KR20150116883A

KR20150116883A - 상처 치유를 촉진하기 위한 짧은 생체-활성 펩티드

Info

Publication number: KR20150116883A
Application number: KR1020157024070A
Authority: KR
Inventors: 리주안 장; 로빈 카마이클
Original assignee: 헬릭스 바이오메딕스, 인코포레이티드
Priority date: 2013-02-14
Filing date: 2014-01-21
Publication date: 2015-10-16
Also published as: US20170000848A1; CY1119087T1; AU2014216730A1; CN105120884B; NZ711281A; WO2014126681A1; EP2956155B1; US9487558B2; EP2956155A1; HUE033976T2; ZA201505516B; JP6348126B2; DK2956155T3; HK1212243A1; MX2015009404A; JP2016513107A; TWI587867B; PL2956155T3; AU2014216730B2; SI2956155T1

Abstract

생물학적 활성을 보유하는 4 내지 6개의 아미노산 잔기를 갖고 있는 펩티드가 개시된다. 이 펩티드는 펩티드 HB-107 (MPKEKVFLKIEKMGRNIRN)의 짧은 단편으로 구성되며, 이것은 그 자체로 항균 단백질 세크로핀 B의 단편이고, 세포 자극 및 이동 성질을 나타낸다. 본 발명의 펩티드는 HB107 (MPKEKVFLKIEKMGRNIRN)의 위치 11 및 16 사이에 위치한 4 내지 6개의 인접한 아미노산 잔기, 즉 EKMGRN를 포함한다. 개시된 펩티드는 피부 손상, 예를 들어, 당뇨성 궤양의 의학적 치료에 유용한 약제를 포함한다. 펩티드는 또한 다양한 환경적 손상으로부터 초래되는 피부 표면 손상을 방지하고 반전시키는데 효과적이다. 중요하게는, 펩티드의 치료적 효과는 펩티드 HB-107과 동일하거나 이것보다 더 높은 농도에서 나타나고, 따라서 효과적인 치료법을 개발하기 위해 덜 비싸고 , 더 융통성이 있는 수단을 나타낸다. 이 펩티드의 생산 및 사용 방법이 또한 개시된다.

Description

상처 치유를 촉진하기 위한 짧은 생체-활성 펩티드{SHORT BIO-ACTIVE PEPTIDES FOR PROMOTING WOUND HEALING}

본 출원은 2013년 2월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 61/764,913에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이것은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본 발명의 분야

본 발명은 생물학적, 미용적 및 치료적 활성을 가진 펩티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 모모 세포(keratinocyte cell) 증식 및 이동을 자극하는 서열 번호: 1 (EKMGRN)의 4 내지 6개의 인접한 아미노산 잔기를 가진 짧은 펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 상처 회복을 촉진하고 피부 및 다른 관련된 체표면, 예를 들어, 구강에 영향을 미치는 다양한 손상을 치료하기 위해 이 펩티드를 사용하는 방법에 더 관련된다.

피부는 신체의 가장 큰 기관이며 환경과 우리의 내부 생물학 사이의 계면이다. 그것은 두 개의 주요 층으로 구성된다: 피부의 가장 바깥쪽 층인 표피; 및 표피 바로 아래에 있는 진피. 각질 형성 세포(keratinocyte)가 주된 세포이며, 표피의 95%를 구성한다. 초기저 각질 형성 세포는 세라미드, 콜레스테롤 및 지방산를 포함하는, 단백질 및 지질에 의해 둘러싸여 있는 화학적으로 및 물리학적으로 저항성인 각질층으로 분화된다. 이 각질화된 상피의 최상층의 자연적 또는 강제적 제거는 손상된 또는 손실된 세포를 대체하기 위해 근본적인 세포에 의한 턴오버(turnover)를 자극할 것이다. 이 각질화된 층은 신체와 환경 사이에서 보호적 및 물-장벽(water-barrier) 기능을 제공한다. 각질 형성 세포의 주요 기능은 화학적, 물리학적 및 기계적 위험, 미생물에 의한 침입, 열, UV 복사 및 수분 손실에 대하여 신체를 보호하기 위한 장벽의 형성이다 (Proksch et al., 2008). 각질 형성 세포는 또한 표피와 계속적인 점막 조직의 주요 구성요소이다 (Presland and Dale, 2000).

상처는 피부 상피의 온전함의 붕괴로서 정의된다. 정상적인 상처 치유는 염증, 새로운 조직 형성 및 조직 리모델링을 포함하는, 복합적이고 역동적이지만 잘 조율된 일련의 이벤트를 수반한다. 상처 치유는 조직이 손상되는 순간 시작되고 상피화(epithelialization) 및 피부 회복의 정밀한 협력을 필요로 하는데, 이것들 중에서 상피화 과정은 궁극적으로 각질 형성 세포의 이동, 증식, 및 분화 능력에 의존적이다 (Singer and Clark, 1999). 상피화 중에, 상처 주변에 위치한 각질 형성 세포는 이동하고 증식하여 상처 위에 단층을 형성한다. 각질 형성 세포의 추가의 증식 및 분화는 정상적인 중층(stratified layer)을 포함하는 표피층을 확립한다. 또한 정상 진피 섬유아세포를 가진 각질 형성 세포는 콜라겐 타입 I 및 III에 대한 mRNA의 상향 조절, 증가된 섬유아세포 증식, 및 조직의 구조 및 기능을 복원에 의한 완벽한 치유를 위한 세포 외 기질 축적 및 리모델링으로 이어진다 (Bergers G and Coussens LM, 2000). 따라서, 각질 형성 세포 증식 및 이동 능력은 피부 표면 상에서 이 과정을 수행하는데 필수적이다. 특정 성장 인자가 상처 치유 중에 자연적으로 이용된다는 지식을 가지고, 작업은 성장 인자-기반 상처 치료 방법의 개발과 관련된다 (Mustoe et al., 1994; Steed, 1995). 하지만, 이러한 전략을 이용한 대부분의 시도는 부분적으로 수반된 단백질의 큰 크기와 같이, 치료 단백질의 사용에 관련된 어려움으로 인해 임상적으로 유의한 결과를 달성하는데 실패했다. 성장 인자 요법의 사용은 또한 큰 단백질의 제조에 관련된 복잡성 및 높은 비용으로 고통받는다. 항균 펩티드로도 알려져 있는 숙주 방어 펩티드 (HDP)는 피부 상처 치유의 조절자로서 연관되어 있었다. 그것들의 작은 크기로 인해 이 짧은 활성 펩티드는 치료제 개발을 위해 관심을 끌었다 (Zhang and Falla, 2006).

HDP는 자연에 편재하고 진핵생물의 선천적 면역계의 중요한 구성요소를 형성한다. 그것들은 조직 재생 및 회복을 촉진하기 위한 병원체 제거, 뿐만 아니라 숙주 세포 행동 조절의 작용기로서 선천적 숙주 방어에 필수적이다. 정상적인 상처 회복은 염증, 상피화, 조직-과립화 및 리모델링의 정밀한 조율을 수반한다. 숙주 방어 펩티드는 이러한 모든 행동에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 카텔리시딘 PR-39는 호중구 옥시다제 활성의 억제에 의한 항-염증 기능을 가지고 있으며, 상처 회복에 중요한 신데칸, 헤파린 술페이트 프로테오글리칸을 유발한다 (Gallo et al., 1994; Shi J., Ross, CR. et al., 1996). 카텔리시딘 과 숙주 방어 펩티드의 또 다른 멤버, LL-37는 또한 기관 배양에서 인간 피부 상처의 재상피화에 영향을 미치는 것으로 나타났다 (Heilborn JD, et al., 2003). 인간 호중구 디펜신은 타입 I 콜라겐의 발현을 촉진하는 한편, 세포 사이 콜라게나제의 발현을 억제한다 (Oono T., et al., 2002). 게다가 더 많은 인간 카텔리시딘 LL-37 및 인간 β-디펜신-3은 매우 다양하며, 상피 세포 이동의 자극, 혈관 형성의 촉진, 및 전-염증 반응의 억제를 포함하는 활성을 촉진한다 (Steinstraesser et al., 2008, 2009). 그것들은 호중구, 단핵구, 비만 세포, 및 T 림프구의 관심을 끌고, 또한 많은 세포 타입에서 호중구 및 단핵구 화학주성인자(chemoattractant)의 생산을 유도한다. 최근에, HDP는 또한 염증, 혈관 형성, 및 세포 외 조직 침착 및 리모델링의 조절에 의한 피부 상처 회복의 조절자로서 연관되었다. 상처 회복에 대한 HDP의 영향은 항균 기능에 의존적이지 않으며 HDP에 대한 잠재적인 새로운 임상적 적용을 제공하는 것으로 나타났다. 발명자들은 이전에 세크로핀 B로부터 유래된 비-항균 숙주 방어 펩티드 HB107 (MPKEKVFLKIEKMGRNIRN)이 쥐 모델에서 상처 회복을 돕는 능력을 가지고 있으며 HB107로 관찰된 이익은 성장 인자 rhPDGF로 치료된 상처와 구별할 수 없다는 것을 보고하였다 (Lee, et al., 2004). HB107 치료된 상처의 조직학적 분석은 표피 과형성증(epidermal hyperplasia)이 HB107-치료된 상처에서 증가되었다는 것을 제안하고, HB107이 각질 형성 세포 증식 또는 이동에 영향을 미칠 수도 있다는 것을 나타낸다 (Lee PH., et al., 2004). 선천적 방어 조절자 (IDR)로 불리는, HDP의 합성 변이체의 새로운 군이 최근 설명되었는데, 이것은 다제-내성균(multidrug-resistant bacteria)으로 전신성 감염에 대한 광범위한 보호를 제공한다 (Easton DM., et al., 2009). 예를 들어, IDR-1 및 IDR 1002는 숙주의 선천적 면역 방어를 향상시키는 한편 잠재적으로 해로운 과도한 염증 반응을 억제함으로써 미생물의 도전에 대한 보호를 부여한다 (Easton et al., 2009; Nijnik A., et al., 2010).

본 발명은 포유동물의 상처 치유를 촉진하는데 유용한 짧은 생체-활성 펩티드에 관한 것이다. 분리된 펩티드에 의해 바람직하게 표적화된 상처는 피부 및 관련된 점막 표면에 영향을 미치는 것들이다. 어떤 특정한 메커니즘에 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 펩티드는 세포 증식 및 이동을 자극함으로써 상처 치유에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 펩티드는 시험관 내 및 생체 내 방식 모두에서 유용하고, 각질 형성 세포에서 상기 언급된 활성을 유발할 수 있다.

본 발명의 한 구체예는 HB107 (MPKEKVFLKIEKMGRNIRN)의 위치 11과 16 사이에 위치한 4개 내지 6개의 인접한 아미노산 잔기, 즉 EKMGRN (서열 번호: 1)을 함유하는 분리된 펩티드에 관한 것이다. 분리된 펩티드는 아미노산의 L- 또는 D-이성질체, 또는 이것들의 조합을 함유할 수도 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 분리된 펩티드는 운반 단백질에 컨쥬게이션되거나(conjugated), 또는 지방산으로 C-말단 아미드화 또는 N-말단 아세틸화 (즉, 지질화)를 통해 변형될 수도 있다. 이 추가된 것들은 피부 및 이것의 상처에 적용될 때 펩티드의 생체 활성을 향상시킨다.

본 발명의 특정 바람직한 구체예에 따르면, 분리된 펩티드 모두는 메티오닌을 함유한다. 분리된 펩티드의 특이적 구체예는 서열 번호: 1, 2, 3, 4 및 5를 포함하는데 이것들 모두는 세포 증식 및 이동에 대한 자극 활성을 나타내며 상처 회복에 영향을 미친다.

본 발명의 또 다른 구체예는 약학적으로 또는 미용적으로 허용 가능한 담체 및 상기 언급된 펩티드 중 하나 이상을 함유하는 치료적 또는 미용적 조성물용 의약품의 제조에 관한 것이다. 상기 언급된 조성물은 포유동물의 피부 상처의 치유를 위한 의약품 또는 화장품 적용에 유용하다. 이러한 조성물에서 펩티드는 바람직하게 농도가 약 0.1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 또는 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 mg/mL의 범위에 있다. 조성물의 바람직한 형태는 에어로졸, 에멀젼, 액체, 용액, 로션, 크림, 페이스트(paste), 연고, 분말, 겔 폼(foam)이다.

추가적으로, 본 발명의 펩티드, 및 그것들을 함유하는 조성물은 일반적인 스킨 케어(skin care) 및 화장품 제형, 예를 들어, 다양한 피부 화장품, 피부 크림, 로션, 선크림, 및 치료적 로션 또는 크림, 예를 들어, 레이져 시술 관리용 항-여드름제에 포함되는 유용한 특징을 제공할 수도 있다.

본 발명은 또한 포유동물의 상처 치유를 위해 상기 언급된 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 전형적으로, 치료 방법은 유효한 시간 동안, 상처, 특히 피부(표피) 및 관련된 점막 조직의 그것에 펩티드-함유 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 수반한다. 이러한 상처는 수술 상처, 찰과상(abrasion), 수포(blister), 화상(burn), 열상(laceration), 궤양(ulcer), 타박상(bruise), 발진(rash), 흉터(scar), 임신선(stretch mark) 및 주름 잡힘, 피부 쳐짐 및 광-손상을 포함하는, 노화 및 환경적 노출의 내재적 및 외적인 효과로 인한 피부 손상을 포함한다.

미국 특허 번호 5,962,410, 5,861,478, 및 7,696,174는 본 발명을 이해하는데 유용한 개시물을 제공하며 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 펩티드 HB107 (MPKEKVFLKIEKMGRNIRN) (서열 번호: 10)은 그 자체로 세크로핀 B의 단편을 구성하며, 이것은 나방의 종에 존재하는 항균 단백질이다. HB-107은 그것이 유래된 단백질의 세균 발육 저지 효과를 나타내지는 않지만, 그것은 표피의 상처 치유 특성을 나타낸다 (Lee et al., 2004). 이 19개의 아미노산 잔기 펩티드는 상처 치유에 필수적인 각질 형성 세포 증식, 이동, 소창(scratch wound) 봉합 및 항-염증 활성을 자극하는 다기능적 면역-조절자이다.

이 근거에 기초하여 발명자들은 본 연구에서 11-16의 위치로부터 HB107의 서열 번호: 1 (HB2265), EKMGRN로 나타나는 6개 아미노산 신장에 초점을 맞췄다.

발명자들은 서열 번호: 1로부터 3 내지 5개의 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를 더 생성하였으며, 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로 나타난다. 새롭게 유래된 펩티드가 상처 치유 활성을 갖고 있는지 평가하기 위해, 펩티드 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9는 각질 형성 세포 소창 테스트, 활성 화합물이 상처 봉합을 촉진하는 능력의 평가가 허용된 검정을 받았다. 표 1에서 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 및 5의 펩티드는 10 내지 20 μg/ml의 농도에서 소창 봉합을 크게 유발하는 것으로 나타난다. 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 및 5에 의해 유발된 상처 봉합의 퍼센트는 100%로 간주되는 PBS 처리된 것과 비교하여 182-218%의 범위에 있었다. 하지만 서열 번호: 6 (HB2268) 및 서열 번호: 7 (HB2269)로 나타난 트리펩티드, 및 테트라펩티드 HB2232, 모두는 소창 봉합을 유발하는데 실패하였다 (표 1). 아미노산 메티오닌 잔기가 없는 또 다른 펩티드 서열 번호: 9 (HB1062) (GRNIRN)는 또한 같은 시험관 내 각질 형성 세포 소창 테스트에서 소창 봉합을 촉진할 수 없는 것으로 나타났다 (표 1). 그러므로, 관찰된 상처 치유 활성에는 두 가지 결정적인 요소가 필요하다. 첫 번째, 최소한 네 개의 인접한 아미노산 잔기가 있어야 하고; 두 번째, 지정된 서열에 메티오닌 잔기를 함유해야 한다. HB2232 (KIEK) 및 HB1062 (GRNIRN) 모두가 소창 봉합을 촉진하기 위해 비활성화된다는 사실은 메티오닌 잔기가 상처 치유 활성을 촉진하기 위해 넷 이상의 인접한 잔기의 아미노산 중 하나로서 존재해야 하는, 대체 불가능한 아미노산이라고 제안한다. 발명자들은 따라서 메티오닌 잔기를 함유해야 하는, EKMGRN 내 11 내지 16의 위치로부터 HB107의 중심 지역에 위치하는 4 내지 6개의 인접한 아미노산 잔기가 상처 회복을 촉진하는 것으로 결론 내렸다. 활성이 각질 형성 세포에 대한 펩티드의 독성 때문이 아니라는 것을 확인하기 위해서, 모든 펩티드가 MTT 세포 독성 테스트를 받았다. 테스트된 펩티드 중 아무 것도 500 μg/ml까지의 농도에서 시험관 내 정상 피부 각젤 형성 세포에 대하여 세포 독성이 없었다 (표 1).

시험관 내 소창 봉합에 대하여 관찰된 활성은 시험관 내 각질 형성 세포 증식 검정에서 나타난 바와 같이 펩티드의 증식 활성과 밀접하게 연관된다 (표 2). 증식 활성은 낮은 농도에서 더 크다. 각 펩티드에 대한 각질 형성 세포 증식 활성을 자극하는데 필요한 최적의 농도는 다르지만 일반적으로 0.625 내지 5μg/ml의 범위 내에 있다 (표 2). 서열 번호: 1 (HB2265)은 2.5 및 5 μg/ml에서 활성을 나타내고 서열 번호: 2 (HB2262)는 0.625 내지 5μg/ml의 테스트된 모든 농도에서 각질 형성 세포 증식을 자극한다. SEQ ID 3 (HB2263), SEQ ID 4 (HB2234), 및 SEQ ID 5 (HB2235)는 0.625 내지 2.5 μg/ml의 비교적 더 낮은 농도에서 이러한 활성을 부여한다. 트리펩티드 HB2268 (KMG) 및 HB2269 (GRN)는 테스트된 모든 농도에서 증식 활성을 나타내지 않는 것으로 보인다. 또한 테트라펩티드 HB2232는 각질 형성 세포 증식을 유발하지 않는다 (표 2). 결론적으로 본 발명의 펩티드는 피부 각질 형성 세포 증식에 대한 조절 활성을 보유하며 이러한 활성은 피부 상처 회복에 필수적이다.

메커니즘을 더 잘 이해하기 위해서 발명자들은 하나의 대표적인 펩티드 서열 번호: 3, HB2235를 EPIDERM™ 조직 대체물 (MatTek, Ashland MA)을 사용하여 SUNNY BIODISCOVERY™ 유전자 프로파일링 (Santa Paula, CA)으로 수행된 유전자 프로파일링 연구에 제출하였다. 피부 대체물(skin substitute)은 하룻밤 동안 평형화되었고 그 다음에 24시간 동안 2배수로 펩티드 또는 물 대조군의 처리 전 전층 피부 자창(full thickness puncture wound)에 20G 바늘이 적용되었다. 두 개의 정상 조직의 세트는 또한 부상 및 정상 조직 사이의 유전자 프로파일링 변화를 알아보기 위해 대조군으로 사용되었다. 처리의 끝에 RNA가 추출되었고 PCR 어레이(array) 분석을 받았다. 1차 비교는 손상에 반응하는 유전자의 발현 프로파일을 보기 위해 부상 비-처리 조직 대 비-부상 비-처리 조직으로 이루어졌으며, 그 다음에, 부상 비-처리 대 부상 HB2235 처리의 비교가 이루어졌다. 표 3은 상처 치유 캐스케이드(cascade)의 다른 신호전달 경로 사이에서 크게 영향을 받은 일부 유전자를 나열한다. 영향을 받은 유전자는 콜라겐 및 인테그린과 같은 매트릭스 단백질을 암호화하는 것들, 시토킨 및 케모킨 수용체와 같은 전염증 캐스케이드의 유전자, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 플라스미노겐 활성제 및 프로테아제 억제제와 같이 조직 리모델링 과정에 수반된 유전자, 및 상처 치유에 수반된 다른 것들을 나타낸다. 성공적인 상처 치유는 많은 세포 타입, 비-세포 구성요소, 예를 들어, 피브린 및 콜라겐, 및 생물학적 활성 화학종의 칵테일을 수반하는, 잘-조율된 과정이다. 그것은 중첩 과정의 연속적인 캐스케이드이지만, 종종 세 단계로 나누어진다: 염증; 증식; 및 리모델링. 표 3에서 나타난 바와 같이, 정상 비-부상 피부 조직에 비해 급성 부상 또는 손상 후에는, 보통 전염증 시토킨 및 케모킨 수용체와 연관된 유전자가 크게 상향-조절된다. 예를 들어, C-X-C 케모킨 리간드 2 및 5는 각각 최대 4.29 및 2.93배였다 (표 3). 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 2 및 인터류킨-6 신호 변환기는 또한 각각 최대 1.87 및 1.93배였다. 염증 단계 중에, 손상 부위에서 혈소판 응집은 백혈구, 예를 들어, 호중구 및 대식세포의 상처 부위로의 침입으로 이어지는데 그 동안 피브린-풍부 응혈이 추가의 혈액 손실을 방지하기 위해 형성되고 상처로의 조기 세포 이동을 위한 스캐폴드(scaffold)의 역할을 한다. 손상 후 24시간에 관찰된 염증 신호 (부상 대 정상 조직)는 생리학적 상태에서 일정하며 호중구 및 대식세포를 손상의 부위로 끌어당기는데 필수적이다. 피브린-풍부 응혈은 결국 플라스민과 같은 단백질에 의해 이후의 단계에서 분해된다. 플라스민의 생산은 조직 플라스미노겐 활성제, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)의 기능과 밀접하게 관련된, 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키는 단백질의 존재에 의해 통제된다. 손상 후 24시간에 조직 및 유로키나제 플라스미노겐 활성제 (PLAT 및 PLAU), 뿐만 아니라 MMP (MMP-1) 모두를 암호화하는 유전자가 상향 조절된다는 것이 분명하게 나타난다. 정상 상처 치유 과정에서 리모델링 단계는 더 긴 시간 규모로 발생하며, 종종 완료하는데 몇 주가 걸리는데 이것은 콜라겐을 합성하고 리모델링하는 각질 형성 세포 및 섬유아세포의 신속한 증식의 단계를 수반한다. HB2235 처리된 부상 조직의 엄밀한 검사에서, 발명자들은 HB2235에 의해 영향을 받거나 조절되고 있는 상처 치유 캐스케이드에서 여러 결정적인 단계가 있다는 것을 관찰하였다. 첫째로, 펩티드는 전염증 시토킨 및 케모킨 수용체를 암호화하는 유전자가 HB2235의 24시간 처리 후 크게 하향 조절되었다는 점에 의해 지시된 바와 같이 초기 염증 단계의 기간을 분명하게 단축시킨다 (표 3). 염증 신호의 하향 조절과 일관되게, 항-염증 시토킨, IL-10은 상향 조절된다 (표 3).

이것은, 많은 연구가 지연된 상처 치유가 상처 치유의 모든 단계에 걸쳐 심각한 염증과 관련된 것이 분명하기 때문에 염증 과정의 길이 또는 기간을 감소시키는 것은 상처 치유를 매우 용이하게 할 수 있다는 것을 지시하기 때문에 이것은 중요하다

이것이 중요한데, 이는 많은 연구에서 지연된 상처 치유가 상처 치유의 모든 단계에 걸쳐 심각한 염증과 관련된 것이 분명하기 때문에 염증 과정의 길이 또는 기간을 감소시키는 것은 상처 치유를 매우 용이하게 할 수 있다고 지시된 바와 같다 (Leitch et al., 2009; Wang et al., 2006). 둘째로, HB2235는 24시간 처리 후 플라스미노겐 활성제 및 MMP를 암호화하는 유전자를 크게 하향 조절하며 그것이 조직 과립화 과정을 가속화할 수도 있다는 것을 나타낸다. 셋째로, 세포 이동 및 증식 활성에 필수적인 성장 인자, 예를 들어, TGF-β1, PDGF, EGF를 암호화하는 유전자를 조절함으로써, 펩티드는 분명히 재상피화 및 조직 리모델링 과정의 가속화에 수반되며, 그 동안 새로 형성된 조직이 완벽한 조직 회복을 위해 부상 영역을 커버하기 시작한다. 가장 중요하게는 HB2235 처리된 조직은 비트로넥틴 (VTN)의 5배 이상의 상향조절을 나타냈다 (표 3). VTN은 세포 외 기질에서 발견된 풍부한 당단백질이며 각질 형성 세포 접착, 증식 및 이동을 촉진하는 것으로 잘 알려져 있다 (Upton et al., 2008). 넷째로, 세포 증식 및 이동 활성과 일관되게, HB2235는 재상피화 및 조직 리모델링에 필수적인 매트릭스 단백질, 예를 들어, 콜라겐 및 인테그린을 암호화하는 유전자의 상향 조절을 자극한다 (표 3). 유전자 어레이 분석은 펩티드가 세포 증식 및 이동, 뿐만 아니라 매트릭스 리모델링 및 콜라겐 자극을 촉진함으로써 상피화 과정을 가속화한다는 것을 강력하게 지지한다.

서열 번호: 1, 2, 3, 4 및 5를 포함하는 본 발명의 펩티드는 각질 형성 세포가 있는 표피 조직에서 상처 치유 과정에 필수적인 각질 형성 세포 이동 및 증식의 상향 조절에 중요한 활성을 나타낸다. 본 발명에서 개시된 펩티드는 새롭고 이전에 개시된 서열보다 더 짧다. 본 발명의 펩티드에 의해 유도된 생물학적 활성은 세포 증식 및 이동인데 이것들 모두는 상처 치유 기능을 매개하는데 큰 역할을 한다.

더 작은 크기 때문에, 예를 들어, 본 발명의 네 개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드는 제조하기 더 쉽고 따라서 훨씬 비용 효율적이다. 또한, 더 큰 펩티드와는 달리, 개시된 펩티드는 화학적 변형을 위해 조작되기 더 쉽고 용해도 문제가 더 적다. 그것들의 간편한 핸들링은 더 많은 수의 약물 전달 옵션, 예를 들어, 사용되는 비히클 및 그것을 적용하는 방법을 가능하게 한다. 본 발명의 펩티드의 작은 크기 및 더 높은 가용성은 증가된 흡수 및 유지를 통해 상처 부위, 국소적 각질 형성 세포 및 더 오랜 기간 동안 더 높은 농도의 펩티드에 노출되는 다른 세포에서 그것들의 증가된 치유 효능을 허용한다.

개시된 모든 펩티드는 표준 Fmoc (9-플루오레닐메톡시카르보닐) 고체상 화학반응을 사용하여 합성될 수도 있다. 상기 설명된 펩티드 각각은 L- 또는 D-아미노산 이성질체를 포함할 수도 있다. 펩티드의 카르복시-말단은 산성 (-COOH)이거나 또는 아미드화 (예를 들어, -CONH2, -CONHR, 또는 -CONR2)될 수도 있다. 카르복시-말단의 아미드화는 본 발명의 펩티드를 유리 산 형태와 비교하여 프로테아제 분해에 덜 민감하게 만들고 그것들의 극성을 증가시킬 수도 있으며, 그러므로 높아진 치료적 효능을 제공한다. N-말단 지질화 또는 아세틸화가 펩티드의 생체-활성 기능을 변화시키지 않으면서 피부 전체에 걸쳐 펩티드 침투를 개선할 수도 있다는 것이 논의된다 (Samah A, 2011). 그러므로 펩티드가 또한 지질화될 수도 있는데 이것은 향상된 피부 침투를 제공할 수도 있다. C_12-18 지질 - 본 발명의 화합물의 구성요소를 제공하는데 사용될 수 있는 포화 또는 불포화 지방산의 예는 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 미리스트올레산, 팔미톨레산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다.

펩티드는 필요에 따라 그것들의 가용성 성질을 변형시키기 위해 및 표적화된 조직에서 펩티드의 국소적 농도를 증가시키기 위해 가용성 또는 불용성 담체 분자에 컨쥬게이션될 수도 있다. 가용성 담체 분자의 예는 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 및 폴리비닐피롤리돈의 폴리머를 포함하고; 불용성 폴리머의 예는 실리케이트, 폴리스티렌 및 셀룰로스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 펩티드는 그것들의 안정성을 향상시키기 위해 리포솜 기술을 사용하거나 나노 기술을 통해 및 적용 중 및 후에 그것들의 안정성을 향상시키기 위한 제어된 방출을 위해 미세캡슐화될 수도 있다.

본 발명은 , 예를 들어, 제형에서 또는 치료제로서, 상기 설명된 펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 단일 펩티드 , 또는 조합하여 다수의 펩티드의 사용을 수반할 수도 있다. 어떤 경우에, 본 발명의 조성물이 피부 위에, 피부에, 또는 피부 하에 배치된 디바이스 내에 배치될 수 있다. 이러한 디바이스는 수동적 또는 능동적 방출 메커니즘에 의해 피부 또는 모낭에 접촉하도록 하는 방식으로 물질을 방출하는, 경피성 패치, 임플란트, 및 주사를 포함한다. 본원에서 설명된 방법에서 펩티드를 전달하는데 사용된 조성물은 에어로졸, 에멀젼, 액체, 로션, 용액, 겔, 미세캡슐화, 크림, 페이스트, 연고, 분말, 폼, 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 제형의 형태로 되어 있을 수 있다. 게다가, 펩티드는 탈염수/증류수, PBS 또는 표준 의학적 식염수 용액과 같이 덜 관련된 제형을 사용하여 전달될 수 있다.

제형은 선택적으로 미용적 매력을 가질 수도 있고, 및/또는 레티노이드, 비타민 C 또는 본 발명의 펩티드의 치료적 작용을 위해 보조제로서 역할을 할 수 있는 다른 펩티드와 같은 다른 약제를 함유할 수도 있다. 항생제는 또한 감염을 막기 위해 제형에 추가되어, 이로 인해 최대 치유 과정이 발생하게 할 수 있다.

제형은 프로테아제 억제제를 함유할 수도 있다. 프로테아제 억제제는 선택된 생체-활성 펩티드를 분해할 것으로 예상되는 프로테아제를 특이적으로 표적화하기 위해 선택될 수 있으며; 이러한 선택은 생체-활성 펩티드의 길이 및/또는 서열에 기초하여 결정될 것이다. 하지만, 프로테아제 억제제는 반드시 어떤 특이적 방식으로 선택될 필요는 없다; 예를 들어, 둘 이상의 억제제를 함유하는 프로테아제 억제제 칵테일이 본 발명에 이용될 수 있다. 프로테아제 억제제의 다음 타입이 본 발명에 포함될 수 있다: 세린 프로테아제 억제제, 시스테인 프로테아제 억제제, 아스파르테이트 프로테아제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 티올 프로테아제 억제제 및 트레오닌 프로테아제 억제제. 본 발명에서 사용된 프로테아제 억제제는 펩티드 또는 단백질 또는 화학물질일 수도 있다. 억제제의 비-제한 예는 세르핀이며, 이것들은 알파-1-안티트립신, 보체 1-억제제, 안티트롬빈, 알파-1-안티키모트립신, 플라스미노겐 활성제 억제제 1, 및 뉴로세르핀, 또는 본 발명의 펩티드의 치료적 작용을 위해 보조제로서 역할을 할 수 있는, 우르솔릭산 및 트라넥사민산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 화학물질을 포함한다.

본 발명의 펩티드는 피부의 상처를 치료하는데 사용될 수도 있다. 피부 표피는 주로 각질 형성 세포로 만들어진 고도로 동적 층화된 상피로 구성된다. 섬유아세포와 같은 다른 세포 타입이 또한 표피에 있다. 새로운 분화 중인 각질 형성 세포가 상층을 보충하기 위해 표피의 증식성 기저층으로부터 지속적으로 나타나며, 점진적으로 외부 각질화된 것으로 분화하하고 죽은 외피를 박리한다. 각질 형성 세포는 또한 표피와 연속적인 점막 조직의 주요 구성성분이다 (Presland and Dale, 2000). 이러한 조직은 표피의 불투과성, 각질화된 층이 없으며, 입, 코, 목구멍, 귀, 항문 및 생식기와 연관된 이너 라이닝(inner-lining) 표면을 형성한다. 피부와 유사하게, 점막 표면은 신체의 다양한 조직으로 감염원의 진입을 방지하는데 중요하고, 따라서, 이 조직 타입에 대한 손상은 개체의 건강을 약화시킬 수도 있다. 표피층이 , 예를 들어, 열상, 화상 또는 수포로부터 파괴될 때 피부 및 점막 조직 손상이 발생한다. 손상은 또한 파열 또는 멍을 수반할 수 있는데, 이것은 표피의 동시 균열이 없는 조직 손상을 수반한다. 피부 감염, 뿐만 아니라 암 및 자가면역 질환과 같은 특정 만성 질환은 또한 표피 표면 상의 피해가 강요된다. 궤양, 예를 들어, 당뇨병에 영향을 미치는 것들 또는 욕창(pressure sore)에 관련된 것들은 또 다른 형태의 피부 손상이고; 이 상처는 종종 매우 치료하기 어렵고, 염증이 생기고, 감염되기 쉬우며, 너무 긴 치유 과정이 필요하다. 궤양 또는 다른 타입의 만성 상처의 지속은 치유에 수반되는 세포 과정의 실패 때문이다. 상처 치유의 실패는 부분적으로 상처 경계의 각질 형성 세포가 가까운 곳으로 이동하지 않거나 상처를 커버하지 않는다는 점으로 인해 병변을 상피화할 수 없는 능력의 결과일 수도 있다 (Enoch and Price, 2004). 피부 및 점막 상처의 치유는, 부분적으로는, 기저 각질 형성 세포의 활성화를 통해 조율된다. 활성화 시 상처 주변에 위치한 각질 형성 세포는 증식하고 이동하여 상피화로 불리는 과정에서 상처 위에 단층을 형성한다. 각질 형성 세포의 추가 증식 및 분화는 정상 중층을 포함하는 표피층을 확립한다 (Enoch and Price, 2004). 그러므로, 본 발명은 또한 점막 조직에서 각질 형성 세포와 관련된 손상을 치료하는데 사용될 수도 있다. 용어 "관련된 점막 조직"은 피부와 유사한 방식으로 조직화된 어떤 조직에 관한 것이며 상피 세포/각질 형성 세포를 함유한다. 이러한 조직의 예는 구강, 비인두, 귀 및 비뇨생식기 표면, 뿐만 아니라 안검결막(the palpebral conjunctive of the eye)이 있다. 이 조직들에 영향을 미칠 수 있고 본 발명의 펩티드로의 치료를 받아들일 수 있는 상처 또는 병변/손상의 예는 찰과상, 수포, 화상, 열상, 천자, 궤양, 타박상, 발진 및 흉터이다. 수술 후 외상 또한 펩티드로 치료될 수 있다.

또 다른 형태의 표피 손상은 감지하기 어렵고 장시간에 걸쳐 발생하며, 결국 피부 기능을 약화시키는데, 이른바 피부 노화라고 불린다. 피부 노화는 유전적 프로그램, 뿐만 아니라 개체의 수명 전반에 걸쳐 일어나는 누적된 환경적 및 내인성 손상에 의해 영향을 받는다. 피부 노화를 유발하는 두 개의 주요 과정이 있다: 일광 보호된 피부에서 내재적인 것 (생활연령으로 인한 노화) 및 일광-노출 영역에서 외적인 것 (광-노화). 내재적 노화는 유전적 배경을 반영하고 시간에 의존적이다. 이에 상관없이, 피부 노화는 다음 중 하나 이상을 공유한다: 주름, 잔주름, 과다 색소 침착(hyperpigmentation), 광채의 손실, 매끄러움, 탄력, 피부 톤 투명도 및 균일성, 및 모공 외관의 변화. 근본적인 이 가시적 징후는 유전적 성향 이외에 자외선 (UV) 및 오염물질과 같은 환경적 자극의 급성 또는 만성 노출에 의해 유발된 다양한 조직학적 및 세포학적 변화이다. 미용적 문제, 예를 들어, 주름, 건조, 얇아짐, 처짐, 멍 및 일광 화상에 더 큰 민감성은 노화 이외에, 자외선 및 오염물질과 같은 핵산 손상제에 장기적 노출로 인해 너무 이르게 발생할 수도 있는 표피 손상의 보통의 외측 징후이다. 연구는 피부 노화의 가장 주목받는 형태학적 변형이 피부 조직의 점진적 손실이라는 것을 제안한다. 피부 조직의 이 손실은 세포의 손실 및 감소된 세포 증식과 같은 여러 인자에 기인할 수 있다. 표피와 같은 자체-재생 조직에서, 세포 수는 증식, 말기 분화 및 세포 사멸(apoptosis) 사이의 미세한 균형에 의해 엄중히 조절된다 (Robert L, Labat-Robert J and Robert AM. 2009). 그러므로 개시된 펩티드는 노화의 효과를 방지하거나 반전시키기 위해 내재적 및 외적인 자극 모두에 의해 유발된 피부 노화와 관련된 문제에 사용될 수도 있다. 관련된 방식으로, 펩티드는 일광과 같은 다양한 외용제에 노출에 의해 손상된 조직에 적용될 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 관점에서 피부가 더 젊어보이는 외관 및 감촉으로 만들기 위해, 및 더 나은 기능을 제공하기 위해 화장품으로서 사용될 수 있다. 스스로, 또는 화학적 변형 및/또는 특수한 전달을 통해 변화되지 않는 짧은 펩티드는 피부 얇아짐, 주름, 취약성(fragility) 및 조면화(roughening)/경화(hardening)를 유발하는 것에 반하는 과정에 영향을 미치도록 표피를 통해 침투하게 될 수 있다. 각질 형성 세포는 표피 표면의 주요 구성요소이며 노화된 및 손상된 피부에서 줄어들기 때문에, 펩티드 자극에 의한 이것의 보충은 상기 언급된 문제를 반전시킬 것으로 예상된다.

피부는 비교적 탄성이 있지만, 그것의 늘어나는 능력에 대한 제한이 있다. 임신선, 또는 선(striae)은 오프-컬러(off-color) 색깔의 피부 상 흉터의 형태이다. 그것들은 진피의 갈라짐에 의해 유발되는데, 이것은 시간이 흐름에 따라 줄어들 수도 있지만, 완전히 사라지지는 않을 것이다. 그것들은 처음에 불그스름하거나 보라색 선으로 나타나지만, 더 밝은 범위로 점점 퇴색하는 경향이 있다. 임신선은 종종 신속한 성장 또는 신속한 체중 감소와 관련된 신속한 피부 늘어남의 결과이다. 임신선은 눈에 띄는 또는 과도한 늘어남 또는 팽만(distention)을 전혀 경험하지 않은 신체 부위의 어떤 곳에서도 나타날 수 있다. 가장 흔한 장소는 복부, 유방, 위팔, 겨드랑이, 등, 허벅지, 둔부, 및 엉덩이이다. 임신선은 종종 사춘기 및 임신과 같은 생활의 일부 주요 단계의 호르몬 변화에 의해 유발되지만, 코르티코스테로이드 처리, 비만, 미용 수술 및 집중적인 보디 빌딩이 임신선으로 이어질 수도 있다. 코르티코스테로이드의 작용 하에서 각질 형성 세포 및 섬유아세포 둘 다의 성장은 심각하게 손상될 수 있고 그 결과 콜라겐 I 및 III의 합성, 뿐만 아니라 피브로넥틴 합성은 또한 정상 피부와 비교하여 90%까지 크게 감소한다 (Rogalski et al., 2002). 진피/표피 구간에서 각질 형성 세포 기능 회복 및 복원이 임신선 보정에 열쇠가 될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 각질 형성 세포 증식 및 이동을 촉진하고 그러므로 임신선의 치료에 이상적이다.

일반적으로 , 약학적으로 허용 가능한 제형은 인간 피부에서 사용에 적합한 어떤 담체도 포함할 것이다. 이러한 약학적으로 및 미용적으로 허용 가능한 담체는 에탄올, 디메틸 술폭시드, 글리세롤, 실리카, 알루미나, 전분, 및 동등한 담체 및 희석제를 포함한다. 제형은 선택적으로 미용적 매력을 가질 수도 있고, 및/또는 레티노이드 또는 본 발명의 펩티드의 치료적 작용을 위해 보조제의 역할을 할 수 있는 다른 펩티드와 같은 다른 약제를 함유할 수도 있다. 항생제는 또한 감염을 피하기 위해 제형에 추가되어 , 최대 치유 과정이 발생한다. 조성물에서 펩티드의 농도는 약 0.1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL 또는 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 mg/mL일 수 있지만, 이용된 최종적인 농도는 이 범위 밖으로 달라질 수도 있으며, 상처/조직 상태의 성질, 본 발명의 펩티드의 생체 활성 및 향상된 조성물 흡수를 얻기 위한 어떤 보조제 또는 기술의 사용에 의존적이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 조성물이 인간 각질 조직과 접촉될 경우에, 본 발명의 펩티드 외에 어떤 추가적인 구성요소도 각질 조직에 적용에 적합해야 한다; 즉, 조성물로 통합될 때, 이러한 다른 구성요소는 타당한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 부적합성, 불안정성, 알레르기 반응, 등을 입증한다. CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition (1992)는 스킨 케어 산업에서 보통 사용되는 다양한 비-제한 미용적 및 약학적 구성성분을 설명하는데, 이것은 본 발명의 조성물에서 사용에 적합하다. 이 구성성분 등급의 예는 다음을 포함한다: 연마재, 흡착제, 심미적 구성요소, 예를 들어, 방향제, 색소, 착색료/색료, 에센셜 오일, 스킨 센세이트, 수렴제, 등 (예를 들어, 클로브 오일, 멘톨, 장뇌, 유칼리 오일, 유게놀, 멘틸 락테이트, 하마메리스 증류액(witch hazel distillate)), 항-여드름제, 고화 방지제, 소포제, 항미생물제 (예를 들어, 아이오도프로필 부틸카바메이트), 항산화제, 바인더, 생물학적 첨가제, 완충제, 벌킹제, 킬레이트 시약, 화학적 첨가제, 미용용 살생물제, 변성제, 약물 수렴제, 외부 진통제, 필름 형성제 또는 필름 재료, 불투명화제, pH 조절제, 분사제, 환원제, 격리제, 피부 미백제 및 라이트닝제 (예를 들어, 히드로퀴논, 코직산, 아스코르브산, 마그네슘 아스코르빌 포스페이트, 아스코르빌 글루코사민), 피부 컨디셔닝제 (예를 들어, 보습제), 피부 진정제 및/또는 치료제 (예를 들어, 판테놀 및 그것의 유도체, 알로에 베라, 판토텐산 및 그것의 유도체, 알란토인, 비사볼롤, 및 이칼륨 글리시리지네이트), 피부 치료제, 점증제, 및 비타민 및 이것의 유도체.

본 발명의 펩티드 및 관련된 조성물의 투여는 인간 및 모든 포유동물을 포함는 동물에게 이루어질 수도 있다. 적용은 전형적인 및/또는 실험적인 재료, 예를 들어, 조직 이식편, 피부 대체물, 조직 배양 생성물 및 드레싱과 조합하여 이루어질 수도 있다. 예는 거즈 (제직 및 부직, 함침, 비점착, 포장, 괴사 조직 제거); 압박 붕대 및 시스템; 상처 충전재 및 클렌저; 접촉층; 콜라겐; 양막; 무세포 인간 진피; 무세포 매트릭스 및 조합 생성물; 및 보통 사용되는 다양한 드레싱을 포함하지만 , 이에 제한되지 않는다.

일반적으로, 조성물은 국소적으로, 경구로, 경피로, 전신성으로, 또는 본 발명의 펩티드를 표적 조직으로 전달하는 것이 유용할 수 있도록 당업자에게 알려져 있는 어떤 다른 방법에 의해 투여될 수 있다. 조성물은 또한 시험관 내 또는 생체 외 방식으로, 예를 들어, 배양물에서 자라고 있는 세포 또는 환자 이식편에 적용될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 스킨 케어 활성을 발휘하는 하나 이상의 추가적인 약제를 함유할 수 있다. 생체-활성 펩티드 구성요소 외에, 본 발명은 다른 활성제, 예를 들어, 히알루론산, 니아신아미드, 피탄트리올, 파르네솔, 비사볼롤, 살리실산, 레티놀, 레티노산, 알파히드록시산, 아스코르브산 및 알구론산을 함유할 수 있다. 특정 추가적인 활성제는 생체-활성 펩티드 구성요소와 협력하여 상승 작용을 하거나, 또는 제형의 유통기한을 향상시킬 것으로 예상된다.

게다가, 아미노산에 대한 약어는 통상적인 용법을 따른다:

조제약의 제형화 및 투여 기술에 대한 상세한 설명은 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co, Easton Pa.)의 최신판에서 발견될 수도 있다. 국소적 전달이 바람직하지만, 다른 전달 수단도 있다: 예를 들어, 경구, 비경구, 에어로졸, 근육 내, 피하, 경피, 골수 내, 척추강 내, 심실 내, 정맥 내, 복강 내, 또는 비강 내 투여. 본 발명은 많은 담체 비히클, 예를 들어, 스프레이; 에어로졸; 물 및 오일-타입 에멀젼; 오일 및 물-타입 에멀젼; 얼굴 크림 또는 바디 크림; 선 로션 또는 애프터-선(after-sun) 로션; 또는 다른 국소적 투여 비히클로 제형화될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 펩티드, 및 그것들을 함유하는 조성물은 일반적인 스킨 케어 및 화장품 제형, 예를 들어, 다양한 피부 화장품, 피부 크림, 로션, 선크림, 및 항-여드름제와 같은 치료적 로션 또는 크림에 포함되는 유용한 특징을 제공할 수도 있다.

하기 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 구체예를 입증하기 위해 포함된다.

실시예

실시예 1: 세포 이동 및 소창 봉합을 자극하는 펩티드의 확인

인간 피부 각질 형성 세포 (ATCC CRL-2404)를 5ng/ml 인간 재조합 상피 성장 인자 (EOF) (Life Technologies Corporation, Grand Island, N.Y.)가 보충된, 혈청이 없는 각질 형성 세포 성장 배지에서 키웠다. 세포를 12-웰 플레이트로 분주하였고 100% 밀집도에 도달하게 하였다. 세포 단층에 24시간 동안 영양분을 제공하지 않았고 그 다음에 소창을 P200 (200 μl) 피펫 팁을 사용하여 만들었다. 소창을 세척하고 제0 시간에 사진을 촬영하였다. 펩티드를 40 μg/ml의 최종 농도로 추가하였다. 세포를 짧은 시간 동안 실온에서 이미지를 캡쳐할 때를 제외하고는, 37℃, 5% C0₂ 인큐베이터에서 >90% 습도로 유지하였다. 소창 봉합은 7-8시간 처리 후 이어지며 결과는 표 1에서 나타난다.

실시예 2. 정상 인간 피부 각질 형성 세포에서 세포 독성

펩티드가 세포에게 세포 독성이 없다는 것을 확인하기 위해서, 정상 인간 표피 각질 형성 세포를 96-웰 플레이트에 분주하였다. 플레이트를 5% C0₂의 존재 하에 37℃에서 배양하여 세포가 >95% 밀집도로 자라게 했다. 펩티드를 스톡(stock) 용액으로 50, 100, 200, 및 500 μg/ml의 농도로 희석한다. 세포 배양 배지를 다양한 농도로 펩티드를 함유한 신선한 배지로 대체하고 그 다음에 37℃ 및 5% C0₂에서 24시간 동안 배양한다. 처리의 끝에, 세포 생존률을 ATCC (Manassas VA)에서 구입한 MTT 검정 키트를 사용하여 측정하였다. 결과는 표 1에서 나타난다. 50 내지 500 μg/ml의 농도에서 펩티드는 MTT 검정을 사용하여 측정된 바와 같이 세포 생존률을 변화시키지는 않았다.

실시예 3: 세포 증식을 자극하는 펩티드의 확인

정상 인간 피부 각질 형성 세포 (ATCC CRL-2404)를 5ng/ml 인간 재조합 상피 성장 인자 (EGF) (Life Technologies Corporation, Grand Island, N.Y.)가 보충된, 혈청이 없는 각질 형성 세포 성장 배지에서 키웠다. 세포를 현미경으로 매일 검사한다. 배양물이 50-75% 밀집도가 되면, 플레이트의 배지를 빨아내고 0.25% 트립신/EDTA를 추가한다. 세포가 원형이 되거나 떨어지면, 트립신을 신선한 배양 배지의 첨가에 의해 중화시킨다. 세포를 그 다음에 원심분리하고 펠렛을 신선한 배양 배지에서 재현탁한다. 혈구 계산기를 사용하여 세포 현탁액을 계수하고 세포의 총 수를 각 웰에 세포 현탁액 100 μl를 추가함으로써 웰 당 약 500-1000개의 세포로 조정한다. 전형적으로, 중간의 60개의 웰을 사용하고 바깥쪽 웰을 신선한 배지로 채워서 증발을 최소화한다. 6-8시간 배양 후 세포가 각 웰에 부착될 때, PBS를 함유한 신선한 배지 100 μl 또는 2x 원하는 농도의 펩티드를 3배수로 추가한다. 마이크로플레이트를 그 다음에 37℃ 및 5% C0₂에서 48-72시간 동안 배양한다.

배양의 끝에 세포는 제조사의 지시에 따라 CYTOSCAN™ SRB 세포 독성 검정 (GBiosciences Company, St. Louis, MO)을 받는다. 간략히 말하면, 세포를 수포로다민 B (SRB) 염색 전에 고정하였다. 광번위한 세척 후 색을 가용화 버퍼를 사용하여 가용화한다. 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 565nm에서 측정하였다. 표 1에서 나타난 결과는 3배수 처리의 평균 값이며 120이 넘는 값이 유의한 것으로 간주된다.

실시예 4. 유전자 프로파일링 분석

상처 치유, 세포 외 기질 및 접착 분자를 암호화하는 84개의 유전자를 Sunny Biodiscovery, Inc (Santa Paula, CA)에 의해 실행된 PCR 어레이를 사용하여 분석하였다. 간략히 말하면, EPIDERM™ 피부 대체물을 MatTek (Ashland, MA)으로부터 얻었고 제조사의 지시에 따라 처리하였다. 하룻밤 동안 평형화 후, 배지를 교체하였고 10개의 전층 피부 자창을 20G 바늘로 만들었으며 HB2235 (330μg/ml) 또는 물 대조군을 피부 조직의 맨 위에 2배수로 적용하였고 24시간 동안 처리를 허용하였다. 두 개의 정상 비-부상 조직의 세트를 또한 부상 및 정상 조직 사이의 유전자 프로파일링을 알아보기 위한 대조군으로 사용하였다. 처리의 끝에 조직을 수거하여 RNAlater 용액 (Ambion, Austin, TX)에서 보존하였다. RNA를 추출하여 Illustra mini RNAspin 키트 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)로 정제하였다. 정제된 전체 RNA를 Agilent HP-8452A 다이오드 어레이 분광광도계로 260nm 및 280nm에서 평가하였다. RNA의 농도를 샘플 전반에 걸쳐 균등화하였고 원하는 유전자의 발현을 제1 가닥 합성 키트와 함께 , PCR 어레이 PAHS-121A를 사용하는 BioRad iCycler iQ Detection System로 실시간 정량적 PCR에 의해 측정하였다. Qiagen의 SYBR Green 마스터 믹스 및 PCR 실행 조건. RT2 Profiler PCR Array Data 분석 버젼 3.5 소프트웨어에 있는 5개의 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)에 대한 유전자 발현의 표준화 후, 효율적인 ΔΔCt 방법을 결과의 정량에 사용하였다. 발현의 수준이 상당히 높고 (30 주기 미만에서 검출됨) 조절은 각각의 2배수 시리즈에서 1.5 이상이면 유전자는 별도로 발현된 것으로 간주된다.

본원에서 개시되고 주장된 모든 조성물 또는 방법은 본 개시물에 비추어 과도한 실험 없이 만들어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구체예의 측면에서 설명되는 한편, 변화는 본 발명의 개념, 사상 및 범위에서 벗어나지 않으면서 조성물 및/또는 방법에 및 본원에서 설명된 방법의 단계 또는 단계의 순서에서 적용될 수도 있다는 것이 당업자에게 분명할 것이다. 더 구체적으로는, 화학적으로 및 생리학적으로 관련된 특정 약제들은 본원에서 설명된 약제로 대신할 수 있지만 같거나 유사한 결과가 달성될 것이 분명할 것이다. 당업자에게 분명한 모든 이러한 유사한 대체 및 변형은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

본 출원에서 확인된 모든 특허 및 공보는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

참고문헌

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서열 목록

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<223> Peptide HB2263

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<220>

<223> Peptide HB2234

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1

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Claims

펩티드의 서열이 서열 번호: 1 (EKMGRN)의 4 내지 6개의 인접한 아미노산 잔기로 구성된 분리된 펩티드.
제1 항에 있어서, 서열 번호: 1 (EKMGRN), 서열 번호: 2 (KMGRN), 서열 번호: 3 (EKMGR), 서열 번호: 4 (EKMG) 또는 서열 번호: 5 (MGRN)를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제1 항에 있어서, L- 및 D-아미노산 이성질체 중 하나 또는 둘 다를 포함하거나 또는 담체 분자에 컨쥬게이션되거나, 아미드화되거나, 또는 지질화되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제1 항에 있어서, 유리 산 형태로 되어 있는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 따르는 적어도 하나의 펩티드 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
제5 항에 있어서, 펩티드는 약 0.1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 또는 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 mg/mL의 범위에 있는 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제5 항에 있어서, 조성물은 에어로졸, 에멀젼, 액체, 로션, 용액, 겔, 미세캡슐화, 크림, 페이스트, 연고, 분말 또는 폼의 형태로 되어 있거나 피부 또는 점막 조직의 표면에 또는 피부 조직 하에 적용을 위해 개조된 디바이스에 통합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
유효한 시간 동안 치료적 유효량으로 적용될 때 포유동물의 상처를 치유하는데 사용되는 조성물로서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 및 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 따르는 적어도 하나의 펩티드를 포함하는 조성물.
제8 항에 있어서, 상처는 상기 포유동물의 피부 또는 관련된 점막 조직에 영향을 미치는 것을 특징으로 하는 조성물.
제9 항에 있어서, 상처는 찰과상, 수포, 화상, 열상, 궤양, 타박상, 발진, 흉터, 임신선 또는 노화 또는 환경적 노출의 효과 때문인 것을 특징으로 하는 조성물.
제5 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 스킨 케어 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제5 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 화장품에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
포유동물의 피부 또는 점막 조직 상처 치료용 의약품의 제조에 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 따르는 펩티드의 사용.
제13 항에 있어서, 상처는 찰과상, 수포, 화상, 열상, 궤양, 타박상, 발진, 흉터, 임신선 또는 노화 또는 환경적 노출의 효과 때문인 것을 특징으로 하는 사용.
포유동물의 피부 또는 점막 조직의 상처를 치료하는 방법으로서, 서열 번호: 1 (EKMGRN)의 4 내지 6개의 인접한 아미노산 잔기로 구성된 서열을 갖고 있는 펩티드를 포함하는 조성물을 상처 부위에 적용하는 단계를 포함하는 방법.
제15 항에 있어서, 펩티드는 서열 번호: 1 (EKMGRN), 서열 번호: 2 (KMGRN), 서열 번호: 3 (EKMGR), 서열 번호: 4 (EKMG) 또는 서열 번호: 5 (MGRN)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15 항에 있어서, 펩티드는 L- 및 D-아미노산 이성질체 중 하나 또는 둘 다를 포함하거나 또는 담체 분자에 컨쥬게이션되거나 아미드화되거나 또는 지질화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15 항에 있어서, 펩티드는 유리 산 형태로 되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제15 항에 있어서, 상처는 찰과상, 수포, 화상, 열상, 궤양, 타박상, 발진, 흉터, 임신선 또는 노화 또는 환경적 노출의 효과 때문인 것을 특징으로 하는 방법.