매트릭스의 기계적 특성은 세포 배양 미세환경의 중합체 함량뿐만 아니라 중합체 겔 전구체의 분자량 및/또는 작용성(가교결합에 이용할 수 있는 부위의 수)을 변화시킴으로써 바뀔 수 있다. 따라서, 예를 들면, 영률(E)로 표시되는 매트릭스의 강성도는 300 내지 5400 Pa로 다양할 수 있다.

추가로, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 또는 플라스민과 같은 세포 분비 프로테아제에 대한 상이한 감응성(즉, k_cat/K_m)의 펩티드의 매트릭스 내로의 도입을 통해 겔 매트릭스에 분해 특성을 부여함으로써, 매트릭스의 물리화학적 특성은 시간 경과에 따라 변화할 수 있다. 프로테아제에 대한 감수성 및 그 결과, 프로테아제가 세포에 의해 분비되는 경우, 매트릭스의 물리화학적 특성의 변화는 삼차원 매트릭스에서 효과적인 세포 증식 및 이동을 가능하게 한다. 단백질가수분해적 분해에 대한 상이한 감수성을 갖는 하이드로겔 매트릭스의 기계적 특성을 맞추기 위하여, 매트릭스의 전구체 함량은 매트릭스의 중합체 전구체 함량, 중합체 겔 전구체의 분자량 및/또는 작용성(가교결합에 이용가능한 부위의 수)을 변화시킴으로써 미세 조정될 수 있다. PEG계 하이드로겔 매트릭스에서, 프로테아제에 대한 감수성은, 예를 들면, 하기 더 상세하게 기재된 바와 같이, 세포 분비 프로테아제에 대하여 상이한 감응성을 갖는 상이한 펩티드 서열을 매트릭스 전구체 분자 내로 도입함으로써 변화될 수 있다.

세포 배양 미세환경의 생화학적 특성은 매트릭스에 대한 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 첨가에 의해 조절될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 이들 생물학적 활성 분자는, 예를 들면,

i) 세포외 매트릭스 유래(ECM) 인자;

ii) 세포-세포 상호작용 인자; 및/또는

iii) 세포 신호전달 인자

의 군으로부터 선택될 수 있다.

사용되는 세포외 매트릭스 유래 인자(i)는, 예를 들면, ECM 단백질, 예를 들면, 라미닌, 콜라겐, 엘라스틴류, 피브로넥틴 또는 엘라스틴, 프로테오글리칸, 예를 들면, 헤파린 설페이트 또는 콘드로이틴 설페이트, 비프로테오글리칸 다당류, 예를 들면, 히알루론산, 또는 매트릭스 세포 단백질(matricellular protein), 예를 들면, 단백질의 CN 패밀리의 것들, 피불린, 오스테오폰틴, 페리오스틴, SPARC 패밀리 멤버, 테나신, 또는 트롬보스폰딘일 수 있다. 이들 ECM 인자는 전체 길이 버전으로 또는 더 작은, 작용성 빌딩 블록, 예를 들면, 펩티드 또는 올리고당으로서 사용될 수 있다.

대부분 막횡단 단백질인, 사용되는 세포-세포 상호작용 단백질(ii)은 세포 세포 점착에 관련된 단백질, 예를 들면, 캐드헤린, 셀렉틴 또는 Ig 수퍼패밀리에 속하는 세포 부착 분자(CAM)(ICAM 및 VCAM) 또는 막횡단 세포 신호전달 체계의 구성원, 예를 들면, 노치(Notch) 리간드 델타 유사 및 재기드(Jagged)일 수 있다.

사용되는 세포 신호전달 인자(iii)는 성장 인자 또는 발달 모르포젠, 예를 들면, 하기 패밀리의 것들일 수 있다: 아드레노메둘린(AM), 안지오포이에틴(Ang), 자가분비 운동성 인자, 골 형성 단백질(BMP), 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 표피 성장 인자(EGF), 에리스로포이에틴(EPO), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 교세포주 유래 신경영양 인자(GDNF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포, 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 성장 분화 인자-9(GDF9), 간세포 성장 인자(HGF), 간암 유래 성장 인자(HDGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 백혈병 억제 인자(LIF), 이동 자극 인자, 마이오스타틴(GDF-8), 신경 성장 인자(NGF) 및 기타 뉴로트로핀, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 트롬보포이에틴(TPO), 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β) 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), Wnt 신호전달 경로, 태반 성장 인자(PlGF), 또는 사이토카인 또는 케모카인의 대분류의 멤버.

세포외 매트릭스 유래 인자(i) 및 세포-세포 상호작용 인자(ii)는 가교결합 전 또는 동안 하이드로겔 매트릭스에 부위 특이적으로 부착될 수 있다. 생물학적 활성 분자에 의한 겔 작용화는 생체분자의 유리 작용기(예를 들면, 아민 또는 티올 기) 또는 가교결합 효소(예를 들면, 트랜스글루타미나제)를 위한 펩티드 기질과 겔 네트워크 사이의 직접적인 공유 결합 형성에 의해, 또는 키메라/태그를 단 단백질의 도메인과 겔에 부착된 보조 단백질 사이의 친화력 결합을 통해 달성될 수 있다. 태그를 단 단백질은 단백질A(또는 단백질G, 단백질A/G), 스트렙타비딘(또는 뉴트르아비딘) 또는 NTA에 결합될 수 있는 Fc 태그, 비오틴 태그 또는 His 태그를 갖는 것들을 포함한다.

생체분자는 하이드로겔 네트워크에 대한 상이한 겔 테터링(tethering) 전략을 필요로 할 수 있다. 큰 ECM 유래 또는 ECM 모방 단백질 및 펩티드는 바람직하게는 선형, 이종이작용성 링커를 사용하는 비특이적 테터링에 의해 하이드로겔에 부착된다. 이러한 링커의 하나의 작용기는 중합체 쇄의 말단에 부착된 작용기, 바람직하게는 티올에 반응성이다. 링커의 다른 작용기는 이의 아민 기를 통해 흥미있는 생체분자에 비특이적으로 테터링할 수 있다. 후자 작용기는 석신이미딜 활성 에스테르, 예를 들면, N-하이드록시석신이미드(NHS), 석신이미딜 알파 메틸부타노에이트, 석신이미딜 프로피오네이트; 알데하이드; 티올; 티올 선택적 기, 예를 들면, 아크릴레이트, 말레이미드 또는 비닐설폰; 피리딜티오에스테르 및 피리딜디설피드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 NHS-PEG-말레이미드 링커는 생체분자에 부착된다.

세포 신호전달 인자(iii)는 공간적으로 분리된 영역에서 가용성 형태로 세포를 캡슐화하는 가교결합된 하이드로겔 매트릭스에 첨가될 수 있고, 따라서 매트릭스 내로 자유롭게 확산되어 세포에 도달하는 것이 가능하다. 대안적으로, 이들은 세포외 매트릭스 유래 인자(i) 및 세포-세포 상호작용 인자(ii)에 있어서 상기 기재된 바와 동일한 방식으로 매트릭스에 테터링될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기재된 바와 같은 어레이 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 이러한 방법은

a) 하나 이상의 상이한 하이드로겔 전구체 분자를 제공하는 단계;

b) 단계 a)에 따른 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합을 조합하고, 기판, 바람직하게는 멀티웰 플레이트의 개별 용적 상에 또는 내에 분주(dispense)하는 단계;

c) 상기 개별 용적에 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 첨가하고, 상기 분자를, 존재하는 하이드로겔 전구체 분자 또는 단계 e)에서 형성되는 하이드로겔 중 적어도 하나에 부착시키거나 이들이 자유롭게 확산되도록 하는 단계;

d) 세포를 상기 기판의 개별 용적 상에/내에 첨가하는 단계; 및

e) 상기 하이드로겔 전구체 분자를 가교결합하여 하이드로겔 매트릭스를 형성하는 단계

를 포함한다.

상기 기재된 방법의 단계 a)에서 사용되는 하이드로겔 전구체 분자는 바람직하게는 이에 생체분자가 테터링될 수 있고 세포 생존능을 위태롭게 하지 않는 메커니즘에 의해 가교결합될 수 있는 화학적 또는 효소적 반응성 중합체 PEG계 전구체이다. PEG계 전구체가, 예를 들면, 인자 XIIIa와 같은 트랜스글루타미나제를 위하여 (글루타민 및 리신 함유) 펩티드 기질을 포함하는 경우, 가교결합은 이러한 효소에 의하여 수행될 수 있다. 가장 바람직하게는, 전구체 분자는 또한 세포 매개된 하이드로겔 분해, 즉 시간에 따른 매트릭스의 구조적 및 기계적 특성의 국지적 변화를 가능하게 하기 위하여 상이한 단백질가수분해 감응성 펩티드 서열을 포함한다.

상기 기재된 방법의 단계 (b)는 바람직하게는, 다수의 상이한 세포 배양 미세환경을 갖는 3D 세포 함유 매트릭스를 제제화하는데 필요한 레벨의 다양성을 달성하고 또한 필요한 반복을 달성하기 위하여, 자동화된 겔 제작 방법 및 소형화된 샘플을 사용하여 수행된다. 이를 달성하기 위하여, 상업적으로 이용가능한 액체 핸들링 로봇은 바람직하게는 삼중으로, 완전하게 자동화된 방식으로, 기판, 예를 들면, 유리 슬라이드에서 또는, 바람직하게는, 멀티웰 플레이트, 예를 들면, 표준 1536 웰 플레이트 내에서, 바람직하게는 단계 a)에 따른 전구체 분자의 고유한 혼합물 각각의 100 내지 500 나노리터 만큼 낮은 용적을 정확하게 합성하는데 사용된다. 후자 형식은 선택되는 하이드로겔 액적의 이상적인 표면적 대 용적 비율을 나타내고 다양한 실험 설정에 맞출 수 있는 표준 형식을 나타내기 때문에 바람직하다. 일단 3D 하이드로겔 매트릭스가 생성되면, 시스템은 다중 판독이 평행하게 수득될 수 있는 다중모드 검정 플랫폼으로서 기능할 수 있다.

상기 기재된 방법의 단계 c)에서, 생물학적 활성 분자는 하기 기재된 바와 같이 선택된다.

단계 e)에서 삼차원 하이드로겔 매트릭스를 형성하는 하이드로겔 전구체 분자의 가교결합은 하나 이상의 가교결합제를 사용하여 달성될 수 있다. PEG계 전구체 분자가 사용되는 경우, 트롬빈 활성화된 인자 XIIIa 또는 MMP 감응성 기질을 함유하는 화학적 반응성 2작용성 올리고펩티드(문헌 [Lutolf et al., 2003]에 기재된 바와 같음)는 선택되는 가교결합제이다. 그러나, 또한 가교결합은 서로를 향해 용이하게 반응할 수 있는 두 상이한 전구체 분자의 조합에서 즉시 발생할 수 있는 것이 가능하다(예를 들면, 매우 선택적인 소위 클릭(click) 화학 또는 기타 화학적, 효소적으로 촉매된 것이 아닌 반응, 예를 들면, 마이클형 첨가 반응).

분주된 하이드로겔 전구체의 어레이는 저장되고 후속 시점에서 사용될 수 있다(즉, 선별 실험을 위해 세포와의 접촉이 야기된다). 저장은 바람직하게는 멀티 웰 플레이트(예를 들면, 96, 384 또는 1536 웰 플레이트)에서 수행되고, 용액(가교결합제를 아직 함유하지 않음) 중의 전구체 또는, 그렇지 않으면 동결건조된 전구체, 즉 분말을 사용하여 수행될 수 있다. 분말은 반응하지 않거나 반응하지 않은 채로 남아 있고, 이는 전구체의 구조적 성분(예를 들면, PEG) 중 대부분이 가교결합제와 반응하지 않음을 의미한다. 예를 들면, 버퍼가 첨가되면, 동결건조된 전구체는 용해된 다음, 서로 반응할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 세포 성장 거동에 대한 하이드로겔 제제의 영향을 테스트하는 조합적 방법에 관한 것이다. 특히, 이러한 조합적 방법은

b) 단계 a)에 따른 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합을 조합하고, 기판, 바람직하게는 멀티웰 플레이트의 개별 용적 상에/내에 분주하는 단계;

d) (목적하는 세포 유형의) 세포를 상기 기판의 개별 용적 상에/내에 첨가하는 단계;

e) 상기 하이드로겔 전구체 분자를 가교결합하여 하이드로겔 매트릭스를 형성하는 단계;

f) 상기 세포가 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 개별 용적 내에서 성장하도록(및 이들의 거동이 변화하도록) 하는 단계;

g) 단계 f) 동안 시간 경과에 따라 상기 세포를 모니터링하는 단계;

h) 상이한 세포 배양 미세환경에 대한 거동을 측정하는 단계로서, 여기서 거동은, 바람직하게는 상이한 세포 배양 미세환경의 전체 어레이에 대하여, 바람직하게는 증식, 콜로니 형성, 분화, 이동, 또는 이들의 조합의 정도로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계;

i) 임의로, 바람직하게는 프로테이나제에 의한, 개별 세포 배양 미세환경의 효소적 분해에 대한 감수성 및/또는 기계적 특성 및/또는 생물학적 활성 분자의 서로에 대한 상승작용적 및/또는 길항적 효과를 측정하는 단계;

j) 임의로, 특정한 세포 거동을 지시하는 특이적 하이드로겔 제제, 또는 하이드로겔 제제의 범위를 확인하는 단계;

k) 임의로, 추가의 분석, 바람직하게는 표현형 검정, 또는 연속 세포 배양 또는 계대배양을 위하여 하나 이상의 하이드로겔 세포 배양 미세환경으로부터 세포를 단리하는 단계

를 포함한다.

단계 a)에서 사용되는 상이한 하이드로겔 전구체 분자는 바람직하게는 본원에 달리 기재된 바와 같이 선택된다.

상기 기재된 조합적 방법의 단계 b)는 바람직하게는 본원에 달리 기재된 바와 같은 자동화된 방법을 사용하여 수행된다.

상기 기재된 조합적 방법의 단계 c)에서, 언급된 생물학적 활성 분자는 본원에 달리 기재된 바와 같이 선택될 수 있다.

단계 e)에서, 단계 a)에서 제공된 하이드로겔 전구체 분자의 가교결합은 본원에 달리 기재된 바와 같이 달성될 수 있다.

조합적 방법 단계 f)에서, 세포는, 바람직하게는 수 일 내지 수 주 동안, 하이드로겔 매트릭스의 개별 용적 내에서 증식하고/자기 재생하거나 콜로니를 형성하거나 분화하거나 이동하는 것이 허용된다.

조합적 방법 단계 g)에서 세포 거동의 모니터링은 고정된 시간 간격으로, 예를 들면, 특정 일수가 지난 후, 반복적으로 이루어질 수 있다. 모니터링은, 예를 들면, 자동화된 이미징 기술, 통상적인 또는 공초점 현미경을 사용하여 수행되고, 저속 촬영 이미징을 포함할 수 있다.

조합적 방법 단계 h)에서 상이한 세포 배양 미세환경에 대한 증식/자기 재생, 콜로니 형성, 분화, 및/또는 이동 거동의 측정은, 예를 들면, 형광 마커, 예를 들면, 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 세포 또는 형광 항체를 사용하는 면역염색 세포를 사용하고, 예를 들면, 자기 재생 또는 분화에 의해, 이들이 성장하고 이들의 거동이 변화함에 따라 형광 강도를 정량하거나, 현미경을 사용하여 3D에서 단일 세포의 다세포 콜로니로의 발달을 정량함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 각각의 개별 세포 배양 미세환경에서 성장하는 세포 수 및 동역학을 판독함에 있어서, 리포터 유전자 발현의 레벨, 또는 세포 및 세포 콜로니 성장의 삼차원 형태학이 수득될 수 있다. 기타 형태학적 측정, 예를 들면, 세포 또는 콜로니 이심률, 견고함, 극성의 정도는 평가되고 정량될 수 있다. 이들 측정의 가변성이 또한 정량화되어 불균질성의 척도를 평가할 수 있다.

조합적 방법 단계 i)에서 다양한 세포 배양 미세환경의 전체 어레이의 세포 거동의 정량화는 목적하는 적용에서 3D 세포 배양을 위하여 추가로 사용되고 규모 증가될 수 있는 하나 이상의 하이드로겔 제제를 수득할 수 있다.

단계 j)에서, 필요한 경우, 특이적 세포 배양 미세환경을 소화시켜 세포를 채취할 수 있다. 세포 채취는 연속 세포 배양/계대배양뿐만 아니라 다운스트림 표현형 검정, 예를 들면, 유세포분석, 유전자 발현 분석, 생체내 검정 등에 유용하다.

본 발명의 또 다른 측면은 임의로 본원에 기재된 바와 같고 상기 기재된 바와 같은 조합적 방법에 적합한 3D 하이드로겔 마이크로어레이의 제조 및 사용을 위한 부품 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 개별적인 구성요소로서

a) 하나 이상의 하이드로겔 전구체 분자, 바람직하게는 하나 이상의 멀티암 PEG 분자(본원에 달리 기재된 바와 같음);

b) 하나 이상의 생물학적 활성 분자(본원에 달리 기재된 바와 같음);

c) 임의로, 전구체 분자 a)를 위한 하나 이상의 가교결합제(본원에 기재된 바와 같음); 및

d) 바람직하게는 상기 기재된 방법에 따른, 상기 구성요소의 사용에 대한 설명서

를 포함한다.

부품 키트 내에서 구성요소 a) 내지 c)의 사용에 대한 설명서 d)는 상기 구성요소들과 함께 포장되고, 삼차원 매트릭스의 제조 방법뿐만 아니라 상기 기재된 바와 같은 세포 증식 및/또는 분화에 대한 하이드로겔 세포 배양 미세환경의 영향을 연구하는 조합적 방법에 따른 설명을 제공한다.

요약하면, 본 발명자들은 본 발명의 과정 동안 다양한 도전과 직면하였고, 이러한 장해물을 적절하게 극복하는 가장 유망한 가능성을 쉽게 예측할 수 없었다:

1. 액체 하이드로겔 전구체 특성 및 제조에 관한 요건

1.1 고처리량 루틴을 가능하게 하기 위하여, 하이드로겔 전구체는 자동 액체 핸들링 로봇 공학과 혼화성이어야 한다. 재현가능하게 분주되기 위하여, 이들은 너무 점성이 있거나 너무 끈적거려서는 안된다. 물의 점성부터 10 내지 40 kDa의 분자량의 PEG의 10%(w) 수성 용액의 점성까지의 액체의 점성 범위가 확실한 분주에 사용될 수 있는 것으로 확인되었다. 단백질 또는 당(예를 들면, 마트리겔(Matrigel)™, 콜라겐, 피브린, 라미닌, 히알루론산 등, 즉, 최신 기술 및 3D 세포 배양에서 가장 일반적으로 사용되는 겔)을 기반으로 한 천연 유래 하이드로겔 네트워크의 대부분의 전구체는 이들이 이러한 요건을 만족하지 못하기 때문에 확실하게 분주될 수 없다. 이들 가장 일반적으로 사용되는 겔 제제는 개념을 실천으로 바꾸는데 사용될 수 없었다. 상기 언급된 점도 범위는, 예를 들면, 단백질 또는 당이 아니라 친수성 중합체, 가장 바람직하게는 전구체 농도 범위 1 내지 10%(w/v)를 형성하는, 2000 내지 5000 kDa의 분자량의 3 내지 8개의 팔을 갖는 분지된 폴리(에틸렌 글리콜) 분자를 기반으로 한 하이드로겔 골격을 사용하여 달성될 수 있다.

1.2 하이드로겔 전구체는 안정하여야 하고, 실온에서 자발적으로 겔이 되거나 광에 노출시 자발적으로 반응하지 말아야 한다. 천연 유래 하이드로겔 네트워크(예를 들면, 마트리겔™, 콜라겐, 피브린)의 대부분의 전구체는 실온 또는 심지어 더 낮은 온도에서 자발적으로 겔이 된다. 추가로, 합성 하이드로겔(예를 들면, 광중합 PEG 겔)의 많은 전구체는 광 감응성이고, 따라서 자발적으로 겔을 형성한다. 이들 가장 일반적으로 사용되는 겔 제제는 개념을 실천으로 바꾸는데 이상적이지 않다. 자발적인 겔화를 방지하기 위하여, 효소 반응을 기반으로 한 가교결합 반응, 바람직하게는 트랜스글루타미나제를 기반으로 한 반응이 사용될 수 있고, 이러한 경우, 활성 효소는 마이크로어레이 제조의 가장 마지막 단계에서(즉, 조합적 혼합의 수행 후), 또는 가교결합 효소의 활성에 필수적인 칼슘이 결핍된 용액 중에 첨가될 수 있고, 또는 플레이트를 약 10℃ 이하로 냉각시켜 효소적 가교결합 반응을 극적으로 느리게 함으로써 첨가될 수 있다.

1.3 액체 전구체의 겔화의 개시를 위한 제어가능한 촉발 사건이 존재하여야 한다. 구체적으로, 이러한 겔화 촉발 성분의 첨가 전 성분의 혼은 비반응성이어야 한다. 이는 천연 유래 하이드로겔 네트워크의 경우가 아니고, 이들 제제는 따라서 개념을 실천으로 바꾸는데 이상적이지 않다. 상기 언급된 촉발 사건은, 예를 들면, 가교결합을 유도하는 효소, 바람직하게는 트랜스글루타미나제 패밀리의 멤버인 효소의 첨가, 효소가 불활성이 되도록 칼슘 결핍인 용액에 칼슘의 첨가, 또는 약 10℃에서 실온으로 플레이트를 가열함으로써 효소 가교결합 반응을 촉발하는 것일 수 있다.

1.4 하이드로겔 형태로 고체화되기 전에, 물질이 액체 형태로 자유롭고 제어가능하게 조작되어야 하는 경우, 액체 전구체의 활성화 사이에 제한된 기간이 존재하여야 한다. 구체적으로, 물질은 실온에서 액체 형태로 취급되는 것이고, 최종 플레이트에 분주되기 위해 필요한 전형적인 시간인 2 내지 4분의 최소 시간 기간 동안 겔이 되지 말아야 한다. 3D 세포 배양에서 가장 일반적으로 사용되는 겔 제제에서, 중합 동역학은 제어가능하지 않고, 이러한 설정 시간 기간은 존재하지 않는다. 이들 제제는 따라서 개념을 실천으로 바꾸는데 이상적이지 않았다. 본 발명의 내용에서, 이러한 문제점은 바람직하게는 가교결합 효소에 의한 겔화 촉발에 의해 극복되고, 이는 추가로 온도 감응성이고(즉, 온도가 감소함에 따라 비활성화될 수 있음), 성공적인 분주를 위하여 점성이 너무 높아지기 전에 시간 기간의 길이를 조정하는 강력한 수단을 제공한다. 본 발명의 내용에서 사용되는 가장 적합한 효소는 트랜스글루타미나제의 패밀리의 멤버, 가장 바람직하게는 트롬빈 활성화된 인자 XIIIa이다.

2. 고체 하이드로겔 특성에 관한 요건

2.1 최종 겔 물질은 비팽창 및 비수축이어야 한다. 팽창 또는 수축은, 이들이 놓인 배지 중에서 평행에 도달된 후, 전구체 용액(플레이트 내로 분주되는 것) 용적과 하이드로겔 사이의 용적에서 증가 또는 감소에 따라 본원에서 정의된다. 구체적으로, 물과 평형인 겔의 최종 용적을 합성 직후 겔의 용적(즉, 전구체 용액의 용적에 상응함)으로 나눔으로써 정의되는 팽창 비율은 80 내지 130%이어야 한다. 특히, 물 중의 하이드로겔 팽창은 전형적으로 하기와 같이 측정된다: 겔을 합성하고(전형적으로 용적 25 ㎕), 탈이온수 1 ㎖ 중에서 48시간 동안 팽창 전 및 후, 동결 건조 후, 밀도 측정 키트를 사용하여, 공기 및 에탄올 중에서 중량 측정하였다. 아르키메데스 부력 원리를 기반으로 하여, 가교결합 후 겔 용적(Vg,c) 및 팽창 후 겔 용적(Vg,s)을 측정하였다. Vg,s/Vg,c 비율은 팽창 비율로서 정의된다. 이러한 요건의 부족은 비균질 물질 특성, 물질 변형 및 기판으로부터 겔 탈착 가능성을 야기할 수 있고, 이는 각각 당해 개념을 실천으로 바꾸는데 유해하다. 본 발명자가 아는 한, 모두는 아니지만 대부분의 합성 하이드로겔 시스템은 가교결합 후 과도하게 팽창하고, 따라서 당해 개념을 실천으로 바꾸는데 이상적으로 사용될 수 없었다. 본 발명자들은 비팽창 및 비수축인 겔을 확인하기 위하여 중합체 전구체 건축(즉, 작용성 및 분자량)을 조작하였다. 구체적으로, 분지된 친수성 중합체, 가장 바람직하게는 각각 분자량 5000 kDa의 8개의 팔(즉, 8개의 작용기)을 갖고 트랜스글루타미나제 가교결합 효소를 위한 펩티드 기질을 보유하는 폴리(에틸렌 글리콜) 매크로머로부터 형성된 하이드로겔은, 1 및 10%(w/v) 범위의 전구체 농도에서 형성시, 본 발명자들에 의해 (기타 매크로머 건축 및 가교결합 반응의 큰 라이브러리로부터) 이러한 비팽창 및 비수축 기준을 만족시키는 것으로 확인되었다.

2.2 최종 겔 물질은 이의 생화학적 특성(즉, 분해도 및 신호전달)과는 독립적으로 제어가능한 생물물리학적 특성(즉, 강성도)을 가져야 한다. 구체적으로, 중합체 함량 변화에 의한 겔 특성 변경은 분해도를 변화시키지 않아야 한다. 3D 세포 배양에서 가장 일반적으로 사용되는 겔(예를 들면, 마트리겔™, 콜라겐, 피브린, 라미닌)은 이의 생화학적 특성과 독립적으로 겔의 생물물리학적 특성을 변화시키는 것을 허용하지 않고, 따라서 당해 개념을 실천으로 바꾸는데 이상적으로 사용될 수 없었다. 본 발명자들은 강성도에서의 변화가 중합체 함량에서의 변화에 선형적으로 의존적인 하이드로겔 시스템을 조작함으로써 당해 문제점을 해결하였다. 겔 골격이 상이한 프로테아제 기질의 도입을 통해 겔의 분해도를 변화시키는 경우, 이러한 선형성은 상이한 분해도를 갖는 겔의 생물물리학적 특성을 정밀하게 맞추는 것을 가능하게 한다.

2.3 최종 겔 물질은 전체적인 비특이적 분해(즉, 전체 겔 조각이 용해됨)보다는 겔 골격의 매우 국지화된 붕괴(즉, 겔내에 구멍이 생성됨)에 의해 분해되어야 한다. 많은 일반적으로 사용되는 합성 하이드로겔 물질, 예를 들면, 가수분해적으로 불안정한 에스테르 결합을 포함하는 것들(예를 들면, 아크릴레이트 기를 통해 형성된 PEG 겔)은 비국지화된 메커니즘에 의해 분해된다. 게다가, 3D 세포 배양에서 많은 일반적으로 사용되는 겔(예를 들면, 마트리겔™ 또는 피브린)은 전체적으로 및 비특이적으로 용해되고(마트리겔™은 특히 제어불가능한 분해의 경향이 있음), 따라서 당해 개념을 실천으로 바꾸는데 이상적으로 사용될 수 없었다. 본 발명의 내용에서, 겔 골격의 매우 국지화된 붕괴는 세포막에 앵커링(anchoring)된 세포 분비 프로테아제(예를 들면, 막 결합 프로테아제)가 세포 뒤가 아닌 세포 표면에 아주 근접하게 있는 하이드로겔을 절단하도록, 분지된 친수성 중합체의 말단에 부착된 프로테아제 기질을 하이드로겔 네트워크의 골격에 위치시킴으로써 달성된다. 바람직하게는, 세포 분비 MMP에 대한 상이한 감응성(즉, k_cat/K_m)의 펩티드의 도입을 통해, 이러한 겔에 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)에 의한 분해 가능성을 부여한다.

2.4 최종 겔 물질은 생화학적 인자(예를 들면, 단백질 또는 펩티드)가 부착시 이들의 생물활성이 감소되지 않고 이에 부착되도록 하여야 한다. 게다가, 생화학적 인자의 부착은 생물물리학적 겔 특성에 영향을 미치지 말아야 한다. 많은 일반적으로 사용되는 합성 하이드로겔 물질은 생화학적 인자의 작용적 도입과 비혼화성이거나 인자 도입시 이들의 생물물리학적 특성을 변경하는 가교결합 화학을 통해 형성되고; 이들 시스템은 따라서 당해 개념을 실천으로 바꾸는데 이상적으로 사용될 수 없었다. 게다가, 3D 세포 배양에서 가장 일반적으로 사용되는 겔(예를 들면, 마트리겔™, 콜라겐, 피브린, 라미닌)은 구체적으로 생화학적 인자를 도입하는 것을 허용하지 않고, 따라서 당해 개념을 실천으로 바꾸는데 이상적으로 사용될 수 없었다. 본 발명자들은 최종 겔의 강성도를 20% 이상 변경하지 않고 단백질 1 mg/㎖ 또는 펩티드 1 mM 이하로 부착하도록 합성 하이드로겔 시스템을 조작하였다. 이는 바람직하게는 가교결합 전 또는 동안 하이드로겔 매트릭스에 대한 생화학적 인자 부위 특이적 부착에 의해 달성된다. 생물학적 활성 분자와 함께 겔 작용화는 생체분자의 유리 작용기(예를 들면, 아민 또는 티올 기) 또는 가교결합 효소(예를 들면, 트랜스글루타미나제)를 위한 펩티드 기질과 겔 네트워크 사이의 직접적인 공유 결합 형성에 의하여, 또는, 바람직하게는 감응성 세포 신호전달 단백질의 경우, 키메라/태그를 단 단백질의 도메인과 겔에 부착된 보조 단백질 사이의 친화력 결합을 통하여 달성될 수 있다. 태그를 단 단백질은 단백질A(또는 단백질G, 단백질A/G), 스트렙타비딘(또는 뉴트르아비딘) 또는 NTA에 결합할 수 있는 Fc 태그, 비오틴 태그 또는 His 태그를 갖는 것들을 포함한다. 생체분자는 하이드로겔 네트워크에 대한 상이한 겔 테터링 전략이 필요할 수 있다. 큰 ECM 유래 또는 ECM 모방 단백질 및 펩티드는 바람직하게는 선형, 이종이작용성 링커를 사용하는 비특이적 테터링에 의해 하이드로겔에 부착된다. 이러한 링커의 하나의 작용기는 중합체 쇄에 말단에 부착된 작용기, 바람직하게는 티올에 반응성이다. 링커의 다른 작용기는 이의 아민 기를 통해 흥미있는 생체분자에 비특이적으로 테터링할 수 있다. 후자 작용기는 석신이미딜 활성 에스테르, 예를 들면, N-하이드록시석신이미드(NHS), 석신이미딜 알파 메틸부타노에이트, 석신이미딜 프로피오네이트; 알데하이드; 티올; 티올 선택적 기, 예를 들면, 아크릴레이트, 말레이미드 또는 비닐설폰; 피리딜티오에스테르 및 피리딜디설피드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 NHS-PEG-말레이미드 링커는 생체분자에 부착된다.

2.5 최종 겔 물질은 전형적으로 플라스틱 또는 유리인 마이크로어레이 기판에 점착되어야 한다. 구체적으로, 이러한 기판은 처리 또는 미처리 유리 현미경 슬라이드, 표준 조직 배양 처리 또는 미처리 감마 조사 세포 배양 플라스틱 랩웨어(labware), 처리 또는 미처리 웰 플레이트, 처리 또는 미처리 고밀도(384, 1536 웰) 세포 배양 플레이트이다. 요건의 부족은 겔 탈착 및 테스트 샘플의 손실을 야기할 수 있다. 많은 일반적으로 사용되는 합성 하이드로겔 물질은 이러한 표면에 점착되지 않고, 따라서 당해 개념을 실천으로 바꾸는데 사용될 수 없었다. 팽창하거나 수축하지 않는 하이드로겔 물질은 상기 기재된 바와 같은 기판에 바람직한 점착을 갖는 것으로 확인되었다. 구체적으로, 분지된 친수성 중합체, 가장 바람직하게는 각각 분자량 5000kDa의 8개의 팔(즉, 8개의 작용기)를 갖고 트랜스글루타미나제 가교결합 효소에 대한 펩티드 기질을 보유하는 폴리(에틸렌 글리콜) 매크로머로부터 형성된 하이드로겔은, 1 내지 10%(w/v) 범위의 전구체 농도에서 형성시, 본 발명자들에 의해 (기타 매크로머 건축 및 가교결합 반응의 큰 라이브러리로부터) 이러한 비팽창 및 비수축 기준을 만족시키는 것으로 확인되었다.

3. 나노리터/마이크로리터 규모의 로봇 분주에 관한 요건

3.1 로봇 액체 핸들링 기구는 큰 액체 용적을 정밀하게 혼합하는 능력뿐만 아니라 공간적으로 다룰 수 있는 형식으로 나노리터 범위 액적을 분주하는 능력을 가져야 한다. 대부분의 상업적으로 이용가능한 액체 핸들링 기계는 나노리터 범위의 정밀성으로는 분주가 가능하지 않다. 추가로, 액체 핸들링 기구는 광범위하게 상이한 점도의 액체에 대하여 정밀성을 유지하여야 한다. 구체적으로, 기구 용적은 물의 점도 내지 10% PEG의 점도의 액체 점도 범위를 유지하여야 한다. 상업적으로 이용가능한 액체 핸들링 로봇은 바람직하게는 50 나노리터(정밀성에서 최대 +/- 1% 오차) 만큼 낮은 용적을 정확하게 분주하는데 사용된다.

3.2 마이크로리터 및 특히 나노리터 용적 범위에서 겔 증발을 회피하기 위한 전략이 개발되어야 하고, 이는 매우 지루한 최적화 작업 및 프로토콜 개발이 필요하다. 구체적으로, 증발은 분주과 겔화된 샘플에 대한 배지 첨가 사이의 시간 동안 회피되어야 한다. 구체적으로, 전구체/겔의 작은 용적(약 100 nl - 1 uL) 증발은 대략 20분 동안 회피되어야 한다. 구체적으로, 혼합 및 분주는 제어된 온도 및 습도, 특히, 예를 들면, 25℃ 및 30% 상대 습도에서 수행되어야 하고, 이로부터, 예를 들면, 6℃의 이슬점 온도가 계산되고 냉각 블록이 설정된다. 구체적으로, 기판(전형적으로 멀티웰 플레이트)의 온도는 냉각 블록의 사용에 의해 제어되어야 한다. 구체적으로, 주위 온도 및 주위 상대 습도가 이슬점을 계산하는데 사용되고, 냉각 블록은 이슬점으로 설정된다. 구체적으로, 플레이트는 다중 분주 단계가 수행되는 동안 이슬점으로 유지되어야 한다. 구체적으로, 모든 겔 분주 단계가 수행된 후, 플레이트는 20분 동안 인큐베이터(37℃, 5% CO₂)에서 위를 향해 놓아 증발이 방지되는 동안 완전한 겔화를 가능하도록 하여야 한다. 구체적으로, 겔화가 완료된 후, 플레이트는 빠르게(약 1분) 소량의 기준선 배지(전형적으로 1536 웰 플레이트의 경우 1 ㎕)로 채워져야 한다. 추가로, 검정 과정 동안, 배지는 빠르게 교환되어야 한다. 구체적으로, 배지는 원심분리(약 200-300g)에 의해 플레이트로부터 회전 방출될 수 있다.

3.3 겔 전구체 액체 혼합은 정밀하게 정의된, 계층적으로 정돈된 순서로 수행되어야 하고, 이는 일부 지루한 최적화 작업 및 프로토콜 개발이 필요하다. 이는 과도한 계획 및 최적화 작업을 필요로 한다. 구체적으로, 개별적으로 프로테아제 감응성 중합체 전구체 스톡 용액은 먼저 상이한 농도로 희석되어야 한다. 그 다음, 생화학적 인자, 예를 들면, 단백질 및 펩티드를 용액에 가한 후, 세포 및 바람직하게는 가교결합 효소인 가교결합 유도제를 첨가해야 한다. 이 순서를 따르는 것의 실패는 다양한 물리적 및 화학적 특성 사이에서 독립성의 손실 및 개념을 실천으로 바꾸는 것의 실패를 야기할 수 있다. 부정확한 순서는 또한 단백질의 부정확한 농도, 부정확한 세포 밀도 또는 시기가 이른 겔화를 야기할 수 있다.

3.4 겔내의 세포 밀도 및 균질한 3D 분포가 보장되어야 하고, 이는 일부 지루한 최적화 작업 및 프로토콜 개발을 필요로 한다. 구체적으로, 분주 시간 및 가교결합제의 첨가에 대한 지연이 최적화되어야 한다. 추가로, 겔 용적은 특이적 기판 형식에 대해 최적화되어, 소형화된 최소 용적을 유지하면서 최적의 세포 생존능(확산에 의해 제한됨) 및 증발 방지가 보장되어야 한다. 구체적으로, 겔 용적은 전형적으로 1536 웰 플레이트의 웰에 대하여 1 ㎕이고, 이는 대략 500 ㎛의 겔 높이를 야기한다.

이하, 본 발명의 양태는 양태에 의하여 더 상세하게 설명될 것이다.

분자 빌딩 블록의 도구 키트로부터의 3D 신호전달 세포 배양 미세환경의 어레이의 생성

본 발명에 따른 세포 미세환경의 삼차원 선별을 실현시키기 위하여, 독립적으로 혼합되고 세포의 존재하에 가교결합될 수 있는 분자 빌딩 블록의 라이브러리로 구성된 생체물질 시스템을 조작하여, 별개의 독립적으로 제어가능한 특성의 삼차원 세포 미세환경의 무한한 다양성을 잠재적으로 형성하는 것이 유용함이 입증되었다. 본 발명은 매우 잘 정의된 생화학적 및 기계적 특성(Lutolf and Hubbell, 2005)을 갖는 생체모방 삼차원 세포 미세환경으로서 합성 하이드로겔을 기반으로 하여 수행될 수 있음이 확인되었다. 바람직하게는, 응고 효소 활성화 트랜스글루타미나제 인자 XIIIa(FXIIIa)는 본 발명의 내용에서 생리학적 조건(도 1a 참조)(Ehrbar et al., 2007) 하에 멀티암 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)계 예비중합체를 3D 하이드로겔 네트워크 내로 가교결합시키는데 사용된다. 실제로, 이러한 PEG계 하이드로겔로 캡슐화된 단일 마우스 ESC는 젤라틴 코팅된 플라스틱에서 표준 배양 조건(92.5±3.6%)과 유의미하게 상이하지는 않은(p=0.44) 매우 우수한 생존능(89.1±7.3%)을 나타내는 것으로 확인되었고, 결과는 상세하게 도시되지 않는다. 겔 캡슐화된 단일 ESC는 실험 시작부터 서로 물리적으로 분리되어 있고, 시간이 지나도 계속 유지되며, 이로써 클론 엔티티로서 증폭된다. 삼차원에서 효율적인 성장을 허용하기 위하여, 분해를 위한 프로테아제 기질 부위(Lutolf et al., 2003; Patterson and Hubbell, 2010)(도 1a 참조)를 보유하는 겔을 설계함으로써, 겔에 세포 분비 단백질가수분해 리모델링에 대한 감수성을 부여할 수 있다. 게다가, 올리고펩티드 또는 단백질과 같은 생물학적 활성 분자는 가교결합 동안 매트릭스에 부위 특이적으로 부착될 수 있다(도 1a). 다양한 하이드로겔 매트릭스를 제조하기 위한 이러한 분자 "도구 키트"는 상이한 3D 세포 미세환경의 매우 큰 조합적 공간의 탐색을 효율적으로 허용한다.

원리 증명으로서, 삼차원 생체내 미세환경의 5종의 주요 신호 유형을 제조하였고, 각각 이들 특성은 독립적으로 다양할 수 있었다(도 1b 참조): 매트릭스 기계적 특성(약칭 "MP"), 단백질가수분해적 분해에 대한 감수성("DG"), 세포외 매트릭스 유래 단백질("EC"), 세포-세포 상호작용 단백질("CC") 및 가용성 인자("SF"). 중합체 함량을 다양하게 하여, 겔의 강성도(영률, E로 나타냄)를 약 300 내지 5400 Pa로 특정하고(Ehrbar et al., 2011)(도 1b), 이는 연조직의 생리학적 해당 범위이다(Engler et al., 2006). 세포 분비 MMP(Lutolf et al., 2003)에 대한 상이한 감응성(즉, k_cat/K_m)의 펩티드의 도입을 통해, 겔에 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)에 의한 상이한 분해 가능성을 부여하였다. 중요하게, 상이한 MMP 기질 펩티드에 의하여 가교결합되는 겔의 기계적 특성을 완벽하게 맞추기 위하여, 전구체 함량을 조절하였다. 따라서 이러한 합성 겔 시스템의 주요 기계적 및 생화학적 특성은 독립적으로 제어되었다. 매트릭스의 세포 신호전달 특성을 시스템적으로 조절하기 위하여, ESC 만능성을 조절하는데 이전에 연관되었고 본 발명의 내용에서 겔에 효소적으로 테터링되는 ECM과 재조합 성장 인자 단백질의 세트를 선택하였다(도 1b 참조). 라미닌, 피브로넥틴 및 콜라겐 IV와 ESC의 상호작용은 2D에서 만능성의 손실과 이전에 연관되었다(Prudhomme et al., 2004). 그러나, 삼차원 배양 시스템에서 펩티드 아날로그에 의한 이들의 인테그린 호모다이머의 결찰은 이들이 자기 재생의 유지를 대신 촉진할 수 있다는 것을 지시하였다(Lee et al., 2010). 추가로, 작업 본체의 증가는 자기 재생의 매개체로서 세포 세포 신호전달에 포함된 막횡단 단백질을 가리켰다: E-캐드헤린, EpCam 및 재기드가 대표적인 예로서 본원에서 선택되었다(Andrews et al., 2008; Gires et al., 2009; Soncin et al., 2009). 최종적으로, 가용성 ESC 조절 인자 백혈병 억제 인자(LIF), 골 형성 단백질 4(BMP4) 및 섬유아세포 성장 인자 4(FGF4)(Prudhomme et al., 2004; Qi et al., 2004; Ying et al., 2003)는 이들이 겔 네트워크의 확산 특성을 통해 캡슐화된 세포에 도달할 수 있도록 혈청 무함유 배지 제제에 사용되었다. 본 발명의 양태에서, 5개의 범주 각각에 대하여 4개의 조절 레벨이 특정되었고, 이는 1024 고유한 조건의 총 파라미터 공간을 야기한다(도 1c). 추가로, 자가분비 효과에 의한 ESC 운명의 중요 조절자로서 점점 더 인식되는 세포 밀도는 당해 실험 설정에서 규정될 수 있을 뿐만 아니라 하기 증명된 바와 같이 소급적으로 이미징될 수 있다. 삼차원 세포 함유 매트릭스를 제제화하는데 이러한 레벨의 복잡성뿐만 아니라 필요한 반복은 바람직하게는 샘플 용적의 소형화 및 자동화된 겔 제작 방법의 맞춤화(도 1c 참조) 및 세포 운명 분석(도 1d 참조)에 의하여 실천으로 바뀐다. 구체적으로, 상업적으로 이용가능한 액체 핸들링 로봇은 삼중으로 각각 고유한 조건 1 ㎕를, 완벽하게 자동화된 방식으로, 유리 슬라이드(도시되지 않음)에서 또는 표준 1536 웰 플레이트(도시되지 않음) 내에서, 정확하게 합성하는데 사용되었다. 후자 형식은 선택되는 하이드로겔 액적에 있어서 이상적인 표면 대 용적 비율을 나타내고 다양한 실험적 설정에 맞춤화될 수 있는 표준 형식을 나타내도록 선택되었다. 일단 삼차원 겔 어레이가 생성되면, 시스템은 다중모드 검정 플랫폼으로서 기능할 수 있고, 여기서 다중 판독은 평행적으로 수득될 수 있다.

ESC 운명은 3D 세포 배양 미세환경의 조성에 매우 의존적이다

상기 삼차원 세포 배양 미세환경 어레이에 대한 ESC 자기 재생 및 분화의 정량적 정보를 수득하기 위하여, 자동화된 이미징 및 이미지 분석(도 1d 참조)과 함께, Oct4-GFP 리포터 세포주를 사용하였다. 전사 인자 Oct4는 ESC 만능성의 마커로서 광범위하게 고려된다(Niwa et al., 2000). 삼차원 매트릭스 내에 삽입된 세포는 접종 후 일에 이미징되어 각각의 웰에 대하여 세포의 정확한 초기 개수를 수득하였다. 가장 관대한 조건에서, 이들 세포는 3일 내에 구형 콜로니를 형성하였고, 5일 후 고정될 때까지 증식을 유지하였다(도 1d, 좌측 패널 참조). 공초점 현미경은 이들 조건에서 콜로니 성장이 두께 대략 500㎛의 진정한 삼차원 공간 내인 것을 확인시켜 주었다(도 1d, 중간 패널 참조). 하이드로겔의 완벽한 3D 건축의 자동화된 이미징을 효율적인 이미지 분석 파이프라인과 조합하여 다수의 형태학적 판독을 수득하였다. 콜로니 면적은 증식의 척도로서, GFP 강도는 ESC 만능성의 척도로서 수득하였다(도 1d, 우측 패널 참조). 모든 고유한 매트릭스 작동인자(즉, MP, DG, EC, CC 및 SF) 조합에 있어서, 콜로니 면적 및 GFP 강도를 삼중 반복의 평균으로서 계산하였다. 각각 평균값은 정사각형으로서 나타내고 색상을 제공하고(적색은 상대적으로 높은 값을 나타내고 청색은 상대적으로 낮은 값을 나타냄), 모든 값/정사각형은 입력 조건에 의해 정리되고, 이로써 열지도 표시가 발생된다(도 2a 참조). 일반적으로, 가용성 인자 조절은 높은 증식 및 자기 재생 둘 다를 야기하는 LIF를 갖고, FGF4 및 BMP4에 대한 반대 효과를 갖는, 열지도 강도의 가장 강한 예측변수 및 가용성 인자를 갖지 않는 조건을 나타내는 중간 체제인 것으로 확인되었다. 10위 안의 자기 재생 및 증식 조건은 모두 LIF 조건이었고, 대부분 낮은 기계적 특성 및 세포-세포 상호작용 단백질의 부재 조건인 경향이 있었다. 실제로, 모든 세포 배양 미세환경이 콜로니 면적 대 GFP 강도로서 플롯팅된 경우(도 2b 참조), LIF, 인자 없음("없음") 및 BMP4/FGF4를 함유하는 세포 배양 미세환경으로서 확인되고 이들 사이에 거의 겹침이 없는 세 집단이 드러났다. LIF는 전사 인자 신호 트랜스듀서 및 전사(STAT) 3의 활성자의 인산화를 통해 ESC 만능성 및 자기 재생을 유지하는 중요한 신호로 알려져 있기 때문에(Niwa et al., 1998), LIF 의존성은 플랫폼의 강한 생물학적 입증을 증명하였다. 추가로, 자기 재생과 증식 사이의 연관성을 제안하는 이러한 표시로부터 드러난 별개의 면적 대 GFP 관계는 특정한 가용성 인자 체제와 연결되고; LIF 증식이 자기 재생과 강하게 연관된 반면, FGF/BMP에 있어서, 성장 특성과 관계없이, 자기 재생이 손실되었다. 임의의 외인성 가용성 인자가 없는 세포 배양 미세환경에서, 자기 재생 콜로니가 관찰되었다. 이는 ESC 만능성의 빠른 손실을 야기하고 삼차원에서 ESC를 유지하는데 포함된 기타 인자의 잠재적인 역할을 지시하는 LIF 무함유 이차원 배양과 매우 대조적이다. 흥미롭게도, 모든 소집단에서 대부분의 자기 재생 및 증식(즉, 고 GFP, 고 면적) 매트릭스 특성은 낮은 매트릭스 강성도의 조건인 것으로 확인되었다(도 2c 및 2d 참조).

시스템 레벨 분석은 삼차원에서 ESC 운명 결정의 상대적이고 조합적인 효과를 드러낸다

얼마나 많은 자기 재생 및 증식이 신호전달 세포 배양 미세환경의 함수로서 다양한지 시스템 방식으로 정량화하기 위하여, 세포 배양 미세환경의 모든 5종의 결정요인 및 이들의 상호작용을 포함하는 일반화 선형 모델(GLM)을 이용하였다(도 3 참조). 이러한 접근은 시스템에서 70% 이상의 가변성을 설명하는 것을 허용하였다. 미묘한 효과를 더 우세한 것들로부터 분리함으로써, 삼차원에서 ESC 운명에 영향을 미치는 성분의 전체적인 체계를 정립하는 다양한 인자의 상대적인 중요도를 정량화할 수 있었다(도 3a 참조). 가용성 인자는 모델 변량의 60% 이상을 차지하였다. 매트릭스 분해도 및 강성도를 포함한 물리적 특성은 남은 모델 변량의 대략 반을 차지하고, 테터링된 단백질 및 초기 세포 밀도 효과는 각각 최대 15%를 차지하였다. 개별적인 인자의 역할이 또한 이들 범주 내에서 조사되었다(도 3b 참조). BMP4 및 FGF4는, 본 발명의 내용에서 혈청 무함유 배지 중에 단일 인자로서 나타나는 경우, 자기 재생을 손상시키고, 다른 미세환경 인자들은 임의의 유의미한 정도로 이러한 효과를 극복할 수 없었다. 분해 가능한 매트릭스는 자기 재생을 선호하였지만, 반드시 증식을 선호한 것은 아니었다. 따라서, 매트릭스의 물리적 파라미터는 콜로니 성장을 좌우할 뿐만 아니라 줄기세포능을 조정할 수 있다. 이들 과정은 항상 평행적으로 작용하지는 않고 상호작용 인자에 의해 매개될 수 있다. 실제로, ECM 단백질은 콜로니의 크기를 증가시키지만 Oct4 발현을 감소시키는 경향이 있었고, 이는 이차원 분석에서 이전에 발견된 것과 일치하는 것이고, 여기서 라미닌 및 피브로넥틴은 ESC의 분화의 강화를 나타내었다(Prudhomme et al., 2004). 놀랍게도, 선택되는 모든 세 단백질이 이차원 연구에서 ESC 자기 재생의 유지에 이전에 연관되었음에도 불구하고(Andrews et al., 2008; Gires et al., 2009; Soncin et al., 2009), EpCam와 같은 세포-세포 상호작용 단백질은 당해 시스템에서 증식 및 자기 재생 둘 다를 감소시키는 경향이 있다. 이는 특정한 경로가 삼차원 환경에서 다른 인자에 의해 개별적으로 활성화되거나 무효화될 수 있다는 것을 제시한다.

통계적으로 유의미한 인자들 사이의 상승작용적 또는 길항적 효과는 네트워크 상호작용 지도(도 3c 참조) 및 유의미한 쌍방식 상호작용을 나타내는 군집형 열지도(도 3d-g)로서 나타났다. 가용성 인자를 포함한 것들과 같은 일부 상호작용이 자기 재생 및 증식 둘 다에 포함되는 반면, 다른 것들은 자기 재생 특이적이다(도 3c 참조). 예를 들면, 모든 ECM 단백질과의 EpCam 존재는 콜로니 성장을 감소시켰고(도 3e), 낮은 세포 밀도의 겔 중의 콜라겐의 존재는 콜로니 성장을 강화시켰다(도 3f). 따라서, 인테그린 부착을 통한 세포 부착 착물의 활성화에서 역할을 하는 ECM 단백질(Lee et al., 2010)은 매트릭스의 순수하게 물리적인 성분을 조절하는 것에 포함된다. 전체적으로, 상호작용 계획은 가용성 인자의 중심에 있고, 심지어 삼차원 환경에서 ESC 운명을 조절하는데 이들이 중요한 역할을 강조한다.

상보적 검정(complementary assay)은 ESC 운명에 대한 강성도의 효과를 밝힌다

이러한 대규모 선별에 의하여 더 상세하게 확인된 3D에서 ESC 조절의 주요 측면을 연구하기 위하여, 플랫폼에 유세포분석 및 정량적 RT-PCR을 포함한 상보적 다운스트림 세포 검정과의 혼화성을 부여하였다(도 4 참조). 신규한 판독은 3D ESC 거동의 역학을 밝혀내기 위하여 더 표적화된 실험(도 4a 참조) 및 저속 촬영 방식(도 4b 참조)으로 시행되었다. 예를 들면, LIF의 효능은 용량 의존적 연구를 수행함으로써 동시에 조사되었고, 기계적 특성의 효과는 강성도 범위를 넓혀 평가되었으며 모든 겔의 강성도를 소급적으로 측정하고(도시되지 않음), 넓은 범위의 미리 설정된 세포 밀도를 탐색하였다(도 4a 참조). 증식은 처음 2일 동안 모든 조건에 대하여 유지되었고, 뒤이어 모든 세 파라미터에 강하게 의존적이었다(도 4c 참조). 특히, LIF는 3D에서 심지어 2D 표준보다 적은 세자릿수 농도에서 이의 증식 역할을 유지하였다. 증식이 낮은 매트릭스 강성도와 직접적으로 관련된다는 것이 확인되었고, 중간 강성도가 자기 재생 및 콜로니 형성 효능에 최적화된 것으로 발견되었다(도 4d 참조). 이러한 발견은 종양 편구와 같은 다세포 응집물(Helmlinger et al., 1997)에서 거시적 레벨 및 세포 레벨 둘 다에서 세포 성장을 제어할 수 있다는 것을 제시하는 데이타와 일치한다. 최근 작업은 시험관내 기질의 유연성이 줄기 세포 운명에 관여함을 보여주었다(Engler et al., 2006; Gilbert et al., 2010). 본 발명의 내용에서 수득된 결과는 기계적 특성이 3D에서 ESC 유지를 조절하는 유사하고 기초적인 역할을 수행할 수 있고, 초기 배반포에서 측정된 것들의 범위에서 최적의 특성이 대부분 적절할 수 있다는 것을 제시한다(Khalilian et al., 2010; Murayama et al., 2006). 단일 세포 유세포분석 및 유전자 발현 데이타로 콜로니 레벨에서 이들 발견들을 확증하기 위하여, 각각의 웰 내의 하이드로겔 매트릭스를 세포 무결성을 유지하면서 프로테아제 용액으로 소화시켰다. 유세포분석에 의한 총 세포 수는 이미지에 의한 총 콜로니 면적의 측정과 매우 밀접하게 연관된다(도시되지 않음). 세포 밀도의 역할을 더 잘 정의하기 위하여, 총 콜로니 면적을 초기 세포 밀도로 정규화하였다: 초기 세포 밀도가 높을수록 큰 콜로니를 야기하였지만, 이는 유세포분석에 의한 실제 세포 수에 반영되지 않았고(도 4e 참조), 이는 큰 콜로니 내의 세포가 사멸하였을 수 있다는 것을 제시한다. 이미지 기반 데이타와 같이, 각각의 조건은 개별적으로 가시화될 수 있고; 열지도 표시(도 4f 참조)는 LIF 및 MP의 등급화된 양방향 영향에 대한 명백한 경향을 나타내고, 관찰은 세포 증식에 영향을 주는 이들 두 인자의 거의 동일한 역할 및 세포 밀도의 감소된 역할을 보여주는 전체적인 분석에 의해 강화되었다. 겔로부터의 세포를 해리시키는 추가의 잇점은 용이하게 면역세포화학을 수행하는 가능성이다. 예를 들면, Oct4와 같은 전사 인자에 대한 만능성의 상보적 마커로서 일반적으로 사용되는 표면 마커인 SSEA1의 염색은 심지어 높은 Oct4의 경우에서도 광범위한 SSEA1 발현을 지시하였다(도 4g 참조). SSEA1 발현은 일반적으로 매트릭스가 연질일수록 높은 레벨에 도달하였고, SSEA1 고/Oct4 저 소집단은 고 LIF 및 고 MP의 경우에 발생하였고, 이는 기계적 특성 및 LIF 농도에서 변화의 결과로서, 일부 세포가 만능성의 세포내 및 세포외 마커에서 미묘한 변화에 의해 반영되는 초기 수임 단계를 겪었음을 제시한다. 겔로부터 수집된 세포가 필수적으로 임의의 상보적 다운스트림 검정에 사용될 수 있다는 것을 증명하기 위하여, 선택되는 샘플에 대하여 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 이러한 분석은 얼마나 많은 만능성과 연관된 일부 유전자의 발현이 Rex1을 유의미하게 하향조절하였고 다른 것들(나노그(Nanog))은 물리화학적 환경에서 변화의 결과로서 크게 변하지 않은 채 남아있었고, 반면, 3D 매트릭스 강성도에서 변화는 초기 신경외배엽 분화와 연관된 유전자인 Map2의 유의미한 상향조절을 야기하였음을 보여주었다(도 4h 참조). 종합하면, 저속 촬영 이미징, 유세포분석 및 PCR를 포함한 이들 다중모드 판독의 수행 가능성은 본 발명에 따른 마이크로어레이 3D 세포 배양 미세환경에서 세포 시스템을 검토하는 넓은 방안을 연다.

체계적인 세포 배양 미세환경적 인자 분석은 신경상피 분화의 특징을 표시하는 인자 세트를 밝힌다

본 발명의 또 다른 양태를 증명하기 위하여, 상기 기재된 바와 유사한 방법을 사용하여 초기 신경 발달을 조절하는 인자, 특히 ESC 유래 신경상피 분화를 조사하였다.

중요하게, 증식 및 분화의 판독의 정량화 이후에, 후자는 Sox1 발현을 보고하는 GFP 강도에 의해 평가되었고, 신경상피 낭포의 형태학적 특징을 재창조할 수 있는 조건이 구해졌고, 이는 이들의 구형 및 네오편광 특징을 포함한 루멘을 감싼 구부러진 상피 세포층으로 구성된 조직으로서 정의된다(Gin, 2010).

광범위한 파라미터 공간(5개의 범주 x 범주당 4개의 인자)을 유지하고 필요한 실험 조건의 수를 최적화하기 위하여, 완전 요인 실험 설계를 수정하여 두 차례의 4 범주 조절에 집중하였다. 첫번째 어레이에서, MP, DG, EC 및 SF는 완전 요인 설계(CC 단백질 없음)로 평가되었고, 두번째에서, MP, DG, EC, CC는 모든 조건에서 가용성 인자 FGF4와 함께 유사한 방식으로 평가되었다.

결과의 정량화는 이전에 기재된 GLM기반 모델링 전략을 사용하여 수행하였다. LIF 효과에 의해 지배된 가용성 인자는 콜로니 면적에서 관찰된 가변성의 74% 이상을 기여하였고, 기계적 특성 및 MMP 감응성(5%)으로부터 매우 적은 기여 및 기타 인자로부터의 거의 무시해도 될만한 효과가 있었다(데이타 도시되지 않음). 대조적으로, GFP 강도에서 가변성은 훨씬 넓은 세트의 인자로부터 기인하였다: 가용성 인자가 여전히 가장 큰 비율(32%)로 기여하고, 세포-세포 상호작용 단백질은 변량의 16%를 차지하고, 물리적 특성(기계적 특성 및 MMP 감응성)은 각각 9%를 차지하였다(도 5a 참조).

Sox1-GFP 강도에 대한 개별적인 인자의 기여를 추가로 분석하여 어느 인자가 분화의 양성 또는 음성 조절자로서 역할을 갖는지를 결정하였다. FGF4는 GFP에 대하여 가장 강한 양성 효과를 갖는 가용성 인자이고, LIF 및 BMP4는 둘 다 신경상피 운명의 강한 음성 조절자이다(도 5b 참조). 임의의 가용성 인자의 부족은 Sox1-GFP 발현에 대한 작은 음성 효과만을 야기하였고, 이는 기준선 조건이 테스트된 조건 내에 세포 운명에 일반적으로 중성 효과를 생성하였음을 지시한다. 기계적 특성에 있어서 탄성의 중간 내지 연질 범위는 가장 높은 Sox1-GFP 발현을 촉진하였다. 실제로, 분화에 대하여 약간의 음성 효과가 연질 매트릭스에서 나타나고, 더 강성인 조건에서 더 현저한 음성 효과가 나타난다(도 5b 참조).

비분해성 매트릭스는 MMP 감응성 매트릭스보다 GFP+ 콜로니 형성에 유의미하게 관대하였다(도 5b 참조). 임의의 합성 매트릭스에서 시간 경과에 따라 매트릭스의 벌크 기계적 특성에서 변화 없음이 5일 동안 관찰되었음을 주의할 수 있고, 이는 나타난 효과가 기계적 특성에서 벌크 변화와 독립적이고 따라서 국지적 세포 및 콜로니 규모에서 수행됨을 제시한다(데이타 도시되지 않음).

마트리겔과 같은 ECM 풍부 천연 매트릭스를 기반으로 예측된 분화 프로파일에서 예상된 변화와 대조적으로, 당해 합성 시스템에서 Sox1-GFP 발현에 대한 ECM 단백질의 효과는 개별적으로 존재하는 경우에 유의미하지 않았다. 최종적으로, 세포-세포 상호작용 단백질은 분화의 강한 음성 조절자인 것으로 확인되었다. 특히, 노치 경로를 활성화하는 리간드인 재기드는 GFP 발현의 가장 강한 음성 조절자로서 나타났고(도 5b 참조), 이는 목적하는 세포 운명에 존재하는 인자의 첨가가 분화되지 않은 세포를 그 계통을 향하도록 야기하는 올바른 자극으로서 필수적으로 작용하지 않고, 실제로, 사실 반대 거동을 촉진할 수 있다는 것을 제시한다.

인자들 사이의 상호작용은 GFP 모델의 전체 변량의 8%만큼 기여하는 것으로 보이고, 모든 가능한 범주 상호작용의 수학적 모델을 기반으로, 5개의 쌍방식 상호작용은 통계적으로 유의미한 것으로 결정되었다(도 5c 참조). 가용성 인자(SF)는 생물물리학적(MP 및 DG) 뿐만 아니라 생화학적(EC)(도 5f, g, h 참조) 둘 다인 다른 세 범주와 상호작용하였다. 이들 SF 상호작용 효과는 세 범주에 걸쳐 체계적인 것으로 보인다: 예를 들면, FGF4는 모든 다른 인자에 대해 추가의 효과를 갖고, 이는 비선형 효과로서 단순하게 해석될 수 있고, 이는 선형 모델에서 주요 효과로서 포착되지 않을 수 있지만 이의 비선형성은 이러한 상호작용 분석에 의하여 포착될 수 있다. 유사하게, 비분해성 조건은 또한 이러한 비선형 효과를 나타내지만, Ecad 조건은 고 분해성 조건의 존재하에 양성 영향을 미쳤다(도 5d 참조). 유사하게, ECad는 더 강성인 조건 중 하나에서 더 현저한 양성 효과를 갖는다(도 5e 참조).

선별된 조건은 신경상피 형태학 및 극성에 기계론적 통찰의 근거를 제공한다

본원에 기재된 것과 같은 고처리량 선별은 더 표적화된 연구를 위한 가설 생성 도구로서 제공될 수 있다. 예를 들면, 인자 상호작용 분석에 의해 확인된, FGF4의 추정되는 비선형 효과는 세포 밀도에 의해 매개되는 것으로 나타났다: 상대적으로 높은 세포 밀도(3,000,000 세포/㎖)에서, 배지에 대한 FGF4의 첨가는 거의 효과가 없는 반면, 낮은 세포 밀도(1,000,000 세포/㎖)에서, FGF4의 부족은 증식 및 GFP 강도의 손실을 야기하였고(도 6a 참조), 신경 분화의 자가분비 조절자로서 당해 성장 인자의 역할이 주목된다.

이러한 선별로부터의 이미지 세트의 분석은 또한 증식의 척도로서 평균 콜로니 면적을 넘는 추가의 계량 및 분화의 척도로서 Sox1-GFP 발현을 출력해내고, 형태학적 계량은 특히 세포 배양 미세환경을 입력하는 관찰된 표현형과 관련된다. 다차원적 출력을 연결된 형태학, 증식 및 분화의 클러스터 내로 조합하는 클러스터 접근법을 사용하여(도시되지 않음), 세포 거동의 더 완벽한 그림을 제공하는 표현형 특징을 구축할 수 있다. 이와 같이, 특징적인 부드럽고 둥근 콜로니는 비분해성 조건에서 거의 독점적으로 발생되는 것으로 측정되는 것이 가능한 반면, 콜로니는 높은 GFP 발현을 유지하지만 더 편심이고 별모양인 형태가 분해성 매트릭스에 존재하였다(도 6b 참조). 광대역 MMP 억제제를 사용한 추가의 실험(도시되지 않음)에서, 이러한 현상은 실제로 프로테아제 매개된 것으로 확인되었다. 따라서, 형태학적 특징을 포함하는 흥미있는 계량의 확대에 의하여, 특이적 형태형성 경로에 연결될 수 있는 상이한 형태학을 유도하는 특정한 미세환경적 조건을 확인하는 것이 가능하였다.

신경 낭포 형성의 하나의 특질은 루멘의 발달이다. 공초점 3D 재구성은 콜로니가 겔 두께 전체에서 실제로 잘 분주되고 특정한 평면 편향이 없음을 증명하였음을 명백하게 보여주었다(도 6b 참조). 비분해성 겔에서 3D 배열에서 아주 근접한 콜로니 성장은 융합되지 않았지만 서로 간의 얇은 하이드로겔 경계를 유지하였고(도 6b 참조), 이는 이러한 매트릭스 내의 성장이 임의의 리모델링 과정이 아닌 매트릭스에 대항하여 밖을 향하는 힘에 의해 달성되었음을 제시한다. 가장 유의미하게, 정점기저(apico-basal) 극성의 척도(도 6c 참조) 및 가능한 퇴화의 개시가 비분해성 매트릭스 및 FGF4를 특징으로 하는 선택되는 조건에서 관찰되었다. 추가의 실험은 단일 ECM 인자가 존재하는 조건에서 오직 희귀 낭포 극성만이 입증되고, 모든 세 ECM 성분(라미닌, 콜라겐 IV 및 피브로넥틴)이 매트릭스 내로 도입되는 경우, 강력하고 빈번한 극성이 정립됨을 밝혀냈다(도 6d 참조).

이러한 고처리량 접근에서, 3D 세포 배양 미세환경의 어레이에서 ESC의 반응은 신경상피 분화의 조절에 대한 새로운 통찰을 제공하였다. ESC 자기 재생 연구에서와 같이, 가용성 인자는 특히 증식 측정에서 우세한 역할을 하고, 분화를 촉진하거나 저해하는데 분명한 효과를 가졌다. 매트릭스 효과, 특히 매트릭스 MMP 감응성은 세포 운명을 특정하는데 동일하게 유의미한 역할을 하였다. 실제로, 구형 신경상피 콜로니는 오직 비분해성 매트릭스에서만 관찰되었고, 분해성 매트릭스에서, 분화의 정도 및 콜로니 형태학은 유의미하게 변경되었다. 추가로, 세포-세포 상호작용에 관련된 단백질은 신경상피 분화를 손상시키고, ECM 단백질은 오직 조합적 방식에서만 정점기저 극성을 정립하는데 유의미한 역할을 하였다. 본원에 전개된 것과 같은 고처리량 플랫폼은 따라서 발달 경로에 대한 세포 배양 미세환경적 영향을 이해하기 위한 도구뿐만 아니라 더 복잡한 메커니즘의 설명을 야기할 수 있는 엄청난 가설 생성 과정으로 보여진다.

플랫폼의 어레이화는 다중 검정 및 세포 유형을 처리할 수 있다

본 발명의 추가의 양태는 이동 및 형태학적 검정의 수행 가능성을 포함한다. 추가로, 이러한 검정은 단일 세포(이전에 도시된 바와 같음)로부터 출발하거나 시험관내 형성된 세포 응집물(예를 들면, 배양체)로부터 출발하여 수행될 수 있거나, 살아있는 조직으로부터 직접 단리될 수 있다. 예로서, 중간엽 줄기 세포를 300 세포의 크기로 응집시키고, 조합적 세포 배양 미세환경 내로 도입하고, 이들의 이동을 16시간 후 평가하였다(배지 중의 가용성 인자로서 PDGF 존재하에). 매트릭스 테터링된 ECM 모방 펩티드(피브로넥틴 유래 RGD 모티프), 뿐만 아니라 매트릭스 MMP 감응성 둘 다는 클러스터로부터 외부를 향하는 세포의 이동 반응을 조절하였다(도 7a 참조). 예를 들면, 췌장, 자궁내막, 장 또는 유방을 포함한 다양한 상피 세포 클러스터는 선별 플랫폼 내로 도입될 수 있고, 줄기 세포 마커, 극성 또는 기타 형태학적 특징에 대해 평가될 수 있다(도 7b 참조).

실험 세부사항

하이드로겔 전구체 합성

PEG 비닐설폰(PEG-VS)을 다른 문헌(Lutolf and Hubbell, 2003)에서 기재된 바와 같이 제조하고 특성화하였다. 제2 단계에서, PEG-VS를 마이클형 첨가를 통해 인자 XIIIa-펩티드 기질으로 작용화하였다. 글루타민을 갖는 펩티드(NQEQVSPL-ERCG-NH₂) 및 다양한 MMP 감응성 서열의 상이한 유형의 리신을 갖는 펩티드를 사용하였다: AcFKGG-GPQGIWGQ-ERCG-NH₂(펩티드 W), AcFKGG-GDQGIAGF-ERCG-NH₂(펩티드 A), AcFKGG-PQGIAGQ-ERCG-NH₂(펩티드 G), AcFKGG-VPMSMRGG-ERCG-NH₂(펩티드 V). 그 결과, 1개의 글루타민-PEG 전구체(Q-PEG) 및 4개의 상이한 리신-PEG 전구체를 수득하였다: W-PEG, A-PEG, V-PEG, G-PEG. 이들 전구체의 작용화 및 특성화를 다른 문헌(Ehrbar et al., 2007)에서 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히 말해서, 펩티드를 37℃에서 2시간 동안 0.3M 트리에탄올아민(pH 8.0) 중의 VS 기에 대하여 1.2배 몰 과량으로 PEG-VS에 가한 후, 4 일 동안 4℃에서 초순수에 대하여 투석(Snake Skin, MWCO 10k, PIERCE)을 수행하였다. 투석 후, 염 무함유 생성물(Q-PEG, W-PEG, A-PEG, V-PEG, G-PEG)을 동결건조시켜 백색 분말을 수득하였다.

하이드로겔 제조

인자 XIII(Fibrogammin P, CSL Behring)를 동결건조된 분말로부터 물 중에 농도 200U/㎖로 재구성하였다. 인자 XIIIa 1㎖를 트롬빈(20 U/㎖, Sigma-Aldrich, Switzerland) 100㎕로 30분 동안 37℃에서 활성화시켰다. 활성화 인자 XIIIa의 분취액을 추가 사용을 위하여 -80℃에서 저장하였다. 50 mM 염화칼슘을 함유한 트리스 버퍼(TBS, 50mM, pH 7.6) 중의 Q-PEG 및 4종의 리신-PEG 각각의 화학량론적으로 균형잡힌([Lys]/[Gln]=1) 용액에 의하여 1.5 내지 4% 범위의 최종 건조 질량 함량의 하이드로겔을 수득하는 전구체 용액을 제조하였다. 10 U/㎖ 트롬빈 활성화된 인자 XIIIa 및 힘찬 혼합에 의하여 가교결합 반응이 개시되었다. 디스크형 매트릭스를 수득하기 위하여, 액체 반응 혼합물(50㎕)을 스페이서(약 1mm 두께)에 의해 분리된 무균 소수성 유리 현미경 슬라이드(시그마코트(SigmaCote, Sigma) 처리에 의해 수득됨) 사이에 끼워넣고 바인더 클립으로 클램핑하였다. 그 다음, 매트릭스를 30분 동안 37℃에서 배양하였다.

MMP 매개된 분해의 특성화

3.5% w/v PEG에서 3개의 50㎕ 겔 디스크를 4개의 펩티드 서열 각각에 대하여 만들고, 12시간 동안 50mm 트리스, 100mM NaCl, 10mM CaCl₂ 버퍼 중에서 pH 7.5에서 팽창하도록 하였다. 그 다음, 이들의 중량을 측정하고 40mM MMP-1 용액 중에 넣고, 동일한 버퍼 중에서 용해시켰다. 겔 질량을 처음 12시간 동안 2시간 간격으로, 그 후 t = 18, 24, 48 및 72시간에 기록하였다. 분해가 완료된 시간을 직접적으로 측정하거나 선형 회귀(G 펩티드의 경우)으로 측정하고 역전시켜 분해도를 측정하였다.

기계적 특성의 특성화

겔 디스크(각각의 MMP 감응성에 대하여 n=3)를 버퍼 중에서 12시간 동안 팽창되도록 한 다음, 소형 변형률 진동 전단 유량측정을 수행하였다. 1 내지 1.4mm 두께의 팽창된 하이드로겔 디스크를 미끄러짐을 회피하기 위하여 이들의 원래 두께의 85% 내지 75% 범위 이하의 압축하에 보린(Bohlin) CV 120 유량계(Bohlin Instruments)의 2개의 플레이트 사이에 끼워넣었다. 그 다음, 측정을 일정한 변형률(5%) 방식으로 수행하였다. 전단 응력을 0.1 내지 1Hz의 진동수 범위에서 기록하고, 진동수 범위에서 평균 저장 탄성률 G'를 수득하였다. 저장 탄성률(G')을 각각의 4개의 MMP 감응성에 대하여 하이드로겔 %PEG w/v의 함수로서 플롯팅하였다. 선형 보간법을 G' 대 %PEG 데이타점에 대하여 수행하였다. 0, 600, 1200 및 1800 Pa에 상응하는 %PEG를 각각의 분해도에 대하여 측정하였다.

세포-세포 상호작용 단백질에 의한 매트릭스의 변형

세포-세포 상호작용 단백질을 하이드로겔 네트워크에 결합시키기 위하여, Fc 태그/단백질 A 컨쥬게이션 전략을 사용하였다. 단백질 A를 인자 XIIIa 촉매된 가교결합에 민감하게 만들기 위하여, NHS-PEG-말레이미드, 이종이작용성 PEG 링커를 사용하여 Q를 갖는 펩티드를 단백질 A에 연결하였다. 단백질 A의 변형은 2단계 반응으로 달성되었다: 10배 몰 과량의 NHS-PEG-말레이미드의 반응에 의한 말레이미드 기와의 작용화 후, 이의 시스테인 측쇄를 통한 Q-펩티드 부착. 그 결과, Q-단백질 A-작용화를 SDS-PAGE에 의하여 정량적으로 평가하였다. 인자 XIIIa 매개된 가교결합 반응이 발생하는 경우를 검출하기 위하여, 인자 XIIIa를 위한 형광 카운터 반응성 기질, 리신 함유 프로브, Lys-Tamra를 선택하였다. 인자 XIIIa의 존재하에 단백질 A 및 Lys-Tamra를 혼합한 다음, 단백질 A에 상응하는 형광 신호를 SDS-PAGE 및 겔내 형광 스캐닝으로 검출하였고, 이는 성공적인 바이오-컨쥬게이션을 증명한다. 인자 XIIIa기반 하이드로겔 내로 세포-세포 상호작용 단백질의 공유 테터링을 달성하기 위하여, Fc 태그를 단 E-캐드헤린, EpCAM 및 재기드(R&D Systems)를 Q-단백질 A와 1.66몰 과량의 비율로 30분 동안 실온에서 전혼합하였다. 단백질 A가 5개의 Fc 결합 부위를 갖는다는 사실을 고려하여, Fc 단백질에 관하여 각각의 Fc 결합 부위의 3배의 분자 과량을 제공하고, 이는 모르포젠의 최적의 고정화를 보장하여야 한다. 완전한 작용성 단백질 구성물의 수득된 용액을 분취하고, 추가로 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다.

인자 XIIIa 매개된 가교결합에 대한 ECM 단백질 감수성의 측정

큰 크기의 ECM 단백질은 인자 XIIIa에 대한 천연 기질이 될 수 있고 추가의 컨쥬게이션 없이 하이드로겔 네트워크에 테터링할 수 있다는 가설을 기반으로, 용액 중의 흥미있는 하기 ECM 단백질을 사용하였다: 라미닌, 콜라겐 I(BD Biosciences), 피브로넥틴(R&D Systems). 형광 결합 검정을 수행하고, 여기서 단백질을 인자 XIIIa의 존재하에 각각의 형광 인자 XIIIa-기질(Q-펩티드-Alexa647 또는 Lys-Tamra)과 혼합하였다. 반응을 SDS-PAGE 및 겔내 형광 스캐닝으로 정량적으로 분석하고, 이는 실제로 단백질이 인자 XIIIa기반 가교결합에 민감하다는 것을 증명한다. 모든 ECM 단백질을 4℃에서 분취하고 -20℃에서 저장하였다.

세포 배양

모든 ESC 자기 재생 실험에서 Oct4-GFP 마우스 배아 줄기 세포(mESC)(잔드스트라 랩(Zandstra lab)에 의해 제공된 R1 라인)를 15% 혈청(Hyclone) 및 10⁶ U/㎖ LIF(Millipore)를 함유하는 배지 중에서 젤라틴 코팅된 디쉬에서 일상적으로 배양하였다. 실험 12시간 전에, 배지를 혈청 무함유 녹아웃 배지(KO)로 변경하였다.

모든 신경상피 분화 실험에서 Sox1-GFP 마우스 배아 줄기 세포(타나카 랩(Tanaka lab)에 의해 제공된 46C 세포주)를 15% 혈청(Hyclone) 및 106 U/㎖ LIF(Millipore)를 함유하는 배지 중에서 일상적으로 배양하였다. 실험 전에, 세포를 트립신 처리하고, 임의의 유도 자극이 없는 신경 분화 배지에 재현탁시켰다. N2/B27 제제는 다른 문헌(Ying, 2003)에서 보고된 바와 같았다.

모든 중간엽 줄기 세포 이동 실험에서, 인간 태반으로부터의 일차 다능성 중간엽 줄기 세포(에바 랩(Ehrbar lab)에 의해 제공된 패시지(Passage) 8에서 사용되는 세포)를 15% 혈청을 함유한 배지(Invitrogen)에서 일상적으로 배양하였다. 아그레웰(Aggrewell) 플레이트(STEMCELL Technologies SARL)를 사용하여 각각 250 세포의 세포 응집물을 생성한 다음, 이를 채취하고 겔 캡슐화 실험에서 사용하였다. 검정에서 이동을 자극하기 위하여, 50 ng/㎖ PDGF(Peprotech)를 기초 배지에 첨가하였다.

유방 상피 세포의 실험을 MCF10A 세포주를 사용하여 수행하고, 성장 배지에서 일상적으로 배양하고, 다른 문헌(Debnath, 2003)에 기재된 바와 같이 분화시켰다. 일차 상피 세포 응집물을 표준 기술 및 시약을 사용하여 다른 문헌(Jin, 2013; Schatz, 2000; Li, 2012; 췌장, 자궁내막, 장 각각)에 기재된 바와 같이 단리시키고 분화시켰다.

생존능 검정

생존능 검정을 수행하여 2D 및 3D 조건에서 세포 거동을 비교하였다. 야생형 mESC를 트립신 처리하고, 젤라틴-코팅된 조직 배양 디시(2D)에 접종하거나, 600 Pa 비분해성(A) 하이드로겔 디스크(3D)에서 1 M 세포/㎖으로 캡슐화하였다. 37℃, 5% C0₂에서 배양을 4시간 동안 +LIF 혈청 무함유 조건에서 수행한 다음, 제조사의 설명서에 따라 라이브/데드(LIVE/DEAD) 세포 생존능 검정으로 염색하였다. 통상적인(2D) 또는 공초점(3D) 형광 이미징을 수행한 다음, 살아있는 세포(녹색) 대 죽은 세포(적색)의 비율을 3개의 상이한 샘플에 대하여 수동으로 계산하였다.

로봇 혼합 및 분주

이러한 접근의 조합적 복합성을 달성하기 위하여, 나노피펫터(Nanopipettor) 헤드가 장착된 해밀톤 마이크로랩 스타플러스(Hamilton Microlab StarPlus) 자동 액체 핸들링 로봇을 사용하였다. 모든 자동화된 단계를 마이크로랩 벡터 소프트웨어(MicroLab Vector Software) 버전 4.1.1(HAMILTON Bonaduz AG, Switzerland)으로 프로그래밍하였다. 글루타민-PEG 전구체(Q-PEG)를 4개의 상이한 리신-PEG 전구체: W-PEG, A-PEG, V-PEG, G-PEG와 혼합함으로써 4개의 펩티드에 상응하는 전혼합된 화학량론적 균형잡힌 PEG 용액의 스톡 용액을 제조하였다. 맞춰진 표적 강성도를 달성하는데 필요한 유동학 측정된 4개의 상응하는 농도로 이들 4개의 스톡 용액 각각을 희석하였다. 모든 물질 부류에 대하여 최적화되고 저울에서 질량 측정에 의하여 확인된 유체 핸들링 파라미터와 함께(데이타 도시되지 않음), 희석 및 모든 후속적인 공정 단계를 로봇식으로 수행하였다. 중요하게, 단백질, 세포 및 인자 XIIIa의 후속적인 첨가(각각의 성분에 대하여 총 용적의 10%)를 위하여 총 최적 용적의 30%를 비워놓았다(여분의 용적). 이들 16개의 조합을 384 웰 플레이트의 256개의 웰 내로 분취하였다. EC 및 CC 단백질을 얼음 상에서 해동시키고, 500nM의 농도로 희석시키고, 차가운 384 웰 플레이트의 웰 내로 넣었다. 겔 전구체로 채워진 256개의 웰 내로 4개의 EC 단백질(블랭크 대조군을 포함하여)을 분주시킨 후, 4개의 CC 단백질을 직교 방식으로 분주시켜 당해 단계 끝에 MP, DG, EC 및 CC의 256개의 고유한 조합(4x4x4x4)을 수득하였다. 3개의 가용성 인자 및 블랭크 대조군: FGF4, 10ng/㎖의 BMP4(R&D Systems) 및 106 U/㎖의 LIF(Millipore)를 함유하는 배지로 96 웰 플레이트를 제조하였다. 세포를 트립신 처리하고, 혈청 무함유 배지 중에 1 x 106 세포/㎖의 농도로 재현탁시키고, 얼음 상에서 유지하였다. 동시에, 인자 XIIIa의 냉동된 분취액을 해동시키고, 또한 얼음 상에서 유지하였다. 그 다음, 순차적인 방식으로, 세포를 혼합된 겔 전구체의 8개의 웰로 분주시킨 다음, 빠르게 인자 XIIIa의 분주 및 로봇 혼합을 수행하였다. 인자 XIIIa의 첨가 직후, 겔화(약 2-3 분) 개시 전에, 8채널 나노피펫터를 사용하여 각각의 웰로부터 12.5 ㎕를 흡입하고 1536 웰 플레이트의 12개의 웰에 1 ㎕를 분주시켰다. 당해 공정을 1536 플레이트당 총 8회 반복하여(12 x 8 채널 x 8회 x 12 액적/(채널.시간) = 768 액적) 1536 웰 플레이트의 절반을 채웠다. 공정 전체에서 1536 웰 플레이트를 4℃로 냉각시켜 증발을 방지하였다. 겔 분주 회차의 끝에, 96 웰 플레이트의 4개의 상이한 배지를 1536 실험 플레이트 내로 분주시켰다. 배지 분주 단계를 또한 순차적으로 수행하고, 모든 겔이 대략 30분 동안 가교결합되도록 동기화시켰다. 트립신 처리로부터 배지 분주의 완료까지의 전체적인 공정은 2시간이 걸렸고, 온전한 실험에 대하여 4회 수행하였다(1536 웰의 4 x 4 절반 플레이트 = 3072 웰).

신경상피 분화 실험을 위하여, 제1 어레이에서, 세포-세포 상호작용 단백질을 제외한 모든 다른 조합으로 가용성 인자 조절을 수행하였다. 제2 어레이에서, 가용성 인자 이외의 모든 다른 조건에 대하여 모든 세포-세포 상호작용 단백질을 테스트하고, 이는 FGF4 조건으로 한정되었다. 이러한 가용성 인자 체제는 신경상피 분화²를 위하여, 특히 자가분비 피드백 메커니즘이 감소되는 낮은 세포 밀도의 상황에서 가장 바람직한 것으로 보고되었기 때문에 선택되었다. 당해 연구에서, 자가분비 메커니즘과 독립적인 외재성 인자의 역할을 확인하기 위하여, 우리는 일일 배지 교환으로 200 세포/㎕의 상대적으로 희박한 초기 세포 밀도를 부과하였다.

기계적 특성의 동일반응계 측정

기계적 특성에 중점을 둔 실험에서, 384 웰 각각에서 압입에 의해 강성도를 측정하는 기술을 개발하였다(도시되지 않음). 압축 시험기(TA.XTPlus Texture Analyze, Stable Micro Systems Ltd)는 맞춤 제작 1.5mm 직경의 압입 팁이 장착되었다. 힘은 0 내지 70% 변형률로 기록되었다. 영률은 방정식: E = 2ad / F(1-v²)를 사용하여 20 내지 30% 변형률(Elow)의 곡선 기울기로부터 계산하였고, 여기서 a는 압입자 팁 실리더의 반경이고(0.75mm), d는 mm 단위의 압입 깊이이고, F는 N 단위의 기록된 힘이고, v는 0.5인 푸아송비이다.

겔 해리, 유세포분석 및 유전자 발현 분석

384 웰 플레이트 내의 겔을 PBS로 30분 동안 세척한 다음, 37℃에서 트리플 익스프레스(TrypLE Express, Invitrogen) 세포 해리 용액과 함께 30분의 세 주기 동안 배양하였다. 각각의 주기 후, 세포를 수집하고, 환저 96 웰 플레이트로 옮기고, 4℃로 유지하였다. 공정의 끝에, 웰을 혈청 함유 배지로 세척하였다. 항체 염색이 수행되는 경우에, SSEA-1-AlexaFluor647(EBiosciences)를 제조사의 설명에 따라 사용하였다. Accuri C6 유세포분석기(BD Biosciences)를 사용하여 세포를 분석하였다. PCR을 위하여, 세포 해리를 상기와 같이 트리플 익스프레스로 수행하고, 트리퓨어 아이솔레이션 리에이전트(Tripure Isolation Reagent, Roche)를 제조사의 설명에 따라 사용하여 RNA를 단리하고, 이스크립트 셀렉트(iScript Select) cDNA 합성 키트(BioRad)를 사용하여 cDNA를 합성하고, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 7500 기계에서 iQ SYBR 그린 수퍼믹스(Green Supermix)(BioRad)로 RT-PCR을 수행하였다.

이미징

모든 이미징을 BD 패쓰웨이(Pathway) 435 자동화된 이미징 시스템(BD Biosciences)에서 수행하였다. GFP 채널에서 D1에서 살아있는 세포로 이미징을 플레이트에서 수행하였다. 플레이트를 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고 D5에서 DAPI로 염색한 다음, GFP 및 DAPI 채널에서 이미징하였다. 전체 웰이 단일 시계로 포착될 수 있도록 4x 대물렌즈(Olympus UPlan FLN N.A. 0.13)를 사용하였다. 심지어 이러한 낮은 해상도에서도, D1에서 단일 세포를 구별할 수 있었다. 모든 xy 위치에서, 즉, 모든 웰에서, 6개의 이미지를 800㎛의 z-스택 높이를 가로질러 포착하였다. 각각의 웰에서, 각각의 채널에서 이들 6개의 이미지를 단일 가법 이미지(additive image)로 병합(collapse)하였다. 전체 실험의 3D 정보 내용을 4시간 미만 내에 수득하였다.

이미지 분석

ESC 자기 재생 연구로부터의 모든 이미지를 셀프로파일러(CellProfiler) v.9777(Broad Institute)에서 전개된 알고리즘을 사용하여 처리하였다. D1 분석을 위하여, GFP 채널에서 각각의 웰에 대한 병합된 이미지 스택을 입력하였다. DAPI 이미지를 스레숄드(threshold)하고 세그먼트화(segmentation)하였다. 웰당 세포 수는 본원에서 흥미있는 유일한 판독이었다. 모든 세그먼트화를 육안 검사로 입증하였다. D5 분석을 위하여, GFP 및 DAPI 채널에서 각각의 웰에 대한 병합된 이미지 스택을 입력하였다. DAPI 이미지를 스레숄드하고 세그먼트화하였다. DAPI에서 확인된 콜로니 면적을 GFP 이미지를 위한 마스크로서 사용하였다. 각각의 콜로니에 있어서, 면적(픽셀), 평균(콜로니 픽셀을 가로지름) DAPI 강도 및 평균 GFP 강도를 기록하였다.

신경상피 분화 연구로부터의 모든 이미지를 셀프로파일러 v.11710(Broad Institute)에서 전개된 알고리즘을 사용하여 처리하였다. 간략하게, GFP 및 DAPI 채널에서 각각의 웰에 대한 병합된 이미지 스택을 입력하였다. DAPI 이미지를 스레숄드하고 오츄 아답티브(Otsu Adaptive) 세그먼트화 알고리즘을 사용하여 세그먼트화하였다. 콜로니는 8픽셀 이상의 면적을 커버하는 것으로 확인되었다(즉, 더 작은 콜로니는 추가의 분석으로부터 배제되었다). DAPI에서 확인된 콜로니 면적을 GFP 이미지를 위한 마스크로서 사용하였다. 각각의 콜로니에 있어서, 형태 계량을 당해 세그먼트화 공정으로부터 수득하고, 이들 콜로니에 대한 DAPI 및 GFP 콜로니 강도 계량을 원본, 미처리된 이미지로부터 수득하였다. 모든 세그먼트화는 육안 검사로 입증하였다.

데이타 처리

데이타를 처리하고 가시적으로 탐색하기 위하여 매트랩(Matlab) R2010b(Mathworks) 및 매트랩 R2010b를 사용하였다. 각각의 웰(3072 데이타점) 및 각각의 고유한 조건(1024 데이타점)에 대하여 단일 콜로니 데이타를 평균내어, D1 및 D5에서의 콜로니 수, 뿐만 아니라 모든 D5에서 콜로니 수, 평균 콜로니 면적(픽셀) 및 평균 GFP 및 DAPI 강도(임의적인 형광 단위)를 계산하였다. GFP 강도를 DAPI 강도로 정규화하고, 면적을 픽셀에서 mm²로 전환하였다. 데이타를 추가로 평균에 집중시키고 입력 조건을 재배열하여 도 2에 나타낸 열지도를 수득하였다.

통계적 분석

개별적인 조건으로부터의 데이타를 R V2.11에 입력하였다. 콜로니 면적 및 정규화된 GFP 강도를 위하여, 모든 가능한 상호작용 항을 고려한 GLM(일반화 선형 모델) 모델을 특정하였다. 단계 AIC 과정을 수행하여 아카이케(Akaike) 기준을 기반으로 한 최적의 모델을 수득하였다. SAS v9.0 소프트웨어(SAS Institute)의 GLM 과정을 사용하여 콜로니 면적 변화의 유의성을 테스트하였다. 대조군과 함께 LS 평균 ± 표준 오차의 차이를 유의성에 대하여 테스트하였다. 동일한 과정을 사용하여 GFP 강도의 가변성을 설명하였다. 사용된 모델은 MP, DG, CC, EC 및 SF의 효과 뿐만 아니라 유의성이 측정된 상호작용의 효과를 고려하였다. 모든 파라미터 테스트를 위하여, 잉여의 정규성 및 변량의 균질성을 각각 QQ 및 터키-앤스콤(Tukey-Anscombe) 플롯에서 테스트하였다. 로그 변형을 이용하여 잉여의 정규성을 개선시켰다. 노드 크기가 정규화된 면적 및 정규화된 GFP 강도의 생성물에 선형으로 비례하는 네트워크 상호작용 지도를 사이토스케이프(Cytoscape, USCD)에서 구성하고, 상호작용 매트릭스 및 클러스터화를 MeV v.4.4(TM4 Microarray Suite)에서 수행하였다.

참고문헌

Claims

캡슐화된 세포의 거동, 특히 증식, 콜로니 형성, 분화, 이동, 또는 이들의 조합에 영향을 주는 상이한 특성을 보유하는 세포 배양 미세환경의 개별 용적을 갖는 어레이.
제1항에 있어서, 상기 세포 배양 미세환경의 개별 용적이 하이드로겔로 이루어지는 것인 어레이.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포 배양 미세환경의 개별 용적 중 적어도 2개가 프로테이나제, 바람직하게는 매트릭스 메탈로프로테이나제에 의해 서로 다르게 분해될 수 있는 것인 어레이.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 미세환경의 개별 용적 중 적어도 2개가
i) 상이한 세포외 매트릭스 유래 인자; 바람직하게는 펩티드, 단백질, 다당류, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것; 가장 바람직하게는 라미닌, 콜라겐, 엘라스틴류, 피브로넥틴, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 비프로테오글리칸 다당류, 매트릭스 세포 단백질(matricellular protein), SPARC 유형의 매트릭스 세포 단백질(산성 및 시스테인 풍부 분비 단백질), 테나신, 트롬보스폰딘, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하고/포함하거나;
ii) 상이한 세포-세포 상호작용 인자; 바람직하게는 펩티드, 단백질, 다당류, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것; 가장 바람직하게는 캐드헤린, 셀렉틴, 세포 부착 분자(CAM), 특히 ICAM 및 VCAM, 막횡단 세포 신호전달 시스템의 구성요소, 또는 이들의 조합을 포함하고/포함하거나;
iii) 상이한 세포 신호전달 인자; 바람직하게는 성장 인자 또는 발달 모르포젠의 군으로부터 선택되는 것; 가장 바람직하게는 아드레노메둘린(AM), 안지오포이에틴(Ang), 자가분비 운동성 인자, 골 형성 단백질(BMP), 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 표피 성장 인자(EGF), 에리스로포이에틴(EPO), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 교세포주 유래 신경영양 인자(GDNF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포, 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 성장 분화 인자-9(GDF9), 간세포 성장 인자(HGF), 간암 유래 성장 인자(HDGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 백혈병 억제 인자(LIF), 이동 자극 인자, 마이오스타틴(GDF-8), 뉴로트로핀, 특히 신경 성장 인자(NGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 트롬보포이에틴(TPO), 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 태반 성장 인자(PlGF), 사이토카인, 케모카인 및 이들의 조합의 군으로부터 선택되는 것을 포함하고/포함하거나;
iv) 상이한 강성도를 갖는 것인 어레이.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 미세환경이
- 공유 결합 형성으로서,
ㆍ 효소적 촉매 반응, 바람직하게는 활성화 트랜스글루타미나제 인자 XIIIa에 의존하는 효소적 촉매 반응; 및
ㆍ 비효소적 촉매 및/또는 비촉매 반응, 바람직하게는 마이클 첨가 반응(Michael addition reaction)
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공유 결합 형성; 및/또는
- 비공유 결합 형성
을 기반으로 한, 세포 적합성(cell-compatible) 반응 또는 반응들에 의해 가교결합 가능한 전구체 분자로부터 형성되는 것인 어레이.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 미세환경이 선형 또는 분지형 친수성 중합체, 가장 바람직하게는 분지형 폴리(에틸렌 글리콜) 분자로부터 형성되는 것인 어레이.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 어레이의 제조 방법으로서,
a) 하나 이상의 상이한 하이드로겔 전구체 분자를 제공하는 단계;
b) 단계 a)에 따른 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합을 조합하고, 기판, 바람직하게는 멀티웰 플레이트의 개별 용적 상에 분주하는 단계;
c) 상기 기판의 상기 개별 용적에 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 첨가하고, 상기 분자를, 존재하는 하이드로겔 전구체 분자 또는 단계 e)에서 형성되는 하이드로겔 중 적어도 하나에 부착시키거나 이들이 자유롭게 확산되도록 하는 단계;
d) 세포를 상기 기판의 상기 개별 용적 상에/내에 첨가하는 단계; 및
e) 상기 하이드로겔 전구체 분자를 가교결합하여 하이드로겔 매트릭스를 형성하는 단계
를 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 단계 c)에서, 세포외 매트릭스 유래 인자, 세포-세포 상호작용 인자 및 세포 신호전달 인자의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 첨가하는 것인 방법.
세포 성장 거동에 대한 하이드로겔 제제의 영향을 테스트하는 조합적 방법으로서,
a) 하나 이상의 상이한 하이드로겔 전구체 분자를 제공하는 단계;
b) 단계 a)에 따른 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합을 조합하고, 기판, 바람직하게는 멀티웰 플레이트의 개별 용적 상에/내에 분주하는 단계;
c) 상기 기판의 상기 개별 용적에 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 추가로 첨가하고, 상기 분자를, 존재하는 하이드로겔 전구체 분자 또는 단계 e)에서 형성되는 하이드로겔 중 적어도 하나에 부착시키거나 이들이 자유롭게 확산되도록 하는 단계;
d) 세포를 상기 기판의 개별 용적 상에/내에 첨가하는 단계;
e) 상기 하이드로겔 전구체 분자를 가교결합하여 하이드로겔 매트릭스를 형성하는 단계;
f) 상기 세포가 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 개별 용적 내에서 성장하도록 하는 단계;
g) 단계 f) 동안 시간 경과에 따라 상기 세포를 모니터링하는 단계;
h) 상이한 세포 배양 미세환경에 대한 거동을 측정하는 단계로서, 여기서 거동은 바람직하게는 증식, 콜로니 형성, 분화, 이동, 또는 이들의 조합의 정도로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계;
i) 임의로, 바람직하게는 프로테이나제에 의한, 개별 세포 배양 미세환경의 효소적 분해에 대한 감수성 및/또는 기계적 특성 및/또는 생물학적 활성 분자의 서로에 대한 상승작용적 및/또는 길항적 효과를 측정하는 단계;
j) 임의로, 특정한 세포 거동을 지시하는 특이적 하이드로겔 제제, 또는 하이드로겔 제제의 범위를 확인하는 단계;
k) 임의로, 추가의 분석, 바람직하게는 표현형 검정을 위하여, 또는 연속 세포 배양 또는 계대배양을 위하여 적어도 하나의 하이드로겔 세포 배양 미세환경으로부터 세포를 단리하는 단계
를 포함하는 조합적 방법.
제9항에 있어서, 단계 c)의 하나 이상의 생물학적 활성 분자가 세포외 매트릭스 유래 인자, 세포-세포 상호작용 인자 및 세포 신호전달 인자의 군으로부터 선택되는 것인 조합적 방법.
하이드로겔의 개별 용적을 갖는 어레이, 특히 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 어레이의 제조를 위한 부품 키트로서,
a) 하나 이상의 하이드로겔 전구체 분자;
b) 하나 이상의 생물학적 활성 분자;
c) 임의로, 전구체 분자 a)를 위한 하나 이상의 가교결합제; 및
d) 바람직하게는 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 따른, 상기 구성요소의 사용에 대한 설명서
를 구성요소로서 포함하는 키트.
제11항에 있어서,
- 구성요소 b)의 분자 또는 분자들이 세포외 매트릭스 유래 인자, 세포-세포 상호작용 인자 및/또는 세포 신호전달 인자의 군으로부터 선택되고/선택되거나,
- 인자 XIIIa가 구성요소 c)로서 포함되는 것인 부품 키트.
제11항 또는 제12항에 있어서, 구성요소 a)의 하이드로겔 전구체 분자가 멀티암 폴리(에틸렌 글리콜) 분자를 포함하거나 이로 이루어지는 것인 부품 키트.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 하이드로겔 전구체 분자가 바람직하게는 구성요소 c)로서 포함된 효소에 의해 가교결합 가능한 구성요소 a)로서 제공되고; 바람직하게는, 둘 이상의 하이드로겔 전구체 분자 중 하나는 글루타민을 갖는 펩티드 기질에 의해 작용화되고, 다른 하나는 가교결합 효소를 위한 리신을 갖는 펩티드 기질에 의해 작용화되며, 트랜스글루타미나제 인자 XIIIa가 구성요소 c)로서 포함되는 것인 부품 키트.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 구성요소 a)의 하나 이상의 하이드로겔 전구체 분자가 실질적으로 미반응 형태로, 바람직하게는 건조된 형태로 멀티웰 플레이트의 웰 내에 미리 공급되어 제공되는 것인 부품 키트.