KR20160005044A - 염증성 장 질환의 진단 및 치료 방법 - Google Patents

염증성 장 질환의 진단 및 치료 방법 Download PDF

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제이슨 에이. 해크니
매리 키어
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제넨테크, 인크.
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Abstract

섬유화 또는 섬유협착성 크론병을 포함하는 크론병 및 궤양성 결장염을 비롯한 염증성 장 질환을 진단하기 위한 바이오마커, 및 이러한 바이오마커를 사용하는 방법이 제공된다. 또한, 위장 염증성 장애, 예컨대 궤양성 결장염 및 섬유화 또는 섬유협착성 크론병을 포함하는 크론병을 비롯한 염증성 장 질환을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

염증성 장 질환의 진단 및 치료 방법 {METHODS FOR DIAGNOSING AND TREATING INFLAMMATORY BOWEL DISEASE}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2013년 5월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 61/824,661을 우선권 주장하며, 상기 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
분야
섬유화 또는 섬유협착성 크론병을 포함하는 크론병 및 궤양성 결장염을 비롯한 염증성 장 질환을 진단하기 위한 바이오마커, 및 이러한 바이오마커를 사용하는 방법이 제공된다. 또한, 위장 염증성 장애, 예컨대 궤양성 결장염 및 섬유화 또는 섬유협착성 크론병을 포함하는 크론병을 비롯한 염증성 장 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
염증성 장 질환 (IBD)은 위장 (GI)관의 만성 염증성 자가면역 상태이고, 이는 임상적으로 궤양성 결장염 (UC) 또는 크론병 (CD)으로서 나타난다. CD는 전체 GI관의 임의의 부분에 영향을 미치는 잠재력을 갖는 만성 경벽성 염증성 질환이고, UC는 결장의 점막 염증이다. 두 가지 상태는 모두 임상적으로 일상의 활동에서의 곤란과 함께 빈번한 장 운동, 영양실조 및 탈수를 특징으로 한다. 만성 염증은 CD 환자의 하위세트에서 섬유증과, 협착 및 누공을 포함하는 합병증으로 이어질 수 있고, 반복 수술을 필요로 할 수 있다. UC는 덜 빈번하게는 중증 혈성 설사 및 독성 거대결장증을 합병증으로 할 수 있고, 또한 수술을 필요로 할 수 있다. IBD 상태는 둘 다 GI관의 악성종양에 대한 증가된 위험과 연관된다. IBD의 병인은 복합적이고, 발병기전의 다수의 측면은 명백하지 않은 채로 남아 있다.
장 근섬유모세포의 활성화는 콜라겐 및 세포외 매트릭스 단백질의 증가된 침착을 통해 장 섬유증에서 주요 역할을 할 수 있다. 이 과정에서 염증성 시토카인의 역할은 이해되지 않는다.
시토카인의 인터류킨-1 (IL-1) 및 IL-18 패밀리는 기원의 메카니즘, 수용체 구조, 및 이용된 신호 전달 경로와 관련된다. 이들 시토카인은 전구체 분자로 합성되고, 세포로부터의 방출 전에 또는 방출 동안 효소 카스파제-1에 의해 절단된다. NALP-3 인플라마솜은 활성 카스파제-1을 생성하는데 있어서 결정적인 중요성을 갖는다 (Cassel et al., 2009; Ferrero-Miliani et al., 2007). IL-1 패밀리는 2종의 효능제인 IL-1α 및 IL-1β, 특이적 억제제인 IL-1 수용체 길항제 (IL-1Ra), 및 2종의 수용체인 생물학적 활성 유형 IL-1R 및 불활성 유형 II IL-1R을 함유한다 (Arend et al., 2008). IL-1RI 및 IL-33R 둘 다는 동일한 상호작용 보조 단백질 (IL-1RAcP)을 이용한다. IL-1과 IL-1Ra 사이의 균형은 다양한 기관에서 질환을 예방하는데 있어서 중요하고, IL-1의 과량 생산은 많은 인간 질환에 연루되었다. IL-18 패밀리는 또한 유체 상에서 IL-18에 결합하는 특이적 억제제인 IL-18-결합 단백질 (IL-18BP)을 함유한다. IL-18 수용체는 단일 리간드-결합 쇄 및 상이한 상호작용 보조 단백질을 포함하는 IL-1 수용체 복합체와 유사하다. IL-18은 선천성 및 적응성 면역 반응 사이에 중요한 연관성을 제공한다.
인플라마솜 활성화 및 IL-1β/IL-18 프로세싱과 분비는 질환 진행에 관여될 수 있다. 게놈전반 연관 연구는 염증성 장 질환 (IBD)에서 인플라마솜에 대한 역할을 나타낸다. 인플라마솜-화합물 NALP-3의 다형성을 갖는 환자는 보고된 바로는 크론병에 대한 증가된 위험에 놓여있다 (Ferrero-Miliani et al., 2007; Villani et al., 2009). 또한, 카스파제-1 활성화 및 IL-1β/IL-18 프로세싱을 제어하는 자가포식 성분인 Atg16l1 및 IRGM의 다형성은 보고된 바로는 크론병과 연관성이 있었다 (Baldassano et al., 2007; Cadwell et al., 2008; Kuballa et al., 2008; Saitoh et al., 2008). 독립적 연구는 IBD를 가진 환자에서 IL-1β 및 IL-18의 증가된 혈청 수준을 보고하였다 (Ludwiczek et al., 2005; Ludwiczek et al., 2004; Monteleone et al., 1999). 인간에서의 연구는 전임상 연구에 의해 추가로 지지되었다. IL-18 또는 IL-1β의 차단은 보고된 바로는 질환의 전임상 모델에서 임상 점수의 개선으로 이어진다 (Ten Hove et al., 2001).
코르티코스테로이드를 사용한 통상의 요법 및 면역조절제 요법 (예를 들어, 아자티오프린, 6 메르캅토퓨린 및 메토트렉세이트)이 부작용 및 불내성과 연관되고, 유지 요법 (스테로이드)에서의 증명된 이익을 보여주지 않았기 때문에, 중등도 내지 중증 IBD의 치료는 치료하는 의사에게 중요한 도전과제를 제시한다. 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)를 표적화하는 모노클로날 항체, 예컨대 인플릭시맙 (키메라 항체) 및 아달리무맙 (완전 인간 항체)은 현재 CD의 관리에 사용된다. 인플릭시맙은 또한 UC에서 효능을 보여주었고 사용에 대해 승인되었다. 그러나, CD를 가진 환자의 대략 10%-20%는 항 TNF 요법에 대한 1차 비반응자이고, CD 환자의 또 다른 ~20%-30%는 시간이 지남에 따라 반응을 상실한다 (Schnitzler et al., Gut 58:492-500 (2009)). 항 TNF와 연관된 다른 유해 사례 (AE)는 결핵을 비롯한 박테리아 감염의 상승된 비율, 및 보다 드물게는 림프종 및 탈수초화를 포함한다 (Chang et al., Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatology 3:220 (2006); Hoentjen et al., World J. Gastroenterol. 15(17):2067 (2009)). 어떠한 현재 이용가능한 요법도 만성 질환을 가진 IBD 환자의 20%-30% 초과에서 지속적인 완화를 달성하지 않는다 (Hanauer et al., Lancet 359:1541-49 (2002); Sandborn et al., N Engl J Med 353:1912-25 (2005)). 또한, 대부분의 환자는 지속적인 무스테로이드 완화 및 점막 치유, 진정한 질환 변형과 상관관계가 있는 임상 결과를 달성하지 않는다. 따라서, 만성 사용에 대해 최적화된, IBD에서의 보다 표적화된 요법: 항 TNF 치료제에 전혀 반응하지 않거나 또는 시간이 지남에 따라 반응을 상실하는 환자를 비롯한 보다 큰 비율의 환자에서의 지속적인 완화, 특히 무스테로이드 완화 및 장기 합병증의 예방을 갖는 개선된 안전성 프로파일을 개발할 필요성이 있다.
치료 전에 환자가 특정한 치료제 또는 치료제 부류에 반응할 것인지 여부는 종종 알려져 있지 않다. 따라서, 일반적으로 IBD 환자, 특히 CD 및 UC 환자가 치료를 구하는 경우에, 특정한 환자에 유효한 치료제(들)에 관한 조사와 관련된 상당한 시행 착오가 있다. 이러한 시행 착오는 종종 가장 유효한 요법을 찾기 위해 환자에게 불쾌감을 주고 상당히 위험하기도 하다. 따라서, 환자가 해당 치료에 반응할 것인지를 결정하고 이러한 결정을 IBD 환자에 보다 유효한 치료 요법 내로 도입시키는데 보다 유효한 수단이 필요하다.
따라서, IL-1β 및/또는 IL-18을 표적화하는 치료제, 예컨대 다중특이적 항-IL-1β/항-IL18 항체 또는 항-IL-1β 항체와 항-IL-18 항체의 조합을 비롯한 다양한 IBD 치료제를 사용한 치료에 대해 반응할 가능성이 가장 큰 환자를 객관적으로 확인하는데 사용될 수 있는, 예측 진단 바이오마커 방법을 비롯한 추가의 진단 바이오마커 및 방법을 갖는 것이 매우 유리할 것이다. 따라서, 궤양성 결장염, 크론병 뿐만 아니라 다른 염증성 장 장애와 연관되어 있으며 치료 반응을 예측하는 새로운 바이오마커를 확인할 필요성이 계속하여 존재한다. 또한, 이러한 연관성에 관한 통계상 및 생물학상 유의하고 재현가능한 정보는 특정 치료제를 사용한 치료가 유의하게 유익한 것으로 예상될 UC 또는 CD 환자의 특정 하위세트를 확인하기 위한 노력에서, 예를 들어 치료제가 상기 특정 UC 또는 CD 환자 하위집단에서 치료 이익을 갖는 것으로 임상 연구에서 나타난 경우에 통합 성분으로서 이용될 수 있다.
본원에 기재된 본 발명은 특정의 상기 기재된 필요성을 충족시키며 다른 이익을 제공한다.
특허 출원 및 공개를 비롯한 본원에 인용된 모든 참고문헌은 임의의 목적을 위해 그의 전문이 참조로 포함된다.
본 발명은 비-IBD 대상체와 비교하여, IBD 대상체의 장 조직에서 및 특정 경우에 혈청에서 차등 발현되는 특정 유전자의 확인을 적어도 부분적으로 기반으로 한다.　 또한, 본 발명은 비-섬유화 또는 염증성 조직과 비교하여, 또는 혈청의 경우에 비-IBD 또는 비-섬유화/섬유협착성 IBD 대상체와 비교하여, 예를 들어 크론병 대상체에서의 섬유화 장 조직에서 및 특정 경우에 혈청에서 차등 발현되는 특정 유전자의 확인을 적어도 부분적으로 기반으로 한다.
따라서, 한 측면에서, 염증성 장 질환을 진단하거나 또는 그의 진단을 보조하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 (a) 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현을 측정하고, (b) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준을 참조 수준과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 참조 수준을 초과하는 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 수준 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 수준은 대상체가 염증성 장 질환을 가진다는 것을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 방법은 (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 염증성 장 질환의 진단을 제공하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합은 CSF3 (GCSF), IL-24, SERPINB3, SERPINB4, AMIGO2, SERPINB7, ABAT, PF4, STEAP2, ELN, CCL4, VEGFA, DACT1, KCNMB4, PDLIM4, TGFBR1, KCNE1L, HIF1A, SLC25A45, OSMR, P4HA2, ELF3, TGIF1, TMEM158, COL7A1, COL16A1, 암피레귤린 (AREG) 및 IL-11로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합은 CSF3 (GCSF), TMEM158, Col7A1, Col16A1, 암피레귤린 (AREG), IL-11로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합은 CSF3 (GCSF) 및 암피레귤린으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 염증성 장 질환은 궤양성 결장염 또는 크론병이다.
염증성 장 질환을 진단하거나 또는 그의 진단을 보조하는 일부 실시양태에서, 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 측정된 발현 수준 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현은 IL-1β, CASP1 및 p20으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 참조 수준을 초과하는, IL-1β, CASP1 및 p20 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준은 대상체가 염증성 장 질환을 가진다는 것을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 방법은 IL-1β, CASP1 및 p20 중 하나 또는 그의 조합의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 염증성 장 질환의 진단을 제공하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 염증성 장 질환은 궤양성 결장염 또는 크론병이다.
또 다른 측면에서, 섬유화 크론병 또는 섬유협착성 크론병을 진단하거나 또는 그의 진단을 보조하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 (a) 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현을 측정하고, (b) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준을 참조 수준과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 참조 수준을 초과하는 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 수준 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 수준은 대상체가 염증성 장 질환을 가진다는 것을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 방법은 (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 염증성 장 질환의 진단을 제공하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합은 COL7A1, COL16A1, 암피레귤린, IL-11, AEBP1 및 IL1R1로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합은 MMP3, INHBA, COL5A2, CHN1, LMCD1, COL12A1, COL7A1, COL18A1, TMEM158, FAM65C, IGFBP5, THY1, TMEM132A, PXDN, GPR68, TWIST1, COL4A1, SERPINH1, AEBP1, NAB2, TMEM45A, TMEM121, VIM, NOTCH4 및 TIMP2로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 참조 수준은 비섬유화 조직에서 유전자 중 동일한 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 동일한 하나 또는 그의 조합의 발현 수준을 측정함으로써 수득된다.
특정 상기 실시양태에서, 생물학적 샘플은 장 조직이다. 특정 상기 실시양태에서, 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 발현은 PCR 방법 또는 마이크로어레이 칩을 사용하여 측정된다. 특정 상기 실시양태에서, 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현은 면역검정 또는 면역조직화학 검정을 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 면역검정은 ELISA 검정이다. 일부 상기 실시양태에서, 참조 수준은 염증성 장 장애를 갖지 않은 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 유전자 중 동일한 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 동일한 하나 또는 그의 조합의 발현 수준을 측정함으로써 수득된다.
또 다른 측면에서, 대상체에서 하위유형의 크론병을 진단하거나 또는 그의 진단을 보조하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 (a) 대상체의 장 조직으로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IL18의 발현 수준을 측정하고, (b) (a)에서 측정된 IL18의 발현 수준을 참조 수준과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 참조 수준을 초과하는 IL18의 수준은 대상체가 섬유화 크론병 또는 섬유협착성 크론병인 하위유형의 크론병을 가진다는 것을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 방법은 (a)에서 측정된 IL18의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 섬유화 크론병 또는 섬유협착성 크론병의 진단을 제공하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 참조 수준은 염증성 장 장애를 갖지 않은 대상체의 장 조직으로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IL18의 발현 수준을 측정함으로써 수득된다. 특정 실시양태에서, 참조 수준은 염증성 크론병을 가진 대상체의 장 조직으로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IL18의 발현 수준을 측정함으로써 수득된다. 특정 실시양태에서, 참조 수준은 궤양성 결장염을 가진 대상체의 장 조직으로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IL18의 발현 수준을 측정함으로써 수득된다. 특정 실시양태에서, 발현 수준은 면역검정을 사용하여 측정된다. 특정 실시양태에서, 면역검정은 ELISA 검정이다.
또 다른 측면에서, 추가로 대상체에서 염증성 장 질환을 진단하거나 또는 그의 진단을 보조하는 추가의 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 (a) 대상체로부터 수득된 혈청 샘플에서 GCSF의 발현 수준을 측정하고, (b) (a)에서 측정된 GCSF의 발현 수준을 참조 수준과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 참조 수준을 초과하는 대상체의 혈청 샘플에서의 GCSF의 수준은 대상체가 염증성 장 질환을 가진다는 것을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 방법은 (a)에서 측정된 GCSF의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 염증성 장 질환의 진단을 제공하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 염증성 장 질환은 궤양성 결장염 또는 염증성 크론병 또는 섬유화 크론병 또는 섬유협착성 크론병이다. 특정 실시양태에서, GCSF의 발현 수준은 면역검정을 사용하여 측정된다. 특정 실시양태에서, 면역검정은 ELISA 검정이다. 특정 실시양태에서, 참조 수준은 염증성 장 장애를 갖지 않은 대상체로부터 수득된 혈청 샘플에서 GCSF의 발현 수준을 측정함으로써 수득된다.
한 측면에서, 환자에서 염증성 장 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 (a) 환자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 CSF3 (GCSF), IL-24, SERPINB3, SERPINB4, AMIGO2, SERPINB7, ABAT, PF4, STEAP2, ELN, CCL4, VEGFA, DACT1, KCNMB4, PDLIM4, TGFBR1, KCNE1L, HIF1A, SLC25A45, OSMR, P4HA2, ELF3, TGIF1, TMEM158, COL7A1, COL16A1, 암피레귤린 (AREG) 및 IL-11로부터 선택된 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현을 측정하고; (b) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준을 참조 수준과 비교하고; (c) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 환자에게 항-IL-1β 항체, 항-IL-18 항체 또는 다중특이적 항-IL-1β/항-IL-18 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합은 CSF3 (GCSF), TMEM158, Col7A1, Col16A1, 암피레귤린 (AREG), IL-11로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합은 CSF3 (GCSF) 및 암피레귤린으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합은 MMP3, INHBA, COL5A2, CHN1, LMCD1, COL12A1, COL7A1, COL18A1, TMEM158, FAM65C, IGFBP5, THY1, TMEM132A, PXDN, GPR68, TWIST1, COL4A1, SERPINH1, AEBP1, NAB2, TMEM45A, TMEM121, VIM, NOTCH4, AEBP1, IL1R1 및 TIMP2로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합은 IL-1β, CASP1 및 p20으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 염증성 장 질환을 가진 환자를 치료하는데 사용하기 위한 항-IL-1β 항체, 항-IL-18 항체 또는 다중특이적 항-IL-1β/항-IL-18 항체가 제공되며, 여기서 환자는 환자로부터 수득된 샘플에서 상기 바이오마커 중 어느 하나의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에 치료된다. 특정 실시양태에서, 염증성 장 질환은 궤양성 결장염 또는 염증성 크론병 또는 섬유화 크론병 또는 섬유협착성 크론병이다. 특정 실시양태에서, 발현 수준은 PCR 방법 또는 마이크로어레이 칩을 사용하여 측정된다. 특정 실시양태에서, 발현 수준은 면역검정 또는 ELISA 검정을 사용하여 측정된다.
또 다른 측면에서, 환자에서 염증성 장 질환을 치료하는 추가의 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 (a) 환자의 장 조직으로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IL18의 발현 수준을 측정하고; (b) (a)에서 측정된 IL18의 발현 수준을 참조 수준과 비교하고; (c) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 환자에게 항-IL-1β 항체, 항-IL-18 항체 또는 다중특이적 항-IL-1β/항-IL-18 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 염증성 장 질환을 가진 환자를 치료하는데 사용하기 위한 항-IL-1β 항체, 항-IL-18 항체 또는 다중특이적 항-IL-1β/항-IL-18 항체가 제공되며, 여기서 환자는 환자의 장 조직 샘플에서 IL18의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에 치료된다. 특정 실시양태에서, 염증성 장 질환은 궤양성 결장염 또는 염증성 크론병 또는 섬유화 크론병 또는 섬유협착성 크론병이다. 특정 실시양태에서, 발현 수준은 PCR 방법 또는 마이크로어레이 칩을 사용하여 측정된다.
또 다른 측면에서, 환자에서 염증성 장 질환을 치료하는 추가의 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 (a) 대상체로부터 수득된 혈청 샘플에서 GCSF의 발현 수준을 측정하고; (b) (a)에서 측정된 GCSF의 발현 수준을 참조 수준과 비교하고; (c) (a)에서 측정된 GCSF의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 환자에게 항-IL-1β 항체, 항-IL-18 항체 또는 다중특이적 항-IL-1β/항-IL-18 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 염증성 장 질환을 가진 환자를 치료하는데 사용하기 위한 항-IL-1β 항체, 항-IL-18 항체 또는 다중특이적 항-IL-1β/항-IL-18 항체가 제공되며, 여기서 환자는 환자의 혈청 샘플에서 GCSF의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에 치료된다. 특정 실시양태에서, 염증성 장 질환은 궤양성 결장염 또는 염증성 크론병 또는 섬유화 크론병 또는 섬유협착성 크론병이다. 특정 실시양태에서, 발현 수준은 면역검정 또는 ELISA 검정을 사용하여 측정된다.
도 1은 실시예 1에 기재된 바와 같이 IBD 환자로부터 또는 비-IBD 환자로부터 수득된 절제 조직에서의 IL-1β의 증가된 수준을 제시한다. (a) CD 환자, UC 환자 및 비-IBD 환자 사이에서의 IL-1β mRNA의 비교, 질환 상태는 수평축에 표시되고, 상대 mRNA 발현 수준은 수직축에 표시된다; (b) 섬유화 또는 염증성 질환에 대해 장 절제를 받은 CD 환자 또는 비-IBD 환자 (수평축에 표시된 바와 같음)에서의 IL-1β mRNA 수준의 비교; 수직축에 표시된 바와 같은 상대 mRNA 발현 수준. 모든 mRNA 수준을 하우스키핑 유전자인 GAPDH의 수준에 대해 정규화하였다. (c) IL-1β 단백질에 대한 면역조직화학 염색; 상부 패널은 저배율에서 CD 환자 절제 조직의 절편을 제시하며, 이는 주위 조직보다 더 큰 염색 영역을 나타내고; 하부 패널은 화살표에 의해 표시된 바와 같이 동일한 절편의 보다 높은 배율의 시야를 제시한다.
도 2는 실시예 2에 기재된 바와 같이 비-IBD, UC 또는 CD 생검 조직의 이뮤노블롯 분석을 제시한다.
도 3은 실시예 1에 기재된 바와 같이 배지, IL-1β 또는 TNFα를 사용한 자극 후에 qRT-PCR에 의해 결정된 바와 같은 3종의 1차 상피하 근섬유모세포 세포주에서의 mRNA 수준을 제시한다. 각각의 경우에, 생성된 데이터를 GAPDH에 대해 정규화하였다. 세포를, 6시간 동안 자극시킨 패널 (e)를 제외하고는 24시간 동안 자극시켰다. (a) GCSF; (b) TMEM158; (c) Col7A1; (d) Col16A1; (e) 암피레귤린 (AREG); (f) IL11.
도 4는 실시예 1에 기재된 바와 같이 배지, IL-1β 또는 TNFα를 사용하여 24시간 동안 처리한 3종의 1차 상피하 근섬유모세포 세포주의 처리 후의 (a) GCSF 및 (b) 암피레귤린에 대한 세포 상청액 ELISA 결과를 제시한다.
도 5는 (a) 나타낸 바와 같이 염증성 CD (iCD), 섬유화/섬유협착성 CD (fCD), UC, 결장암, 게실염을 갖는 환자 또는 건강한 대조군에서의 혈청 GCSF 수준; LLOD = 검출 하한치, 및 (b) 실시예 1에 기재된 바와 같이 결장 용해물 및 혈청 GCSF에서의 IL-1β 수준 사이의 상관관계를 제시한다.
도 6은 실시예 1에 기재된 바와 같이 RNA 단리, H&E 염색 (이는 염증 점수를 산출함) 및 IHC에 의한 SMA 염색을 위해 매칭된 CD 조직 절편에서의 나타낸 콜라겐 및 섬유증-연관 유전자에 대한 qRT-PCR에 의해 결정된 바와 같은 RNA 발현의 수준을 제시한다. 절편을 SMA에 대한 병리학자에 의해 점수화하였으며; SMA+ 샘플은 섬유증의 증거를 갖는 것으로 간주된다. (a) 콜라겐 하위유형 7A1; (b) 콜라겐 하위유형 16A1; (c) 암피레귤린; (d) IL-11 (e) AEBP1; (f) IL1R1.
도 7은 실시예 2에 기재된 바와 같이 장 조직 용해물 및 매칭된 환자 샘플로부터의 혈청에서의 IL18 및 IL18BP 단백질 수준을 제시한다. 염증성 CD (점묘 원) 및 섬유화 CD (점 경계를 갖는 개방 원)에 관한 (a) 장 조직 용해물 IL18; (b) 혈청 IL18; (c) 장 조직 용해물 IL18BP; (d) 혈청 IL18BP; (e) 장 조직 용해물 IL18:IL18BP 비; (f) 장 조직 용해물 IL18 대 혈청 IL18BP의 비교.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 전문 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), 및 March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]은 통상의 기술자에게 본원에 사용된 다수의 용어에 대한 일반적 지침을 제공한다.
특정 정의
본 명세서를 해석하고자 하는 목적을 위해, 하기 정의가 적용될 것이고, 적절한 경우에는 언제라도, 단수형으로 사용된 용어는 복수형을 또한 포함할 것이고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 하기 열거된 임의의 정의가 본원에 참조로 포함된 임의의 문헌과 상충되는 경우에는 하기 열거된 정의가 우선한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "단백질"에 대한 언급은 복수형의 단백질을 포함하고; "세포"에 대한 언급은 세포의 혼합물 등을 포함한다.
명세서 및 첨부된 청구범위에 제공된 범위는 종점 둘 다 및 종점 사이의 모든 점을 포함한다. 따라서, 예를 들어 2.0 내지 3.0의 범위는 2.0, 3.0, 및 2.0과 3.0 사이의 모든 점을 포함한다.
"치료", "치료하는", 및 그의 문법적 변형은 치료할 개체 또는 세포의 자연적인 경과를 변경하려는 시도에서의 임상 개입을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리상태의 과정 도중에 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발병 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 경감, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 예후의 완화 또는 개선을 포함한다.
"치료 요법"은 제2 의약을 추가하거나 추가하지 않으면서, 투여량, 투여 빈도 또는 치료의 지속시간의 조합을 지칭한다.
"유효 치료 요법"은 치료를 받고 있는 환자에게 유익한 반응을 제공하게 될 치료 요법을 지칭한다.
"환자 반응" 또는 "환자 반응성"은 (1) 질환 진행의 어느 정도까지의 억제, 예컨대 지연 및 완전한 정지; (2) 질환 에피소드 및/또는 증상 수의 감소; (3) 병변 크기의 감소; (4) 인접한 말초 기관 및/또는 조직으로의 질환 세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지); (5) 질환 확산의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지); (6) 질환 병변의 퇴행 또는 제거를 일으킬 수 있으나 그래야만 하는 것은 아닌 자가면역 반응의 감소; (7) 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 경감; (8) 치료 후 무질환 상태 기간의 증가; 및/또는 (9) 치료 후 주어진 시점에서의 사망률의 감소를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 환자에 대한 이익을 나타내는 임의의 종점을 사용하여 평가될 수 있다. 용어 "반응성"은 완전 반응 (CR) 및 부분 반응 (PR)을 비롯한 측정가능한 반응을 지칭한다.
본원에 사용된 "완전 반응" 또는 "CR"은 치료에 반응한 염증의 모든 신호의 소멸 또는 완화를 의미한다. 이는 반드시 질환이 치유되었음을 의미하지는 않는다.
"부분 반응" 또는 "PR"은 치료에 반응한 염증 중증도의 적어도 50%의 감소를 지칭한다.
치료제를 사용한 치료에 대한 환자의 "유익한 반응" 및 유사한 단어는 그 작용제를 사용한 치료로부터 또는 치료의 결과로서, 위장 염증성 장애에 걸릴 위험이 있거나 장애를 앓고 있는 환자에게 부여된 임상 또는 치료 이익을 지칭한다. 이러한 이익은 그 작용제를 사용한 치료로부터 또는 치료의 결과로서 세포 또는 생물학적 반응, 완전 반응, 부분 반응, 안정 질환 (진행 또는 재발이 없음), 또는 환자의 후기 재발이 있는 반응을 포함한다.
본원에 사용된 "비-반응" 또는 "반응 결핍" 또는 유사한 단어는 치료제를 사용한 치료에 대한 완전 반응, 부분 반응 또는 유익한 반응이 부재함을 의미한다.
환자의 반응성이 치료 과정 동안의 시간에 따라 감소되지 않는 경우에, "이러한 환자는 치료에 대한 반응성을 유지한다".
본원에 사용된 용어 "샘플" 또는 "시험 샘플"은, 예를 들어 물리적, 생화학적, 화학적 및/또는 생리학적 특징에 기초하여 특성화 및/또는 확인되는 세포성 및/또는 다른 분자 엔티티를 함유하는, 관심 대상체로부터 얻거나 상기 대상체로부터 유래된 조성물을 지칭한다. 한 실시양태에서, 상기 정의는 생물학적 기원의 혈액 및 다른 액체 샘플 및 조직 샘플, 예컨대 생검 시편 또는 조직 배양물 또는 그로부터 유래된 세포를 포괄한다. 조직 샘플의 공급원은 새로운, 동결된 및/또는 보존된 기관 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성성분; 체액; 및 대상체의 임신 또는 발생 중 임의의 시점으로부터의 세포 또는 혈장일 수 있다. 용어 "샘플" 또는 "시험 샘플"은 공급 후에 시약으로 처리하거나, 가용화하거나, 특정 성분, 예컨대 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 풍부하게 하거나, 또는 절편화를 목적으로 반-고체 또는 고체 매트릭스 중에 포매시키는 것과 같은 임의의 방식으로 조작된 생물학적 샘플을 포함한다. 본원의 목적상, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 단일 부분 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단한 조직의 박편 또는 세포를 의미한다. 샘플은 전혈, 혈액-유래 세포, 혈청, 혈장, 림프액, 활액, 세포 추출물 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 샘플은 임상 샘플이다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 진단 검정에 사용된다.
본원에 사용된 "참조 샘플"은 비교 목적으로 사용되는 임의의 샘플, 표준물 또는 수준을 지칭한다. 한 실시양태에서, 참조 샘플은 동일한 대상체 또는 환자 신체의 건강한 및/또는 비-이환 부분 (예를 들어, 조직 또는 세포)으로부터 수득된다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플은 동일한 대상체 또는 환자의 신체의 비처리 조직 및/또는 세포로부터 수득된다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 개체의 신체의 건강한 및/또는 비-이환 부분 (예를 들어, 조직 또는 세포)으로부터 수득된다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 개체의 신체의 비처리 조직 및/또는 세포 부분으로부터 수득된다.
"위장 염증성 장애"는 점막에서 염증 및/또는 궤양화를 유발하는 만성 장애 군이다. 이들 장애는, 예를 들어 염증성 장 질환 (예를 들어, 크론병, 궤양성 결장염, 불확정 결장염 및 감염성 결장염), 점막염 (예를 들어, 구강 점막염, 위장 점막염, 비강 점막염 및 직장염), 괴사성 소장결장염 및 식도염을 포함한다.
"염증성 장 질환" 또는 "IBD"는 염증 및/또는 궤양화를 유발하는 장의 질환을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 이는 비제한적으로 크론병 및 궤양성 결장염을 포함한다.
"크론병 (CD)" 및 "궤양성 결장염 (UC)"은 미지 병인의 만성 염증성 장 질환이다. 크론병은 궤양성 결장염과는 달리, 장의 어떠한 부분에도 영향을 미칠 수 있다. 크론병의 가장 두드러진 양상은 장 벽에 과립형의 적색빛 자주색 부종이 비대해지는 것이다. 염증이 발생함에 따라, 이들 육아종은 종종 자신의 국한성 경계를 상실하고 주위 조직과 통합된다. 설사 및 장 폐쇄가 주요 임상 양상이다. 궤양성 결장염과 같이, 크론병의 과정은 지속적이거나 재발성, 경도이거나 중증일 수 있지만, 궤양성 결장염과는 달리, 크론병은 관계된 장 절편을 절제함으로써 치유될 수 없다. 크론병을 가진 대부분의 환자는 일부 시점에서는 수술이 필요하지만, 후속 재발이 흔하기 때문에 지속적인 의료 치료가 통상적이다.
크론병은 구강에서부터 항문까지의 소화관의 임의의 부분에 관여할 수 있지만, 전형적으로는 회결장, 소장 또는 결장-항문직장 영역에서 나타난다. 조직병리학적으로, 상기 질환은 불연속적인 육아종증, 음와 농양, 열구 및 아프타성 궤양의 징후가 나타난다. 염증성 침윤물은 림프구 (T 세포 및 B 세포 둘 다), 형질 세포, 대식세포 및 호중구로 이루어진 혼합 형태이다. IgM- 및 IgG-분비성 형질 세포, 대식세포 및 호중구에서의 불균형적 증가가 있다.
항염증 약물 술파살라진 및 5-아미노살리실산 (5-ASA)은 경도의 활성 결장성 크론병을 치료하는데 유용하고, 상기 질환의 완화를 유지시키기 위한 시도로 통상적으로 처방되고 있다. 메트로니다졸 및 시프로플록사신은 술파살라진과 효능면에서 유사하고, 특히 항문주위 질환을 치료하기 위해 처방된다. 보다 중증의 경우에는, 코르티코스테로이드가 활성 악화를 치료하기 위해 처방되고, 이는 때때로 완화를 유지시킬 수 있다. 아자티오프린 및 6-메르캅토퓨린은 또한, 코르티코스테로이드의 만성 투여를 필요로 하는 환자에서 사용되었다. 또한, 이들 약물은 장기간 예방에 있어서 일정 역할을 할 수 있는 것으로 시사되었다. 불행하게도, 일부 환자에서는 작용이 발생하기 전에 매우 장기간 (6개월까지) 지연될 수 있다. 항설사 약물은 또한, 일부 환자에서 증상 완화를 제공할 수 있다. 영양 요법 또는 기본식은 환자의 영양 상태를 개선할 수 있고, 급성 질환의 증상 개선을 유도하지만, 지속적인 임상 완화는 유도하지 않는다. 항생제는 2차 소장 박테리아 과도성장을 치료하고 화농성 합병증을 치료하는데 사용된다.
"궤양성 결장염 (UC)"은 대장을 침범한다. 질환 과정은 연속적이거나 재발성, 경도이거나 중증일 수 있다. 가장 초기 병변은 리버쿤 음와의 기저부에 농양이 형성되는 염증성 침윤이다. 이들 팽창되고 파열된 음와의 유착은 위에 가로놓인 점막을 그의 혈액 공급으로부터 분리시켜 궤양화를 유발하는 경향이 있다. 이러한 질환의 증상은 경련, 하복부통, 직장 출혈, 및 희박한 대변 입자와 함께 혈액, 고름 및 점액으로 주로 이루어진 빈번하고 무른 배설물을 포함한다. 급성, 중증 또는 만성, 끊임없는 궤양성 결장염에는 전체 결장절제술이 요구될 수 있다.
UC의 임상 양상은 고도로 가변적이고, 그 발병은 잠행성이거나 돌연성일 수 있고, 설사, 이급후중 및 재발성 직장 출혈을 포함할 수 있다. 전체 결장의 전격성 관여에 따라, 생명을 위협하는 응급 상황인 독성 거대결장증이 일어날 수 있다. 장외 징후는 관절염, 괴저성 농피증, 포도막염 및 결절성 홍반을 포함한다.
UC를 위한 치료는 경도 사례의 경우에 술파살라진 및 관련 살리실레이트-함유 약물을 포함하고, 중증 사례의 경우에 코르티코스테로이드 약물을 포함한다. 살리실레이트 또는 코르티코스테로이드를 국소 투여하는 것이 종종 유효한데, 특히 상기 질환이 말단부 장에 제한되고 전신 용도와 비교하여 부작용을 감소시키는 것과 연관되는 경우에 유효하다. 철 및 항설사제를 투여하는 것과 같은 지지 조치가 종종 지시된다. 또한, 아자티오프린, 6-메르캅토퓨린 및 메토트렉세이트가 종종 난치성 코르티코스테로이드-의존성 사례에 사용하도록 처방된다.
"유효 투여량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과 달성에 필요한 투여량에서 이러한 기간 동안 유효한 양을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "환자"는 치료가 요망되는 임의의 단일 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본원에서의 환자는 인간이다.
본원에서의 "대상체"는 전형적으로 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 비-인간 포유동물이다. 예시적인 비-인간 포유동물은 실험실 동물, 가축, 애완동물, 스포츠 동물 및 농장 동물, 예를 들어 마우스, 고양이, 개, 말 및 소를 포함한다. 전형적으로, 대상체는 치료, 예를 들어 위장 염증성 장애의 치료에 적격이다.
용어 "항체" 및 "이뮤노글로불린"은 가장 넓은 의미에서 상호교환적으로 사용되고, 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 1가 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체 등)를 포함하고, 또한 특정 항체 단편 (본원에서 보다 상세히 기재된 바와 같음)을 포함할 수 있다. 항체는 인간, 인간화 및/또는 친화도 성숙 항체일 수 있다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 단지 일부만을 포함하며, 특정 실시양태에서 상기 일부분은 무손상 항체 내에 존재할 때 그 일부분과 통상적으로 연관된 기능들 중 적어도 하나 및 전형적으로는 대부분 또는 모든 기능을 보유한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하므로 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 단편은 무손상 항체 내에 존재할 때 Fc 영역과 통상적으로 연관된 생물학적 기능들, 예컨대 FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 보체 결합 중 적어도 하나를 보유한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 이러한 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 이러한 집단을 포함하는 개개의 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원에 대해 지정된다. 추가로, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지정된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지정된다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이면서, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능이 추가로 개선되도록 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로 또한 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부분, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한 하기 종설 논문 및 그에 인용된 참고문헌을 참조한다: [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)].
"인간 항체"는 인간에 의해 생산되고/거나 본원에 개시된 바와 같은 임의의 인간 항체 제조 기술을 사용하여 제조된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 이러한 기술은 인간-유래 조합 라이브러리, 예컨대 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝 (예를 들어, 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) 및 Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)] 참조); 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주의 사용 (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 55-93 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조); 및 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)에서의 모노클로날 항체의 생성 (예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al.,Year in Immunol., 7: 33 (1993)] 참조)을 포함한다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 동물로부터의 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명백하게 제외한다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 결정 시에 항체를 95 중량% 초과로, 및 종종 99 중량% 초과로, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용함으로써 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기를 적어도 15개 수득하는데 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 은 염색을 사용한 환원 또는 비-환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의해 균일한 것으로 나타날 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하며, 이는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1회의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열 내에서 초가변적이고/거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함하며; VH에 3개가 있고 (H1, H2, H3), VL에 3개가 있다 (L1, L2, L3). 다수의 초가변 영역 묘사가 사용되고 있고 본원에 포괄된다. 카바트(Kabat) 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 기반으로 하며, 가장 통상적으로 사용된다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 코티아(Chothia)는 대신에 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM 초가변 영역은 카바트 CDR과 코티아 구조적 루프 사이의 절충을 나타내고, 이는 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되고 있다. "접촉" 초가변 영역은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 각각의 이들 HVR로부터의 잔기가 하기 기재된다.
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초가변 영역은 하기와 같은 "확장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL 내의 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 49-56 또는 50-56 또는 52-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH 내의 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 상기 정의에 대해 상기 문헌 [Kabat et al.]에 따라 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시에 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우 하위군은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우 하위군은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 III이다.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 갖지 않는 모 항체와 비교하여, 항원에 대한 항체의 친화도를 개선하는, 그의 하나 이상의 CDR 내에서의 하나 이상의 변경(들)을 갖는 항체이다. 특정 실시양태에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 생산된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에서는 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 설명하고 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1996); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
본원에 사용된 어구 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은 통상의 기술자가 2개의 수치값에 의해 측정된 생물학적 특성과 관련하여 이들 2개 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 없거나 또는 전혀 없는 것으로 간주하도록, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다.
"결합 친화도"는 일반적으로, 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 전체 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 비롯하여 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원과 서서히 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원과 보다 신속하게 결합하고 보다 오랫 동안 결합된 상태를 유지하는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
항체 또는 이뮤노글로불린과 관련하여 용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열에서 광범위하게 상이하며, 각각의 특정한 항체의 그의 특정한 항원에 대한 결합 및 특이성에 이용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역이라 지칭되는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 3개의 초가변 영역에 의해 연결되고 주로 β-시트 형태를 취하는 4개의 FR을 각각 포함하며, 상기 초가변 영역은 상기 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 근접하게 위치하고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체의 참여를 나타낸다.
항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 나머지 "Fc" 단편을 생산하며, 이러한 명칭은 그의 용이하게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 영역은 긴밀, 비-공유 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이러한 배위에서 각각의 가변 도메인의 3개의 초가변 영역은 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면 상에서 항원-결합 부위를 한정한다. 총괄적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 초가변 영역 3개만을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다 낮은 친화도에서도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 일부 잔기의 추가에 의해 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 1개의 유리 티올 기를 보유하는 Fab'의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 명백하게 구분되는 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (이뮤노글로불린)는 상이한 부류로 지정될 수 있다. 5종의 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 일부는 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배위는 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co., 2000)]에 일반적으로 기재되어 있다. 항체는 항체와 1종 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비-공유 회합에 의해 형성되는, 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는, 하기 정의된 바와 같은 항체 단편이 아닌, 실질적으로 무손상 형태인 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
본원의 목적상 "네이키드 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체이다.
용어 "Fc 영역"은 본원에서 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는, 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 것으로 사용된다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 그의 카르복실-말단까지의 범위로 한정된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은, 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 동안 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산의 재조합적 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하는 항체와 존재하지 않는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 본원에서 이뮤노글로불린 중쇄 내의 잔기에 관한 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] (명백히 본원에 참조로 포함됨)에서와 같은 EU 인덱스의 것이다. "카바트에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 갖는다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능을 위해서는 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 합해져야만 하고, 이는 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 그의 자연 발생 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 하나 이상의 아미노산 변형을 통해 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은, 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 1개의 아미노산 치환, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 및 특정 실시양태에서 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과의 적어도 약 80%의 상동성, 또는 그와의 적어도 약 90%의 상동성, 또는 그와의 적어도 약 95%의 상동성을 보유할 것이다.
중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 무손상 항체는 상이한 "부류"로 지정될 수 있다. 5종의 주요 부류의 무손상 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 일부는 "하위부류" (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배위는 널리 공지되어 있다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식한 후에 이러한 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 1개 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 특정 실시양태에서, 이러한 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 이펙터 세포는 그의 천연 공급원, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 혈액 또는 PBMC로부터 단리될 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재하는 것으로 사용된다. 특정 실시양태에서, FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 추가로, FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체 (이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함함)를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 주로 그의 세포질 도메인에 있어서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조 검토). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 추후에 확인될 것들을 포함하여 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포괄된다. 상기 용어는 또한, 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하고 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), 이뮤노글로불린의 항상성을 조절하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다. 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합이 개선되고 반감기가 증가된 항체가 WO00/42072 (Presta, L.) 및 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 예를 들어, Fc 영역은 위치 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 또는 434 (잔기의 Eu 넘버링) 중 1개 이상에서 치환을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, FcRn 결합이 개선된 Fc 영역-포함 항체 변이체는 그의 Fc 영역의 위치 307, 380 및 434 (잔기의 Eu 넘버링) 중 1, 2 또는 3개에서 아미노산 치환을 포함한다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv 단편의 검토를 위해, 문헌 [Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다. HER2 항체 scFv 단편은 WO93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458에 기재되어 있다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 가변 경쇄 도메인 (VL)과 연결된 가변 중쇄 도메인 (VH)을 포함한다 (VH - VL). 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강제된다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 나타내지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선하는, 그의 하나 이상의 초가변 영역 내에서의 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 특정 실시양태에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 생산된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에서는 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 설명하고 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
"아미노산 서열 변이체" 항체는 본원에서 주요 종 항체와 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 특정 실시양태에서, 아미노산 서열 변이체는 주요 종 항체와 적어도 약 70%의 상동성을 가질 것이거나, 또는 이들은 주요 종 항체와 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 상동성일 것이다. 아미노산 서열 변이체는 주요 종 항체의 아미노산 서열 내의 또는 이러한 서열에 인접한 특정 위치에서 치환, 결실 및/또는 부가를 보유한다. 본원에서 아미노산 서열 변이체의 예는 산성 변이체 (예를 들어, 탈아미드화 항체 변이체), 염기성 변이체, 그의 1 또는 2개의 경쇄 상에 아미노-말단 리더 연장부 (예를 들어, VHS-)를 갖는 항체, 그의 1 또는 2개의 중쇄 상에 C-말단 리신 잔기를 갖는 항체 등을 포함하며, 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열에 대한 변이 조합을 포함한다. 본원에서 특별히 관심을 갖는 항체 변이체는 1 또는 2개 경쇄 상에 아미노-말단 리더 연장부를 포함하고, 주요 종 항체에 비해 다른 아미노산 서열 및/또는 글리코실화 차이를 임의로 추가로 포함하는 항체이다.
"글리코실화 변이체" 항체는 본원에서 그에 부착된 하나 이상의 탄수화물 모이어티가 주요 종 항체에 부착된 하나 이상의 탄수화물 모이어티와 상이한 항체이다. 본원의 글리코실화 변이체의 예는 그의 Fc 영역에 부착된, G0 올리고사카라이드 구조 대신에 G1 또는 G2 올리고사카라이드 구조를 갖는 항체, 그의 1 또는 2개의 경쇄에 부착된 1 또는 2개의 탄수화물 모이어티를 갖는 항체, 항체의 1 또는 2개의 중쇄에 부착된 탄수화물이 전혀 없는 항체, 및 글리코실화 변경들의 조합을 포함한다. 항체가 Fc 영역을 갖는 경우에, 올리고사카라이드 구조는, 예를 들어 잔기 299 (298, 잔기의 Eu 넘버링)에서 항체의 1 또는 2개의 중쇄에 부착될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고/거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함)를 포함한다.
용어 "시토카인"은 세포간 매개자로서 또 다른 세포에 대해 작용하는, 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반 용어이다. 이러한 시토카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 통상적인 폴리펩티드 호르몬이다. 이러한 시토카인에 포함되는 것은 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예컨대 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체화 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮬러-억제 물질; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예컨대 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터류킨 (IL), 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-18; 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-α 또는 TNF-β; 및 다른 폴리펩티드 인자 (LIF 및 kit 리간드 (KL) 포함)이다. 본원에 사용된 용어 시토카인은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 시토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
보조 요법에 대해 본원에 사용된 용어 "면역억제제"는 본원에서 치료할 대상체의 면역계를 억제하거나 차폐하는 작용을 하는 물질을 지칭한다. 이는 시토카인 생산을 억제하거나 자기-항원 발현을 하향-조절 또는 억제하거나 MHC 항원을 차폐하는 물질을 포함한다. 이러한 작용제의 예는 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘 (미국 특허 번호 4,665,077 참조); 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID); 간시클로비르; 타크롤리무스; 글루코코르티코이드, 예컨대 코르티솔 또는 알도스테론; 항염증제, 예컨대 시클로옥시게나제 억제제; 5-리폭시게나제 억제제; 또는 류코트리엔 수용체 길항제; 퓨린 길항제, 예컨대 아자티오프린 또는 미코페놀레이트 모페틸 (MMF); 알킬화제, 예컨대 시클로포스파미드; 브로모크립틴; 다나졸; 답손; 글루타르알데히드 (이는 미국 특허 번호 4,120,649에 기재된 바와 같이, MHC 항원을 차폐함); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-이디오타입 항체; 시클로스포린; 6 메르캅토퓨린; 스테로이드, 예컨대 코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코이드 유사체, 예를 들어 프레드니손, 메틸프레드니솔론 (솔루-메드롤(SOLU-MEDROL)® 메틸프레드니솔론 나트륨 숙시네이트 포함) 및 덱사메타손; 디히드로폴레이트 리덕타제 억제제, 예컨대 메토트렉세이트 (경구 또는 피하); 항말라리아제, 예컨대 클로로퀸 및 히드록시클로로퀸; 술파살라진; 레플루노미드; 시토카인 또는 시토카인 수용체 항체 또는 길항제 (항-인터페론-알파, -베타 또는 -감마 항체 포함), 항-종양 괴사 인자 (TNF)-알파 항체 (인플릭시맙 (레미케이드(REMICADE)®) 또는 아달리무맙), 항-TNF-알파 이뮤노어드헤신 (에타네르셉트), 항-TNF-베타 항체, 항-인터류킨-2 (IL-2) 항체 및 항-IL-2 수용체 항체, 및 항-인터류킨-6 (IL-6) 수용체 항체 및 길항제; 항-LFA-1 항체 (항-CD11a 및 항-CD18 항체 포함); 항-L3T4 항체; 이종 항-림프구 글로불린; 범-T 항체, 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 함유하는 가용성 펩티드 (1990년 7월 26일자로 공개된 WO 90/08187); 스트렙토키나제; 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-베타); 스트렙토도마제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 클로람부실; 데옥시스페르구알린; 라파마이신; T-세포 수용체 (미국 특허 번호 5,114,721 (Cohen et al.)); T-세포 수용체 단편 (Offner et al., Science, 251: 430-432 (1991); WO 90/11294; [Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)]; 및 WO 91/01133); BAFF 길항제, 예컨대 BAFF 또는 BR3 항체 또는 이뮤노어드헤신 및 zTNF4 길항제 (검토를 위해, 문헌 [Mackay and Mackay, Trends Immunol., 23:113-5 (2002)] 참조; 및 또한 하기 정의 참조); T 세포 헬퍼 신호를 방해하는 생물학적 작용제, 예컨대 항-CD40 수용체 또는 항-CD40 리간드 (CD154), 예를 들어 CD40-CD40 리간드에 대한 차단 항체 (예를 들어, 문헌 [Durie et al., Science, 261: 1328-30 (1993); Mohan et al., J. Immunol., 154: 1470-80 (1995)]) 및 CTLA4-Ig (Finck et al., Science, 265: 1225-7 (1994)); 및 T 세포 수용체 항체 (EP 340,109), 예컨대 T10B9를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "개선하다" 또는 "개선"은 상태, 질환, 장애 또는 표현형, 예컨대 이상 또는 증상의 감소, 축소 또는 제거를 지칭한다.
질환 또는 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염 또는 크론병)의 "증상"은 대상체가 경험하고 질환을 나타내는 임의의 병적 현상, 또는 구조, 기능 또는 감각에 있어서의 정상을 벗어나는 것이다.
표현 "치료 유효량"은 질환 또는 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염 또는 크론병)를 예방하거나, 개선하거나 또는 치료하는데 효과적인 양을 지칭한다. 예를 들어, 항체의 "치료 유효량"은 특정된 질환 또는 장애를 예방하거나, 개선하거나 또는 치료하는데 효과적인 항체의 양을 지칭한다. 유사하게, 항체 및 제2 화합물의 조합의 "치료 유효량"은, 특정된 질환 또는 장애를 예방하거나, 개선하거나 또는 치료하는데 효과적인 조합 중 항체의 양 및 제2 화합물의 양을 지칭한다.
용어 2종의 화합물"의 조합"은 화합물이 서로 혼합물로 투여되어야 한다는 것을 의미하지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 이러한 조합을 사용하는 치료 또는 이러한 조합의 사용은 화합물의 혼합물 또는 화합물의 개별 투여를 포괄하며, 동일한 날 또는 상이한 날의 투여를 포함한다. 따라서, 용어 "조합"은 2종 이상의 화합물이 치료를 위해 개별적으로 또는 서로 혼합물로 사용된다는 것을 의미한다. 항체 및 제2 화합물이, 예를 들어 대상체에게 조합되어 투여되는 경우에, 항체는 항체 및 제2 화합물이 대상체에게 개별적으로 투여되든지 혼합물로 투여되든지, 제2 화합물이 또한 대상체 내에 존재하는 시점에 대상체 내에 존재한다. 특정 실시양태에서, 항체 이외의 화합물은 항체 전에 투여된다. 특정 실시양태에서, 항체 이외의 화합물은 항체 후에 투여된다.
본원의 목적상, "종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파)"는 문헌 [Pennica et al., Nature, 312:721 (1984) 또는 Aggarwal et al., JBC, 260:2345 (1985)]에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 인간 TNF-알파 분자를 지칭한다.
본원에서 "TNF-알파 억제제"는 일반적으로 TNF-알파에 결합하여 그의 활성을 중화함으로써 TNF-알파의 생물학적 기능을 어느 정도 억제시키는 작용제이다. 본원에서 구체적으로 고려되는 TNF 억제제의 예는 에타네르셉트 (엔브렐(ENBREL)®), 인플릭시맙 (레미케이드®), 아달리무맙 (휴미라(HUMIRA)®), 골리무맙 (심포니(SIMPONI)™) 및 세톨리주맙 페골 (심지아(CIMZIA)®)이다.
"코르티코스테로이드"는 자연 발생 코르티코스테로이드의 효과를 모방하거나 증대시키는, 스테로이드의 일반적 화학 구조를 갖는 여러 합성 또는 자연 발생 물질 중 임의의 것을 지칭한다. 합성 코르티코스테로이드의 예는 프레드니손, 프레드니솔론 (메틸프레드니솔론 포함), 덱사메타손, 트리암시놀론 및 베타메타손을 포함한다.
"길항제"는 특정한 또는 특정된 단백질의 활성, 예컨대 리간드의 경우에는 하나 이상의 수용체에 대한 그의 결합, 또는 수용체의 경우에는 하나 이상의 리간드에 대한 그의 결합을 중화하거나, 차단하거나, 억제하거나, 없애거나, 감소시키거나, 또는 방해할 수 있는 분자를 지칭한다. 길항제는 항체 및 그의 항원-결합 단편, 단백질, 펩티드, 당단백질, 당펩티드, 당지질, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 핵산, 생물유기 분자, 펩티드모방체, 약리학적 작용제 및 그의 대사물, 전사 및 번역 제어 서열 등을 포함한다. 길항제는 또한 단백질의 소분자 억제제, 및 단백질에 특이적으로 결합하여 그것이 그의 표적에 결합하는 것을 봉쇄하는 융합 단백질, 수용체 분자 및 유도체, 단백질의 길항제 변이체, 단백질에 대해 지정된 안티센스 분자, RNA 압타머, 및 단백질에 대한 리보자임을 포함한다.
본원에 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 길이가 적어도 약 7개의 뉴클레오티드 및 약 250개 미만의 뉴클레오티드인 짧은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 합성될 수 있다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기재는 올리고뉴클레오티드에 동일하고 완전하게 적용가능하다.
용어 "프라이머"는 핵산에 혼성화하고, 일반적으로 유리 3'-OH 기를 제공함으로써 상보성 핵산의 중합을 허용할 수 있는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
용어 "증폭"은 하나 이상의 카피의 참조 핵산 서열 또는 그의 상보체의 생산 과정을 지칭한다. 증폭은 선형 증폭 또는 지수 증폭 (예를 들어, PCR)일 수 있다. "카피"가 반드시 주형 서열에 대해 완벽한 서열 상보성 또는 동일성을 의미하는 것은 아니다. 예를 들어, 카피는 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 데옥시이노신, 인위적인 서열 변경 (예컨대, 주형에 혼성화가능하지만 완전히 상보성이지는 않은 서열을 포함하는 프라이머를 통해 도입된 서열 변경), 및/또는 증폭 동안 발생하는 서열 오류를 포함할 수 있다.
용어 "검출"은 직접 및 간접 검출을 비롯한 임의의 검출 수단을 포함한다.
"상승된 발현" 또는 "상승된 수준"은 자가면역 질환, 예를 들어 IBD를 앓고 있지 않은 개체 또는 개체들과 같은 대조군에 비해 또는 미리 확립된 역치 또는 컷-오프 값에 비해 또는 환자 및/또는 대상체 집단에 대한 중앙값에 비해 환자에서 mRNA 또는 단백질의 증가된 발현을 지칭한다.
"낮은 발현" 또는 "낮은 발현 수준"은 자가면역 질환, 예를 들어 IBD를 앓고 있지 않은 개체 또는 개체들과 같은 대조군에 비해 또는 미리 확립된 역치 또는 컷-오프 값에 비해 또는 환자 및/또는 대상체 집단에 대한 중앙값에 비해 환자에서 mRNA 또는 단백질의 감소된 발현을 지칭한다.
용어 "멀티플렉스-PCR"은 단일 반응에서 2개 이상의 DNA 서열을 증폭시킬 목적으로 하나 초과의 프라이머 세트를 사용하여 단일 공급원 (예를 들어, 환자)으로부터 수득한 핵산에 대해 수행되는 단일 PCR 반응을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "바이오마커"는 환자의 생물학적 샘플에서 검출될 수 있는 환자의 표현형의 지시자, 예를 들어 병리학적 상태 또는 치료제에 대한 반응 가능성을 지칭한다. 바이오마커는 DNA, RNA, 단백질, 탄수화물 또는 당지질-기재 분자 마커를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "진단"은 분자 또는 병리학적 상태, 질환 또는 상태의 확인 또는 분류를 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 예를 들어, "진단"은 특정한 유형의 IBD, 예를 들어 UC 또는 크론병의 확인을 지칭할 수 있다. "진단"은 또한 예를 들어 조직병리학적 기준, 또는 분자 특징 (예를 들어, 특정한 유전자 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현을 특징으로 하는 하위유형)에 의한 특정한 하위유형의 IBD의 분류를 지칭할 수 있다.
용어 "진단을 보조하는 것"은 특정한 유형의 증상 또는 상태의 존재 또는 특성에 관한 임상 결정을 보조하는 방법을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 예를 들어, IBD의 진단을 보조하는 방법은 개체로부터의 생물학적 샘플에서 특정 유전자의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 어구 "진단을 제공하는"은 환자의 샘플에서 본원에 기재된 바와 같은 바이오마커 중 어느 하나 이상 또는 그의 조합의 수준 또는 존재에 관하여 생성된 정보 또는 데이터를 사용하여 환자에서 궤양성 결장염, 크론병, 염증성 크론병, 섬유화/섬유협착성 크론병을 비롯한 염증성 장 질환을 진단하는 것을 지칭한다. 정보 또는 데이터는 서면, 구술 또는 전자의 임의의 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생성된 정보 또는 데이터를 사용하는 것은 통신, 제시, 보고, 저장, 송신, 전달, 공급, 전송, 분배 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 통신, 제시, 보고, 저장, 송신, 전달, 공급, 전송, 분배 또는 이들의 조합은 컴퓨터 장치, 분석기 유닛 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다. 일부 추가의 실시양태에서, 통신, 제시, 보고, 저장, 송신, 전달, 공급, 전송, 분배 또는 이들의 조합은 실험실 또는 의료 전문가에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 정보 또는 데이터는 참조 수준에 대한, 본원에 기재된 바와 같은 바이오마커 중 어느 하나 이상 또는 그의 조합의 수준의 비교를 포함한다. 일부 실시양태에서, 정보 또는 데이터는 본원에 기재된 바와 같은 바이오마커 중 어느 하나 이상 또는 그의 조합이 샘플에 존재 또는 부재한다는 지표를 포함한다. 일부 실시양태에서, 정보 또는 데이터는 환자가 염증성 장 질환으로 진단된다는 지표를 포함한다. 일부 실시양태에서, 정보 또는 데이터는 환자가 궤양성 결장염, 크론병, 염증성 크론병 또는 섬유화/섬유협착성 크론병으로 진단된다는 지표를 포함한다.
본원에 사용된 어구 "치료를 권장하는"은 요법에 의해 적합하게 치료되거나 적합하게 치료되지 않은 환자를 확인하기 위해 환자의 샘플에서 본원에 기재된 바와 같은 바이오마커 중 어느 하나 이상 또는 그의 조합의 수준 또는 존재에 관하여 생성된 정보 또는 데이터를 사용하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서 요법은 항-IL-1β 항체 및/또는 항-IL-18 항체/항체들을 포함할 수 있다. 정보 또는 데이터는 서면, 구술 또는 전자의 임의의 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생성된 정보 또는 데이터를 사용하는 것은 통신, 제시, 보고, 저장, 송신, 전달, 공급, 전송, 분배 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 통신, 제시, 보고, 저장, 송신, 전달, 공급, 전송, 분배 또는 이들의 조합은 컴퓨터 장치, 분석기 유닛 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다. 일부 추가의 실시양태에서, 통신, 제시, 보고, 저장, 송신, 전달, 공급, 전송, 분배 또는 이들의 조합은 실험실 또는 의료 전문가에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 정보 또는 데이터는 참조 수준에 대한, 본원에 기재된 바와 같은 바이오마커 중 어느 하나 이상 또는 그의 조합의 수준의 비교를 포함한다. 일부 실시양태에서, 정보 또는 데이터는 본원에 기재된 바와 같은 바이오마커 중 어느 하나 이상 또는 그의 조합이 샘플에 존재 또는 부재한다는 지표를 포함한다. 일부 실시양태에서, 정보 또는 데이터는 환자가 항-IL-1β 항체 및/또는 항-IL-18 항체/항체들을 포함하는 요법으로 적합하게 치료되거나 적합하게 치료되지 않는다는 지표를 포함한다.
용어 "예후"는 자가면역 질환, 예컨대 IBD의 자가면역 장애-기인 질환 증상의 가능성의 예측을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다.
용어 "예측"은 환자가 약물 (치료제) 또는 약물 세트 또는 치료 요법에 대해 유리하게 또는 불리하게 반응할 가능성을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 한 실시양태에서, 예측은 이러한 반응의 정도에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 예측은 환자가 치료, 예를 들어 특정한 치료제를 사용한 치료 후에 또는 질환의 재발 없이 특정 기간 동안 생존하거나 개선되는지의 여부 및/또는 그러할 확률과 관련이 있다. 본원에 기재된 바와 같은 예측 방법은 임의의 특정한 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택하여 치료를 결정하는데 임상적으로 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 예측 방법은 환자가 치료 요법, 예컨대 주어진 치료 요법, 예를 들어 주어진 치료제 또는 조합의 투여, 수술적 개입, 스테로이드 치료 등에 유리하게 반응할 것인지의 여부 또는 치료 요법 후에 환자의 장기간 생존 또는 완화 또는 지속적 완화가 가능한지의 여부를 예측할 때 유용한 도구이다.
"대조군 대상체"는 특정한 질환, 예를 들어 IBD를 가지는 것으로 진단되지 않았으며 그 질환과 연관된 임의의 징후 또는 증상을 앓고 있지 않은 건강한 대상체를 지칭한다.
"상관시키다" 또는 "상관시키는"은 임의의 방식으로 제1 분석 또는 프로토콜의 성과 및/또는 결과를 제2 분석 또는 프로토콜의 성과 및/또는 결과와 비교하는 것을 의미한다. 예를 들어, 제2 프로토콜의 수행시에 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용할 수 있고/있거나 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용하여 제2 분석 또는 프로토콜을 수행해야 하는지의 여부를 결정할 수 있다. 유전자 발현 분석 또는 프로토콜의 실시양태와 관련하여, 유전자 발현 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용하여 특정 치료 요법을 수행해야 하는지의 여부를 결정할 수 있다.
"포장 삽입물"은 치료 제품 또는 의약의 상업용 패키지 내에 통상적으로 포함되어 있으며 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기사항, 이러한 포장 제품과 조합될 다른 치료 제품, 및/또는 이러한 치료 제품 또는 의약의 사용에 관한 경고 등에 대한 정보를 함유하는 지침서를 지칭하는 것으로 사용된다.
"키트"는 적어도 하나의 시약, 예를 들어 IBD, 예를 들어 UC 또는 크론병의 치료를 위한 의약, 또는 예를 들어 바이오마커 유전자 또는 단백질을 특이적으로 검출하기 위한 프로브를 포함하는 임의의 제조 물품 (예를 들어, 패키지 또는 용기)이다. 특정 실시양태에서, 제조 물품은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유닛으로서 프로모션되거나, 배급되거나 또는 판매된다.
"표적 청중"은, 마케팅 또는 광고에 의해서와 같이, 특히 특정한 용도, 치료 또는 적응증을 위한 특정한 의약이 프로모션되고 있거나 프로모션되도록 의도되는 일군의 사람들 또는 기관, 예컨대 개별 환자, 환자 집단, 신문, 의학 문헌 및 잡지의 구독자, 텔레비젼 또는 인터넷 시청자, 라디오 또는 인터넷 청취자, 의사, 제약 회사 등이다.
용어 "혈청 샘플"은 개체로부터 수득된 임의의 혈청 샘플을 지칭한다. 포유동물로부터 혈청을 수득하기 위한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
용어 "전혈"은 개체로부터 수득된 임의의 전혈 샘플을 지칭한다. 전형적으로, 전혈은 모든 혈액 성분, 예를 들어 세포 성분 및 혈장을 함유한다. 포유동물로부터 전혈을 수득하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
표현 "에 반응성이 아닌", "비-반응" 및 이들의 문법적 변형은 이전에 투여된 하나 이상의 의약 (치료제)에 대한 대상체 또는 환자의 반응과 관련이 있으며, 이러한 의약(들)의 투여시에 치료를 받은 장애의 치료에 대한 임의의 또는 적절한 징후를 나타내지 않거나 의약(들)에 대해 임상적으로 허용되지 않는 높은 정도의 독성을 나타내거나 이러한 의약(들)의 최초 투여 후에 치료 징후를 유지하지 않는 대상체 또는 환자를 나타내며, 이와 관련하여 사용된 치료라는 단어는 본원에 정의된 바와 같이 사용된다. 어구 "반응성이 아닌"은 이전에 투여된 의약(들)에 대해 내성이 있고/있거나 불응성인 대상체에 관한 기재를 포함하고, 의약(들)이 투여되는 동안에도 대상체 또는 환자가 진행된 상황 및 대상체 또는 환자가 더이상 반응성이 아니어서 이러한 의약(들)을 수반하는 투여를 완료한 후 이들이 12개월 이내 (예를 들어, 6개월 이내)에 진행된 상황을 포함한다. 따라서, 하나 이상의 의약에 대한 비-반응성은, 이것을 사용한 이전 또는 현행 치료 후에도 계속해서 활성 질환을 가지는 대상체를 포함한다. 예를 들어, 환자는 비-반응성인 의약(들)을 사용하는 요법을 시작한지 약 1 내지 3개월 또는 3 내지 6개월 또는 6 내지 12개월 후에 활성 질환의 활성을 가질 수 있다. 이러한 반응성은 해당 장애 치료에 숙련된 임상의가 평가할 수 있다.
의약(들)에 대해 반응하지 않을 목적으로, 하나 이상의 의약을 이용한 이전의 또는 최근의 치료로부터 "임상적으로 허용되지 않는 높은 수준의 독성"을 경험한 대상체는 경험이 풍부한 임상의에 의해 유의한 것으로 고려되는, 예를 들어 심각한 감염, 울혈성 심부전, 탈수초화 (다발성 경화증으로 이어짐), 심각한 과민증, 신경병리학적 사례, 고도의 자가면역, 암, 예컨대 자궁내막암, 비-호지킨 림프종, 유방암, 전립선암, 폐암, 난소암, 또는 흑색종, 결핵 (TB) 등과 같은 그와 연관된 하나 이상의 부정적 부작용 또는 유해 사례를 경험하게 된다.
특정 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자에 대한 증가된 임상 이익 또는 특정한 치료제 또는 치료 요법에 대한 반응의 예측과 연관된 바이오마커의 "양" 또는 "수준"은 생물학적 샘플 중의 검출가능한 수준이다. 이것은 통상의 기술자에게 공지되고 또한 본 발명에 의해 개시된 방법에 의해 측정될 수 있다. 평가되는 바이오마커의 발현 수준 또는 양은 치료 또는 치료제에 대한 반응 또는 예측된 반응을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "발현의 수준" 또는 "발현 수준"은 일반적으로 상호교환적으로 사용되고, 일반적으로 생물학적 샘플에서 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 생성물 또는 단백질의 양을 지칭한다. "발현"은 일반적으로 유전자-코딩 정보가, 세포 내에 존재하고 작동하는 구조로 전환되는 과정을 지칭한다. 따라서, 본원에 사용된 유전자의 "발현"은 폴리뉴클레오티드로의 전사, 단백질로의 번역 또는 심지어 단백질의 번역후 변형을 지칭할 수 있다. 전사된 폴리뉴클레오티드, 번역된 단백질 또는 번역후 변형된 단백질의 단편은 또한 이들이 대안적 스플라이싱에 의해 생성된 전사체 또는 분해된 전사체로부터 유래하든지 또는 예를 들어 단백질분해에 의한 단백질의 번역후 프로세싱으로부터 유래하든지 발현되는 것으로 여겨질 것이다. "발현된 유전자"는 mRNA로서 폴리뉴클레오티드로 전사되고, 이어서 단백질로 번역되는 것, 또한 RNA로 전사되지만 단백질로 번역되지 않는 것 (예를 들어, 전달 및 리보솜 RNA)을 포함한다.
어구 "항-IL-1β 항체 및/또는 항-IL-18 항체/항체들"은, 문맥에 따라, (1) 항-IL-1β 항체, 또는 (2) 항-IL-18 항체, 또는 (3) 항-IL-1β 항체와 항-IL-18 항체의 조합 (즉, 2종의 항체), 또는 (4) IL-1β 및 IL-18 둘 다에 결합하는 항체를 지칭한다.
용어 "항-IL-1β 항체" 및 "IL-1β에 결합하는 항체"는 항체가 IL-1β를 표적화하는데 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 IL-1β에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 관련되지 않은 비-IL-1β 단백질에 대한 항-IL-1β 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA)에 의해 측정 시 IL-1β에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 항-IL-1β 항체는 상이한 종으로부터의 IL-1β 사이에 보존된 IL-1β의 에피토프에 결합한다.
용어 "항-IL-18 항체" 및 "IL-18에 결합하는 항체"는 항체가 IL-18를 표적화하는데 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 IL-18에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 관련되지 않은 비-IL-18 단백질에 대한 항-IL-18 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA)에 의해 측정 시 IL-18에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 항-IL-18 항체는 상이한 종으로부터의 IL-18 사이에 보존된 IL-18의 에피토프에 결합한다.
"인플라마솜-매개 질환"은 IL-1β 및/또는 IL-18이 정상적인 비염증성 조직에 비해 상승되어 있는 임의의 질환을 지칭한다. 일반적으로, 인플라마솜-매개 질환에서, 카스파제-1 프로세싱 및/또는 활성화가 관여되어 있으며/유도되지 않은 대조군 세포에 비해 상승되어 있다. 카스파제-1 활성은 상업적으로 입수가능한 검정 키트, 예를 들어 카스파제 1 형광측정 검정 키트 (Cat. 번호 ab394120; 압캠(AbCam), 매사추세츠주 캠브리지), 카스파제-1 비색 검정 (Cat. 번호 BF14100; 알앤디 시스템즈(R&D Systems)) 등을 사용하여 측정될 수 있다.
일반적으로, 질환 또는 상태는 그것이 체액 또는 조직에서 IL-1β의 상승된 수준과 연관되어 있는 경우에 또는 신체로부터 취한 세포 또는 조직이 배양에서 IL-1β의 상승된 수준을 생성하는 경우에 IL-1β 관련 질환 또는 상태로 간주될 수 있다. 유사하게, 질환 또는 상태는 그것이 체액 또는 조직에서 IL-18의 상승된 수준과 연관되어 있는 경우에 또는 신체로부터 취한 세포 또는 조직이 배양에서 IL-18의 상승된 수준을 생성하는 경우에 IL-18 관련 질환 또는 상태로 간주될 수 있다. 따라서, IL-1β/IL-18 관련 질환 또는 상태는 체액 또는 조직에서 IL-1β 및 IL-18의 상승된 수준과 연관되어 있거나 또는 신체로부터 취한 세포 또는 조직이 배양에서 두 시토카인의 상승된 수준을 생성하는 경우이다.
IL-1β 관련 질환의 예는 급성 췌장염; ALS; AIDS-유도 악액질을 비롯한 악액질/식욕부진; 천식 및 다른 폐 질환; 자가면역 혈관염; CIAS1 연관 주기성 증후군 (CAPS); 신생아 발병 다기관 염증성 장애 (NOMID/CINCA), 전신 발병 소아 특발성 관절염, 스틸병, 머클-웰즈 증후군, 만성 피로 증후군; 클로스트리디움(Clostridium)-연관 설사를 비롯한 클로스트리디움 연관 질병; 울혈성 심부전, 관상동맥 재협착, 심근경색, 심근 기능장애 (예를 들어, 패혈증과 관련된 것), 및 관상 동맥 우회로 이식을 비롯한 관상동맥 상태 및 적응증; 암, 예컨대 다발성 골수종 및 골수 (예를 들어, AML 및 CML) 및 다른 백혈병, 뿐만 아니라 종양 전이; 당뇨병 (예를 들어, 인슐린 당뇨병); 자궁내막증; 가족성 한랭 자가염증성 증후군 (FCAS); 가족성 지중해열 (FMF); 열; 섬유근육통; 사구체신염; 이식편 대 숙주 질환/이식 거부; 출혈성 쇼크; 통각과민; 염증성 장 질환; 건선성 관절염 (뿐만 아니라 골관절염 및 류마티스 관절염)을 비롯한 관절의 염증성 상태; 염증성 안질환, 예를 들어 각막 이식과 연관될 수 있는 것; 뇌 허혈 (예를 들어, 각각이 신경변성으로 이어질 수 있는 외상, 간질, 출혈 또는 졸중의 결과로서의 뇌 손상)을 비롯한 허혈; 가와사키병; 학습 장애; 폐 질환 (예를 들어, ARDS); 근병증 (예를 들어, 특히 패혈증에서 근육 단백질 대사); 신경독성 (예를 들어, HIV에 의해 유도된 것); 골다공증; 암-관련 통증을 비롯한 통증; 파킨슨병; 치주 질환; 조기 진통; 건선; 재관류 손상; 방사선 요법으로부터의 부작용; 수면 장애; 측두 하악 관절 질환; 종양 괴사 인자 수용체-연관 주기열 증후군 (TRAPS); 포도막염; 또는 균주, 염좌, 연골 손상, 외상, 정형외과 수술, 감염 또는 다른 질환 과정으로부터 유래하는 염증성 상태이다.
인터류킨 18은 면역 및 염증성 요소를 포함하는 다양한 질환과 연관된 병리상태에서 중요한 역할을 한다. 이들 질환은 류마티스 관절염, 골관절염, 소아 만성 관절염, 라임 관절염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 척추관절병증, 루푸스 (예를 들어, 전신 홍반성 루푸스 및 루푸스 신염), 크론병, 궤양성 결장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 제1형 건선, 제2형 건선, 피부염 경피증, 이식편 대 숙주 질환, 기관 이식 거부, 기관 이식과 연관된 급성 또는 만성 면역 질환, 사르코이드증, 아테롬성동맥경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키병, 그레이브스병, 신증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증, 헤노흐-쉔라인 푸르푸레아, 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충성 질환, 급성 횡단성 척수염, 헌팅톤 무도병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 졸중, 원발성 담즙성 간경변증, 용혈성 빈혈, 악성종양, 심부전, 심근경색, 애디슨병, 산발성, 제I형 다선성 결핍 및 제II형 다선성 결핍, 슈미트 증후군, 성인 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 원형 탈모증, 혈청음성 관절병증, 관절병증, 라이터병, 건선성 관절병증, 궤양성 결장염 관절병증, 장병증성 활막염, 클라미디아, 예르시니아 및 살모넬라 연관 관절병증, 척추관절병증, 아테롬성 질환1 동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 유천포창, 선상 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 쿰스 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 소아 악성 빈혈, 근육통성 뇌염/로열 프리 질환, 만성 점막피부 칸디다증, 거대 세포 동맥염, 원발성 경화성 간염, 잠재성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍 질환 증후군, 후천성 면역결핍 관련 질환, C형 간염, 공통 가변성 면역결핍, 공통 가변성 저감마글로불린혈증, 확장성 심근병증, 여성 불임, 난소 부전, 조기 난소 부전, 섬유화 폐 질환, 잠재성 섬유화 폐포염, 염증후 간질성 폐 질환, 간질성 폐렴, 결합 조직 질환 연관 간질성 폐 질환, 혼합 결합 조직 질환 연관 폐 질환, 전신 경화증 연관 간질성 폐 질환, 류마티스 관절염 연관 간질성 폐 질환, 전신 홍반성 루푸스 연관 폐 질환, 피부근염/다발근염 연관 폐 질환, 쇼그렌병 연관 폐 질환, 강직성 척추염 연관 폐 질환, 혈관염성 미만성 폐 질환, 혈철증 연관 폐 질환, 약물-유발 간질성 폐 질환, 방사선 섬유증, 폐쇄성 세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구성 침윤성 폐 질환, 감염후 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가면역 간염, 제1형 자가면역 간염, 전형적 자가면역 또는 루푸스양 간염, 제2형 자가면역 간염, 항-LKM 항체 간염, 자가면역 매개 저혈당증, 흑색 극세포증을 갖는 B형 인슐린 저항성, 부갑상선기능저하증, 기관 이식과 연관된 급성 면역 질환, 기관 이식과 연관된 만성 면역 질환, 골관절증, 원발성 경화성 담관염, 특발성 백혈구감소증, 자가면역 호중구감소증, 신질환 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임병, 원판상 홍반성 루푸스, 남성 불임증 특발성 또는 NOS, 정자 자가면역, 모든 하위유형의 다발성 경화증, 교감신경성 안염, 결합 조직 질환에 속발성인 폐고혈압, 굿패스쳐 증후군, 결절성 다발동맥염의 폐 징후, 급성 류마티스성 열, 류마티스 척추염, 스틸병, 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 다카야스병/동맥염, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선기능항진증, 갑상선종성 자가면역 갑상선기능저하증 또는 하시모토병, 위축성 자가면역 갑상선기능저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염, 백반증, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알레르기 및 천식, 정신 장애, 우울증, 정신분열증, Th2 유형 및 Thl 유형 매개 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 염증성, 자가면역 및 골 질환을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"단리된" 핵산 분자는 항체 핵산의 천연 공급원 내에서 통상적으로 회합되는 적어도 하나의 오염성 핵산 분자로부터 확인되어 이로부터 분리시킨 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 환경 이외의 것이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 것과 같은 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는, 예를 들어 천연 세포의 경우와 상이한 염색체 위치에 존재하며 통상적으로 항체를 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
본원에 언급된 용어 "노브-인투-홀" 또는 "KnH"는 돌출부 (노브)를 하나의 폴리펩티드 내로 및 함몰부 (홀)를 다른 폴리펩티드 내로 이들이 상호작용하는 계면에서 도입함으로써 시험관내에서 또는 생체내에서 2개의 폴리펩티드를 함께 선택적으로 쌍형성하도록 지시하는 기술을 지칭한다. 예를 들어, KnH는 항체의 Fc:Fc 결합 계면, CL:CH1 계면 또는 VH/VL 계면에 도입되었다 (예를 들어, US20007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431, 및 [Zhu et al. (1997) Protein Science 6:781-788]). 이것은 다중특이적 항체의 제조 동안 2개의 상이한 중쇄를 함께 쌍형성하도록 유도하는데 특히 유용하다. 예를 들어, Fc 영역에 KnH를 갖는 다중특이적 항체는 각각의 Fc 영역에 연결된 단일 가변 도메인을 추가로 포함할 수 있거나, 또는 유사하거나 상이한 경쇄 가변 도메인과 쌍형성하는 상이한 중쇄 가변 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 실제로, KnH 기술은 2개의 상이한 수용체 세포외 도메인을 함께 또는 상이한 표적 인식 서열 (예를 들어, 아피바디, 펩티바디 및 다른 Fc 융합체 포함)을 포함하는 임의의 다른 폴리펩티드 서열을 쌍형성하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 이러한 다중특이적 항체는 VHVL 유닛이 다중에피토프 특이성을 갖는, 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체, 각각의 VHVL 유닛이 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, 적어도 2개의 단일 가변 도메인이 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체, 전장 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 탠덤 항체, 선형 항체 및 트리아바디, 공유 연결되거나 또는 비-공유 상호작용을 통해 서로 결합된 항체 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 디아바디, 탠덤 항체 및 단일 쇄 항체의 Fc 융합체 (예를 들어, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3 및 (scFV)4-Fc), 노브-N-홀 (KnH) 항체, 옥토퍼스 항체 및 DAF 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다중특이적 항체를 생성하기 위해 항체 포맷의 다른 예가 사용되었거나 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "다중특이적 분자"는 폴리에피토프 특이성을 갖는 분자를 지칭한다. "폴리에피토프 특이성"은 하나의 표적 분자 상 또는 여러 표적 분자 상의 적어도 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다 (예를 들어, 항-IL-1β/IL-18 다중특이적 항체). "단일특이적"은 1개의 에피토프에만 결합하는 능력을 지칭한다. 한 실시양태에 따르면 다중특이적 분자는 5μM 내지 0.001pM, 3μM 내지 0.001pM, 1μM 내지 0.001pM, 0.5μM 내지 0.001pM 또는 0.1μM 내지 0.001pM의 친화도로 각각의 에피토프에 결합한다. 본원에 사용된 용어 "이중특이적"은 2개의 에피토프에 결합하는 능력을 지칭한다. 폴리에피토프 특이성을 지지하거나 또는 지지하도록 조작될 수 있는 분자의 예는 항체, 아피바디, 이뮤노어드헤신, 펩티바디 및 다른 Fc 융합체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "옥토퍼스" 항체 또는 항체들은 Fc 영역 및 Fc 영역에 대한 아미노-말단에 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 다가 항체를 지칭한다 (예를 들어, WO01/77342, [Wu et al. (2007) Nature Biotechnology], 및 WO 2007/024715). 한 실시양태에서, 항체의 폴리펩티드의 배위는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc이며, 여기서 VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 1개의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다. 한 실시양태에서, X1 또는 X2는 CH1 도메인, CH1 도메인의 일부분, 일부 다른 링커 서열, 예컨대 GS 링커, 또는 이들의 일부 조합이다 (예를 들어, WO 2007/024715의 5면).
핵산이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계가 되도록 배치되는 경우에, 이러한 핵산은 본원에 사용된 바와 같이 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프리서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 항체가 그의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현되는 경우에 상기 항체에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되거나, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나, 또는 리보솜 결합 부위는 코딩 서열이 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우에 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우에는 인접하여 위치하고 리딩 상 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상의 실시에 따라 사용된다.
"펩티바디" 또는 "펩티바디들"은 Fc 도메인을 갖는 펩티드 서열의 융합체를 지칭한다. 2003년 12월 9일자로 허여된 미국 특허 번호 6,660,843 (Feige et al.) (그의 전문이 참조로 포함됨)을 참조한다. 이는 N-말단, C-말단, 아미노산 측쇄, 또는 1개 초과의 이들 부위에 연결된 하나 이상의 펩티드를 포함한다. 펩티바디 기술을 이용함으로써 하나 이상의 리간드 또는 수용체, 종양-귀소 펩티드, 막-수송 펩티드 등을 표적화하는 펩티드를 포함하는 치료제를 설계할 수 있다. 펩티바디 기술은 선형 및 디술피드-제한된 펩티드, "탠덤 펩티드 다량체" (즉, Fc 도메인의 단일 쇄 상의 하나 초과의 펩티드)를 포함하는 다수의 상기 분자의 설계에 유용한 것으로 입증되었다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,660,843; 2003년 10월 16일에 공개된 미국 특허 출원 번호 2003/0195156 (2002년 11월 21일에 공개된 WO 02/092620에 대응함); 2003년 9월 18일에 공개된 미국 특허 출원 번호 2003/0176352 (2003년 4월 17일에 공개된 WO 03/031589에 대응함); 1999년 10월 22일에 출원된 미국 일련 번호 09/422,838 (2000년 5월 4일에 공개된 WO 00/24770에 대응함); 2003년 12월 11일에 공개된 미국 특허 출원 번호 2003/0229023; 2003년 7월 17일에 공개된 WO 03/057134; 2003년 12월 25일에 공개된 미국 특허 출원 번호 2003/0236193 (2004년 4월 8일에 출원된 PCT/US04/010989에 대응함); 2003년 9월 18일에 출원된 미국 일련 번호 10/666,480 (2004년 4월 1일에 공개된 WO 04/026329에 대응함) (이들 각각은 그 전체내용이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
본원의 목적상, "제약 조성물"은 포유동물, 특히 인간에 적합하며 이에 투여하기에 적합한 것이다. 따라서, 조성물은 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 그의 치료 용도를 방해할 수 있는 오염물(들)이 이로부터 분리되도록 조성물 내의 단백질에 대해 1회 이상의 정제 또는 단리 단계를 수행하였다. 일반적으로, 제약 조성물은 치료 단백질 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다. 조성물은 통상적으로 멸균되고, 동결건조될 수 있다. 제약 제제는 하기에 보다 상세하게 기재된다.
"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기재일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 존재하는 경우에 중합체의 조립 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에 예컨대 표지와의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은 예를 들어 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드를 유사체로 "캡" 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 예를 들어 비하전된 연결부 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 하전된 연결부 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)를 갖는 것, 펜던트 모이어티, 예컨대 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 삽입제 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 갖는 것, 킬레이트화제 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형 연결부 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)를 갖는 것 뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형된 형태를 포함한다. 추가로, 당 내에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실 기가 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기로 대체되거나, 표준 보호 기로 보호되거나, 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결부가 만들어지도록 활성화되거나, 또는 고체 또는 반고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화될 수 있거나, 아민 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사 형태, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비-시클릭 유사체 및 무염기 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결부가 대안적 연결 기로 대체될 수 있다. 이들 대안적인 연결 기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H이거나 또는 임의로 에테르 (-O-) 연결부를 함유하는 치환 또는 비치환 알킬 (1-20 C.), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄딜임)로 대체되는 실시양태를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결부가 동일할 필요는 없다. 상기 기재는 RNA 및 DNA를 비롯하여 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
용어 "수용체 결합 도메인"은 세포 부착 분자를 포함하는, 수용체에 대한 임의의 천연 리간드, 또는 적어도 상응하는 천연 리간드의 정성적 수용체 결합 능력을 유지하는 이러한 천연 리간드의 임의의 영역 또는 유도체를 지칭하는데 사용된다. 이러한 정의는 특히 구체적으로 상기 언급된 수용체에 대한 리간드로부터의 결합 서열을 포함한다.
"분비 신호 서열" 또는 "신호 서열"은 관심있는 새로 합성된 단백질을 원핵생물의 세포 막, 통상적으로 내막 또는 내막과 외막 둘 다를 통해 유도하는데 사용될 수 있는 짧은 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 따라서, 관심 단백질, 예컨대 이뮤노글로불린 경쇄 또는 중쇄 폴리펩티드가 원핵 숙주 세포의 주변세포질 내로 또는 배양 배지 내로 분비된다. 분비 신호 서열에 의해 코딩되는 신호 펩티드는 숙주 세포에 내인성일 수 있거나, 또는 이들이 외인성일 수 있으며, 발현될 폴리펩티드에 대해 천연 신호 펩티드를 포함한다. 분비 신호 서열은 전형적으로 발현될 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하고, 전형적으로 생합성과 세포질로부터의 폴리펩티드의 분비 사이에 효소적으로 제거된다. 따라서, 신호 펩티드는 통상적으로 성숙 단백질 생성물에 존재하지 않는다.
표현 "단일 도메인 항체" (sdAb) 또는 "단일 가변 도메인 (SVD) 항체"는 일반적으로 단일 가변 도메인 (VH 또는 VL)이 항원 결합을 부여할 수 있는 항체를 지칭한다. 즉, 단일 가변 도메인은 표적 항원에 결합하기 위해 또 다른 가변 도메인과의 상호작용을 필요로 하지 않는다. 단일 도메인 항체의 예는 자연, 예컨대 낙타류 (라마 및 낙타) 및 연골성 어류 (예를 들어, 너스 상어)로부터 유래된 것 및 인간 및 마우스 항체로부터 재조합 방법으로부터 유래된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다 (Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490; WO 2005/035572; WO 03/035694; Febs Lett (1994) 339:285-290; WO00/29004; WO 02/051870).
본원에 사용된 "치료 항체"는 질환 또는 장애를 가지거나 또는 이에 걸리기 쉬운 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는데 유효한 항체이다.
"표적 분자"는 표적 인식 부위에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 표적 분자:표적 인식 부위 상호작용의 예는 항원:항체 가변 도메인 상호작용, 수용체:리간드 상호작용, 리간드:수용체 상호작용, 어드헤신:어드헤신 상호작용, 비오틴:스트렙타비딘 상호작용 등을 포함한다. 한 실시양태에서, 표적 분자는 생물학적 분자이다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 그가 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 벡터의 한 가지 유형은 추가의 DNA 절편이 그 내부에 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프인 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제가 가능하다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터가 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히, "재조합 벡터")로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 이는 플라스미드가 가장 흔하게 사용되는 벡터의 형태이기 때문이다.
항체는 이것이 표적 분자가 아닌 다른 분자에 결합하는 것보다 유의하게 우수한 친화도로 표적 분자에 "선택적으로 결합한다". 상대 결합 및/또는 결합 친화도는 관련 기술분야에서 허용되는 다음의 다양한 방법 (이에 제한되지는 않음)으로 입증될 수 있다: 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA) 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS). 일부 실시양태에서, ELISA에 의해 결정된 바와 같이, 항체는 비-표적 분자에 결합하는 경우보다 적어도 약 1 log 더 높은 농도 반응성으로 표적 분자에 결합한다.
다양한 추가의 용어가 본원에 정의되거나 또는 달리 특성화된다.
예시적인 항체
가용성 인간 IL-1β 또는 인간 IL-18 또는 그의 단편 (다른 분자에 임의로 접합됨)이 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 인간 IL-1β 또는 인간 IL-18을 발현하는 세포가 면역원으로 사용될 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 인간 IL-1β 또는 인간 IL-18을 발현하기 위한 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다. 항체를 제조하기에 유용한 인간 IL-1β 또는 인간 IL-18의 다른 형태가 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
a. 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 관련 항원 및 아주반트의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 전형적으로 생성된다. 이관능성 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통한 접합), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬 기임)을 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
예를 들어 단백질 또는 접합체 100 μg 또는 5 μg (각각, 토끼 또는 마우스의 경우)을 3 부피의 프로인트 완전 아주반트와 합하고, 이 용액을 다중 부위에 피내 주사함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 대략 1개월 후에, 프로인트 완전 아주반트에 포함된 펩티드 또는 접합체의 원래 양의 1/5 내지 1/10을 다중 부위에 피하 주사함으로써 상기 동물을 부스팅한다. 7 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 검정한다. 역가가 정체기에 도달할 때까지 동물을 부스팅한다. 전형적으로는, 동물을 동일한 항원의 접합체로 부스팅하지만, 이것은 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교 시약을 통해 접합된 것이다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양에서 단백질 융합체로서 제조될 수 있다. 또한, 응집제, 예컨대 명반이 면역 반응을 증진시키는데 적합하게 사용된다.
b. 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., 1975, Nature, 256:495]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)에 의해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터 또는 마카크 원숭이를 상기 기재된 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 도출한다. 대안적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 이어서, 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (Goding, 1986, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press)).
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포는 전형적으로 미융합 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우에, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
특정 실시양태에서, 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생산을 지지하며, 배지, 예컨대 HAT 배지에 감수성인 세포이다. 이들 중에, 예시적인 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center) (미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 기재되어 있다 (Kozbor, 1984, J. Immunol., 133:3001; Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York)).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대해 지정된 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정한다. 특정 실시양태에서, 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정한다.
목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 후에, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고 표준 방법 (Goding, 상기 문헌)에 의해 성장시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장할 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차, 예컨대 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
통상의 절차를 사용하여 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA가 용이하게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포가 이러한 DNA의 전형적인 공급원으로 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내로 넣을 수 있고, 이후에 이를 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 항체의 재조합 생산은 하기에 보다 상세하게 기재될 것이다.
추가 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628, 및 Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597]은 파지 라이브러리를 사용하여 뮤린 및 인간 항체를 각각 단리하는 방법을 기재한다. 후속 공개문헌은 쇄 셔플링에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생산 (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783) 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리 구축을 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., 1993, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266)을 기재한다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
DNA는 또한, 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환시키거나 (미국 특허 번호 4,816,567; [Morrison, et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851]), 또는 이뮤노글로불린 코딩 서열을 비-이뮤노글로불린 물질 (예를 들어, 단백질 도메인)에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부와 공유 연결함으로써 변형시킬 수 있다.
전형적으로, 이러한 비-이뮤노글로불린 물질로 항체의 불변 도메인을 치환시키거나 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인을 치환시켜, 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성한다.
c. 인간화 및 인간 항체
인간화 항체는 비인간 공급원으로부터의 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 비인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기라고 지칭되고, 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터의 것이다. 인간화는 일반적으로 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환시킴으로써, 윈터(Winter) 및 동료의 방법 (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536)에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 무손상 인간 가변 도메인 이외의 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다 (미국 특허 번호 4,816,567). 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 아마도 일부 FR 잔기가 비인간, 예를 들어 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체의 제조에 사용될 인간 가변 도메인 경쇄 및 중쇄 둘 다의 선택은 항원성 감소에 매우 중요하다. 소위 "최적-적합" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지의 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 (FR)로서 허용된다 (Sims et al., 1987, J. Immunol., 151:2296; Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol., 196:901). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 사용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 (Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al., 1993, J. Immunol., 151:2623).
또한, 항체가 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 한 실시양태의 방법에 따르면, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 통상의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이들의 검사로 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 항원에 결합하는 후보 이뮤노글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 목적하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수용자 및 유입 서열로부터 FR 잔기들을 선택하고 조합시킬 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로 및 가장 실질적으로 관련된다.
대안적으로, 면역화시에 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제된다는 것이 기재된 바 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 챌린지 시에 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551; Jakobovits et al., 1993, Nature, 362:255-258; Bruggermann et al., 1993, Year in Immuno., 7:33; 및 Duchosal et al., 1992, Nature 355:258]을 참조한다. 인간 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유래될 수 있다 (Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222:581-597; Vaughan et al., 1996, Nature Biotech 14:309).
i. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 스위칭" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 개선하기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (SDR (a-CDR) 그라프팅 기재); [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("재표면화" 기재); [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링" 기재); 및 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근법 기재)에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적-적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
인간 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 다양한 관련 기술분야의 공지된 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 챌린지에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하여 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 로커스를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 로커스는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술 기재); 미국 특허 번호 5,770,429 (HuMab® 기술 기재); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술 기재), 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술 기재)을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조.) 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기 기재된다.
d. 다중특이적 항체
다중특이적 항체는 적어도 2종의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다. 이러한 분자는 단지 2종의 항원에만 결합할 것이지만 (즉, 이중특이적 항체, BsAb), 추가의 특이성을 갖는 항체, 예컨대 삼중특이적 항체가 본원에서 사용되는 경우에는 이러한 표현에 포괄된다. BsAb의 예는 IL-1β에 대해 지정된 하나의 항원 결합 부위 및 IL-18에 대해 지정된 또 다른 항원 결합 부위를 갖는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, BsAb는 IL-1β 또는 IL-18에 대한 제1 결합 특이성 및 세포질 ITAM 모티프를 갖는 활성화 수용체에 대한 제2 결합 특이성을 포함한다. ITAM 모티프 구조는 9-11개 아미노산 스페이서에 의해 분리된 2개의 티로신을 보유한다. 일반적인 컨센서스 서열은 YxxL/I(x)6- 8YxxL이다 (Isakov, N., 1997, J. Leukoc. Biol., 61:6-16). 예시적인 활성화 수용체는 FcεRI, FcγRIII, FcγRI, FcγRIIA, 및 FcγRIIC를 포함한다. 다른 활성화 수용체는, 예를 들어 CD3, CD2, CD10, CD161, DAP-12, KAR, KARAP, FcεRII, Trem-1, Trem-2, CD28, p44, p46, B 세포 수용체, LMP2A, STAM, STAM-2, GPVI, 및 CD40을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Azzoni, et al., 1998, J. Immunol. 161:3493; Kita, et al., 1999, J. Immunol. 162:6901; Merchant, et al., 2000, J. Biol. Chem. 74:9115; Pandey, et al., 2000, J. Biol. Chem. 275:38633; Zheng, et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:12999; Propst, et al., 2000, J. Immunol. 165:2214] 참조).
한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 IL-1β에 대한 제1 결합 특이성 및 IL-18에 대한 제2 결합 특이성을 포함한다. 이중특이적 항체를 비롯한 다중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다. 이중특이적 항체는 추가로 노브-인-홀 또는 무힌지 항체로 제조될 수 있다. 이중특이적 항체는 문헌 [Segal et al., 2001, J. Immunol. Methods 248:1-6]에서 검토된다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공발현을 기반으로 하며, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 편성으로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10종의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고, 이중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 이루어지는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., 1991, EMBO J., 10:3655-3659]에 개시되어 있다.
다른 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인이 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합일 수 있다. 특정 실시양태에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체 중 적어도 하나에 존재한다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우에 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 개별 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질감염시킨다. 이는 구축에 사용된 3종의 항체 쇄의 동일하지 않은 비가 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 상기 3종의 항체 단편의 상호 비를 조정하는데 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비의 적어도 2종의 항체 쇄의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우에, 또는 비가 특정한 유의성을 갖지 않는 경우에, 2종 또는 모든 3종의 항체 쇄에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
이러한 접근법의 또 다른 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른쪽 아암에 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 조합으로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법이 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 방법에 대한 추가의 상세한 내용에 대해, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121:210]을 참조한다.
WO96/27011에 기재된 또 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 소형 아미노산 측쇄가 보다 대형의 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 대형 아미노산 측쇄를 보다 소형의 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 대형 측쇄(들)에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보상성 "함몰부"가 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치않는 최종-산물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 것은 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어 면역계 세포의 원치않는 세포로의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980) 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089)를 위해 제안된 바 있다. 임의의 편리한 가교 방법을 사용하여 이종접합체 항체를 제조할 수 있다. 적합한 가교제가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 다수의 가교 기술과 함께, 예를 들어 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.
2가 초과의 원자가를 갖는 항체가 또한 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 문헌 [Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147: 60]에 따라 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 비롯한, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 두 가지 표적, 예를 들어 IL-1β 뿐만 아니라 IL-18에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
e. 변이체 힌지 영역을 갖는 항체
본원에 기재된 항체는 또한, 예를 들어 2003년 10월 30일에 출원된 출원 일련 번호 10/697,995에 기재된 바와 같은 변이체 중쇄를 포함할 수 있다. 변이체 중쇄를 포함하는 항체는 시스테인 잔기가 디술피드 연결을 형성할 수 없도록 하는, 적어도 1개의 디술피드-형성 시스테인 잔기의 변경을 포함한다. 한 측면에서, 상기 시스테인(들)은 중쇄의 힌지 영역의 것이다 (따라서, 이러한 힌지 영역은 본원에서 "변이체 힌지 영역"으로 지칭되고, 추가로 "무힌지"로 지칭될 수 있음).
일부 측면에서, 이러한 이뮤노글로불린은 분자간에서 (예컨대, 2개의 중쇄 사이) 또는 분자내에서 (예컨대, 단일 폴리펩티드 쇄 내의 2개의 시스테인 잔기 사이) 디술피드 연결을 정상적으로 형성할 수 있는 중쇄 시스테인 잔기의 완전한 레퍼토리가 결핍되어 있다. 일반적으로, 변경된 (즉, 디술피드 연결을 형성할 수 없게 된) 시스테인 잔기(들)에 의해 형성된 디술피드 연결은, 항체에 존재하지 않는 경우에 이뮤노글로불린의 정상적인 물리화학적 및/또는 생물학적 특성의 실질적인 손실을 초래하지 않는 것이다. 특정 실시양태에서, 디술피드 연결을 형성할 수 없게 된 시스테인 잔기는 중쇄의 힌지 영역의 시스테인이다.
변이체 중쇄 또는 변이체 힌지 영역을 갖는 항체는 일반적으로 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 2 내지 11개의 중쇄간 디술피드 연결이 제거된 항체를 숙주 세포에서 발현시키고, 상기 항체를 숙주 세포로부터 회수함으로써 생산된다. 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 상기 항체를 발현시킬 수 있고 (상기 항체는 감소된 디술피드 연결 능력을 갖는 변이체 중쇄를 포함함), 이후에 상기 항체를 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포로부터 회수한다. 한 실시양태에서, 상기 중쇄는 이뮤노글로불린 중쇄의 변이체 힌지 영역을 포함하며, 여기서 상기 변이체 힌지 영역의 적어도 1개의 시스테인이 디술피드 연결을 형성할 수 없게 된다.
이뮤노글로불린 중쇄 내의 임의의 시스테인이 본원에 기재된 힌지 시스테인과 유사하게 디술피드 연결을 형성할 수 없게 될 수 있다는 것이 추가로 예상되며, 단 이러한 변경은 이뮤노글로불린의 생물학적 기능을 실질적으로 감소시키지 않는다. 예를 들어, IgM 및 IgE는 힌지 영역이 결핍되어 있지만, 각각은 여분의 중쇄 도메인을 함유하고 있으며; 중쇄의 시스테인의 적어도 1개 (일부 실시양태에서, 모두)는 중쇄 및/또는 중쇄를 포함하는 항체의 생물학적 기능을 실질적으로 감소시키지 않는 한 디술피드 연결을 형성할 수 없게 될 수 있다.
중쇄 힌지 시스테인은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Kabat, 1991, "Sequences of proteins of immunological interest," 상기 문헌]에 기재된 바와 같음). 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 힌지 시스테인의 수는 이뮤노글로불린의 부류 또는 하위부류에 따라 달라진다. 예를 들어, 문헌 [Janeway, 1999, Immunobiology, 4th Ed., (Garland Publishing, NY)]을 참조한다. 예를 들어, 인간 IgGI에서, 2개의 힌지 시스테인이 2개의 프롤린에 의해 분리되고, 이들은 분자간 디술피드 연결에서 인접한 중쇄 상에 그의 상대와 정상적으로 쌍을 형성한다. 다른 예는 4개의 힌지 시스테인을 함유하는 인간 IgG2, 11개의 힌지 시스테인을 함유하는 IgG3, 및 2개의 힌지 시스테인을 함유하는 IgG4를 포함한다.
따라서, 특정 실시양태에서, 방법은 숙주 세포에서 변이체 힌지 영역 (여기서 변이체 힌지 영역의 적어도 1개의 시스테인은 디술피드 연결을 형성할 수 없게 되어 있음)을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄를 발현시켜, 중쇄가 경쇄와 복합체를 이루도록 함으로써 생물학적 활성 항체를 형성하고, 항체를 숙주 세포로부터 회수하는 것을 포함한다.
대안적 실시양태는 적어도 2, 3 또는 4개의 시스테인이 디술피드 연결을 형성할 수 없게 된 것; 약 2 내지 약 11개의 시스테인이 디술피드 연결을 형성할 수 없게 된 것; 및 변이체 힌지 영역의 모든 시스테인이 디술피드 연결을 형성할 수 없게 된 것을 포함한다.
본원에 기재된 방법에 따라 생산된 항체를 구성하는 경쇄 및 중쇄는 단일 폴리뉴클레오티드에 의해 또는 개별 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.
디술피드 연결 형성에 정상적으로 관련된 시스테인은 관련 기술분야에 공지된 임의의 다양한 방법, 또는 본원에 기재된 기준을 고려하여 통상의 기술자에게 명백하게 될 방법에 의해 디술피드 연결을 형성할 수 없게 될 수 있다. 예를 들어, 힌지 시스테인은 디술피드 결합이 가능하지 않은 세린과 같은 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 아미노산 치환은 표준 분자 생물학 기술, 예컨대 변형될 힌지 영역을 코딩하는 핵산 서열의 부위 지정 돌연변이유발에 의해 달성될 수 있다. 적합한 기술은 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.]에 기재된 것을 포함한다. 변이체 힌지 영역을 갖는 이뮤노글로불린을 생성하기 위한 다른 기술은 힌지 영역을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것을 포함하며, 여기서 치환될 시스테인에 대한 코돈은 치환 아미노산에 대한 코돈으로 대체된다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 이어서 다른 적절한 항체 서열, 예컨대 가변 영역 및 적절한 경우 Fc 서열을 포함하는 벡터 백본 내로 라이게이션될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 힌지 시스테인은 결실될 수 있다. 아미노산 결실은 표준 분자 생물학 기술, 예컨대 변형될 힌지 영역을 코딩하는 핵산 서열의 부위 지정 돌연변이유발에 의해 달성될 수 있다. 적합한 기술은 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 것을 포함한다. 변이체 힌지 영역을 갖는 이뮤노글로불린을 생성하기 위한 다른 기술은 변형될 시스테인에 대한 코돈이 결실된 힌지 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것을 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 이어서 다른 적절한 항체 서열, 예컨대 가변 영역 및 적절한 경우 Fc 서열을 포함하는 벡터 백본 내로 라이게이션될 수 있다.
f. "돌출부-대-함몰부" 전략을 사용하여 형성된 이중특이적 항체
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 헤테로-올리고머화를 위해 제1 및 제2 폴리펩티드 사이에 계면을 조작하도록 돕는 "돌출부-대-함몰부" 전략 (또한 "노브 인투 홀"로서 지칭됨)을 사용하여 형성된다. 한 실시양태에서, 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. Fc 서열의 CH3 도메인에서 "노브 인투 홀" 돌연변이는 동종이량체의 형성을 크게 감소시키는 것으로 보고되었다 (예를 들어, 문헌 [Merchant et al., 1998, Nature Biotechnology, 16:677-681] 참조). "돌출부"는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터 소형 아미노산 측쇄를 보다 대형의 측쇄 (예를 들어, 티로신 및 트립토판)로 대체하여 구축된다. 돌출부에 대해 동일한 또는 유사한 크기를 갖는 보상성 "함몰부"는 임의로 대형 아미노산 측쇄를 보다 소형의 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체하여 제2 폴리펩티드의 계면 상에서 생성된다. 적합하게 위치되고 치수화된 돌출부 또는 함몰부가 제1 또는 제2 폴리펩티드의 계면에 존재하는 경우에, 단지 인접한 계면에서 각각 상응하는 함몰부 또는 돌출부를 조작할 필요가 있다. 돌추부 및 함몰부는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 변경과 같은 합성 수단에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 노브 인투 홀의 추가의 설명에 대해, 미국 특허 번호 5,731,168; 5,807,706; 5,821,333을 참조한다.
일부 실시양태에서 "노브 인투 홀" 기술을 사용하여 이종이량체화를 촉진함으로써 전장 이중특이적 항-FcγRIIB 및 항-"활성화 수용체" (예를 들어, IgER) 항체를 생성한다. 한 실시양태에서, 구축물은 항-FcγIIB 성분 (예를 들어, p5A6.11.Knob)의 경우에 "노브" 돌연변이 (T366W)를 Fc 영역에 도입하여 제조하고, 항-IgER 성분 (예를 들어, p22E7.11.Hole)의 경우에 "홀" 돌연변이 (T366S, L368A, Y407V)를 도입하여 제조한다. 또 다른 실시양태에서, 구축물은 항-FcγIIB 성분 (예를 들어, p5A6.11.Hole)의 경우에 "홀" 돌연변이를 그의 Fc 영역에 도입하여 제조하고, 항-IgER 성분 (예를 들어, p22E7.11.Knob)의 경우에 "노브" 돌연변이를 그의 Fc 영역에 도입하여 제조한다 (예컨대 본원에 개시된 절차 또는 문헌 [Merchant et al., (1998), 상기 문헌] 또는 미국 특허 번호 5,731,168; 5,807,706; 5,821,333에 개시된 절차에 의함).
"돌출부-대-함몰부" 전략을 사용하여 이종다량체를 제조하는 일반적 방법은 하나의 또는 별도의 숙주 세포에서 돌출부를 코딩하도록 원래 폴리뉴클레오티드로부터 변경된 제1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 함몰부를 코딩하도록 원래 폴리뉴클레오티드로부터 변경된 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 것을 포함한다. 폴리펩티드를 공통 숙주 세포에서 발현시켜 숙주 세포 배양물로부터 이종다량체를 회수하거나 또는 폴리펩티드를 별도의 숙주 세포에서 발현시켜 회수 및 정제한 후에 이종다량체가 형성된다. 일부 실시양태에서, 형성된 이종다량체는 다량체 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 또한, 2011년 4월 22일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 13/092,708을 참조한다.
일부 실시양태에서, 항체는 무힌지 이중특이적 항체를 생산하기 위해 노브 인투 홀 전략을 변이체 힌지 영역 구축물과 조합한다.
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
또한, 본원에 개시된 바와 같은 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 이러한 항체의 생산을 위한 재조합 기술이 제공된다.
항체의 재조합 생산을 위해, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리하여, 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터 내로 삽입한다. 항체를 코딩하는 DNA는 용이하게 단리되고, 통상적인 절차를 사용하여, 예를 들어 항체를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 서열분석된다. 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
(i) 신호 서열 성분
본원에 기재된 항체는 직접적으로, 뿐만 아니라 이종 항체와의 융합 항체로서, 재조합적으로 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 이종 항체는 성숙 단백질 또는 항체의 N-말단에 특정 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 항체이다. 선택된 이종 신호 서열은 전형적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 것 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는 것)이다.
천연 항체 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우에는, 신호 서열을, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, 1pp 또는 열-안정한 장독소 II 리더로 이루어진 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열로 치환시킨다. 효모 분비의 경우에는, 천연 신호 서열을, 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로미세스(Saccharomyces) 및 클루이베로미세스(Kluyveromyces) α-인자 리더 포함), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 WO 90/13646에 기재된 신호로 치환시킬 수 있다. 포유동물 세포 발현시에는, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다. 이러한 전구체 영역을 위한 DNA는 항체를 코딩하는 DNA에 리딩 프레임으로 라이게이션된다.
또 다른 실시양태에서, 항체의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있고, 이에 따라 각각의 시스트론 내에 분비 신호 서열의 존재를 필요로 하지 않는다. 이와 관련하여, 이뮤노글로불린 경쇄 및 중쇄는 발현되고, 폴딩되고, 조립되어 세포질 내에 기능적 이뮤노글로불린을 형성한다. 특정 숙주 균주 (예를 들어, 이. 콜라이 trxB 균주)는 디술피드 결합 형성에 유리한 세포질 조건을 제공하며, 이로 인해 발현된 단백질 서브유닛의 적절한 폴딩 및 조립이 가능해진다 (Proba and Plukthun, 1995, Gene, 159:203).
g. (ii) 복제 기점 성분
발현 벡터 및 클로닝 벡터 둘 다는 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 상기 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제될 수 있게 하는 것이고, 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에서는 필요하지 않다 (전형적으로, SV40 기점은 단지 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있음).
h. (iii) 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택 마커라고도 불리는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보충하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요 영양분을 공급하는 단백질을 코딩하며, 예를 들어 바실루스의 경우에는 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자이다.
선택 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 이들 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하고, 따라서 선택 요법에서 생존한다. 이러한 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.
포유동물 세포에 적합한 선택 마커의 또 다른 예는 항체 핵산을 취하는데 적격인 세포의 확인을 가능하게 하는 것, 예컨대 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 예를 들어 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 우선 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인한다. 야생형 DHFR의 사용시에 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다.
대안적으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또 다른 선택 마커, 예컨대 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질감염되거나 또는 공동-형질감염된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선택 마커, 예컨대 아미노글루코시드계 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418에 대한 선택 작용제를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선택될 수 있다. 미국 특허 번호 4,965,199를 참조한다.
효모에 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al., 1979, Nature, 282:39). trp1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 결핍된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다. 문헌 [Jones, 1977, Genetics, 85:12]. 이어서, 효모 숙주 세포 게놈 내의 trp1 병변의 존재는 트립토판의 부재 하의 성장에 의해 형질전환을 검출하는데 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주 (예를 들어, ATCC 수탁번호 20,622 또는 38,626을 갖는 균주)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보충된다.
또한, 1.6 μm 원형 플라스미드 pKD1로부터 유래된 벡터는 클루이베로미세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 대안적으로, 재조합 송아지 키모신의 대규모 생산을 위한 발현 시스템이 케이. 락티스(K. lactis)에 대해 보고되었다. 문헌 [Van den Berg, 1990, Bio/Technology, 8:135]을 참조한다. 클루이베로미세스의 산업적 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중-카피 발현 벡터가 또한 개시된 바 있다. 문헌 [Fleer et al., 1991, Bio/Technology, 9:968-975]을 참조한다.
i. (iv) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주와 사용하기에 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터도 적합하다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno (S.D.)) 서열을 함유할 것이다.
프로모터 서열은 진핵생물에 대해 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 다수의 유전자의 전사 출발점으로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)이다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에는 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 이들 모든 서열들이 진핵 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.
효모 숙주와 사용하기에 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 또한, 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포 내의 벡터로부터의 항체 전사는 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성일 경우 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터로부터, 열-쇼크 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 제어된다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 극초기 프로모터가 HindIII E 제한 단편으로 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현시키기 위한 시스템이 미국 특허 번호 4,419,446에 개시되어 있다. 이 시스템의 변형이 미국 특허 번호 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서의 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해 문헌 [Reyes et al., 1982, Nature 297:598-601]을 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복부를 프로모터로 사용할 수 있다.
j. (v) 인핸서 요소 성분
고등 진핵생물에 의한 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 다수의 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로는 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 하류 쪽 (bp 100-270)의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소에 대해 문헌 [Yaniv, 1982, Nature 297:17-18]을 참조한다. 인핸서는 항체-코딩 서열의 위치 5' 또는 3'에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 전형적으로는 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.
k. (vi) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 상기 서열은 통상적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 통상적으로 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 유용한 전사 종결 성분 중 하나는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 그에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
l. (vii) 번역 강도의 조절
본원에 기재된 이뮤노글로불린은 또한 발현된 경쇄 및 중쇄의 정량적 비가 분비 및 적절하게 조립된 전장 항체의 수율을 최대화하기 위해 조절될 수 있는 발현 시스템으로부터 발현될 수 있다. 이러한 조절은 경쇄 및 중쇄를 위한 번역 강도를 동시에 조절함으로써 달성된다.
번역 강도를 조절하기 위한 한 기술은 미국 특허 번호 5,840,523 (Simmons et al.) 및 문헌 [Simmons et al., 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133-147]에 개시되어 있다. 이는 시스트론 내의 번역 개시 영역 (TIR)의 변이체를 이용한다. 주어진 TIR에 대해, 일련의 아미노산 또는 핵산 서열 변이체는 소정 범위의 번역 강도로 생성되고, 이에 의해 상기 인자를 특정 쇄의 목적하는 발현 수준을 위해 조정하는 편리한 수단을 제공할 수 있다. TIR 변이체는, 뉴클레오티드 서열의 침묵 변화가 전형적이긴 하지만, 아미노산 서열을 변경할 수 있는 코돈 변화를 유발하는 통상적인 돌연변이유발 기술에 의해 생성될 수 있다. TIR의 변경은, 예를 들어 신호 서열의 변경과 함께, 샤인-달가노 서열의 수 또는 스페이싱의 변경을 포함할 수 있다. 돌연변이체 신호 서열을 생성하는 한 가지 예시적인 방법은 신호 서열의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 (즉, 변화가 침묵인) 코딩 서열의 시작점에서의 "코돈 뱅크"의 생성이다. 이는 각각의 코돈의 제3 뉴클레오티드 위치를 변화시킴으로써 달성될 수 있으며; 추가로 류신, 세린 및 아르기닌과 같은 일부 아미노산은 상기 뱅크를 제조하는데 있어서 복잡성을 부가할 수 있는 다수의 제1 및 제2 위치를 갖는다. 이러한 돌연변이유발 방법은 문헌 [Yansura et al., 1992, METHODS: A Companion to Methods in Enzymol., 4:151-158]에 상세하게 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 각각의 시스트론에 대한 일정 범위의 TIR 강도를 갖는 벡터의 세트가 생성된다. 이 제한된 세트는 각각의 쇄의 발현 수준의 비교 뿐만 아니라 다양한 TIR 강도 조합 하의 전장 생성물의 수율을 제공한다. TIR 강도는 미국 특허 번호 5,840,523 (Simmons et al.) 및 문헌 [Simmons et al., 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133-147]에 상세하게 기재된 바와 같이 리포터 유전자의 발현 수준을 정량화하여 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 벡터 내의 TIR의 특정한 쌍에 대한 번역 강도 조합을 (N-경쇄, M-중쇄)로 표시하며, 여기서 N은 경쇄의 상대 TIR 강도이고, M은 중쇄의 상대 TIR 강도이다. 예를 들어, (3-경쇄, 7-중쇄)는 벡터가 경쇄 발현의 경우 약 3의 상대 TIR 강도를 제공하고, 중쇄 발현의 경우 약 7의 상대 TIR 강도를 제공한다는 것을 의미한다. 번역 강도 비교를 기반으로 하여, 발현 벡터 구축물에 조합되도록 목적하는 개별 TIR을 선택한다.
m. (viii) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원에서 벡터에 DNA를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 상기 기재된 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이 목적을 위한 적합한 원핵생물은 아르카에박테리아(Archaebacteria) 및 유박테리아(Eubacteria), 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella) 뿐만 아니라 바실루스, 예컨대 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일에 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다. 한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주, 예컨대 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이러한 예들은 제한적이기보다는 예시적이다. 또한, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해 효소를 분비하는 것이 유용하며, 추가의 프로테아제 억제제가 바람직하게는 세포 배양물에 혼입될 수 있다. 원핵 숙주 세포는 또한 티오레독신 및/또는 글루타티온 경로에서 돌연변이(들)를 포함할 수 있다.
원핵생물 이외에도, 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상적인 제빵 효모는 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종 및 균주가 본원에서 통상적으로 이용가능하고 유용하며, 예컨대 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로미세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코더마 레에시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈완니오미세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈완니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger)가 있다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (과실파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 확인되어 있다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체, 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용가능하고, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본원에서 바이러스로서 사용될 수 있다. 목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다.
척추동물 숙주 세포는 널리 사용되고, 배양물 (조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 증식은 통상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁액 배양물에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68); MRC 5 세포; FS4 세포; 마우스 골수종 세포, 예컨대 NSO (예를 들어, RCB0213, 문헌 [1992, Bio/Technology 10:169]) 및 SP2/0 세포 (예를 들어, SP2/0-Ag14 세포, ATCC CRL 1581); 래트 골수종 세포, 예컨대 YB2/0 세포 (예를 들어, YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포, ATCC CRL 1662); 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다. CHO 세포는 CHO-K1, DUK-B11, CHO-DP12, CHO-DG44 (Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555 (1986)) 및 예시적인 숙주 세포주인 Lec13과 함께, 본원에 기재된 방법을 실시하기 위한 예시적인 세포주이다. CHO-K1, DUK-B11, DG44 또는 CHO-DP12 숙주 세포의 경우에, 이들은 이들에서 발현된 단백질을 푸코실화하는 능력이 결핍되도록 변경될 수 있다.
하이브리도마 세포가 또한 사용될 수 있다. 용어 "하이브리도마"는 면역학적 기원의 불멸 세포주 및 항체 생산 세포의 융합에 의해 생산된 하이브리드 세포주를 지칭한다. 상기 용어는 헤테로하이브리드 골수종 융합체의 자손을 포괄하며, 상기 융합체는 인간 세포 및 뮤린 골수종 세포주의 융합의 결과로 이후 형질 세포와 융합되며, 통상적으로 트리오마 세포주로 공지되어 있다. 또한, 상기 용어는, 예를 들어 쿼드로마와 같은, 항체를 생산하는 임의의 불멸화 하이브리드 세포주를 포함하는 것으로 의도된다 (예를 들어, 문헌 [Milstein et al., 1983, Nature, 537:3053] 참조). 하이브리드 세포주는 인간 및 마우스를 비롯한 임의의 종의 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 관심 항체를 코딩하는 단리된 외인성 핵산으로 형질전환된 비-하이브리도마 포유동물 세포이다. "외인성 핵산" 또는 "이종 핵산"은 세포에 대해 외래인 핵산 서열, 또는 세포에 대해 동종이나 핵산이 통상적으로 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 위치에 있는 핵산 서열을 의미한다.
n. (ix) 숙주 세포의 배양
숙주 세포는 항체 생산을 위해 상기 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선택하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양된다.
항체를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대 햄의 F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM) (시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (시그마)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58:44, Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102:255], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기재된 임의의 배지가 숙주 세포용 배양 배지로 사용될 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대, HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, 겐타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가 에너지원으로 보충시킬 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제가 또한 통상의 기술자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 기존에 사용된 것들이고, 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
모든 배양 배지는 전형적으로 하기 카테고리 중 하나 이상으로부터 적어도 하나의 성분을 제공한다:
1) 통상적으로 탄수화물, 예컨대 글루코스의 형태의 에너지원;
2) 모든 필수 아미노산, 및 통상적으로 20개 아미노산의 기본 세트와 시스틴;
3) 저농도로 요구되는 비타민 및/또는 다른 유기 화합물;
4) 유리 지방산; 및
5) 전형적으로 매우 낮은 농도, 통상적으로 마이크로몰 범위로 요구되는 무기 화합물 또는 자연 발생 요소로서 정의되는 미량 원소.
특정 실시양태에서, 배양 배지는 혈청이 없고 (예를 들어 약 5% 미만, 또는 1% 미만, 또는 0 내지 0.1% 혈청) 및 다른 동물-유래 단백질이 없다. 그러나, 이들은 목적하는 경우에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 과량의 아미노산을 포함한다. 과량으로 제공되는 아미노산은, 예를 들어 Asn, Asp, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, Asn, Asp, Lys, Met, Ser 및 Trp이 과량으로 제공된다. 예를 들어, 유럽 특허 EP 307,247 또는 미국 특허 번호 6,180,401에 명시된 범위의 1 또는 2배의 아미노산, 비타민, 미량 원소 및 다른 배지 성분이 사용될 수 있다. 상기 두 문헌은 본원에 참조로 포함된다.
목적하는 단백질을 발현하고 특정 위치에 목적하는 탄수화물을 첨가할 수 있는 포유동물 세포의 배양을 위해, 다수의 배양 조건이 배양될 숙주 세포에 특정한 주의를 기울이면서 사용될 수 있다. 포유동물 세포에 적합한 배양 조건은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있거나 (W. Louis Cleveland et al., 1983, J. Immunol. Methods 56:221-234), 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있고 (예를 들어, 문헌 [Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickwood, D. and Hames, B. D., eds. Oxford University Press, New York (1992)] 참조), 선택된 특정한 숙주 세포에 따라 달라진다.
o. (x) 항체 정제
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는 세포내에서 생산되거나, 주변세포질 공간에서 생산되거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되는 경우에, 제1 단계로서 미립자 파편인 숙주 세포 또는 용해된 단편을, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 문헌 [Carter et al., 1992, Bio/Technology 10: 163-167]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하는 절차가 기재되어 있다. 간략하게, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 파편을 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우에, 일반적으로 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 먼저 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF를 임의의 이전 단계에 포함시킬 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 예시적인 정제 기술이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 영역의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄 기재의 항체를 정제할 수 있다 (Lindmark et al., 1983, J. Immunol. Meth. 62:1-13). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (Guss et al., 1986, EMBO J. 5:15671575). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유량 및 더 짧은 가공 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 회수될 항체에 따라, 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(heparin SEPHAROSE)™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전과 같은 다른 단백질 정제 기술이 또한 이용가능하다.
한 실시양태에서, 당단백질을 렉틴 기질 (예를 들어, 렉틴 친화성 칼럼) 상으로의 흡착을 사용하여 정제하여, 제제로부터 푸코스-함유 당단백질을 제거함으로써 푸코스-무함유 당단백질을 풍부하게 할 수 있다.
p. (xi) 항체 활성 검정
이뮤노글로불린은 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정에 의해 그의 물리학적/화학적 특성 및 생물학적 기능에 관하여 특성화될 수 있다. 한 측면에서, 다른 결합 표적에 비해 면역원에 결합하는 항체의 선택성을 비교하는 것이 중요하다.
특정 실시양태에서, 본원에서 생산된 이뮤노글로불린은 그의 생물학적 활성에 대해 분석된다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린은 그의 항원 결합 활성에 대해 시험된다. 관련 기술분야에 공지되어 있으며 본원에 사용될 수 있는 항원 결합 검정은 웨스턴 블롯, 방사성면역검정, ELISA (효소 연결 면역흡착 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 형광 면역검정 및 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 사용하는 임의의 직접적 또는 경쟁적 결합 검정을 비제한적으로 포함한다. 예시적인 항원 결합 검정은 하기 실시예 섹션에서 제공된다.
정제된 이뮤노글로불린은 N-말단 서열분석, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광측정법, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 소화를 포함하나 이에 제한되지는 않는 일련의 검정에 의해 추가로 특성화될 수 있다. 단백질 정량화를 위한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 발현된 단백질의 샘플을 쿠마시-염색 SDS-PAGE 상에서 그의 정량적 강도에 대해 비교할 수 있다. 대안적으로, 관심 특정 밴드(들) (예를 들어, 전장 밴드)를, 예를 들어 웨스턴 블롯 겔 분석 및/또는 AME5-RP 검정에 의해 검출할 수 있다.
제약 제제
항체/항체들의 치료 제제는 동결건조 제제 또는 수용액 형태로, 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체를 임의의 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조될 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에 대해 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 항산화제 (아스코르브산 및 메티오닌 포함); 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 항체; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물 (글루코스, 만노스 또는 덱스트린 포함); 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 본원에서 예시적인 제약상 허용되는 담체는 간질성 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 비롯한, 특정의 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조 항체 제제는 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원의 제제는 또한 치료할 특정한 적응증에 필요한, 예를 들어 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 갖는 1종 초과의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 제제는 또 다른 항체 또는 화학요법제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
활성 성분은 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 초과 동안 분자를 방출할 수 있는 반면, 특정 히드로겔은 단백질을 보다 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 항체가 신체 내에 장기간 동안 유지되는 경우에, 이들은 37℃에서 수분에 노출된 결과로 변성되거나 또는 응집될 수 있어, 생물학적 활성의 손실 및 가능하게는 면역원성의 변화를 초래한다. 관련 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견되는 경우에, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 제어, 적절한 첨가제의 사용 및 특정 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성될 수 있다.
항체에 대한 비-치료 용도
항체는 친화도 정제 작용제로서 사용될 수 있다. 이 과정에서, 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여, 항체를 고체 상, 예를 들어 세파덱스(Sephadex)™ 수지 또는 여과지 상에 고정화시킨다. 고정화된 항체를 정제될 항원을 함유하는 샘플과 접촉시킨 후에 지지체를 적합한 용매로 세척하며, 이러한 용매는 고정화된 항체에 결합된 정제될 항원을 제외하고는 샘플 내의 실질적으로 모든 물질을 제거할 것이다. 최종적으로, 지지체를 또 다른 적합한 용매, 예컨대 글리신 완충제, pH 5.0으로 세척하며, 이로써 항원이 항체로부터 방출될 것이다.
항체는 또한, 예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 관심 항원의 발현을 검출하기 위한 진단 검정에 유용할 수 있다. 진단 용도를 위해, 항체는 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 다수의 표지가 이용가능하고, 이들은 일반적으로 하기 카테고리로 분류될 수 있다:
(a) 방사성동위원소, 예컨대 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I. 항체는, 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 방사성동위원소로 표지될 수 있고, 방사능은 섬광 계수를 사용하여 측정될 수 있다.
(b) 형광 표지, 예컨대 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 리사민(Lissamine), 피코에리트린 및 텍사스 레드(Texas red)가 이용가능하다. 형광 표지는 예를 들어 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌]에 개시된 기술을 사용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광은 형광계를 사용하여 정량화될 수 있다.
(c) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하고, 미국 특허 번호 4,275,149는 이들 중 일부에 대한 검토를 제공한다. 효소는 일반적으로 발색 기질의 화학적 변경을 촉매하며, 이는 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 효소는 기질에서의 색 변화를 촉매할 수 있고, 이는 분광학적으로 측정될 수 있다. 대안적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량화하는 기술은 상기 기재되어 있다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전기적으로 여기된 후에, 측정 (예를 들어, 화학발광측정기를 사용하여 측정)될 수 있는 빛을 방출할 수 있거나 또는 형광 수용자에 에너지를 공여한다. 효소 표지의 예는 루시페라제 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제; 미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키는 기술이 [O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone and H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)]에 기재되어 있다.
효소-기질 조합의 예는 예를 들어 다음을 포함한다:
1) 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO)는 과산화수소를 이용하여 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킴;
2) 알칼리성 포스파타제 (AP)와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트; 및
3) β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 발색 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제.
다수의 다른 효소-기질 조합이 통상의 기술자에게 이용가능하다. 이들의 일반적 검토를 위해, 미국 특허 번호 4,275,149 및 4,318,980을 참조한다.
때때로, 표지는 항체와 간접적으로 접합된다. 통상의 기술자는 이를 달성하기 위한 다양한 기술을 알 것이다. 예를 들어, 항체는 비오틴과 접합될 수 있고, 상기 언급된 표지의 광범위한 세 가지 카테고리 중 임의의 것이 아비딘에 접합될 수 있거나, 또는 반대로 접합될 수 있다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하며, 이에 따라 표지는 이러한 간접 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 대안적으로, 표지와 항체의 간접 접합을 달성하기 위해서, 항체가 소형 합텐 (예를 들어, 디곡신)과 접합되고, 상기 언급된 다양한 유형의 표지 중 하나가 항-합텐 항체 (예를 들어, 항-디곡신 항체)와 접합된다. 이에 따라, 표지와 항체의 간접 접합이 달성될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 표지될 필요가 없고, 그의 존재는 항체에 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
항체는 임의의 공지된 검정 방법, 예컨대 경쟁적 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정, 및 면역침전 검정에서 사용될 수 있다. 문헌 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 47-158 (CRC Press, Inc. 1987)].
항체는 또한 생체내 진단 검정에 사용될 수 있다. 일반적으로, 항체는 항원 또는 이를 발현하는 세포가 면역섬광조영을 사용하여 국재화될 수 있도록 방사성핵종 (예컨대, 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P 또는 35S)으로 표지된다.
항체에 대한 생체내 (치료) 용도
치료 항체가 다양한 질환의 치료를 위해 개발 및 승인되었다. 특정 실시양태에서, 항-IL-1β 및/또는 항-IL-18 항체/항체들은 치료제의 기능을 증진시키기 위한 치료제와 공-투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 항체의 적절한 투여량이 치료할 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.
질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해서든 연속 주입에 의해서든, 항체 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1-20 mg/kg)이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 상태에 따라, 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 치료를 지속한다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
항체 조성물은 우수한 의료 행위에 일관되는 방식으로 제제화, 투약 및 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 요인은 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 진료의에게 공지된 다른 요인을 포함한다. 투여될 항체의 "치료 유효량"은 이러한 고려사항에 의해 좌우될 것이고, 질환 또는 장애를 예방하거나, 개선하거나 또는 치료하는데 필요한 최소량이다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로 해당 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 좌우된다. 일반적으로, 이들은 이전에 사용되던 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로 사용되거나, 또는 이전에 사용되던 투여량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
예를 들어, 염증성 세포 (예를 들어, 백혈구) 부착, 이동 및 활성화와 관련된 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염 및 루푸스를 치료하기 위해, 본원의 항체는 예를 들어 항-LFA-1 항체 (예컨대, 항-CD11a 또는 항-CD18 항체) 또는 항-ICAM 항체, 예컨대 ICAM-1, -2 또는 -3과 공-투여될 수 있다. 본원의 항체와 조합하여 류마티스 관절염을 치료하기 위한 추가의 작용제는 엔브렐™, DMARDS, 예를 들어 메토트렉세이트 및 NSAID (비-스테로이드성 항-염증성 약물)를 포함한다. 또한 본원의 항체보다 하나 초과의 이러한 다른 활성제가 사용될 수 있다. 추가로, 인슐린은 당뇨병 치료를 위해, 항-IgE는 천식 치료를 위해, 항-CD 11a는 건선 치료를 위해, 항-알파4베타7 및 성장 호르몬 (GH)은 염증성 장 질환 치료를 위해 사용될 수 있다.
제조 물품
또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 회합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물 자체를 수용하거나 또는 상기 조성물을 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 조합하여 수용하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 적어도 한 가지 활성제는 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조 물품은 (a) 항체를 포함하는 조성물이 내부에 수용된 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물이 내부에 수용된 제2 용기를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서의 제조 물품은, 조성물이 특정한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조 물품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 비롯한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
치료 항체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 넣는다.
또한, 염증성 장 질환, 예를 들어 CD 또는 UC의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품 및 키트가 제공된다. 제조 물품은 라벨을 갖는 용기를 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알 및 시험관을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 본원에 기재된 항체를 포함하는 조성물을 수용한다. 조성물 내의 활성제는 특정한 항체이다. 용기 상의 라벨은 조성물이 특정한 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 사용된다는 것을 나타내며, 또한 생체내에서, 예컨대 상기 기재된 것에 대한 지침을 나타낼 수 있다.
특정 실시양태에서, 키트는 상기 기재된 용기 및 완충제를 포함하는 제2 용기를 포함한다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 및 사용 지침서를 갖는 포장 삽입물을 비롯하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
일반적 바이오마커 기술
달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 실시는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상의 기술을 이용할 것이며, 이들은 관련 기술분야의 기술 범위 내에 있다. 이러한 기술은 문헌, 예컨대 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994)]에 충분히 설명되어 있다.
본 발명에서 사용되는 프라이머, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
UC 또는 크론병을 앓고 있는 환자를 비롯한 IBD 환자의 특정 치료제에 대한 반응성을 예측하는 것과 연관된 유전자 발현 바이오마커가 본원에 제공된다. 유전자에 의해 코딩된 mRNA 또는 개별 단백질의 이러한 발현 수준은 IBD 치료제, UC 치료제 및/또는 크론병 치료제에 대한 반응성을 예측하기 위한 바이오마커를 구성한다. 따라서, 본원에 개시된 발명은 다양한 상황에서, 예를 들어 염증성 장 질환의 진단 및 요법에 관련된 방법 및 조성물에서 유용하다.
유전자 발현 수준의 검출
본원에 기재된 임의의 방법에 따라, 핵산은 게놈 DNA로부터 전사된 RNA, 또는 RNA 또는 mRNA로부터 생성된 cDNA일 수 있다. 핵산은 척추동물, 예를 들어 포유동물로부터 유래될 수 있다. 핵산은 특정한 공급원으로부터 직접 수득되거나 공급원에서 발견되는 핵산의 카피일 경우에 상기 공급원으로부터 "유래된" 것으로 언급된다.
핵산은 핵산의 카피, 예를 들어 증폭에 의해 생성된 카피를 포함한다. 증폭은 특정 경우에, 예를 들어 변이를 검출하기 위한 물질의 목적하는 양을 수득하는데 바람직할 수 있다. 이어서, 앰플리콘은 특정 유전자의 발현을 결정하기 위해 하기 기재된 것과 같은 변이 검출 방법에 적용될 수 있다.
mRNA의 수준은 상업적으로 입수가능한 키트 및 시약의 사용을 비롯하여, 통상의 기술자에 널리 공지된 다양한 방법에 의해 측정되고 정량화될 수 있다. 이러한 하나의 방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)이다. 정량적 사용을 위한 또 다른 방법은 실시간 정량적 PCR 또는 qPCR이다. 예를 들어, 문헌 ["PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications," (M.A. Innis et al., eds., Academic Press, Inc., 1990); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); 및 "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994)]을 참조한다.
마이크로어레이는 전형적으로 고-엄격도 조건 하에, 예를 들어 cDNA 또는 cRNA 샘플과 혼성화하기 위해 수천개의 핵산 프로브의 어레이 시리즈를 사용하는 멀티플렉스 기술이다. 전형적으로 형광단-, 은- 또는 화학발광-표지된 표적을 검출함으로써 프로브-표적 혼성화를 검출하고 정량화하여, 표적에서 핵산 서열의 상대 존재비를 결정한다. 전형적인 마이크로어레이에서, 프로브는 (에폭시-실란, 아미노-실란, 리신, 폴리아크릴아미드 또는 기타를 통해) 화학적 매트릭스에 대한 공유 결합에 의해 고체 표면에 부착된다. 고체 표면은, 예를 들어 유리, 규소 칩 또는 미세 비드이다. 예를 들어 아피메트릭스, 인크.(Affymetrix, Inc.) 및 일루미나, 인크.(Illumina, Inc.)에 의해 제조된 것을 비롯한 다양한 마이크로어레이가 상업적으로 입수가능하다.
생물학적 샘플은 통상의 기술자에게 공지된 특정 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 생물학적 샘플은 척추동물, 특히 포유동물로부터 수득될 수 있다. 특정 경우에, 생물학적 샘플은 활막 조직, 혈청 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)이다. 이러한 신체 샘플을 스크리닝함으로써, 간단한 조기 진단이 궤양성 결장염 및 크론병과 같은 질환에 대해 달성될 수 있다. 또한, 요법의 진행은 표적 핵산 (또는 코딩된 폴리펩티드)의 발현 수준의 변화에 대해 상기 신체 샘플을 시험함으로써 보다 용이하게 모니터링될 수 있다.
대상체, 또는 조직 또는 세포 샘플이 본원에 개시된 유전자 발현 시그너처 또는 특정 바이오마커의 상대 수준을 포함하는지 결정한 후에, 유효량의 적절한 치료제가 대상체에서의 특정한 질환, 예를 들어 UC 또는 크론병을 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있는 것으로 생각된다. 본원에 기재된 다양한 병리학적 상태의 포유동물에서의 임상 진단이 숙련된 진료의에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어 포유동물에서의 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염 및 크론병의 진단 또는 검출을 가능하게 하는 임상 진단 기술이 관련 기술분야에서 이용가능하다.
진단 검정 키트
본원에 기재되거나 제안된 용도에서 사용하기 위해, 진단 검정 키트 또는 제조 물품이 또한 제공된다. 상기 키트는 긴밀하게 닫힌 하나 이상의 용기 수단, 예컨대 바이알, 튜브 등을 수용하도록 구획화된 운반체 수단을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 용기 수단은 방법에서 사용될 개별 요소 중 하나를 포함한다. 예를 들어, 용기 수단 중 하나는 검출가능하게 표지되거나 검출가능하게 표지될 수 있는 프로브를 포함할 수 있다. 이러한 프로브는 유전자 발현 시그너처의 하나 이상의 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 특이적인 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 키트가 표적 핵산을 검출하기 위해 핵산 혼성화를 이용하는 경우에, 키트는 또한 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 뉴클레오티드(들)를 함유하는 용기, 및/또는 효소, 형광 또는 방사성동위원소 표지와 같은 리포터 분자에 결합된, 아비딘 또는 스트렙타비딘과 같은 비오틴-결합 단백질과 같은 리포터 수단을 포함하는 용기를 가질 수 있다.
진단 검정 키트는 전형적으로 상기 기재된 용기, 및 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 및 사용 지침서를 갖는 포장 삽입물을 비롯하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 물질을 포함하는 1개 이상의 다른 용기를 포함할 것이다. 조성물이 특정 요법을 위해 또는 비-치료 용도를 위해 사용되는지 나타내도록 라벨이 용기 상에 존재할 수 있고, 또한 상기 기재된 것과 같은 생체내 또는 시험관내 용도를 위한 지침을 나타낼 것이다. 키트 중 다른 임의적 성분은 하나 이상의 완충제 (예를 들어, 차단 완충제, 세척 완충제, 기질 완충제 등), 다른 시약, 예컨대 효소 표지에 의해 화학적으로 변경되는 기질 (예를 들어, 발색체), 에피토프 복구 용액, 대조군 샘플 (양성 및/또는 음성 대조군), 대조군 슬라이드(들) 등을 포함한다.
마케팅 방법
본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 유전자 발현 시그너쳐 또는 혈청 바이오마커 또는 말초 혈액 바이오마커의 수준 또는 조직 바이오마커의 검출을 보이는 샘플이 수득된 특정한 질환, 예를 들어 UC 또는 크론병을 가지는 환자 또는 환자 집단을 치료하기 위한 치료제 또는 그의 제약 조성물의 사용을 표적 청중에게 프로모션, 지시 및/또는 명시하는 것을 포함하는, 치료제 또는 그의 제약상 허용되는 조성물을 마케팅하기 위한 방법을 포괄한다.
마케팅은 일반적으로 후원자가 확인되고 메시지가 제어되는 비-인적 매체를 통한 유료 커뮤니케이션이다. 본원의 목적에서 마케팅은 선전, 홍보, 작품 속 광고, 후원, 보증 및 판촉을 포함한다. 이러한 용어는 또한 본원에서 본 발명을 구입하거나 지지하거나 승인하는 유리한 패턴으로 설득하거나 정보를 제공하거나 프로모션하거나 동기부여하거나 또는 다르게는 행동을 변형시키기 위해 대중에게 호소하도록 설계된 인쇄 커뮤니케이션 매체들 중 임의의 것으로 나타나는, 후원받은 정보성 공시를 또한 포함한다.
본원에서 진단 방법의 마케팅은 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 이들 메시지를 전달하기 위해 사용되는 마케팅 매체의 예는 텔레비젼, 라디오, 영화, 잡지, 신문, 인터넷, 및 전파 매체에서 나타나는 메시지인 광고방송을 포함한 광고게시판을 포함한다.
사용된 마케팅의 유형은 많은 인자, 예를 들어 도달할 표적 청중의 특성, 예를 들어 병원, 보험 회사, 클리닉, 의사, 간호사 및 환자, 뿐만 아니라 비용 고려사항 및 의약 및 진단의 마케팅을 규제하는 관련 관할 법률 및 규정에 따라 달라질 수 있다. 마케팅은 서비스 상호작용 및/또는 다른 데이터, 예컨대 사용자 인구통계 및 지리학적 위치에 의해 규정되는 사용자 특성화를 기반으로 하여 개별화되거나 주문제작될 수 있다.
상기 기재된 명세서 및 하기 실시예는 통상의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하는데 충분한 것으로 여겨진다. 본원에 제시되고 기재된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재 및 하기 실시예로부터 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 이는 첨부된 청구범위의 범주에 속할 것이다.
본 발명의 교시를 구체적 문제 또는 상황에 적용하는 것은 본원에 함유된 교시의 측면에서 통상의 기술자의 능력 내에 있을 것으로 이해된다.
본 발명의 추가 상세내용은 하기의 비제한적 실시예에 의해 예시된다. 본 명세서 내의 모든 인용문헌의 개시내용은 명백히 본원에 참조로 포함된다.
실시예
달리 나타내지 않는 한, 본 실시예에서 언급되는 상업적으로 입수가능한 시약은 제조업체의 지침에 따라 사용하였다.
물질 및 방법
인간 절제 조직 샘플
궤양성 결장염, 크론병, 게실염 또는 결장암에 대해 장 절제를 받은 환자는 연구에 참가하기 위해 사전 동의를 제공하였다. 수술 전에, 혈액 샘플을 수득하였으며, 이를 밤새 제넨테크(Genentech)에 신선한 상태로 수송하거나 또는 표준 임상 실험실 절차에 따라 가공하고 혈청 또는 혈장으로서 저장하였다. 수술 후에, 임상 분석에 요구되는 것보다 과량의 조직을 수거하였다. 소량 부분을 단백질 분석을 위해 순간 동결시켰고, 남아있는 조직을 밤새 제넨테크로 수송하였다.
1차 장 상피하 근섬유모세포 (MF)를 환자 장 절제 샘플로부터 단리하였다. 간략하게, 표면 상피 세포를 1 mmol EDTA를 사용한 세 가지 순차적 처리에 의해 점막 샘플로부터 박리시키고, 상피 세포가 박탈된 조직 샘플을 10% 소 태아 혈청 (FCS)-RPMI (깁코(Gibco)-인비트로젠(Invitrogen), 미국 칼스배드) 중 (37℃ 및 5% CO2에서) 배양하였다. MF는 고유판의 상피하 영역 밖으로 이동하여 조직 배양 접시에 콜로니를 확립하였다. 조직 샘플의 제거 후에, 1차 MF는 증식하여 여러 계대에 걸쳐 유지될 수 있는 단층을 확립하였다. 배양물을 유동 세포측정법에 의해 1차 MF로서 확인하였다 (알파-평활근 액틴-양성, 비멘틴-양성, 데스민-음성). 1차 MF를 10% FBS, 1% 비필수 아미노산 및 항생제 칵테일 (100ug/ml 페니실린/Strep, 20ug/ml 겐타미신, 2.5ug/ml 암포테리신 B 및 1ug/ml 메트로니다졸)과 함께 고 글루코스로 보충된 DMEM 중에서 배양하고, 3 내지 5 계대로 실험에 사용하였다.
MF (3인의 다른 환자로부터의 것)를 밤새 (6 웰 플레이트) 웰당 65,000개 세포로 플레이팅하고, 실험에 따라 37℃에서 6시간 또는 24시간 동안 IL-1β (10 ng/ml) (Cat# 201-LB-CF, 알앤디 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스) 또는 TNFα (10 ng/ml) (Cat# 210-TA-CF, 알앤디 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스)의 첨가 하에 또는 첨가 없이 상기에 기재된 바와 같은 보충된 DMEM로 자극시킨 다음, RNA 단리를 위해 수집하였다. RNA를 칼럼-상의 DNAse 소화 단계를 포함하는 제조업체의 프로토콜에 따라 RNeasy 칼럼 (퀴아젠(Qiagen))을 사용하여 단리한 다음, 마이크로어레이 (애질런트(Agilent), 캘리포니아주 산타 클라라)를 위해 준비하였다.
순간 동결된 절제 조직 샘플을 액체 질소 예비-냉각된 베스만(Bessman) 조직 미분쇄기 (스펙트럼 래보러토리즈(Spectrum Laboratories), 캘리포니아주 란초 도밍게즈; 카탈로그 #189475)에서 가공하였다. 조직 조각을 2 x 45s 진탕 하에 패스트프렙(FastPrep)®-24 기기에서 1 ml 용해 완충제 (1x TBS, 1% 트리톤-X 100, 2x 완전 프로테아제 억제제 칵테일)로 균질화시켰다. 이어서, 균질화된 조직을 저온 미세원심분리기에서 14,000g로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 분취하고, -80℃에서 저장하였다.
마이크로어레이 분석
RNA를 증폭시키고, 퀵 앰프(Quick Amp) 표지 키트 (애질런트, 캘리포니아주 산타 클라라)를 사용하여 표지하여 1ug의 총 RNA로부터 표지된 cRNA를 생성하였다. 실험 샘플을 Cy5로 표지하고; 보편적 인간 참조(Universal Human Reference) RNA (스트라타진(Stratagene), 캘리포니아주 라 졸라)를 참조 채널용으로 사용하고, Cy3으로 표지하였다. Cy5 및 Cy3 표지된 cRNA를 2-색 전체 인간 게놈(Whole Human Genome) 4 x 44K 유전자 발현 마이크로어레이 플랫폼에 경쟁적으로 혼성화시켰다. 혼성화된 마이크로어레이를 제조업체의 프로코콜 (애질런트, 캘리포니아주 산타 클라라)에 따라 세척하고, 모든 특징적 강도를 애질런트 마이크로어레이 스캐너(Agilent Microarray Scanner)를 사용하여 수집하였다. 스캐닝된 슬라이드의 TIFF 영상을 특징 추출 소프트웨어(Feature Extraction Software) (애질런트, 캘리포니아주 산타 클라라), 프로토콜 GE2-v5_95 (애질런트, 캘리포니아주 산타 클라라)를 사용하여 분석하였다. 모든 데이터를 염료-정규화 Cy5/Cy3 비의 log2 값으로 보고하였다.
IL1β 및 TNFα 유도된 유전자의 확인
선형 모델을 IL-1β, TNFα 및 배지 대조군 처리 및 시점 각각에 적합시켰다. 본 발명자들은 기준선으로부터의 변화 및 처리간 차이 둘 다 적어도 1.5배를 보인 유전자를 확인하였다 (오류 발견율 또는 FDR=0.001). IL-1β 및 TNF-α에 의해 독특하게 상향조절된 유전자를 중복에 대해 평가하였다.
섬유증-관련 유전자의 확인
RNA를 절제 조직 샘플에서 가져온 전체 두께 펀치 생검으로부터 단리하고, 마이크로어레이 분석에 적용하였다. 섬유증 연관 유전자는 섬유협착증에 대해 절제를 받은 환자 대 모든 다른 환자로부터의 생검 사이에서의 유전자 발현을 비교함으로써 확인하였다. 크론병에서 섬유증은 염증과 공동-발생되기 때문에, 섬유협착성 생검의 다수는 다양한 수준의 면역 침윤을 보여주었다. 면역 세포 침윤의 양을 추정하기 위해, 본 발명자들은 세포 유형-특이적 유전자 세트의 패널에 대한 유전자 발현 값의 제1 고유벡터를 계산하였다 (문헌 [Abbas et al., Genes Immun. 6(4):319-31(2005)] 참조). 이 고유벡터는 상기 샘플 내의 상기 세포 유형에 대한 침윤 정도의 추정치로서 사용하였다. 이들 추정치는 진단, 섬유증 및 생검 위치를 또한 설명하는 선형 모델에서 공변량으로서 사용하였다. 이 모델을 기반으로 하여 0.1의 FDR로 유전자를 선택하였다.
qRT-PCR
qPCR 연구에 사용하기 위해 RNA를 시험관내 MF 자극 실험, 조직 절제 샘플로부터의 생검, 및 조직학적 분석에 사용된 것에 인접한 OCT 절편으로부터 단리하였다. 제1 가닥 cDNA를 아이스크립트(iScript) (바이오-라드(Bio-Rad), 캘리포니아주 허큘레스)를 사용하여 200ng의 총 RNA로부터 생성하였다. 12.5ng의 cDNA를 제조업체의 제안에 따라 희석된 택맨(Taqman) 검정 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 캘리포니아주 칼스배드)과 함께 택맨 프리앰프 마스터 믹스(PreAmp Master Mix) (라이프 테크놀로지스, 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 예비-증폭시켰다. 바이오마크(Biomark) HD 시스템 (플루이다임(Fluidigm) 96.96 포맷) 및 마이크로어레이 데이터로부터 확인된 유전자 뿐만 아니라 여러 하우스키핑 유전자로 구성된 48개 택맨 검정의 패널을 사용하여 qPCR을 수행하였다. 생성된 데이터를 GAPDH에 대해 정규화하여 ΔCt 값을 산출하였다.
ELISA
자극으로부터의 상청액을 수집하고, 제조업체의 프로토콜 및 가이드라인에 따라 ELISA에 의해 GCSF (Cat# HSTCS0, 알앤디 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스) 및 암피레귤린 (ab99975, 압캠, 매사추세츠주 캠브리지)에 대해 검정하였다.
IL-11 (ab100551, 압캠, 매사추세츠주 캠브리지), IL1Ra (DRA00B, 알앤디 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스), IL18BP (DY119, 알앤디 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스), 암피레귤린 (ab99975, 압캠, 매사추세츠주 캠브리지) 및 GCSF (HSTCS0, 알앤디 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스)를 제조업체의 프로토콜 및 가이드라인에 따라 환자 혈청 샘플에서 측정하였다.
IL-1β (HSLB00C, 알앤디 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스), IL1Ra (DRA00B, 알앤디 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스), IL18 (7620, 알앤디 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스) 및 IL18BP (DY119, 알앤디 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스)를 제조업체의 프로토콜 및 가이드라인에 따라 조직 용해물에서 측정하였다.
실시예 1: 인간 1차 장 근섬유모세포에서의 섬유증-연관 유전자의 IL-1β-유도된 발현
장 상피하 근섬유모세포 (MF)의 활성화는 콜라겐 및 세포외 매트릭스 단백질의 증가된 침착을 통해 장 섬유증에서 주요 역할을 할 수 있다. 이 과정에서 염증성 시토카인, 예컨대 IL-1β의 역할이 잘 이해되지 않기 때문에, 본 발명자들은 장 절제를 받은 환자로부터의 조직 샘플에서의 유전자의 발현을 조사하였고, 1차 MF에서의 IL-1β 유전자 유도를 연구하였다. 연구된 환자의 특성이 표 1에 제시되어 있다.
<표 1>
환자 특성
Figure pct00002
본 발명자들은 장 절제를 받은 IBD 및 비-IBD 환자로부터의 조직에서의 IL-1β mRNA 수준에 차이가 있었는지 여부를 먼저 검사하였다. 도 1a에 제시된 바와 같이, CD 환자 및 UC 환자로부터의 조직 샘플에서의 IL-1β mRNA의 수준은 비-IBD 환자로부터의 샘플에서의 IL-1β mRNA의 수준보다 유의하게 더 높았다 (CD 환자 및 UC 환자에서의 중앙 상대 발현 수준은 비-IBD 환자에서의 대략 0.001과 비교하여 대략 0.01이었다, 각각 p = 0.0222 및 p = 0.0409). 또한, 섬유협착성 질환에 대해 수술을 받은 CD 환자에서의 IL-1β mRNA의 수준은 염증성 질환에 대해 수술을 받은 CD 환자에서보다 더 높은 경향을 나타냈다. 본 발명자들은 도 1b에 제시된 바와 같이 비-IBD 환자 조직과 비교하여 IL-1β mRNA 수준의 차이가 훨씬 더 크다는 것을 발견하였다 (CD 환자로부터의 섬유화 조직에서의 중앙 상대 발현 수준은 비-IBD CD 환자로부터의 조직에서의 대략 0.001과 비교하여 대략 0.015였다, p = 0.0012). 또한, 본 발명자들은 절제 CD 조직에서 면역조직화학에 의해 증가된 IL-1β 단백질 발현을 관찰하였다 (도 1c).
본 발명자들은 또한 비-IBD 환자, UC 환자 또는 CD 환자로부터 수득된 절제 조직의 이뮤노블롯 분석을 수행하였다. 도 2에 제시된 바와 같이, 이 분석은 전구-IL1β 및 성숙 IL-1β와 함께, 인플라마솜 활성화와 연관된 단백질인 CASP1 및 p20이 특히 CD 환자로부터의 조직에서 및 UC 환자에서 고도로 발현되었으나, 비-IBD 조직에서는 좀처럼 검출가능하지 않다는 것을 밝혀내었다. 이들 데이터는 CD 환자로부터의 비-섬유화 또는 염증성 조직 또는 비-IBD 결장 조직과 비교하여, CD 환자에서의 섬유화 조직에서 IL-1β의 증가된 발현에 대한 증거를 제공하였다. 유동 세포측정법 및 qRT-PCR 분석은 IL1R1 및 TNFR1이 절제 조직으로부터 단리된 1차 장 상피하 MF 상에 존재하였다는 것을 입증하였다 (데이터는 제시되지 않음).
다음에, 본 발명자들은 상기 기재된 방법을 사용하여 IL-1β에 의해 (그러나 TNFα에 의해서는 아님) 1차 MF에서 조절되는 유전자를 조사하였다. 본 발명자들은 MF에서 IL-1β에 의해 (그러나 TNFα에 의해서는 아님) 특이적으로 유도되는 콜라겐을 포함한 유전자 군을 발견하였다. 마이크로어레이 분석에 의해 평가된 바와 같이 IL-1β 처리에 의한 대부분의 유도 및 TNFα 처리에 의한 유도 부재를 나타내는 유전자가 하기 표 2에 제시되어 있다. 유전자 발현을 도 3에 제시된 바와 같이 자극된 MF의 qRT-PCR에 의해 검증하였다. IL-1β 처리 (그러나 TNFα 처리는 아님)는 GCSF (도 3a), TMEM158 (도 3b), Col7A1 (도 3c), Col16A1 (도 3d), 암피레귤린 (도 3e) 및 IL-11 (도 3f)의 발현을 자극하였으며, 이에 의해 마이크로어레이 발견을 검증하였다.
<표 2>
MF의 마이크로어레이 분석.
Figure pct00003
배지, IL-1β 또는 TNFα를 사용하여 자극시킨 MF 배양물로부터의 상청액을 ELISA에 의해 GCSF 및 암피레귤린에 대해 분석하였다. 도 4a-b에 제시된 바와 같이, GCSF 및 암피레귤린 단백질은 IL-1β 처리 후에 상청액에서 증가하였으나, TNFα 또는 배지 처리 후에는 증가하지 않았으며, 이는 qRT-PCR 결과와 일치한다.
상기 결과는 본 발명자들이 ELISA에 의해 세포 상청액에서의 GCSF 및 암피레귤린 수준을 측정 및 정량화할 수 있었다는 것 및 본 발명자들이 RNA 발현을 측정함으로써 관찰된 바와 같이 IL-1β 자극 후에 단백질 수준의 유사한 증가를 관찰할 수 있었다는 것을 입증하였기 때문에, 본 발명자들은 인간 혈청에서의 GCSF 측정의 실행가능성을 시험하였다. 도 5a는 혈청 GCSF 수준이 건강한 대조군과 비교하여 CD 및 UC 환자 둘 다에서 상향조절되었다는 것을 제시한다. 본 발명자들이 어떠한 암 환자 또는 건강한 대조군 환자에서도 혈청 GCSF를 검출할 수 없었지만, 본 발명자들은 수많은 fCD 환자 및 iCD 환자에서 혈청 GCSF를 용이하게 검출할 수 있었다. 단지 2명의 DVT 환자만이 그들의 혈청에서 GCSF의 검출가능한 수준을 입증하였다. 동일한 샘플을 사용하여, 본 발명자들은 장 조직 용해물에서의 IL-1β의 수준을 혈청 GCSF와 상관시켰고, 장 조직 용해물에서의 IL-1β 발현이 보다 높은 환자가 혈청 GCSF의 검출가능한 수준이 보다 높았다는 것을 발견하였다 (도 5b, 스피어만 r = 0.500, p = 0.1777). 이들 데이터는 혈청 GCSF가 장 조직에서 IL-1β 단백질 수준의 유용한 대용 바이오마커라는 것을 시사한다.
본 발명자들은 다수의 기질 및 근육 유전자, 예를 들어 INHBA 및 LMCD1이 비-섬유화 조직과 비교하여 섬유화 조직에서 상향조절되었다는 것을 발견하였다. 또한, 세포외 매트릭스 전환 및 조직 재형성 유전자 (예를 들어, MMP3, PXDN), 콜라겐 유전자 (예를 들어, Col7A1, Col5A2, Col12A1, Col18A1) 및 Wnt 신호전달 표적 유전자 (예를 들어, TMEM158, CHN1)는 비-섬유화 조직과 비교하여 섬유화 조직에서 상향조절되었다. 하기 표 3은 마이크로어레이 분석에 의해 결정된 섬유증 유전자의 확인을 제시하며; 단백질 위치 또한 표에 표시되어 있다. 본 발명자들은 MF에서 시토카인 (예를 들어, IL24, IL11), 콜라겐 (예를 들어, Col7A1, Col16A1) 및 WNT 신호전달 유전자 (예를 들어, TMEM158, DACT1)를 비롯한, 여러 경로로부터의 IL-1β-조절된 유전자를 추가로 발견하였다. MF에서의 TNF-α 유도된 유전자는 케모카인 (예를 들어, IL-8, CXCL3) 및 부착 분자 유전자 (예를 들어, ICAM1)를 포함하였다. MF의 IL-1β 자극은 장 섬유증에서 상향조절된 유전자 (예를 들어, TMEM158, Col7A1)와 중복되는 콜라겐 및 WNT 신호전달 유전자를 유도하는 것으로 관찰되었다. 대조적으로, 장 섬유증과 연관된 어떠한 유전자도 MF에서 TNF-α에 의해 독특하게 상향조절되는 것으로 발견되지 않았다.
<표 3>
섬유증 유전자
Figure pct00004
본 발명자들의 마이크로어레이 발견을 확인하기 위해, 본 발명자들은 IHC에 의해 SMA 염색을 위해 사용된 것에 인접한 OCT 절편을 분석하였다. 절편을 SMA에 대한 병리학자에 의해 점수화하였으며; 전형적으로, SMA+ 샘플은 섬유증의 증거를 갖는 것으로 간주된다. qRT-PCR 결과는 도 6a-f에 제시되어 있다. 본 발명자들은 암피레귤린, IL-11, AEBP1 및 IL1R1과 함께, 콜라겐 하위유형 7A1 및 16A1이 CD SMA- 절편 또는 대조군 절편과 비교하여 CD SMA+ 절편에서 증가된 발현을 나타내었다는 것을 발견하였으며, 이는 이들 IL-1β 유도된 유전자가 섬유화 조직에서 상향조절된다는 것을 입증한다.
실시예 2: 추가의 바이오마커
표 4에 기재된 환자 코호트를 사용하여, 본 발명자들은 비교자로서 UC 및 DVT를 사용하여 섬유화/섬유협착성 CD (fCD)와 염증성 CD (iCD)를 구별하는데 유용할 수 있는 추가의 바이오마커를 조사하였다. 매칭된 장 조직 용해물 및 혈청 샘플을 사용하여, 본 발명자들은 ELISA에 의해 각각의 샘플을 IL18 및 IL18BP 수준에 대해 검정하였다. 본 발명자들은 fCD 환자가 iCD 환자와 비교하여 장 조직에서 약간 더 높은 수준의 IL18을 발현하였으나 (도 7a, p <0.05, 크루스칼-왈리스 검정에 의함), 혈청 수준에서는 어떠한 유의차도 존재하지 않았다는 것을 발견하였다 (도 7b). 본 발명자들은 어떠한 환자 군에서도 조직과 혈청 사이에 IL18BP 수준의 유의차를 발견하지 못했다 (도 7c 및 7d). 본 발명자들은 또한 장 조직 용해물에서 IL18 대 IL18BP의 비를 검사하였다. 도 7e에 제시된 바와 같이, IL18:IL18BP 비는 iCD 환자와 비교하여 fCD 환자에서 약간 더 높았다 (p <0.05, 크루스칼-왈리스 검정에 의함). 또한, 도 7f는 fCD 환자 및 iCD 환자에 대한 혈청 IL18BP에 대하여 플롯팅된 장 IL18 수준을 제시한다.
<표 4>
환자 특성
Figure pct00005
참고문헌
Figure pct00006
Figure pct00007

Claims (37)

  1. (a) 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 CSF3 (GCSF), IL-24, SERPINB3, SERPINB4, AMIGO2, SERPINB7, ABAT, PF4, STEAP2, ELN, CCL4, VEGFA, DACT1, KCNMB4, PDLIM4, TGFBR1, KCNE1L, HIF1A, SLC25A45, OSMR, P4HA2, ELF3, TGIF1, TMEM158, COL7A1, COL16A1, 암피레귤린 (AREG) 및 IL-11로부터 선택된 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현을 측정하고;
    (b) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준을 참조 수준과 비교하고;
    (c) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 염증성 장 질환의 진단을 제공하는 것
    을 포함하는, 대상체에서 염증성 장 질환을 진단하거나 또는 그의 진단을 보조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합이 CSF3 (GCSF), TMEM158, Col7A1, Col16A1, 암피레귤린 (AREG), IL-11로부터 선택된 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합이 CSF3 (GCSF) 및 암피레귤린으로부터 선택된 것인 방법.
  4. (a) 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IL-1β, CASP1 및 p20으로부터 선택된 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현을 측정하고;
    (b) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준을 참조 수준과 비교하고;
    (c) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 염증성 장 질환의 진단을 제공하는 것
    을 포함하는, 대상체에서 염증성 장 질환을 진단하거나 또는 그의 진단을 보조하는 방법.
  5. (a) 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 COL7A1, COL16A1, 암피레귤린, IL-11, AEBP1 및 IL1R1로부터 선택된 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현을 측정하고;
    (b) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준을 참조 수준과 비교하고;
    (c) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 섬유화 크론병의 진단을 제공하는 것
    을 포함하는, 대상체에서 섬유화 크론병을 진단하거나 또는 그의 진단을 보조하는 방법.
  6. (a) 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 MMP3, INHBA, COL5A2, CHN1, LMCD1, COL12A1, COL7A1, COL18A1, TMEM158, FAM65C, IGFBP5, THY1, TMEM132A, PXDN, GPR68, TWIST1, COL4A1, SERPINH1, AEBP1, NAB2, TMEM45A, TMEM121, VIM, NOTCH4 및 TIMP2로부터 선택된 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현을 측정하고;
    (b) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준을 참조 수준과 비교하고;
    (c) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 섬유화 크론병의 진단을 제공하는 것
    을 포함하는, 대상체에서 섬유화 크론병을 진단하거나 또는 그의 진단을 보조하는 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 염증성 장 질환이 궤양성 결장염 또는 크론병인 방법.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, 섬유화 크론병이 섬유협착성 크론병인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 장 조직인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 발현이 PCR 방법 또는 마이크로어레이 칩을 사용하여 측정된 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현이 면역검정 또는 면역조직화학 검정을 사용하여 측정된 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 면역검정이 ELISA 검정인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 참조 수준이 염증성 장 장애를 갖지 않은 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 유전자 중 동일한 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 동일한 하나 또는 그의 조합의 발현 수준을 측정함으로써 수득된 것인 방법.
  14. 제5항, 제6항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 참조 수준이 비섬유화 조직에서 유전자 중 동일한 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 동일한 하나 또는 그의 조합의 발현 수준을 측정함으로써 수득된 것인 방법.
  15. (a) 대상체의 장 조직으로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IL18의 발현 수준을 측정하고;
    (b) (a)에서 측정된 IL18의 발현 수준을 참조 수준과 비교하고;
    (c) (a)에서 측정된 IL18의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 섬유화 크론병의 진단을 제공하는 것
    을 포함하는, 대상체에서 하위유형의 크론병을 진단하거나 또는 그의 진단을 보조하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 참조 수준이 염증성 장 장애를 갖지 않은 대상체 또는 염증성 크론병을 가진 대상체 또는 궤양성 결장염을 가진 대상체의 장 조직으로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IL18의 발현 수준을 측정함으로써 수득된 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 섬유화 크론병이 섬유협착성 크론병인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 발현 수준이 면역검정을 사용하여 측정된 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 면역검정이 ELISA 검정인 방법.
  20. (a) 대상체로부터 수득된 혈청 샘플에서 GCSF의 발현 수준을 측정하고;
    (b) (a)에서 측정된 GCSF의 발현 수준을 참조 수준과 비교하고;
    (c) (a)에서 측정된 GCSF의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 염증성 장 질환의 진단을 제공하는 것
    을 포함하는, 대상체에서 염증성 장 질환을 진단하거나 또는 그의 진단을 보조하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 염증성 장 질환이 궤양성 결장염 또는 염증성 크론병 또는 섬유화 크론병인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 섬유화 크론병이 섬유협착성 크론병인 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, GCSF의 발현 수준이 면역검정을 사용하여 측정된 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 면역검정이 ELISA 검정인 방법.
  25. 제20항에 있어서, 참조 수준이 염증성 장 장애를 갖지 않은 대상체로부터 수득된 혈청 샘플에서 GCSF의 발현 수준을 측정함으로써 수득된 것인 방법.
  26. (a) 환자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 CSF3 (GCSF), IL-24, SERPINB3, SERPINB4, AMIGO2, SERPINB7, ABAT, PF4, STEAP2, ELN, CCL4, VEGFA, DACT1, KCNMB4, PDLIM4, TGFBR1, KCNE1L, HIF1A, SLC25A45, OSMR, P4HA2, ELF3, TGIF1, TMEM158, COL7A1, COL16A1, 암피레귤린 (AREG) 및 IL-11로부터 선택된 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현을 측정하고;
    (b) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준을 참조 수준과 비교하고;
    (c) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 환자에게 항-IL-1β 항체, 항-IL-18 항체 또는 다중특이적 항-IL-1β/항-IL-18 항체를 투여하는 것
    을 포함하는, 환자에서 염증성 장 질환을 치료하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합이 CSF3 (GCSF), TMEM158, Col7A1, Col16A1, 암피레귤린 (AREG), IL-11로부터 선택된 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합이 CSF3 (GCSF) 및 암피레귤린으로부터 선택된 것인 방법.
  29. (a) 환자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IL-1β, CASP1 및 p20으로부터 선택된 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현을 측정하고;
    (b) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준을 참조 수준과 비교하고;
    (c) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 환자에게 항-IL-1β 항체, 항-IL-18 항체 또는 다중특이적 항-IL-1β/항-IL-18 항체를 투여하는 것
    을 포함하는, 환자에서 염증성 장 질환을 치료하는 방법.
  30. (a) 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 MMP3, INHBA, COL5A2, CHN1, LMCD1, COL12A1, COL7A1, COL18A1, TMEM158, FAM65C, IGFBP5, THY1, TMEM132A, PXDN, GPR68, TWIST1, COL4A1, SERPINH1, AEBP1, NAB2, TMEM45A, TMEM121, VIM, NOTCH4, AEBP1, IL1R1 및 TIMP2로부터 선택된 유전자 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준 또는 상기 유전자 중 하나 또는 그의 조합에 의해 코딩된 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현을 측정하고;
    (b) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 발현 수준을 참조 수준과 비교하고;
    (c) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 환자에게 항-IL-1β 항체, 항-IL-18 항체 또는 다중특이적 항-IL-1β/항-IL-18 항체를 투여하는 것
    을 포함하는, 환자에서 염증성 장 질환을 치료하는 방법.
  31. (a) 환자의 장 조직으로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IL18의 발현 수준을 측정하고;
    (b) (a)에서 측정된 IL18의 발현 수준을 참조 수준과 비교하고;
    (c) (a)에서 측정된 유전자 중 하나 또는 그의 조합 또는 단백질 중 하나 또는 그의 조합의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 환자에게 항-IL-1β 항체, 항-IL-18 항체 또는 다중특이적 항-IL-1β/항-IL-18 항체를 투여하는 것
    을 포함하는, 환자에서 염증성 장 질환을 치료하는 방법.
  32. (a) 대상체로부터 수득된 혈청 샘플에서 GCSF의 발현 수준을 측정하고;
    (b) (a)에서 측정된 GCSF의 발현 수준을 참조 수준과 비교하고;
    (c) (a)에서 측정된 GCSF의 수준이 참조 수준을 초과하는 경우에, 환자에게 항-IL-1β 항체, 항-IL-18 항체 또는 다중특이적 항-IL-1β/항-IL-18 항체를 투여하는 것
    을 포함하는, 환자에서 염증성 장 질환을 치료하는 방법.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 염증성 장 질환이 궤양성 결장염 또는 염증성 크론병 또는 섬유화 크론병인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 섬유화 크론병이 섬유협착성 크론병인 방법.
  35. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 수준이 PCR 방법 또는 마이크로어레이 칩을 사용하여 측정된 것인 방법.
  36. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 수준이 면역검정을 사용하여 측정된 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 면역검정이 ELISA 검정인 방법.
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