KR20150092641A

KR20150092641A - 신규효소와 이를 이용한 아스코르브산 배당체의 제조방법

Info

Publication number: KR20150092641A
Application number: KR1020140013250A
Authority: KR
Inventors: 윤태중; 조재형; 서민호; 차혁진
Original assignee: 엘에스엠 주식회사
Priority date: 2014-02-05
Filing date: 2014-02-05
Publication date: 2015-08-13
Also published as: KR101614924B1

Abstract

본 발명은 아스코르브산 AA2G 생산을 위해 필요한 당류 전이 활성효소인 CGTase를 고활성으로 개량한 개량 CGTase 및 그를 이용한 효과적인 AA2G 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

Description

신규효소와 이를 이용한 아스코르브산 배당체의 제조방법{Novel enzyme and method for preparing ascorbic acid glycoside using the same}

본 발명은 신규효소 및 그를 이용한 아스코르브산 배당체의 제조방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 효소개량을 통해 얻은 신규효소 및 그를 이용하여 아스코르브산 배당체의 생산량을 향상시킨 제조방법에 관한 것이다.

L-아스코르브산(L-ascorbic acid)은 황산화 작용을 가진 물질로서 수용성 비타민으로 비타민C 라고도 하는데 약학 제제, 사료, 멜라닌색소의 축적억제, 의료약품, 화장품을 포함한 다양한 산업적응용에 사용되고 있다. 그러나 L-아스코르브산은 매우 불안정한 화합물로 산화조건 및 열조건에 불안정하여 제조과정에서 열, 공기, 빛에 노출되면 활성을 잃어버린다. 이러한 문제를 해결하기 위해 안정적이고 다양한 형태의 비타민 C 유도체가 개발되어 사용되고 있는데 대표적으로 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산(2-o-α-D-glucopyranosyl L-ascorbic acid, 이하, 'AA2G'로 약칭함)을 들 수 있다. 일반적으로 아스코르브산과 덱스트린을 원료로 하여 바실러스균 유래의 효소인 시클로말토 덱스트린 클리칸트란스페아제(cyclomaltodextrin glucanotransferase, 이하, 'CGTase'로 약칭함)(EC 2.4.1.19)의 효소반응에 의해 제조된다. 또한, AA2G의 생산은 기존 전분에서 합성하는 비타민 C가 아닌 천연 비타민 C를 이용하여 생산할 수 있는데 대표적인 것으로 비타민나무(Hippophae rhamnoides L.)를 이용한다. 중국, 몽골 등이 원산지인 보리수과(Elaeagnacease)에 속하는 낙엽송 관목인 비타민나무는 잎과 열매에 비타민과 아미노산을 포함하고 있어 면역강화와 항염작용 등의 효과가 있는 것으로 보고되고 있고 토코페놀, 카로티노이드, 폴리페놀 및 플라보노이드 등의 생리활성 물질이 함유되어 있는 것으로 알려졌다.

대한민국 등록특허 제1013195호는 L-아스코르빈산과 α-글루코실 당화합물을 함유하는 용액에 α-이소말토실글루코 당질생성효소 또는 α-이소말토실글루코 당질생성효소와 CGTase를 작용시켜 AA2G를 생산하는 방법을 개시하고 있다.

본 발명은 아스코르브산 AA2G 생산을 위해 필요한 당류 전이 활성효소인 CGTase를 고활성으로 개량한 개량 CGTase 및 그를 이용한 AA2G 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 시클로말토 덱스트린 클리칸 트란스페아제 활성을 갖는 폴리펩티드가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 벡터로 형질전환된 비인간 형질전환체가 제공된다.

본 발명의 다른 일관점에 따르면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포 준비단계;

상기 형질전환 숙주세포를 배양배지에서 배양하는 형질전환 숙주세포 배양단계; 및

상기 배양된 형질전환 숙주세포로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 상기 폴리펩티드의 생산방법이 제공된다.

본 발명의 다른 일관점에 따르면, a) 상기 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드가 포함된 세포 파쇄액; b) 아스코르브산; 및 c) 다당체를 상기 폴리펩티드가 작동하는 조건하에서 반응시키는 단계를 포함하는 아스코르브산 배당체의 생산방법이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 아스코르브산 생산 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포 준비단계;

상기 형질전환 숙주세포를 다당체 함유 배양배지에서 배양하는 배양단계; 및

상기 배양된 형질전환 숙주세포 또는 배양액으로부터 아스코르브산 배당체를 회수하는 단계를 포함하는 아스코르브산 배당체의 생산방법이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포 준비단계;

a) 천연 비타민 C를 함유한 식물체로부터 추출된 천연 아스코르브산과 다당체를 함유한 배양배지에서 상기 형질전환 숙주세포를 배양하거나,

b) 상기 형질전환 숙주세포의 파쇄액을 포함하는 반응액에 상기 천연 아스코르브산 및 다당체를 첨가하여 반응시키는 아스코르브산 배당체 제조단계; 및

상기 배양된 형질전환 숙주세포 또는 반응액으로부터 아스코르브산 배당체를 회수하는 단계를 포함하는, 아스코르브산 배당체의 생산방법이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 안정적인 L-아스코르브산의 당유도체 AA2G 생산에 당류 전이 활성효소인 CGTase를 무작위 돌연변이(random mutation)방법을 이용해 고활성으로 개량하여 생산반응에 이용하므로서 종래의 생산량과 비교하여 현저히 높은 AA2G 생산 수율을 나타내었고 미지의 물질도 생성되지 않아 생산효율성 향상과 획기적인 비용절감 효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 대장균 내에서 CGTase가 발현하는 재조합 균주 벡터의 그림이다.
도 2는 도 1의 재조합균주의 세포파쇄액을 이용한 AA2G 생산반응 결과분석사진이다.
도 3은 무작위 돌연변이된 CGTase를 이용하여 AA2G의 생산량을 분석한 그래프이다.
도 4는 도 1의 CGTase와 도 3의 돌연변이 CGTase의 아미노산 서열을 분석한 그림이다.
도 5는 비타민나무에서 아스코르브산을 추출하여 HPLC 방법으로 함유량을 분석한 그래프이다.
도 6은 본 발명 일 실시예에 따른 고활성으로 개량한 CGTase와 비타민나무에서 추출한 아스코르브산을 이용하여 AA2G의 생산량을 분석한 그래프이다.

본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.

본 문서에서 사용되는 "아스코르브산 배당체(ascorbic acid glycoside)" 는 직접 환원성을 보이지 않고, 안정성이 뛰어나며 또한 생체 내에서 용이하게 가수분해 되어 L-아스코르브산 본래의 생리활성을 발휘하는 L-아스코르브산의 당유도체로, α-1,4 결합 형식을 통해 결합된 1-7개의 글루코실 그룹으로 된 α-D-글루코실 그룹을 가지고 있고 이러한 α-D-글루코실 그룹은 2 번째 탄소원자에 있는 최소한 1차 알코올 그룹에 결합되어 있다. 이러한 아스코르브산 배당체에는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토트리오실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토테트라오실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토펜타오실-L-아스코르브산, 및 2-0-α-D-말토헥사오실-L-아스코르브산 등이 포함되며, 이중 AA2G는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 의미한다. 상기 아스코르브산 배당체의 반응방법은 L-아스코르브산과 α-다당류를 함유하는 용액에 당 전이효소를 단독으로 또는 당쇄절단효소와 더불어 작용시켜 주어 실시한다. 상기 당쇄절단효소로 대표적인 것은 글루코실아밀라제이며, 본 발명의 일 실시예에 따른 방법에서는 미생물로부터 유래된 글루코아밀라아제를 사용하였으나, 기타 다른 동물 또는 식물 유래의 효소도 사용이 가능하다.

본 문서에서 사용되는 "AA2G(2-o-α-D-glucopyranosyl L-ascorbic acid)"는 산화조건 및 열조건에 불안정한 아스코르브산의 문제를 해결하기 위해 개발된 유도체로 아스코르브산의 2위치의 수산기가 글루코스 1분자로 알파-치환 되어 자동산화를 받기 어렵고, 직접 환원성을 보이지 않으며 분자로써의 안정성이 충분하게 보존 유지되어 생체 내에서 용이하게 가수분해 되는 L-아스코르브산 당 유도체를 의미한다.

본 문서에서 사용되는 "CGTase"는 바실러스 마세란스(Bacillus macerans)에 의해 제조되는 특수한 전이효소로서 최근에 바실러스 스테아로테르모필러스(Bacillus stearothermophilus) 및 바실러스 서클란스(Bacillus circulans) 종(種)과 같은 기타 미생물에 의해서 제조될 수 있다는 사실을 발견하였다. 일반적으로 가수분해 및 (1→4)-α-D-글루코시드 결합의 형성 및 특히 다당류로부터 시클릭 말토덱스트린의 형성뿐만 아니라 선형 올리고당류의 불균화 반응(disproportionation)을 촉매화한다. 상기 전이효소는 적당한 효소 감수성을 가진 α-글루코실 당 화합물과 L-아스코르브산을 함유하는 용액에 작용시켰을 경우 분해되는 일이 없이 α-글루코실 그룹 하나 또는 몇개를 L-아스코르브산의 적어도 2번째 탄소원자에 전이시켜 주는 것을 말하며 CGTase의 양은 α-글루코실당 화합물 1 그램당 약 0.01 내지 50 U의 범위에서 선택되며 여기서 말하는 CGTase의 효소활성을 나타내는 단위는 20 mM의 초산완충액(pH 5.5) 및 2 mM의 염화칼슘을 포함하는 0.3%(w/v)의 전분용액에 CGTase를 첨가하고, 40℃, 10분간 반응하는 것으로 측정하고, 그 효소활성 1 U는 15 mg의 용액상(狀) 전분의 요오드 소정색(呈色)을 완전히 소실시키는 효소량으로 한다.

본 문서에서 사용되는 "비타민나무(Hippophae rhamnoides L.)"는 중국, 몽골 등이 원산지인 보리수과(Elaeagnacease)에 속하는 낙엽성 관목으로 러시아, 유럽, 캐나다, 중국, 몽골 등에 폭넓게 자생하고 있다. 우리나라에서는 산자나무라 불리는데 사과보다 비타민C 함유량이 200배 높다. 이 나무에는 비타민, 아미노산, 미네랄 등이 높은 영양가가 잎, 과육, 과피 및 씨 안에 포함돼 있다. 특히, 열매에는 폴리페놀류(polyphenols), 토코페롤(tocopherols), 카로티노이드(carotenoids), 플라보노이드(flavonoids) 등이 함유되어 있고, 잎에는 쿠에르세틴(quercetin), 갈산(gallic acid), 탄닌(tannin) 등의 생리활성물질이 함유되어 있는 것으로 알려졌다. 나무는 통상 2~10 m정도 성장하고 6종과 12아종으로 유럽대륙과 아시아대륙의 온화한 위도 지역에 폭넓게 생식한다. 나무에는 수컷과 암컷이 있고 수컷은 년중 잎과 가지를 생산하게 되며 암컷은 열매를 생산한다. 영양소가 풍부한 잎은 건강 차나 고품질 사료를 만드는데 사용되며 가지는 딱딱한 나무의 성질이기 때문에 양질의 연료가 된다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성될 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포 준비단계; 상기 형질전환 숙주세포를 배양배지에서 배양하는 형질전환 숙주세포 배양단계; 및 상기 배양된 형질전환 숙주세포로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 상기 폴리펩티드의 생산방법이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, a) 상기 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드가 포함된 세포 파쇄액; b) 아스코르브산; 및 c) 다당체를 상기 폴리펩티드가 작동하는 조건하에서 반응시키는 단계를 포함하는, 아스코르브산 배당체의 생산방법이 제공된다.

상기 생산방법에 있어서, 상기 다당체는 말토올리고당, 말토덱스트린, 시클로덱스트린, 아밀로스, 아밀로펙틴, 용성(溶性) 전분, 액화(液化) 전분, 호화(糊化) 전분 또는 글리코겐일 수 있다.

아울러 상기 생산방법은 당쇄절단효소로 반응시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 생산방법에 있어서, 상기 아스코르브산은 비타민 C를 함유하고 있는 식물체 유래의 아스코르브산, 균주로부터 발효공정에 의해 생산된 아스코르브산 또는 화학합성 아스코르브산일 수 있고, 상기 식물체는 비타민나무(Hippophae rhamnoides L.), 까무 까무(Camu camu), 아세로라(Acerola), 로즈힙(Rose hips), 레몬, 블랙커런트(Black currant), 히비스커스(Hibiscus), 오렌지 또는 블루베리일 수 있다.

상기 생산방법에 있어서, 상기 아스코르브산 배당체는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토트리오실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토테트라오실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토펜타오실-L-아스코르브산, 및 2-0-α-D-말토헥사오실-L-아스코르브산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 아스코르브산 생산 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포 준비단계;상기 형질전환 숙주세포를 다당체 함유 배양배지에서 배양하는 배양단계; 및 상기 배양된 숙주세포 또는 배양액으로부터 아스코르브산 배당체를 회수하는 단계를 포함하는, 아스코르브산 배당체의 생산방법이 제공된다.

상기 아스코르브산 생산 숙주세포는 본 발명의 기술분야에서 잘 알려져 있다. 이러한 미생물로는 유전공학 기법으로 재조합된 박테리아, 효모 및 미세조류가 보고되고 있다(Bermus et al., J. Bacteriol., 124: 196-205, 2006).

상기 방법에 있어서, 상기 다당체는 말토올리고당, 말토덱스트린, 시클로덱스트린, 아밀로스, 아밀로펙틴, 용성(溶性) 전분, 액화(液化) 전분, 호화(糊化) 전분 또는 글리코겐일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 아스코르브산 배당체는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토트리오실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토테트라오실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토펜타오실-L-아스코르브산, 및 2-0-α-D-말토헥사오실-L-아스코르브산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포 준비단계; a) 천연 비타민 C를 함유한 식물체로부터 추출된 천연 아스코르브산과 다당체를 함유한 배양배지에서 상기 형질전환 숙주세포를 배양하거나, b) 상기 형질전환 숙주세포의 파쇄액을 포함하는 반응액에 상기 천연 아스코르브산 및 다당체를 첨가하여 반응시키는 아스코르브산 배당체 제조단계; 및 상기 배양된 숙주세포 또는 반응액으로부터 아스코르브산 배당체를 회수하는 단계를 포함하는, 아스코르브산 배당체의 생산방법이 제공된다.

상기 생산방법에 있어서, 상기 식물체는 비타민나무(Hippophae rhamnoides L.), 까무 까무(Camu camu), 아세로라(Acerola), 로즈힙(Rose hips), 레몬, 블랙커런트(Black currant), 히비스커스(Hibiscus), 오렌지 또는 블루베리일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: CGTase를 발현하는 벡터제조

본 발명의 일 실시예에 따른 아스코르브산 배당체인 AA2G(2-o-α-D-glucopyranosyl L-ascorbic acid)를 생산하기 위해 당류 전이 활성 효소인 CGTase가 발현하는 벡터를 제조하였다.

상기 CGTase를 암호화하는 DNA는 대한민국 특허 제75123호에 개시된 CGTase 염기서열을 이용하여 합성하였다(바이오니아㈜, 대한민국). 상기 합성한 CGTase 유전자 앞뒤로 NcoI, SalI 제한효소를 달기 위해 정방향 프라이머(5'-AAAAAACCATGGCTGCTGGAAATCTTAATAAGG-3', 서열번호 3)과 역방향 프라이머(5'-AAAAAAGTCGACTTAGTTCTGCCAATCCACTAT-3', 서열번호 4)을 이용하여 95℃에서 5분간 변성한 후, 94℃ 30초, 59℃ 30초 및 72℃ 1분을 30 회 반복하고, 72℃에서 5분간 연장반응을 수행함으로써 PCR을 수행하였다. 그 후, PCR 반응산물을 제한효소인 NcoI, SalI을 처리하여 절단하고 발현 벡터인 pTRC99a의 동일 제한효소 자리로 삽입하였으며 대장균 TOP10F으로 형질전환함으로써, 당류 전이 활성 효소인 CGTase를 발현하는 pTRC99a-CGTase 재조합 균주를 완성하였다(도 1).

실시예 2: 재조합 균주를 이용한 AA2G 생산 방법

2-1: CGTase 효소가 포함된 세포파쇄액 생산

상기 제조한 pTRC99a-CGTase를 포함한 재조합 대장균을 배양 및 IPTG를 이용하여 CGTase의 발현을 유도 하였으며 세포내에서 만들어진 CGTase를 이용해 AA2G의 생산을 시도하였다.

구체적으로, 재조합 균주가 도말 되어있는 플레이트로 부터 콜로니 하나를 50 μg/ml 앰피실린 함유 LB 배지 10 ml에 접종한 뒤 하룻밤 동안 진탕배양하였다. 1 L의 50 μg/ml 앰피실린 함유 LB 배지에 진탕배양한 10 ml LB 배지를 첨가하여 OD₆₀₀=0.6~0.7까지 배양한 후, IPTG 0.1 mM을 첨가하여 12시간 동안 배양함으로써 CGTase의 발현을 유도하였다. 그 후, 4,000 rpm으로 30분간 원심분리를 실시하여 상등액을 버리고 수득된 펠렛을 0.1 M 아세테이트 용액(pH 4.0) 50 ml에 현탁하고 글래스비드(0.1mm) 2 g 첨가 후 vortex를 이용해 5분간 파쇄하였다. 상기 파쇄액은 4,000 rpm으로 30분간 원심분리한 후 CGTase 효소가 포함된 상등액 50 ml을 AA2G 생산에 이용하였다.

2-2: AA2G 생산 반응 방법

본 발명자는 상기 제조한 CGTase 효소가 포함된 세포파세액을 AA2G 생산반응에 이용하였다.

구체적으로, 말토덱스트린 200 g, L-아스코르브산 50 g을 0.1 M 아세테이트 용액(pH 4.0)에 녹이고 앞서 제조한 세포파쇄액 50 ml을 첨가하여 총 볼륨 1,000 ml로 고정하였다. 그 후 65℃, 200 rpm으로 72시간 반응하였고 효소 불활성화를 위해 95℃에서 1시간 동안 방치하였다. 또한, 글루코아밀라제(EC 3.2.1.3)를 처리하여 50℃에서 6시간 반응하였고 마찬가지로 효소불활성화를 위해 95℃에서 1시간 동안 방치한 후에 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 AA2G 생산량을 분석하였다. AA2G 생산량 분석은 Agilent 1260 system을 이용하여 150 x 4.6 mm 유기산 컬럼(YMC-Triart C18)에 시료를 적재한 후, 유량 0.7 ml/min의 0.05% H₃PO₄ 함유 0.05 M KH₂PO₄, H₃PO₄(pH 2.5)를 이동상으로 주입하고 22℃ 조건에서 30분 동안 전개하여 용출액을 분리한 후, 240 nm 파장에서의 흡광도를 측정함으로써 수행하였다

그 결과, 약 1.6 g/L의 AA2G 생산량을 보였으며 아스코르브산과 AA2G 외에 기타 미지의 물질(Unknown matter)이 탐지되었다(도 2).

실시예 3: 효소 개량을 통한 생산수율 향상

3-1: 고활성 CGTase의 제조

본 발명자는 상기 대한민국 특허 제75123호에 개시된 CGTase를 암호화하는 핵산서열을 이용한 AA2G의 생산반응 결과 목적하는 수율을 얻지 못하여 무작위 돌연변이(Random mutation)방법을 통한 효소개량을 시도하였다.

구체적으로, 돌연변이 유도를 위해 우선 상기 실시예 1과 동일한 PCR 반응을 수행하여 수득한 PCR 산물을 pGEMT Easy 벡터(Promega, USA)에 삽입함으로써 pGEMT Easy-CGTase 벡터를 제조하였고, 상기 벡터 내의 CGTase 유전자에 무작위 돌연변이 방법을 적용하기 위하여 아질런트 테크놀로지사의 Gene Morph Ⅱ 무작위 돌연변이화 키트를 이용하였다. 무작위 돌연변이된 PCR 반응산물은 제한효소 NcoI, SalI으로 처리하여 pTRC99a 벡터내로 삽입하였고 대장균 TOP10F'로 형질전환하여 재조합 균주를 제조하였다. 상기 재조합 균주를 이용하여 생성된 콜로니 2,000 여개들은 모두 상기 실시예 2와 동일한 방법을 통해 AA2G 생산량 확인에 사용되었다.

그 결과, 상기 실시예 2-2의 실험결과와 비교하여 약 10배 이상 즉 약 15.3 g/L의 AA2G 생산량을 보인 돌연변이 균주를 수득하였고, 이 경우 아스코르브산과 AA2G 외 다른 물질이 탐지되지 않았다(도 3).

1-2: 돌연변이 CGTase의 아미노산 서열 분석

본 발명자는 상기 실시예 3에서 수득한 돌연변이 CGTase 유전자의 핵산서열을 핵산서열 분석기를 통해 분석하였으며(서열번호 2), 그로부터 추론되는 아미노산 서열을 결정하였다(서열번호 1). 상기 실시예 1에서 사용한 Bacillus stearothermophilus CGTase와 상기 실시예 3에서 사용한 돌연변이 CGTase 아미노산 서열을 비교한 결과 총 6개 아미노산에서 돌연변이가 발생되었음을 확인하였다(도 4).

실시예 4: 천연 비타민 C를 이용한 AA2G 생산

기존 전분에서 합성하는 비타민 C가 아닌 천연 비타민 C를 이용한 AA2G 생산에 상기 실시예 3-1에서 제조한 고활성 CGTase를 사용하였다.

4-1: 천연 비타민 C 추출 공정

AA2G 생산을 위한 천연 비타민 C는 비타민나무 열매로부터 추출하였다.

구체적으로, 수확된 비타민나무 생과에서 썩거나 상품성이 떨어지는 것을 분류하고 생과의 표면에 부착된 먼지, 잡균 및 오염물 등의 이물질 제거를 위한 세척을 실시하였다. 상기 세척 공정은 수세 및 초음파 세척기 등의 통상적인 방법도 가능하나 생과에 포함되어 있는 비타민 C의 손실을 최소화하기 위해서 필터공정을 거친 공기(Air)를 분무하여 세척하였다. 상기 세척, 건조한 비타민나무 열매 5 g을 각각 에탄올 0, 10, 20, 40, 60, 80 및 100%(부피 50 ml)에 첨가 후 실온에서 48시간 동안 방치하였다. 이 후 여과 및 농축과정을 거치고 동결 건조하여 추출물을 획득하였다. 상기 추출물은 증류수 50 ml에 녹여 그 중 20 μl를 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 통해 비타민 C의 함량을 확인하였다.

그 결과, 40%의 에탄올 추출물에서 가장 많은 함유량의 아스코르브산이 관찰되었다. 40% 추출물(3.8 g)으로부터 0.33 g의 천연 비타민C 가 추출됨을 확인하였다(도 5).

4-2: AA2G 생산 공정

상기 추출한 비타민나무 열매 유래의 천연 비타민 C와 상기 실시예 3-1에서 제조한 CGTase를 이용하여 AA2G를 생산하였다.

구체적으로, 말토덱스트린 200 g, 상기 실시예 4-1에서 추출한 비타민 열매 40% 에탄올 추출물 100 g(AsA 함량-약 8.6 g)을 0.1 M 아세테이트 용액(pH 4.0)에 녹이고 실시예 3-1에서 제조된 변이 균주 파쇄액 50 ml을 첨가하여 총 볼륨 1,000 ml로 고정하였다. 그 후 65℃, 200 rpm으로 72시간 반응하였고 효소 불활성화를 위해 95℃에서 1시간 동안 방치하였다. 또한, 글루코아밀라제(EC 3.2.1.3)를 처리하여 50℃에서 6시간 반응하였고 다시 효소 불활성화를 위해 95℃에서 1시간 동안 방치한 후에 HPLC를 이용하여 AA2G 생산량을 분석하였다.

그 결과, 비타민나무 열매 유래의 천연 비타민 C를 이용한 AA2G 생산량은 약 4.8 g/L 수율을 나타내었다(도 6).

본 발명은 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허 청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> LSM CO. , LTD <120> Novel enzyme and method for preparing ascorbic acid glycoside using the same <130> PD13-0988 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 680 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified CGTase <400> 1 Ala Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr Ser Asp Val Val Tyr Gln 1 5 10 15 Ile Val Val Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Pro Ser 20 25 30 Gly Ala Leu Phe Ser Ser Gly Cys Thr Asn Leu Arg Lys Tyr Cys Gly 35 40 45 Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr 50 55 60 Asp Met Gly Val Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val 65 70 75 80 Phe Ser Val Met Asn Asp Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr His Gly Tyr 85 90 95 Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Pro Asn Pro Phe Phe Gly Thr Leu Ser 100 105 110 Asp Phe Gln Arg Leu Val Asp Ala Ala His Ala Lys Gly Ile Lys Val 115 120 125 Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Ser Glu Thr Asn 130 135 140 Pro Ser Tyr Met Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn Gly Thr Leu Leu 145 150 155 160 Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Ala Asn Met Tyr Phe His His Asn Gly Gly 165 170 175 Thr Thr Phe Ser Ser Leu Glu Asp Gly Ile Tyr Arg Asn Leu Phe Asp 180 185 190 Leu Ala Asp Leu Asn His Gln Asn Pro Val Ile Asp Arg Tyr Leu Lys 195 200 205 Asp Ala Val Lys Met Trp Ile Asp Met Gly Ile Asp Gly Ile Arg Met 210 215 220 Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Leu Met Asp 225 230 235 240 Glu Ile Asp Asn Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu 245 250 255 Ser Glu Asn Glu Val Asp Ala Asn Asn His Tyr Phe Ala Asn Glu Ser 260 265 270 Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Gly Gln Lys Leu Arg Gln Val 275 280 285 Leu Arg Asn Asn Ser Asp Asn Trp Tyr Gly Phe Asn Gln Met Ile Gln 290 295 300 Asp Thr Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Val Leu Asp Gln Val Thr Phe Ile 305 310 315 320 Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Met Ile Asp Gly Gly Asp Pro Arg 325 330 335 Lys Val Asp Met Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro 340 345 350 Asn Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro 355 360 365 Asn Asn Arg Lys Met Met Ser Ser Phe Asn Lys Asn Thr Arg Ala Tyr 370 375 380 Gln Val Ile Gln Lys Leu Ser Ser Leu Arg Arg Asn Asn Pro Ala Leu 385 390 395 400 Ala Tyr Gly Asp Thr Glu Gln Arg Trp Ile Asn Gly Asp Val Tyr Val 405 410 415 Tyr Glu Arg Gln Phe Gly Lys Asp Val Val Leu Val Ala Val Asn Arg 420 425 430 Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ser Ile Thr Gly Leu Phe Thr Ala Leu Pro 435 440 445 Ala Gly Thr Tyr Thr Asp Gln Leu Gly Gly Leu Leu Asp Gly Asn Thr 450 455 460 Ile Gln Val Gly Ser Asn Gly Ser Val Asn Ala Phe Asp Leu Gly Pro 465 470 475 480 Gly Glu Val Gly Val Trp Ala Tyr Ser Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ile 485 490 495 Ile Gly His Val Gly Pro Met Met Gly Gln Val Gly His Gln Val Thr 500 505 510 Ile Asp Gly Glu Gly Phe Gly Thr Asn Thr Gly Thr Val Lys Phe Gly 515 520 525 Thr Thr Ala Ala Asn Val Val Ser Trp Ser Asn Asn Gln Ile Val Val 530 535 540 Ala Val Pro Asn Val Ser Pro Gly Lys Tyr Asn Ile Thr Val Gln Ser 545 550 555 560 Ser Ser Gly Gln Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Asn Phe Glu Val Leu Thr 565 570 575 Asn Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Thr Thr Asn 580 585 590 Leu Gly Gln Asn Ile Tyr Ile Val Gly Asn Val Tyr Glu Leu Gly Asn 595 600 605 Trp Asp Thr Ser Lys Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Val Tyr 610 615 620 Ser Tyr Pro Thr Trp Tyr Ile Asp Val Ser Val Pro Glu Gly Lys Thr 625 630 635 640 Ile Glu Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asp Ser Gln Gly Asn Val Thr Trp 645 650 655 Glu Ser Gly Ser Asn His Val Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Thr Thr Gly 660 665 670 Lys Ile Ile Val Asp Trp Gln Asn 675 680 <210> 2 <211> 2043 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified CGTase <400> 2 gctggaaatc ttaataaggt aaactttaca tcagatgttg tctatcaaat tgtagtggat 60 cgatttgtgg atggaaatac atccaataat ccgagtggag cattatttag ctcaggatgt 120 acgaatttac gcaagtattg cggtggagat tggcaaggca tcatcaataa aattaacgat 180 gggtatttaa cagatatggg tgtgacagcg atatggattt ctcagcctgt agaaaatgta 240 ttttctgtga tgaatgatgc aagcggttca gcctcctatc atggttattg ggcgcgcgat 300 ttcaaaaagc caaacccgtt ttttggtacc ctcagtgatt tccaacgttt agttgatgcc 360 gcacatgcaa aaggaataaa ggtaattatt gactttgccc ccaaccatac ttctcctgct 420 tcagaaacga atccttctta tatggaaaac ggacgactgt acgataatgg gacattgctt 480 ggcggttaca caaatgatgc caacatgtat tttcaccata acggtggaac aacgttttcc 540 agcttagagg atgggattta tcgaaatctg tttgacttgg cggaccttaa ccatcagaac 600 cctgttattg ataggtattt aaaagatgca gtaaaaatgt ggatagatat ggggattgat 660 ggtatccgta tggatgcggt gaagcacatg ccgtttggat ggcaaaaatc tctgatggat 720 gagattgata actatcgtcc tgtctttacg tttggggagt ggtttttgtc agaaaatgaa 780 gtggacgcga acaatcatta ctttgccaat gaaagtggaa tgagtttgct cgattttcgt 840 ttcggacaaa agcttcgtca agtattgcgc aataacagcg ataattggta tggctttaat 900 caaatgattc aagatacggc atcagcatat gacgaggttc tcgatcaagt aacattcata 960 gacaaccatg atatggatcg gtttatgatt gacggaggag atccgcgcaa ggtggatatg 1020 gcacttgctg tattattgac atcccgtggc gtaccgaata tttactatgg tacagagcaa 1080 tacatgaccg gtaacggcga tccaaacaat cgtaagatga tgagttcatt caataaaaat 1140 actcgcgcgt atcaagtgat tcaaaaacta tcttctctcc gacgaaacaa tccggcgtta 1200 gcttatggtg ataccgaaca gcgttggatc aatggcgatg tgtatgtgta tgagcgacag 1260 tttggcaaag atgttgtgtt agttgccgtt aatcgtagtt caagcagtaa ttactcgatt 1320 actggcttat ttacagcttt accagcagga acatatacgg atcagcttgg cggtctttta 1380 gacggaaata caattcaagt cggttcaaat ggatcagtta atgcatttga cttaggaccg 1440 ggggaagtcg gtgtatgggc atacagtgca acagaaagca cgccaattat tggtcatgtt 1500 ggaccgatga tggggcaagt cggtcatcaa gtaaccattg atggcgaagg attcggaaca 1560 aatacgggca ctgtgaagtt cggaacgaca gctgccaatg ttgtgtcttg gtctaacaat 1620 caaatcgttg tggctgtacc aaatgtgtca ccaggaaaat ataatattac cgtccaatca 1680 tcaagcggtc aaacgagtgc ggcttatgat aactttgaag tactaacaaa tgatcaagtg 1740 tcagtgcggt ttgttgttaa taacgcgact accaatctag ggcaaaatat atacattgtt 1800 ggcaacgtat atgagctcgg caactgggac actagtaagg caatcggtcc aatgttcaat 1860 caagtggttt actcctatcc tacatggtat atagatgtca gtgtcccaga aggaaagaca 1920 attgagttta agtttattaa aaaagacagc caaggtaatg tcacttggga aagtggttca 1980 aatcatgttt atacgacacc aacgaataca accggaaaaa ttatagtgga ttggcagaac 2040 taa 2043 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CGTase primer F <400> 3 aaaaaaccat ggctgctgga aatcttaata agg 33 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CGTase primer R <400> 4 aaaaaagtcg acttagttct gccaatccac tat 33

Claims

서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 시클로말토 덱스트린 클리칸 트란스페아제 활성을 갖는 폴리펩티드.
제1항의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서,
서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는, 폴리뉴클레오티드.
제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제4항의 벡터로 형질전환된 비인간 형질전환체.
제1항의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포 준비단계;
상기 형질전환 숙주세포를 배양배지에서 배양하는 형질전환 숙주세포 배양단계; 및
상기 배양된 형질전환 숙주세포로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 상기 폴리펩티드의 생산방법.
a) 제1항의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드가 포함된 세포 파쇄액; b) 아스코르브산; 및 c) 다당체를 상기 폴리펩티드가 작동하는 조건하에서 반응시키는 단계를 포함하는, 아스코르브산 배당체의 생산방법.
제7항에 있어서,
상기 다당체는 말토올리고당, 말토덱스트린, 시클로덱스트린, 아밀로스, 아밀로펙틴, 용성(溶性) 전분, 액화(液化) 전분, 호화(糊化) 전분 또는 글리코겐인, 아스코르브산 배당체의 생산방법.
제7항에 있어서,
당쇄절단효소로 반응시키는 단계를 추가적으로 포함하는, 아스코르브산 배당체의 생산방법.
제7항에 있어서,
상기 아스코르브산은 비타민 C를 함유하고 있는 식물체 유래의 아스코르브산, 균주로부터 발효공정에 의해 생산된 아스코르브산 또는 화학합성 아스코르브산인, 아스코르브산 배당체의 생산방법.
제10항에 있어서,
상기 식물체는 비타민나무(Hippophae rhamnoides L.), 까무 까무(Camu camu), 아세로라(Acerola), 로즈힙(Rose hips), 레몬, 블랙커런트(Black currant), 히비스커스(Hibiscus), 오렌지 또는 블루베리인, 아스코르브산 배당체의 생산방법.
제7항에 있어서,
상기 아스코르브산 배당체는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토트리오실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토테트라오실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토펜타오실-L-아스코르브산, 및 2-0-α-D-말토헥사오실-L-아스코르브산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 아스코르브산 배당체의 제조방법.
제1항의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 아스코르브산 생산 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포 준비단계;
상기 형질전환 숙주세포를 다당체 함유 배양배지에서 배양하는 배양단계; 및
상기 배양된 숙주세포 또는 배양액으로부터 아스코르브산 배당체를 회수하는 단계를 포함하는, 아스코르브산 배당체의 생산방법.
제 13항에 있어서,
상기 다당체는 말토올리고당, 말토덱스트린, 시클로덱스트린, 아밀로스, 아밀로펙틴, 용성(溶性) 전분, 액화(液化) 전분, 호화(糊化) 전분 또는 글리코겐인, 아스코르브산 배당체의 생산방법.
제 13항에 있어서,
상기 아스코르브산 배당체는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토트리오실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토테트라오실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토펜타오실-L-아스코르브산, 및 2-0-α-D-말토헥사오실-L-아스코르브산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 아스코르브산 배당체의 생산방법.
제1항의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포 준비단계;
a) 천연 비타민 C를 함유한 식물체로부터 추출된 천연 아스코르브산과 다당체를 함유한 배양배지에서 상기 형질전환 숙주세포를 배양하거나,
b) 상기 형질전환 숙주세포의 파쇄액을 포함하는 반응액에 상기 천연 아스코르브산 및 다당체를 첨가하여 반응시키는 아스코르브산 배당체 제조단계; 및
상기 배양된 숙주세포 또는 반응액으로부터 아스코르브산 배당체를 회수하는 단계를 포함하는, 아스코르브산 배당체의 생산방법.
제16항에 있어서,
상기 식물체는 비타민나무(Hippophae rhamnoides L.), 까무 까무(Camu camu), 아세로라(Acerola), 로즈힙(Rose hips), 레몬, 블랙커런트(Black currant), 히비스커스(Hibiscus), 오렌지 또는 블루베리인, 아스코르브산 배당체의 생산방법.
제16항에 있어서,
상기 다당체는 말토올리고당, 말토덱스트린, 시클로덱스트린, 아밀로스, 아밀로펙틴, 용성(溶性) 전분, 액화(液化) 전분, 호화(糊化) 전분 또는 글리코겐인, 아스코르브산 배당체의 생산방법.
제16항에 있어서,상기 아스코르브산 배당체는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토트리오실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토테트라오실-L-아스코르브산, 2-0-α-D-말토펜타오실-L-아스코르브산, 및 2-0-α-D-말토헥사오실-L-아스코르브산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 아스코르브산 배당체의 생산방법.