KR20150145470A - Cpne7 단백질을 포함하는 비치계 중간엽 줄기세포의 상아모세포로의 분화방법, 조성물 및 이를 이용한 치수조직 재생 및 상아질 지각과민증 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Cpne7 단백질을 포함하는 비치계 중간엽 줄기세포의 상아모세포로의 분화방법, 조성물 및 이를 이용한 치수조직 재생 및 상아질 지각과민증 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CPNE7 단백질을 포함하는 비치계 중간엽 줄기세포의 상아모세포로의 분화용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 인비트로에서 비치계 중간엽 줄기세포의 분화방법 및 그 용도에 관한 것이다.

Description

CPNE7 단백질을 포함하는 비치계 중간엽 줄기세포의 상아모세포로의 분화방법, 조성물 및 이를 이용한 치수조직 재생 및 상아질 지각과민증 치료용 약학적 조성물 {Method and Composition for differentiation of non-dental mesenchymal stem cell into odontoblast using CPNE7 or its gene and pharmaceutical composition for dentin or pulp regeneration or treating dentin hyperesthesia using the same}
본 발명은 비치계 중간엽 줄기세포에서 상아모세포로의 분화 방법 및 이를 이용한 치수조직 재생 및 상아질 지각과민증 치료 분야에 관한 것이다.
치수는 치아의 내부에 있는 치수강을 채우고 있는 부드러운 결합조직으로 신경과 혈관이 풍부하게 분포되어 있으며 상아질의 표층에까지 이르는 곳을 말한다. 이런 치수에 생기는 병변을 치수질환이라 한다.
치수 질환의 원인은 매우 다양하나, 대부분의 경우는 충치에 의한 세균감염과 치아의 천공, 파절, 균열, 치주낭을 통해서 치수내부로의 감염에 의해 발생한다. 또한 외상, 마모, 치아 균열, 치료 시 치과용 기구에서 나오는 열과 마찰 등도 유발할 수 있다. 세균감염에 의한 치수염은 치근단 질환과 치주질환으로 확대 될 수 있다. 치수 질환이 발생 하였을 때, 치수 충혈, 치수염, 치수 괴사의 순으로 진행된다. 치수 괴사의 경우, 치수가 죽어서 치수에 혈액공급이 전혀 안되기 때문에 전체 치주 조직이 사라져서 나중에는 치근단 질환 또는 치아전체의 이상이 초래 될 수 있다.
치수, 치근단 질환의 치료는 치수 복제제와 치근관 충전재를 사용하는데, 일반적으로 칼슘 히드록사이드, MTA (Mineral Trioxide Aggregate), 거타퍼차(Gutta-percha) 등이 이용되어 왔다. MTA의 경우, 밀봉력과 생체친화적인 성질을 가지고 있어서 치료에 효과를 보이나, 상대적으로 치과 치료제로써 높은 비용문제가 발생하고, 변색이 되어 심미적 문제가 발생한다. 거타퍼차의 경우, 비용이 경제적이고 유동성이 좋으나, 만성염증반응이나 상아질에 잘 접착되지 못하고, 손상된 조직의 재생 유도력이 떨어지며 무엇보다도 치수생활력을 상실하게 되는, 생리적이지 못한 치료방법이다. 현재까지 상아질-치수 질환을 치료하는 보존적인 치료 방법은 치료한 치아가 약해지거나, 부서지기 쉬우며, 재감염의 위험을 가지게 된다.
대한민국 공개특허번호 제2012-0089547호에는 법랑모세포, 애피컬 버드세포 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 함유하는 경조직 형성 및, 상아질 또는 치수조직 재생용 조성물에 대하여 기재하고 있다. 또한 대한민국 공개특허번호 제2009-0033643호에는 새로운 치소낭 유래의 치아 줄기세포 및 그의 배양 방법에 대하여 기재하고 있다.
그러나 아직까지는 치계(dental) 중간엽 줄기세포 뿐만 아니라 비치계(non-dental) 중간엽 줄기세포를 상아모세포로 분화시킴으로서 상아질을 재생하거나 또는 치수조직을 재생하는 방법 및 이를 이용한 치수 질환의 치료에 대하여는 알려진 바 없다.
본원은 CPNE7 단백질을 포함하는 비치계 중간엽 줄기세포 분화 및 상아질 또는 치수조직 재생용 약학적 조성물, 방법 및 그 용도를 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 CPNE7 단백질 또는 그 유전자를 포함하는 비치계 중간엽 줄기세포의 상아모세포로의 분화용 조성물을 제공한다. 본원에 따른 조성물은 비치계 자가, 동종 또는 이종 유래의 중간엽 줄기세포 예를 들면 골수중간엽줄기세포 또는 지방줄기세포 등을 치계 줄기세포로 분화시킬 수 있다.
본원에 따른 CPNE7 단백질에 의한 상아모세포로의 분화는 이의 뉴클레오린과 상호작용에 의한 Dspp 발현 조절에 의한 것이나 이로 제한하는 것은 아니다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 조성물을 이용한 인비트로에서 비치계 중간엽 줄기세포의 상아모세포로의 분화방법을 제공하며, 상기 방법은 CPNE7 단백질 또는 그 유전자를 비치계 중간엽 줄기세포에 처리하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서 본원은 또한 CPNE7들 과발현 또는 발현하는 중간엽줄기세포, 상기 중간엽줄기세포로부터 유래된 상아모세포로 분화될 수 있는 전구세포 또는 상기 중간엽줄기세포로부터 분화된 상아모세포를 유효성분으로 포함하는, 상아질 또는 치수조직 재생용 세포 치료제를 제공한다.
본원에 따른 세포 치료제는 상아질 지각과민증, 치수충혈, 치수염, 치수변성, 치수의 괴사 및 괴저 질환 등에서 상아질 또는 치수조직 재생에 사용되어 이들 질환을 치료할 수 있다.
본원에 따른 세포 치료제는 노출된 치수부위 또는 병변치수가 제거된 빈 치수강에 투여되어 상아질 또는 치수조직 재생에 사용될 수 있다.
다른 양태에서 본원의 CPNE7 단백질 또는 그 유전자를 포함하는 상아질 또는 치수조직 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명의 CPNE7들 포함하는 비치계 중간엽 줄기세포 분화 조성물 또는 방법은 치계 중간엽 줄기세포 뿐만 아니라 비치계 중간엽 줄기세포의 DSPP 발현을 증가시켜 상아모세포 분화를 유도하고 상아질 형성을 촉진하였고, 치아 내 환경에서 치수조직 재생을 유도하였고, 생체 내에서는 경조직 형성을 촉진시켜, 상아질 또는 치수 조직 재생용으로 치주질환 또는 치근단 질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 CPNE7이 법랑모세포 분화동안 발현되는 것을 나타낸다. ALC (ameloblast lineage cell) 라인을 분화배지에서 2주 이상동안 배양하였다. (A) ALC에 있는 CPNE7, Odam, 및 Mmp-20 mRNA의 발현을 RT-PCR로 측정한 것이다. GAPDH는 로딩 대조군으로 사용되었다. (B) 지시된 날의 ALCs에 있는 CPNE7, Odam, 및 Mmp-20의 발현을 웨스턴블랏 분석으로 측정하였다. CPNE7, Odam, 및 Mmp-20는 전 세포 융해물에서 탐지되었다. (C) ALCs에 있는 CPNE7의 위치는 면역형광으로 조사하였다. 2차 항체 단독을 음성 대조군으로 사용하였다. 세포는 DAPI로 대조염색하였다. 스케일 바, 20㎛.
도 2는 CPNE7이 범랑모세포에서 상아모세포로 전위한다는 것을 나타낸다. (A) 배아 19일(E19) 및 생후 7일(P7) 및 10일(P10)에 마우스 치아 발달동안 CPNE7 발현을 면역조직화학으로 탐지하였다. CPNE7 단백질은 E19일에는 내부 에나멜 내피 및 기질 중간체에; P7에는 분화되는 상아모세포에; 그리고 P10에는 상아질, 예비상아질 및 분화된 상아모세포에 있었다(화살표). IEE: 내부 상아질 내피(inner enamel epithelium), SI: 기질 중간체(stratum intermedium), Od: 상아모세포(odontoblast), Am: 법랑질모세포(ameloblasts), E: 에나멜(enamel), D: 상아질(dentin). 스케일 바, 200㎛. (B) 공동 배양시스템의 계통도(Schematic diagram). 플래그 태그된 CPNE7과 함께 ALC를 상부 챔버에 씨드하고 상아모세포 MDPC-23 세포는 바닥 챔버에 씨드하였다. Epi : 내피 세포, Mes : 중간엽 세포. 공동 배양 시스템에서 ALCs에 의해 합성된 플래그-태그된 CPNE7의 MDPC-23 세포로의 전위는 웨스턴블랏으로 탐지하였다. GAPDH를 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 3은 CPNE7이 상아모세포 분화동안 발현되는 것을 나타낸다. 상아모세포 세포 라인 MDPC-23을 분화배지에서 2주 이상 배양하였다. (A) MDPC-23 세포에서 CPNE7의 위치는 면역형광으로 탐지하였다. 2차 항체 단독을 음성 대조군으로 사용하였다. 세포는 DAPI로 대조염색하였다. 스케일 바, 20㎛. (B) MDPC-23 세포에서 정해진 날에 CPNE7, Dspp, 및 Osteocalcin mRNA의 레벨을 정량적 실시간 PCR로 측정하였다. 모든 수치는 3번 실험의 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. *P <0.01 대조군과 비교. (C) 정해진 날에 MDPC-23 세포에서 CPNE7, Dsp, 및 Osteocalcin 레벨을 웨스턴블랏으로 측정하였다. GAPDH를 로딩 대조군으로 사용하였다. 시토졸 GAPDH 및 핵 라민 B를 세포 분획 대조군으로 사용하였다. 총 : 전 세포 추출물, Cyto : 시토졸 분획, Nu : 핵 분획.
도 4는 CPNE7 자극 및 불활성화는 상아모세포 분화를 조절하는 것을 나타낸다. MDPC-23 세포를 CPNE7 과발현 또는 siRNA 컨스트럭트와 함께 전달이입하였다. (A) Dspp mRNA 발현은 실시간 PCR로 분석하였다. (B) CPNE7 및 Dsp 발현을 웨스턴블랏으로 분석하였다. GAPDB를 로딩 대조군으로 사용하였다. (C 및 D) MDPC-23 세포를 100 ng/ml rCPNE7로 처리하였다. (C) CPNE7 및 Dspp mRNA 발현을 실시간 PCR로 측정하였다. (D) CPNE7 및 Dsp 단백질 발현을 웨스턴블랏으로 측정하였다. (E) 공동 배양 시스템에서 MDPC023 세포에서 CPNE7 및 Dsp 발현을 웨스턴블랏으로 탐지하였다. (F) CM에서 CPNE7 불활성화 후 MDPC-23 세포에서 Dsp 발현을 웨스턴블랏으로 분석하였다. Dspp 프로모터의 전사 활성을 MDPC-23 세포내 CPNE7 또는 CPNE7 siRNA 과발현을 이용하여 루시퍼라아제 어세이로 측정하였다. 모든 수치는 3번 실험의 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. *P <0.05, **P<0.01 대조군과 비교.
도 5는 인비보에서 인간 치아 치수조직 세포(hDPCs)를 사용하여 재생한 상아질/치수조직 복합체를 조직학적 분석한 것을 나타낸다. (A-H) hDPCs를 100㎎ HA/TCP 단독(A 및 E), 또는 CM(B 및 F), CPNE7 항체-처리된 CM(C 및 G), 또는 rCPNE7 (D 및 H)와 함께 0.5% 피브린 겔에서 혼합하여 면역시스템이 약화된 마우스에서 6주동안 피하로 이식하였다. 샘플은 헤마톡신에오신(H-E)로 염색하였다. (E-H) A-D에 있는 박스 지역은 E-H에 있는 것보다 더 확대하여 나타내었다. 스케일 바, 200 ㎛.
도 6은 CPNE7이 인비보에서 과발현되거나 불활성화된 hDPCs에서 석회화된 조직 형성의 조직형태학적 분석을 나타낸다. (A-H) hDPCs는 전달이입되지 않거나(A 및 E) 또는 CPNE7 과발현(B 및 F), CPNE7 siRNA (C 및 G), 대조군 siRNA (D 및 H) 컨스트럭트와 전달이입되어 2주동안 면역시스템이 약화된 마우스에세 피하로 이식된 것이다. 재생된 조직은 H-E로 염색하였다. (E-H) A-D에 있는 박스 지역은 E-H에 있는 것보다 더 확대하여 나타내었다. 스케일 바, 200 ㎛. (I) 네 그룹에서 생성된 석회화 조직의 총 면적은 LS 스타터 프로그램을 사용하여 분석하였다. 모든 수치는 3번 실험의 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. *P <0.05, **P<0.01 대조군과 비교.
도 7은 이식 10주 후 인간 치아의 치근관 공간(root canal space)에서의 상아질/치수조직-유사 조직 형성을 나타낸 것이다. (A-I)0.5% 피브린 겔 내에 hDPC 단독(A, D, G) 또는 CM과 함께(B, E, H) 또는 CPNE7 항체 처리된 CM와 함께(C, F, I) 12주 동안 인간 치아 새그먼트의 치근관 공간에 주입하였다. 재생된 조직을 H-E로 염색하였고(A-C) 항-BSP(D-F) 및 항-DSP(G-I)로 면역염색하였다. B, E 및 H에 있는 화살표는 상아모세포 돌기와 함께 상아질 유사 세포 재생된 것을 나타낸다. P: 재생된 치수조직, D: pre-기존 상아질 벽, RD: 새로 형성된 대표적 상아질. 스케일 바, 100㎛.
도 8은 인비트로 및 인비보에서 비치계 중간엽 세포 C3H10T1/2 및 hBMSC에 대한 CPNE7의 영향을 나타낸 것이다. (A) C3H10T1/2 세포를 유도 배지 또는 ALC와 함께 공동 배양에서 배양한 것이다. C3H10T1/2 세포에서 CPNE7, Dmp1, 및 Dsp 발현은 웨스턴블랏으로 측정하였다. GAPDH를 로딩 대조군으로 사용하였다. (B) C3H10T1/2 세포를 CPNE7 과발현 컨스트럭트와 함께 전달이입하였다. CPNE7 및 Dsp 발현은 웨스턴블랏으로 분석하였다. (C-K) 0.5% 피브린 겔 내 hBMSCs 단독 (C, F, I) 또는 rCPNE7과 함께(5 ㎍; D, G, J) 또는 rBMP2 (5 ㎍; E, H, K)를 인비보에서 12주 동안 인간 치아 새그먼트의 치근관 공간에 주입하였다. 재생된 조직은 H-E (C-E)로 염색하였고 항-DSP (F-H) 및 항-Nestin (I-K)와 함께 면역염색하였다. D, G 및 J에 있는 점선은, 상아질 세관 구조를 포함하는 새로 형성된 상아질의 마진(margin)을 나타낸다. P: 재생된 펼프, D: pre-기존의 상아질 벽, ND: 새로 형성된 생리학적 상아질. 스케일 바, 50㎛.
도 9는 CPNE7 및 뉴클레오린 복합체에 의해 Dspp가 조절된다는 것을 나타낸다. (A) CPNE7 및 뉴클레오린의 공동-위치화를 MDPC-23 세포에서 형광 현미경으로 탐지하였다. Cy3 (2nd Cy3) 및 FITC (2nd FITC)에 접합된 이차 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 세포는 DAPI로 대조염색하였다. 스케일 바, 20㎛. (B) MDPC-23 세포를 플래그-태그된 CPNE7 발현 또는 CPNE7 siRNA 컨스트럭트와 함께 전달이입하였다. 면역침강된(IP) CPNE7 및 전 세포 융해물(Input)을 항-뉴클레오린 항체와 함께 웨스턴블랏(IB)으로 분석하였다. (C) 교차연결된 크로마틴을 제조하여 MDPC-23세포에서 pre-면역 혈청(IgG) 또는 Nfic-특이적 항체와 함께 면역침강하였다(상부). 교차연결된, 베어낸(sheared) 크로마틴은 CPNE7 과발현과 함께 전달이입된 MDPC-23 세포 또는 뉴클레오린 siRNA 컨스트럭트로부터 제조하였다. ChIP 어세이는 뉴클레오린, 항-CPNE7, 또는 IgG 항체를 사용하여 수행하였다. 크로마틴 샘플은 Dspp 프로모터에 있는 프라이머 페어 스패닝 AP-1 사이트를 사용하여 PCR 분석을 수행하였다. Input : 면역침강 전에 얻은 크로마틴의 PCR 생성물, IgG: pre-면역 혈청, pos1 : ChIP 양성(항-Nfic), neg: PCR 음성, pos2: PCR 양성, con: 대조군, siNu: 뉴클레오린 siRNA. (D) MDPC-23 세포를 지시된 벡터와 함께 공동 전달이입하였다. Dspp 프로모터의 전사 활성은 루시퍼라아네 어세이로 측정하였다. MDPC-23 세포에서의 CPNE7, Nucleolin, 및 Dsp의 발현 레벨은 웨스턴블랏으로 측정하였다. GAPDH는 로딩 대조군으로 사용하였다. 모든 수치는 3번 실험의 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. *P <0.05, **P<0.01 대조군과 비교.
도 10은 CPNE7이 ALC에서 MDPC-23 세포로 전위한 것을 나타낸다. GFP-태그된 CPNE7과 함께 전달이입된 ALC를 상부 챔버에 씨드하였고 MDPC-23 세포는 바닥 챔버에 씨드하였다. ALC에서 MDPC-23 세포로의 GFP-태그된 CPNE7의 이동은 형광 현미경으로 탐지하였다. 세포는 DAPI로 대조염색하였다. 스케일 바, 100㎛.
도 11은 CPNE7 발현이 HEK 293 및 MDPC-23세포에서의 Cpne 7 과발현 및 CPNE7 siRNA에 의해 조절된다는 것을 나타낸다. CPNE7, CPNE7 siRNA, 및 대조군 siRNA를 인코딩하는 컨스트럭트를 HEK 293 및 MDPC-23 세포로 전달이입하였다. (상부) MDPC-23 세포에서의 CPNE7 발현을 RT-PCR로 분석하였다. (하부) HEK293세포에서의 CPNE7 발현을 RT-PCR 및 웨스턴블랏으로 분석하였다.
도 12는 인비트로에서 석회화된 세관 형성에 대한 rCPNE7의 효과를 나타낸 것이다. rCPNE7 처리 존재 도는 부존재시에 2주 동안 MDPC-23 세포를 배양하였다. 석회화된 노쥴 형성에 대한 rCPNE7의 효과를 정해진 날에 알리자린 레드 S 염색으로 분석하였다.
도 13은 뉴클레오린이 Dspp 프로모터에 결합한 것을 나타낸다. MDPC-23 세포를 뉴클레오린 siRNA와 함께 전달이입하고, 핵 추출물을 제조하여, 야생형(WT) 및 돌연변이(MT) AP-1 부위를 함유하는 비오틴화된 Dspp 프로모터 프로브와 혼합하였다. 복합체의 뉴클레오린은 웨스턴블랏으로 탐지하였다.
본원은 CPNE7가 비치계(non dental) 중간엽줄기세포의 상아모세포로의 분화를 유도하여, 상아모세포의 생성을 촉진함으로서, 상아모세포로의 분화방법 또는 상아모세포의 생성이 필요한 질환의 치료에 사용될 수 있다는 발견에 근거한 것이다.
한 양태에서 본원은 CPNE7 단백질 또는 그 유전자 포함하는 비치계 중간엽 줄기세포의 상아모세포로의 분화 방법 또는 조성물에 관한 것이다.
본원의 “CPNE7 단백질”은 CPNE7 유전자에 의해 코딩되는, 칼슘-의존성 멤브레인 결합 단백질인 코핀(copine) 패밀리의 하나를 말한다. 상기 단백질은 두 개의 N-말단 C2 도메인 및 하나의 폰 빌리브랜드(von willebrand) 인자 A 도메인을 함유한다. 본원 발명의 목적 달성을 위해, 본원 발명의 효과를 달성하는 한, 다양한 유래 및/또는 형태의 CPNE7 유전자 및/또는 단백질이 사용될 수 있다. 야생형 서열은 물론, 세포내에서의 발현 또는 단백질의 안정성 등과 같은 특징이 유리하도록 염기서열의 일부가 인위적으로 변형된 유전자, 및 자연적으로 발견되는 염기서열 일부가 변형된 유전자 또는 이들의 모두의 단편을 포함하는 것이다. 유전자 염기서열의 변형은 상응하는 아미노산의 변형을 수반하거나 하지 않을 수 있으며, 아미노산의 변형을 수반하는 경우에는 이러한 변형이 유발된 유전자는 이에 의해 코딩되는 단백질에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 것으로, 돌연변이체(mutants), 유도체(derivatives), 대립유전자(alleles), 변형체(variants) 및 동질체 (homologues)를 포함하는 것이다. 유전자 염기서열의 변이가 단백질 중의 아미노산의 변형을 수반하지 않는 경우는 예를 들어 축중변이가 있고, 이러한 축중변이체(degeneracy mutants)도 본 발명의 상기 유전자에 포함된다.
인위적 유전자 염기서열의 변형은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어, 부위-유도성 돌연변이법 (site-directed mutagenesis, Kramer et al, 1987), 에러유발 PCR (Cadwell, R.C. and G.F. Joyce. 1992. PCR methods Appl., 2:28-33.), 점돌연변이법 (Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press.) 등에 의해 제조될 수 있다.
본원에 사용되는 단백질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일 구현예에서는 단백질의 제조방법은 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이다. 예를 들면 상기 단백질을 코딩하는 상응하는 유전자를 포함하는 벡터를 원핵 또는 진핵세포 세포 예를 들면 곤충세포, 포유류 세포에 전달하여 발현 시킨 후 정제하여 사용할 수 있다. 상기 플라스미드는 예를 들면 pET28b(Novagen)과 같은 발현 벡터에 해당 유전자를 클로닝하여 세포주에 전달이입한 후, 발현된 단백질을 정제하여 사용할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 합성된 단백질은 침전, 투석, 이온교환 크로마토그라피, 겔-퍼미에이션 크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 항-스크리닝 단백질 항체를 이용한 친화성 컬럼 등을 포함하는 컬럼 크로마토그라피로 분리 정제될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서, CPNE7 유전자 및 단백질은 유인원, 사람 등과 같은 포유동물 유래이며, 특히 사람 유래이다. CPNE7 유전자 및 단백질은 그 전장 또는 본원의 효과를 달성하는 한 그 단편이 또한 사용될 수 있으며, 전장 서열은 예를 들면 GenBank 접근번호로 마우스의 경우 NM170684 (아미노산), NP733785 (핵산), 인간의 경우 NM014427 (아미노산), NP055242 (핵산)를 참조할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 일 구현예에서 상술한 유전자는 본원의 조성물이 사용되는 세포내에서 발현이 가능하도록 프로모터에 작동가능하게 연결된 벡터의 형태로 제공될 수 있다.
본원에 따른 CPNE7은 비치계 중간엽 줄기세포의 상아모세포로의 분화를 유도한다. 사람의 사랑니 등에서 분리할 수 있는 치수줄기세포 (hDPSC)는 상아모세포와 골모세포로 분화가능하나, 본원에 따른 조성물 및 방법은 입수가 용이한 비치계 줄기세포도 상아모세포 또는 골모세포로 분화할 수 있는 장점이 있다. 지금까지 치수-상아질 재생 및 상아모세포 분화유도에 관한 연구는 대부분 치계 중간엽줄기세포를 이용하여 진행되어 왔는데, 치계 중간엽줄기세포’들은 발생학적으로 이전에 이미 치계 상피와 상호유도신호를 주고받은 중간엽줄기세포이다. 하지만 본원에 따라 비치계 중간엽줄기세포까지도 이용이 가능해진다면 치수-상아질 재생 및 상아모세포 분화에 있어 이러한 특수 유도신호를 받은 치계 줄기세포는 물론 비치계 중간엽줄기세포까지도 사용가능하여, 즉 이용가능한 줄기세포의 종류와 범위가 더욱 넓어질 것이고, 따라서 실제 사람에게로의 임상적 적용에 있어서 장점 및 편리성이 증대된다. 또한 비치계 줄기세포까지도 상아모세포로 분화시킬 수가 있다는 것은 중간엽 줄기세포에서 치계 상아모세포로의 근본적인 분화 메커니즘을 이해하는데 중요하게 사용될 수 있다.
본원에서 상아모세포는 상아질과 닿아있으며, 상아질을 형성하는 원주형 세포로 기능적으로 치아의 주된 구성성분인 상아질을 직접적으로 만드는 역할을 하며, 이 세포자체는 상아질 내측에 존재하는 ‘치수’라는 조직의 한 구성성분으로 치아 내부의 치수강 벽에 배열되어 존재한다 (Victor, E.; Arana-Chavez, V.E.; Massa, LF. Odontoblasts: the cells forming and maintaining dentine. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2004 36: 136773).
본원에서 치계 (dental origin) 중간엽 줄기세포는 ‘치계상피세포의 영향을 받은 (일부분의) 줄기세포들을 의미하며, 중배엽성 기원으로 치아내부의 치수와 치아 주위조직에 분포하는 줄기세포를 말하는데, 치수줄기세포(dental pulp stem cell (DPSC)), 탈락 유치 줄기세포(stem cell from exfoliated deciduous teeth (SHED)), 치주 인대 줄기세포(periodontal ligament stem cells (PDLSC)), 치근단 유두 줄기세포(stem cell from the apical papilla (SCAP), 및 치배 줄기세포(dental follicle precursor cells (DFPC))의 5가지가 알려져 있다.
본원의 비치계 중간엽 줄기세포는 치계 줄기세포와 동등한 선상에서의 치계가 아닌 다른 조직 기원의 줄기세포들이라는 개념을 포하며, 치계줄기세포보다 상위의 개념으로 더 넓은 범위의 치계상피세포의 영향을 받지 않은 모든 줄기세포를 포함할 수 있다. 예를 들면 치아 내부의 치수 및 치아 주위조직에서 유래한 것이 아닌 것으로, 다음과 같은 중간엽 줄기세포를 말한다. 본원에서 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell; MSC)’는 제대혈, 지방, 골수(bone marrow), 혈액, 진피 또는 골막에서 분리되는 줄기세포로서, 다양한 세포 예컨대 지방세포, 연골세포 및 골세포 등으로 분화할 수 있는 전능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포를 의미한다. 또한, 중간엽 줄기세포는 면역억제제의 사용 없이도 동종 또는 이종 수혜자에서 효과적으로 생착될 수 있는 특징이 있다.
일 구현예에서 본원의 조성물 또는 방법에 사용될 수 있는 중간엽 줄기세포는, 동물의 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간의 중간엽 줄기세포일 수 있다. 또한 본 발명의 중간엽 줄기세포는 골수, 지방조직, 말초혈액, 간 유래 일 수 있다. 본원의 일구현예에서 골수유래 줄기세포 또는 지방줄기세포가 사용된다. 본원의 치료용 조성물에 사용되는 세포는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 이종 (xenogenic) 세포이며, 특히 자가 세포이다.
중간엽 줄기세포는 골수 등에 적은 양으로 존재하지만, 이를 분리 및 배양하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있으며 예를 들면 미국특허 제5,486,359호를 참조할 수 있다. 또한, 본원의 중간엽 줄기세포는 공지된 방법에 따라 골수의 조혈모세포로부터 부착특성에 의해 분리한 후 분화능력을 잃지 않은 상태에서 증식시켜 얻을 수 있다.
예를 들면 중간엽 줄기세포를 얻는 과정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다: (1) 인간 또는 마우스를 포함하는 포유동물, 바람직하게는, 인간의 중간엽 줄기세포, 예컨대, 혈액 또는 골수로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계(상기 골수는 경골, 대퇴골, 척수 또는 장골로부터 추출할 수 있다.); 분리된 세포를 적합한 배지에서 배양하는 단계 및 배양과정에서 부유 세포를 제거하고 배양 플레이트에 부착된 세포들을 계대 배양하여, 최종적으로 구축된 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계를 통하여 얻을 수 있다.
상기 과정에서 이용되는 배지로는, 줄기세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N.et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지(Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al.,Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항생제 또는 항진균제(예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 글루타민 등이 포함될 수 있다.
다른 예에서 중간엽 줄기세포의 확인은 유세포 분석을 통하여 할 수 있다. 이러한 유세포 분석은, 중간엽 줄기세포의 특이한 표면 마커를 이용하여 실시된다. 예컨대, 중간엽 줄기세포는 CD44, CD29 및/또는 MHC 클래스 I에 대하여 양성 반응을 나타내므로, 이를 통해 중간엽 줄기세포를 확인할 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 조성물은 비치계 중간엽줄기세포에 처리되어 비치계 중간엽줄기세포의 상아모세포로의 분화에 사용될 수 있다. 이 경우 본원에 따른 조성물은 CPNE7 유전자 또는 이를 포함하는 벡터를 적절한 세포에 전달이입과 같은 후술하는 방법에 의해 도입하여 과발현하여 달성될 수 있으며, 상아모세포로의 분화를 위한 조성물은 당업자수준에서 적절한 것이 선택될 수 있으며, 본원의 실시예에 기재된 것을 참조할 수 있다.
이런 측면에서 본원은 본원에 따른 조성물, 또는 CPNE7 유전자를 이용한 비치계 유래 중간엽 줄기세포의 상아모세포로의 인비트로 또는 인비보에서의 분화방법에 관한 것이다.
본원에 따른 방법으로 인비트로에서 분화된 상아모세포는 분리된 후 그 자체로 사용되거나 (본원 도 8의 D, G, 및 J 등 참조) 또는 유세포분석기 등을 이용한 분리방법을 통해 분리된 후, 후술하는 세포치료제, 또는 약학조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다. 예를 들면 상아모세포의 분화마커로는 DSP, DMP1, Osteocalcin, Nestin 단백질 등과 Dspp 유전자 등 있으며, 이를 공지된 방법으로 이용하여 검출 분리할 수 있다
본원에 따른 CNPE7 단백질 또는 그 유전자는 환부에 직접처리하여 사용될 수 있으며 또한 환자의 내재성 (endogenous) 비치계 줄기세포의 분화에 영향을 미쳐 재생치료 효과를 나타낼 수 있다.
이런 측면에서 다른 양태에서 본원은 또한 본원의 방법 또는 조성물을 사용하여 분화된 상아모세포 또는 CPNE7를 과발현하는 중간엽줄기세포, 상기 중간엽줄기세포로부터 유래된 상아모세포로 분화될 수 있는 전구세포 또는 상기 중간엽줄기세포로부터 분화된 상아모세포를 유효성분으로 포함하는 상아질 또는 치수조직 재생용 세포 치료제 또는 상기 세포를 포함하는 상아질 또는 치수조직 재생용 약학 조성물, 또는 CPNE7 단백질 또는 그 유전자를 포함하는 상아질 또는 치수조직 재생용 약학 조성물에 관한 것이다.
본원에서 “세포치료제” 란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 이종 (xenogenic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하거나 기타 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 방법을 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포치료제는 조직재생 또는 특정 장기기능 회복을 위한 줄기세포 치료제를 포함하는 것이나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 약학 조성물에 포함되는 CPNE7 단백질 또는 그 유전자는 앞서 설명한 바와 같다.
본원에 따른 일구현예에서 세포 치료제에 포함되는 세포는 CPNE7을 과발현한다. 세포에서 단백질을 과발현하는 방법은 공지되어 있다. CPNE7 유전자를 적절한 진핵세포 발현벡터 예를 들면 파아지, 바이러스 또는 레트로바이러스 유래의 벡터 또는 플라즈미드에 발현 프로모터에 작동가능하도록 연결되도록 클로닝 하여, 발현 벡터를 구축한 후, 이를 본원에 따른 세포에 도입할 수 있다. 도입 방법은 공지되어 있으며 예를 들면 칼슘포스페이트법, DEAE-덱스트란 매개 전달이입, 양하전 지질 매개 전달이입법, 전기천공, 파아지 시스템을 이용한 트랜스덕션 또는 바이러스를 이용한 감염 방법 등을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 세포 치료제 또는 세포를 포함하는 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여될수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 따른 치료제 또는 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 세포치료용 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 세포치료용 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
또한 상기 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. 용어 ‘치료적으로 유효한 양’은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다.
그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 세포치료제 또는 약학적 조성물은 치수 노출에 의한 치수충혈/치수염에도 적용시켜 치수가 노출된 부분을 치수-상아질을 재생할 수 있거나 또는 치수변성, 치수괴사 및 괴저 등 병변치수가 제거된 빈 치수강 또는 기타 병리학적으로 손상된 조직 주위에 국소투여될 수 있다.
본원에 따른 세포 치료제 또는 약학적 조성물은 상아질 또는 치수조직 재생용에 사용된다. 상아질 또는 치수조직 재생을 통해, 다양한 치수질환의 치료가 가능하다. 치수질환은 치수는 치아의 내부에 있는 치수강을 채우고 있는 부드러운 결합조직으로 신경과 혈관이 풍부하게 분포되어 있으며 상아질의 표층에까지 이르는 치수 조직에 생기는 병변을 일컫는 것이다. 치수에 물리적 화학적 또는 세균성의 자극이 가해지면 처음에는 치수의 혈관이 확장되어 충혈을 볼 수 있고(치수충혈), 이 자극이 계속되면 치수에 염증이 생긴다(치수염). 자극의 세기, 세균감염의 유무에 따라서 염증에 정도의 차이가 있는데, 치수가 단단한 상아질에 의해서 쌓여 있는 해부학적 특징 때문에 염증이 일어나면 순환장애가 일어나기 쉽고, 그대로 내버려두면 치수가 괴사하기 쉽다. 치수 질환의 원인은 매우 다양하나, 대부분의 경우는 충치에 의한 세균감염과 치아의 천공, 파절, 균열, 치주낭을 통해서 치수내부로의 감염에 의해 발생한다. 또한 외상, 마모, 치아 균열, 치료 시 치과용 기구에서 나오는 열과 마찰 등도 유발할 수 있다. 세균감염에 의한 치수염은 치근단 질환과 치주질환으로 확대 될 수 있다.
이러한 다양한 원인 및 증상을 나타내는 치수 질환이 본원의 범위에 포함되며, 치수질환의 예로는 상아질 지각과민증, 치수충혈 ·치수염 ·치수변성, 치수의 괴사 및 괴저를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 세포 치료제는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 세포 치료제 또는 조성물의 투여량은 유효성분인 줄기세포로부터 분화된 골모세포를 기준으로 1.0× 107 내지 1.0× 108 세포/kg(체중), 보다 바람직하게는 1.0× 105 내지 1.0× 108 세포/kg(체중)일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개 부위 또는 2개 부위 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 허혈기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실 시 예
실험방법 및 재료
1. 세포주 배양 및 분화
5%의 CO2 포함하는 습윤된 공기 37℃ 조건에서 배양된 세포가 실험에 사용되었다. 마우스 배아 중간엽세포주 (C3H10T1/2), 마우스 골수 유래 중간엽 세포주 (BMSC) 를 사용하였으며, 10% 열 불활성화된 소의 혈청이 첨가된 DMEM 배지에 배양하였다. 마우스 법랑모세포주 (ALC)는 10% 열 불활성화된 소의 혈청이 첨가된 MEM 배지에 배양하였다. 50mg/ml 아스코르브산, 10mM 베타-글리세포포스페이트를 포함한 분화배지를 이용하여 14일간 분화 시켰다.
2. 세포 동시 배양
법랑모세포주와 배아 중간엽세포주를 동시에 배양하기 위하여, 트랜스웰 디쉬 (transwell dishes)를 사용하였다. 법랑모세포주는 트랜스웰 디쉬 윗층 챔버에 키우고, 배아중간엽세포는 트랜스웰 디쉬 아래층 챔버에 각각 배양하였다. 세포가 80-90% 컨플루언스에 이르렀을 때, 위층과 아래층 챔버를 조립하고 각 배지에서 배양하였다.
3. 웨스턴 분석
단백질을 분리하기 위하여 세포를 PBS로 세척하고, 1,000 xg 에서 5분간 저온에서 원심분리하여 세포를 모았다. 상층액을 제거한 후 펠렛은 용해 버퍼(100 mM Tris, pH 7.4, 350 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 1x protease inhibitor (Sigma-Aldrich, USA))에 녹여 얼음에서 15분간 반응하였다. 세포 잔해(Cell debris)는 16,000 xg, 15분간 저온에서, 원심분리하여 제거하고 상층액만 취하였다. 30 μg 의 단백질을 전기영동으로 분리하여 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 0.1% 트윈 20이 포함된 PBS(PBS-T) 에 5% 탈지분유로 블락킹하고 PBS-T로 세척한 후 Anti- CPNE7, GAPDH, DSP, nucleolin, DMP1 항체에 1:1000으로 반응시켰다. 세척 후 멤브레인은 항-래빗, 마우스 IgG 접합된 호스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase)(1:5000) (Santa Cruz Biotechnology)에 한 시간 반응한 후 증강된 화학발광시스템(enhanced chemiluminescence system )(Amersham Biosciences)로 밴드를 확인하였다.
4. DSPP 프로모터 리포터 분석
루시퍼라제 분석은 MDPC-23 세포를 24-well plate에 5 X 104 cells / well로 플레이팅하고, 24시간후 리포펙타민(Lipofectamine) PlusTM 시약으로 전달이입하였다. 각각의 전달이입에, 각각 0.5 g 의 pGL3basic (대조군), pGL3 DSPP 프로모터(-1000~+1), CPNE7 발현 플라스미드, CPNE7 siRNA, nucleolin siRNA, 대조군 siRNA를 사용하였다. 전달이입된 세포는 48 시간 후에 루시퍼라아제 활성을 측정하였다.
5. 크로마틴 면역침강(ChIP) 분석
MDPC-23 세포를 각 지정된 벡터를 전달이입시킨 후 PBS로 수세한 다음 수거하여 초음파기기를 이용하여 세포의 크로마틴을 약 1,000bp 크기로 분쇄하였다. 크로마틴 면역침강은 Nfic, CPNE7, nucleolin 항체 (30 ㎕)를 첨가하여 4°C 에서 4 시간 동안 반응 시킨 후 DNA 펠렛을 수거한 후 PCR을 이용하여 각 단백질이 프로모터 지역에 결합되었는지를 확인 하였다. PCR 프라이머 염기서열은 DSPP promoter 지역 (390bp), mouse DSPP -400 지역: forward 5’-gggtcttaaatagccagtcg-3’와 mouse DSPP-10 지역: reveres, 5’-ctgagagtggcacactgt-3’이다. PCR 조건은 아래와 같다: 94°C for 30s; 60°C for 30s; 72°C for 30s 총 35 cycles. PCR 산물은 2% 아가로스 겔에서 전기영동하여, 에티디움 브로마이드로 염색하여 적외선에서 확인하였다.
6. 마우스 생체 내 이식과 조직학적 분석
사람 골수 중간엽 줄기세포를 1 x 107 개와 사람의 치아치근 절편의 빈 치수강에 0.5% 피브린 겔과 함께 넣고 누드마우스의 피하에 이식하였다. 이식한 샘플은 12주에 분리하여 4% 파라포름알데하이드로 고정하고, 10% 에틸렌디아민테트라 아세트산 용액을 이용하여 일주일 동안 탈회하고, 수세, 탈수 등의 과정을 거친 다음 파라핀에 포매하여 5 μm 두께로 절단하였다. 절단한 조직은 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin; H-E) 염색을 하였다.
7. 면역조직화학 분석
채취한 샘플을 4% 파라포름알데하이드에서 고정하고, 탈회, 수세, 탈수 등의 과정을 거친 다음 파라핀에 포매하여 5 μm 두께로 절단하였다. DSP, Nestin 을 이용하여 면역조직화학 염색을 진행하였다.
8. 면역형광염색법
MDPC-23 세포를 30분간 4°C에서 4% 파라포름알데하이드에 고정하고, 0.15% Triton X-100/PBS에서 투과성화 한 후 2% 소 혈청을 이용하여 비특이적인 결합을 제거하였다. 세포는 CPNE7, nucelolin 항체를 4시간 반응시키고, PBS로 세번 세척한 후 형광성 라벨된 2차 항-마우스, 래빗 항체를 2시간 동안 빛이 차단된 곳에서 반응시켰다. 세포의 핵은 DAPI를 이용하여 염색하였다. 세척 후 샘플을 고정하고, 형광 현미경으로 관찰하였다.
9. Co-immunoprecipitation (Co-IP) 분석
MDPC-23 세포를 각 지정된 벡터를 전달이입시킨 후 PBS로 수세한 다음 용해버퍼에 녹여 얼음에서 15분간 반응하였다. 세포 잔해는 16,000 xg, 15분간 저온에서, 원심분리하여 제거하고 상층액만 취하였다. 면역침강을 위하여, CPNE7, nucleolin 항체 (30 ㎕)을 첨가하여 4°C 에서 4시간 동안 반응 시킨 후, 아가로스 비드 (20 ㎕)을 첨가하여 4°C 에서 4시간 동안 반응시킨다. 아가로스 비드를 이용하여 원심분리 후 웨스턴블랏 방법을 진행하였다.
10. 세포 배양 및 공배양 시스템
MDPC-23 세포는 제이 이 노르(J.E. Nor)박사(미시간 대학교, 앤 아버, MI)에게서 제공받았다. ALCs는 티 스기야먀(T. Sugiyama)박사( 아키타 대학교 약학대학, 아키타, 일본)에게서 제공받았다. C3H10T1/2 및 HEK293 인간 배아 신장 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, 마나사스, VA)에서 얻었다. 인간 BMSC (PT-2501)는 론자(USA)에서 구입하였다. MDPC-23, C3H10T1/2, hBMSCs, 및 HEK293 세포는 둘배코의 변형 이글 배지(DMEM : Life technology, USA)에서 배양하였으며, ALCs는 최소 필수 배지(MEM : Life technology)에서 배양하였는데, 상기 배지에는 10% 열 불활성화된 소태아혈청(FBS : Life technology) 및 항생제-항진균제(Invitrogen, USA)가 첨가되어 있으며 37℃에서 5% CO2 대기하에서 배양하였다. 세포 분화 및 석회화된 결절 형성을 유도하기 위하여, 융합성 세포는 유도 배지(50㎍/㎖ 아스코르브산 및 10 mM β-글리세로포스페이트를 함유하는 DMEM)에서 2주 이상 처리하였다.
ALC를 MDPC-23 세포와 공배양하기 위하여 트랜스웰® 투과성 지지대(permeable supports)를 사용하였다. ALC는 트랜스웰의 상부챔버에서 배양하였다. MDPC-23 세포는 상기 디쉬의 하부챔버에서 배양하였다. 세포가 80-90% 컨플루언스에 이르렀을 때, 상부 챔버를 하부 챔버와 합하였다.
11. 플라스미드
전장 마우스 CPNE7 (mCPNE7, NM_170684) cDNA, siRNA 타겟팅 CPNE7, 및 pGL3-Dspp 벡터를 만들었다. 전장 인간 CPNE7를 인코딩하는 발현 벡터, 녹색 형광 단백질(GFP)-CPNE7 (NM_153636), 및 DDK (플래그)-태그된 CPNE7 (NM_153636)는 오리진(Origene, USA)에서 구입하였다. Recombinant CPNE7(NP 705900)는 오리진에서 구입하였다. 대조군 siRNA (sc-37007) 및 siRNA 타겟팅 뉴클레오린(sc-29230)은 산타 크루즈 바이오테크놀로지(USA)에서 구입하였다.
12. 역전사 - 폴리머라아제 체인 반응( RT - PCR ) 및 실시간 PCR 분석
제조자의 방법에 따라 TRIzol® 시약(Invitrogen)으로 세포에서 총 RNA를 추출하였다. Superscript III 역전사효소(Invitrogen) 및 올리고(dT) 프라이머(New England Biolabs, USA)를 사용하여 총 RNA(3 ㎍)를 역전사하였다. 하기 프라이머 쌍을 사용하여 RT 생성물 중 1 마이크로리터를 PCR로 증폭시켰다: Odam (462 bp, forward[F] 5’-atgtcctatgtggttcctgt-3’, reverse[R] 5’-ttatggttctcttaggctatc -3’), CPNE7(178bp, [F] 5’-cccgacccattgaccaagtc-3’, [R] 5’- catacacctcaaaccgtagcttc-3’), Mmp-20 (458 bp, [F] 5’-agctgtgagcaactgatgactgga- 3’, [R] 5’-acagctagagccaagaacacacct- 3’), GAPDH (452 bp, [F] 5’-accacagtccatgccatcac- 3’, [R] 5’-tccaccaccctgttgctgt 3’), Dspp (141 bp, [F] 5’-gtgaggacaaggacgaatctga- 3’, [R] 5’-cactactgtcactgctgtcact- 3’), 및 Osteocalcin (283 bp, [F] 5’-ccacagccttcatgtccaag- 3’, [R] 5’-ggcagagagagaggacaggg- 3’). 올리고(dT) 프라이머(New England Biolabs). 하기 프라이머 쌍을 사용하여 RT 생성물 1 마이크로리터를 PCR로 증폭시켰다: Odam (462 bp, forward [F] 5’- atgtcctatgtggttcctgt-3’, reverse [R] 5’-ttatggttctcttaggctatc- 3’), CPNE7 (178 bp, [F] 5’-cccgacccattgaccaagtc-3’, [R] 5’- catacacctcaaaccgtagcttc-3’), Mmp-20 (458 bp, [F] 5’-agctgtgagcaactgatgactgga- 3’, [R] 5’-acagctagagccaagaacacacct- 3’), GAPDH (452 bp, [F] 5’-accacagtccatgccatcac- 3’, [R] 5’-tccaccaccctgttgctgt 3’), Dspp (141 bp, [F] 5’-gtgaggacaaggacgaatctga- 3’, [R] 5’-cactactgtcactgctgtcact- 3’), 및 Osteocalcin (283 bp, [F] 5’-ccacagccttcatgtccaag- 3’, [R] 5’-ggcagagagagaggacaggg- 3’). 94℃에서 30s, 55℃에서 30s, 72℃에서 1분동안 30 싸이클 조건하에서 PCR을 수행하였다. PCR 생성물을 1% 아가로스 겔에서 전기영동하고, 에티디움 브로마이드로 염색한 후 자외선 하에서 확인하였다.
SYBR Green PCR Master Mix (Takara Bio, Japan)를 사용한 ABI PRISM 7500 서역 탐지 시스템(Applied Biosystems, USA)에서 매뉴얼에 따라 실시간 PCR을 수행하였다. 95℃에서 1분, 94℃에서 15s, 및 60℃에서 34분 동안 40싸이클의 조건으로 PCR을 하였다. 모든 반응은 세 배수로 진행되었고, PCR 생성물 레벨은 하우스키핑 유전자 GAPDH를 기준으로 노말라이즈하엿다. 유전자 발현에서의 상대적 변화는 비교 역치 싸이클(CT) 방법을 사용하여 계산하였다.
13. 세포질 및 핵 단백질 추출물의 제조
4℃에서 5분간 3000rpm에서 원심분리하여 세포를 모았다. 프로테아제 저해제(Roche Molecular Biochemicals, Germany)가 보충된 얼음처럼 차가운 저장 용해 버퍼(10 mM HEPES, pH 7.9, 10 mM KCl, 0.1% Nonidet P-40 [NP-40])에서 15분간 세포 용해를 수행하였다. 4℃에서 5분간 3000rpm에서 원심분리하여 핵 및 세포질 분획을 분리하였다. 얻은 상층액(세포질 분획)은 추가 분석때까지 4℃에서 저장하였다. 프로테아제 저해제가 보충된 얼음처럼 차가운 저장 용해 버퍼(10 mM HEPES, pH 7.9, 150 mM NaCl, 1% NP-40 [NP-40], 0.25% 소디움 데옥시콜레이트, 10% 글리세롤)에서 멤브레인 펠렛을 재현탁시켰다. 얻은 상층액(핵 부분)은 추가 분석때까지 4℃에서 저장하였다.
14. CM 제조 및 CPNE7 의 불활성화
CM을 하기와 같이 수득하였다. ALC 세포를 7.5 x 105 세포/100-mm 디쉬에 씨드하였다. 세포가 80% 컨플루언스에 이르렀을 때 분화 배지로 교체하였다. 분화한지 3일 후에 세포를 인산완충 식염수(PBS)로 두 번 세척하여 FBS가 없는 분화 배지에서 24시간동안 배양하였다. 무혈청 조정 배지(serum-free conditioned medium)를 하베스트하여 암모늄 설페이트 침전으로 1 ㎍/㎕까지 농축하였다. CM에서 CPNE7을 불활성화하기 위하여 20 또는 40 ㎍/㎖ 항-CPNE7 항체를 4℃에서 2시간동안 회전시켜 CM과 혼합하였다.
15. 웨스턴블랏 분석
총세포 추출물을 제조하기 위하여, 상기 세포를 PBS로 세 번 세척하여 1.5 ml 튜브 내에 스크랩한 후 4℃에서 2분간 12,000rpm에서 원심분리하여 펠렛으로 하였다. 상층액을 제거한 후 상기 펠렛을 용해 버퍼(50 mM Tris-Cl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 2 mM EDTA, pH 7.4)에 재현탁시켜 얼음에서 15분간 배양하였다. 세포 잔해는 원심분리로 제거하였다. 10% 소디움 오데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)로 30 마이크로그램 단백질을 분리하여 니트로셀룰로오스 멤브레인에 트랜스퍼하였다. 0.1% Tween 20 (PBS-T)를 함유하는 PBS내의 5% 탈지 분유로 1시간 동안 멤브레인을 블락하고, 4℃에서 PBS-T (1:1000)에 희석된 1차 항체와 함께 밤새 배양하였다.
래빗 및 친화성이 전제된 폴리클론 항-Odam, 항-CPNE7, 및 항-Dsp 항체를 제조하였다. 플래그(F3165) 항체는 시그마-알드리치에서 구입하였다. Mmp-20 (sc-26926), Lamin B (sc-6216), Osteocalcin (sc-30044), Nucleolin (sc-8031), 및 GAPDH (sc-25778) 항체는 산타 크루즈 테크놀로지에서 구입하였다. Dmp1 항체 (ab103203)는 애브캄(Cambridge, UK)에서 구입하였다. 세척후, 과산화효소(horseradish peroxidase)가 컨쥬게이트(1:5000)된 항-마우스(sc-2031), 항-래빗(sc-2004), 또는 항-염소(sc-2768) IgG 2차 항원(전부 Santa Cruze Biotechnology 에서 구입)와 함께 상기 멤브레인을 1시간동안 배양하였다. 라벨된 단백질 밴드는 증강된 화학 발광 시스템(GE Healthcare, UK)을 사용하여 탐지하였고, 상기 벤드는 상기 디벨롭프된 자기방사 필름의 농도 분석으로 측정하였다.
16. 형광현미경분석
커버글라스(Thermo Scientific, USA)에 있는 Nunc™ Lab-Tek™ II의 세포를 PBS로 세척하고, PBS 내의 4% 파라포름알데히드로 실온에서 10분간 고정시킨 후, 0.5% Triton X-100를 함유하는 PBS에서 10분간 투과성으로 만들었다. 세척 후에, 상기 세포를 항-CPNE7 (1:200) 및 항-Nucleolin (1:200) 항체와 함께 블락킹 버퍼(PBS 및 1% 소 혈청 알부민)에서 1시간 동안 배양한 후 플루오레세인 이소시아네이트(FITC)- 또는 Cy3-컨쥬게이티드된 항-마우스 또는 항-래빗 IgG 항체(1:200, GE Healthcare)를 추가하였다. 세척 후, 상기 세포를 올림푸스 AX70 형광현미경(Tokyo, Japan)으로 확인하였다. 핵 내의 염색체 DNA는 4’,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; 시그마-알드리치)로 염색하였다.
17. 일시적 형질전환 및 루시퍼라아제 어세이
HEK293 또는 MDPC-23 세포를 웰 당 1.5 X 105 세포의 밀도로 12-웰 배양 플레이트에 씨드하였다. 상기 세포를 Metafectene Pro 시약 (Biontex, Martinsried/Planegg, Germany)을 사용하여 상기 컨스트럭트와 함께 일시적으로 형질전환시켰다. CPNE7 발현 벡터 또는 CPNE7 또는 뉴클레오린 siRNA 벡터와 함께 MDPC-23 세포 내에 컨스트럭트 pGL3-Dspp를 공전달이입(cotransfection)시켰다. 이어 50㎕ 루시페린을 50㎕의 세포 융해물에 첨가하여, 루세페라아제 활성을 발광 발광측정기(luminescence luminometer)를 사용하여 매뉴얼에 따라 측정하였다.
18. Co - IP ( immunopercipitaiton ) 어세이
Metafectene Pro 시약을 사용하여 지시된 플라스미드 DNA와 함께 전달이입한 후, MDPC-23 세포를 PBS로 세척하고, 프로테아제 저해제를 보충한 co-IP 버퍼(50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% NP-40, 5 mM EDTA) 1ml를 첨가하여 상기 세포 융해물을 제조하였다. 상기 융해물을 4℃에서 2시간 동안 1:200 희석의 항체와 함께 배양하였다. 30 마이크로리터의 단백질 A/G PLUS-아가로스 (sc-2003, Santa Cruze Biotechnology)를 첨가하여 4℃에서 1시간동안 회전하면서 배양하였다. SDS-PAGE 샘플 버퍼에서 5분간 끓여서 비드로부터 면역 복합체를 방출시켰다. 10% SDS-PAGE 겔에서 전기영동한 후, 항-뉴클레오린과 함께 웨스턴블랏하여 면역침강물을 분석하였다.
19. ChIP 어세이
Metafectene Pro 시약을 사용하여 지시된 플라스미드 DNA와 함께 전달이입한 후, MDPC-23 세포를 37℃에서 10분간 1% 포름알데히드에서 교차결합을 시킨 후, 차가운 PBS로 두 번 린스하여, SDS 용해 버퍼(1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8.1)에서 10분간 얼음 상에서 팽창시켰다. 상기 핵을 얼음 상에서 초음파처리하였다. 10분간 원심분리하여 상층액을 얻어 ChIP 희석 버퍼(0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 및 167 mM NaCl)에서 10배 희석하였다. 조각 염색질 혼합물을 항-Nfic, 항-뉴클레올린, 항-CPNE7, 또는 IgG (1:250)와 함께 4℃에서 4시간동안 회전시켜 배양하였다. 30 마이크로리터의 단백질 A/G PLUS-아가로스를 첨가하여 4℃에서 1시간동안 회전시키면서 배양하여 항체/염색질 혼합물을 모았다. 상기 침전된 염색질 혼합물을 매뉴얼에 따라 복구시켜 해리시켰다(Millipore, USA). 최종 DNA 펠렛을 복구하여 프라이머를 사용하여 PCR로 분석하였는데, 상기 프라이머는 Dspp 프로모터 부위(390 bp), 마우스 Dspp -400 부위: 정방향 5’-gggtcttaaatagccagtcg-3’ 및 마우스 Dspp-10 region: 역방향, 5’-ctgagagtggcacactgt-3’를 포함한다. PCR은 94℃에서 30s동안 55℃에서 30s동안, 그리고 72℃에서 1분동안 35싸이클의 조건으로 수행하였다. PCR 생성물은 1% 아가로스 겔에서 전기영동하고, 에티디움 브로마이드로 염색하여 자외선으로 확인하였다.
20. DAPA
600㎍의 핵 추출물 단백질, Dspp 프로모터의 비오틴화된 특이적 야생형이면서 변이된 AP-1 사이트 올리고뉴클레오타이드 6㎍, 및 60㎕의 스트렙타비딘-아가로스 비드를 혼합하여 결합 어세이를 수행하였다. 상기 혼합물을 4℃에서 2시간동안 회전시키면서 배양하였다. 비드를 펠렛으로 하여 PBS로 세 번 세척하였다. 결합 단백질이 로딩 버퍼와 함께 용출되었으며, SDS-PAGE로 분리하여 웨스턴블랏으로 분석하였다.
21. 알리자린 레드 S 염색
MDPC-23 세포를 PBS 내 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정하였다. 0.1% NH4OH(pH 4.2) 내의 1% 알리자린 레드 S(시그마-알드리치) 용액으로 실온에서 20분간 염색하였다.
22. 동물, 조직 제조 및 면역조직화학분석
동물을 사용하는 모든 실험은 서울국립대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)가 승인한 프로토콜(SNU-111013-2)에 따랐다. 배아 19일(E19), 출생 후 7일(P 7) 및 10일(P 10)의 마우스의 머리를 10% EDTA(pH 7.4)에서 탈회하고, 파라핀에 포매하여, 면역조직화학분석을 진행하였다. 1차 항원으로는 래빗 항-CPNE7 및 2차 항원으로는 비오틴화된 염소 항-래빗 IgG(1:200, Vector Labs)를 사용하여 ABC 키트(Vector Labs, USA)로 CPNE7를 발현하였다.
23. 1차 세포 배양, 인비트로 이식 및 조직학적 분석
본 발명자는 서울국립대학교 치과병원에서 손상된 인간의 세 번째 어금니를 수집하였다. 실험 프로토콜은 IRB(Institutional Review Board)에서 승인받았다. 환자의 동의를 받았다. 인간 DPC를 분리하여 인비보 이식실험에 사용하였다. hDPCs (2 x 106)를 100mg의 히드록시 에퍼타이트(hydroxy apatite)/트리칼슘 포스페이트(HA/TCP) 세라믹 파우더(Zimmer, USA) 단독, 또는 CM(30 ㎍)과 함께, 또는 CPNE7 항체-처리된 CM과 함께, 또는 0.5% 피브린 겔 내의 rCPNE7 (5 ㎍)과 함께 혼합한 후, 면역시스템이 손상된 마우스(NIH-bg-nu-xid; Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)에게 6주 동안 피하 이식시켰다. CM 내 CPNE7을 불활성화시키기 위하여, CPNE7 항체처리된 CM 그룹에 인비보로 이식하기 전에 4℃에서 24시간 동안 CPNE7 항체(5 ㎕)를 CM과 회전하면서 혼합하였다. 새로 형성된 석회화된 조직을 조직형태학적으로 분석하기 위하여, 과발현된 CPNE7로 감염된 hDPCs 또는 불활성 컨스트럭트를 HA/TCP와 함께 12주 동안 이식하였다. 근관 공간(root canal spaces)에서의 상아질/치수조직-유사 조직 형성을 평가하기 위하여, CM(10 ㎍) 또는 0.5% 피브린겔 내의 CPNE7 항체-처리된 CM과 hDPCs (2 x 106)를 혼합하여, 12주 동안 인간 치아 부분의 빈 근관공간에 삽입하였다. 인간 치아 부분은 문헌(Choung et al. (2013) The role of preameloblast-conditioned medium in dental pulp regeneration. J Mol Hist. 44:715-721)에 기재된 프로토콜에 따라 제작하였다. 또한, rCPNE7 (5 ㎍) 또는 rBmp2 (5 ㎍; Cowellmedi, Korea)와 함께 hBMSCs도 빈 근관 공간에 6주 동안 삽입하였다.
샘플을 하베스트하여 4% 파라포름알데히드에 고정하여, 10% EDTA(pH 7.4)에서 탈회시켜, 파라핀에 포매하여, 헤마톡실린-에오신(H-E) (Vector Labs)으로 염색하거나 또는 면역조직화학적 분석을 진행시켰다. 면역조직화학적 분석을 하기 위하여, 1차 항원으로 1:100로 희석한 항-DSP, 항-BSP(1), 또는 항-NESTIN (MAB353, Millipore)와 함께 그리고 2차 항원으로 비오틴 라벨을 한 염소 항-래빗 IgG (Vector Labs)과 함께 단백질을 탐지하였다. 생성된 석회화된 조직의 총 면적은 LS starter program (Olympus Soft Imaging Solutions, Germany)을 사용하여 분석하였다.
24. 통계 분석
스튜던트 t-테스트를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 모든 통계 분석은 SPSS software ver. 19.0를 사용하여 수행하였다.
실험결과
1. CPNE7 에 의한 성숙한 상아모세포로의 분화 조절
18-19 태아기 CD-1 마우스의 치유두(dental papilla)에서 유래된 MDPC-23 (Hanks CT, et al. (1998) Connective tissue research 37(3-4):233-249.) 세포를 본 실험에 사용하였다. 상아모세포 분화에서 전위된 CPNE7의 기능적 역할을 밝히기 위하여, 내인성 상아모세포 CPNE7의 발현패턴을 상아모세포 MDPC-23 세포에서 측정하였다. CPNE7은 MDPC-23 세포의 핵에 주로 위치하고 있었다(도 3A). 상아모세포 분화에서 CPNE7 단백질의 발현 레벨은 0일에서부터 7일(상아모세포 분화의 초기 내지 중간 단계)까지는 증가하였고, 그 후 10일부터 14일(상아모세포 분화의 말기 단계 및 석회화)까지는 감소하였다. Dsp 및 오스테오칼신을 포함하는 상아모세포 분화 마커의 발현은 7일에서 14일까지 상아모세포에서 증가하였는데, 이는 CPNE7에서의 증가보다 늦었다(도 3B 및 C). 이러한 발견은, 상아모세포에서의 핵 CPNE7이 상아모세포 분화, 특히 초기 내지 중간 단계에서 기능적 역할을 한다는 것을 유의하게 증명하는 것이다.
Dspp 상향조절이 CPNE7가 상아모세포로 분화하는 데에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위하여, CPNE7 및 CPNE7 siRNA를 인코딩하는 컨스트럭트와 함께 MDPC-23 세포를 전달이입한 후, Dspp mRNA 및 Dsp 단백질의 발현레벨을 측정하였다. CPNE7의 발현 레벨은 CPNE7-인코딩 컨스트럭트와 함께 전달이입함으로써 증가하였고, 대조군 및 대조군 siRNA와 함께 전달이입된 세포와 비교할 때, MDPC-23 및 HEK293 세포에서 CPNE7 siRNA에 의해 효과적으로 저해되었다(도 11 및 4B). CPNE7 과발현은 Dspp mRNA 및 Dsp 단백질의 발현 레벨을 유의하게 증가시켰고, 반면 siRNA-매개 CPNE7 녹다운은 MDPC-23 세포에서 상기 레벨을 하향조절하였다(도 4A 및 B). 외인성 CPNE7 또한 Dspp 발현을 증가시키는지 확인하기 위하여, 본 발명자는 MDPC-23 세포에서의 Dspp 발현에 대한 재조합 CPNE7(rCPNE7)의 영향을 조사하였다. 예상한 바와 같이, rCPNE7 처리는 MDPC-23 세포에서 Dspp mRNA 및 Dsp 단백질의 발현 레벨 또한 증가시켰다(도 4C 및 D). 인비트로에서 상아모세포 분화동안 대조군과 비교하여, 재조합 CPNE7 처리에 의해 석회화된 결절 형성이 증가되었다(도 12). 이러한 데이터를 통해 CPNE7은 Dspp 발현을 조절하고 상아모세포 분화 및 석회화를 조절한다는 것을 알 수 있다.
다음으로, CPNE7 및 Dspp 유전자 발현의 기능적 연속성을 확인하고자 하였다. 상기 결과와 유사하게, ALC와 공동배양하면 MDPC-23 세포에서 CPNE7 및 Dsp 단백질의 발현 레벨이 증가하였다(도 4E). Dsp 단백질은 PA-CM처리에 의해 용량 의존적 방식으로 증가하였는데, 불활성화를 위한 CPNE7-특이적 항체의 농도를 증가시켜 처리하였을 때는 감소하였다(도 4F). 또한, Dspp 전사 활성은 CPNE7의 과발현에 의해 유의하게 촉진되었지만, siRNA-매개된 CPNE7 녹다운에 의해 억제되었다(도 4G).
종합하면, 이러한 결과는 CPNE7이 Dspp 발현 조절을 통해 상아모세포 분화 및 석회화를 조절한다는 것을 나타낸다.
2. CPNE7 에 의한 인비보에서 인간 치수세포( human dental pulp cells (hDPCs))와 같은 치아 중간엽 줄기세포의 상아모세포로의 분화 및 상아질 형성 유도
인비보에서의 상아모세포 분화 및 상아질 형성에서의 CPNE7의 역할을 규명하기 위하여, 4가지 다른 조건 즉 hDPCs 단독, PA-CM와 함께 hDPCs, PA-CM 및 CPNE7 항체와 함께 hDPCs 그리고 rCPNE7과 함께 hDPCs의 조건으로 히드록시아파타이트/트리칼슘 포스페이트(HA/TCP)의 존재하에서, hDPC를 면역시스템이 손상된 마우스의 피하 조직에 이식하였다. 이식 6주 후에, 모든 그룹에서 HA/TCP 입자의 주변에 상아질/치수조직 유사 조직이 형성되었다(도 5A-H). PA-CM- 또는 rCPNE7-처리한 그룹에서는 hDPCs-단독 그룹보다 상아모세포와 상아질/치수조직 복합체 특징이 더 전형적으로 나타났다(도 5E, F 및 H). 그러나, 불활성화를 위해 CPNE7 항체 처리한 PA-CM와 함께 처리된 그룹에서는 석회화 조직 형성이 거의 관찰되지 않았다(도 F 및 G).
도 4에 나타난 인비트로 실험 결과에 근거하여, 인비보에서 상아질/치수조직-유사 조직 형성에 대한 CPNE7 유전자의 영향을 측정하기 위하여, CPNE7-코딩, CPNE7 siRNA, 또는 대조군 siRNA 컨스트럭트와 함께 전달이입한 hDPC를 피하조직에 이식하였다. 이식 12주 후, hDPC-단독, CPNE7 과발현, 및 대조군 siRNA 그룹은 HA/TCP 입자의 주변에 상아질-유사 석회화된 조직의 발생이 나타났지만, 반면 CPNE7 siRNA 그룹은 석회화에 대한 증거가 거의 나타나지 않았다(도 6A-H). 각 그룹의 조직형태학적 분석에 따르면, hDPC에서의 CPNE7의 과발현은 인비보 상아질-유사 석회화 조직 형성과 가장 높은 레벨로 관련이 있고 CPNE7의 siRNA-매개 녹다운은 가장 최소의 관련이 있었다. hDPCs 단독 및 대조군 siRNA 그룹사이에 유의한 차이는 없었다(도 6I).
자연적 상아질 벽 및 빈 치수 공간으로 구성된 치아 부분은, 치아 줄기세포에 의한 상아질/치수조직-유사 조직의 재생에 특이적 국소 환경을 만들어준다(Huang GT, et al. (2010) Tissue engineering. Part A 16(2):605-615). 치근관 공간에서의 상아질-치수조직 유사 조직 형성을 평가하기 위하여, PA-CM 또는 CPNE7 항체 처리된 PA-CM이 없이 또는 상기와 함께 hDPC를 혼합하여, 면역시스템이 손상된 마우스의 피하 조직에 이식하였다. 이식 12주 후에, 모든 그룹에서 치근관 공간 내부에 혈관이 발달된 치수조직-유사 조직이 재생되었다(도 7A-C). PA-CM 처리된 그룹에서, 기존의 상아질 벽에 상아모세포-유사 세포가 울타리배열로 존재하였고, 이들의 세포 돌기는, 늘어난 핵과 함께, 기존의 상아질 세관을 향해 확장되었다.(도 7B, E 및 H). 그러나, CPNE7 항체-처리된 PA-CM그룹에서, 새로 형성된 치수조직-유사 조직 및 기존의 상아질 사이에서, 갇힌 세포(entrapped cell)가 있는 상대적 상아질-유사 석회화 조직이 관찰되었다. hDPC 단독 및 PA-CM-처리된 그룹과 비교하여 CPNE7 항체 처리된 PA-CM 그룹의 새로 형성된 상대적 상아질 지역에서 BSP가 뚜렷하게 발현되었다(도 7D-F). 그러나, CPNE7 항체 처리된 CM 그룹에서 DSP 희미한 염색이 관찰되었을 뿐 아니라, PA-CM 그룹에서 DSP가 분명히 탐지되었다(도 7G-I).
종합하면, 이러한 결과는 예비범랑모세포-유래 인자들 사이에서, 상아질/치수조직 복합체의 재생에 CPNE7이 중요한 기능적 역할을 하며, hDPC와 같은 치아 유래 중간엽 줄기세포의 상아모세포 분화를 유도한다는 것을 알 수 있다.
3. CPNE7 에 의한 인비보 및 인비트로에서 비치계 ( non dental ) 유래의 중간엽 줄기세포의 상아모세포로의 분화를 유도
본 실시예에서는 치아 내피에서 유도된 것이 아닌 비치계 유래 중간엽줄기세포에서의 CPNE7의 역할을 규명하였다. 이 실험에는 마우스 배아 연결 조직으로부터 만들어졌으며, 유도없이는 상아모세포-유사 세포로 분화되지 않는 C3H10T1/2 세포, 및 인간 골수 중간엽 줄기세포(hBMSC)를 사용하였다.
첫 번째로, C3H10T1/2 세포에서의 CPNE7 과발현 또는 ALC 공배양의 효과를 조사하였다. 대조군 C3H10T1/2 세포 및 분화배지에서 5일간 배양한 상기 세포 둘다에서 CPNE7이 발현되지 않았다. 그러나 ALC와 공배양한 C3H10T1/2 세포에서, 비록 발현 레벨은 낮지만, 웨스턴블랏으로 CPNE7 발현을 확인하였다. ALC 또한 C3H10T1/2 세포에서 Dmp1 및 Dsp 발현을 유도하였다(도 8B).
다음으로, 빈 치근관 공간에서 rCPNE7 또는 rBMP2 단백질의 존재 또는 부존재하에 hBMSCs를 사용하여 인비보 실험을 하였다. rCPNE7-처리된 hBMSCs그룹에서는, 상기 비치계 중간엽 줄기세포가 상아모세포 세포돌기 및 상아질-유사 석회화 조직을 가진 상아질-유사 세포로 분화하였으며, 기존의 상아질벽에 상아질 세관의 구조를 재생해냈다(도 8C-E). 상아모세포-유사 세포의 세포 돌기는 새로 형성된 상아질-유사 조직의 상아질 세관을 향해 뻗었으며, DSP 및 NESTIN를 발현하였다(도 8F-K). 반면에, hBMSC 단독 및 rBMP2-처리된 hBMSC 그룹에서는 상아질-유사 구조 또는 DSP 또는 NESTIN 발현이 관찰되지 않았다.
종합하면, 이러한 결과는, 예비상아모세포에서 유래한 CPNE7은 치원의(odontogenic) 유도 과정에서 시그널 분자로서 작용하며, 이에 인비보 및 인비트로에서 치계(dental) 뿐만 아니라 비치계 유래의 중간엽 줄기세포를 상아모세포-유사 세포로 프로그래밍할 수 있음을 나타낸다.
4. CPNE7 에 의한 상아모세포 분화 조절 기전 규명
상기 결과에서 CPNE7은 상아모세포 MDPC-23세포에서 Dspp 유전자 발현을 조절한다는 것을 알 수 있다. 그러나 코핀 패밀리 멤버의 구조에는 DNA-결합 모티브는 없다(Creutz CE, et al. (1998) The Journal of biological chemistry 273(3):1393-1402 ; Tomsig JL, Sohma H, & Creutz CE (2004) The Biochemical journal 378(Pt 3):1089-1094). 따라서, 코핀 패밀리 단백질이 두 개의 뚜렷한 도메인, 즉 포스포리피드-결합 도메인 및 단백질 상호작용 도메인을 함유하고 있기 때문에, CPNE7-매개 Dspp 발현의 다른 잠재적 효능자에 대하여 더 연구하였다. 뉴클레오린은, 세포 증식, 배형성, 및 세포 사멸을 포함하는 많은 세포 활성에 관여하는 다기능 단백질이다. 뉴클레오린은 치아 발달에 중요한 역할을 하며 CPNE7과 상호작용한다.
CPNE7과 뉴클레오린 사이의 상호작용에 대한 증거를 더 알아보기 위하여, 본 발명자는 MDPC-23 세포의 면역세포화학 및 동시-면역침강(co-IP) 분석을 수행하였다. 뚜렷하게, 내인성 및 외인성 CPNE7 단백질 둘다 상아모세포의 핵에서 뉴클레오린 단백질과 강한 공동-위치화를 나타내었으며(도 9A) 뉴클레오린과 상호작용하였다(도 9B). 다음으로, 본 발명자는 CPNE7-뉴클레오린 복합체가 Dspp 프로모터와 특이하게 결합하는지 여부를 연구하였다. DSPP 프로모터에 대한 특성화(well-characterized) 핵 인자 I-C 항체를 사용하여 양성 대조군을 설계하였다. 크로마틴 면역침강(ChIP) 어세이는 뉴클레오린이 Dspp 프로모터에 결합한 것을 보여주었으며, 반면 음성 대조군(예비-면역 혈청) 또는 뉴클레오린 siRNA는 Dspp 프로모터 분획을 침전시키지 않았다(도 9C, 가운데). 또한 CPNE7은 Dspp 프로모터에 결합하여 남아있었다(도 9C, 아래쪽). 뉴클레오린은 Dspp 프로모터의 AP-1 부위와 상호작용하기에 충분하다는 것을 확인하기 위하여, 본 발명자는 비오틴-라벨된 AP-1부위를 가진 DNA 친화성 단백질-결합 어세이(DAPA)를 사용하였다. 뉴클레오린은 야생형 AP-1 부위와 관련이 있었으나, 돌연변이 서열과는 관련이 없었다(도 13).
최종적으로, CPNE7-매개 Dspp 전사에 대한 뉴클레오린의 영향을 더 조사하기 위하여, 본 발명자는 MDPC-23 세포를 뉴클레오린 siRNA 컨스트럭트로 MDPC-23 세포를 전달이입하여 Dspp-반응성 리포터를 사용하여 루시퍼라아제 리포터 어세이를 수행하였다. 상기 세포에서 CPNE7 레벨의 변화 없이 뉴클레오린 siRNA에 의해 뉴클레오린 레벨이 감소되었다(도 9D, 아래쪽). CPNE7은 Dspp 프로모터 활성을 자극시켰으며 이 상호작용은 뉴클레오린의 녹다운과 함께 없어졌다(도 9D, 위쪽). 상기 데이터를 통해, 뉴클레오린이 CPNE7-의존성 Dspp 전사에 결정적이라는 것을 알 수 있다. 종합해보면, 상기 결과를 통해, 공동 조절자로서 CPNE7은 뉴클레오린 단백질과 물리적으로 연관이 있으며, CPNE7-뉴클레오린 복합체는 Dspp 유전자 전사를 조절한다는 것을 알 수 있다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (11)

  1. CPNE7 단백질 또는 그 유전자를 포함하는 비치계 중간엽 줄기세포의 상아모세포로의 분화용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 비치계 중간엽 줄기세포는 골수중간엽줄기세포 또는 지방줄기세포를 포함하는 것인, 상아모세포로의 분화용 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 비치계 중간엽 줄기세포는 자가, 동종 또는 이종 유래인, 상아모세포로의 분화용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 CPNE7에 의한 상아모세포로의 분화는 뉴클레오린과 상호작용에 의한 Dspp 발현 조절에 의한 것인, 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 이용한 인비트로에서 비치계 중간엽 줄기세포의 상아모세포로의 분화방법.
  6. CPNE7 단백질 또는 그 유전자를 비치계 중간엽 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 인비트로에서 비치계 중간엽 줄기세포의 상아모세포로의 분화방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 비치계 중간엽 줄기세포는 자가, 동종 또는 이종 유래인, 인비트로에서 비치계 중간엽 줄기세포의 상아모세포로의 분화방법.
  8. CPNE7를 과발현하는 중간엽줄기세포, 상기 중간엽줄기세포로부터 유래된 상아모세포로 분화될 수 있는 전구세포 또는 상기 중간엽줄기세포로부터 분화된 상아모세포를 유효성분으로 포함하는, 상아질 또는 치수조직 재생용 세포 치료제.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 세포 치료제는 상아질 지각과민증, 치수충혈, 치수염, 치수변성, 치수의 괴사 및 괴저 치료용인, 상아질 또는 치수조직 재생용 세포 치료제.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 세포 치료제는 노출된 치수부위나, 병변치수가 제거된 빈 치수강에 투여되는 것인, 상아질 또는 치수조직 재생용 세포 치료제.
  11. CPNE7 단백질 또는 그 유전자를 포함하는 비치계 중간엽줄기세포의 분화촉진에 의한 상아질 또는 치수조직 재생용 조성물.
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