KR20150121701A - 재조합 단백질 생산 증가를 위한 제제 및 방법 - Google Patents

재조합 단백질 생산 증가를 위한 제제 및 방법 Download PDF

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Abstract

재조합 단백질의 생산을 증가시키기 위한 제제 및 방법, 및 다른 측면을 개시한다. 본 제제 및 방법은 재조합 단백질을 발현하는 세포를 배양하기 위한 세포 배양 배지 제제 중 만노스 농도 또는 칼슘 농도 또는 그 둘 모두를 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 약 3.5 g/L 이상의 만노스 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 범위의 칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 포유동물 세포 배양 배지 제제를 제공한다. 다수의 다른 측면 및/또는 실시양태를 제공한다.

Description

재조합 단백질 생산 증가를 위한 제제 및 방법 {FORMULATIONS AND METHODS FOR INCREASED RECOMBINANT PROTEIN PRODUCTION}
관련 출원
본 출원은 2013년 2월 26일 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 61/769,402 (발명의 명칭: "FORMULATIONS AND METHODS FOR INCREASED RECOMBINANT PROTEIN PRODUCTION") (대리인 문서 번호 BHC125022US (BH-023/L))를 우선권 주장하며, 이 가출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
세포 배양 시스템은 세포 성장을 촉진시키는 영양소를 포함하는 세포 배양 배지 제제 중에서 재조합 단백질을 생산하는 데 사용될 수 있다. 세포 배양 배지 제제의 예로는 DMEM/F12, RPMI (예컨대, RPMI 1640), MEM, DMEM, F-12, 마우스 ES 세포 기초 배지, L-15, IMDM, 맥코이(McCoy's) 5A 배지, 및 베로플러스(VeroPlus) SFM을 포함한다.
상업적 생산을 비롯한 재조합 단백질 생산에서, 생성물의 품질을 보존하면서 재조합 단백질 생산 수준을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
따라서, 생성물의 품질은 감소시키지 않으면서 재조합 단백질 생산을 증가시키는 세포 배양 배지 제제 및 방법이 요구되고 있다.
일부 실시양태에서, 포유동물 세포 배양 배지 제제가 제공된다. 제제는 약 3.5 g/L 이상의 만노스 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 범위의 칼슘 중 적어도 하나를 가진다.
하나 이상의 실시양태에서, 세포 배양물 중에서 재조합 단백질을 생산하는 방법이 제공된다. 본 방법은 약 3.5 g/L 이상의 만노스 및 재조합 단백질의 안정화제, 예컨대 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 범위의 칼슘 중 적어도 하나를 가지는 세포 배양 배지 중에서 재조합 단백질 발현 세포를 배양하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법으로 재조합 단백질의 생산은 증가하게 된다. 특정 실시양태에서, 본 방법으로 생산되는 재조합 단백질의 품질은 손상되지 않으면서 재조합 단백질의 생산은 증가하게 된다.
상기 및 다른 실시양태에 따라 다수의 다른 측면들이 제공된다. 본 교시의 상기 및 다른 특징이 본원에 기재된다.
통상의 기술자는 하기 기재된 도면이 단지 예시적인 목적을 위한 것임을 이해할 것이다. 본 도면은 어느 방식으로든 본 교시의 범주를 제한하고자 하지 않는다.
도 1은 다양한 실시양태에 따라 세포 배양 시스템 중에서 재조합 단백질 생산을 증가시키는 방법을 예시한 흐름도이다.
도 2는 다양한 실시양태에 따라 1 L 관류 생물반응기 세포 배양물 중에서 만노스 농도를 3 그램/리터 ("g/L")에서 5 g/L로 증가시켰을 때, 재조합 인간 인자 VIII ("rhFVIII") 역가가 25%만큼 증가하였다는 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 다양한 실시양태에 따라 15 L 관류 생물반응기 세포 배양물 중에서 만노스 농도를 3 g/L에서 5 g/L로 증가시켰을 때, rhFVIII 역가가 ~37% 증가하였다는 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 다양한 실시양태에 따라 롤러 튜브 (반복 배치) 실험에서 5 밀리몰 ("mM") 염화칼슘의 시험 조건하에서 rhFVIII 역가에 미치는 영향이 가장 컸다는 것 (~19% 증가)을 입증하는 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 다양한 실시양태에 따라 1 L 관류 생물반응기 세포 배양물 중에서 칼슘 농도를 1 mM에서 5 mM로 증가시켰을 때, rhFVIII 역가가 ~27%만큼 증가하였다는 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 다양한 실시양태에 따라 15 L 관류 생물반응기 세포 배양물 중에서 칼슘 농도를 1 mM에서 5 mM로 증가시켰을 때, rhFVIII 역가가 ~29%만큼 증가하였다는 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 7a-b는 다양한 실시양태에 따라 (1 mM 염화칼슘 및 3 g/L의 만노스를 함유하는) 대조군 배지를 상기 두 성분 모두가 강화된 -- 5 mM 염화칼슘 및 5 g/L의 만노스를 함유하는 -- 배지로 바꾸었을 때, 그 결과로 rhFVIII 역가는 29%만큼 증가하였고, 그 효과는 가역적이라는 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 8a-b는 다양한 실시양태에 따른 15 L 관류 생물반응기 캠페인의 디자인 (a) 및 생성된 효능 데이터 (b)를 보여주는 것이다.
도 9는 다양한 실시양태에 따라, 만노스-함유 배지 및 만노스 무함유 배지를 사용하여 효능의 평균값을 보여주는, 세포 배양 제제의 당 함량을 조작하였을 때의 rhFVIII의 생산 수준에 미치는 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
언급한 바와 같이, 단백질 생성물 품질에는 악영향을 미치지 않으면서, 세포 배양 배지 제제 중에서 배양되는 단백질 발현 세포의 생산 수준을 증가시키는 것이 도전 과제이다. 본원에 기재된 하나 이상의 실시양태에 따라, 추가의 영양소, 예컨대 만노스 및/또는 안정화제, 예컨대 칼슘을 세포 배양 배지에 제공함으로써 개선된 세포 배양 배지 제제를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개선된 세포 배양 배지 제제는 생성물 품질에 대하여 검출가능한 영향을 거의 미치지 않거나 전혀 미치지 않으면서, 세포 배양 배지 제제를 사용하여 배양된 단백질 발현 세포의 생산 수준을 증가시킬 수 있다. 상기 세포 배양 배지 제제를 제조하고/거나 사용하는 방법 또한 제공한다.
예시적인 세포 배양 배지 제제
상기 언급한 바와 같이, 다양한 실시양태에서, 세포 배양 배지 제제 중 만노스의 농도, 및/또는 재조합 단백질의 안정화제, 예컨대 칼슘의 농도 또는 그 둘 모두를 증가시킴으로써 상기 제제 중에서의 재조합 단백질의 생산을 증가시킬 수 있다.
한 측면에서, 약 3.5 g/L 이상 (또는 특정 실시양태에서, 약 4 g/L, 약 5 g/L, 약 6 g/L, 또는 약 7 g/L 이상)의 만노스, 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 이상 범위 (또는 특정 실시양태에서, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 또는 약 9.5 mM 이상)의 칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 세포 배양 배지 제제 (예컨대, 세포 배양 배지 조성물)를 제공한다. 다른 세포 배양 배지 제제도 사용될 수 있다.
약 3.5 g/L 이상의 만노스, 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 범위의 칼슘 중 적어도 하나를 첨가하기 전 세포 배양 배지 제제는 임의의 세포 배양 배지 제제일 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 세포 배양 배지 제제는 적합한 비, 예컨대 1:1의 둘베코 변형 이글 배지 및 햄 F-12 영양소 혼합물 (DMEM/F12), 및 약 5 g/L의 만노스 및 약 5 mM의 칼슘 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
DMEM/F12 대신, 다른 세포 배양 배지 제제, 예컨대 RPMI (예컨대, RPMI 1640), MEM, DMEM, F-12, 마우스 ES 세포 기초 배지, L-15, IMDM, 맥코이 5A 배지, 및 베로플러스 SFM이 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 배양 배지 제제는 포유동물 세포 배양을 위한 것이다.
본원에서 제공하는 세포 배양 배지 제제의 예로는 제한 없이
(a) 약 3.5 g/L 이상의 만노스 및 약 1.5 mM 미만 또는 약 9.5 mM 초과의 칼슘;
(b) 약 3.5 g/L 미만의 만노스 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 범위의 칼슘;
(c) 약 4 g/L 내지 약 5 g/L 범위의 만노스 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 범위의 칼슘 중 적어도 하나;
(d) 약 5 g/L의 만노스 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 범위의 칼슘 중 적어도 하나;
(e) 약 4 g/L 내지 약 5 g/L 범위의 만노스 및 약 1.5 mM 미만 또는 약 9.5 mM 초과의 칼슘;
(f) 약 5 g/L의 만노스 및 약 1.5 mM 미만 또는 약 9.5 mM 초과의 칼슘;
(g) 약 3.5 g/L 이상의 만노스 및 약 2 mM 내지 약 5 mM 범위의 칼슘 중 적어도 하나;
(h) 약 3.5 g/L 이상의 만노스 및 약 5 mM의 칼슘 중 적어도 하나;
(i) 약 3.5 g/L 미만의 만노스 및 약 2 mM 내지 약 5 mM 범위의 칼슘;
(j) 약 3.5 g/L 미만의 만노스 및 약 5 mM의 칼슘; 및/또는
(k) 1:1 비의 DMEM/F12, 및 약 5 g/L의 만노스 및 약 5 mM의 칼슘 중 적어도 하나를 포함한다.
다른 제제가 사용될 수 있다.
세포 배양 배지 제제를 제조/사용하는 방법
이제 도 1-8을 참조로 하여 세포 배양물 중에서 재조합 단백질을 생산하는 방법을 하기에 기술할 것이다.
도 1은 본원에서 제공하는 특정 실시양태에 따라 세포 배양물 중에서 재조합 단백질을 생산하는 방법 (100)에 관한 흐름도를 도시한 것이다. 도 1을 참조하면, 방법 (100)은 재조합 단백질 발현 세포를 제공하는 블록 (101)으로 시작된다.
재조합 단백질 발현 세포의 예로는 예를 들어, 포유동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 박테리아 세포 등을 비롯한, 임의의 진핵 또는 원핵 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 포유동물 세포의 예로는 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 신장 및 B 세포의 하이브리드 (HBK) 세포, 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 및 NS0 세포를 포함한다.
재조합 단백질 발현 세포는 임의의 생물학적 단백질 생성물을 제조하는 임의의 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 하나 이상의 재조합 단백질 생성물을 발현하도록 조작된 재조합 세포; 및/또는 항체 분자를 발현하는 재조합 세포일 수 있다.
재조합 단백질 발현 세포의 생성물은 예컨대, 예를 들어 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX 및 인자 X를 비롯한, 응고 인자 (혈액 응고 경로에서의 단백질)와 같은 재조합 단백질 생성물을 비롯한 임의의 생성물일 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질 발현 세포는 인자 VIII을 발현하는 포유동물 세포일 수 있다.
인자 VIII은 rFVIII 유전자 구축물의 유전적 변이를 제조함으로써 그 결과로 예를 들어, B-도메인 결실 인자 VIII 및 돌연변이된 인자 VIII가 생성될 수 있는 것인, 인자 VIII의 변이체, 예컨대 유전자 변이체일 수 있다. 인자 VIII 변이체는 예를 들어, 발현 후 변형된 인자 VIII의 변이체, 예컨대 PEG화 FVIII 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 공유적으로 부착된 FVIII을 포함한다. 인자 VIII 변이체는 또한 공발현 결합 요소를 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 단백질 발현 세포의 재조합 단백질 생성물은 당단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 단백질은 분비된 것이다. 재조합 단백질을 발현하는 재조합 세포의 임의의 적합한 공급원 및/또는 그를 제조하기 위한 방법이 사용될 수 있다.
블록 (102)에서, 약 3.5 g/L 이상의 만노스 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 범위의 칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 세포 배양 배지 제제 (즉, 조성물) 중에서 재조합 단백질 발현 세포를 배양한다. 본원에서 사용되는 세포 배양 배지로는 조직 또는 세포 배양 유체, 조직 또는 세포 배양 배지 또는 배지들 등을 포함할 수 있다.
약 3.5 g/L 이상의 만노스 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 범위의 칼슘 중 적어도 하나를 첨가하기 전 세포 배양 배지 제제는 임의의 세포 배양 배지 제제일 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 세포 배양 배지 제제는 적합한 비, 예컨대 1:1의 둘베코 변형 이글 배지 및 햄 F-12 영양소 혼합물 (DMEM/F12), 및 약 5 g/L의 만노스 및 약 5 mM의 칼슘 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
DMEM/F12 대신, 다른 세포 배양 배지 제제, 예컨대 RPMI (예컨대, RPMI 1640), MEM, DMEM, F-12, 마우스 ES 세포 기초 배지, L-15, IMDM, 맥코이 5A 배지, 및 베로플러스 SFM이 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 배양 배지 제제는 포유동물 세포 배양을 위한 것이다.
다양한 실시양태에서, 세포 배양 배지 제제는 다른 보충제, 예컨대 철, 플루로닉(Pluronic) F-68, 또는 인슐린을 공급받은, 시그마-알드리치 파인 케미칼즈(Sigma-Aldrich Fine Chemicals: SAFC: 미국 캔자스주 르넥사) 또는 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies: 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)에 의해 제조된 상업적으로 이용가능한 DMEM/F12 제제에 기초한 배지 조성물일 수 있고, 본질적으로 다른 단백질을 함유하지 않을 수 있다. 다른 기초 배지 조성물이 사용될 수 있다.
착물화제 히스티딘 (his) 및/또는 이미노디아세트산 (IDA)이 사용될 수 있고/거나, 유기 완충제, 예컨대 MOPS (3-[N-모르폴리노]프로판술폰산), TES (N-트리스 [히드록시메틸]메틸-2-아미노에탄술폰산), BES (N,N-비스[2-히드록시에틸]-2-아미노에탄술폰산) 및/또는 TRIZMA (트리스[히드록시메틸]아미노에탄)가 사용될 수 있으며; 이들은 모두 예를 들어, SAFC (미국 미주리주 세인트루이스)로부터 입수할 수 있다. 일부 경우에서, 조직 배양 배지는 공지된 농도의 상기 착물화제 및/또는 유기 완충제로 개별적으로 또는 조합하여 보충될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 배양 유체는 EDTA, 예컨대 50 μM, 또는 또 다른 적합한 금속 (예컨대, 철) 킬레이트화제를 함유할 수 있다. 다른 조성물, 제제, 보충제, 착물화제 및/또는 완충제가 사용될 수 있다.
세포 배양 배지 제제는 아미노산을 포함할 수 있으며, 아미노산으로는 예를 들어, 자연 발생 아미노산 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
세포 배양 배지 제제는 염을 포함할 수 있으며, 염으로는 염화칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 인산나트륨, 염화마그네슘, 황산제2구리, 황산제1철, 황산아연, 질산제2철, 이산화셀레늄, 염화칼슘 및/또는 세포 배양 배지 제제에서 사용하기에 적합한 다른 염을 포함할 수 있다.
세포 배양 배지 제제는 비타민을 포함할 수 있으며, 비타민으로는 비오틴, 염화콜린, 판토텐산 칼슘, 폴산, 하이포크산틴, 이노시톨, 니아신아미드, 비타민 C, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 티미딘, 비타민 B-12, 피리독살, 푸트레신 및/또는 세포 배양 배지 제제에서 사용하기에 적합한 다른 비타민을 포함할 수 있다.
세포 배양 배지 제제는 상기 열거된 성분들 이외의 하나 이상의 성분 ("다른 성분")을 포함할 수 있으며, 다른 성분으로는 덱스트로스, 만노스, 피루브산나트륨, 페놀 레드, 글루타티온, 리놀레산, 리포산, 에탄올아민, 메르캅토에탄올, 오르토 포스포릴에탄올아민 및/또는 세포 배양 배지 제제에서 사용하기에 적합한 다른 성분을 포함할 수 있다.
일반 포유동물 세포 배양 배지 제제는 DMEM/F12이다. DMEM/F12는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) 및 햄 F-12 영양소 혼합물의 1:1 혼합물이다. DMEM/F12 배지는 다수의 상업적 공급처로부터 이용가능하고, 이는 흔히 재조합 단백질, 예컨대 rhFVIII을 생산하는 데 사용된다. DMEM/F12의 완전한 성분의 조성물은 자유롭게 이용가능하다 (예컨대, ATCC 카탈로그 번호 30-2006) (하기 표 1). DMEM/F12 (1:1)는 전형적으로 1.05 mM (0.11665 g/L)의 잘 용해되는 CaCl2 (무수)를 함유한다. D-만노스는 DMEM/F12 (1:1) 제제의 성분이 아니고; D-글루코스는 (탄수화물 공급원으로서) 약 3 g/L로 존재한다.
특정 실시양태에서, DMEM/F12 및 약 3 g/L 이하의 만노스를 포함하는 제제를 제공한다. 예를 들어, DMEM/F12 (1 g/L의 글루코스 포함) 및 3 g/L의 만노스 (4 g/L의 전당 포함)를 포함하는 제제를 통해서 세포 배양물 중 rhFIII 역가는, 만노스는 함유하지 않지만 4 g/L의 글루코스 (4 g/L의 전당)와 함께 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양물과 비교하였을 때 약 28%만큼 증가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 글루코스는 함유하지 않지만 4 g/L의 만노스 (4 g/L의 전당)와 함께 DMEM/F12를 포함하는 제제를 통해서 세포 배양물 중 rhFVIII 역가는, 3 g/L의 만노스 및 1 g/L의 글루코스 (4 g/L의 전당)와 함께 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양물과 비교하였을 때 약 18%만큼 증가될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 제제의 당 함량을 조작하였을 때의 rhFVIII의 생산 수준에 미치는 결과를 그래프로 나타낸 도 9를 참조할 수 있다.
만노스는 당 단량체이고, 글루코스의 에피머이다. 만노스는 세포 대사에 관여한다. 당단백질 생합성 동안 번역 후에 단백질 내로 도입된다. 당단백질에 부착된 올리고당은 초기 단백질의 적절한 폴딩을 지원할 수 있고, 성숙한 단백질을 단백질분해로부터 보호하는 데 도움을 줄 수 있다 (Hebert and Molinari, Physiol . Rev. 87:1377-1408 (2007)). 전형적인 N-연결된 올리고당은 만노스 뿐만 아니라, N-아세틸글루코사민을 함유하고, 일반적으로 수개의 분지를 가지며, 종종 말단에는 음으로 하전된 시알산 잔기를 가진다. 이러한 구조상의 변형은 분자의 생물발생, 분비 및 안정성, 및 약동학적/약역학적 (PK/PD) 특성에 영향을 줄 수 있는, FVIII을 비롯한 다수의 당단백질에 대한 중요한 품질적 특질이다.
진핵 세포는, 프룩토스-6-포스페이트가 만노스-6 포스페이트 이소머라제에 의해 만노스-6-포스페이트로 전환되는 과정에서 글루코스를 만노스로 전환시킬 수 있지만, 일부 세포 유형에서 당단백질 생합성을 위한 만노스 대부분은 글루코스가 아닌 만노스로부터 유도된다 (Alton et al., Glycobiology 8 (3) 285-295 (1998)).
재조합 단백질의 안정화제는 재조합 단백질을, 예를 들어 분해로부터 안정화시키는 임의의 것일 수 있다. 안정화제의 예로는 칼슘 및 망가니즈를 포함한다.
칼슘 이온은 FVIII 복합체의 4차 구조를 안정화시킴으로써 FVIII 응고 활성을 안정화시키는 중요한 역할을 한다 (Switzer et al., The Journal of Clinical Investigation 60: 819-828 (1977); Mikaelsson et al. Blood 62(5): 1006-1015 (1983)). 칼슘 및 망가니즈는 중쇄 및 경쇄 둘 모두에 결합하여 이종이량체의 입체구조를 조정함으로써 FVIII 활성을 촉진시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Fay, Blood Rev. 18: 1-15 (2004)]에서 리뷰됨). FVIII의 활성 입체구조를 촉진시키는 데 칼슘 (및/또는 망가니즈)이 요구된다는 것이 제안되었다.
실시양태 제제 및/또는 실시양태 방법을 이용하는, 세포를 배양하는 데 적합한 임의의 세포 배양 시스템이 사용될 수 있다. 세포 배양 시스템은 포유동물 세포 배양 시스템일 수 있다. 세포 배양 시스템은 관류 생물반응기 세포 배양 시스템을 비롯한, 생물반응기 세포 배양 시스템일 수 있다. 세포 배양 시스템은 소규모 배양 시스템, 예컨대 조직 배양 플라스크 또는 롤러 병, 및/또는 대규모 세포 배양 시스템, 예컨대 생물반응기 세포 배양 시스템을 포함할 수 있다. 예시적인 세포 배양 배지는 소 혈청, 말 혈청, 송아지 혈청, 송아지 태아 혈청, 및/또는 소 태아 혈청을 비롯한, 혈청에 의해 추가로 보충될 수 있다. 예시적인 세포 배양 배지는 인간 혈청 및/또는 인간 혈장 단백질 분획에 의해 추가로 보충될 수 있다.
생물반응기 세포 배양 시스템은 (1) 재조합 단백질 발현 세포; 및 (2) (a) 약 3.5 g/L 이상의 만노스 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 범위의 칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 제제; (b) 약 3.5 g/L 이상의 만노스 및 약 1.5 mM 미만 또는 약 9.5 mM 초과의 칼슘을 포함하는 제제; (c) 약 3.5 g/L 미만의 만노스 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 범위의 칼슘을 포함하는 제제; (d) 약 4 g/L 내지 약 5 g/L 범위의 만노스 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM의 칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 제제; (e) 약 5 g/L의 만노스 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 범위의 칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 제제; (f) 약 4 g/L 내지 약 5 g/L 범위의 만노스 및 약 1.5 mM 미만 또는 약 9.5 mM 초과의 칼슘을 포함하는 제제; (g) 약 5 g/L의 만노스 및 약 1.5 mM 미만 또는 약 9.5 mM 초과의 칼슘을 포함하는 제제; (h) 약 3.5 g/L 이상의 만노스 및 약 2 mM 내지 약 5 mM 범위의 칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 제제; (i) 약 3.5 g/L 이상의 만노스 및 약 5 mM의 칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 제제; (j) 약 3.5 g/L 미만의 만노스 및 약 2 mM 내지 약 5 mM 범위의 칼슘을 포함하는 제제; (k) 약 3.5 g/L 미만의 만노스 및 약 5 mM의 칼슘을 포함하는 제제; 및 (l) 1:1 비의 DMEM/F12를 포함하고, 약 5 g/L의 만노스 및 약 5 mM의 칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 제제로부터 선택되는 세포 배양 배지 제제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 약 5 g/L의 만노스 및 약 5 mM의 칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 세포 배양 배지 제제의 사용을 통해 재조합 단백질 생산은 증가된다. 특정 실시양태에서, 생상된 재조합 단백질의 품질은 손상시키지 않으면서, 재조합 단백질 생산은 (예컨대, 본원에 기재된 약 3.5 g/L 이상의 만노스 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 범위의 칼슘, 또는 상기 범위(들) 중 임의의 특정 농도점(들)의 것 중 적어도 하나를 포함하지 않는 동일한 또는 실질적으로 동일한 세포 배양 배지와 비교하였을 때) 증가된다. 특정 실시양태에서, 재조합 단백질의 생산 증가는 최대 약 130일 이상 동안 지속된다.
재조합 단백질 생산을 위한 예시적인 세포 배양 시스템 및 생물반응기 세포 배양 시스템은 문헌에 기재되어 있다. 재조합 인자 VIII 생산을 위한 예시적인 관류 배양 시스템은 문헌, 예를 들어 US 6,338,964 (발명의 명칭: "Process and Medium For Mammalian Cell Culture Under Low Dissolved Carbon Dioxide Concentration") 및 [Boedeker, B.G.D., Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 27(4), pages 385-394]에 기재되어 있다.
상기 기재된 제제 및 방법은 유의적으로 공장 생산력을 증가시키고, 생산 비용을 절감시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, rhFVIII에 대해 최대 ~40%까지 세포 배양 생산성이 증가한 것으로 관찰되었다 (예컨대, 연속 관류 배양의 생산성 증가는 3개월 이상 동안 지속되었다). 추가로, 특정 실시양태에 따른 방법에서의 cGMP 규제 기관에 부응하는 API 생산 공장에서 실행되는 복잡도 및 비용은 상대적으로 낮다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 확립된 재조합 단백질 생성물을 위한 유전자 조작 또는 세포주 변화를 위해 요구되는 것은 없고/거나; 기반 구조에 대한 또는 생산 공정에 대한 주요 변화를 위해 요구되는 것은 없고/거나; 생성물 품질에 대해서는 어떤 영향도 미치지 않는다.
본 교시의 측면은 하기 실시예에 비추어 추가로 이해될 수 있으며, 이 실시예는 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1: 만노스를 증가시킨 결과, 세포 배양 시스템에서 재조합 단백질의 생산은 증가하였다.
현존 DMEM/F12 배지 성분의 농도를 변화시켜 가면서, rhFVIII을 발현하는 BHK-21 세포를 롤러 튜브에서 배양하였다 (Shimoni et al., BioPharm International 23(8):28-37 (2010)). 만노스 수준을 증가시켰을 때, (효능에 대해 검정하여 측정한 바) rhFVIII 역가는 증가한 것으로 관찰되었다.
1 L 관류 생물반응기 시스템을 사용하여 실험을 수행한 후, 15 L 규모의 관류 생물반응기 연구를 수행하였다. 1 L 규모와 15 L 규모 사이의 결과는 일반적으로 일치하였다.
3 g/L의 만노스를 함유하는 (대조군 조건) 표준 배지 중 접종 및 정상 상태로까지의 성장 후, 1 L 규모의 관류 생물반응기에서 수행된 범위 시험 실험을 통해 만노스 증가가 역가에 미치는 용량 의존적인 효과가 입증되었다. 3 g/L의 만노스를 함유하는 (표준) 배지 중, 이어서 (생물반응기 내로 공급된 배지를 교체함으로써) 4 g/L 및 5 g/L의 만노스를 함유하는 (표준) 배지 중에서 각각 약 10일씩 세포를 추가로 연속하여 배양하였다. 본 실험에서 다른 배지 성분은 바꾸지 않았다. 효능 측정을 위해 거의 매일 샘플을 채취하였다 (프로세싱하고, 냉동시켰다). 만노스를 3 g/L에서 4 g/L로 증가시켰을 때, 역가는 ~15%만큼 증가하였고, 만노스를 추가로 5 g/L로 증가시켰을 때에는 ~25% (즉, 추가로 ~10%)만큼 증가하였다 (도 2).
도 2로부터의 데이터의 통계학적 분석을 통해 만노스 농도 증가가 효능/역가 증가에 미치는 효과는 유의적이라는 것이 입증되었다 (P 값 < 0.0001).
본 실험을 15 L 규모로 수행하였을 때, 거의 매일 채취된 (프로세싱되고 냉동된) 샘플을 이용하고, 배양물을 3 g/L의 만노스를 함유하는 배지로부터 5 g/L의 만노스를 함유하는 배지로 바꾼 결과, 역가는 ~37% 증가하였다 (도 3; 3 g/L의 만노스는 X축 상에 "대조군"으로 표지되어 있고, 5 g/L의 만노스는 X축 상에 "만노스"로 표지되어 있다). (1 L 규모 및 15 L 규모로 수행된) 상기 두 실험 모두에서, 통계학적 분석 결과, 만노스 증가가 미치는 효과는 통계학상 유의적인 것으로 나타났다. 만노스가 FVIII 역가에 미치는 효과는 배지 교체 수일 이내에 관찰되었고, 이는 연속 (1 L 및 15 L) 관류 배양 시스템에서 지속되었다.
도 3으로부터의 데이터의 통계학적 분석을 통해 만노스가 효능/역가 증가에 미치는 효과는 유의적이라는 것이 입증되었다 (P 값 < 0.0012).
실시예 2: 칼슘을 증가시킨 결과, 세포 배양 시스템에서 재조합 단백질의 생산은 증가하였다.
rhFVIII을 발현하는 BHK-21 세포를 롤러 튜브에서 배양하였다 (Shimoni et al., BioPharm International 23(8):28-37 (2010)). DMEM/F12 기초 배지 중 칼슘 수준을 증가시켰을 때, (효능에 대해 검정하여 측정한 바) rhFVIII 역가는 증가한 것으로 관찰되었다.
롤러 튜브에서 범위 발견 실험을 수행하여 FVIII 역가 증가를 위한 칼슘의 최적 농도를 확인하였다. 시험된 농도 중 5 mM 염화칼슘이 FVIII 역가에 미치는 효과가 가장 컸다 (~19% 증가) (도 4: 샘플을 4일간의 실험 동안에 걸쳐 제2일, 제3일 및 제4일에 수집하였고 (X축), 역가 (효능)는 Y축에 대조군 (1 mM 염화칼슘)에 대한 상대적인 비율(%)로 표시되어 있다). 1 mM (대조군), 2 mM, 5 mM 및 10 mM 범위의 염화칼슘 농도를 시험하였다. 1 mM (대조군)에서 2 mM로의 칼슘 증가는 FVIII 역가를 ~8%만큼 증가시킨 반면, 5 mM일 때에는 역가를 ~19%만큼 증가시켰다. 그러나, 10 mM일 때, 칼슘은 역가에 대해 부정적인 영향을 미쳤다.
1 L 관류 생물반응기에서 성장시킨 세포를 1 mM 염화칼슘 (대조군 배지) 함유 배지로부터 5 mM 염화칼슘 함유 배지로 옮겼을 때, 역가는 ~27%만큼 증가하였다 (도 5). 1 L 관류 생물반응기 중 1 mM 염화칼슘을 함유하는 배지 중에서 약 5일 동안 세포를 정상 상태로 연속하여 배양한 후, 이어서 5 mM 염화칼슘을 함유하는 배지로 옮기고, 그 중에서 추가의 ~5일 동안 배양하였다. 효능 측정을 위해 거의 매일 샘플을 채취하였다 (프로세싱하고, 냉동시켰다).
15 L 규모 관류 생물반응기에서 유사 실험을 반복하였을 때, 역가는 1 mM 칼슘 함유 배지에서보다 5 mM 칼슘 함유 배지에서 ~29% 더 높았다 (도 6: 5 mM 염화칼슘을 함유하는 배지는 X축 상에 "Ca"로 표지되어 있다). 15 L 관류 생물반응기 중 1 mM 염화칼슘을 함유하는 배지 ("대조군")중에서 약 3일 동안 세포를 정상 상태로 연속하여 배양한 후, 이어서 5 mM 염화칼슘을 함유하는 배지로 옮기고, 그 중에서 1주일 초과 동안 배양하였다. 효능 측정을 위해 거의 매일 샘플을 채취하였다 (프로세싱하고, 냉동시켰다).
따라서, 1 L 규모 및 15 L 규모로 수행된 상기 두 실험 모두 서로 매우 일치하였으며, 일단 배지가 1 mM 염화칼슘에서 5 mM 염화칼슘으로 바뀐 후에는 FVIII 역가가 27-29% 빠르게 증가하였다는 것이 입증되었다. 실험 지속 기간 내내 역가는 더 높은 고역가로 지속되었다.
5 g/L의 만노스를 함유하는 배지 (도 2)를 사용하고, 5 mM 칼슘을 함유하는 배지 (도 5)를 사용한, 상기 기재된 두 15 L의 실험 실행 종료시 물질을 수거하고, 한외여과에 의해 농축시켰다.
도 6으로부터의 데이터의 통계학적 분석을 통해 칼슘 농도 증가가 효능/역가 증가에 미치는 효과는 유의적이라는 것이 입증되었다 (P 값 < 0.0176).
실시예 3: 만노스 또는 칼슘 농도 증가에 의한 재조합 단백질의 생산 증가가 단백질 품질을 손상시키지 않았다.
이어서, 실시예 1-2로부터의 냉동된 한외여과된 배양 수거물 (15 L 생물반응기, 각 배지 유형마다 대략 2주간의 캠페인: A. 5 mM 칼슘; B. 5 g/L의 만노스)을 프로세싱하고, 앞서 기재된 바와 같이 수단계에 걸쳐 FVIII을 정제하고 (Boedeker, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27(4): 385-394 (2001)), 최종적으로 다양한 생성물 품질 특징에 대해 평가하였다. 5 g/L의 만노스 함유 배지 및 5 mM 칼슘 함유 배지 둘 모두로부터 정제된 rhFVIII 물질은 HPLC-SEC 및 SDS-PAGE/웨스턴 블롯 기반 방법, 효능, 특이 활성, 각종 숙주-세포 불순물 (단백질 및 핵산) 및 글리코실화 패턴에 의해 평가된, 순도 및 완전성을 비롯한 다양한 생성물 품질 특질을 통과하였으며, 이는 배지 중 만노스 및 칼슘 농도 변화가 FVIII 생성물에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사하는 것이다.
실시예 4: 만노스 및 칼슘을 증가시킨 결과, 세포 배양 시스템에서 재조합 단백질의 생산은 증가하였다.
도 7a-b는 (5 mM) 칼슘 및 (5 g/L) 만노스 둘 모두가 강화된 DMEM/F12 기초 배지가 각 성분 단독인 것보다 FVIII 역가에 대하여 더 높은 유익한 효과를 미쳤다는 것을 보여주는 것이다. 역가 변화는 1일 이내에 발생하였으며, 일단 배양물이 (1 mM 염화칼슘 및 3 g/L의 만노스를 함유하는) 표준 배지로 복귀되고 나면, ~29%의 역가 증가는 기준선으로 역전되었는 바, 역가 변화는 가역적이라는 것 또한 보여주는 것이다.
도 7a-b는 (1 mM 염화칼슘 및 3 g/L의 만노스를 함유하는) 대조군 배지를 상기 두 성분 모두가 강화된 -- 5 mM 염화칼슘 및 5 g/L의 만노스를 함유하는 -- 배지로 바꾸었을 때, 그 결과로 rhFVIII 역가는 29%만큼 증가하였고, 그 효과는 가역적이라는 것을 그래프로 나타낸 것이다. 15 L 관류 생물반응기 세포 배양물 중 5 mM 칼슘 및 5 g/L의 만노스를 함유하는 배지로 옮긴 표준 배지 (1 mM 칼슘 및 3 g/L의 만노스; 대조군-1) 중에서 약 9일 동안 세포를 연속하여 배양한 후, 이어서 표준 배지 (대조군-2)로 다시 복귀시켰을 때, (1일 이내의) 빠르고 가역적인 rhFVIII 역가 변화가 입증되었다. 조건은 (각각) 5 mM 염화칼슘 및 5 g/L의 만노스 ("Ca+만노스") 시험 배지로의 이동 전인 "대조군-1", 및 그로부터의 이동 후인 "대조군-2"였다. 효능 측정을 위해 거의 매일 샘플을 채취하였다 (프로세싱하고, 냉동시켰다). "조건"에 의한 것인 패널 a.
도 7(a) 및 (b)로부터의 데이터의 통계학적 분석을 통해 만노스 및 칼슘 (함께) 농도 증가가 효능/역가 증가에 미치는 효과는 유의적이라는 것이 입증되었다. 도 7(a)로부터의 데이터의 통계학적 분석을 통해 p 값 < 0.05를 얻었다. 도 7(b)로부터의 데이터의 통계학적 분석을 통해 p 값 < 0.0102를 얻었다.
실시예 5: 만노스 및 칼슘 농도 증가에 의한 재조합 단백질의 생산 증가가 단백질 품질을 손상시키지 않았다.
관류 배양에서 130일 동안 지속되는 캠페인 동안에 걸쳐 효과가 지속되는지를 확인하기 위해, 5 g/L의 만노스 및 5 mM 칼슘을 함유하는 시험 배지 중에서 배양하는 것 하나, 및 3 g/L의 만노스 및 1 mM 칼슘을 함유하는 대조군 배지 중에서 배양하는 것 하나인, 두 생물반응기를 함께 작동시켰다 (도 8a). 실제로, 대조군과 비교하였을 때, 시험 생물반응기에서는 130일 동안의 관류 캠페인 동안에 걸쳐 >30%의 역가 이점이 지속되었다 (도 8b).
실시예 5로부터 수거 물질을 수집하고, 그를 한외여과에 의해 농축시킴으로써 시험 배양물 (도 8a, 시점 3, 5, 7) 및 대조군 배양물 (도 8a, 시점 2, 4, 6)에 대해 3개의 시점에서 생성물 품질을 함께 시험하였다. 대조군 배지로부터 시험 배지로 옮기기 전에 조기 시점의 것 (도 8a, 시점 1)을 시험 생물반응기로부터 수집하였다. 한외여과된 배양 수거물을 정제하고, FVIII 품질을 평가하였다. 시험 배지를 사용하여 생성된 FVIII은 순도 및 완전성, 효능, 특이 활성, 각종 숙주-세포 불순물 및 글리코실화 패턴을 비롯한 모든 품질 측정 기준을 충족시켰고; 추가로, 시험 배지 중의 배양물로부터 생성된 FVIII 물질은 대조군 배지에서 성장한 배양물로부터 생성된 것과 유사하였으며, 이는 >30%의 지속적인 역가 증가가 생성물 품질에는 영향을 주지 않았다는 것을 시사하는 것이다. 세포 배양물 성장 특질 또한 두 생물반응기, 시험 생물반응기 및 대조군 생물반응기에서 유사하였다. 시험 생물반응기와 대조군 생물반응기 사이의 프로세스 제어 설정점 (pH, 용존 산소량, pCO2 및 온도), 세포 특질 (생물반응기 세포 밀도, 생물반응기 생존율), 대사산물 (글루코스 및 락테이트에 대한 잔류율 및 소모율) 및 특이 생산성 모두 유사하였다.
실시예 6: 실시예 1-5에 대한 물질 및 방법
롤러 튜브 실험
앞서 기재된 바와 같이 통기 스크류 캡이 장착된 50 mL 배양 튜브 (컬티플라스크 50(Cultiflask 50), 사토리우스(Sartorius: 미국 뉴욕주 보헤미아)) 중에서 소규모 배지 시험 실험을 수행하였다 (Shimoni et al., BioPharm International , 23(8):28-37 (2010)). 초기 세포 밀도가 3 x 105개의 세포/mL인 14 mL의 시험 배지로 튜브를 충전시켰다. 습윤화, 온도 및 CO2 제어식 인큐베이터에 배치된 롤링 튜브 플랫폼 상에서 30 rpm으로 롤링 모션으로 튜브를 혼합하였다. 튜브를 4일 동알 인큐베이션시키고, 대사산물 분석을 위해 제2일, 제3일 및 제4일에 1.3 mL의 샘플을 채취하였다. 응고 또는 발색 검정을 이용하는 효능 검사를 위해 제3일 및 제4일에 추가 샘플을 채취하였다.
1 L 관류 생물반응기 세포 배양
규모 확장을 위해 rhFVIII을 발현하는 BHK-21 세포를 생산 배지 (DMEM/F12 기초 배지)를 사용하여 진탕 플라스크에 접종하였다. 플라스크를 35.5℃ 및 30 rpm으로 인큐베이션시키고, 원하는 양의 세포가 존재할 때까지 연속하여 분열시켰다.
규모 확장으로부터의 세포를 9 x 106개의 vc/mL로 DASGIP 제어 장치 상의 1 L의 작업 부피의 1.5 L DASGIP (에펜도르프(Eppendorf: 독일)) 용기에 접종하였다. 배지 펌프를 제어하는 수준 센서에 의해 작업 부피를 일정하게 유지시켰다.
측정된 세포 밀도에 의존하는 수거물 펌프를 조정함으로써 정상 상태의 0.45 nL/세포/일의 표적 세포 특이 관류 속도 ("CSPR")의 세포 잔류 장치 (침강기)를 이용하여 관류를 확립하였다. 장치의 온도 조절기를 이용하여 온도를 35.5℃로 제어하고, 침강기 온도는 20-23℃로 제어하였다. 침지된 실리콘 배관에 의해 통기시켰다. 표적 세포 밀도를 25 x 106개의 vc/mL로 유지시키기 위해 용존 산소량 감소시 그에 대한 반응으로 생물반응기로부터 세포를 폐기하였다. 5 L/시간의 헤드 스페이스 통기에 의해 보충적으로 통기시켰다. 필요에 따라 탄산나트륨 용액을 첨가함으로써 배양물 pH를 표적 6.85로 제어하였다.
15 L 관류 생물반응기 세포 배양
세포 배양을 12 L의 작업 부피로 15 L 생물반응기 (앱플리콘 인크.(Applikon Inc.: 미국 캘리포니아주 포스터 시티)) 중에서 수행하였다. 생물반응기에 ≥ 1 x 106개의 세포/mL의 시딩 밀도로 접종하였다. 조절가능한 프로세스 파라미터에 대한 표준 설정점은 실험 진행 동안 내내 유지시켰다; pH = 6.8, 온도 = 35.5℃, 용존 산소량 DO = 50% 공기 포화. 용존 산소량 및 pH 제어를 위해 실리콘 막에 의해 혼합 기체를 배양물에 공급하고, 정압을 유지시키고, 스트립핑을 돕기 위해 수동식 로타미터를 통해 헤드스페이스를 제어하였다. 세포를 수거물 스트림으로부터 제거하고, 침강된 세포 매스를 다시 생물반응기로 복귀시키기 위해 생물반응기를 세포 잔류 장치 (침강기)에 연결시켰다.
CSPR을 0.45 nL/세포/일의 정상 상태 표적으로 조정하고, 실험 진행 동안 유지시켰다. 산소 유량 제어 알고리즘에 기초하여 시스템으로부터 자동으로 세포를 폐기함으로써 정상 상태 세포 농도를 20 x 106개의 vc/mL로 표적화하였다.
샘플링 및 샘플 프로세싱
생물반응기 및 수거물 스트림으로부터 샘플을 매일 채취하였다. 세덱스(Cedex) 세포 계수기 (로슈 인노바티스(Roche Innovatis: 독일))를 이용하여 세포 농도, 생존율 및 크기를 측정하였다. YSI 2700 생화학적 분석기 (YSI 라이프 사이언시즈(Life Sciences: 미국))를 사용하여 잔류 글루코스 및 락테이트 농도를 측정하였다. 라피드랩(RapidLab) 248 혈액 가스 분석기 (지멘스(Siemens: 독일))를 이용하여 생물반응기 기체 및 pH를 측정하였다. rFVIII 정량화를 위해 (하기 기재되는) 1단계 응고 또는 발색 검정에 의해 생물반응기 및 수거물 샘플을 분석하였다.
FVIII 효능 검정 (1단계 응고 및 발색 검정)
응고 FVIII:C 시험 방법은 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)에 기초한 1단계 검정이다. 인자 VIII은 인자 X의 Xa로의 효소적 전환에서 인자 IXa, 칼슘, 및 인지질의 존재하에 보조 인자로의 역할을 한다. 상기 검정에서, 희석된 시험 샘플을 FVIII 결핍 혈장 기질 및 aPTT 시약의 혼합물과 함께 37℃에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션된 혼합물에 염화칼슘을 첨가하자, 응고가 개시되었다. 응고물 형성 소요 시간 (초)과 FVIII:C 농도의 로그 사이에는 반비례 관계가 존재하였다. 시험 물질의 다양한 희석액의 응고 시간을 활성이 공지된 표준 물질의 일련의 희석액으로부터 작성된 곡선과 비교하여 비공지된 샘플에 대한 활성 수준을 내삽하고, 1 mL당 국제 단위 (IU/mL)로 기록하였다.
발색 효능 검정 방법은 색상 강도가 샘플 중 인자 VIII 활성에 비례하는 연속되는 2개의 단계를 포함하였다. 제1 단계에서, 인자 X는 최적량의 칼슘 이온 및 인지질의 존재하에서 보조 인자인 인자 VIIIa와 함께 인자 IXa에 의해 인자 Xa로 활성화되었다. 과량의 인자 X는 인자 X의 활성화 속도가 단지 인자 VIII의 양에만 의존할 수 있도록 존재하였다. 제2 단계에서, 인자 Xa가 발색 기질을 가수분해함으로써 발색단이 생성되었고, 색상 강도를 405 nm에서 광도계로 판독하였다. 선형 회귀 통계 방법을 이용하여 비공지된 것의 효능을 계산하고, 검정의 유효성을 검사하였다. 활성을 1 mL당 국제 단위 (IU/mL)로 기록하였다. 인자 VIII의 발색 및 응고 검정에 대한 추가의 상세한 설명은 문헌에서 살펴볼 수 있다 (참조를 위해, [Barrowcliffe T.W. et al., seminars in Thrombosis and Hemostasis, 28 (3), 2002]; [Lippi G. et al., Blood Coagulation and Fibrinolysis 2009, 20 (1), 2009]를 참조할 수 있다).
본원에 기록된 실험 결과는 상대 단위로 제시되어 있다.
한외여과된 배양 수거물
15 L 발효의 수거물 유체를 여과하여 세포 및 잔여물을 제거한 후, 100 킬로달톤 (kDa) 컷오프 막을 사용하여 직교류식 여과에 의해 40배로 농축시켰다.
UFDF로의 정제
문헌 [Boedeker, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 27(4):385-394 (2001)]에 기재된 바와 같이, rFVIII의 고정화된 모노클로날 항체에의 결합에 의한 면역친화도 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 일련의 크로마토그래피 단계에 의해 한외여과된 물질로부터 rFVIII을 정제하였다.
QC 검정
생산된 rFVIII 단백질의 품질을 분석하기 위하여, 일련의 구체적인 방법을 적용시켰다. 완전성, 글리코실화 패턴에 대한 임의의 잠재적인 변화, 및 숙주 세포 불순물에 대해 FVIII 생성물의 품질을 평가하였다.
인자 VIII 완전성을 HPLC에 의해 분석하였다. 은 염색법에 이어서, SDS-PAGE에 의해, 및 항-FVIII 항체를 이용하는 웨스턴 블롯에 의해 생성물을 완전성 및 불순물에 대해 분석하였다.
오염물질 및 불순물 측정을 위해, 특이 면역검정을 사용하여 숙주 세포 단백질에 대해, 및 BHK 세포 배양물로부터 유도된 핵산 불순물에 대해서 생성물을 분석하였다.
상이한 당 성분 및 시알릴화 정도를 측정함으로써 단리된 단백질의 글리코실화 패턴을 분석하였다. 데이터를 사내 대조군 rFVIII 단백질과 비교하였다.
실시예 1-6에 관한 결론
본 결과를 통해 배양 배지 중 만노스 및/또는 칼슘을 도입하고/거나 그의 농도를 증가시킴으로써 역가를 >30% 증가시킬 수 있고; 역가 증가는 연속 관류 배양에서 >130일 동안 지속된다는 것이 입증되었다. 중요하게는, 생성물 품질 특질 (불순물 포함)도 배양 성능도 배양 배지의 변화에 의해 영향을 받지 않는다. 역가 증가에 미치는 관찰된 영향은 글루코스 사용시에는, 예를 들어 만노스를 포함하는 것 없이 DMEM/F12 중 글루코스의 농도만을 증가시켰을 때에는 재현되지 않는다.
만노스 농도를 3 g/L에서 5 g/L로 증가시키면, 15 L 관류 생물반응기를 사용하여 rhFVIII 생산성을 25% 초과만큼 증가시킬 수 있다. 독립적으로, 칼슘을 ~1 mM에서 5 mM로 증가시킨 결과, 이 또한 생산성이 거의 동일하게 증가하였다. 추가로, 만노스 및 칼슘 둘 모두를 증가시켰을 때, 생산성 증가는 거의 40%까지 추가로 증가하였고; 5 g/L의 만노스 및 5 mM 칼슘의 조합을 통해서는 3 g/L의 만노스 및 1 mM 칼슘을 함유하는 표준 생산 배지에 비하여 인자 VIII 특이 생산성이 >30% 증가하였다. 세포 배양 성능 및 생성물 품질 특질은 상기와 같은 배지 제제의 변화에 의해 영향을 받지 않았다. 배지 교체 이후 약 1일 이내에 생산성에 미치는 영향은 뚜렷하게 나타났고, 이는 가역적이었다. 30% 초과의 생산성 증가는 연속적인 관류 생물반응기 세포 배양 동안 세포 은행 해동으로부터 3개월 동안에 걸쳐 지속되었다.
만노스 및 칼슘이 역가 증가에 미치는 효과는 각각이 단독으로 사용되었을 때보다 그 둘 모두가 사용될 때에 더 높았다. 칼슘은 인자 VIII 분자를 안정화시키는 것으로 공지되어 있다. 표준 DMEM/F12 (1:1) 배양 배지 제제 중의 칼슘 농도는 단지 ~1 mM이다. 그러므로, 배양 배지 제제 중 더 높은 수준의 칼슘은 수거물이 수집된 이후보다는 프로세스에서 보다 조기에 - 인자 VIII이 세포 밖으로 분비되는 때인 조기 시점에 인자 VIII 분자의 안정화에 도움을 줄 수 있다.
<표 1>
Figure pct00001
Figure pct00002
본원에서 사용된 섹션의 표제는 단지 조직화하기 위한 것이며, 어느 방식으로든 기재된 대상을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 교시를 다양한 실시양태와 함께 기술하였지만, 본 교시를 상기 실시양태로 제한하고자 하지 않는다. 그와 반대로, 본 교시는 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 다양한 대안, 변형 및 등가물을 포함한다.
따라서, 세부사항 및 일례들은 제한적인 의미보다는 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 추가로, 본원에서 언급된 모든 논문, 서적, 특허 출원 및 특허는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

Claims (24)

  1. 약 3.5 g/L 이상의 만노스 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 범위의 칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 포유동물 세포 배양 배지 제제.
  2. 제1항에 있어서, 배지가 약 3.5 g/L 이상의 만노스 및 약 1.5 mM 미만 또는 약 9.5 mM 초과의 칼슘을 포함하는 것인 제제.
  3. 제1항에 있어서, 배지가 약 3.5 g/L 미만의 만노스 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 범위의 칼슘을 포함하는 것인 제제.
  4. 제1항에 있어서, 배지가 약 4 g/L 내지 약 5 g/L 범위의 만노스를 포함하는 것인 제제.
  5. 제2항에 있어서, 배지가 약 4 g/L 내지 약 5 g/L 범위의 만노스를 포함하는 것인 제제.
  6. 제1항에 있어서, 배지가 약 2 mM 내지 약 5 mM 범위의 칼슘을 포함하는 것인 제제.
  7. 제3항에 있어서, 배지가 약 2 mM 내지 약 5 mM 범위의 칼슘을 포함하는 것인 제제.
  8. 제1항에 있어서, 1:1 비의 DMEM/F12를 포함하고, 약 4 g/L 내지 약 5 g/L 범위의 만노스 및 약 2 mM 내지 약 5 mM 범위의 칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 제제.
  9. 재조합 단백질 발현 세포를 제공하고;
    약 3.5 g/L 이상의 만노스 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 범위의 칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 세포 배양 배지 중에서 세포를 배양하는 것
    을 포함하는, 세포 배양물 중에서 재조합 단백질을 생산하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 배지가 약 3.5 g/L 이상의 만노스 및 약 1.5 mM 미만 또는 약 9.5 mM 초과의 칼슘을 포함하는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 배지가 약 3.5 g/L 미만의 만노스 및 약 1.5 mM 내지 약 9.5 mM 범위의 칼슘을 포함하는 것인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 배지가 약 4 g/L 내지 약 5 g/L 범위의 만노스를 포함하는 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 배지가 약 4 g/L 내지 약 5 g/L 범위의 만노스를 포함하는 것인 방법.
  14. 제9항에 있어서, 배지가 약 2 mM 내지 약 5 mM 범위의 칼슘을 포함하는 것인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 배지가 약 2 mM 내지 약 5 mM 범위의 칼슘을 포함하는 것인 방법.
  16. 제9항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 포유동물 세포가 BHK 세포, CHO 세포, HKB 세포, HEK 세포 및 NS0 세포로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 포유동물 세포가 BHK 세포인 방법.
  19. 제9항에 있어서, 세포가 혈액 응고 경로 재조합 단백질을 발현하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 세포가 재조합 인간 인자 VIII (rhFVIII) 또는 그의 변이체를 발현하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 변이체 인자 VIII이 유전자 변이체인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 유전자 변이체가 B-도메인 결실 FVIII인 방법.
  23. 제20항에 있어서, 변이체 인자 VIII이 PEG화 FVIII인 방법.
  24. 제9항에 있어서, 세포가 재조합 인자 VIII을 발현하는 BHK 세포이고, 배지가 1:1 비의 DMEM/F12를 포함하고, 약 4 g/L 내지 약 5 g/L 범위의 만노스 및 약 2 mM 내지 약 5 mM 범위의 칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
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