KR20150128334A - 생 클로렐라로부터 퍼퓨린 18의 제조방법 - Google Patents

생 클로렐라로부터 퍼퓨린 18의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광역학 치료(PDT)에 유용한 광민감제(PS)인 퍼퓨린 18의 제조방법에 관한 것으로, 파쇄되지 않은 인택트 클로렐라 세포 자체를 이용하여 클로로필 α를 추출하고 이로부터 메틸 페오포바이드 또는 에틸 페오포바이드, 퍼퓨린 18 전구체 물질을 얻고, 최종적으로 퍼퓨린 18을 제조하는 방법으로, 본 발명의 방법에 따르면 비교적 간단한 공정에 의해 높은 수율로 퍼퓨린 18을 제조할 수 있으며, 특히 퍼퓨린 18의 대량생산에 적합하다.

Description

생 클로렐라로부터 퍼퓨린 18의 제조방법{METHOD OF PREPARING PURPURIN 18 FROM LIVE CHLORELLA}
본 발명은 퍼퓨린 18의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 파쇄되지 않은 인택트 클로렐라 세포 자체를 이용하여 클로로필 α를 추출하고, 이로부터 메틸 페오포바이드 또는 에틸 페오포바이드를 거쳐 최종적으로 퍼퓨린 18을 제조하는 방법에 관련된다.
광역학 치료(photodynamic therapy; PDT)는 암 치료를 위한 방법으로, 폐, 방광, 식도, 위, 대장암과 같은 다양한 암의 치료에 사용되어왔다. PDT에서는 빛에 의한 활성을 가짐으로써 화학반응을 통해 암세포에 대해서만 독성을 나타내는 광민감제(photosensitizer, PS)로 알려진 약물을 사용한다. PDT에 대한 이상적인 PS는 암세포나 그 주위에 자리할 수 있어야 하며, 정상세포에는 무독성을 가져야 한다. 빛에 의한 활성은 600 ㎚ 이상의 긴 파장에서 일어나야 하는데, 이때 피부에 대한 빛의 침투가 최적화된다. 또한 이상적인 PS는 화학반응으로 암 세포를 선택적으로 소멸시키는 독성 물질을 만드는 반면, 정상세포는 그대로 보존시켜야 한다.
퍼퓨린 18(purpurin 18)은 광역학 치료(PDT)에 유용한 광민감제(PS)로서 포르피린 구조의 이중결합 2개가 산화된 17,18-디하이드로포르피린(클로린)의 공명 구조를 갖는다. 퍼퓨린 18은 파쇄하지 않은 클로렐라를 출발 물질로 이용하여 합성되는데, 파쇄하지 않은 클로렐라로부터 높은 함량과 높은 순도의 클로로필 α를 추출할 수 있다.
PS, 즉 광역학 치료를 위한 LCP 감광제(리실-클로린 p 6 의 트리소듐 염)를 제조하는 공지의 방법은, 먼저 클로로필 α를 추출하기 위하여 바이오매스 (biomass)를 아세톤으로 2-3 차례 처리하고 여과 또는 원심분리 후 추출물을 증발시키고, 클로로필 분자로부터 마그네슘 이온을 제거하고 프탈릴 에스테르기를 가수분해하기 위해 산으로 처리하고, 동시에 에스테르화하기 위하여 메탄올을 첨가하고, 반응 매스(reaction mass)를 물로 처리하고, 페오포비드 α 유도체를 클로로메틸렌으로 추출한 다음 추출물을 중화하여 물로 세정 후 증발시키고, 알루미나 상에서 크로마토그래피하고, 메틸 페오포비드 α를 클로로메틸렌과 메탄올의 혼합물로부터 결정화하고, 얻어진 페오포비드 α 유도체를 산소가 존재하는 피리딘-디에틸에테르-n-프로판올 내에서 강한 무기 염기와 반응시키고, 반응 매스를 물로 처리한 후 수층을 pH 4가 될 때까지 산성화하고, '불안정한 클로린(unstable chlorin)'을 클로로메틸렌으로 추출한 후 추출물을 증발시키고, '불안정한 클로린'을 다시 테트라하이드로퓨란에 용해시킨 후 용액을 증발시키고, 이러한 절차를 700 ㎚에서의 흡수(absorption)의 증가가 멈출 때까지 계속하여 퍼퓨린(purpurine) 18을 얻는 단계를 포함한다(미국특허 제5,330,741호). 얻어진 퍼퓨린 18을 테트라하이드로퓨란에 용해시키고 디아조메탄으로 에스테르화하여 퍼퓨린 18 메틸 에스테르를 얻고, 이를 피리딘 존재 하에서 클로로메틸렌 중의 리신 수용액과 혼합한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하고 용매를 고 진공 상태에서 제거한 다음, 얻어진 조생성물(crude product)을 역상 고성능 액체 크로마토그리피(HPLC)로 정제하고, 용매를 동결건조(lyophilisation)로 제거한다. PS를 PDT용 주사액으로 얻기 위해서는 인산염 완충 용액에 용해시키고, 0.1N NaOH 용액을 첨가한 후 0.1N HCl를 사용하여 pH를 생리적 값인 pH 7.35로 조절하고, 용액을 미세 기공 필터(microporous filter)를 통과시켜 여과한다(미국특허 제5,330,741호).
클로로필 페이스트로부터 추출한 메틸 페오포바이드 α를 KOH를 포함하는 n-프로판올에서 공기 산화시키는 것에 의해 퍼퓨린 18 메틸 에스테르로 전환시키는 방법은 문헌(Bing Cun Cui, et al., Bull. Korean Chem. Soc. 2010, Vol. 31, No. 11, pp3313-3317)에 개시되어 있다.
또한, 스피루리나로부터 퍼퓨린 18을 고수율로 제조하는 방법(Nicolas Drogat, et al., Dyes and Pigments 88 2011, 125-127)에 따르면, 스피루리나(Spirulina maxima) 건조 분말의 아세톤 추출물에 NaOH를 가하고 교반하면서 산소 가스로 처리하고(air bubbling), 최종적으로 농 HCl로 산성화시켜 얻은 추출물로부터 카로티노이드와 잔트로필을 제거한 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 퍼퓨린 18을 제조하고 있다. 이 방법에 따르면, 스피루리나 5 g으로부터 31.5 ㎎의 퍼퓨린 18을 얻어, 최초 스피루리나 중량 대비 약 0.63%의 수율을 나타낸다.
그러나, 이러한 종래의 방법에 따르면 퍼퓨린 18의 수율이 낮을 뿐 아니라 반응이 어렵다는 문제가 있다. 따라서, 간단한 공정으로 대량생산에 적합한 방식으로 퍼퓨린 18을 제조할 수 있는 방법에 대한 요구가 있다.
본 발명자들은 퍼퓨린 18을 높은 수율로 제조하면서도, 비교적 간단한 공정에 따라 대량생산에 적합한 방식으로 퍼퓨린 18을 제조할 수 있는 방법을 연구하였으며, 그 결과 녹조류에 속하는 클로렐라로부터 효율적인 제조 프로토콜을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 광역학 치료(PDT)에 유용한 광민감제(PS)로서 700 ㎚ 이상의 긴 파장에서 빛을 흡수할 수 있는 광민감제인 퍼퓨린 18(purpurin 18)을 대량생산에 적합한 간단한 공정에 따라 고수율로 제조할 수 있는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 퍼퓨린 18의 제조방법은,
클로렐라에 저급 알코올을 가하여 클로로필 α를 추출하고;
클로로필 α를 포함하는 알코올 추출액을 냉동침전시키고;
여과한 알코올 추출액에 황산을 처리하여 알킬 페오포바이드 α를 얻고;
알킬 페오포바이드 α에 아세톤 및 염기를 가하고 반응시켜 퍼퓨린 18 전구체 물질을 얻고;
퍼퓨린 18 전구체 물질에 아세톤, 산 및 물을 가하고 반응시킨 후, 물을 가하여 침전을 형성시켜 퍼퓨린 18을 수득하는 단계를 포함한다.
여기에서, 저급 알코올은 탄소수 1 내지 4의 알코올을 의미하며, 특히 메탄올 또는 에탄올이 바람직하다.
그리고, 염기는 NaOH 또는 KOH일 수 있으며, 산은 트리플루오로아세트산, 염산 또는 황산이 바람직하다.
또한, 냉동침전은 알코올 추출액을 0 ℃ 내지 -24 ℃, 바람직하게는 -20 ℃에서 6 내지 24 시간, 예를 들어 12 시간 동안 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명은 파쇄되지 않은 인택트 클로렐라 세포 자체를 이용하여 클로로필 α를 추출하고, 이로부터 메틸 페오포바이드 또는 에틸 페오포바이드, 이어서 퍼퓨린 18 전구체 물질을 제조한 다음, 최종적으로 퍼퓨린 18을 제조하는 단계로 이루어진다.
이하에서는 각 단계를 구체적으로 설명한다.
(1) 클로렐라로부터 클로로필 α 수득 단계
해수 클로렐라에서 염분을 제거하기 위해 먼저 증류수로 세척하고, 5000 rpm에서 원심분리하여 클로렐라를 침전시킨다. 침전물을 증류수로 재현탁하고 원심분리를 다시 실시하는 증류수 세척 과정을 수 회 실시한 다음, 침전물을 소량 취하여 HPLC로 클로로필 α 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인한다.
해수가 제거된 클로렐라(파쇄되지 않은 클로렐라 세포 자체)에 메탄올 또는 에탄올을 첨가하여 24시간 동안 교반하고, 교반이 끝난 후 여과하여 클로로필 α 추출액을 얻는다. 추출액을 0 ℃ 내지 -24 ℃, 바람직하게는 -20 ℃에서 6 내지 24 시간, 바람직하게는 12 시간 동안 냉동침전으로 불순물을 제거하고, 이후 여과하여 불순물이 제거된 클로로필 α 추출액을 얻는다.
(2) 클로로필 α로부터 알킬 페오포바이드의 제조
클로로필 α를 포함하는 메탄올 또는 에탄올 추출액에 황산을 가하고 12 시간 동안 교반하여 클로로필 α로부터 마그네슘 이온 및 파이톨 그룹을 제거함으로써 메틸 페오포바이드 또는 에틸 페오포바이드를 수득한다.
메틸 페오포바이드 α 용액은 분별갈때기에서 5% 암모니아수(5% NH4OH)를 포함하는 디클로로메탄으로 추출한 후 디클로로메탄층을 분리 농축하여 검은색의 메틸 페오포바이드 α를 얻는다.
에틸 페오포바이드 α 용액은 DW(증류수)를 첨가하여 -24 ℃ 냉동실에 6 시간 보관하여 침전을 형성시킨 후 여과하여 에틸 페오포바이드 α 침전물을 수득한다.
(3) 알킬 페오포바이드로부터 퍼퓨린 18 전구체 물질의 생성
메틸 페오포바이드 α 또는 에틸 페오포바이드 α를 아세톤으로 녹인 다음 여과하고, 여기에 NaOH 또는 KOH와 같은 염기를 첨가하여 여액의 pH를 13-14로 조정하고, 6시간 동안 교반시켜 메틸 페오포바이드 α 또는 에틸 페오포바이드 α로부터 퍼퓨린 18 전구체 물질을 형성시킨다.
(4) 퍼퓨린 18 전구체 물질로부터 퍼퓨린 18의 생성
퍼퓨린 18 전구체 물질 침전물에 TFA(트리플루오로아세트산), 염산 및 황산과 같은 산을 첨가한 아세톤에 가하고 교반하여 완전히 용해시킨 다음, 여기에 DW(증류수)를 첨가하여 교반시킨다. 교반이 끝난 후 DW(증류수)를 첨가하여 침전을 유도하고 여과하여 퍼퓨린 18을 수득한다.
도 1은 클로렐라로부터 추출한 클로로필 α로부터 메틸 페오포바이드를 거쳐 퍼퓨린 18 전구체 물질을 제조한 다음, 최종적으로 퍼퓨린 18을 제조하는 단계를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 클로렐라로부터 추출한 클로로필 α로부터 에틸 페오포바이드를 거쳐 퍼퓨린 18 전구체 물질을 제조한 다음, 최종적으로 퍼퓨린 18을 제조하는 단계를 모식적으로 나타낸 것이다.
이상과 같은 본 발명의 방법에 따르면, 채택하는 생클로렐라로부터 메탄올 및 에탄올을 이용하여 추출한 액을 냉동침전 과정에 의해 불순물을 제거함으로써 클로로필의 순도를 높일 수 있으며, 이로부터 높은 순도의 메틸 페오포바이드 α(methyl pheophorbide α), 에틸 페오포바이드 α(ethyl pheophorbide α), 그리고 퍼퓨린 18 전구체 물질을 거쳐 퍼퓨린 18을 높은 순도도 얻을 수 있다.
또한, 종래의 방법에서는 퍼퓨린 18 제조시 O2 가스를 사용하여 수율 및 경제적인 면에서 바람직하지 않았다. 본 발명의 방법에서는 물과 산을 이용하여 퍼퓨린 18을 수득하므로 비용을 절감할 수 있으며 반응 시간도 단축된다는 이점이 있다.
본 발명의 방법에 따르면 비교적 간단한 공정에 의해 높은 수율로 퍼퓨린 18을 제조할 수 있으며, 특히 퍼퓨린 18의 대량생산에 적합하다.
도 1은 클로렐라로부터 추출한 클로로필 α로부터 메틸 페오포바이드를 거쳐 퍼퓨린 18 전구체 물질을 제조한 다음, 최종적으로 퍼퓨린 18을 제조하는 단계를 나타낸 모식도이다.
도 2는 클로렐라로부터 추출한 클로로필 α로부터 에틸 페오포바이드를 거쳐 퍼퓨린 18 전구체 물질을 제조한 다음, 최종적으로 퍼퓨린 18을 제조하는 단계를 나타낸 모식도이다.
도 3a 및 3b은 해수가 제거된 클로렐라 및 클로로필 α 추출액을 HPLC로 분석한 결과를 보여주는 데이터이다.
도 4는 클로로필 α 추출액으로부터 얻은 메틸 페오포바이드 α를 HPLC로 분석한 결과를 보여주는 데이터이다.
도 5는 메틸 페오포바이드 α로부터 얻은 퍼퓨린 18 전구체 물질을 HPLC로 분석한 결과를 보여주는 데이터이다.
도 6은 메틸 페오포바이드 α를 거쳐 퍼퓨린 18 전구체 물질로부터 얻은 퍼퓨린 18을 HPLC로 분석한 결과를 보여주는 데이터이다.
도 7은 퍼퓨린 18의 NMR 데이터이다.
도 8은 클로로필 α 추출액으로부터 얻은 에틸 페오포바이드 α를 HPLC로 분석한 결과를 보여주는 데이터이다.
도 9는 에틸 페오포바이드 α로부터 얻은 퍼퓨린 18 전구체 물질을 HPLC로 분석한 결과를 보여주는 데이터이다.
도 10은 에틸 페오포바이드 α를 거쳐 퍼퓨린 18 전구체 물질로부터 얻은 퍼퓨린 18을 HPLC로 분석한 결과를 보여주는 데이터이다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 메틸 페오포바이드 α를 통한 퍼퓨린 18의 제조
단계 1: 클로렐라로부터 클로로필 α의 수득
해수 클로렐라(Chlorella ellipsoidea, (주)클로랜드에서 구입)에서 염분을 제거하기 위해 먼저 증류수로 세척하고, 5000 rpm에서 원심분리하여 클로렐라를 침전시켰다. 이어서, 침전물을 증류수로 재현탁하고 원심분리를 다시 실시하였다. 증류수에 의한 세척 과정을 총 3회 실시한 다음, 침전물을 소량 취하여 HPLC로 클로로필 α 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였다. HPLC는 Eclips plus C18(5 ㎛, 4.6×150 ㎜) 컬럼이 장착된 애질런트 HPLC 1260 시스템을 이용하여 실시하였고, 주입 용적은 10 ㎕, 유속은 1 mL/분으로 하였다.
해수가 제거된 클로렐라(파쇄 되지 않은 클로렐라 세포 자체) 100 g에 메탄올 500 mL을 첨가하여 24시간 동안 교반하고, 교반이 끝난 후 여과하여 클로로필 α 추출액을 얻었다. 추출액을 -20 ℃에서 12 시간 동안 냉동침전으로 불순물을 제거하고, 12 시간이 지난 후 여과하여 불순물이 제거된 클로로필 α 추출액을 얻었다.
도 3a 및 3b은 해수가 제거된 클로렐라 및 클로로필 α 추출액을 HPLC로 분석한 결과를 보여주는 데이터이다. 도 3a는 해수가 제거된 클로렐라의 HPLC 분석 차트로서 정제되지 않은 클로로필 α는 7.233분에 측정되었고 순도는 70.25%인 것을 보여준다. 도 3b는 클로로필 α 추출액의 HPLC 분석 차트로서 냉동침전으로 불순물이 제거된 클로로필 α가 7.640분에 측정되었고 순도는 83.41%인 것으로 나타났다.
단계 2: 클로로필 α로부터 메틸 페오포바이드의 제조
단계 1에서 얻은 클로로필 α를 포함하는 메탄올 추출액 500 mL에 황산 25 mL를 처리하고 12 시간 동안 교반하여 클로로필 α로부터 마그네슘 이온 및 파이톨 그룹을 제거함으로써 메틸 페오포바이드(pheophorbide α)를 수득하였다. 이어서, 검은색의 메틸 페오포바이드 α 용액을 분별갈때기(separatory funnel)의 5% 암모니아수(5% NH4OH) 및 디클로로메탄(dichloromethane)에 넣고, 메틸 페오포바이드 α를 디클로로메탄층으로 보내기 위해 10 회 흔들어주었다. 디클로로메탄층을 분리하고 농축기(evaporator)를 사용하여 디클로로메탄을 제거한 후 검은색의 메틸 페오포바이드 α(1632 ㎎)를 얻었다.
도 4는 클로로필 α 추출액으로부터 얻은 메틸 페오포바이드 α를 HPLC로 분석한 결과를 보여주는 데이터로, 메틸 페오포바이드 α는 12.097분에 측정되었고 순도는 91.98%인 것으로 나타났다.
단계 3: 메틸 페오포바이드로부터 퍼퓨린 18 전구체 물질의 생성
단계 2의 메틸 페오포바이드 α를 100 mL 아세톤으로 녹인 다음 여과하였다. 이어서, 여기에 5 N NaOH 1 mL를 첨가하여 메틸 페오포바이드 α 용액을 포함하는 여과액의 pH를 13-14로 조정하고, 6 시간 동안 교반시켜 메틸 페오포바이드 α로부터 퍼퓨린 18 전구체 물질을 형성시켰다. 다음에, 여과하여 퍼퓨린 18 전구체 물질(1384 ㎎, 수율 84.3%)을 수득하였다.
도 5는 메틸 페오포바이드 α로부터 얻은 퍼퓨린 18 전구체 물질을 HPLC로 분석한 결과를 보여주는 데이터로, 퍼퓨린 18 전구체 물질은 9.117분에 측정되었고 순도는 93.35%인 것으로 나타났다.
단계 4: 퍼퓨린 18 전구체 물질로부터 퍼퓨린 18의 생성
단계 3의 퍼퓨린 18 전구체 물질 침전물을 5% TFA를 첨가한 아세톤 100 mL에 천천히 첨가한 후 30 분간 교반하여 완전히 용해시켰다. 이어서, 여기에 DW(증류수) 10 mL를 첨가하여 12 시간 동안 교반시켰다. 교반이 끝난 후 DW(증류수) 200 mL를 첨가하여 침전을 유도하고, 여과하여 퍼퓨린 18(875 ㎎, 수율 68.3%)을 수득하였다.
도 6은 메틸 페오포바이드 α를 거쳐 퍼퓨린 18 전구체 물질로부터 얻은 퍼퓨린 18을 HPLC로 분석한 결과를 보여주는 데이터로, 퍼퓨린 18은 12.997분에 측정되었고 순도는 97.23%인 것으로 나타났다. 도 7은 퍼퓨린 18의 NMR 데이터이다.
H NMR (CDCl3): δppm = 9.31, 9.22, 8.54 s (1H, 5-H, 10-H, 20-H); 7.84 dd (J=17.0, 11.4 Hz, 1H, 3-CH); 6.28 dd (J=17.0, 1.0 Hz, 1H, trans-3-CH2); 6.17 dd (J=11.4, 1.0 Hz, 1H, cis-3-CH2); 5.13 m (1H, 17-H); 4.39 q (J=6.0 Hz, 1H, 18-H); 3.58 s (3H, 12-CH3); 3.51 q (J=6.6 Hz, 2H, 8-CH2); 3.31 et 3.07 s (3H, 2-CH3 et 7-CH3); 2.75, 2.47, 2.41, 1.92 m (1H, 2 x 17-H and 2 x 17-H); 1.73 d (J = 6.0 Hz, 3H, 18-CH3); 1.60 t (J=6.8 Hz, 3H, 8-CH3)
실시예 2: 에틸 페오포바이드 α를 통한 퍼퓨린 18의 제조
단계 1: 클로렐라로부터 클로로필 α의 수득
해수 클로렐라(Chlorella ellipsoidea, (주)클로랜드에서 구입)에서 염분을 제거하기 위해 먼저 증류수로 세척하고, 5000 rpm에서 원심분리하여 클로렐라를 침전시켰다. 이어서, 침전물을 증류수로 재현탁하고 원심분리를 다시 실시하였다. 증류수에 의한 세척 과정을 총 3회 실시한 다음, 침전물을 소량 취하여 HPLC로 클로로필 α 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였다. HPLC는 Eclips plus C18(5 ㎛, 4.6×150 ㎜) 컬럼이 장착된 애질런트 HPLC 1260 시스템을 이용하여 실시하였고, 주입 용적은 10 ㎕, 유속은 1 mL/분으로 하였다.
해수가 제거된 클로렐라(파쇄 되지 않은 클로렐라 세포 자체) 100 g에 에탄올 500 mL을 첨가하여 24 시간 동안 교반하고, 교반이 끝난 후 여과하여 클로로필 α 추출액을 얻었다. 추출액을 -20 ℃에서 12 시간 동안 냉동침전으로 불순물을 제거하고, 12 시간이 지난 후 여과하여 불순물이 제거된 클로로필 α 추출액을 얻었다.
단계 2: 클로로필 α로부터 에틸 페오포바이드의 제조
단계 1에서 얻은 클로로필 α를 포함하는 에탄올 추출물 500 mL에 황산 25 mL를 처리하고 12 시간 동안 교반하여 클로로필 α로부터 마그네슘 이온 및 파이톨 그룹을 제거함으로써 에틸 페오포바이드(pheophorbide α)를 수득하였다. 이어서, DW(증류수) 100 mL를 첨가하고 검은색의 에틸 페오포바이드 α 용액을 -24 ℃ 냉동실에 6 시간 보관하여 침전을 형성시키고, 여과하여 에틸 페오포바이드 α(1750 ㎎)를 얻었다.
도 8은 클로로필 α 추출액으로부터 얻은 에틸 페오포바이드 α를 HPLC로 분석한 결과를 보여주는 데이터로, 에틸 페오포바이드 α는 12.573분에 측정되었고 순도는 92.64%인 것으로 나타났다.
단계 3: 에틸 페오포바이드로부터 퍼퓨린 18 전구체 물질의 생성
단계 2의 에틸 페오포바이드 α를 100 mL 아세톤으로 녹인 다음 여과하였다. 이어서, 여기에 5 N NaOH 1 mL를 첨가하여 에틸 페오포바이드 α 용액를 포함하는 여과액의 pH를 13-14로 조정하고, 12 시간 동안 교반시켜 에틸 페오포바이드 α로부터 퍼퓨린 18 전구체 물질을 형성시켰다. 다음에, 여과하여 퍼퓨린 18 전구체 물질(1470 ㎎, 수율 85.4%)을 수득하였다.
도 9는 에틸 페오포바이드 α로부터 얻은 퍼퓨린 18 전구체 물질을 HPLC로 분석한 결과를 보여주는 데이터로, 퍼퓨린 18 전구체 물질은 9.083분에 측정되었고 순도는 93.12%인 것으로 나타났다.
단계 4: 퍼퓨린 18 전구체 물질로부터 퍼퓨린 18의 생성
단계 3의 퍼퓨린 18 전구체 물질 침전물을 5% TFA를 첨가한 아세톤 100 mL에 천천히 첨가한 후 30 분간 교반하여 완전히 용해시켰다. 이어서, 여기에 DW(증류수) 10 mL를 첨가하여 12 시간 동안 교반시켰다. 교반이 끝난 후 DW(증류수) 200 mL를 첨가하여 침전을 유도하고, 여과하여 퍼퓨린 18(943 ㎎, 수율 69.3%)을 수득하였다.
도 10은 에틸 페오포바이드 α를 거쳐 퍼퓨린 18 전구체 물질로부터 얻은 퍼퓨린 18을 HPLC로 분석한 결과를 보여주는 데이터로, 퍼퓨린 18은 12.990분에 측정되었고 순도는 98.29%인 것으로 나타났다.
앞서 언급한 스피루리나로부터 퍼퓨린 18을 제조하는 방법에 따르면, 스피루리나 5 g으로부터 31.5 ㎎의 퍼퓨린 18을 얻어, 최초 스피루리나 중량 대비 약 0.63%의 수율을 나타내고 있다. 반면, 본 발명의 방법에서는 클로렐라 100 g 당 875 ㎎ 및 943 ㎎의 퍼퓨린 18을 수득하여, 클로렐라 중량 대비 0.875% 및 0.943%의 수율을 나타내고 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법에 따르면 생클로렐라로부터 높은 함량 비율의 클로로필 α를 얻을 수 있으며, 이어서 퍼퓨린 18(purpurin 18) 역시 높은 수율로 제조할 수 있다.

Claims (6)

  1. 클로렐라에 저급 알코올을 가하여 클로로필 α를 추출하고;
    클로로필 α를 포함하는 알코올 추출액을 냉동침전시키고;
    여과한 알코올 추출액에 황산을 처리하여 알킬 페오포바이드 α를 얻고;
    알킬 페오포바이드 α에 아세톤 및 염기를 가하고 반응시켜 퍼퓨린 18 전구체 물질을 얻고;
    퍼퓨린 18 전구체 물질에 아세톤, 산 및 물을 가하고 반응시킨 후, 물을 가하여 침전을 형성시켜 퍼퓨린 18을 수득하는 단계를 포함하는, 퍼퓨린 18의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 저급 알코올이 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 염기가 NaOH 또는 KOH인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 산이 트리플루오로아세트산, 염산 또는 황산인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 알코올 추출액을 0 ℃ 내지 -24 ℃에서 6 내지 24 시간 냉동침전시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 알코올 추출액을 -20 ℃에서 12 시간 동안 냉동침전시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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